Genotypowanie metodą REA-PFGE pałeczek Listeria
advertisement
MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 199 - 207 Agnieszka Kołakowska, Grzegorz Madajczak Genotypowanie metodą REA-PFGE pałeczek Listeria monocytogenes izolowanych z próbek materiału klinicznego, próbek środowiskowych i próbek żywności Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego – Państwowego Zakładu Higieny Kierownik: prof. dr hab. M. Jagielski Pałeczki Listeria monocytogenes poddano genetycznemu typowaniu metodą REA – PFGE z restryktazami AscI oraz ApaI oraz genotypowaniu metodą multipleks PCR wg Doumitha i wsp. Wśród badanych szczepów wyróżniono 62 profile PFGE w dwóch grupach filogenetycznych. Połączona analiza profili PFGE dla enzymów AscI i ApaI wyodrębniła 8 pulsotypów grupujących dwa lub więcej szczepów pałeczek L. monocytogenes. Pałeczki Listeria monocytogenes są jednym z ważniejszych patogenów odpowiedzialnych za groźne w skutkach uogólnione zakażenia przebiegające w postaci bakteriemii, zakażenia ośrodkowego układu nerwowego czy ogniskowej listeriozy narządów wewnętrznych, jak również zakażenia układu pokarmowego. Wywoływana przez te drobnoustroje choroba może występować w postaci sporadycznych zachorowań, jak też ognisk epidemicznych, w tym o zasięgu międzynarodowym. W krajach Unii Europejskiej i krajach stowarzyszonych (EEA/EFTA) notuje się systematyczny wzrost przypadków zachorowań na listeriozę, co potwierdzają dane European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC). W latach 2006-2007 wskaźnik zachorowalności wynosił 0,35 na 100 000 (1). Podobne zjawisko obserwuje się także w Polsce. W związku z narastającym problemem, jakim jest zwiększająca się liczba zgłaszanych przypadków zachorowań na listeriozę, istnieje potrzeba szybkiego i skutecznego wykrywania, identyfikacji i różnicowania pałeczek Listeria monocytogenes, jako etiologicznego czynnika tych zakażeń. Najefektywniejszymi jak dotąd metodami subtypowania przedstawicieli tego gatunku są techniki genetyczne, wśród których jako „złoty standard” wymienia się analizę makrorestrykcyjną genomowego DNA w połączeniu z elektroforezą w zmiennym polu elektrycznym (REA – PFGE), która cechuje się dużą siłą dyskryminującą oraz powtarzalnością wyników, a dodatkowo dzięki wystandaryzowanej procedurze (REA-PFGE wg PulseNet) pozwala na międzylaboratoryjne porównywanie otrzymywanych wyników (2). Alternatywną metodą pozwalająca na znacznie szybsze typowanie pałeczek Listeria monocytogenes jest technika multipleks PCR opisana przez Doumitha i wsp. (3). Metoda ta, bazując na łańcuchowej reakcji polimerazy z jednoczesnym zastosowaniem sześciu 200 A. Kołakowska, G. Madajczak Nr 3 par starterów, w założeniu autorów pozwala zaklasyfikować izolaty pozyskane z ogniska epidemicznego do jednej z pięciu grup filogenetycznych, cechujących się występowaniem określonej kombinacji sekwencji fragmentów genów. Zgodnie z zaleceniami ECDC, technika multipleks PCR ma zastąpić klasyczną metodę serotypowania wykonywaną w celach epidemiologicznych. MATERIAŁ I METODY S z c z e p y b a k t e r y j n e . W przeprowadzonych badaniach subtypowaniu poddano 97 szczepów pałeczek Listeria monocytogenes, zgromadzonych w kolekcji Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH w latach 1998-2010, wśród których znalazły się szczepy wyizolowane z próbek żywności (52), próbek materiału klinicznego (36) oraz próbek środowiskowych (9). Do badań użyto także wzorcowych szczepów: Listeria monocytogenes CLIP 74910 oraz