Białka PPR — molekularne czynniki regulujące

advertisement
Białka PPR — molekularne czynniki regulujące
ekspresję genomów organelli
STRESZCZENIE
B
iałka PPR stanowią najliczniejszą zidentyfikowaną do tej pory rodzinę białek wiążących
RNA. Występują one prawie wyłącznie w plastydach i mitochondriach organizmów eukariotycznych. Szczególnie uderzająca jest ekspansja genów kodujących białka PPR u roślin
naczyniowych, która prawdopodobnie towarzyszyła opanowaniu lądów przez tę grupę organizmów. Białka PPR biorą udział w stabilizacji RNA, aktywacji translacji, redagowaniu,
wycinaniu intronów, degradacji oraz obróbce transkryptów policistronowych w mitochondriach i plastydach. Choć u organizmów nieroślinnych występuje zdecydowanie mniej białek PPR, nadal odgrywają one kluczową rolę w ekspresji mtDNA, a ich mutacje przeważnie
niosą ze sobą poważne konsekwencje fenotypowe związane z defektami oddechowymi. Roślinne białka PPR wiążą RNA w sposób specyficzny względem sekwencji nukleotydowej,
gdzie pojedynczy motyw rozpoznaje jeden nukleotyd docelowego transkryptu. Otwiera to
perspektywy tworzenia od podstaw syntetycznych sekwencji białkowych oddziałujących
specyficznie z wybranymi cząsteczkami RNA, umożliwiając precyzyjne modulowanie ekspresji informacji genetycznej zapisanej w mtDNA i ctDNA.
WPROWADZENIE
Rodzinę białek PPR (ang. pentatricopeptide repeats) zidentyfikowano w następstwie poznania pierwszej kompletnej sekwencji genomu roślinnego, rzodkiewnika zwyczajnego (Arabidopsis thaliana), w roku 2000. Białka PPR charakteryzują
się tandemowo powtórzonymi, 35-cio aminokwasowymi motywami. Pojedynczy motyw PPR tworzy dwie antyrównoległe α-helisy. Większa liczba następujących po sobie motywów PPR układa się w strukturę superhelisy z długą,
dodatnio naładowaną bruzdą (Ryc. 1) [1,2]. Pomimo niewątpliwego pokrewieństwa (oraz podobieństwa strukturalnego) do motywów TPR (ang. tetratricopeptide repeats), które uczestniczą w oddziaływaniach białko-białko, motywy PPR
warunkują wiązanie RNA w sposób wysoce specyficzny względem sekwencji
nukleotydowej. Białka PPR (z nielicznymi wyjątkami) występują w mitochondriach i plastydach. W samym genomie rzodkiewnika zwyczajnego zidentyfikowano około 450-ciu genów kodujących białka PPR, co czyni je najliczniejszą
rodziną białek wiążących RNA [3]. Dystrybucja białek PPR w zbadanych organizmach każe podejrzewać, że pojawiły się one na wczesnym etapie ewolucji
eukariontów lub u bezpośredniego przodka pierwszej komórki eukariotycznej.
Są one obecne u wszystkich eukariontów posiadających mtDNA i praktycznie
nieobecne u prokariontów. Nieliczne organizmy prokariotyczne posiadające
geny kodujące białka PPR to albo patogeny, albo symbionty organizmów eukariotycznych, co pozwala przypuszczać, że uzyskały te sekwencje na drodze
horyzontalnego transferu genów [4,5]. U Opisthokonta (supergrupa obejmująca grzyby, zwierzęta i niektóre protista) liczba genów kodujących białka PPR
nie przekracza trzydziestu u pojedynczego organizmu. U roślin naczyniowych
nastąpiła gwałtowna ekspansja rodziny PPR, gdzie liczba genów PPR sięga od
400 do ponad 1000 na genom (Ryc. 2) [6,7]. O ile u glonów liczba białek PPR nie
jest znacząco większa niż u Opisthokonta, mchy wykazują wartości pośrednie
(około 100 genów PPR na genom [8]). W związku z tym, ekspansję białek PPR u
roślin należy wiązać z okresem wyjścia na ląd.
Bartosz Zapisek
Jakub Piątkowski
Instytut Genetyki i Biotechnologii; Wydział
Biologii, Uniwersytet Warszawski, Warszawa
Instytut Genetyki i Biotechnologii; Wydział
Biologii Uniwersytetu Warszawskiego, ul.
Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa; tel.: (22)
592 22 44, e-mail: [email protected]

Artykuł otrzymano 21 sierpnia 2015 r.
Artykuł zaakceptowano 5 października 2015 r.
Słowa kluczowe: mitochondria, plastydy, białka PPR, metabolizm RNA, mtDNA, regulacja
ekspresji
Wykaz skrótów: ctDNA — chloroplastowy
DNA; CMS (ang. cytoplasmatic male sterility)
— cytoplazmatyczna męska sterylność; HMM
(ang. hidden Markov model) — ukryty model
Markova; MIOREX (ang. mitochondrial organization of gene expresion) — organizacja ekspresji
genów mitochondrialnych; mtDNA — mitochondrialny DNA; PCMP (ang. plant combinatorial and modular proteins) — kombinatoryczne
i modularne białka roślinne; PPR (ang. pentatricopeptide repeat) — polska nazwa; TALEs (ang.
transcription-activator-like effectors) — efektory
podobne do aktywatorów transkrypcyjnych);
TPR (ang. tetratricopeptide repeat) — polska nazwa; UTR (ang. untranslated region) — region
nieulegający translacji
BIAŁKA PPR U ROŚLIN
Funkcje oraz mechanizm działania białek PPR najintensywniej badane były
na przykładzie białek PPR w roślinach naczyniowych. Upośledzenia ekspresji
genów kodujących białka PPR niosą ze sobą zazwyczaj poważne konsekwencje
fenotypowe, co wskazuje na niezwykle istotną rolę tej rodziny w koewolucji genomów organellarnych oraz genomu jądrowego, jak i na niewielką redundancję
pod względem funkcji. Ten drugi wniosek znajduje dalsze potwierdzenie w stosunkowo niewielkiej zmianie w liczbie genów kodujących białka PPR pomiędzy
liniami ewolucyjnymi roślin, gdzie miała miejsce duplikacja genomu oraz gdzie
Postępy Biochemii 61 (4) 2015
403
Rycina 1. Struktura białka PPR na przykładzie roślinnego białka PPR10 (A) oraz struktura pojedynczego motywu PPR (B).
Rycina 2. Liczba genów kodujących białka PPR w genomach wybranych organizmów.
taka duplikacja nie zaszła (co świadczy o tym, że „nadmiarowe” geny PPR tracone były szybciej niż te kodujące inne
białka) (Ryc. 3).
Białka PPR pełnią szeroki zakres funkcji związanych z
potranskrypcyjną ekspresją genomów organellowych, w
tym podczas: wycinania intronów, redagowania (ang. RNA
editing), stabilizacji, degradacji, obróbki transkryptów policistronowych oraz inicjacji translacji [6,9].
Roślinne białka PPR dzielą się na dwie podrodziny. Sekwencja aminokwasowa białek z podrodziny P składa się
prawie wyłącznie z kanonicznych, 35-cio aminokwasowych
motywów PPR oraz N-końcowej sekwencji kierującej do
mitochondrium. Powszechnie uważa się, że wobec braku
innych motywów funkcjonalnych, białka z tej podrodziny
często pełnią funkcję adaptorową.
W skład podrodziny PLS (lub PCMP, ang. plant combinatorial and modular proteins) wchodzą białka z naprzemiennie
404
powtarzającym się motywem kanonicznym (P), długim (36
reszt aminokwasowych — L) i krótkim (przeważnie 31 reszt
aminokwasowych — S). Białka PLS przeważnie posiadają
dodatkowe motywy C-końcowe oznaczone jako E i DYW
(Ryc. 4). Biorą one udział w redagowaniu transkryptów, a
sam motyw DYW wykazuje podobieństwo do domeny deaminazy cytydynowej [10-12].
Białka PPR z podrodziny P, obok stabilizowania 5’ i 3’
końców transkryptów, aktywowania translacji, udziału w
splicingu i wyznaczania miejsc cięcia endonukleolitycznego
[13-15], stanowią również większość zidentyfikowanych do
tej pory czynników cofających męską cytoplazmatyczną sterylność (CMS, ang. cytoplasmatic male sterility), będącą przejawem tzw. „międzygenomowego wyścigu zbrojeń” pomiędzy genomem jądrowym a mitochondrialnym [16,17].
