Porównanie efektywności różnych metod izolacji genomowego DNA
advertisement
Magdalena Dębska, Jacek Drabik Porównanie efektywności różnych metod izolacji genomowego DNA ze śladów biologicznych Wstęp i cel Rozwój nauk kryminalistycznych spowodowa³ zwrócenie wiêkszej uwagi na pozostawione na miejscu zdarzenia œlady biologiczne, które mo¿na poddaæ badaniom genetycznym. W ci¹gu ostatnich lat analiza DNA wyizolowanego z biologicznego materia³u dowodowego sta³a siê jednym z najsilniejszych narzêdzi kryminalistyki. Obecnie badania genomowego DNA s¹ metod¹ identyfikacji cz³owieka charakteryzuj¹c¹ siê najwy¿sz¹ si³¹ dyskryminacji. Ma ona zastosowanie zarówno w identyfikacji osobniczej, jak i w ustalaniu pokrewieñstwa. Materia³em do badañ genetycznych mog¹ byæ: krew, nasienie, œlina, mocz, a tak¿e w³osy, koœci, paznokcie, zêby i fragmenty tkanek miêkkich [5]. W praktyce równie czêsto mamy do czynienia zarówno z próbkami dobrej jakoœci, jak i z materia³em bardzo zdegradowanym i starym. Zdarza siê równie¿, ¿e œlady biologiczne pozostawione na miejscu zdarzenia zawieraj¹ niewielk¹ iloœæ materia³u genetycznego. Uzyskanie pe³nego profilu genetycznego z zabezpieczonych œladów mo¿e stanowiæ dla eksperta kryminalistyki du¿e wyzwanie. Jednym z kluczowych etapów badania DNA jest jego odzyskanie z pod³o¿a, na którym zosta³o ujawnione, a nastêpnie oczyszczenie z substancji hamuj¹cych reakcjê amplifikacji (inhibitory reakcji PCR). Mo¿liwoœæ oznaczenia profilu genetycznego z zabezpieczonych œladów biologicznych jest uzale¿niona od jakoœci i iloœci DNA, które uzyskuje siê w procesie ekstrakcji. Zastosowanie odpowiedniej metody izolacji materia³u genetycznego ma zasadniczy wp³yw na koñcowe wyniki badañ [3, 4, 8]. W praktyce laboratoryjnej korzysta siê z wielu metod izolacji kwasów nukleinowych. W Wydziale Biologii Centralnego Laboratorium Kryminalistycznego Komendy G³ównej Policji do ekstrakcji DNA z zabezpieczonych œladów stosuje siê obecnie metodê organiczn¹ w uk³adzie fenol : chloroform : alkohol izoamylowy. Technologia badañ genetycznych w kryminalistyce stale siê rozwija, wiêc pojawiaj¹ siê na rynku gotowe zestawy przeznaczone do izolacji DNA z ró¿nego rodzaju próbek, w tym ze œladów zawieraj¹cych znikom¹ iloœæ materia³u genetycznego. Nowo wprowadzane PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 metody charakteryzuj¹ siê coraz mniejsz¹ toksycznoœci¹ stosowanych odczynników, dziêki czemu s¹ bardziej bezpieczne dla u¿ytkowników. W Wydziale Biologii CLK KGP przeprowadzono testy skutecznoœci czterech nowych zestawów przeznaczonych do izolacji DNA ze œladów biologicznych. Do badañ wytypowano zestawy rekomendowane przez producentów i innych u¿ytkowników – dwa wykorzystuj¹ce technologiê separacji magnetycznej oraz dwa kolumienkowe, wykorzystuj¹ce technologiê separacji na membranie silikonowej. Uzyskane wyniki porównano z wynikami otrzymanymi dla próbek wyizolowanych metod¹ organiczn¹ w uk³adzie fenol : chloroform : alkohol izoamylowy. Testy pozwoli³y oceniæ ich w³aœciwoœci i przydatnoœæ do badañ prowadzonych w policyjnych laboratoriach kryminalistycznych. Dodatkowym efektem testów jest mo¿liwoœæ doboru optymalnych metod badañ materia³u genetycznego zapewniaj¹cych najwy¿sz¹ skutecznoœæ przy minimalizacji ponoszonych kosztów. Testowana w doœwiadczeniu technologia separacji magnetycznej opiera siê na powinowactwie cz¹steczek DNA do specjalnie zaprojektowanego ligandu zwi¹zanego z kulk¹ paramagnetyczn¹. Ligandem mo¿e byæ cz¹steczka pochodzenia naturalnego lub syntetycznego, wykazuj¹ca powinowactwo do izolowanej biomoleku³y. W praktyce najczêœciej stosowane s¹ monodyspersyjne kulki paramagnetyczne o jednakowej œrednicy otoczone cienkimi warstwami polimeru. Polimer stanowi specyficzn¹ powierzchniê do przy³¹czenia bioreaktywnego ligandu, w tym przypadku skierowanego wobec kwasów nukleinowych. Procedura izolacji rozpoczyna siê od lizy komórek. Nastêpnie do roztworu dodaje siê zawiesinê zawieraj¹c¹ kulki paramagnetyczne. Ligandy znajduj¹ce siê na powierzchni kulek wi¹¿¹ cz¹steczki DNA. Kulki paramagnetyczne ze zwi¹zanym materia³em osadzaj¹ siê na œcianie probówki od strony magnesu. Supernatant usuwa siê za pomoc¹ pipety. DNA przytwierdzone do kulek przemywa siê kilkakrotnie, a nastêpnie odzyskuje w postaci eluatu [1, 2, 6]. Schemat procedury przedstawiono na rycinie 1. 11 Ryc. 1. Procedura izolacji DNA metod¹ separacji magnetycznej Fig. 1. Procedure of DNA isolation using separation based on magnetic beads Ÿród³o (ryc. 1–11): autorzy Metoda kolumienkowa bazuje na specjalnie zbudowanej membranie silikonowej, z któr¹ ³¹czy siê DNA. Procedura izolacji obejmuje cztery etapy: lizê komórek, zwi¹zanie DNA ze z³o¿em krzemionkowym, przemywanie oraz elucjê DNA z membrany (ryc. 2). Próbki poddawane s¹ lizie w obecnoœci proteinazy K i odpowiedniego buforu lizuj¹cego. Adsorpcjê DNA do matrycy si- • Stopieñ trudnoœci wykonania procesu izolacji. • Czas potrzebny do przeprowadzenia procedury izolacji. • Czynniki ryzyka wyst¹pienia kontaminacji. • Zu¿ycie materia³ów i dodatkowych odczynników niezbêdnych do przeprowadzenia procedury. • Koszt zestawu. Ryc. 2. Procedura izolacji DNA metod¹ separacji na membranie silikonowej Fig. 2. Procedure of DNA isolation using separation based on silica membrane likonowej umo¿liwia obecnoœæ soli chaotropowej o wysokim stê¿eniu. Nastêpnie za pomoc¹ roztworów p³ucz¹cych DNA przemywane jest z inhibitorów reakcji PCR, bia³ek i innych zanieczyszczeñ. Uwolnienie DNA z silikonowej membrany nastêpuje dziêki dzia³aniu buforu o niskiej zawartoœci soli, który powoduje zmianê warunków wi¹zania [7, 9]. Celem przeprowadzonych badañ by³o porównanie efektywnoœci ró¿nych metod izolacji kwasów nukleinowych. Zestawy przeznaczone do izolacji DNA zosta³y porównane pod wzglêdem nastêpuj¹cych kryteriów: • Wydajnoœæ metody (porównanie uzyskanych stê¿eñ DNA). • Jakoœæ uzyskanego DNA (porównanie uzyskanych profili genetycznych). 