Listeria monocytogenes CLIP 70891. Szczepy, zawieszone w bulionie mózgowo-sercowym (BHI) z 20% dodatkiem glicerolu, przechowywano w temperaturze -70 ºC. Bezpośrednio przed rozpoczęciem badań, szczepy rozmrażano i posiewano na podłoże BHI agar. Po ocenie czystości i swoistości wyrosłych kolonii, na podstawie procedury identyfikacji szczepów pałeczek Listeria wg Madajczaka, szczepy przesiewano na podłoże BHI agar (2). R E A - P F G E . Analizę polimorfizmu długości restrykcyjnych fragmentów chromosomalnego DNA w zmiennym polu elektrycznym przeprowadzono zgodnie z zaleceniami sieci PulseNet (2, 4). DNA wszystkich badanych szczepów pałeczek Listeria monocytogenes poddano cięciu z użyciem enzymu restrykcyjnego AscI, natomiast DNA izolatów sklasyfikowanych jako ten sam klon (98% i więcej zgodności genomu) – dodatkowo z zastosowaniem enzymu ApaI. Jako wzorzec wielkości zastosowano DNA szczepu Salmonella Braenderup H9812, cięty enzymem restrykcyjnym XbaI (5, 3). Obraz rozdziału produktów REA – PFGE utrwalono przy użyciu aparatu Gel Doc II (Kucharczyk). Wyniki typowania pałeczek Listeria monocytogenes analizowane były z użyciem programu GelCompar II Version 5.10 (Applied Maths, Belgia). W analizie elektroforegramów przyjęto tolerancję pozycji prążków na poziomie 1,2. Analizę klasterową przeprowadzono metodą Dice’a. Dendrogramy dla profili PFGE uzyskanych po analizie makrorestrykcyjnej z enzymem AscI oraz połączonej analizie profili PFGE uzyskanych po analizie makrorestrykcyjnej z enzymem AscI a także ApaI wykreślono przy użyciu metody UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean). W typowaniu z użyciem enzymu restrykcyjnego AscI za szczepy nierozróżnialne tj. należące do tej samej grupy klonalnej (o tym samym profilu PFGE) uznano takie izolaty, które posiadały układ prążków o 98% poziomie zgodności (6). M u l t i p l e k s P C R . Subtypowanie metodą multipleks PCR przeprowadzono zgodnie z procedurą opracowaną przez Doumitha i wsp. (3). Produkty amplifikacji rozdzielano elektroforetycznie, a następnie układ prążków odpowiadających produktom multipleks PCR analizowano zgodnie z zaleceniami autora metody (3). S t a t y s t y c z n a a n a l i z a w y n i k ó w. Do statystycznej analizy wszystkich uzyskanych wyników zastosowano dokładny test Fishera oraz tam, gdzie było to możliwe – test Nr 3 Genotypowanie L. monocytogenes 201 chi-kwadrat. Powyższe analizy wykonano przy pomocy programu komputerowego Excel 2007 (pakiet MS Office 2007). WYNIKI Wśród izolatów pałeczek Listeria monocytogenes wyosobnionych z próbek pochodzenia klinicznego 14 (39%) stanowiły izolaty należące do grupy PCR 4B, 10 (28%) - izolaty należące do grupy PCR 1/2A, 10 (28%) - izolaty należące do grupy PCR 1/2B oraz 2 (5%) izolaty należące do grupy PCR 1/2C. W obrębie izolatów pochodzących z próbek żywności 22 (43%) izolaty należały do grupy PCR 1/2A, 13 (25%) należało do grupy PCR 4B, 9 (17%) należało do grupy PCR 1/2C, natomiast 8 (15%) należało do grupy PCR 1/2B. Izolaty z próbek środowiskowych zaklasyfikowano do następujących grup PCR: 4 (45%) w grupie PCR 1/2A, po 2 (22%) w grupach 1/2B i 1/2C oraz 1 (11%) izolat w grupie 4B (Ryc. 1). Rycina 1. Procentowy udział izolatów pałeczek Listeria monocytogenes należących od poszczególnych grup PCR, w zależności od pochodzenia próbki. A – próbki pochodzenia klinicznego; B – próbki pochodzące z żywności; C – próbki pochodzące ze środowiska. Subtypowanie izolatów Listeria monocytogenes metodą REA-PFGE z zastosowaniem restryktazy