Wzrost mikroorganizmów na uniwersa
advertisement
PODŁOśA MIKROBIOLOGICZNE Wzrost mikroorganizmów na uniwersalnym podłoŜu stałym Escherichia coli i Micrococcus luteus podstawowe cechy podłoŜy: • źródło pierwiastków biogennych • o odpowiednim pH, izotoniczne • klarowne • STERYLNE poŜywka mikrobiologiczna moŜe być: • uniwersalna • wybiórcza • róŜnicująca • płynna • półpłynna (0.6% agar-agar) • stała (2% agar-agar) MoŜemy odróŜnić te bakterie na uniwersalnym podłoŜu, gdyŜ jedna z nich, Micrococcus luteus, wytwarza Ŝółty barwnik Określanie ilości mikroorganizmów – posiew na podłoŜe stałe PodłoŜa róŜnicujące – podłoŜe MacConkey’a Na tym podłoŜu bakterie fermentujące laktozę (Escherichia coli) produkują kwasy organiczne, indykator pH zmienia kolor i bakterie te rosną w postaci czerwonych kolonii Bakterie nie fermentujące laktozy (Salmonella enteritidis) rozkładają pepton obecny w podłoŜu bez zmiany pH i rosną w postaci Escherichia coli i Salmonella enteritidis białych kolonii Trzeba jednak pamiętać, Ŝe • w skład mikroflory dorosłego człowieka wchodzi ponad 400 gatunków mikroorganizmów, z których 60% nie umiemy hodować w laboratorium hodowla bakterii rozcieńczenie 9 ml bulionu 1 ml próbki na płytki zbyt duŜo bakterii do policzenia liczba kolonii Zalety bycia niewielkim • szybsza wymiana substancji odŜywczych i szkodliwych produktów metabolizmu • większe tempo wzrostu • większe rozmiary populacji • większa zdolność akumulacji mutacji – szybsza adaptacja do zmieniającego się środowiska • w laboratorium umiemy hodować tylko około 5% mikroorganizmów obecnych w środowisku Istnieje jednak dolna granica wielkości komórki około 0.2 µm 1 spora pseudogrzybnia substratowa UKŁADY KOMÓREK pseudogrzybnia powietrzna przegrody ze sporami Przemiana pokoleń – Myxobacteriae Przemiana pokoleń – Streptomyces coelicolor Przemiana pokoleń – Caulobacter sp. komórka ruchliwa tworzenie ciała owocowego myksospory komórka osiadła agregacja kiełkowanie głodzenie Quorum sensing (wyczuwanie liczebności) Przemiana pokoleń– Anabena sp. Przemiana pokoleń – Bdelovibrio sp. • komórki wegetatywne wiąŜą CO2 dostarczają organiczne źródło węgla uwolnienie nowych komórek potomnych błona (CM) CM CM CM przestrzeń peryplazmatyczna • heterocysty wiąŜą N2 dostarczają NH3 jako glutaminy zróŜnicowanie komórek jak u organizmów wielokomórkowych 2 Lipidy błonowe u bakterii Budowa komórki prokariotycznej • kwasy tłuszczowe nierozgałęzione, • rzadko wielonasycone • brak steroli, są hopanoidy błona cytoplazmatyczna wiązanie estrowe cholesterol cytoplazma i rybosomy ściana komórkowa nukleoid hopanoid wiązanie ETEROWE i archae Lipidy u archae • brak kwasów tłuszczowych • są alkohole poliizoalkilowe, często rozgałęzione • czasem obecne sterole Peptydoglikan (mureina) u bakterii N-acetyloglukozamina kw.N-acetylo muraminowy (β β1,4) dwuwarstwa dwuetery glicerolu Tworzy rodzaj siatki wokół komórki L-alanina czteroetery diglicerolu kw. D-glutaminowy Archae: pseudomureina • wiązanie (β β1,3) • brak form D aa kw. mezo-diamino pimelinowy D-alanina monowarstwa peptydoglikan Ściana komórkowa bakterii gramdodatnich Struktura i funkcje kwasów tejchojowych błona cytoplazmatyczna białka związane ze ścianą komórkową • polisacharydy o negatywnym ładunku kwasy tejchojowe kwasy lipotejchojowe • nadają komórce negatywny ładunek (ochrona przed toksycznymi związkami hydrofobowymi) peptydoglikan • wiąŜą dwuwartościowe jony (Ca2+ i Mg2+) błona cytoplazmatyczna 3 błona zewnętrzna peptydoglikan Ściana komórkowa bakterii gramujemnych Lipopolisacharyd (LPS) błona cytoplazmatyczna łańcuch O-specyficzny poryna rdzeń lipid A LPS błona zewnętrzna lipoproteina przestrzeń peryplazmatyczna peptydoglikan błona wewnętrzna Błona zewnętrzna bakterii gramujemnych jest asymetryczna Barwienie Grama zalewamy utrwalony preparat fioletem krystalicznym na 1 minutę • wewnętrzna warstwa składa się z fosfolipidow • zewnętrzna warstwa zbudowana jest głównie z lipopolisacharydu (LPS) dodajemy płynu Lugola na 1 minutę lipopolisacharyd odbarwiamy etanolem fosfolipidy dobarwiamy fuksyną przez 30 sekund