Białka z podrodziny P wiążą swoje docelowe RNA silniej
niż białka PLS, co może wynikać z faktu, że ochrona przed
egzorybonukleazą (bardziej niż deaminacja cytydyny) wymaga stworzenia stabilniejszego kompleksu białko–RNA.
www.postepybiochemii.pl
Rycina 3. Porównanie wzrostu liczebności poszczególnych grup białek w następstwie powielenia genomu roślinnego na przykładzie sorgo dwubarwnego (Sorghum bicolor) i kukurydzy zwyczajnej (Zea mays). Opis w tekście (Piątkowski, dane niepublikowane).
Fenotypy dysrupcji genów kodujących białka PPR u roślin obejmują: defekty w procesie fotosyntezy, defekty w
rozwoju nasion i zarodków, nadwrażliwość na stres abiotyczny, zmiany w zabarwieniu liści oraz wrażliwość na
kwas abscysynowy [6]. Wszystkie tak bardzo zróżnicowane
fenotypy mają swoje źródło w jednym mechanizmie molekularnym - wiązaniu konkretnych sekwencji transkryptów
organelli.
MECHANIZM DZIAŁANIA ROŚLINNYCH BIAŁEK PPR
Jak wspomniano w poprzednim rozdziale artykułu,
przewidywana struktura motywu PPR wykazuje znaczne
podobieństwo do struktury motywu TPR, pomimo pełnienia odmiennej funkcji. Już w oparciu o wczesne przewidywania strukturalne sugerowano, że mechanizm rozpoznawania docelowego RNA przez białka PPR odbywa się na
zasadzie jeden motyw — jeden nukleotyd, gdzie sekwencja
aminokwasowa każdego motywu z osobna warunkuje jego
specyficzność względem konkretnego nukleotydu. Tego rodzaju modularny mechanizm potwierdzono już wcześniej
w przypadku dwóch innych rodzin białek wiążących kwasy nukleinowe w sposób specyficzny względem sekwencji:
białek wiążących RNA z rodziny PUF (PUMILIO/FBF) jak
i oddziałujących z DNA białek TALEs (ang. transcription
activator like effectors) [18,19]. W obydwu przypadkach specyficzność względem konkretnego nukleotydu warunkują
tylko nieliczne (odpowiednio: trzy i dwie) pozycje aminokwasowe w motywie. Przyjmując założenie, że podobny
mechanizm działa w przypadku białek PPR, można było
przeprowadzić bioinformatyczną próbę odnalezienia „kodu
PPR”, opierając się o doświadczalnie ustalone docelowe sekwencje RNA rozpoznawane przez konkretne białka PPR.
Analiza oparta o sekwencję rozpoznawaną przez białko PPR10 z kukurydzy zwyczajnej (Zea mays) wskazała, że
kluczowe dla rozpoznawania określonych nukleotydów są
pozycje aminokwasowe 5 i 35 (lub 6 i 1’ — w zależności od
przyjętego systemu numeracji) [20]. Ze względu na większą
wygodę (aminokwasy oddziałujące z danym nukleotydem
mieszczą się w tych samych umownych granicach motywu), w tej pracy posługiwać będziemy się tym pierwszym
systemem numeracji. Asparagina w pozycji 5 (gdzie indziej
6) wykazuje silną preferencję względem pirymidyny (cytydyny lub urydyny) w sekwencji RNA, podczas gdy seryna
lub treonina koreluje z obecnością puryny (czyli adenozyną lub guanozyną) w rozpoznawanej sekwencji. W pozycji
Rycina 4. Schematyczne przedstawienie struktury białek z podrodziny P i PLS. Opis motywów P, L, S, E i DYW w tekście.
Postępy Biochemii 61 (4) 2015
405
Tabela 1. Tabela roślinnego „kodu PPR” wg [6].
Pozycja 5/6
T
S
S
N
N
T
S
N
P
Pozycja 35/1’
N
N
S
N
S
D
D
D
D
Preferowany nukleotyd
A
A
A
C
C
G
G
U
U
35 (gdzie indziej 1’) asparaginian zwiększa powinowactwo
względem urydyny lub guanozyny, podczas gdy asparagina względem cytydyny lub adenozyny (Tab. 1 i Ryc. 5)
W powyższy sposób udało się określić prosty kod, umożliwiający przewidywanie docelowych sekwencji RNA rozpoznawanych przez roślinne białka PPR. Aminokwasy w
pozycjach 5 i 35 znajdują się blisko siebie w strukturze przestrzennej, a łatwość tworzenia wiązań wodorowych przez
ich łańcuchy boczne nasuwa skojarzenia z mechanizmem
podobnym do parowania Watsona-Cricka w dupleksach
kwasów nukleinowych.
PPR10 było również pierwszym białkiem z rodziny PPR,
dla którego udało się poznać strukturę na drodze krystalografii rentgenowskiej. Struktura białka ze związanym
docelowym RNA zasadniczo potwierdziła przewidywania
teoretyczne odnośnie „kodu PPR”. Wykazano też, że białka PPR przed związaniem RNA występują pod postacią
homodimeru. Po związaniu RNA dimer może, ale nie musi
ulec rozdysocjowaniu [2].
W przypadku innego białka PPR, THA8, stwierdzono
zjawisko odwrotne, gdzie monomery THA8 dimeryzują
dopiero po związaniu RNA [21]. Ta zadziwiająca różnica
może wynikać z rozmiarów białka i różnej liczby powtórzeń PPR (PPR10 zawiera 19, a THA8 5 motywów PPR). Z
pewną dozą ostrożności można stwierdzić, że białka PPR
wykazują zdolność do dimeryzacji, na którą wpływ ma wiązanie ich docelowego RNA.
EWOLUCJA ROŚLINNYCH BIAŁEK PPR
Większość genów kodujących białka PPR w roślinach naczyniowych nie zawiera intronów. Tymczasem, większość z
ok. 100 genów PPR mchu czareczki otwartej (Physcomitrella
patens) posiada liczne introny. Można zatem wywnioskować, że gwałtowna ekspansja rodziny PPR w tej linii roślin
naczyniowych zaszła na drodze retrotranspozycji [7]. Nie
tłumaczy to jednak mechanizmu presji ewolucyjnej, która do tak uderzającej ekspansji doprowadziła. Wysunięto
liczne potencjalne wyjaśnienia. Hipoteza „korekcji błędów
w genomie” (ang. genome-debugging) postuluje, że szybko
różnicujące białka PPR umożliwiają korektę mutacji akumulujących się w aseksualnie rozmnażających się organellach [22]. Duża liczba białek PLS, które wyraźnie korelują
z liczbą miejsc redagowania w danym organizmie może
wynikać też z większego narażenia na promieniowanie UV
u roślin lądowych, a co za tym idzie — zmiany udziału poszczególnych zasad w mtDNA i ctDNA [23]. Wyjaśnienie
opierające się o wizję „międzygenomowego wyścigu zbrojeń” [16,17,24] wskazuje na miejscami rozbieżne „interesy”
reprodukcyjne genomów organelli i genomu jądrowego.
Genom jądrowy przekazywany jest zarówno w linii męskiej, jak i żeńskiej. W związku z tym, u wielu roślin hemafrodytyzm okazuje się optymalną strategią rozrodczą.
Organella są natomiast przekazywane wyłącznie w linii
żeńskiej, w związku z czym produkcja gamet męskich nie
przynosi genomom organelli żadnej przewagi rozrodczej.
Wręcz przeciwnie, w populacji hemafrodytycznych organelle osobnika, który przestaje produkować pyłek zyskują przewagę rozrodczą nad organellami osobników, które
nadal produkują zarówno gamety żeńskie jak i męskie. W
efekcie mamy do czynienia z doborem preferującym warianty genomu mitochondrialnego, który produkuje nietypowe hydrofobowe białka wywołujące obumieranie pyłku.
Zachodzi to jednak kosztem sukcesu reprodukcyjnego genomu jądrowego (choć są też populacje, gdzie CMS zapewnia wytworzenie korzystnej równowagi między roślinami
żeńskimi a hermafrodytycznymi). Stąd liczne (kodowane
jądrowo) białka PPR cofają fenotyp męskiej bezpłodności,
poprzez wygaszanie syntezy białek mitochondrialnych ją
wywołujących (m.in. na drodze cięcia endonukleolitycznego w określonej pozycji transkryptu mitochondrialnego lub
jego destabilizacji).
Białka PPR mogą również służyć koordynacji i regulowaniu poziomów syntezy białek
jądrowych i organellowych. Powyższe hipotezy nie wykluczają się wzajemnie.
Rycina 5. Schemat rozpoznawania nukleotydów w cząsteczce RNA przez motywy PPR.