12 Materiał i metody Schemat doświadczenia Badania wykonywano w okresie od wrzeœnia 2008 do marca 2009 roku na 280 próbkach krwi pobranych od oœmiu osób i umieszczonych w probówkach z heparyn¹ jako œrodkiem antykoagulacyjnym. Materia³ do badañ stanowi³a krew naniesiona na odpowiednie pod³o¿e (ja³owe p³ótno, materia³ jeansowy) o wymiarach oko³o 5 x 5 mm. Do sprawdzenia zale¿noœci iloœci uzyskanego DNA od iloœci materia³u wyjœciowego na ja³owe p³ótno nanoszono kolejno 1 μl, 2,5 μl oraz 5 μl krwi. W celu zbadania efektywnoœci usuwania inhibitora reakcji PCR z ekstraktu, na materia³ jeansowy zawieraj¹cy barwnik indygo nanoszono 1 μl krwi. Dodatkowo izolowano materia³ zdegradowany stanowi¹cy 1 μl krwi PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 na ja³owym p³ótnie poddany dzia³aniu temperatury 150oC przez 30 minut. Temperaturê i czas degradacji ustalono wczeœniej doœwiadczalnie. Wszystkie próby od momentu przygotowania do czasu przeprowadzenia procesu izolacji przechowywano przez okres 4 miesiêcy w wyja³owionych, suchych, otwartych probówkach w temperaturze pokojowej. Plan doœwiadczenia zak³ada³ wykonanie izolacji DNA w oœmiu powtórzeniach dla nastêpuj¹cych przypadków: • 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. • 2,5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. • 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. • Degradacja – 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno degradowanej 30 minut w temperaturze 150oC. • Inhibicja – 1 μl krwi naniesionej na materia³ jeansowy zawieraj¹cy barwnik indygo. • Kontrola pozytywna – 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. • Kontrola negatywna – ja³owe p³ótno bez naniesionej krwi. Wszystkie próbki przygotowane w opisany sposób poddano procesom izolacji piêcioma metodami: Metody oparte na separacji magnetycznej: • NucleoMag 96 Trace • DNA IQ™ System Metody wykorzystuj¹ce silikonow¹ membranê: • NucleoSpin®Tissue XS • QIAamp® DNA Micro Metoda organiczna: • Metoda organiczna w uk³adzie fenol : chloroform : alkohol izoamylowy (25 : 24 : 1). W zale¿noœci od zastosowanej metody i zaleceñ producenta koñcowa objêtoœæ, w jakiej zawieszano izolowane DNA, wynosi³a: • NucleoMag 96 Trace: 50 μl • DNA IQ™ System: 25 μl 20 μl • NucleoSpin®Tissue XS: 20 μl • QIAamp® DNA Micro: • Metoda organiczna: 20 μl Oznaczenie uzyskanego stê¿enia DNA w izolacie wykonano metod¹ „Real Time PCR” z wykorzystaniem aparatu ABI PRISM 7500 Sequence Detection System i oprogramowania 7500 System Detection Software v. 1.2.3 z zastosowaniem zestawu odczynników Quantifiler™ Human DNA Quantification Kit. Otrzymane ekstrakty DNA amplifikowano przy u¿yciu zestawu odczynników AmpFlSTR® SGM Plus™ i aparatu GeneAmp PCR System 9700. Produkty reakcji PCR poddawano elektroforezie w sekwenatorze ABI PRISM® 3130 XL. PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 Do analizy wyników u¿ywano oprogramowania GeneMapper® ID v. 3.2.1 firmy Applied Biosystems. Wszystkie badania przeprowadzono w obecnoœci kontroli dodatniej (DNA o znanym genotypie) i kontroli ujemnej (próba odczynnikowa), otrzymuj¹c prawid³owe dla nich wyniki. Procedury badawcze Procedura izolacji wykorzystuj¹ca wi¹zanie DNA przez paramagnetyczne kulki (separacja magnetyczna) – NucleoMag 96 Trace: 1. Do probówki o pojemnoœci 1,5 ml z badanym materia³em dodaæ 25 μl roztworu proteinazy K i 200 μl buforu FLB, a nastêpnie zworteksowaæ przez oko³o 15 sekund i krótko zwirowaæ. 2. Inkubowaæ próbkê przez 1 godzinê w temperaturze 56oC. 3. Z probówki przenieœæ 225 μl lizatu do do³ka na plastikowej p³ytce Square-well Block (ryc. 3). Ryc. 3. P³ytka Square-well Block (NucleoMag 96 Trace) Fig. 3. Square-well Block plate (NucleoMag 96 Trace) 4. Do lizatu dodaæ 14 μl zawiesiny paramagnetycznych kulek oraz 360 μl buforu MB2. Ca³oœæ wymieszaæ przez 5 minut na wytrz¹sarce. 5. P³ytkê umieœciæ na separatorze magnetycznym NucleoMag SEP (ryc. 4, 5) i pozostawiæ na 2 minuty w celu oddzielenia paramagnetycznych ku- Ryc. 4. Separator magnetyczny (NucleoMag 96 Trace) Fig. 4. Magnetic separator (NucleoMag 96 Trace) 13 lek od roztworu. Supernatant odci¹gn¹æ za pomoc¹ pipety. 4. Wirowaæ przez 2 minuty przy maksymalnych obrotach. Usun¹æ DNA IQ™ Spin Basket. 5. Do probówki dodaæ 7 μl homogennej zawiesiny kulek paramagnetycznych. Inkubowaæ próbkê przez 5 minut w temperaturze pokojowej, worteksuj¹c co minutê. 6. Probówkê umieœciæ w statywie magnetycznym, a nastêpnie ostro¿nie usun¹æ z probówki supernatant (ryc. 6). Ryc. 5. P³ytka Square-well Block umieszczona na separatorze magnetycznym (NucleoMag 96 Trace) Fig. 5. Square-well Block plate placed on the magnetic separator (NucleoMag 96 Trace) 6. Zdj¹æ p³ytkê z separatora. Dodaæ 600 μl buforu MB3, a nastêpnie mieszaæ przez 5 minut na wytrz¹sarce. 7. Ponownie umieœciæ p³ytkê na separatorze. Pozostawiæ na 2 minuty w celu oddzielenia paramagnetycznych kulek od roztworu. Supernatant odci¹gn¹æ za pomoc¹ pipety. 8. Zdj¹æ p³ytkê z separatora. Dodaæ 600 μl buforu MB4, a nastêpnie mieszaæ przez 5 minut na wytrz¹sarce. 9. Ponownie umieœciæ p³ytkê na separatorze. Pozostawiæ na 2 minuty w celu oddzielenia paramagnetycznych kulek od roztworu. Supernatant odci¹gn¹æ za pomoc¹ pipety. 10. Pozostawiaj¹c p³ytkê na separatorze dodaæ 900 μl buforu MB5 i inkubowaæ przez 60 sekund, a nastêpnie odci¹gn¹æ za pomoc¹ pipety supernatant. 11. Zdj¹æ p³ytkê z separatora. Dodaæ 50 μl buforu MB5 podgrzanego do temperatury 56oC. Mieszaæ przez 10 minut na wytrz¹sarce. 12. Umieœciæ p³ytkê na separatorze. Pozostawiæ na 2 minuty w celu oddzielenia paramagnetycznych kulek od roztworu. Uzyskany roztwór DNA odci¹gn¹æ do probówki o pojemnoœci 1,5 ml za pomoc¹ pipety. Procedura izolacji wykorzystuj¹ca wi¹zanie DNA przez paramagnetyczne kulki (separacja magnetyczna) – DNA IQ™ System: 1. Do probówki o pojemnoœci 1,5 ml zawieraj¹cej badany materia³ dodaæ 150 μl buforu lizuj¹cego. 