fosfolipidy kierunek ruchu losowy Escherichia coli (G-) i Staphylococcus aureus (G+) Chemotaksja Zmiana kierunku ruchu – urzęsienie peritrichalne obrót rzęsek w prawo „koziołkowanie” ATRAKTANT obrót rzęsek w lewo ruch komórki obrót rzęsek w lewo ruch komórki nowy kierunek ruchu jest przypadkowy ukierunkowany ruch • czas ruchu w kierunku atraktanta dłuŜszy • czas ruchu w kierunku przeciwnym do atraktanta krótszy 4 Synteza rzęski bakteryjnej Typy urzęsienia flagelina Gram + Powstawanie endospory Gram - komórka wegetatywna sporulująca komórka dojrzała endospora miejsce inicjacji replikacji Replikacja DNA u Eukaryota - wielopunktowa Replikacja DNA u Prokaryota – jednopunktowa (struktura theta) miejsca inicjacji replikacji widełki replikacyjne nowo syntezowany DNA bąbelki replikacyjne Archae • niektóre posiadają 2 aktywne • miejsca inicjacji replikacji 5 Fazy wzrostu populacji bakteryjnej Podział komórki bakteryjnej wzrost – zwiększenie liczby komórek w populacji • z jednej komórki powstają dwie identyczne (jedno pokolenie) wykładnicza lag zamierania stacjonarna przegroda • czas podziału róŜny minimum 20 minut dla E. coli gęstość optyczna liczba Ŝywych komórek czas Hodowla okresowa – fazy wzrostu • faza lag – czas potrzebny komórkom na adaptację do nowych warunków środowiska; bardzo wolny wzrost populacji • faza wykładnicza – większość komórek w populacji dzieli się dając początek dwóm komórkom; faza najszybszego, równomiernego wzrostu • faza stacjonarna – wzrost spowalnia się w miarę wyczerpania ilości składników odŜywczych i nagromadzenia toksycznych produktów przemiany materii; niektóre komórki giną, więc ilość komórek w populacji jest stała Faza stacjonarna • najczęściej występuje w środowisku • komórki znajdują się w odmiennym stanie fizjologicznym podobnym do stanu komórek rosnących pod postacią BIOFILMU (wolne tempo wzrostu, duŜa odporność na niekorzystne warunki środowiska) • faza zamierania – wzrost ustaje; coraz więcej komórek w populacji obumiera FtsZ – homolog tubuliny MreB, Mbl, ParM – homologi aktyny • homologia ok.15% na poziomie sekwencji aminokwasów • podobieństwo struktury trzeciorzędowej • homologia 10-18% na poziomie sekwencji aminokwasów • podobieństwo struktury trzeciorzędowej • polimeryzacja zaleŜna od GTP • występuje: • u większości bakterii i archae • u eukaryota w plastydach • w mitochondriach niektórych eukaryota • polimeryzacja zaleŜna od ATP • rola: rozdział DNA plazmidowego i chromosomowego determinacja kształtu komórki 6 Wielkość genomu Eukaryota • 3 000 kb (2000) mikrosporidia • 12 000 (6000) Saccharomyces cerevisiae • 3 000 000 kb (30-35 tys) człowiek Prokaryota • 600 kb (500) Mycoplasma sp. • 4700 kb (4000) Escherichia coli • 8000 kb (8000) Mezorhizobium loti • maksymalnie 12 000 kb ok. 40% OFR o funkcji nieznanej Mycobacterium tuberculosis zawartość GC 26% 76% Mycoplasma sp. Micrococcus sp. Ilość róŜnych chromosomów w komórce •Vibrio sp. 2 •Agrobacterium sp. 3 Borelia burgdorferii 1 chromosom liniowy 5 plazmidów • 3 liniowe (160-500 kb) • 2 koliste (270 i 300 kb) Rhodobacter sphaeroides chromosom I (3 045 kb) chromosom II (914 kb) 4 plazmidy po 100 kb 1 plazmid 42 kb Ilość kopii chromosomu w komórce •Escherichia coli maks. 4 •Azotobacter vinelandii 4-40, maks. 80 •Methanococcus sp. 3-15 Eukaryota 1n, 2n do 500 w niektórych tkankach roślin Chromosom bakteryjny – kolisty Chromosom Eukaryota otwarte koło superskręcone u Archae liniowe: •Borelia sp. •Streptomyces sp. •Agrobacterium sp. (1 liniowy i 1 kolisty) •homologi histonów H1, H3 i H4 • tetramery histonowe tworzą nukleosom białka superskręcona domena • brak „ogonków” histonowych • występują warianty histonów Liczenie bakteriofagów 3 drogi wymiany informacji genetycznej u Prokaryota: • transdukcja – bakteriofagi wylewamy mieszankę bakterii i bakteriofaga na plytkę z poŜywką dla bakterii • koniugacja – plazmidy koniugacyjne • transformacja – bezpośrednio ze środowiska inkubujemy w cieplarce przez noc 3% genów wolno Ŝyjących bakterii pochodzi od Archae lub Eukaryota nawet do 24% genów u bakterii hypertermofilnych