406
Warto też wspomnieć o hipotezie silnie
zakorzenionej w założeniach ewolucji neutralnej, gdzie nadmiarowe białka PPR, niespecyficznie wiążące pewne transkrypty,
„rozluźniają” działający na nie dobór oczyszczający i umożliwiają pojawienie się mutacji
w innej sytuacji letalnych (albo bardzo silnie
obniżających dostosowanie rośliny) [25,26].
Na przykład, białko PPR wiążące 3’ koniec
transkryptu, może chronić go przed egzorybonukleazami, tym samym umożliwiając wystąpienie mutacji destabilizujących strukturę
www.postepybiochemii.pl
spinki do włosów, która wcześniej pełniła tą sama funkcję.
W efekcie, obecność takiego białka szybko staje się niezbędna dla zachowania stabilności transkryptu.
RÓŻNICE POMIĘDZY BIAŁKAMI PPR
U ROŚLIN I OPISTHOKONTA
Przytłaczająca większość poznanych białek PPR to białka
roślinne. W efekcie, początkowo tworzone profile motywu
PPR nie były reprezentatywne dla białek PPR u wszystkich
organizmów eukariotycznych, co z kolei doprowadziło do
zaniżenia liczby białek PPR wykrywanych w genomach
Opisthokonta. Wyszukiwania oparte o profile nieroślinne
pomogły wykryć wcześniej niezidentyfikowane białka PPR,
choć ich liczba dla większości Opisthokonta nadal nie przekracza kilkunastu.
U Opisthokonta nie występuje podrodzina PLS, co nie powinno dziwić, biorąc pod uwagę brak zjawiska redagowania transkryptów organellowych w tej grupie organizmów.
Jednak nawet w porównaniu z kanonicznym roślinnym
motywem P, profil motywów PRR u organizmów nieroślinnych wykazuje pewną odmienność. Biorąc za przykład profile motywów PPR z dwóch gatunków drożdży: drożdży
piekarskich (Saccharomyces cerevisiae) i drożdży rozszczepkowych (Schizosaccharomyces pombe), można stwierdzić, że
drożdżowe motywy PPR są znacząco słabiej zachowane w
ewolucji niż roślinne (Ryc. 6). Pomimo, że drożdżowe biał-
Rycina 6. Profile logo dla motywów PPR białek z drożdży piekarskich, drożdży rozszczepkowych oraz białek PPR roślinnych. Należy zwrócić uwagę na inną skalę na osi
y (względna entropia) dla profili drożdżowych i profilu roślinnego. Wskazuje to na znacznie wyższy poziom zachowania sekwencji roślinnych motywów PPR w ewolucji
(zmodyfikowano wg [27]).
Postępy Biochemii 61 (4) 2015
407
ka PPR nadal zachowują tę samą podstawową funkcję na
poziomie molekularnym [27] (tj. wiązanie transkryptów mitochondrialnych), nie udało się do tej pory zidentyfikować
u nich jednoznacznego i prostego „kodu PPR”, jak to miało
miejsce w przypadku białek roślinnych. Podobne, choć słabiej zachowane profile dla pozycji aminokwasowych kluczowych w roślinnym „kodzie PPR” każą podejrzewać, że
mechanizm rozpoznawania RNA przez białka PPR u Opisthokonta jest jednak zbliżony do tego w roślinach.
W roku 2013 zidentyfikowano pierwszą podrodzinę białek PPR występującą wyłącznie u organizmów nieroślinnych: PPR-TGM. Obok ciągu motywów PPR, białka z tej
podrodziny charakteryzują się C-końcową domeną metylotransferazy guaninowej o sugerowanej funkcji w metylacji
tRNA [28]. Geny kodujące białka PPR-TMG występują wyłącznie u mikroorganizmów eukariotycznych należących
do tak zróżnicowanych grup (i supergrup) jak: Amebozoa,
Alveolata, Chlorophyta, Cryptophyta, Haptophyta i Straminopyla. Wart zauważenia jest fakt, iż do niektórych wyżej wymienionych grup taksonomicznych należą gatunki posiadające geny kodujące białka PPR z domeną DYW. Nie zidentyfikowano natomiast jeszcze żadnego gatunku, w którego
genomie występowałyby jednocześnie geny kodujące białka PPR z motywem DYW i z motywem TGM [29]. Może to
świadczyć o pewnej redundancji funkcjonalnej między tymi
podrodzinami.
Białka PPR-TGM zidentyfikowano m.in. u stanowiącego
istotne zagrożenie gospodarcze pasożyta ostryg Perkinsus
marinus oraz u wywołującego pełzakowicę u ludzi Entamoeba histolytica (rocznie notuje się około 50 mln zachorowań
oraz ok. 100 tys. zgonów wywołanych przez tego pasożyta
[30]). Uwzględniając, że związki hamujące proces metylacji
RNA były już w przeszłości wykorzystywane w celach terapeutycznych, białka PPR-TGM mogą stanowić obiecujący
cel dla przyszłych leków przeciwpasożytniczych.
EKSPRESJA MITOCHONDRIALNEGO DNA U DROŻDŻY
Drożdże, a w szczególności drożdże piekarskie oraz
drożdże rozszczepkowe, są jednym z najczęściej wybieranych modeli badawczych do studiowania ekspresji genomu
mitochondrialnego (mtDNA) oraz biogenezy kompleksów
łańcucha oddechowego [31,32].
Rycina 7. Schematyczne przedstawienie ekspresji genomu mitochondrialnego drożdży piekarskich. mtDNA — mitochondrialne DNA; Kompleks III — cytochrom bc1;
Kompleks IV — oksydaza cytochromu c; Kompleks V — mitochondrialna syntaza ATP; LSU (ang. large subunit) — duża podjednostka rybosomu; SSU (ang. small subunit)
— mała podjednostka rybosomu. Rpo41 — mitochondrialna polimeraza RNA wymagająca do inicjacji transkrypcji białka Mtf1. Opis w tekście.
408
www.postepybiochemii.pl
łańcucha oddechowego, zarówno poprzez kodowanie jego
strukturalnych podjednostek, jak i przez uczestniczenie w
obróbce RNA i procesie translacji mitochondrialnej (Ryc. 7).
Mimo, iż mitochondria posiadają swój własny genom,
jego replikacja, naprawa i ekspresja jest całkowicie zależna
od czynników kodowanych jądrowo. Przewiduje się, że u
drożdży piekarskich nawet do 800 białek kodowanych jądrowo może występować w mitochondrium, z czego 1/4
może być zaangażowana tylko w ekspresję mtDNA [33].
W konsekwencji, prawidłowa biogeneza mitochondriów
wymaga skoordynowanej ekspresji dwóch różnych genomów i ich wzajemnej komunikacji na drodze oddziaływań
jądrowo-mitochondrialnych [34].
W przeciwieństwie do genomu jądrowego, gdzie ekspresja na poziomie DNA jest wysoce regulowana przez wiele
czynników działających zarówno cis, jak i trans (oraz przez
zmianę struktury chromatyny), regulacja ekspresji genomu mitochondrialnego drożdży na etapie transkrypcji jest
prosta [35-37]. Produktami transkrypcji mtDNA u drożdży
są policistronowe transkrypty, które następnie podlegają
złożonym procesom obróbki w celu wytworzenia dojrzałych cząsteczek RNA. Większość obecnej wiedzy na temat
metabolizmu mitochondrialnego RNA pochodzi z badań
na drożdżach piekarskich oraz rozszczepkowych [38]. Porównanie podstawowych cech mtDNA i jego ekspresji u
drożdży piekarskich, rozszczepkowych oraz dodatkowo
dla człowieka (Homo sapiens) zostało przedstawione poniżej
(Tab. 2).
DNA mitochondrialny u drożdży koduje jedynie kilka
białek. Zarówno u drożdży piekarskich, jak i u drożdży
rozszczepkowych, mtDNA koduje 8 białek, w tym jedno
białko małej podjednostki mitorybosomu (VAR1 u drożdży piekarskich i RPS3 u drożdży rozszczepkowych) oraz
7 kluczowych podjednostek łańcucha oddechowego: CYTB
dla kompleksu III (cytochrom cb1), COX1, COX2 i COX3 dla
kompleksu IV (oksydaza cytochromu c) oraz AtTP6, ATP8
i ATP9 dla kompleksu syntazy ATP. Dodatkowo, mtDNA
koduje własny zestaw 24 tRNA, dwa rRNA (15S dla małej podjednostki, 21S dla dużej podjednostki rybosomu
mitochondrialnego) oraz jeden komponent dla kompleksu
RNazy P (RPM1 RNA u drożdży piekarskich i rnpB u drożdży rozszczepkowych). Tym samym, wszystkie cząsteczki
RNA kodowane przez mtDNA są niezbędne dla biogenezy
Mimo, iż dojrzałe transkrypty powstają z tych samych
policistronowych jednostek, ich poziom może się znacząco
między sobą różnić, co może być wynikiem różnego tempa
dojrzewania i degradacji indywidualnych transkryptów
[40]. Z tego powodu, to właśnie czynniki potranskrypcyjne
zaangażowane w dojrzewanie i degradację RNA wydają
się odgrywać istotną rolę w regulacji ekspresji mtDNA. Co
Tabela 2. Porównanie wybranych cech mtDNA i metabolizmu RNA pomiędzy drożdżami piekarskimi, rozszczepkowymi oraz człowiekiem. Na podstawie [32,38,39].