AscI, pozwoliło wyodrębnić 62 różne profile PFGE, należące do dwóch linii filogenetycznych: F I (47 izolatów) oraz F II (49 izolatów), w obrębie których wyróżniono 13 profili PFGE (zawierających łącznie 49 szczepów), grupujących dwa lub więcej izolatów. Za najbardziej liczne uznano profile PFGE oznaczone symbolami: P_04, P_05 oraz P_07, do których zaklasyfikowano odpowiednio 11 szczepów (4 pochodzące z żywności, 7 – z materiału klinicznego oraz szczep wzorcowy Listeria monocytogenes CLIP 74910), 7 oraz 5 szczepów pochodzących z żywności. Pozostałe profile PFGE reprezentowane były przez pojedyncze szczepy. Dla jednego izolatu o symbolu PZH 1/10 nie udało się ustalić profilu PFGE z użyciem restrykcyjnego enzymu AscI. Połączona analiza profili PFGE dla enzymów AscI i ApaI wykazała obecność 8 pulsotypów (P_03A, P_04A, P_04C, P_05A, P_07A, P_08A, P_13A, P_14A), z których każdy grupował dwa lub więcej szczepów (Ryc. 2). Pozostałe szczepy, które w analizie z enzymem AscI wykazały co najmniej 98% podobieństwo profili PFGE, w połączonej analizie okazały się być zróżnicowane pod względem genetycznym (poziom podobieństwa niższy, niż 98%). W analizie tej również stwierdzono obecność dwóch linii filogenetycznych F I i F II (Ryc. 2). A. Kołakowska, G. Madajczak Rycina 2. Dendrogram obrazujący filogenetyczne pokrewieństwo szczepów pałeczek Listeria monocytogenes, na podstawie połączonej analizy profili PFGE dla enzymów AscI i ApaI. Na rycinie zaznaczono pulsotypy grupujące więcej niż jeden szczep, wraz z podaniem ich nazwy. 202 Nr 3 Nr 3 Genotypowanie L. monocytogenes 203 Analiza korelacji pomiędzy grupą PCR, a pulsotypem szczepu wykazała obecność takiej zależności jedynie w przypadku najliczniejszego pulsotypu P_05A. Wszystkie szczepy zaliczane do tego pulsotypu należały do grupy PCR 4B. Pulsotypy P_03A oraz P_13A składające się ze szczepów o tej samej grupie PCR (odpowiednio 1/2B i 1/2C), nie mogły być analizowane w ten sposób, ze względu na zbyt małą liczebność grup (po 2 szczepy każda). Pozostałe pulsotypy składały się ze szczepów należących do różnych grup PCR. DYSKUSJA Metody oparte na wiedzy, jakiej dostarcza biologia molekularna, zrewolucjonizowały typowanie szczepów dla potrzeb analizy ognisk epidemicznych, jak i zachorowań sporadycznych. Jak podkreślają Wagner i Allerberger oraz inni autorzy, w przypadku pałeczek Listeria monocytogenes do najczęściej stosowanych metod zalicza się techniki makrorestrykcyjnej analizy genomowego DNA przy zastosowaniu enzymów AscI i ApaI (REA-PFGE) oraz multipleks PCR (7). Pierwsza nich uważana jest za „złoty standard” genotypowania szczepów pałeczek L. monocytogenes, głównie ze względu na powtarzalność wyników oraz dużą siłę dyskryminującą. Druga zaś stanowi alternatywę dla klasycznego serotypowania pałeczek Listeria monocytogenes opartego na aglutynacji somatycznych i rzęskowych antygenów ze swoistymi przeciwciałami. W prezentowanej pracy powyższymi metodami przeprowadzono typowanie 97 szczepów pałeczek Listeria monocytogenes. W grupie tej znalazły się izolaty pochodzące z próbek żywności, próbek środowiskowych, jak i izolaty z próbek pochodzących ze sporadycznych przypadków zachorowań na listeriozę. Izolaty pochodziły z różnych regionów Polski i izolowane były przez okres kilkunastu ostatnich lat. Przeprowadzone badania genotypowania metodą REA-PFGE, wykazały znaczne zróżnicowanie genetyczne szczepów pałeczek Listeria monocytogenes użytych do badań. Wynik ten prawdopodobnie spowodowany jest znacznym zróżnicowaniem