pochodzi od hypertermofilnych Archae łysinki na murawie rosnących bakterii obserwujemy „łysinki” 7 Cykl lizogenny (infekcja) – bakteriofag λ Cykl lityczny – bakteriofag T4 cząstka fagowa cząstka fagowa cykl lityczny cykl lizogennyy cząstka transdukująca cząstka transdukująca homologiczna rekombinacja integracja faga do genomu biorcy integracja DNA do genomu biorcy profag do komórek biorcy przekazywany jest dowolny fragment genomu dawcy transdukcja ogólna podział komórki lizogennej komórka lizogenna Cykl lizogenny (indukcja) – bakteriofag λ Koniugacja INDUKCJA często rzadko • część DNA dawcy (czerwony) wydziela się wraz z DNA faga • plazmid wolny w cytoplazmie • plazmid wbudowany w chromosom • przekazywany DNA plazmidu tzw. szczepy Hfr • przekazywany DNA chromosomu bakterii • namnaŜanie cząsteczek transdukujących • do następnych komórek przekazywane zawsze te same fragmenty DNA dawcy transdukcja specyficzna Koniugacja DAWCA plazmid • jedna nić DNA plazmidu nacinana i przekazywana do biorcy • komplementarna nić DNA dosyntezowywana zarówno u biorcy jak i dawcy pilus BIORCA chromosom • plazmid wbudowany w chromosom tzw. szczepy Hfr • do dawcy przekazywane są geny chromosomowe • geny plazmidowe przechodzą na końcu Gen C przekazywany pierwszy CW • po transferze OBIE komórki zawierają cząsteczkę plazmidu Gen L przekazywany pierwszy CCW Gen X przekazywany pierwszy CW Gen C przekazywany pierwszy CCW 8 Koniugacyjna mapa chromosomu E.coli Transformacja • komórka dawcy DNA obumiera • DNA uwalniany jest do środowiska • komórka kompetentna pobiera DNA do swego wnętrza geny z jednej komórki są przekazywane do drugiej bez kontaktu komórek i bez pośrednictwa wirusów • nie wszystkie gatunki bakterii mogą pobierać DNA ze środowiska • stan kompetencji moŜna wywołać sztucznie w laboratorium Quorum sensing – wykrywanie liczebności Transformacja - Bacillus subtilis •kompetencja indukowana przez dwa feromony 9-10 aa oligopeptyd pentapeptyd •pobierana jedna nić DNA, druga degradowana produkcja autoinduktora wykrywanie autoinduktora indukcja transkrypcji wydzielanie efektorów • enzymów, • antybiotyków, • sideroforów peptydy laktony homoserynowe Trends in Microb. (2002) 10: 365 Adaptacja komórek Bacillus sp. do zmiennych warunków środowiska Prokaryota Eukaryota stan represowany stan wyciszenia STAN PODSTAWOWY NIERESTRYKCYJNY Pro• promotory silne • regulacja przez represję • ruch i chemotaksja • wydzielanie enzymów degradacyjnych • wydzielanie antybiotyków • stan kompetencji, pobieranie DNA • sporulacja Eu• promotory słabe • regulacja przez aktywację (zmiana struktury chromatyny) RESTRYKCYJNY stan przygotowania stan aktywny 9 Homologiczna rekombinacja a naprawa DNA Naprawa DNA przed rozpoczęciem replikacji DNA • naprawa bezpośrednia (np. fotoreaktywacja) • wycięcie nukleotydu • wycięcie odcinka DNA pojedyncza nić łączy się z siostrzaną chromatydą po rozpoczęciu replikacji DNA • rekombinacja homologiczna • niehomologiczne łączenie końców • mismatch wymiana nici uszkodzenia DNA często powodują zaburzenie struktury helisy kompleks polimerazy nie jest w stanie ominąć takiego miejsca i oddysocjowuje od tak odkształconej matrycy rozszerzanie się połączenia replikacja zostaje wznowiona kilkanascie nukleotydów dalej – w nowej nici powstają przerwy Naprawa DNA na drodze homologicznej rekombinacji Rola mediatorów • resekcja końców usuwanie białek wiąŜących jednoniciowy DNA • tworzenie nukleofilamentu przez Rad51 (RecA) • Rhp52 • Rhp55 i Rhp57 • poszukiwanie homologii • tworzenie pętli D mediator rekombinaza (Rhp51, RecA) • synteza DNA • rozdział produktów rekombinacji PNAS (1999) 96: 10684 PNAS (2001) 98: 8419 PNAS (2001) 98: 8411 Gen. Dev. (2004) 18: 602 Naprawa DNA poprzez uszkodzenie - mutagenna Regulon SOS represowany LexA polV kompleks UmuD’2C aktywny RecA • naprawa DNA wycięcie nukleotydów, homologiczna - wierna poprzez uszkodzenie – mutagenna • zahamowanie podziałów komórkowych • apoptoza (kolicyny A, E1) 10 Antybiotyki – mechanizm działania Antybiotyki – spektrum działania prątki Gram - Gram + chlamydie riketsje