2. Inkubowaæ przez 30 minut w temperaturze 70oC. 3. Lizat wraz z pod³o¿em przenieœæ na filtr DNA IQ™ Spin Basket umieszczony w probówce o pojemnoœci 1,5 ml. 14 Ryc. 6. Usuwanie supernatantu po oddzieleniu siê kulek magnetycznych od roztworu (DNA IQ™ System) Fig. 6. Discarding of supernatant after magnetic beads separation (DNA IQ™ System) 7. Dodaæ 100 μl buforu lizuj¹cego. Wyj¹æ probówkê ze statywu magnetycznego i zworteksowaæ. 8. Ponownie umieœciæ probówkê w statywie magnetycznym i usun¹æ ca³y bufor lizuj¹cy. 9. Dodaæ 100 μl roztworu p³ucz¹cego. Wyj¹æ probówkê ze statywu magnetycznego i zworteksowaæ. 10. Ponownie umieœciæ probówkê w statywie magnetycznym i usun¹æ ca³y roztwór p³ucz¹cy. 11. P³ukanie powtórzyæ jeszcze dwa razy. Upewniæ siê, ¿e ca³y roztwór zosta³ usuniêty po ostatnim p³ukaniu. 12. Osad suszyæ przez 5 minut w temperaturze pokojowej przy otwartych probówkach. 13. Dodaæ 25 μl buforu elucyjnego i zworteksowaæ. 14. Inkubowaæ przez 5 minut w temperaturze 65oC. 15. Wyj¹æ z cieplarki, zworteksowaæ, a nastêpnie wstawiæ do statywu magnetycznego (osad musi byæ gor¹cy). Uzyskany roztwór DNA przenieœæ do czystej probówki o pojemnoœci 1,5 ml. Procedura izolacji wykorzystuj¹ca wi¹zanie DNA przez silikonow¹ membranê – NucleoSpin®Tissue XS: 1. Do probówki z badanym materia³em o pojemnoœci 1,5 ml dodaæ 160 μl buforu T1, a nastêpnie zworteksowaæ 2 x 5 sekund. PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 2. Inkubowaæ próbkê przez 10 minut w temperaturze 94oC. Po zakoñczonej inkubacji pozostawiæ próbki, aby ostyg³y. 3. Dodaæ 16 μl roztworu proteinazy K, zworteksowaæ, a nastêpnie krótko zwirowaæ. 4. Inkubowaæ próbkê przez 1 godzinê w temperaturze 56oC. 5. Przenieœæ lizat wraz z pod³o¿em na filtr NucleoSpin®Filter umieszczony w probówce o pojemnoœci 1,5 ml. Zwirowaæ przez 1 minutê przy 11 000 obr./min. Filtr z pod³o¿em odrzuciæ. 6. Dodaæ 160 μl buforu B3, a nastêpnie zworteksowaæ 2 x 5 sekund. 7. Inkubowaæ przez 5 minut w temperaturze 70oC. 8. Zworteksowaæ próbkê po wyjêciu z cieplarki i pozostawiæ do ostygniêcia. 9. Dodaæ 160 μl etanolu, zworteksowaæ 2 x 5 sekund, a nastêpnie krótko zwirowaæ. 10. Przenieœæ lizat na kolumienkê z membran¹ silikonow¹, umieszczon¹ w probówce o pojemnoœci 2 ml i zwirowaæ przez 1 minutê przy 11 000 obr./min (je¿eli ca³a p³ynna zawartoœæ nie przes¹czy siê przez membranê, powtórzyæ wirowanie). Odrzuciæ probówkê wraz z supernatantem, a kolumienkê przenieœæ do nowej probówki o pojemnoœci 2 ml. 11. Dodaæ na membranê 50 μl buforu B5, a nastêpnie zwirowaæ przez 1 minutê przy 11 000 obr./min. 12. Ponownie dodaæ 50 μl buforu B5 i zwirowaæ przez 2 minuty przy 11 000 obr./min. 13. Umieœciæ kolumienkê w nowej probówce o pojemnoœci 1,5 ml, a nastêpnie dodaæ 20 μl buforu BE dok³adnie na sam œrodek membrany silikonowej. Zwirowaæ przez 1 minutê przy 11 000 obr./min. 14. Inkubowaæ otwart¹ probówkê przez 8 minut w temperaturze 90oC w celu odparowania pozosta³oœci etanolu. Ryc. 7. Przenoszenie pod³o¿a na kolumnê QIAshredder Spin (QIAamp® DNA Micro) Fig. 7. Transferring the solid sample material to the QIAshredder Spin column (QIAamp® DNA Micro) Ryc. 8. Pod³o¿e na kolumnie QIAshredder Spin po zwirowaniu (QIAamp® DNA Micro) Fig. 8. The solid sample material on the QIAshredder Spin column after centrifugation (QIAamp® DNA Micro) 5. Ostro¿nie przenieœæ supernatant na kolumnê QIAamp® MinElute umieszczon¹ w probówce o pojemnoœci 2 ml, bez zwil¿ania obwódki (ryc. 9). Procedura izolacji wykorzystuj¹ca wi¹zanie DNA przez silikonow¹ membranê – QIAamp® DNA Micro: 1. Do probówki o pojemnoœci 1,5 ml z badanym materia³em dodaæ 300 μl buforu ATL i 20 μl roztworu proteinazy K. Zworteksowaæ pulsacyjnie przez 10 sekund. 2. Inkubowaæ próbkê przez 1 godzinê w temperaturze 56oC. Po wyjêciu z cieplarki krótko zwirowaæ. 3. Dodaæ 300 μl buforu AL, a nastêpnie zworteksowaæ pulsacyjnie przez 10 sekund. 4. Inkubowaæ przez 10 minut w temperaturze 70oC. Zwirowaæ przez 1 minutê przy 14 000 obr./min. Jeœli materia³ biologiczny znajduje siê na pod³o¿u ch³onnym (np. tkaninie), nale¿y przenieœæ lizat wraz z pod³o¿em na kolumnê QIAshredder Spin (ryc. 7, 8) i zwirowaæ 2 minuty przy 14 000 obr./min. PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 Ryc. 9. Kolumna QIAamp® MinElute (QIAamp® DNA Micro) Fig. 9. QIAamp® MinElute column (QIAamp® DNA Micro) 6. Zwirowaæ przez 1 minutê przy 8000 obr./min. Probówkê z przes¹czem odrzuciæ, a kolumnê QIAamp® MinElute umieœciæ w nowej probówce o pojemnoœci 2 ml. 15 7. Na kolumnê dodaæ 500 μl buforu AW1, zwirowaæ przez 1 minutê przy 8000 obr./min. Probówkê z przes¹czem odrzuciæ, a kolumnê QIAamp® MinElute umieœciæ w nowej probówce o pojemnoœci 2 ml. 8. Na kolumnê dodaæ 500 μl buforu AW2, zwirowaæ przez 1 minutê przy 8000 obr./min. Probówkê z przes¹czem odrzuciæ, a kolumnê QIAamp® MinElute umieœciæ w nowej probówce o pojemnoœci 2 ml. 9. Zwirowaæ przez 3 minuty przy 14 000 obr./min, probówkê z przes¹czem odrzuciæ, a kolumnê QIAamp® MinElute umieœciæ w nowej probówce o pojemnoœci 1,5 ml. 10. Dodaæ 20 μl buforu AE na œrodkow¹ czêœæ membrany. 11. Inkubowaæ przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a nastêpnie zwirowaæ przez 1 minutê przy 14 000 obr./min. Ryc. 10. Przenoszenie fazy wodnej ekstraktu (metoda organiczna): a – faza wodna z widoczn¹ zawartoœci¹ barwnika indygo, b – faza wodna bez zawartoœci barwnika indygo. Fig. 10. Transferring the non-organic phase of the extract (organic method): a – non-organic phase containing indigo, b – non-organic phase without indigo Procedura izolacji DNA metod¹ organiczn¹ w uk³adzie chloroform : fenol : alkohol izoamylowy (25 : 24 : 1) 1. Do probówki o pojemnoœci 1,5 ml z badan¹ próbk¹ dodaæ kolejno: – 300 μl 2% roztworu SDS w buforze ekstrakcyjnym, – 12 μl 1 M roztworu DTT w buforze ekstrakcyjnym, – 15 μl 20 mg/ml roztworu proteinazy K. 2. Inkubowaæ próbkê w temperaturze 56oC przez noc. 3. Roz¿arzon¹ w p³omieniu palnika ig³¹ przek³uæ wieczko i dno zawieraj¹cej materia³ probówki. Probówkê umieœciæ w nowej opisanej probówce o pojemnoœci 1,5 ml, a nastêpnie zwirowaæ przez 5 minut przy 9000 obr./min. Odrzuciæ górn¹ probówkê z pod³o¿em. 4. Do przes¹czu dodaæ 300 μl mieszaniny fenol : chloroform : alkohol izoamylowy (25 : 24 : 1) rozpuszczonej w 10 mM roztworze Tris pH 8 z 1 mM EDTA i zworteksowaæ do uzyskania mlecznej zawiesiny. 