Wielkość mtDNA [kpz]
Sekwencje niekodujące
Miejsca replikacji
Jednostki
transkrypcyjne
Kodowane podjednostki
Kompleks I
Kompleks III
Kompleks IV
Syntaza ATP
Mitorybosom
Główne mechanizmy
dojrzewania RNA
5’ UTR mRNA
Drożdże piekarskie
od ok.75 do ok.85
zależnie od szczepu
ok. 70%
8 ori
11
różne zestawienia mRNA,
rRNA i tRNA
8
–
CYTB
COX1, 2, 3
ATP6, 8, 9
VAR1
splicing (do 8 intronów)
częściowa interpunkcja tRNA
RNaza P
obróbka 5’ końca
obróbka 3’ końca za
sekwencją dodekameru
(AAUAAUAUUCUU)
Drożdże rozszczepkowe
Człowiek
ok.19
16
ok. 25%
nieznane
2
różne zestawienia mRNA,
rRNA i tRNA
8
–
CYTB
COX1, 2, 3
ATP6, 8, 9
RPS3
0%
2 (OH i OL)
3
różne zestawienia
mRNA, rRNA i tRNA
13
ND1, 2, 3, 4, 4L, 5, 6
CYTB
COX1, 2, 3
ATP6, 8
–
splicing (do 3 intronów)
pełna interpunkcja tRNA
generująca dojrzały 5’ koniec
RNaza P niezidentyfikowana
obróbka 3’ końca za sekwencją
C-core (CCCCC)
brak intronów
interpunkcja tRNA
RNaza P
poliadenylacja na 3’
końcu przez MTPAP
długie
krótkie
długie, krótkie lub brak
(zależnie od transkryptu)
brak „struktury typu cap” na 5’ końcach mRNA
brak sekwencji Shine-Dalgarno
3’ UTR mRNA
brak ogona poli (A), sekwencja dodekameru lub C-Core
chroniąca przed degradacją od 3’ końca
Degradacja RNA
głównie degradacja egzorybonukleolityczna np. degradosom
mitochondrialny (mtEXO) i białko Pet127.
Liczba tRNA i ich
rozmieszczenie w mtDNA
25
zgrupowane
25
częściowo zgrupowane
rRNA
15S, 21S
rns, rnl
RNaza P
9S RNA, białko RPM2
rnpB RNA, nieznana część białkowa
Postępy Biochemii 61 (4) 2015
ogon poli (A) na 3’ końcu
kompleks degradacyjny
PNPase-hSUV3
22
rozproszone pomiędzy
mRNA i rRNA
12S, 16S
tylko białkowe podjednostki
MRPP1, 2, 3,
409
ciekawe, również translacja różnych transkryptów może
zachodzić na różnym poziomie, w czym udział biorą liczne i specyficzne (względem transkryptu) tzw. aktywatory
translacyjne, których obecność często jest niezbędna dla
zaistnienia samej translacji i stabilności mitochondrialnego mRNA [41]. Najnowsze badania pokazały również, że
u drożdży piekarskich rybosom mitochondrialny oddziałuje z ogromną liczbą różnych czynników potranskrypcyjnych, tworząc wyżej zorganizowane struktury nazwane
kompleksami MIOREX (ang. mitochondrial organization of
gene expression) [42]. Sugerowaną rolą kompleksów MIOREX jest sterowanie ekspresją mtDNA poprzez odpowiednie organizowanie (w czasie i przestrzeni) dojrzewania,
translacji i degradacji mitochondrialnego RNA. Dodatkowo, część kompleksów MIOREX współwystępuje z nukleoidem mitochondrialnym, gdzie przypuszczalnie bierze
udział we wczesnych etapach jego ekspresji takich jak
transkrypcja.
Podsumowując, kluczowe etapy regulacji ekspresji mtDNA zachodzą na poziomie potranskrypcyjnym poprzez
kontrolowaną obróbkę, stabilizację i degradację mitochondrialnych RNA oraz regulację ich translacji przez rybosom
mitochondrialny i oddziałujące z nim białka. Tym samym,
ekspresja genomu mitochondrialnego jest bardziej zorganizowana przestrzennie i czasowo niż wcześniej sądzono. Nadal jednak, mimo identyfikacji licznych białek kodowanych
jądrowo zaangażowanych w ekspresje genów mitochondrialnych u drożdży, wiele z nich jest nadal bardzo słabo
scharakteryzowanych.
IDENTYFIKACJA I ROLA DROŻDŻOWYCH BIAŁEK
PPR W EKSPRESJI MITOCHONDRIALNEGO DNA
Identyfikacja białek typu PPR w analizach genomowych
jest wymagająca ze względu na fakt, że motyw PPR jest
krótki i charakteryzuje się wysokim stopniem zróżnicowania. Większość metod bioinformatycznych, które pozwoliły
na identyfikację dużej liczby białek PPR u roślin, bazowała
na metodach analizy wykorzystujących tzw. ukryte modele Markova (HMM, ang. hidden Markov model) [43]. Innym
podejściem były próby wykrywania białek z tandemowymi
powtórzeniami specyficznych sekwencji poprzez stosowanie takich programów jak TPRpred [44]. Metody te jednak
korzystały z profili stworzonych w oparciu o liczne roślinne
białka PPR i nie były efektywne w analizie genomów drożdżowych oraz zwierzęcych. Opracowanie bioinformatycznego narzędzia SCIPHER, opartego na algorytmie HMM
i zmodyfikowanym drożdżowo-specyficznym profilu pozwoliło ostatecznie na adnotacje ponad 150 drożdżowych
białek jako białka PPR (o różnej liczbie motywów PPR w sekwencji), z czego 15 znaleziono u drożdży piekarskich, a 10
u drożdży rozszczepkowych [45,46]. Wszystkie znane drożdżowe białka PPR mają przewidywane lub potwierdzone
występowanie mitochondrialne i tym samym wskazuje się,
że ich celami molekularnymi są cząsteczki mitochondrialnego RNA (Tab. 3).
Ponieważ motyw PPR jest wysoce dywergentny, powstaje pytanie czy przeprowadzone dotychczas poszukiwania
zidentyfikowały wszystkie geny kodujące białka z tej rodzi-
Tabela 3. Spis białek PPR i ich sugerowane funkcje u drożdży piekarskich i rozszczepkowych. Na podstawie [27,46] oraz nieopublikowanych wyników własnych.
Drożdże piekarskie
Rpo41
Cbp1
Pet309
Pet111
Rpm2
Rmd9
Dmr1/Ccm1/Rrg2
Mrx1
Sov1
Aep1/Nca1
Aep2/Atp13
Aep3
Atp22/Tcm10
Rmd9L
Msc6
Drożdże rozszczepkowe
Ppr1
Ppr2
Ppr3
Ppr4
Ppr5
Ppr6
Ppr7
Ppr8
Rpo41
Ppr10
410
Nazwa systematyczna
Sugerowane cele RNA
Główna funkcja
Yfl036w
Yjl209w
Ylr067c
Ymr257c
Yml091c
Ygl107c
Ygr150c
Yer077c
Ymr066w
Ymr064w
Ymr282c
Ypl005w
Ydr350c
Ybr238c
Yor354c
wszystkie
COB
COX1
COX2
wszystkie tRNA
mRNA i rRNA
15S rRNA, COB
mRNA i rRNA
VAR1
ATP9
ATP9
ATP6/8
ATP6/8
?
?
mitochondrialna polimeraza RNA
stabilizacja i translacja
stabilizacja i translacja
translacja
dojrzewanie tRNA
stabilizacja
stabilizacja
stabilizacja i translacja
stabilizacja
translacja
stabilizacja i i translacja
stabilizacja i translacja
translacja
?
?
Spbc1604.02c
Spbc18H10.11c
Spbc19G7.07c
Spac8C9.06c
Spac1093.01
Spcc11E10.04
Spbc16A3.03c
Spbc1289.06c
Spac26H5.12
Spbc106.19
cox2, cox3
?
15S rRNA
cox1
?
atp9
atp6
cox1?
wszystkie
?
stabilizacja
pozytywny regulator translacji
stabilizacja
translacja
negatywny regulator translacji
stabilizacja
stabilizacja
translacja
mitochondrialna polimeraza RNA
translacja
www.postepybiochemii.pl
ny w genomach drożdżowych. Przede wszystkim, zastanawiający jest brak u drożdży rozszczepkowych białka PPR
zaangażowanego w obróbkę tRNA przez kompleks RNazy
P, w którym zarówno u drożdży piekarskich, jak i u ludzi
obecne jest białko PPR [47]. Brak białka o homologicznej
funkcji u drożdży rozszczepkowych może sugerować, że
RNaza P uległa znaczącej dywergencji w tej linii ewolucyjnej lub proces obróbki tRNA w tych drożdżach zachodzi w
odmienny sposób. Choć wiele genów i mechanizmów pomiędzy drożdżami rozszczepkowymi i piekarskimi jest zachowanych, należy pamiętać, że dystans ewolucyjny, który
dzieli te dwa gatunki jest bardzo znaczny.
Tak jak zostało wspomniane wcześniej, mimo iż przeciętny genom roślinny koduje setki białek PPR, jedynie kilkanaście takich białek zostało zidentyfikowanych u drożdży. Jakie są więc przyczyny leżące u podstaw tak dużej
różnicy liczebności tych białek pomiędzy poszczególnymi
domenami? Jednym z głównych powodów mniejszej
ekspansji tych białek u drożdży wydaje się być mniej
złożony metabolizm RNA, w którym brak takich procesów
jak trans-splicing, poliadenylacja czy redagowanie RNA,
angażujących liczne roślinne białka PPR. Dodatkowo, splicing mitochondrialnego RNA, jeśli obecny u danego gatunku drożdży, zachodzi zazwyczaj tylko dla kilku transkryptów. Co więcej, żadne ze zbadanych białek PPR u drożdży
nie wydaje się być wymagane dla tego procesu.
Jaka jest więc dokładna funkcja białek PPR w mitochondriach drożdży? Komórki drożdżowe, u których usunięto
geny kodujące białka PPR (np. w wyniku delecji sekwencji
kodującej w genomie jądrowym), zazwyczaj charakteryzują się utratą zdolności oddechowych (brak wzrostu tlenowego), wynikających z zaburzeń dojrzewania i translacji mitochondrialnych RNA. Przeprowadzone w ostatnich
latach analizy funkcjonalne dla większości znanych białek
PPR z drożdży piekarskich i rozszczepkowych wskazują
na rolę tych białek w ekspresji mtDNA, głównie poprzez
zaangażowanie w stabilizację i translację RNA (Ryc. 8).
Funkcja tych białek może być zarówno specyficzna względem transkryptu (np. Cbp1p i Pet111p), jak i bardziej ogólna wpływając na metabolizm większości RNA (np. Rpo41p,
Rpm2p, Rmd9p i Mrx1p) oraz jego translację (np. regulatory translacji Ppr2 i Ppr5). Szczególnie istotne wydają się
również białka PPR zaangażowane w metabolizm rybosomalnego RNA (np. Dmr1p i Ppr3). Stabilizując i chroniąc
przed degradacją rRNA grają one kluczową rolę w biogenezie rybosomu mitochondrialnego, a tym samym pośrednio
ich funkcja jest niezbędna dla biosyntezy wszystkich białek
kodowanych mitochondrialnie.
Ponieważ drożdżowe białka PPR składają się tylko z motywów PPR, a tym samym ich jedyną aktywnością jest wiązanie RNA, sugeruje się, że mogą pełnić one rolę adaptorową
podobnie jak podrodzina P u roślin. Poza samą stabilizacją
transkryptów, szczególnie interesujące jest pytanie o dokładną rolę tych białek w translacji mitochondrialnego RNA.
Z jednej strony wydaje się, że poprzez wiązanie mRNA
w obrębie sekwencji 5’ UTR białka PPR mogą uczestniczyć
Rycina 8. Schematyczne przedstawienie głównych funkcji białek PPR w ekspresji genomu mitochondrialnego u drożdży piekarskich. mtDNA — mitochondrialne DNA;
LSU (ang. large subunit) — duża podjednostka rybosomu; SSU (ang. small subunit) — mała podjednostka rybosomu. Wszystkie białka PPR zostały przedstawione kolorem
fioletowym.
Postępy Biochemii 61 (4) 2015
411
w lokowaniu transkryptów w miejscu ich translacji w pobliżu wewnętrznej błony mitochondrialnej. Dane z dotychczas
otrzymanych wyników sugerują, że zasadniczo wszystkie
etapy ekspresji mtDNA zachodzą w pobliżu wewnętrznej
błony mitochondrialnej, z którą związany jest rybosom mitochondrialny [48]. Dodatkowo, wiele czynników potranskrypcyjnej ekspresji mtDNA, jak i białek PPR (np. Rmd9p),
jest częściowo zlokalizowana przy wewnętrznej błonie [41].
Jest to logiczne ze względu na fakt, że kodowane przez
mtDNA białka mają wysoce hydrofobowy charakter. Przybłonowy proces translacji tych białek ułatwia ich sprawne
i szybkie umiejscowienie w wewnętrznej błonie, gdzie następują kolejne etapy składania kompleksów oddechowych.
Z drugiej strony, odpowiednie stabilizowanie mRNA
w kompleksie rybosomalnym dla jego efektywnej translacji również może być istotną funkcją tych białek PPR,
które są zaangażowane w translację. Dotychczas najlepiej
zbadanymi aktywatorami translacyjnymi, będącymi białkami PPR, są białka Pet111 i Pet309 z drożdży piekarskich
[27]. Wszystkie roślinne białka plastydowe, u których
potwierdzono wiązanie regionu 5› UTR danego transkryptu
biorą jednocześnie udział w aktywacji translacji. Pierwotna
hipoteza, wedle której wyższy poziom syntezy białka wynika z samej stabilizacji transkryptu przez białko PPR nie
znalazła potwierdzenia w danych doświadczalnych. Okazuje się natomiast, że związanie 5’ UTR transkryptu może
zapobiegać tworzeniu się struktury spinki do włosów, która pod nieobecność białka PPR hamuje inicjację translacji.
Podobnego mechanizmu nie udało się jednak stwierdzić w
przypadku sprzyjających translacji białek PPR w mitochondriach roślinnych. Wobec braku ustalonych doświadczalnie
konkretnych sekwencji wiązanych przez drożdżowe białka
PPR, tym trudniejsze jest postulowanie mechanizmu działania tych białek, w przypadku których stwierdzono udział
w aktywacji translacji (takich jak Cbp1p lub Pet309p). W
przypadku białka Pet309 sugeruje się jego udział (pośredni
bądź bezpośredni) w rekrutowaniu rybosomu do kodonu
AUG [27].
W tym kontekście szczególnie interesujące są liczne wyniki wskazujące na oddziaływanie drożdżowych białek
PPR z rybosomem mitochondrialnym lub innymi czynnikami translacyjnymi [27]. Ostatnie badania skupiające się
na określeniu specyficznego interaktomu mitorybosomu u
drożdży piekarskich wskazują na jego niezwykle bogatą
sieć oddziaływań. Oprócz identyfikacji większości znanych
aktywatorów translacyjnych wykryto również wiele białek
odpowiedzialnych za dojrzewanie mRNA, a wcześniej nie
wiązanych z procesem translacji, w tym wszystkie znane
drożdżowe białka PPR [42]. Dokładniejsze analizy, wykorzystujące metody frakcjonowania kompleksu rybosomalnego w gradiencie stężeń sacharozy wskazują, że niektóre
z tych białek specyficznie komigrują tylko z małą podjednostką (np. białka Rmd9 i Dmr1), podczas gdy inne migrują
wspólnie z dużą podjednostką rybosomu mitochondrialnego, jak np. białko Mrx1 (Zapisek, dane niepublikowane). U
drożdży rozszczepkowych, w porównaniu do drożdży piekarskich i znanych gatunków roślin lądowych, wiedza na
temat biochemii białek PPR jest jednak nadal bardzo uboga.
Niemniej, wstępne wyniki również wskazują na ich oddziaływanie z rybosomem mitochondrialnym, sugerując równie
412
istotną rolę w procesie translacji mitochondrialnej (Zapisek,
dane niepublikowane).
EWOLUCJA RODZINY BIAŁEK PPR U DROŻDZY
Rodzina PPR u drożdży podlega niezwykle szybkiej
ewolucyjnej dywergencji w porównaniu do innych rodzin
białkowych [45]. Analiza dopasowania sekwencji pomiędzy
parami ortologów białek PPR z różnych gatunków drożdży
wskazuje bardzo szybką dywergencję tych białek. Wydaje
się również, że szybka ewolucja tej rodziny nie jest zależna
od ich właściwości strukturalnych ponieważ strukturalnie
podobne białka TPR ewoluują znacznie wolniej [45]. Jednym z możliwych wyjaśnień jest zrozumienie procesu
koewolucji białka i wiązanej przez nie cząsteczki RNA.
Dywergencja wiązanych sekwencji, takich jak sekwencje
międzygenowe w pierwotnych transkryptach lub regiony
nieulegające translacji w mRNA, zdaje się być kluczowa w
procesie napędzania ewolucji białek PPR. Dość istotny w
tym przypadku jest również fakt, że dywergencja genomu
mitochondrialnego zazwyczaj postępuje szybciej niż genomu jądrowego.
Prawie wszystkie mitochondrialne białka zaangażowane w ekspresję mtDNA są kodowane jądrowo, a
prawidłowa interakcja obu genomów jest niezbędna
do biogenezy funkcjonalnego łańcucha oddechowego.
Brak kompatybilności pomiędzy genomami jądrowym i
mitochondrialnym może prowadzić do sterylności takich
hybryd oraz odpowiadać za izolację reprodukcyjną u
drożdży z rodzaju Saccharomyces, a tym samym jest wskazywany jako jeden z mechanizmów napędzających specjację [49]. Rolę w tym procesie zdają się również grać białka
PPR, czego interesującym przykładem jest funkcjonowanie
białka Aep2 z dwóch blisko spokrewnionych gatunków z
rodzaju Sacchcaromyces, mianowicie drożdży piekarskich i
winiarski (Saccharomyces bayanus). Ortolog Aep2p z drożdży winiarskich nie rozpoznaje 5’ UTR mRNA genu atp9
z drożdży piekarskich, czego skutkiem jest brak translacji
tego białka i defekt oddechowy [50]. Tak więc, koewolucja kodowanego jądrowo białka i wiązanego przez niego
mitochondrialnego transkryptu wydaje się być kluczowa
do zrozumienia powodów szybkiej ewolucji białek PPR u
drożdży.
BIAŁKA PPR CZŁOWIEKA
U człowieka zidentyfikowano dotychczas siedem białek PPR, wszystkie o potwierdzonej lub przewidywanej lokalizacji mitochondrialnej [51]. Tak jak u drożdży,
ludzka mitochondrialna polimeraza RNA (POLRMT)
również posiada domenę PPR o nieznanej funkcji, choć
sugeruje się jej udział w posttranskrypcyjnym metabolizmie mtRNA poprzez oddziaływanie z innymi białkami PPR [52]. Najlepiej zbadanym ludzkim białkiem PPR
jest LRPPRC/LRP130, które zawiera również największą liczbę przewidzianych motywów PPR. Początkowo
sugerowano, że białko to jest zaangażowane w obróbkę
transkryptów genów cox1 i cox3, jednak najnowsze badania wskazują na bardziej ogólną rolę LRPPRC w regulacji
poziomu wszystkich mitochondrialnych mRNA poprzez
wpływ na ich transkrypcję i stabilizację [53-55]. Mutacje
www.postepybiochemii.pl
w LRPPRC są odpowiedzialne za kanadyjsko-francuską
odmianę syndromu Leigha (miopatia mitochondrialna),
mającą swoje podłoże w defekcie aktywności mitochondrialnej oksydazy cytochromu c [56]. Co ciekawe, białko LRPPRC jest także obecne w jądrze komórkowym,
gdzie oddziałuje z transkrypcyjnym koaktywatorem
PGC-1α odpowiedzialnym za regulacje glukoneogenezy
i ekspresje genów zaangażowanych w biogenezę mitochondrialnego łańcucha oddechowego [57]. Dodatkowo,
LRPPRC może również grać rolę koaktywatora PGC-1α
dla jego funkcji w rozwoju i różnicowaniu komórek brązowej tkanki tłuszczowej. Działające w dwóch różnych
przedziałach komórkowych, aby regulować metabolizm
mitochondrialny białko LRPPRC jest doskonałym
przykładem białka PPR zaangażowanego w oddziaływania jądrowo-mitochondrialne.
Inne znane, choć nie tak dobrze zbadane, przykłady
białek PPR człowieka to białka PTCD1, PTCD2 i PTCD3
[58-60]. PTCD1 jest negatywnym regulatorem tRNA dla
leucyny, podczas gdy PTCD2 wydaje się być zaangażowany w obróbkę pierwotnego transkryptu dla genu cytB,
a jego mutacja powoduje spadek aktywności kompleksu
III. Wyciszenie PTCD3 skutkuje redukcją poziomu translacji mitochondrialnej, co prawdopodobnie związane jest
z jego powinowactwem do rybosomalnego 12S rRNA. Tak
jak u drożdży piekarskich, również jedno z białek PPR
człowieka, MRPP3, jest podjednostką kompleksu RNazy
P [47]. Co ciekawe, u człowieka kompleks ten składa się
aż z 3 białek i nie posiada żadnego komponentu RNA [61].
Ostatnim ludzkim białkiem PPR jest białko małej podjednostki rybosomu mitochondrialnego MRPS27, wymagane do translacji mitochondrialnych transkryptów [62].
Ponieważ genom mitochondrialny i jego ekspresja u
drożdży rozszczepkowych wykazuje pewne podobieństwa do wyższych eukariontów, organizm ten jest również pomocnym modelem do badań mitochondrialnych
[31]. Przykładowo, biorąc pod uwagę znany zbiór białek
PPR z drożdży rozszczepkowych, można znaleźć funkcjonalne podobieństwa aż do 4 ludzkich białek PPR, to jest;
MRPS27 (Ppr2); PTCD1 (Ppr5); PTCD3 (Ppr3) oraz LRPPRC (Ppr4). Szczególnie istotna dla genomu mitochondrialnego wydaje się funkcja białek PTCD3 i LRPPRC,
jako że ich funkcjonalne homologi (Dmr1p oraz Pet309p,
odpowiednio) można też znaleźć u tak odległego ewolucyjnie gatunku jak drożdże piekarskie. Mimo wszystko,
duża część drożdżowych białek PPR wydaje się być specyficzna tylko dla danego organizmu (np. funkcja Ppr1 u
drożdży rozszczepkowych lub Sov1p i Rmd9p u drożdży
piekarskich). Można to wytłumaczyć przez fakt, że pierwotne jednostki transkrypcyjne u odległych ewolucyjnie
gatunków często różnią sie liczbą i składem genowym, a
tym samym mogą wymagać unikatowych, specyficznych
genowo czynników do ich obróbki i ekspresji. Przykładowo, brak jest intronów w ludzkim mtDNA, który dodatkowo koduje 7 podjednostek dla kompleksu I, nieobecnego u drożdży piekarskich i rozszczepkowych. Niemniej,
ze względu na problematyczne wykrywanie motywów
PPR w genomach nieroślinnych, wydaje się, że wszystkie
białka PPR zarówno u drożdży, jak i u człowieka nie zostały nadal zidentyfikowane.
Postępy Biochemii 61 (4) 2015
POTENCJALNIE ZASTOSOWANIA
PRAKTYCZNE BIAŁEK PPR
Białka PPR, choć jeszcze nie tak dokładnie zbadane pod
względem strukturalnym jak rodziny białek TALEs i PUF,
jako białka syntetyczne mają potencjał stać się bardzo użytecznym narzędziem w biologii molekularnej. Tym bardziej,
że w teorii powinny umożliwiać rozpoznawanie dłuższych
sekwencji RNA niż białka PUF (do 9-ciu nukleotydów) [18].
W ostatnich latach liczne badania poświęcono rodzinie
białek TALEs, których modularna struktura, wraz z przewidywalnym kodem wiązania, umożliwia tworzenie nowych,
syntetycznych białek wiążących konkretne sekwencje DNA
[19,63]. Białka TALEs, podobnie jak białka PUF i PPR należą do nadrodziny alfa-solenoidowej. W przypadku białek
TALEs i PUF eksperymenty dążące do projektowania białek
wiążących konkretne sekwencje DNA i RNA zakończyły się
sukcesem [64,65].
W odpowiedni sposób zaprojektowane białka PPR mogą
szczególnie dobrze nadawać się do wpływania na regulację ekspresji genomów organelli. Należy jednak brać pod
uwagę, iż żadne występujące w przyrodzie białko nie jest
wyłącznie modularne, w związku z czym sekwencja poszczególnych motywów PPR ewoluowała nie tylko w kierunku rozpoznawania poszczególnych nukleotydów RNA,
istotnym czynnikiem selekcyjnym niewątpliwie była także stabilność struktury trzeciorzędowej białka jako całości
[66]. Niemniej, pierwsze próby projektowania i produkcji
syntetycznych białek PPR zostały już podjęte, a otrzymane
syntetyczne białko synthPPR charakteryzuje się, w przeciwieństwie do natywnych białek PPR, wysoką rozpuszczalnością i stabilnością w roztworach [67]. Tym samym, dalsze
badania nad dokładną rolą pojedynczych aminokwasów w
wiązaniu RNA wydają się być niezbędne, aby umożliwić
szersze zastosowanie białek PPR w biologii syntetycznej i
biotechnologii.
PIŚMIENICTWO
1. Ban T, Ke J, Chen R, Gu X, Tan MH, Zhou XE, Kang Y, Melcher K,
Zhu JK, Xu HE (2013) Structure of a PLS-class pentatricopeptide repeat
protein provides insights into mechanism of RNA recognition. J Biol
Chem 288: 31540-31548
2. Yin P, Li Q, Yan C, Liu Y, Liu J, Yu F, Wang Z, Long J, He J, Wang HW,
Wang J, Zhu JK, Shi Y, Yan N (2013) Structural basis for the modular
recognition of single-stranded RNA by PPR proteins. Nature 504: 168171
3. Rivals E, Bruyere C, Toffano-Nioche C, Lecharny A (2006) Formation
of the Arabidopsis pentatricopeptide repeat family. Plant Physiol 141:
825-839
4. Cazalet C, Gomez-Valero L, Rusniok C, Lomma M, Dervins-Ravault
D, Newton HJ, Sansom FM, Jarraud S, Zidane N, Ma L, Bouchier C,
Etienne J, Hartland EL, Buchrieser C (2010) Analysis of the Legionella
longbeachae genome and transcriptome uncovers unique strategies to
cause Legionnaires’ disease. PLoS Genet 6: e1000851
5. Schallenberg-Rudinger M, Lenz H, Polsakiewicz M, Gott JM, Knoop
V (2013) A survey of PPR proteins identifies DYW domains like those
of land plant RNA editing factors in diverse eukaryotes. RNA Biol 10:
1549-1556
6. Barkan A, Small I (2014) Pentatricopeptide repeat proteins in plants.
Annu Rev Plant Biol 65: 415-442
413
7. O’Toole N, Hattori M, Andres C, Iida K, Lurin C, Schmitz-Linneweber
C, Sugita M, Small I (2008) On the expansion of the pentatricopeptide
repeat gene family in plants. Mol Biol Evol 25: 1120-1128
8. Sugita M, Ichinose M, Ide M, Sugita C (2013) Architecture of the PPR
gene family in the moss Physcomitrella patens. RNA Biol 10: 1439-1445
9. Mach J (2009) Chloroplast RNA editing by pentatricopeptide repeat
proteins. Plant Cell 21: 17
10.Nakamura T, Sugita M (2008) A conserved DYW domain of the pentatricopeptide repeat protein possesses a novel endoribonuclease activity. FEBS Lett 582: 4163-4168
11.Robbins JC, Heller WP, Hanson MR (2009) A comparative genomics
approach identifies a PPR-DYW protein that is essential for C-to-U
editing of the Arabidopsis chloroplast accD transcript. RNA 15: 11421153
12.Wagoner JA, Sun T, Lin L, Hanson MR (2015) Cytidine deaminase
motifs within the DYW domain of two pentatricopeptide repeat-containing proteins are required for site-specific chloroplast RNA editing.
J Biol Chem 290: 2957-2968
13.Chateigner-Boutin AL, des Francs-Small CC, Delannoy E, Kahlau S,
Tanz SK, de Longevialle AF, Fujii S, Small I (2011) OTP70 is a pentatricopeptide repeat protein of the E subgroup involved in splicing of the
plastid transcript rpoC1. Plant J 65: 532-542
14.Meierhoff K, Felder S, Nakamura T, Bechtold N, Schuster G (2003)
HCF152, an Arabidopsis RNA binding pentatricopeptide repeat protein
involved in the processing of chloroplast psbB-psbT-psbH-petB-petD
RNAs. Plant Cell 15: 1480-1495
15.Pfalz J, Bayraktar OA, Prikryl J, Barkan A (2009) Site-specific binding
of a PPR protein defines and stabilizes 5’ and 3’ mRNA termini in chloroplasts. EMBO J 28: 2042-2052
16.Fujii S, Toriyama K (2009) Suppressed expression of Retrograde-Regulated Male Sterility restores pollen fertility in cytoplasmic male sterile
rice plants. Proc Natl Acad Sci USA 106: 9513-9518
17.Kazama T, Nakamura T, Watanabe M, Sugita M, Toriyama K (2008)
Suppression mechanism of mitochondrial ORF79 accumulation by Rf1
protein in BT-type cytoplasmic male sterile rice. Plant J 55: 619-628
18.Lu G, Dolgner SJ, Hall TM (2009) Understanding and engineering
RNA sequence specificity of PUF proteins. Curr Opin Struct Biol 19:
110-115
19.Moscou MJ, Bogdanove AJ (2009) A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science 326: 1501
20.Barkan A, Rojas M, Fujii S, Yap A, Chong YS, Bond CS, Small I (2012)
A combinatorial amino acid code for RNA recognition by pentatricopeptide repeat proteins. PLoS Genet 8: e1002910
21.Ke J, Chen RZ, Ban T, Zhou XE, Gu X, Tan MH, Chen C, Kang Y, Brunzelle JS, Zhu JK, Melcher K, Xu HE (2013) Structural basis for RNA
recognition by a dimeric PPR-protein complex. Nat Struct Mol Biol 20:
1377-1382
22.Schmitz-Linneweber C, Small I (2008) Pentatricopeptide repeat proteins: a socket set for organelle gene expression. Trends Plant Sci 13:
663-670
23.Fujii S, Small I (2011) The evolution of RNA editing and pentatricopeptide repeat genes. New Phytol 191: 37-47
24.Castandet B, Araya A (2012) The nucleocytoplasmic conflict, a driving
force for the emergence of plant organellar RNA editing. IUBMB Life
64: 120-125
25.Gray MW, Lukeš J, Archibald JM, Keeling PJ, Doolittle WF (2010) Cell
biology. Irremediable complexity? Science 330: 920-921
26.Lukeš J, Archibald JM, Keeling PJ, Doolittle WF, Gray MW (2011) How
a neutral evolutionary ratchet can build cellular complexity. IUBMB
Life 63: 528-537
27.Herbert CJ, Golik P, Bonnefoy N (2013) Yeast PPR proteins, watchdogs
of mitochondrial gene expression. RNA Biol 10: 1477-1494
28.Manna S, Barth C (2013) Identification of a novel pentatricopeptide repeat subfamily with a C-terminal domain of bacterial origin acquired
via ancient horizontal gene transfer. BMC Res Notes 6: 525
30.Tanyuksel M, Petri WA, Jr. (2003) Laboratory diagnosis of amebiasis.
Clin Microbiol Rev 16: 713-729
31.Chiron S, Gaisne M, Guillou E, Belenguer P, Clark-Walker GD, Bonnefoy N (2007) Studying mitochondria in an attractive model: Schizosaccharomyces pombe. Methods Mol Biol 372: 91-105
32.Lipiński KA, Kaniak-Golik A, Golik P (2010) Maintenance and expression of the S. cerevisiae mitochondrial genome — from genetics to evolution and systems biology. Biochim Biophys Acta 1797: 1086-1098
33.Perocchi F, Jensen LJ, Gagneur J, Ahting U, von Mering C, Bork P, Prokisch H, Steinmetz LM (2006) Assessing systems properties of yeast
mitochondria through an interaction map of the organelle. PLoS Genet
2: e170
34.Cannino G, Di Liegro CM, Rinaldi AM (2007) Nuclear-mitochondrial
interaction. Mitochondrion 7: 359-366
35.Deshpande AP, Patel SS (2012) Mechanism of transcription initiation
by the yeast mitochondrial RNA polymerase. Biochim Biophys Acta
1819: 930-938
36.Jiang H, Sun W, Wang Z, Zhang J, Chen D, Murchie AI (2011) Identification and characterization of the mitochondrial RNA polymerase
and transcription factor in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.
Nucleic Acids Res 39: 5119-5130
37.Deshpande AP, Patel SS (2014) Interactions of the yeast mitochondrial
RNA polymerase with the +1 and +2 promoter bases dictate transcription initiation efficiency. Nucleic Acids Res 42: 11721-11732
38.Schafer B (2005) RNA maturation in mitochondria of S. cerevisiae and
S. pombe. Gene 354: 80-85
39.Nicholls TJ, Rorbach J, Minczuk M (2013) Mitochondria: mitochondrial RNA metabolism and human disease. Int J Biochem Cell Biol 45:
845-849
40.Krause K, Dieckmann CL (2004) Analysis of transcription asymmetries along the tRNAE-COB operon: evidence for transcription attenuation and rapid RNA degradation between coding sequences. Nucleic
Acids Res 32: 6276-6283
41.Herrmann JM, Woellhaf MW, Bonnefoy N (2013) Control of protein
synthesis in yeast mitochondria: the concept of translational activators.
Biochim Biophys Acta 1833: 286-294
42.Kehrein K, Schilling R, Moller-Hergt BV, Wurm CA, Jakobs S, Lamkemeyer T, Langer T, Ott M (2015) Organization of mitochondrial gene
expression in two distinct ribosome-containing assemblies. Cell Rep,
in press
43.Eddy SR (2004) What is a hidden Markov model? Nat Biotechnol 22:
1315-1316
44.Karpenahalli MR, Lupas AN, Söding J (2007) TPRpred: a tool for prediction of TPR-, PPR- and SEL1-like repeats from protein sequences.
BMC Bioinformatics 8: 2
45.Lipiński KA, Puchta O, Surendranath V, Kudła M, Golik P (2011) Revisiting the yeast PPR proteins-application of an Iterative Hidden Markov Model algorithm reveals new members of the rapidly evolving
family. Mol Biol Evol 28: 2935-2948
46.Kuhl I, Dujeancourt L, Gaisne M, Herbert CJ, Bonnefoy N (2011) A
genome wide study in fission yeast reveals nine PPR proteins that regulate mitochondrial gene expression. Nucleic Acids Res 39: 8029-8041
47.Holzmann J, Frank P, Loffler E, Bennett KL, Gerner C, Rossmanith W
(2008) RNase P without RNA: identification and functional reconstitution of the human mitochondrial tRNA processing enzyme. Cell 135:
462-474
48.Pfeffer S, Woellhaf MW, Herrmann JM, Forster F (2015) Organization
of the mitochondrial translation machinery studied in situ by cryoelectron tomography. Nat Commun 6: 6019
49.Chou JY, Hung YS, Lin KH, Lee HY, Leu JY (2010) Multiple molecular
mechanisms cause reproductive isolation between three yeast species.
PLoS Biol 8: e1000432
50.Lee HY, Chou JY, Cheong L, Chang NH, Yang SY, Leu JY (2008) Incompatibility of nuclear and mitochondrial genomes causes hybrid
sterility between two yeast species. Cell 135: 1065-1073
29.Manna S (2015) An overview of pentatricopeptide repeat proteins and
their applications. Biochimie 113: 93-99
414
www.postepybiochemii.pl
51.Lightowlers RN, Chrzanowska-Lightowlers ZM (2013) Human pentatricopeptide proteins: only a few and what do they do? RNA Biol 10:
1433-1438
52.Arnold JJ, Smidansky ED, Moustafa IM, Cameron CE (2012) Human
mitochondrial RNA polymerase: structure-function, mechanism and
inhibition. Biochim Biophys Acta 1819: 948-960
53.Gohil VM, Nilsson R, Belcher-Timme CA, Luo B, Root DE, Mootha VK
(2010) Mitochondrial and nuclear genomic responses to loss of LRPPRC expression. J Biol Chem 285: 13742-13747
54.Ruzzenente B, Metodiev MD, Wredenberg A, Bratic A, Park CB, Camara Y, Milenkovic D, Zickermann V, Wibom R, Hultenby K, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Brandt U, Stewart JB, Gustafsson CM,
Larsson NG (2012) LRPPRC is necessary for polyadenylation and coordination of translation of mitochondrial mRNAs. EMBO J 31: 443456
55.Sasarman F, Brunel-Guitton C, Antonicka H, Wai T, Shoubridge EA,
Consortium L (2010) LRPPRC and SLIRP interact in a ribonucleoprotein complex that regulates posttranscriptional gene expression in mitochondria. Mol Biol Cell 21: 1315-1323
56.Debray FG, Morin C, Janvier A, Villeneuve J, Maranda B, Laframboise R, Lacroix J, Decarie JC, Robitaille Y, Lambert M, Robinson BH,
Mitchell GA (2011) LRPPRC mutations cause a phenotypically distinct
form of Leigh syndrome with cytochrome c oxidase deficiency. J Med
Genet 48: 183-189
57.Cooper MP, Uldry M, Kajimura S, Arany Z, Spiegelman BM (2008)
Modulation of PGC-1 coactivator pathways in brown fat differentiation through LRP130. J Biol Chem 283: 31960-31967
58.Davies SM, Rackham O, Shearwood AM, Hamilton KL, Narsai R,
Whelan J, Filipovska A (2009) Pentatricopeptide repeat domain protein 3 associates with the mitochondrial small ribosomal subunit and
regulates translation. FEBS Lett 583: 1853-1858
59.Rackham O, Davies SM, Shearwood AM, Hamilton KL, Whelan J, Filipovska A (2009) Pentatricopeptide repeat domain protein 1 lowers the
levels of mitochondrial leucine tRNAs in cells. Nucleic Acids Res 37:
5859-5867
60.Xu F, Ackerley C, Maj MC, Addis JB, Levandovskiy V, Lee J, Mackay
N, Cameron JM, Robinson BH (2008) Disruption of a mitochondrial
RNA-binding protein gene results in decreased cytochrome b expression and a marked reduction in ubiquinol-cytochrome c reductase activity in mouse heart mitochondria. Biochem J 416: 15-26
61.Gobert A, Pinker F, Fuchsbauer O, Gutmann B, Boutin R, Roblin P,
Sauter C, Giege P (2013) Structural insights into protein-only RNase P
complexed with tRNA. Nat Commun 4: 1353
62.Davies SM, Lopez Sanchez MI, Narsai R, Shearwood AM, Razif MF,
Small ID, Whelan J, Rackham O, Filipovska A (2012) MRPS27 is a pentatricopeptide repeat domain protein required for the translation of
mitochondrially encoded proteins. FEBS Lett 586: 3555-3561
63.Boch J, Scholze H, Schornack S, Landgraf A, Hahn S, Kay S, Lahaye T,
Nickstadt A, Bonas U (2009) Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science 326: 1509-1512
64.Cooke A, Prigge A, Opperman L, Wickens M (2011) Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold. Proc Natl
Acad Sci USA 108: 15870-15875
65.Zhang F, Cong L, Lodato S, Kosuri S, Church GM, Arlotta P (2011) Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating
mammalian transcription. Nat Biotechnol 29: 149-153
66.Filipovska A, Rackham O (2013) Pentatricopeptide repeats: modular
blocks for building RNA-binding proteins. RNA Biol 10: 1426-1432
67.Gully BS, Shah KR, Lee M, Shearston K, Smith NM, Sadowska A, Blythe AJ, Bernath-Levin K, Stanley WA, Small ID, Bond CS (2015) The
design and structural characterization of a synthetic pentatricopeptide
repeat protein. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 71: 196-208
PPR proteins — modular factors regulating
expression of organellar genomes
Bartosz Zapisek, Jakub Piątkowski
Institute of Genetics and Biotechnology; Faculty of Biology, University of Warsaw, 5a Pawińskiego St., 02-106 Warsaw, Poland

e-mail: [email protected]
Key words: mitochondria, plastids, PPR protein, RNA metabolism, mtDNA, regulation of expression
ABSTRACT
PPR proteins make up the most numerous family of RNA-binding proteins identified to date. They localize almost exclusively to plastids
and mitochondria of eukaryotic organisms. The most striking feature of this family is the expansion of PPR protein-encoding genes in vascular plants, which likely coincided with plants colonizing land. PPR proteins participate in stabilizing, editing, splicing, degradation and
processing of policistronic transcripts, as well as translation activation in mitochondria and plastids. Although the number of PPR proteins in
non-plant organisms is significantly smaller than in plants, they still play a crucial role in regulating the expression of mtDNA. Disruptions
of PPR protein-encoding genes usually result in severe phenotypic consequences. Plant PPR proteins bind RNA in a sequence-specific manner, where a single PPR motif recognizes an individual nucleotide in a given sequence. This opens up possibilities for engineering de novo
synthetic protein sequences that would interact with precisely determined organellar sequences, thus enabling modulation of mtDNA and
ctDNA expression.
Postępy Biochemii 61 (4) 2015
415
Download
Random flashcards
123

2 Cards oauth2_google_0a87d737-559d-4799-9194-d76e8d2e5390

bvbzbx

2 Cards oauth2_google_e1804830-50f6-410f-8885-745c7a100970

Pomiary elektr

2 Cards m.duchnowski

Create flashcards