hamowanie syntezy ściany komórkowej penicylina, wankomycyna zakłócenie funkcji błony komórkowej polimyksyny ściana komórkowa błona komórkowa penicyliny tobramycyna sulfonamidy cefalosporyny streptomycyna hamowanie syntezy kwasów nukleinowych chinolowe (replikacja) rifamycyna (transkrypcja) hamowanie syntezy białka streptomycyna, erytromycyna, tetracyklina, chloramfenikol tetracykliny izonazid polimyksynyny antymetabolity sulfonamidy, trimetoprim Degradacja polimerów zewnątrzkomórkowa proteazy – Bacillus, Clostridium, Proteus, Pseudomonas spp. alkaliczne, neutralne, kwaśne specyficzne (np. typu reniny) i niespecyficzne nukleazy deoksyrybonukleazy – Clostridium sp., Staphylococcus aureus, hemolityczne paciorkowce rybonukleazy – Bacillus subtilis, Penicillium citrinum (RNazaP) lipazy enzymy degradujące polisacharydy fermentacje Rola: • patogenność • biotechnologia enzymy lub produkty ich działania oddychanie Fosforylacja oksydacyjna – róŜnice w potencjale oksydoredukcyjnym Fosforylacja oksydacyjna – łańcuch oddechowy • w wyniku transportu elektronow na łańcuchu oddechowym i wyrzucaniu H+ na zewnatrz komórki powstaje potencjał w poprzek błony para red-ox fumaran bursztynian • zredukowany NADH zostaje zregenerowany do NAD+ • ATP powstaje pośrednio, w wyniku działania ATP-az błonowych, wnikanie H+ do wnętrza komórki dostarcza energii 11 rozmieszczenie elementów łańcucha w błonie cytoplazmatycznej mitochondria E.coli Paracoccus denitryficans Micrococcus luteus ODDYCHANIE AZOTANOWE (dysymilacyjna redukcja azotanów) 1. denitryfikacja - Bacillus, Pseudomonas spp., Paracoccus denitrificans glu + 4.8 NO3- + 4.8 H+ → 6 CO2 + 2.4 N2 + 8.4 H2O Go’ = -2669 kJ (-638 kcal) dla porównania: glu + 6O2 → 6 CO2 + 6H2O Fosforylacja substratowa • ATP powstaje bezpośrednio, sprzęŜone jest z utlenianiem substratu • powstaje zredukowany NADH Go’ = -2870 kJ (-686 kcal) część wykorzystywana do biosyntezy 2. Escherichia coli, Klebsiella sp., Staphylococcus sp. glu + 12 NO3- → 6 CO2 + 12 NO2 - + 6 H2O Go’ = -1766 kJ (-422 kcal) część musi być zregenerowana by odnowić pulę NAD+ do utleniania następnych cząsteczek substratu u niektórych mikroorganizmów z tej grupy zachodzi proces: glu + 3 NO3- + 3 H+ → 6 CO2 + 3 NH3 + 3 H2O Go’ = -1796 kJ (-429 kcal) Rozkład glukozy do pirogronianu HMP EMP ED • brak energizacji błony komórkowej DEKARBOKSYLACJA PIROGRONIANU 1. Eukaryota, bakterie tlenowe pirogronian + CoA + NAD+ → acetylo-CoA + NADH + H+ + CO2 (kompleks dehydrogenazy pirogronianu) 2. Archebakterie, bakterie beztlenowe pirogronian + CoA + 2Fd → acetylo-CoA + 2FdH + CO2 (oksydoreduktaza pirogronianu) U Archaebacteriae zamiast ferredoksyny (Fd) występuje koenzym F420. 3. Fermentacja mieszana pałeczek jelitowych pirogronian + CoA → acetylo-CoA + mrówczan (liaza pirogronianowa) 4. Fermentacja alkoholowa droŜdŜy i Zygomonas sp. pirogronian → acetaldehyd + CO2 (dekarboksylaza pirogronianu) 5. Bacillus sp., Enterobacteriaceae 2 cz. pirogronianu → acetomleczam + CO2 (syntaza acetomleczanu) 12 Homofermentacja mlekowa Znaczenia słowa FERMENTACJA 1. KaŜdy proces, tlenowy lub beztlenowy, w którym na duŜą skalę wykorzystuje się hodowlę mikroorganizmów. 2. KaŜdy proces biologiczny zachodzący pod nieobecność tlenu. 3. Psucie się poŜywienia. 4. Produkcja napojów alkoholowych. 5. UŜywanie organicznego substratu jako dawcy i akceptora elektronów. 6. UŜywanie organicznego substratu jako czynnika redukującego i tego samego, częściowo rozłoŜonego organicznego substratu jako czynnika utleniającego (akceptora elektronów). 