pochodzenia szczepów z kolekcji. W przypadku próbek klinicznych, szczepy pochodziły ze sporadycznych przypadków – nie zaś z ognisk epidemicznych zakażeń pałeczkami L. monocytogenes. Ponadto, zarówno próbki środowiskowe, jak i próbki żywności w większości nie były powiązane epidemiologicznie. Podobne wyniki uzyskali w swoich badaniach Revazishvili i wsp. (8), którzy wśród 175 przebadanych metodą REA-PFGE izolatów pałeczek L. monocytogenes, pochodzących z próbek różnorodnego materiału, wyodrębnili 57 profili PFGE. Niemniej, przeprowadzone analizy wśród przebadanych szczepów pozwoliły na wykazanie obecności 8 pulsotypów charakterystycznych dla więcej niż jednego szczepu każdy. Najbardziej liczny z nich – oznaczony symbolem P_05A grupuje 6 szczepów pałeczek L. monocytogenes wyizolowanych z próbek żywności w 2000 roku w Akademii Rolniczej w Szczecinie. Może to świadczyć o wspólnym pochodzeniu szczepów zaklasyfikowanych do tego pulsotypu. Niemniej jednak brak wyczerpujących informacji na temat przebadanego materiału, nie pozwala na wyciągnięcie bardziej szczegółowych wniosków. Pozostałe pulsotypy w większości przypadków grupowały izolaty pochodzące z tego samego rodzaju materiału (P_04A, P_07A, P_08A – próbki żywności; P_03A, P_14A – próbki środowiskowe). Wyjątek stanowiły pulsotypy P_04C i P_13A, do których zaklasyfikowano zarówno izolaty z próbek materiału klinicznego, jak i żywności. 204 A. Kołakowska, G. Madajczak Nr 3 W ramach bieżących badań typowano metodą REA-PFGE pałeczki Listeria monocytogenes pochodzące z Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego – Oddziału Chłodnictwa i Jakości Żywności w Łodzi (szczepy oznaczone symbolem CLCH). Z każdej próbki żywności izolowano 2 lub 3 kolonie tych drobnoustrojów. Podobna sytuacja miała miejsce dla 6 szczepów (PZH 8/04/A, /B, /C oraz PZH 2/04/A, /B, /C) wyizolowanych z próbek materiału klinicznego pochodzących od dwóch pacjentów (po trzy izolaty od jednego pacjenta z różnych próbek). Celem tego działania była ocena możliwości występowania więcej niż jednego szczepu, tj. izolatów o różnym profilu PFGE w jednej badanej próbce. Sytuację taką stwierdzono w 3 na 5 analizowanych przypadków. Na przykład izolaty oznaczone symbolami CLCH 180/2, CLCH 180/3, zaklasyfikowano do pulsotypu P_04A, a izolat CLCH 180/1 pochodzący z tej samej próbki żywności – zaklasyfikowano do pulsotypu P_04B. Wszystkie trzy izolaty wykazywały 100% podobieństwo profili PFGE dla enzymu AscI oraz 90% podobieństwo dla wspólnej analizy profili dla obu enzymów. Zgodnie z zasadami ustalonymi przez Tenovera i wsp., dwa pierwsze izolaty należy traktować jako jeden klon natomiast trzeci – jako blisko spokrewniony (6). Podobnie rzecz miała się w przypadku izolatów oznaczonych symbolami CLCH 182/1 i CLCH 182/2 zaliczonych odpowiednio do pulsotypów P_01A i P_01B, wykazujących 89% poziom podobieństwa. Spostrzeżenie to bezspornie wskazuje na konieczność pobierania co najmniej trzech izolatów z posiewu jednej próbki żywności, zwłaszcza w przypadku prowadzenia dochodzenia epidemiologicznego w ognisku. Tylko takie postępowanie da możliwość wiarygodnego wykazania powiązań lub ich braku pomiędzy izolatami pozyskanymi w toku opracowywania ognisku z próbek żywności i od zakażonych osób. Podobnej analizy dokonano w przypadku 8 szczepów wyizolowanych w roku 2000 z próbek wody pochodzących z rzeki Odra. Wśród badanych szczepów wyodrębniono 2 pulsotypy liczące po 2 szczepy każdy – (pulsotyp P_03A ze szczepami PZH 1113 i PZH 1115 oraz