5. Próbkê odwirowaæ przez 5 minut przy 13 500 obr./min. 6. Górn¹ fazê ekstraktu (wodn¹) przenieœæ na filtr zestawiony z opisan¹ probówk¹ mikrokoncentratora Microcon® YM-100, na który wczeœniej wpipetowano 100 μl wody (ryc. 10, 11). Zwirowaæ przez 10 minut przy 5500 obr./min. 7. Mikrokoncentrator wyj¹æ ostro¿nie z probówki, usun¹æ z niej przefiltrowany p³yn i ponownie zestawiæ mikrokoncentrator z probówk¹. 16 Ryc. 11. Filtr mikrokoncentratora Microcon® YM-100 (metoda organiczna) Fig. 11. Microcon® Centrifugal Filter Units (organic method) 8. Na filtr mikrokoncentratora wpipetowaæ 200 μl wody. 9. Odwirowaæ przez 10 minut przy 5500 obr./min. 10. Na filtr mikrokoncentratora wpipetowaæ 20 μl wody, a nastêpnie zestawiæ go w pozycji odwróconej z now¹ opisan¹ probówk¹ o pojemnoœci 1,5 ml. 11. Zwirowaæ przez 5 minut przy 2500 obr./min. Opracowanie wyników Wyniki uzyskane z oznaczenia iloœciowego opracowano z u¿yciem analizy wariancji testem Tukeya za pomoc¹ wersji demo oprogramowania GraphPad Prism v. 5 przeznaczonego do obliczeñ biostatystycznych (zgodnie z obwi¹zuj¹c¹ licencj¹ producenta). Omówienie wyników badań Testowane w doœwiadczeniu zestawy przeznaczone do izolacji DNA analizowano w nastêpuj¹cych aspektach: • Wydajnoœæ metody (uzyskane stê¿enie DNA). • Jakoœæ uzyskanego DNA (obraz profilu genetycznego). • Ryzyko wyst¹pienia kontaminacji. PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 • Ekonomika przeprowadzenia procesu izolacji (iloœæ zu¿ytych materia³ów i dodatkowych odczynników, czas niezbêdny do przeprowadzenia procedury, koszt zestawu) oraz stopieñ trudnoœci danej techniki. Analiza ilościowa uzyskanego DNA w zależności od zastosowanej metody izolacji Efektywnoœæ wybranych metod izolacji DNA porównano i omówiono dla nastêpuj¹cych przypadków: – objêtoœæ krwi naniesionej na ja³owe p³ótno (1 μl; 2,5 μl; 5 μl), – czynnik degraduj¹cy (wysoka temperatura), – wp³yw inhibitora (barwnik indygo). Wyniki przedstawiaj¹ce stê¿enie DNA w zale¿noœci od iloœci naniesionej na ja³owe p³ótno krwi przedstawiono w tabelach 1–3. (NucleoSpin®Tissue XS) utrzymywa³o siê na podobnym poziomie. Wynik ten zosta³ potwierdzony statystycznie. Najni¿sze stê¿enie DNA otrzymano przy u¿yciu metody QIAamp® DNA Micro. Porównawszy stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane po izolacji z 1 μl krwi naniesionego na ja³owe p³ótno, przy zastosowaniu ró¿nych metod, stwierdzono ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy wy¿szym stê¿eniem DNA uzyskanym przy zastosowaniu metody organicznej w porównaniu z: – metod¹ QIAamp® DNA Micro (p ≤ 0,01) – metodami: DNA IQ™ System, NucleoSpin®Tissue XS (p ≤ 0,05) Porównuj¹c œrednie stê¿enia DNA uzyskane ró¿nymi metodami, nale¿y mieæ na uwadze tak¿e wyniki cz¹stkowe. Daje siê bowiem zauwa¿yæ du¿¹ rozbie¿noœæ pomiêdzy pojedynczymi wynikami, co potwierdza du¿e odchylenie standardowe – zbli¿one do œred- Tabela 1 Stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale¿noœci od zastosowanej metody izolacji z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 1 μl of blood taken from the linen, depending on the extraction’s method Ÿród³o (tabele 1–7): autorzy S.D. – odchylenie standardowe Œrednie stê¿enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró¿ni¹ siê statystycznie: AB przy p ≤ 0,01 [p – poziom istotnoœci] ab przy p ≤ 0,05 […] – wartoœæ podana w nawiasie zosta³a wyeliminowana z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa Przy izolacji DNA z 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno najwy¿sz¹ œredni¹ ze stê¿enia [ng/μl] otrzymano, stosuj¹c metodê organiczn¹ (w uk³adzie fenol : chloroform : alkohol izoamylowy). Œrednie stê¿enie DNA otrzymane przy zastosowaniu technik separacji magnetycznej (NucleoMag 96 Trace i DNA IQ™ System) oraz separacji przy u¿yciu membrany silikonowej PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 niej, a nawet j¹ przewy¿szaj¹ce w przypadku metod opartych na separacji magnetycznej. Taka sytuacja mo¿e potwierdzaæ nisk¹ powtarzalnoœæ otrzymywanych wyników przy zastosowaniu wymienionych metod. Najwiêksze rozbie¿noœci w otrzymanych stê¿eniach zanotowano w przypadku metody NucleoMag 96 Trace. 17 Tabela 2 Stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale¿noœci od zastosowanej metody izolacji z materia³u stanowi¹cego 2,5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 2,5 μl of blood taken from the linen, depending on the extraction’s method Œrednie stê¿enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró¿ni¹ siê statystycznie: AB przy p ≤ 0,01 ab przy p ≤ 0,05 […] – wartoœæ podana w nawiasie zosta³a wyeliminowana z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa Tabela 3 Stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale¿noœci od zastosowanej metody izolacji z materia³u stanowi¹cego 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 5 μl of blood taken from the linen, depending on the extraction’s method Œrednie stê¿enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró¿ni¹ siê statystycznie: AB przy p ≤ 0,001 AB przy p ≤ 0,01 […] – wartoœæ podana w nawiasie zosta³a wyeliminowana z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa W przypadku izolacji DNA z 2,5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno, najwy¿sze œrednie stê¿enie [ng/μl] otrzymano przy zastosowaniu metody NucleoMag 96 18 Trace. Rozpatruj¹c wyniki cz¹stkowe przy zastosowaniu tej metody, w próbce numer 3 otrzymano stê¿enie znacznie przewy¿szaj¹ce inne wyniki (19,54 ng/μl). PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 Przy wyeliminowaniu tego wyniku do celów statystycznych œrednia stê¿enia DNA w metodzie NucleoMag 96 Trace by³a zbli¿ona do œredniego stê¿enia uzyskanego metod¹ organiczn¹. Wynik ten zosta³ potwierdzony statystycznie. Podobnie jak w przypadku omawianej wczeœniej izolacji z 1 μl krwi, tak¿e i w tym przypadku rozbie¿noœci uzyskanych wyników w metodzie Nucleo Mag 96 Trace by³y bardzo du¿e (od 1,33 ng/μl do 19,54 ng/μl). Odchylenie standardowe w metodzie opartej na separacji za pomoc¹ matrycy silikonowej przewy¿sza³o œredni¹. Najni¿sze stê¿enie DNA otrzymano przy u¿yciu metody QIAamp® DNA Micro, co potwierdza wynik uzyskany w doœwiadczeniu przy przeprowadzaniu izolacji z 1 μl. Porównuj¹c stê¿enie DNA [ng/μll] uzyskane po izolacji z 2,5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno, przy zastosowaniu ró¿nych metod, stwierdzono ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy wiêkszym stê¿eniem DNA, przy zastosowaniu metody NucleoMag 96 Trace, w porównaniu z: – metod¹ DNA IQ™ System (p ≤ 0,05) – metod¹ QIAamp® DNA Micro (p ≤ 0,01) Zanotowano tak¿e wy¿sze stê¿enie DNA otrzymane metod¹ organiczn¹ w porównaniu z metod¹ QIAamp® DNA Micro (p ≤ 0,05). Wyniki œrednich stê¿eñ DNA przy zastosowaniu pozosta³ych metod nie ró¿ni³y siê od siebie statystycznie. Przy izolacji DNA z 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno najwy¿sze œrednie stê¿enie [ng/μl] zanotowano przy zastosowaniu metody NucleoMag 96 Trace. Drug¹ pod wzglêdem wydajnoœci metod¹ by³a metoda organiczna. Najni¿sze stê¿enie DNA uzyskano, stosuj¹c metodê QIAamp® DNA Micro (podobny wynik zanotowano w przypadku izolacji z 1 μl i 2,5 μl krwi). Porównuj¹c stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane po izolacji z 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno, przy zastosowaniu ró¿nych metod, stwierdzono ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy wiêkszym stê¿eniem DNA przy zastosowaniu metody Nucleomag 96 Trace w porównaniu z metodami: DNA IQ™ System, NucleoSpin®Tissue XS oraz QIAamp® DNA Micro (p ≤ 0,01). Potwierdzono tak¿e statystycznie wy¿sze œrednie stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane metod¹ organiczn¹ w porównaniu z nastêpuj¹cymi metodami: – DNA IQ™ System i NucleoSpin®Tissue XS (p ≤ 0,01) – QIAamp® DNA Micro (p ≤ 0,001) W tabeli 4 przedstawiono stê¿enie DNA otrzymane ró¿nymi metodami izolacji w przypadku dzia³ania czynnika degraduj¹cego, jakim by³a wysoka temperatura. W przypadku izolowania DNA z materia³u zdegradowanego najwy¿sze œrednie stê¿enie DNA [ng/μl] uda³o siê uzyskaæ stosuj¹c metodê organiczn¹. Podobnie wysokie stê¿enie otrzymano, izoluj¹c materia³ metod¹ NucleoSpin®Tissue XS. Porównuj¹c stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane po izolacji z 1 μl zdegradowanej krwi na p³ótnie, przy zastosowaniu ró¿nych metod, stwier- Tabela 4 Stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale¿noœci od zastosowanej metody izolacji z materia³u zdegradowanego, stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 1 μl of degraded blood taken from the linen, depending on the extraction’s method Œrednie stê¿enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró¿ni¹ siê statystycznie: AB przy p ≤ 0,001 AB przy p ≤ 0,01 ab przy p ≤ 0,05 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 19 dzono ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy ni¿szym stê¿eniem DNA po zastosowaniu metody QIAamp® DNA Micro w porównaniu z metodami: – organiczn¹ (p ≤ 0,001) – NucleoSpin®Tissue XS (p ≤ 0,01) – DNA IQ™ System (p ≤ 0,05). W tabeli 5 przedstawiono stê¿enie DNA otrzymane ró¿nymi metodami izolacji w przypadku obecnoœci inhibitora reakcji PCR w pod³o¿u. Izoluj¹c DNA z 1 μl krwi naniesionej na jeans zawieraj¹cy inhibitor reakcji PCR (barwnik indygo), najwy¿sze œrednie stê¿enie DNA [ng/μl] otrzymano, stosuj¹c Tabela 5 Stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane w zale¿noœci od zastosowanej metody izolacji z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na jeans z barwnikiem indygo (pod³o¿e z inhibitorem reakcji PCR) Concentration of DNA [ng/μl] obtained from 1 μl of blood taken from the jeans (PCR inhibitor), depending on the extraction’s method Œrednie stê¿enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró¿ni¹ siê statystycznie: AB przy p ≤ 0,001 AB przy p ≤ 0,01 […] – wartoœæ podana w nawiasie zosta³a wyeliminowana z obliczeñ statystycznych za pomoc¹ testu Grubbsa Tabela 6 Stê¿enie DNA [ng/μl] stanowi¹cego próbê kontroln¹ uzyskane w zale¿noœci od zastosowanej metody izolacji z 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno Concentration of DNA [ng/μl] obtained from the control – 1 μl of blood taken from the linen, depending on the extraction’s method Œrednie stê¿enia DNA [ng/μl] oznaczone parami liter ró¿ni¹ siê statystycznie: AB przy p ≤ 0,01; ab przy p ≤ 0,05 20 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 metodê NucleoSpin®Tissue XS. W przypadku metody QIAamp® DNA Micro nie stwierdzono wystêpowania inhibitora reakcji PCR w koñcowym izolacie, jednak DNA nie uda³o siê wyizolowaæ. Ekstrakcja DNA metod¹ organiczn¹ w uk³adzie fenol : chloroform : alkohol izoamylowy skutkowa³a obecnoœci¹ inhibitora reakcji PCR w koñcowym izolacie. Odchylenie standardowe w metodzie opartej na separacji magnetycznej DNA IQ™ System przewy¿sza³o œrednie stê¿enie. Przy izolacji DNA z pod³o¿a zawieraj¹cego inhibitor reakcji PCR stwierdzono wy¿sze stê¿enie DNA przy zastosowaniu metody NucleoSpin®Tissue XS w porównaniu z: – QIAamp® DNA Micro (p ≤ 0,001) – DNA IQ™ System (p ≤ 0,01) Wszystkie badania przeprowadzono w obecnoœci kontroli pozytywnej – próbki o znanym genotypie, stanowi¹cej 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. Wyniki przedstawiono w tabeli 6. W próbie kontrolnej najwy¿sze stê¿enia DNA [ng/μl], potwierdzone statystycznie, zanotowano w przypadkach izolacji metodami NucleoMag 96 Trace oraz organiczn¹. Najni¿sze stê¿enie DNA uzyskano metod¹ QIAamp® DNA Micro. Porównuj¹c stê¿enie DNA [ng/μl] uzyskane po izolacji z próby kontrolnej, przy zastosowaniu ró¿nych metod, stwierdzono ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy wy¿szym