7. Wzrost zaleŜny od fosforylacji na poziomie substratu. FERMENTACJA MLEKOWA Udział mikroorganizmów w przetwarzaniu mleka homofermentacja kefir Lactococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Saccharomyces spp. jogurt Streptococcus thermophilus, L.bulgaricus masło Lactococcus diacetylactis, Leuconostoc cremoris glukoza → 2 cz. mleczanu (Lactobacillus lactis, L.delbrueckii, L. bulgaricus, L.casei, Streptococcus faecalis, S.cremoris, S.lactis, Pediococcus damnosus) sery heterofermentacja glukoza → mleczan + etanol + CO2 (Lactobacillus brevis, L.fermentum, Leuconostoc mesenteroides, L.dextranicum) szlak bifidum Roquefort L.lactis, L.cremoris, Penicillium roqueforti Camembert L.lactis, L.cremoris, Penicillium camamberti, Gouda L.lactis, L.diacetylactis, L.cremoris Ementaler S. thermophilus, L.lactis, Propionibacterium shermani Brevibacterium linens 2 glukoza → 3 cz. octanu + 2 cz. mleczanu (Bifidobacterium bifidum) L.helveticus, P.freudenreichii Fermentacja alkoholowa ENTEROBACTERIACEAE dekarboksylaza pirogronian/aldehyd octowy rzadka u bakterii Escherichia coli Salmonella sp. Shigella sp. komensal przewodu pokarmowego ssaków Enterobacter sp. Serratia sp. Proteus sp. Erwinia sp. występują w glebie i wodzie Yersinia sp. patogeny człowieka Vibrio sp. Aeromonas sp. Photobacterium sp. występują w wodzie, niektóre patogenne patogeny człowieka patogeny roślin 13 Fermentacja mieszana produkty kwaśne Fermentacja mieszana produkty obojętne Fermentacja masłowa IMViC + + - - - - + + Fermentacja masłowa Toksyczność tlenu wynika z obecności w komórce : CO2 enzymów flawinowych oksydaz (np. oksydaza NADPH) barwników uczulających na światło (np. chlorofil, cytochromy) H2 ATP etanol octan CO2 ATP funkcję ochronna pełnią: dysmutazy ponadtlenkowe katalazy karotenoidy O2- + 2H+ → H2O2 2H2O2 → 2H2O + O2 aceton maślan butanol 14 Enegrizacja błony. Metabolity prekursorowe • hydroliza ATP • dekarboksylacje sprzęŜone z transkolacją Na+ 12 • symport z produktem fermentacji REAKCJE ANAPLEUROTYCZNE glukoza Cykl glioksalowy 1. karboksylaza PEP PEP + HCO3- → szczawiooctan + Pi (pałeczki jelitowe, Bacillus anthracis, Acetobacter xylinum, Azotobacter vinelandii) 2. karboksylaza pirogronianu pirogronian + HCO3- + ATP → szczawiooctan + ADP + Pi (enzym obecny u ssaków i bakterii, zawiera biotynę) pirogronian, jabłczan 1. karboksykinaza PEP szczawiooctan + ATP → PEP + ADP + CO2 2. syntetaza PEP pirogronian + ATP → PEP + AMP + Pi 3. enzym jabłczanowy jabłczan + NAD+ (NADP+) → pirogronian + NADH (NADPH) + H+ + CO2 octan 1. karboksykinaza PEP szczawiooctan + ATP → PEP + ADP + CO2 2. cykl glioksalowy Rozkład związków aromatycznych wszystkie związki przekształcane do dwóch kluczowych struktur • aktywacja pierścienia przez wprowadzenie grup hydroksylowych – powstaje katechol lub protokatechol • rozerwanie pierścienia w pozycji ORTO lub META – udział dioksygenazy • przekształcenie alifatycznych produktów pośrednich i włączenie ich do metabolizmu centralnego Bezwzględne tlenowce (Pseudomonas sp., Rhizobium sp., Azotobacter sp., Agrobacterium sp., Caulobacter sp., Spiryllum sp., bakterie octowe – Acetobacter sp., Gluconobacter sp.) OH OH OH OH protokatecholan katechol 15 dioksygenaza ORTO Rozkład węglowodorów O2 O2 • metan – metanotrofy O2 • do C8 – niewiele bakterii (Nocardia sp., Mycobacterium sp.) specjalna struktura ściany komórkowej O2 • C10-C18 – wiele mikroorganizmów (Pseudomonas sp., Nocardia sp., Mycobacterium sp., Corynebacrium sp., droŜdŜe np. Candida sp., Torulopsis sp. ) META metylotrofy monooksygenaza CH4 + NADH + H+ + O2 → CH3OH + NAD+ + H2O monooksygenaza oksydacja terminalna CH3OH + PQQ → CH2O + PQQH2 dehydrogenaza CH2O + NAD+ + H2O → HCOOH + NADH + H+ HCOOH + NAD+ → CO2 + NADH + H+ O2 O2 PQQ u droŜdŜy brak PQQ CH3OH + O2 → CH2O + H2O2 oksydaza O2 2 H2 O2 → 2 H2 O + O2 katalaza CH2O punktem wyjścia do biosyntezy oksydacja subterminalna 3 drogi asymilacji aldehydu mrówkowego (CH2O) • cykl serynowy CH2O + CO2 → acetyloCoA 3 drogi asymilacji aldehydu mrówkowego (CH2O) • cykl rybulozomonofosforanu → fruktozo-6-fosforan • cykl ksylulozomonofosforanu → dihydroksyaceton tylko u droŜdŜy 16 Niepełne utlenianieprodukcja acetoiny i butandiolu Niepełne utlenianie substratu – bakterie octowe Acetobacter sp. Gluconobacter sp. Bacillus spp. Oddychanie beztlenowe Oddychanie beztlenowe – dysymilacyjna redukcja siarczanów brak akceptora elektronów – uwalnianie H2 oddychanie azotanowe lub fumaranowe 5H2 + 2NO3- + 2H+ → N2 + 6H2O mrówczan + fumaran → bursztynian + CO2 H2 + fumaran → bursztynian H2 dawcą energii 3 grupy mikroorganizmów oddychanie