diagnostyka molekularna

Diagnostyka molekularna i terapia genowa
Dr hab. Józef Dulak
Zakład Biochemii Komórki
Wydział Biotechnologii UJ
Ul. Gronostajowa 7
30-387 Kraków
Email: [email protected]
Odkrywanie
przeznaczenia
Kariotyp
Kariotyp ludzki – zestaw wszystkich
chromosomów składa się z z 22 par
chromosomów autosomalnych i
chromosomów płci (XX u kobiety, XY u
mężczyzny). Ryc. 1. Barwienie barwnikami
specyficznymi dla poszczególnych par
chromosomów.
Aberracje chromosomowe
Utrata, powielenie lub pęknięcie
chromosomów powoduje określone
objawy kliniczne. Ryc.2. Kariotyp
komórek nowotworowych płuc.
(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)
Choroby genetyczne
Stanowią różnorodną grupę zaburzeń spowodowanych przez mutacje
punktowe, duże mutacje i nieprawidłowości chromosomowe
1.
Defekty pojedynczych genów (zaburzenia mendlowskie) wywołane
przez mutacje, których rezultatem jest synteza uszkodzonych
białek lub zaprzestanie syntezy. Mutacje mogą być dziedziczone
lub powstawać de novo w rodzicielskich komórkach rozrodczych.
2.
Zaburzenia chromosomowe polegają na utracie lub zyskaniu
chromosomów, albo na zmianach w ich strukturze. Większość
zaburzeń chromosomowych powstaje de novo w rodzicielskich
komórkach rozrodczych.
•
Nieprawidłowości związane z liczbą chromosomów – dotyczą
obecności wielokrotności kopii całego aparatu chromosomów
(poliploidy) albo polegają na utracie lub powieleniu pojedynczego
chromosomu (aneuploidy)
•
Nieprawidłowości strukturalne chromosomów wynikają z
pęknięcia chromosomu i obejmują delecje, duplikacje czy
rearanżacje chromosomu
3.
Zaburzenia wieloczynnikowe spowodowane są przez zespół genów
i czynników środowiskowych. Obejmują wiele powszechnych
chorób (osteoporoza, choroba wieńcowa)
(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)
Tempo identyfikacji genów sprzężonych z chorobami
genetycznymi (1981 do 2000). Do roku 2000 zidentyfikowano
1112 genów, warunkujących choroby. Te dane nie obejmują 94
chorób warunkowanych fuzją genów, będąca wynikiem translokacji.
Liczby w nawiasach wskazują „gen-kandydat” podejrzany o
sprzężenie z chorobą.
Mutacje DNA
Zmiany sekwencji DNA organizmu
spowodowane działaniem czynników
chemicznych, fizycznych lub błędami w
replikacji DNA.
Mutacje punktowe – zmiana pojedynczej
zasady:
Zmiany sensu
Nonsensowne
Fazy odczytu
Miejsc składania
Duże mutacje – zmiana więcej niż jednej
zasady:
Delecje
Insercje
Inwersje (rearanżacje)
Mutacje dynamiczne
Zaburzenia struktury i liczby chromosomów
Delecje
Insercje
Rearanżacje
Translokacje
Aneuploidy i poliploidy
Origin of chronic myelogenous leukemia
Origin of chronic myelogenous leukemia
Origin of chronic myelogenous leukemia
http://www.cmlsupport.com/cmlstiresourcecenter.htm
CCT
CCT
GAG
GTG
GAG
GAG
From Anthony Cerami and Charles M. Peterson,
"Cyanate and Sickle-Cell Disease." Copyright ©1975 by
Scientific American, Inc. All rights reserved.)
Wykrywanie mutacji w genie β-globiny – anemia sierpowata
Kopiarka inżyniera genetyka
ILLUSTRATION: TERRY SMITH
Molecular Biology of the Cell
Przyspieszony kurs wiedzy nt. replikacji DNA...
5’-CACGTGTGC TTCTGGATT CATT CAGGGACC TTGC ACA-3’
3’-GTGCACACG AAGACCTAAGTAAGT CCCT GGAACGTGT-5’
Denaturacja
5’-CACGTGTGC TTCTGGATT CATT CAGGGACC TTGC ACA-3’
GGAAGGTGT-5’
replikacja DNA
replikacja DNA
5’-CGTGT GC TT
3’-GTGCACACG AAGACCTAAGTAAGT CCCT GGAACGTGT-5’
Reakcja łańcuchowa polimerazy - PCR
Reakcja łańcuchowa polimerazy - PCR
Etapy reakcji łańcuchowej polimerazy (1)
1. Izolacja kwasu nukleinowego (nawet z b. małej ilości materiału)
2. Umieszczenie w probówce DNA, nukleotydów, starterów,
polimerazy DNA (wszystko w odpowiednim buforze – K+, Mg2+)
3. Umieszczenie probówek w termocyklerze
Etapy reakcji łańcuchowej polimerazy (2)
1.