stê¿eniem DNA uzyskanym metod¹ NucleoMag 96 Trace w porównaniu z: – metod¹ QIAamp® DNA Micro (p ≤ 0,01) – metodami: DNA IQ™ System, NucleoSpin®Tissue XS (p ≤ 0,05) Ponadto zanotowano statystycznie wy¿sze stê¿enie DNA przy zastosowaniu metody organicznej w porównaniu z metod¹ QIAamp® DNA Micro (p ≤ 0,05). Analiza jakościowa uzyskanego DNA w zależności od zastosowanej metody izolacji Po izolacji DNA z materia³u wyjœciowego, jaki stanowi³y próbki krwi o objêtoœci: 1 μl, 2,5 μl oraz 5 μl stwierdzono, ¿e tylko przy zastosowaniu metody Nucleo Spin®Tissue XS oraz metody organicznej uda³o siê uzyskaæ pe³ne profile w przypadku wszystkich analizowanych próbek. Izoluj¹c metod¹ DNA IQ™ System z 1 μl krwi, uzyskano dwa profile czêœciowe (wypadniêciu uleg³y allele z uk³adu D18S51) oraz 6 pe³nych profili. Najmniejsz¹ liczbê pe³nych profili uzyskano przy zastosowaniu metod: NucleoMag 96 Trace (3FP) i QIAamp® DNA Micro (4FP). W obu tych metodach uzyskano tak¿e profile czêœciowe: w metodzie NucleoMag 96 Trace wypadniêciu uleg³y allele z uk³adów D16S539, D2S1338, D21S11, D18S51 i FGA w jednej próbce oraz TH01 w drugiej. W przypadku metody QIAamp® DNA Micro wypad³y uk³ady: D18S51 w jednej próbce oraz D3S1358, vWA, D16S539, D2S1338, D21S11, D18S51, D19, TH01 i FGA w kolejnych. Przy zastosowaniu metod: NucleoMag 96 Trace, DNA IQ™ System oraz QIAamp® DNA Micro wraz ze wzrostem iloœci materia³u wyjœciowego uzyskiwano wiêcej pe³nych profili genetycznych. Tabela 7 Analiza uzyskanych profili genetycznych w zale¿noœci od zastosowanej metody izolacji Analysis of the genetic profiles depending on the the extraction’s method Zastosowane w tabeli oznaczenia: FP – pe³ny profil (ang. full profile) PP – czêœciowy profil (ang. partial profile) NEG – brak profilu PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 21 W przypadku analizy materia³u zdegradowanego stwierdzono, ¿e przy zastosowaniu metod: DNA IQ™ System, NucleoSpin®Tissue XS oraz organicznej uzyskano profile, w których wypadniêciu uleg³y tylko allele w loci o wysokiej masie cz¹steczkowej. Dla DNA IQ™ System by³y to uk³ady: D2S1338 i D18S51 (w jednym przypadku tak¿e D16S539 i FGA), dla NucleoSpin®Tissue XS: D2S1338, D18S51 (w dwóch przypadkach dodatkowo D16S539 i D21S11, a tak¿e w jednym przypadku FGA), dla metody organicznej: D16S539, D2S1338, D18S51 (w jednym przypadku tak¿e D21S11 i FGA). Stosuj¹c metody izolacji z zastosowaniem systemów NucleoMag 96 Trace i QIAamp® DNA Micro, uda³o siê uzyskaæ tylko profile czêœciowe, w których wypadniêciu uleg³y allele z wiêkszoœci loci. W przypadku metody QIAamp® DNA Micro nie uzyskano profili genetycznych dla piêciu na osiem badanych próbek. Analiza profili DNA z materia³u izolowanego z pod³o¿a zawieraj¹cego inhibitor reakcji PCR wskaza³a, ¿e jedynie stosuj¹c metodê opart¹ na separacji za pomoc¹ paramagnetycznych kulek – DNA IQ™ System – uda³o siê uzyskaæ wszystkie profile genetyczne (cztery pe³ne profile i cztery czêœciowe). W pozosta³ych stosowanych metodach wielokrotnie obserwowano brak sygna³u: dla QIAamp® DNA Micro nie uda³o siê uzyskaæ profili genetycznych we wszystkich oœmiu przypadkach, dla NucleoMag 96 Trace w siedmiu, oraz dla NucleoSpin®Tissue XS w szeœciu. Próba kontrolna potwierdzi³a wyniki uzyskane z izolacji przeprowadzonej z 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno w przypadku metod: DNA IQ™ System, Nucleo Spin®Tissue XS oraz metody organicznej. Natomiast dla metody NucleoMag 96 Trace otrzymano w przypadku próby kontrolnej znacznie lepszy wynik – osiem pe³nych profili. Podobnie w przypadku systemu QIAamp® DNA Micro otrzymano wiêcej pe³nych profili. W ¿adnym z analizowanych przypadków nie stwierdzono profilu mieszanego, co œwiadczy o braku wyst¹pienia kontaminacji. Ekonomika procesów izolacji DNA oraz ocena stopnia trudności ich stosowania Podsumowanie ekonomiki wykonania izolacji DNA poszczególnymi metodami uwzglêdnia czas etapów niezbêdnych do przeprowadzenia procesu, iloœæ dodatkowych materia³ów i odczynników, a tak¿e ceny brutto zestawów. Podane kwoty odnosz¹ siê do cen rynkowych z I kwarta³u 2009 r. NucleoMag 96 Trace: Czas inkubacji: 60 min Czas wytrz¹sania: 26 min Czas separacji: 8 min 22 Zu¿ycie materia³ów: 2 x probówka o poj. 1,5 ml, 10 x koñcówka 1000 μl 4 x koñcówka 100 μl Plastikowa 96-do³kowa p³ytka Square-well block Dodatkowe odczynniki: brak Koszt zestawu (96 izolacji): 900 PLN Cena separatora magnetycznego: 2240 PLN Koszt w przeliczeniu na 1 próbkê: 9,40 PLN £¹czny czas operacji niezbêdnych do przeprowadzenia izolacji DNA zestawem NucleoMag 96 Trace (inkubacja, wytrz¹sanie i separacja) wynosi 94 minuty. Zestaw zawiera wszystkie odczynniki potrzebne do wykonania procedury. Niezbêdne jest zabezpieczenie dodatkowych materia³ów w postaci probówek o pojemnoœci 1,5 ml i plastikowych 96-do³kowych p³ytek Square-well block. S¹ one sprzedawane oddzielnie w zestawach po 4 lub 20 sztuk. Dodatkowym kosztem jest zakup separatora magnetycznego, na którym umieszcza siê p³ytkê Square-well block. Separator nie ma bezpoœredniego kontaktu z próbkami, wiêc mo¿e byæ stosowany wielokrotnie. Jednorazowo mo¿na umieœciæ na separatorze jedn¹ p³ytkê. W ca³ym procesie zu¿ywanych jest 14 ró¿nych koñcówek do pipet. Metoda jest bardzo trudna do wykonania manualnego. Istnieje du¿e ryzyko wyst¹pienia kontaminacji ze wzglêdu na to, ¿e ca³y proces izolacji odbywa siê przy otwartej p³ytce Square-well block. Szczególne niebezpieczeñstwo zanieczyszczenia próbek wystêpuje na etapie wytrz¹sania. Operator musi zachowaæ przez ca³y czas szczególn¹ ostro¿noœæ. Ponadto niemo¿liwe jest rêczne wykonanie izolacji z pe³nym wykorzystaniem p³ytki 96-do³kowej, co w przypadku mniejszej iloœci próbek czyni metodê ma³o op³acaln¹. Zestaw NucleoMag 96 Trace jest dedykowany do izolacji DNA za pomoc¹ automatycznych stacji (robotów). DNA IQ™ System: Czas wirowania: Czas inkubacji: Zu¿ycie materia³ów: 2 min 45 min 3 x probówka o poj. 1,5 ml 7 x koñcówka 300 μl 6 x koñcówka 100 μl 1 x