Drożdże piekarskie jako organizm modelowy w genetyce

Drożdże piekarskie jako organizm
modelowy w genetyce
W dobie nowoczesnych, szybko rozwijających się metod sekwencjonowania
DNA, naukowcy bez problemu potrafią zidentyfikować kolejność par
nukleotydowych wielu wariantów danego genu. Jednak rosnącym
wyzwaniem, któremu metody bioinformatyczne nie zawsze mogą sprostać,
staje się przypisanie funkcji danym allelom z uwzględnieniem mutacji,
które odpowiedzialne są za poszczególne choroby. Wyzwanie to podjął
międzynarodowy zespół naukowców z uniwersytetów w Stanach
Zjednoczonych, Kanadzie i Szwecji. Badacze wzięli pod lupę 179
wariantów 22 genów związanych z chorobami genetycznymi u człowieka i
przy pomocy drożdży piekarskich opracowali panel oparty na 26
komplementacjach genetycznych.
Od opublikowania w 1996 roku sekwencji genomu Saccharomyces cerevisiae stały
się one niezastąpionym elementem każdego laboratorium mikrobiologicznego.
Pomimo faktu, iż człowieka i komórki drożdży dzieli aż 1 miliard lat ewolucji, to
właśnie drożdże piekarskie stały się modelowym organizmem biologii
molekularnej eukariotów. Posiadają one wiele zalet: są nietoksyczne,
niepatogenne, nieskomplikowane w hodowli oraz niewymagające dużych
nakładów kosztów utrzymania hodowli.
Szeroki zakres aktualnie prowadzonych badań nad ekspresją genów wykonuje
się z właśnie udziałem drożdży piekarskich.
Niezwykle
istotnym
aspektem
jest
heterologiczna
(obca
gatunkowo) ekspresja genów innych eukariontów w komórkach drożdży. Fakt ten
nabrał większego znaczenia, kiedy wykazano, że wiele chorobotwórczych (a
czasem śmiertelnych) mutacji znajdujących się w genach ludzkich ma swoje
odpowiedniki (znane także jako ortologi) w genomie drożdży. Ponadto, możliwość
bezpośredniej heterologicznej ekspresji jak i badania drożdżowych homologów
genów ludzkich pozwoliły na lepsze zrozumienie mechanizmu transformacji
nowotworowych.
Specjalnie zmodyfikowane szczepy S. cerevisiae używane są szeroko na polu
biotechnologii medycznej w produkcji: leków (np. hirudiny), insuliny, szczepionek
na wirusowe zapalenie wątroby typu B, a także małych molekuł jak
hydrokortyzon. Co więcej, na komórkach drożdżowych wykonuje się badania nad
zjawiskiem wielolekowej oporności. Ich zastosowanie pozwoliło na
scharakteryzowanie białek z rodziny ABC transporterów, które są głównymi
mediatorami wielolekooporności u prokariotów i eukariotów [1].
W swoim najnowszym eksperymencie naukowcy opracowali zestaw testów
komplementacji opartych na systemie genetycznym drożdży szczepu
Saccharomyces cerevisiae.
Głównym celem badania było określenie potencjalnej patogeniczności 179
wariantów z 22 ludzkich genów, które są odpowiedzialne za rozwój chorób o
podłożu genetycznym.
Technika komplementacji genów zmutowanego organizmu modelowego
pokrewnymi genami ludzkimi jest klasyczną metodą w biologii molekularnej,
pozwalającą na identyfikację i przypisanie funkcji poszczególnym wariantom
ludzkich genów.
Zjawisko to polega na tym, że funkcja zmutowanego genu u organizmu
modelowego zostaje przywrócona na drodze komplementacji z typem dzikim genu
ludzkiego. Do celów swoich badań naukowcy wyselekcjonowali 22 geny,
odpowiedzialne za rozwój różnych, ludzkich chorób m.in schizofrenii, autyzmu,
raka piersi czy raka płuc. W badaniu stworzono dla tych 22 genów klony, które w
101 przypadkach były wariantami odpowiedzialnymi za choroby genetyczne,
natomiast pozostałe 78 dotychczas traktowano jako neutralne. Warianty tych
genów cechują się tak zwaną mutacją zmiany sensu, która do celów tego
eksperymentu została wprowadzona dzięki metodzie mutagenezy miejscowo
ukierunkowanej (ang. site directed mutagenesis). Następnie tak przygotowane
sekwencje DNA zostały wprowadzone do drożdżowych wektorów ekspresyjnych za
pomocą systemu klonowania Gateway, aż w końcu odpowiednie mutanty wrażliwe
na zmiany temperatury (ang. temperature-sensitive, ts mutants) drożdży
piekarskich zostały tym wektorem transformowane.
Przygotowane w ten sposób genetyczne konstrukty zostały poddane dwóm
równoległym testom w celu zaobserwowania wzrostu komórek drożdży. Pierwsza
z metod to test komplementacji, polegający na obserwacji wzrostu (lub jego
braku) kolonii na płytce ze stałą pożywką (ang. functional complementation by
spotting – FCS). Podstawową zasadą drugiej metody była hodowla komórek
drożdży w płynnej pożywce, gdzie wzrost liczby tych komórek mierzono
spektrofotometrycznie poprzez pomiar OD 600 (ang. functional complementation
by liquid growth time – course – FCT). Każdy wariant genetyczny został zbadany
równolegle z pozytywną i negatywną kontrolą.
Obydwie techniki pomiaru miały na celu pokazać, że wariant genu ludzkiego
podejrzewanego o powodowanie choroby genetycznej nie potrafi znieść mutacji w
genie ortologicznym organizmu modelowego drożdży. Brak komplementacji
oznaczał ujawnienie się fenotypu zmutowanego lub braku wzrostu komórki
drożdży. Jeżeli wariant genu ludzkiego okazał się być neutralny, potrafił znieść
mutację w konserwatywnym ewolucyjnie, pokrewnym genie u drożdży, co w
konsekwencji prowadziło do ujawnienia się typu dzikiego i wzrostu komórek
drożdży.
Wyniki testów FCS i FCT są obiecujące. Pokryły się one w 81% analizowanych
przypadków. Fakt ten sugeruje, że komplementacja lub jej brak jest zachowana
niezależnie od metody jej testowania. Pomimo tego, że testy mikrobiologiczne w
płynnej pożywce są lepsze jakościowo i ilościowo w porównaniu do metody
obserwacji wzrostu komórek mikroorganizmów na podłożu stałym, to w tym
wypadku defekt lub brak wzrostu komórek drożdży łatwiej było zaobserwować na
płytkach z pożywką stałą.
Niepodważalnym dowodem na skuteczność i wiarygodność opracowanych metod
stanowią wyniki testów komplementacji na wybranych genach ludzkich.
Niektóre warianty związanych z chorobami genów, których ekspresja w różnym
stopniu przyczynia się do ujawnienia charakterystycznych fenotypów klinicznych
danej choroby, zostały opisane szczegółowo w artykułach naukowych. Analizując
dane z literatury fachowej badacze sprawdzili czułość opracowanych testów
komplementacji. W jednym z przypadków przetestowano dwa warianty genu
HsGDI1 (gen ortologiczny u drożdży to ScGDI1) [2]. Mutacje w genie GDI1 są
powiązane z niespecyficznym, związanym z chromosomem X upośledzeniem
umysłowym [3]. Test komplementacji wykazał negatywny wynik dla wariantu
R423P, podczas gdy wariant L92P wykazał tylko częściową komplementację. Na
podstawie literatury, odpowiednio, pacjent noszący gen o wariancie R423P
charakteryzował się silniejszym fenotypem klinicznym niż pacjent z wariantem
genu L92P. Wynik ten dowodzi, że opracowane metody mogą posłużyć nie tylko w
identyfikowaniu chorobotwórczych wariantów danego genu, ale też w ich
ilościowej ocenie [2].
Drożdże piekarskie zostały użyte w badaniu nad patogenicznością
poszczególnych wariantów genów ludzkich.
Źródło Wikipedia, autor Rainis Venta, licencja CC BY-SA 3.0
Identyfikacja patogenicznych mutacji na podstawie testów komplementacyjnych
ma swoje ograniczenia. Jednak we współpracy z dynamicznie rozwijającymi się
metodami sekwencjonowania i zastosowaniu modelowego organizmu o bardzo
dobrze poznanym genomie, nowo opracowana platforma testów
komplementacyjnych niesie ze sobą duże możliwości na polu badań nad genetyką
organizmów. Wyniki opisanej pracy potwierdzają tezę, że zastępcze podłoże
genetyczne innego eukariotycznego organizmu może posłużyć do identyfikacji i
charakteryzacji patogenicznych wariantów genetycznych u ludzi.
inż. Adrianna Grzelak, biotechnolog
Piśmiennictwo:
1. Wawrzycka D., Drożdże jako model w badaniach chorób neurodegeneracyjnych,
Postepy Hig Med. Dosw (online), 2011; 65: 328-337
2. Sun S. et al, An extended set of yeast-based functional assays accurately
identifies human disease mutations, Genome Res., 2016 online access
3. NCBI Gene Database
Data publikacji: 18.05.2016r.