2.
3.
4.
Wstępna denaturacja – 94oC – 5 minut
Denaturacja – 94oC – 40 sekund
Przyłączenie starterów – 58oC – 40 sekund
Replikacja – 72oC – 40 sekund
Etapy 2-4 powtarzane są 30-35 razy...
Tu mieszka Thermus thermophilus
Analysing of DNA- gel electrophoresis
Mutacje – przyczyny chorób
Człowiek zdrowy
Człowiek chory
na mukowiscydozę
-zazwyczaj umiera
do 20 roku życia
DIAGNOSTYKA PRENATALNA
PCR 10 eksonu genu warunkującego mukowiscydozę (CF) w rodzinie, w której
rodzice są nosicielami mutacji ∆F508
Tor 1 – marker wielkości; tor 2 –
kontr. neg; tor 3-homozygota
∆F508; tor 4-prawidłowy DNA; tor
– ojciec –nosiciel zmutowanego
allelu; tor – matka, nosicielka
zmutowanego allelu, tor- płód - ?
(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)
Diagnostyka molekularna
Wykrywanie wirusa HIV-1
Wykrywanie wirusów jest jednym z najtrudniejszych zadań
diagnostycznych
(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)
Diagnostyka molekularna
Wykrywanie mutacji w genie BRCA1
Mutacje
genu
Częstość
wyst.
defektu u
kobiet
% nowotworów
piersi w
populacji
BRCA1
1:500 do
1:2000
8%<40lat
1%>50lat
ATM
1:80 do
1:200
do 8%
p53
1:10 000
1%<35 lat
HRAS1
1:10 do
1:20
do 8%
2430T>C
3232A>G
3667A>G
4427T>C
Molecular Medicine – Trent RJ
(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)
Sekwencja DNA
W Projekcie Sekwencjonowania Genomu Człowieka zastosowano metodę opisaną w
1977 roku przez Freda Sangera. W styczniu 2001 roku przedstawiono 2 700 000 000 par
zasad genomu człowieka z czego około 1 000 000 000 z dokładnością 99.99%.
(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)
Mutacje w genie DMD
Substytucja C>T w eksonie 45
1052
Kontrola
Biochimie 79, 1997; Zakład Genetyki Człowieka PAN, Poznań
(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)
Mikromacierze
Mikromacierze DNA/Czujniki DNA/Czipy DNA/Genetyczne mikroprocesory
Mikromacierze w badaniu ekspresji genów
Mikromacierze w badaniu ekspresji genów
Fig. 3. Genes distinguishing acute
lymphoid leukaemia (ALL) from
acute myeloid leukaemia (AML).
The figure shows the 50 genes
with the greatest distinction
between ALL and AML, the top
panel showing genes more highly
expressed in ALL and the bottom
panel showing genes more highly
expressed in AML. Each row
corresponds to a gene, with the
columns corresponding to
expression levels of these genes in
different patient samples.
Expression levels greater than the
mean are red, and those below the
mean are blue. The scale indicates
standard deviations above or
below the mean. (Adapted with
permission from Golub et al5)
DIAGNOSTYKA PRENATALNA
AMNIOCENTEZA - aspiracja płynu owodniowego za pomocą specjalnej, cienkiej
igły i założeniu hodowli komórek owodniowych (diagnostyka molekularna) oraz
analizie w kierunku stężenia markerów płodowych, takich jak α-fetoproteina
(AFP).
Amniocentezę wykonuje się zwykle
w 15-17 tyg. ciąży (są próby w 1114 tyg.). Wyniki z hodowli
uzyskuje się po 2-4 tyg., w
zależności od techniki hodowli
Powikłania:
-
(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)
niezaaspirowanie płynu pod
wpływem skurczu macicy
powikłania matczyne
polegające na plamieniu i
przecieku płynu owodniowego
poronienia - ryzyko 0,5%
uraz płodu igłą aspiracyjną –
ultrasonograf minimalizuje
ryzyko
Genetyczna diagnostyka pre-implantacyjna
Źródła materiału do badań
•
•
•
•
•
•
•
•
Krew
Nasienie
Ślina
Mocz
Włos
Ząb
Kość
Tkanka
(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)
DNA satelitarny
¾ DNA satelitarny – sekwencje DNA składające się z krótkich
powtarzających się motywów (zwykle od 5-200 bp), charakterystyczne dla
eukariontów.