koñcówka 10 μl Dodatkowe odczynniki: 0,3 ml EtOH 0,3 ml iPrOH 2,5 μl 1M DTT Koszt zestawu (100 izolacji): 1874 PLN Koszt w przeliczeniu na 1 próbkê: 18,75 PLN Metoda izolacji z zastosowaniem zestawu DNA IQ™ System wymaga przeprowadzenia etapów wirowania PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 i inkubacji, których ³¹czny czas wynosi 45 minut. Zestaw zawiera zarówno statyw magnetyczny, jak i wystarczaj¹c¹ iloœæ probówek o pojemnoœci 1,5 ml, jednak niektóre odczynniki nale¿y zabezpieczyæ we w³asnym zakresie (etanol, izopropanol, 1 M roztwór DTT w buforze lizuj¹cym). W procesie zu¿ywanych jest 14 ró¿nych koñcówek do pipet. Metoda jest doœæ ³atwa do wykonania manualnego w przypadku niewielkiej liczby próbek. Statyw magnetyczny przewidziany jest na 12 probówek. Ryzyko kontaminacji wystêpuje w niewielkim zakresie z tego wzglêdu, ¿e wszystkie próbki znajduj¹ siê w oddzielnych probówkach typu safe-lock. Proces mo¿na przeprowadzaæ równie¿ z zastosowaniem robota do izolacji. NucleoSpin®Tissue XS: Czas wirowania: 6 min Czas inkubacji: 83 min Zu¿ycie materia³ów: 2 x probówka o poj. 1,5 ml 2 x probówka o poj. 2 ml 2 x koñcówka 1000 μl 3 x koñcówka 300 μl 4 x koñcówka 100 μl Filtry NucleoSpin Dodatkowe odczynniki: 0,4 ml EtOH Koszt zestawu (50 izolacji): 974 PLN Koszt w przeliczeniu na 1 próbkê: 19,50 PLN £¹czny czas inkubacji i wirowania w procedurze izolacji DNA za pomog¹ zestawu NucleoSpin Tissue XS wynosi 89 minut. Niezbêdne jest zabezpieczenie dodatkowych materia³ów w postaci probówek o pojemnoœci 1,5 ml i 2 ml oraz filtrów NucleoSpin s³u¿¹cych do oddzielania lizatu od pod³o¿a. Nale¿y równie¿ przygotowaæ etanol do sporz¹dzenia buforu p³ucz¹cego. W ca³ym procesie zu¿ywanych jest dziewiêæ ró¿nych koñcówek do pipet. Zestaw NucleoSpin Tissue XS jest dedykowany do manualnego wykonywania. Izolacja DNA t¹ metod¹ jest ³atwa do przeprowadzenia. Ryzyko kontaminacji próbek wystêpuje w bardzo niewielkim stopniu. QIAamp® DNA Micro Kit: Czas wirowania: 10 min Czas inkubacji: 75 min Zu¿ycie materia³ów: 2 x probówka o poj. 1,5 ml 6 x koñcówka 1000 μl 2 x koñcówka 100 μl Kolumna QIAshredder Spin Dodatkowe odczynniki: 1,1 ml EtOH PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 Koszt zestawu (50 izolacji): Koszt w przeliczeniu na 1 próbkê: 1574 PLN 31,50 PLN Izolacja DNA za pomog¹ zestawu QIAamp® DNA Micro wi¹¿e siê z przeprowadzeniem inkubacji i wirowania, których ³¹czny czas wynosi 85 minut. Niezbêdne jest zabezpieczenie etanolu wchodz¹cego w sk³ad roztworów p³ucz¹cych, równie¿ dodatkowych materia³ów w postaci probówek o pojemnoœci 1,5 ml oraz kolumn QIAshredder Spin s³u¿¹cych do oddzielania lizatu od pod³o¿a. Probówki o pojemnoœci 2 ml znajduj¹ siê w zestawie. W ca³ym procesie zu¿ywanych jest osiem ró¿nych koñcówek do pipet. Ryzyko wyst¹pienia kontaminacji w procesie izolacji DNA za pomoc¹ zestawu QIAamp® DNA Micro jest bardzo ma³e. Procedura jest ³atwa do przeprowadzenia manualnie. Metoda organiczna w uk³adzie fenol : chloroform : alkohol izoamylowy (25 : 24 : 1) Czas wirowania: 35 min Czas inkubacji: > 150 min Zu¿ycie materia³ów: 4 x probówka o poj. 1,5 ml 2 x koñcówka 1000 μl 1 x koñcówka 300 μl 5 x koñcówka 100 μl Mikrokoncentrator Microcon® YM-100 Dodatkowe odczynniki: 300 μl 2% SDS 12 μl 1M DTT 15 μl proteinazy K (20 mg/ml) Koszt w przeliczeniu na 1 próbkê: oko³o 15 PLN Izolacja z zastosowaniem metody organicznej wymaga przeprowadzenia etapów wirowania i inkubacji, których ³¹czny czas wynosi co najmniej 185 minut. Wymaga ona wczeœniejszego przygotowania odczynników. Na ka¿d¹ próbkê nale¿y zabezpieczyæ 4 probówki o pojemnoœci 1,5 ml, zestaw mikrokoncentratora Microcon® YM-100 firmy Millipore i osiem ró¿nych koñcówek do pipet. Stosowanie metody organicznej do izolacji DNA jest dosyæ ³atwe, jednak¿e stwarza niebezpieczeñstwo nara¿enia operatora na dzia³anie par niebezpiecznych substancji organicznych: fenolu – substancji silnie ¿r¹cej i toksycznej, chloroformu – substancji szkodliwej oraz groŸnej dla œrodowiska, a tak¿e alkoholu izoamylowego o dzia³aniu szkodliwym i dra¿ni¹cym. Ponadto zachodzi ryzyko wyst¹pienia kontaminacji krzy¿owej próbek przy operowaniu filtrami mikrokoncentratora na etapie elucji DNA. 23 Wnioski 1. W przypadku izolacji DNA z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno stwierdzono statystycznie istotne wy¿sze stê¿enie DNA przy zastosowaniu metody organicznej w porównaniu z metodami DNA IQ™ System, NucleoSpin®Tissue XS oraz QIAamp® DNA Micro. 2. W przypadku izolacji DNA z materia³u stanowi¹cego 2,5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno stwierdzono statystycznie istotne wy¿sze stê¿enie DNA przy zastosowaniu metody NucleoMag 96 Trace w porównaniu z metodami DNA IQ™ System oraz QIAamp® DNA Micro, a tak¿e metody organicznej w odniesieniu do QIAamp® DNA Micro. 3. W przypadku izolacji DNA z materia³u stanowi¹cego 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno stwierdzono statystycznie istotne wy¿sze stê¿enie DNA przy zastosowaniu metody Nucleo Mag 96 Trace i metody organicznej, w porównaniu z pozosta³ymi metodami. 4. Najwy¿sz¹ wydajnoœæ izolacji DNA z materia³u zdegradowanego uzyskano przy zastosowaniu metody organicznej oraz NucleoSpin®Tissue XS. Stwierdzono statystycznie istotne ni¿sze stê¿enie DNA w przypadku zastosowania zestawu QIAamp® DNA Micro w porównaniu z pozosta³ymi metodami z wyj¹tkiem NucleoMag 96 Trace. 5. Izolacja DNA z materia³u stanowi¹cego 1 μl krwi naniesionej na pod³o¿e zawieraj¹ce inhibitor reakcji PCR wykaza³a najwiêksz¹ skutecznoœæ zestawu NucleoSpin®Tissue XS. Stwierdzono statystycznie istotne wy¿sze stê¿enie DNA w izolacie przy zastosowaniu tej metody w porównaniu z metodami DNA IQ™ System oraz QIAamp® DNA Micro. Ekstrakcja DNA metod¹ organiczn¹ skutkowa³a obecnoœci¹ inhibitora reakcji PCR w uzyskanym izolacie. 