Rozmieszczenie elementów łańcucha oddechowego w błonie • niepełne utlenianie substratu Desulfovibrio sp. (gram-), Desulfotomaculum sp. (gram+) niepełne utlenienie substratu Desulfovibrio sp. • pełne utlenianie substratu zmodyfikowany CKTK Desulfobacter sp. (gram-) oksydatywnej dehydrogenazy CO Desulfobacterium sp. (gram-), Desulfotomaculum sp. (gram+) Arechaeglobus sp. (Archae) jako źródło węgla mogą słuŜyć: cukry aminokwasy alkohole kw. organiczne zw. aromatyczne węglowodory (C12-C20) tlen włączany do cząsteczki substratu pochodzi z H2O hydroksylazy nie będące oksydazami biosynteza (asymilacjyjna redukcja siarczanów) mleczan pirogronian octan mleczan + SO42- + 8H+ → octan + CO2 + H2S 17 Pełne utlenianie substratu – oksydatywna dehydrogenaza CO Pełne utlenianie substratu – zmodyfikowany CKTK • dehydrogenaza kw. α-ketoglutarowego zaleŜna od Fd a nie NAD+ • dehydrogenaza jabłczanu niezaleŜna od NAD+, związana z błoną • liaza a nie syntaza cytrynianu, CoA przenoszone na octan z bursztynylo-CoA, powstaje ATP Desulfobacterium sp. Desulfotomaculun sp. Desulfobacter sp. Arechaeglobus sp. (Archae) (inne koenzymy) Bakterie homoacetogenne – oddychanie węglanowe CO2 jako końcowy akceptor elektronów: oddychanie węglanowe fruktoza → 3 cz. octanu 4H2 +2CO2 → octan- +2H2O + H+ redukcyjna dehydrogenaza CO CO2 dwie grupy organizmów: CO2 acetogeny - redukcja CO2 do octanu H2 dawcą energii CO2 akceptorem elektronów dawcy elektronów: • głównie H2 • cukry, kwasy organiczne, aa, alkohole metanogeny -redukcja CO2 do metanu Clostridium aceticum, Acetobacterium woodi Szlak redukcyjnej dehydrogenazy CO 4H2 +2CO2 → CO2 formylo- Bakterie metanogennne (Archae) octan- + 2H2O + H+ 4H2 + CO2 → CH4 + 2H2O Methanobacterium thermoautotrophicum CO2 akceptorem elektronów – oddychanie węglanowe H2 dawcą energii metylo- metylo- CH3COOH → CH4 + CO2 Methanosarcina sp. Methanothrix sp. 3CH3OH → 3CH4 + CO2 + 2H2O 4(CH3)3N + 6H2O → 9CH4 + 3CO2 + 4NH3 Methanolobus sp., Methanococcoides sp. Methanosarcina barkeri - modelowy organizm ograniczona ilość substratów dla metanogenezy OCTAN acetylo- 18 Metanogeneza z octanu Metanogeneza z CO2 OCTAN CO2 formylo- biosynteza metyleno- metylo- METAN METAN CHEMOLITOTROFY Typy troficzne – źródła energii • bakterie wodorowe H2 + 0.5O2 → H2O Nocardia, Alcaligenes, Pseudomonas spp. 5H2 + 2NO3- + 2H+ → N2 + 6H2O Paracoccus denitryficans 4H2 + CO2 → CH4 + 2H2O Methanobacterium sp. 4H2 +2CO2 → octan- + 2H2O + H+ Clostridium aceticum, Acetobacterium woodi • bakterie siarkowe S2- + 2O2 → SO42- Beggiatoa, Thiothrix spp. S0 + 1.5O2 + H2O → SO42- + 2H+ Thiobacillus, Sulfolobus spp. S2O32- + 2O2 + H2O → 2SO42- + 2H+ Thiobacillus thiooxidans 5S2O32- + 8NO3- + H2O → 10SO42- + 2H+ +4N2 Thiobacillus denitryficans • bakterie Ŝelazowe 2Fe2+ + 2H+ + 0.5O2 → 2Fe3+ + H2O Gallionella sp., Thiobacillus ferroxidans • bakterie nitryfikacyjne utleniające amoniak NH4+ + 1.5O2 → NO2- + H2O + 2H+ Typy troficzne – źródła węgla CO2 – autotrofy Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus spp. utleniające azotyny zwiazki organiczne - heterotrofy Odwrotny transport elektronów potencjał dawcy elektronów nie jest dostatecznie ujemny by zapewnić redukcję NAD+ (wyjątek H2) NO2- + 0.5O2 → NO3- Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus spp. Odwrotny transport elektronów – bakterie siarkowe bakterie nitryfikacyjne siła redukcyjna odwrotny transport ATP Figure 20.27b wiele z nich to autotrofy – bardzo wolny wzrost 19 Obligatoryjna autotrofia Fosforylacja cykliczna – bakterie purpurowe CO2 CO2 odwrotny transport elektronów zewnętrzne źródło elektronów, np. H2S brak dehydrogenazy kw. α-ketoglutarowego Fosforylacja cykliczna – bakterie zielone bakterie purpurowe bakterie zielone Fotoasymilacja związków organicznych przez bakterie purpurowe octan 2nCH3COOH + 2nH+ → (C4H6O2)n + 2nH2O CH3COOH + H2O → 2CO2 + 8H+ (CKTK - źródło siły redukcyjnej) razem: 9nCH3COOH → 4 (C4H6O2)n + 2CO2 + 6nH2O maślan 2nC4H8O2 + nCO2 → 2 (C4H6O2)n + (CH2O)n + nH2O związki aromatyczne Wiązanie CO2 – cykl Calvina Wiązanie CO2 – redukcyjny CKTK