¾ DNA minisatelitarny to powtórzenia krótszych, kilkunukleotydowych
jednostek, a DNA mikrosatelitarny to powtórzenia sekwencji najwyżej
cztero- a często dwu-nukleotydowych:
Np.
-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA-CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT¾ Wiele mikrosatelitów jest polimorficznych, różniąc się u poszczególnych
osób liczbą powtórzeń, gdyż podczas replikacji DNA gubią się lub (rzadziej)
dodają kolejne pary. Pozwala to ustalenie tzw. profilu genetycznego, co
wykorzystuje się między innymi w kryminalistyce.
Krótkie tandemowe powtórzenia (STR)
AATG
7 powtórzeń
8 powtórzeń
Region powtórzeń jest zmienny natomiast sekwencje
DNA rozpoznawane przez startery są stałe
Homozygota = obydwa allele tej samej długości
Heterozygota = allele różnej długości
(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)
Analiza DNA mikrosatelitarnego
pozwala na ustalanie ojcostwa
?
OKREŚLANIE POKREWIEŃSTWA
1
2
3 4
DNA fingerprinting
DNA trawiono enzymem HinfI, a następnie
rozdzielono w żelu agarozowym i
hybrydyzowano z sondą molekularną
(CAC)5.
Tor 1, matka; tor 2, dziecko I; tor 3, dziecko
II; tor 4, domniemany ojciec, którego
ojcostwo badanie wykluczyło. Dzieci są
bliźniętami dizygotycznymi
Laboratorium Genetyki Molekularnej, Poznań
(udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)
¾ F.L. Smith został skazany za gwałt i morderstwo
ośmioletniej dziewczynki.
¾ Został skazany na dożywocie – zmarł po 14 latach w
więzieniu w Teksasie
¾ Analiza mikrosatelitarnego DNA wykazała, że był
niewinny.
2. osoba
1. osoba
Frank Lee Smith
Jedna z metod:
¾ Namnaża się fragmenty DNA
mikro-satelitarnego.
¾ Analizuje długość otrzymanych
fragmentów.
¾ Im więcej namnażanych
fragmentów, tym większa czułość
testu.
Do kogo jesteśmy podobni?...
Dziedziczenie cech psychicznych
Minnesota Twin Studies
Współczynniki korelacji występowania tych samych cech
U bliźniąt jedno- i dwujajowych wychowywanych oddzielnie
Cecha
Bliźnięta
jednojajowe
Bliźnięta
dwujajowe
Cechy osobowości
łącznie
0,45
0,26
Depresja
Wrogość
Fobie
0,48
0,4
0,55
<0,05
0,05
0,32
Religijność
0,61
-0,12
Każda cecha ma podłoże genetyczne...
Zdumiewiająca hipoteza
F. Crick
Czyli nauka o pochodzeniu duszy
Zmienianie przeznaczenia
Terapia genowa
wykorzystanie kwasów nukleinowych w charakterze leków
Białko
lecznicze
Gen
terapeutyczny
Wektor
Pacjent
Ekspresja genu terapeutycznego
Efekt leczniczy
Jakie choroby można leczyć za pomocą terapii genowej?
Czy terapia genowa jest potrzebna?
Narodziny terapii genowej - 1962
Komórki HPRT-/pożywka HAT
Prof.Wacław Szybalski
Ge
Po
ży
nH
wk
aH
AT
PR
T
McArdle Laboratory
for Cancer Research,
Wisconsin, Madison,
USA
Komórki HPRT+/+
Konsekwencje braku funkcjonalnego genu HPRT
HPRT
Choroba Lescha-Nyhana
Genetyczne strzykawki
Wektory AAV
(wirusy towarzyszące
adenowirusom)
Wektory retrowirusowe
Wektory adenowirusowe
plazmidowy DNA
Wektory retrowirusowe
ITR
gag pol env
ITR
retrowirus
• Wbudowują
transgen
do
genomu biorcy – zapewniają
długotrwałą ekspresję genu
• wbudowują
ITR
transgen
ITR
Wektor retrowirusowy
się w przypadkowe
miejsce
chromosomu
–
mogą
powodować mutagenezę insercyjną