6. Stê¿enia DNA uzyskane w próbie kontrolnej potwierdzaj¹ wyniki otrzymane w przypadkach ekstrakcji DNA z 1 μl, 2,5 μl oraz 5 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno. Ró¿nice w iloœci wyizolowanego DNA, pomiêdzy prób¹ kontroln¹ a prób¹ stanowi¹c¹ 1 μl krwi naniesionej na ja³owe p³ótno w przypadku izolacji zestawem NucleoMag 96 Trace, œwiadcz¹ o niskiej powtarzalnoœci tej metody wykonywanej technik¹ manualn¹. 7. Pe³ne profile genetyczne uzyskano we wszystkich przypadkach izolacji DNA z materia³u wyjœciowego, jaki stanowi³y próbki o ró¿nej objêtoœci krwi naniesione na ja³owe p³ótno, tylko przy za- 24 stosowaniu metody organicznej oraz Nucleo-Spin®Tissue XS. 8. Najwiêkszy odsetek pe³nych profili genetycznych w izolacji DNA zdegradowanego oraz z pod³o¿a zawieraj¹cego inhibitor reakcji PCR uzyskano przy zastosowaniu zestawu DNA IQ™ System. 9. Najtrudniejsz¹ do wykonania manualnego okaza³a siê procedura ekstrakcji DNA metod¹ Nucleo Mag 96 Trace. Zestaw ten, w odró¿nieniu od innych, posiada wszystkie odczynniki niezbêdne do przeprowadzenia procedury. Koszt wykonania izolacji jednej próbki zestawem NucleoMag 96 Trace jest najni¿szy. 10. Najkrótszy czas wykonania ca³ego procesu ekstrakcji uzyskano dla zestawu DNA IQ™ System. Metoda ta jest ³atwa do rêcznego przeprowadzenia przy niewielkiej iloœci próbek. 11. Najmniejsze zu¿ycie materia³ów wystêpuje w przypadku zestawu QIAamp® DNA Micro. We wszystkich analizowanych przypadkach zestaw QIAamp® DNA Micro charakteryzowa³ siê najni¿sz¹ wydajnoœci¹ zarówno w aspekcie iloœciowym jak i pod wzglêdem jakoœci uzyskanych profili genetycznych. 12. W ¿adnej z opisanych metod ekstrakcji DNA nie stwierdzono wyst¹pienia kontaminacji. Streszczenie Celem przeprowadzonych badañ by³o porównanie efektywnoœci ró¿nych metod izolacji kwasów nukleinowych w aspekcie iloœciowym, jakoœciowym i ekonomicznym. Przetestowano dwa zestawy przeznaczone do izolacji DNA opieraj¹ce siê na separacji magnetycznej: NucleoMag 96 Trace i DNA IQ™ System oraz dwa zestawy kolumienkowe z membran¹ silikonow¹: NucleoSpin®Tissue XS i QIAamp® DNA Micro. W artykule przedstawiono wyniki analizy testowanych zestawów do izolacji DNA. Badanym materia³em biologicznym by³a wysuszona krew na pod³o¿u ja³owym oraz na pod³o¿u zawieraj¹cym inhibitor reakcji PCR, a tak¿e materia³ zdegradowany. Po izolacji DNA z ró¿nych objêtoœci krwi na ja³owym pod³o¿u najbardziej wydajnymi pod wzglêdem jakoœciowym by³y metody organiczna oraz Nucleospin®Tissue XS. W przypadku materia³u zdegradowanego oraz przy ekstrakcji DNA z pod³o¿a zawieraj¹cego inhibitor reakcji PCR najwiêcej pe³nych profili uzyskano przy zastosowaniu metody DNA IQ™ System. Badania t¹ metod¹ wykonano w najkrótszym czasie. Najni¿szy koszt w przeliczeniu na jedn¹ próbkê uzyskano dla zestawu NucleoMag 96 Trace. S³owa kluczowe: metody izolacji DNA, separacja magnetyczna, kulki paramagnetyczne, membrana silikonowa, œlady biologiczne, kryminalistyczne badania DNA. Summary The purpose of the research was to compare the efficiency of different DNA extraction methods from arranged forensic sam- PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 ples. There were tested four commercial kits: two of them based on magnetic separation: NucleoMag 96 Trace i DNA IQ™ System and two of them based on silica membrane: Nucleo-Spin®Tissue XS and QIAamp® DNA Micro. In the article were presented results of extraction from dried blood spots on sterile linen as well as on jeans contained PCR inhibitor and also from degraded DNA. The best results in the quality aspect were obtained from dried blood spots on sterile linen using Nucleospin®Tissue XS and organic method. DNA IQ™ System was the most effective method in case of degraded DNA and samples contained PCR inhibitor. These method required also the shortest time to perform the whole procedure of extraction. The lowest overall cost per one sample were in NucleoMag 96 Trace. Keywords: DNA extraction methods, magnetic separation, paramagnetic beads, silica membrane, forensic biology. BIBLIOGRAFIA 1. http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Dynal.html 2. Macherey-Nagel User Manual, NucleoMag 96 Trace – Genomic DNA from Forensic Samples, Germany 2006, 1–29. 3. Montpetit S.A., Fitch I.T., O’Donnell P.T.: A simple automated instrument for DNA extraction in forensic casework, Journal of Forensic Science 2005, 50, 1–9. 4. Nagy M., Otremba P., Krüger C. [et al.]: Optimization and validation of a fully automated silica-coated magnetic beads purification technology in forensics, Forensic Science International 2005, 152,13–22. 5. Paw³owski R.: Medyczno-s¹dowe badanie œladów biologicznych, Wydawnictwo IES, Kraków 1997. 6. Promega Technical Bulletin, DNA IQTM System – Small Sample Casework Protocol, USA 2006, 1–14. 7. Qiagen QIAamp® DNA Micro Handbook, Germany 2003, 1–47. 8. Skagestad V., Reitan E., Stacy R. [et al.]: Innovative automated nucleic acid isolation by the key use of magnetic silica particles, European Cells and Materials 2002, 3, 199. 9. Macherey-Nagel User Manual, NucleoSpin®Tissue XS – Genomic DNA from Tissue, Germany 2007, 1–29. Nagrody w konkursie prof. Tadeusza Hanauska Z przyjemnoœci¹ informujemy, ¿e decyzj¹ Jury X Edycji Konkursu im. T. Hanauska na Pracê Roku z Dziedziny Kryminalistyki z dnia 27 marca 2009 r. nagrodzone zosta³y w kategorii publikacje nastêpuj¹ce artyku³y pracowników Centralnego Laboratorium Kryminalistycznego KGP: „N,N-dietylobenzyloamina – produkt utleniania benzoesanu denatonium podchlorynem sodu” – nagrodê otrzyma³ £ukasz Matyjasek, specjalista Wydzia³u Fizykochemii „Analiza sekwencji nowego markera STR zlokalizowanego w lokus ludzkiego hormonu wzrostu i jego wykorzystanie w identyfikacji osobniczej” – wyró¿nienie otrzyma³a dr Magdalena Spólnicka, ekspert Wydzia³u Biologii „Badania zawartoœci morfiny w p³ynach ustrojowych osób po spo¿yciu produktów spo¿ywczych zawieraj¹cych mak oraz jej oznaczanie w tych wyrobach – dyplom Polskiego Towarzystwa Kryminalistycznego otrzyma³a Mariola Burstein, specjalista Wydzia³u Fizykochemii. PROBLEMY KRYMINALISTYKI 264 (kwiecieñ–czerwiec) 2009 25