materiał komórkowy • wiązanie CO2 5 ATP na fosfotriozę • redukcja CO2 • regeneracja akceptora CO2 cykl Calvina- 9ATP na jedną fosfotriozę bakterie zielone (Chlorobiaceae), niektóre redukujące siarczany 20 Wiązanie CO2 – szlak redukcyjnej dehydrogenazy CO Dodatkowe karboksylacje 1. karboksylaza PEP CO2 PEP + CO2 → szczawiooctan + Pi formylo- (pałeczki jelitowe, Bacillus sp.) metylo- metylo- 2. karboksylaza pirogronianu pirogronian + CO2 + ATP → szczawiooctan + ADP + Pi (Pseudomonas sp., Bacillus sp.) 3. cykl glioksalowy fosfotrioza 4. acetylo-CoA + CO2 + FdH2 → pirogronian + Fd + CoA 3ATP acetylo-CoA metanogeny, acetogeny, niektóre redukujące siarczany 3 ATP na fosfotriozę polimery (polisacharydy,białka) Fermentacje II rzędu 1. 3 mleczan → 2 kw. propionowy + octan + CO2 (Propionibacterium sp., Clostridium sp.) hydroliza monomery (cukry, aminokwasy) 2. etanol + H2O → octan + 2H2 Go’ = +9.6 kJ fermentacja I propionian, maślan, bursztynian, alkohole octan H2+CO2 UmoŜliwiają wzrost na octanie, u niektórych (np. Clostridium sp.) aŜ 30% węgla komórkowego pochodzi z CO2 acetogeneza fermentacja II octan H2+CO2 octan metanogeneza 3. kw. masłowy + 2H2O → 2octan + 2H2 Go’ = +48.1 kJ (Syntrophomonas wolfei) 4. kw. propionowy + 3H2O → octan + + CO2 + 3H2 Go’ = +76.1 kJ (Syntrophobacter wolfinii) syntropia międzygatunkowe przekazywanie wodoru CH4+CO2 przełyk Główne grupy mikroorganizmów 1010 – 1011 Układ pokarmowy układ moczowy Escherichia coli, Proteus mirabilis – patogeny oportunistyczne (zmiana pH, spadek oporności) kom./g układ płciowy Enterococcus faecalis, pałeczki jelitowe Bacteroides sp. Bifidobacterium sp. Peptococcus sp. Peptostreptococcus sp. Ruminococcus sp. Closrtidium sp. Streptococcus sp. Staphylococcus sp. Lactobacillus sp. Lactobacillus sp. Enterococcus sp. niskie pH utrzymywane przez Lactobacillus acidophilus inne organizmy to: Escherichia coli, Streptococcus sp. droŜdŜaki: Candida i Torulopsis spp. odbyt 21 OBECNOŚĆ patogenów Czynniki adhezyjne: glycocalyx enterotoksyczna Escherichia coli (ETEC) Streptococcus mutans białka adhezyjne Streptococcus pyogenes Neiseria gonorrhoeae ADHEZJA WZROST i KOLONIZACJA lokalna TOKSYCZNOŚĆ efekt lokalny lub systemowy INWAZYJNOŚĆ wzrost lokalny lub w miejscach oddalonych białkoM białko Opa kwas lipotejchojowy Streptococcus pyogenes fimbrie (pili) Neiseria gonorrhoeae enterotoksyczna Escherichia coli (ETEC) USZKODZENIE TKANEK CHOROBA Neutrofil – fagocytoza komórek bakteryjnych Wnikanie do wnętrza komórki • namnaŜanie się, wzrost, wywoływanie choroby ściśle związane z inwazją cytoplazmy komórek gospodarza riketsie, chlamydie – pasoŜyty wewnątrzkomórkowe lizosomy cytoplazma pseudopodium trawienie • ucieczka przed układem immunologicznym, moŜliwość rozprzestrzeniania się po całym organizmie Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Shigella sp., Salmonella sp., patogenne szczepy Escherichia coli fagolizosom wchłanianie fagosom bakterie wydzielanie adhezja błona cytoplazmatyczna Unikanie fagocytozy 1. repelenty, toksyny – brak chemotaksji Inwazja przez wymuszoną fagocytozę – Shigella sp. 2. otoczki, śluzy, biofilm – brak adhezji i pochłaniania komórka M 3. blokowanie fuzji lizosomów z fagosomem komórka nabłonka jelita 4. wydzielanie katalazy 5. nieprzepuszczalne osłony komórkowe aktynaruch 6. blokowanie odpowiedzi makrofagów na czynniki stymulujące 7. utrata zdolności do prezentacji antygenów makrofag 8. ucieczka patogenu z fagosomu 22 IgA Dopełniacz toksyny neutralizacja fagocytoza opsonizacja fagocytoza komplement bakterie liza fagocyt fagocyt bakterie chemotaksja opsonizacja opsonizacja wiązanie IgG bakterie między komórkami IgM bakterie w plazmie autotransportery I II przeciwciała III dopełniacz i przeciwciała liza i fagocytoza Systemy sekrecyjne dla toksyn bakteryjnych typ systemu sekrecyjnego dopełniacz kompleksy immunologiczne IV przykładowe toksyny IgA proteaza hemaglutynina N.gonorrhoeae Bor. pertusis α-hemolizyna cyklaza adenylowa proteaza pullulanaza elastaza, fosfolipaza E.coli Bor. pertusis Ps. aeruginosa Klebsiella oxytoca Ps. aeruginosa Yersinia sp. białka Yop białka Ipa Shigella sp. toksyna Bor. pertusis (PT), Legionella sp., Helicobacter sp. Autotransportery Typ I peryplazma peryplazma cytoplazma 23 komórka eukariotyczna Typ II Typ III pili typu IV rzęska Podział toksyn bakteryjnych do komórki eukariotycznej Typ IV endotoksyny • składniki LPS, głównie lipid A • bardzo podobne, działają w taki sam sposób, objawy ogólne (gorączka, wymioty, biegunka) • ciepłostałe • mało toksyczne LD50 300 mikrogramów egzotoksyny • białka, wydzielane do środowiska przez bakterie G+ i G• bardzo róŜnorodna grupa, specyficzne działanie (niepyrogenne) • ciepłochwiejne (są wyjątki np. toksyna S.aureus) • bardzo toksyczne LD50 25 pikogramów (botulina) Curr Op Cell Biol (2000) 12:420 Podział toksyn bakteryjnych neurotoksyny zakłócają normalne przekazywanie impulsów nerwowych Clostridium tetani, Clostridium botulinum cytotoksyny zabijają komórki gospodarza Corynebacterium diphteriae – hamuje elongację białka Streptococcus pyogenes – uszkadza błonę lizosomów enterotoksyny stymulują komórki układu pokarmowego do wydzielania wody i elektrolitów do światła jelita Vibrio cholerae, Escherichia coli, Shigella dysenteriae (hamuje syntezę białka w kom. nabłonka jelita) Bakterie chorobotwórcze Staphylococcus aureus • obecny na skórze i w nosogardzieli • powoduje zatrucia pokarmowe (50% szczepów produkuje enterotoksynę) • choroby związane z produkcją ropy (zapalenia skóry, wrzody) • produkuje kolagenazę oraz cytotoksyny (hemolizyna, leukocydyna) Diplococcus pneumoniae • typowa flora górnych dróg oddechowych • powoduje zapalenie płuc, opon mózgowych, ucha środkowego • 30% śmiertelność, duŜy naciek limfocytów, cytokin, zapalenie systemowe, uszkodzenie tkanek gospodarza • oporność warunkowana przez przeciwciała przeciwko cukrowej otoczce – duŜa zmienność patogenu 24 Streptococcus pyogenes • rzadko występuje u zdrowych ludzi • powoduje ropne zapalenie gardła oraz zapalenie skóry • produkuje cytotoksyny (β β-hemoliza) oraz enzymy (nukleazy, lipazy, proteazy) • białka powierzchniowe A i M to tzw. superantygeny • liczne powikłania (zapalenie kłębuszków nerkowych, reumatyczne zapalenie mięśnia sercowego) spowodowane osadzaniem się w tkankach kompleksów immunologicznych Corynebacterium difteriae – transformacja lizogenna Corynebacterium difteriae • powoduje infekcje gardła, nekrozę komórek epitelialnych, toksyna ma efekt systemowy (serce, układ nerwoway, nerki) • produkuje toksynę dyfterytu (hamuje syntezę białka) Helicobacter pylori • bardzo często występuje u zdrowych ludzi • powoduje powstawanie wrzodów oraz nowotworów Ŝołądka • czynniki wirulencji: system sekrecyjny IV oraz cytotoksynę indukującą procesy zapalne i apoptotyczne w komórkach Bacillus anthracis • powoduje wąglik, tzw. zoonozę, chorobę odzwierzęcą • powoduje skórne i płucne infekcje, obrzęki, nekroza tkanek, wysoka śmiertelność • czynniki wirulecji: otoczka uniemoŜliwiająca fagocytozę, wytwarzanie egzotoksyn (zaburzenie równowagi jonowej, zakłócenie przekazywania sygnałów w obrębie układu immunologicznego) W.J.H. Kunicki – Goldfinger śycie Bakterii PWN 1998 Porównanie cech Bacteria, Archaea i Eukarya cecha Bacteria Archaea Eukarya komórka prokariotyczna tak tak nie DNA w postaci CCC tak tak nie białka histonowe nie tak tak ściana komórkowa mureina róŜny skład róŜny skład lipidy błonowe estry etery estry rybosomy 70S 70S 80S inicjacyjny tRNA f-Met Met Met introny nie tak tak operony tak tak nie polimeraza RNA jedna (4podj) kilka (8-12 podj. kaŜda) trzy (12-14 podj. kaŜda) czynniki transkrypcyjne nie tak tak promotory -10 i -35 TATA TATA Porównanie cech Bacteria, Archaea i Eukarya cecha Bacteria Archaea Eukarya metanogeneza nie tak nie redukcja So do H2S tak tak nie nitryfikacja tak nie nie denitryfikacja tak tak nie dysymilacyjna redukcja siarczanów tak tak nie fotosynteza (chlorofil) tak nie tak (chloroplasty) wiązanie azotu tak tak nie chemolitotrofia tak tak nie wzrost powyŜej 80oC tak tak nie Nature (1998) 392: 38 The hydrogen hypothesis for the first eukaryote William Martin, Miklos Muller 25