pulsotyp P_14A ze szczepami PZH 1120 oraz PZH 1121). Cztery pozostałe szczepy nie zostały zaliczone do żadnego z pulsotypów, które grupowałyby więcej niż jeden szczep o tym samym profilu PFGE (były zróżnicowane genetycznie). Biorąc pod uwagę pochodzenie próbek (próbki środowiskowe) i różnorodność ekosystemu wodnego – zróżnicowanie genetyczne szczepów wyizolowanych z tego typu materiału jest naturalne. W przeciwieństwie do sytuacji opisywanej uprzednio, izolaty pochodzące z próbek żywności oznaczone symbolami CLCH 183/1 (/2, /3) zostały zaklasyfikowane do jednego pulsotypu P_08A, co oznacza, iż są to trzy izolaty tego samego szczepu. Podobnie ma się rzecz z izolatami o symbolach PZH 8/04/A (/B, /C) pochodzącymi od jednego pacjenta. Zostały one zaklasyfikowane jako jeden pulsotyp P_04C. W trakcie badań metodą REA-PFGE szczególną trudność sprawił szczep PZH 1/10, dla którego nie uzyskano profilu PFGE w analizie makrorestrykcyjnej z użyciem enzymu AscI. Najbardziej prawdopodobną przyczyną tego stanu rzeczy było wytwarzanie przez ten szczep swoistej endonukleazy, aktywowanej w buforze zalecanym przez producenta enzymu AscI – bufor „Tango” (Fermentas). Potwierdzeniem tej hipotezy jest uzyskanie profilu PFGE dla enzymu ApaI. Enzym ten, zgodnie z zaleceniami producenta (Fermentas), do optymalnego działania wymaga buforu „B”, którego skład znacząco różni się od składu buforu „Tango”. Różnica w składzie obu buforów jest na tyle istotna, iż bufor „B” nie aktywuje swoistej endonukleazy, której działanie uniemożliwia uzyskanie produktów analizy makrorestrykcyjnej szczepu z enzymem AscI. Nr 3 Genotypowanie L. monocytogenes 205 Kolejną metodą wykorzystaną do analizy szczepów w bieżących badaniach było oznaczenie grupy PCR metodą multipleks PCR. Metoda ta, jak zaznacza Almeida i wsp. (9), sama w sobie ma niewielką siłę dyskryminującą, gdyż ogranicza klasyfikację badanych szczepów do pięciu odrębnych grup PCR, z których każda odpowiada kilku serotypom. W publikacjach innych autorów w odniesieniu do określenia „grupa PCR” stosuje się pojęcie „geno-serotyp”. Zdaniem Almeida i wsp. (9), jak też autorów niniejszej pracy, zastosowanie określenia „geno-serotyp” jest nieuprawnione ze względu na brak związku metody, a także uzyskiwanego wyniku, z jakimkolwiek serologicznym odczynem. Niemniej metoda ta, w przypadku wystąpienia ogniska epidemicznego, jest równie przydatna, jak tradycyjne metody serotypowania opisane przez Seeligera i Hohne, ponadto swykonanie badania oznaczenia grupy PCR jest zdecydowanie szybsze i mniej pracochłonne. Rozpoznanie typu serologicznego / grupy PCR jest dość istotne, ze względu na zróżnicowaną chorobotwórczość poszczególnych serotypów dla człowieka. Według badań przeprowadzonych przez Farbera i Peterkina oraz Schuchat i wsp., najczęściej izolowanymi z przypadków listeriozy u ludzi typami serologicznymi były: 4b, 1/2a oraz 1/2b, które należą odpowiednio do grup PCR 4B, 1/2A oraz 1/2B (10, 11). Zastosowanie dokładnego testu Fishera w odniesieniu do uzyskanych wyników wykazało, iż różnice w występowaniu poszczególnych grup PCR w obrębie szczepów pochodzących z próbek materiału klinicznego i szczepów wyizolowanych z próbek żywności, są na granicy istotności statystycznej. Brak istotności statystycznej zaobserwowanych różnic spowodowany jest między innymi zbyt małą liczebnością analizowanych grup. Nie mniej w odniesieniu do uzyskanych wyników można zastosować uproszczoną analizę wartości względnych w obrębie grup szczepów wyróżnionych ze względu na ich pochodzenie. W bieżących badaniach stwierdzono, że najczęściej izolowana z materiału klinicznego jest grupa PCR 4B, co pozwala wnioskować, iż badane izolaty, z dużym prawdopodobieństwem, należały do serotypu 4b. Wynik ten jest zgodny z doniesieniami innych autorów (10, 11, 12). W przeciwieństwie do badań Neves i wsp. (12) wśród badanych szczepów nie stwierdzono występowania izolatów należących do grupy PCR 4A (odpowiadającej serotypom 4a i 4c). Analogiczne wyniki typowania metodą multipleks PCR pałeczek Listeria monocytogenes uzyskali w swojej pracy Madajczak i Majczyna, a także Chen i wsp. (13, 14). Prawdopodobnym powodem braku przedstawicieli tej grupy PCR wśród przebadanych izolatów jest znacząco rzadsze występowanie pałeczek L. monocytogenes należących do grupy 4A (3). Wyniki badań przeprowadzonych przez Almeida i wsp. (9), jak również innych badaczy pokazały istnienie korelacji pomiędzy grupą PCR pałeczek L. monocytogenes, a ich profilem PFGE czy też pulsotypem. W bieżących badaniach korelacja ta została zauważona w jednym przypadku. W dwóch dalszych przypadkach, również zaobserwowano występowanie wspólnej grupy PCR (pulsotyp P_03A oraz P_13A) w obrębie jednego pulsotypu. Jednak liczebność tych grup (po dwa szczepy) nie pozwala na doszukiwanie się wspomnianego związku. Podobne wyniki, dotyczące zależności genotypu i grupy PCR zaobserwowano w przypadku szczepów o profilach genetycznych zbieżnych na poziomie 85%. W czterech na dziewięć wyróżnionych na tym poziomie zgodności subtypów PFGE zaobserwowano przynależność do tej samej grupy PCR (2 subtypy zaklasyfikowano do grupy PCR 4B, po jednym subtypie do grupy PCR 1/2A oraz 1/2C). Techniką multipleks PCR badano również izolaty wyosobnione z tej samej próbki. Analiza tychże izolatów pozwoliła zauważyć różnice w ich przynależności do grupy PCR. 206 A. Kołakowska, G. Madajczak Nr 3 W przypadku szczepu 2/04 z izolatami A, B i C, stwierdzono przynależność dwóch z nich do grupy PCR 1/2A, natomiast trzeci zaliczono do grupy PCR 1/2C. W bieżących badaniach zauważono korelację pomiędzy pochodzeniem próbki, z której wyizolowano badany szczep, a linią filogenetyczną, do której szczep zaliczono. Zastosowanie testu chi-kwadrat, wykazało iż istnieje statystycznie istotne zróżnicowanie cechy przynależności do linii filogenetycznej w obrębie grupy szczepów pochodzących z materiału klinicznego oraz grupy szczepów wyizolowanych z próbek żywności. Dla pierwszej grupy charakterystyczna jest przynależność do linii filogenetycznej FI, natomiast dla szczepów pochodzących z żywności – przynależność do linii filogenetycznej FII. Może to świadczyć o tym, iż szczepy izolowane z próbek żywności są odległe genetycznie od szczepów izolowanych z próbek materiału klinicznego. W obrębie szczepów środowiskowych niemożliwe było przeprowadzenie takiej analizy, ze względu na zbyt małą liczebność tej grupy (9 szczepów). Artykuł ten stanowi fragment pracy magisterskiej pod tytułem „Genotypowanie metodą REA – PFGE szczepów pałeczek Listeria monocytogenes izolowanych z próbek materiału klinicznego, próbek środowiskowych i próbek żywności” autorstwa mgr Agnieszki Kołakowskiej, wykonanej w Zakładzie Bakteriologii NIZP-PZH w latach 2009-10. A. K o ła k o w s k a , G. Ma da j c z a k Genotyping by REA-PFGE of Listeria monocytogenes isolated from clinical, environmental and food samples SUMMARY Listeria monocytogenes strains isolated from clinical food and environmental samples were genotyped by Restriction Enzyme Analysis with Pulsed Field Gel Electrophoresis (REA - PFGE) using ApaI and AscI enzymes according to PulseNet Europe procedure. Analysis of DNA fragments profiles obtained by AscI digestion demonstrated presence of 62 REA-PFGE profiles grouped in 2 lineages (FI, FII). Diversity of strains source among both lineages was observed. Statistical analysis showed, that strains isolated from clinical samples more frequently are included to lineage FI, then lineage FII. Non-clinical strains were more frequently included to lineage FII. Combined analysis of REA-PFGE profiles for ApaI and AscI enzymes showed 8 unique pulsotypes characteristic for two or more L. monocytogenes isolates.Moreover researched L. monocytogenes strains were analyzed by multiplex-PCR according Doumith et al methodology. PCR-group 4B was most frequent among strains isolated from clinical samples. Correlation between PCR-group and pulsotype was observed only in few cases. PIŚMIENNICTWO 1. European Centre for Disease Prevention and Control. Annual epidemiological report on communicable diseases in Europe. Listeriosis. 156-61, 2008; 105-7, 2009. Nr 3 Genotypowanie L. monocytogenes 207 2. Madajczak G. Ocena przydatności wybranych metod genotypowania pałeczek Listeria monocytogenes. Med Dośw Mikrobiol 2006; 58: 329 – 37. 3. Doumith M, Buchrieser C, Glaser P i inni. Differentiation of the Major Listeria monocytogenes Serovars by Multipleks PCR. J Clin Microbiol 2004; 42: 3819-22. 4. www.pulsenet-europe.org/docs.htm 5. Hunter SB, Vauterin P, Lambert-Fair MA i inni. Establishment of a universal size standard strain for use with the PulseNet standardized pulse-field gel electrophoresis protocols: Converting the National Databases to the new size standard. J Clin Microbiol 2005; 43: 1045-50. 6. Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV i inni. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 1995; 33: 2233–9. 7. Allerberger F, Wagner M. Listeriosis: a resurgent foodborne infection. Clin Microbiol Infect 2010; 16: 16-23. 8. Revazishvili T, Kotetishvili M, Stine CO i inni. Comparative Analysis of Multilocus Sequence Typing and Pulse-Field Gel Electrophoresis for Characterizing Listeria monocytogenes Strains Isolated from Environmental and Clinical Sources. J Clin Microbiol 2004; 42: 276-85. 9. Almeida G, Morvan A, Magalhaes R i inni. Distribution and characterization of Listeria monocytogenes clinical isolates in Portugal, 1994–2007. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2010; (Epub ahead of print). 10. Farber JM, Peterkin PI. Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen. Microbiol Rev 1991; 55: 752-881. 11. Schuchat A, Swaminathan B, Broome CV. Epidemiology of human listeriosis. Clin Microbiol Rev 1991; 4: 169-83. 12. Neves E, Lourenco A, Silva AC i inni. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) analysis of Listeria monocytogenes isolates from different sources and geographical origins and representative of the twelve serovars. Syst Appl Microbiol 2008; 31: 387-92. 13. Madajczak G, Majczyna D. Serologiczne typowanie i genoserotypowanie pałeczek Listeria monocytogenes izolowanych z próbek materiału klinicznego, próbek żywności i próbek środowiskowych. Med Dośw Mikrobiol 2009; 61: 79-85. 14. Chen J, Luo X, Jiang L i inni. Molecular characteristics and virulence potential of Listeria monocytogenes isolates from Chinese food systems. Food Microbial 2009; 26: 103-11. Otrzymano: 28 VI 2011 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH
