Polski Kongres Genetyki

advertisement
Polski Kongres
Genetyki
XV Zjazd Polskiego Towarzystwa Genetycznego
IV Zjazd Polskiego Towarzystwa Genetyki Człowieka
Warsztaty: Choroby genetyczne
Gdańsk, 6-9 września 2004 r.
Streszczenia
Gdańsk, 2004 r.
Druk materiałów związanych z Warsztatami pt. „Choroby
genetyczne: diagnostyka, możliwości leczenia, aspekty
etyczne” był sponsorowany przez Polską Sieć Biologii
Komórkowej i Molekularnej UNESCO/PAN.
Druk materiałów zjazdowych był sponsorowany
przez Ministerstwo Nauki i Informatyzacji.
Patronat honorowy
Minister Nauki
prof. dr hab. inż. Michał Kleiber
Minister Zdrowia
Marek Balicki
Wojewoda Pomorski
Cezary Dąbrowski
Prezydent Miasta Gdańska
Paweł Adamowicz
Prezes Polskiej Akademii Nauk
prof. dr hab. Andrzej B. Legocki
Rektor Akademii Medycznej w Gdańsku
prof. dr hab. med. Wiesław Makarewicz
Rektor Uniwersytetu Gdanskiego
dr hab. Andrzej Ceynowa, prof. UG
Rektor Politechniki Gdańskiej
prof. dr hab. inż. Janusz Rachoń
Druk sfinansowany przez Polską Sieć Biologii Molekularnej
oraz Ministerstwo Nauki i Informatyzacji
ISBN 83-920827-2-0
2
Komitet naukowy:
Prof. dr hab. Jerzy Bal
Instytut Matki i Dziecka, Zakład Genetyki Medycznej, Warszawa
Doc. dr hab. Ewa Bocian
Instytut Matki i Dziecka, Pracownia Cytogenetyki,
Zakład Genetyki Medycznej, Warszawa
Prof. dr hab. Kazimierz Jaszczak
Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN
Prof. dr hab. Magorzata Krajewska-Walasek
Instytut „Pomnik-Centrum Zdowia Dziecka”, Zakład Genetyki Medycznej, Warszawa,
Prof. dr hab. Józef Kur
Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny
Prof. dr hab. Janusz Limon
Katedra Biologii i Genetyki, Akademia Medyczna w Gdańsku
Prof. dr hab. Tadeusz Mazurczak
Instytut Matki i Dziecka, Zakład Genetyki Medycznej, Warszawa
Prof. dr hab. Jacek Pietrzyk
Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii,
Wydział Lekarski Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków
Doc. dr hab. med. Marek Sanak
Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków
Prof. dr hab. Zofia Szweykowska-Kulińska
Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu,
Wydział Biologii, Instytut Biologii Molekularnej
Prof. dr hab. Jacek Zaremba
Instytut Psychiatrii i Neurologii, Warszawa
Dr hab. Ewa Ziętkiewicz
Instytut Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu
Komitet Naukowy:
3
Komitet Organizacyjny:
Pracownicy i doktoranci
Katedry Biologii Molekularnej Uniwersytetu Gdańskiego:
prof. dr hab. Grzegorz Węgrzyn
dr Agata Czyż
dr Marcin Łoś
dr Agnieszka Szalewska-Pałasz
dr Joanna Jakóbkiewicz-Banecka
dr Monika Glinkowska
dr Sylwia Barańska
mgr Ewa Piotrowska
mgr Anna Węglewska
mgr Katarzyna Ulanowska
mgr Anna Szambowska
mgr Magdalena Narajczyk
4
Spis treści:
Warsztaty ................................................................................................................7
Genetyka człowieka .............................................................................................15
Neurogenetyka................................................................................................................................................15
Genetyka Kliniczna.........................................................................................................................................31
Epidemiologia genetyczna .........................................................................................................................38
Dysmorfologia ................................................................................................................................................59
Choroby wieloczynnikowe..........................................................................................................................79
Onkogenetyka .................................................................................................................................................93
Doniesienia różne ........................................................................................................................................ 118
Genetyka zwierząt ..............................................................................................123
Ekspresja genów, mapy genomowe, .................................................................................................... 123
polimorfizm genetyczny, ewolucja....................................................................................................... 123
Inżynieria genetyczna, biotechnologia ............................................................................................... 143
Mutacje, diagnostyka genetyczna, terapia ........................................................................................ 146
Dziedziczenie wielogenowe .................................................................................................................... 151
Genetyka roślin ..................................................................................................159
Genetyka molekularna .............................................................................................................................. 160
Mapowanie genetyczne ............................................................................................................................ 170
Genetyka rozwoju ....................................................................................................................................... 176
Genetyka populacji ..................................................................................................................................... 178
Mutacje, rekombinacja, replikacja ......................................................................................................... 189
Ekspresja genów .......................................................................................................................................... 193
Genomika i ewolucja molekularna........................................................................................................ 205
Diagnostyka, terapia, ................................................................................................................................ 211
inżynieria genetyczna, biotechnologia ............................................................................................... 211
Doniesienia różne: ....................................................................................................................................... 218
Suplement (streszczenia nadesłane po terminie) ........................................................231
Skorowidz nazwisk .............................................................................................237
5
Warsztaty
„Choroby genetyczne: diagnostyka, możliwości
leczenia, aspekty etyczne”
6 września 2004
1. Enzyme Replacement Therapy for MPS I.
J. E. Wraith
Willink Biochemical Genetics Unit, Royal Manchester Children’s Hospital, Manchester
The results of a randomized, double-blind, placebo-controlled, global study demonstrated that enzyme replacement
therapy with Aldurazyme was effective and safe for patients with MPS I. Functional measures relevant to
MPS I morbidity and mortality were chosen as efficacy endpoints to overcome the challenge of showing a treatment effect
in a short time period in patients with a chronic disease. Within 26 weeks, Aldurazyme produced clinically important
improvements in respiratory function and physical capacity.
Of the two primary endpoints of the pivotal study, the change in FVC (forced vital capacity) achieved statistical
significance (P = 0.016), while the change in the 6MWT (six minute walk test) approached statistical significance in the
main analysis (P = 0.066) and achieved significance by a pre-specified ANCOVA (P = 0.039). In patients with sleep apnea,
a statistically significant treatment effect was seen in AHI (-6.6 events/hr, P = 0.037) and in patients whose shoulder
flexion fell below the median baseline value, a positive trend was noted (13.4 degrees, P = 0.1). In addition, Aldurazyme
rapidly and effectively cleared accumulated substrate as evidenced by significant reductions in hepatomegaly (P = 0.001)
and urinary GAG levels (P < 0.001). These improvements occurred despite the fact that most patients had long-standing
disease with a mean duration of symptoms of 12.7 years. Earlier treatment, prior to the development of irreversible
changes, is expected to lead to better outcomes.
These results have been maintained in anopen-label extension to the study which has now gone well past 72 weeks. This
data will be presented to the meeting.
The initial safety profile and pharmacodynamic response of Aldurazyme in severe patients less than 5 years old is similar
to that of older patients with attenuated disease. In both groups the product seems very safe with very few serious
infusion associated reactions and drug-related adverse events.
The use of Adurazyme as an adjunct to bone marrow transplantation is also under study and preliminary data suggests
that this may be a very useful therapy in improving the patient’s condition prior to BMT and in helping to prevent graft
rejection.
2. Możliwości leczenia genetycznie uwarunkowanych chorób metabolicznych.
A. Tylki-Szymańska
Klinika Pediatrii, Oddział Chorób Metabolicznych, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa
Choroby lizosomalne możemy zdefiniować jako defekty aparatu lizosomalnego wynikające z deficytu aktywności
enzymów lizosomalnych lub białek transportowych/receptorowych błony lizosmalnej. Wspólną cechą wszystkich
chorób lizosomalnych jest gromadzenie substratów lub produktów reakcji głównie w lizosomach. Niewydolność aparatu
lizosomalnego stymuluje wiele procesów kompensacyjnych, po wyczerpaniu których zaburzeniu ulega złożona funkcja
i struktura komórki, prowadząc do jej zniszczenia, a w następstwie do charakterystycznych objawów klinicznych.
W miarę jak poznawane były przyczyny i patomechanizm chorób lizosomalnych, krystalizowało się wyzwanie ich
leczenia. Do lat osiemdziesiątych możliwe do zaproponowania chorym było jedynie leczenie paliatywne, które do chwili
obecnej dla większości chorób jest jedyną formą pomocy pozwalającą zmniejszyć uciążliwość niektórych objawów
i poprawić komfort życia.
7
Warsztaty
Enzymatyczne leczenie substytucyjne zostało zaproponowane po raz pierwszy przez Bradego w 1965 roku dla chorych
z chorobą Gaucher’a. W 1974 roku dowiedziono, że podanie dożylnie oczyszczonego enzymu – glukocerebrozydazy,
znacznie obniża poziom glukocerebrozydu w wątrobie i we krwi. Otworzyło to drogę do terapii enzymatycznej
w chorobach lizosomalnych. Aktualnie można już leczyć tą metodą chorobę Fabry’ego, Hurler, Pompego (oczekuje
się wkrótce preparatów do leczenia chorych z chorobą Huntera, Maroteaux-Lamy i Niemanna-Picka B). Wczesne
zastosowanie tego typu leczenia może zapobiec w ogóle wystąpieniu objawów klinicznych. Leczenie enzymatyczne
nie pokonuje bariery krew-mózg i stanowi to przeszkodę w zastosowaniu go w tych postaciach chorób lizosomalnych,
w których dominuje zajęcie oun.
Stało się to powodem do szukania jeszcze innych rozwiązań terapeutycznych; jednym z nich jest metoda hamowania
syntezy substratu. N-butyldeoxynojirimycin (OGT 918) hamuje glukozyltransferazę – enzym kluczowy dla syntezy
glikosfingolipidów. Stąd preparat może znaleźć zastosowanie w leczeniu wielu sfingolipidoz. Wprowadzenie tej metody
leczenia u pacjentów, u których aktywność resztkowa enzymu jest wystarczająca do rozłożenia mniejszej ilości substratu,
może sprawić, że skutki choroby staną się nieuchwytne.
Leczenie chorób lizosomalnych spowodowanych defektami białek wchodzących w skład błony lizosomalnej
(ch. Niemanna-Picka C (II), sialidozy) sprawia największe trudności. Dla większości tego typu chorób pozostaje terapia
genowa. Przeprowadzono wiele prób klinicznych z tego typu leczeniem, jednak nie udało się dotychczas wykazać
długotrwałego efektu korygującego.
W leczeniu chorób lizosomalnych nastąpił wręcz zaskakujący postęp w minionym dwudziestoleciu, dający nadzieję
w dalszej przyszłości na leczenie innych chorób spowodowanych wadami metabolizmu.
3. Choroby lizosomalne – rozpoznawanie laboratoryjne i występowanie w Polsce.
B. Czartoryska
Zakład Genetyki, Instytut Psychiatrii i Neurologii, Warszawa
Spichrzeniowe choroby lizosomalne to grupa wrodzonych wad metabolizmu, w których mutacja prowadzi do
niewydolności układu lizosomalnego komórek i, w konsekwencji, do wewnątrzlizosomalnego gromadzenia
niezdegradowanych substancji czego skutkiem jest cała kaskada zjawisk patologicznych.
Do grupy tej zaliczamy ponad 40 chorób, w tym mukopolisacharydozy (9), sfingolipidozy (7) mukolipidozy
i glikoproteinozy (oligosacharydozy, 7), ceroidolipofuscynozy (8) itd. Na ogół błąd genetyczny dotyczy jednego enzymu
lizosomalnego, niekiedy enzymu modyfikującego, zaś w kilkunastu przypadkach dotyczy integralnego białka błonowego
o właściwościach enzymu, transportera lub też o funkcji nieznanej.
Są to bardzo rzadkie choroby – w Polsce rozpoznano 1 przypadek na 23 000 dzieci żywo urodzonych w latach
1988–1997 – najwięcej przypadków jednej z mukopolisacharydoz (1 na 42 000), jednej z gangliozydoz (1 na 140 000)
lub leukodystrofii metachromatycznej (1 na 152 000).
Do rozpoznawania tych chorób wykorzystywane są rozmaite metody, a mianowicie:
1/ Metody histologiczne – stwierdzenie wewnątrzkomórkowego spichrzania nierozłożonego substratu
a/ w mikroskopie świetlnym – komórki piankowate, komórki globoidalne, wewnątrzkomórkowe wakuole,
metachromazja, złogi PAS dodatnie itp.
b/ w mikroskopie elektronowym – ziarnistości, „splątki”, „linie papilarne” itp.
2/ Chemiczna identyfikacja gromadzonego materiału�
a/ wydalanego z moczem – np. sulfatydów, mukopolisacharydów, oligosacharydów, wolnego kwasu sjalowego
(metodą chromatografii cienkowarstwowej –TLC lub elektroforezy)
b/ gromadzonego wewnątrzkomórkowo
– TLC lipidów ekstrahowanych z tkanek (np. z bioptatu wątroby lub po splenektomii)
– metodą histochemiczną w hodowli komórkowej – np. gromadzenie wolnego cholesterolu
4/ Oznaczanie markerów pośrednich, np. aktywności chitotriozydazy w surowicy
3/ Badanie aktywności enzymatycznej – jest to najczęściej stosowana metoda bezpośrednia
a/ in vivo, w hodowli komórkowej
b/ in vitro w ekstraktach leukocytów lub hodowanych fibroblastów skóry
– stosując znakowany substrat naturalny
– stosując substrat syntetyczny, zazwyczaj fluorogenny
3/ Analiza DNA – identyfikacja mutacji.
8
Warsztaty
4. Najnowsze metody diagnozowania i leczenia zespołu Smitha, Lemlego i Opita.
M. Krajewska-Walasek (1), E. M. Małunowicz (2), E. Ciara (1), E. Popowska (1), K. Chrzanowska (1),
B. Kozakiewicz-Goryluk (1), M. Gajdulewicz (1), A. Jezela-Stanek (1), K. Spodar (1)
(1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa
(2) Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa
Zespół Smitha, Lemlego i Opitza (SLO), zespół mnogich wad rodzonych z współistniejącym opóźnieniem umysłowym,
należy do najczęstszych, ale i najrzadziej rozpoznawanych chorób metabolicznych. Choroba uwarunkowana jest
mutacjami w genie DHCR7, kodującym reduktazę 7-dehydrocholesterolu (DHCR7), odpowiedzialną za konwersję
7-dehydrocholesterolu (7-DHC) w cholesterol (CH). Wykrycie zaburzeń w biosyntezie cholesterolu spowodowało
rewolucyjny przewrót w pre– i postnatalnej diagnostyce tego zespołu. Wczesna diagnostyka pozwala na wdrożenie
wczesnego leczenia dietetycznego (dieta bogatocholesterolowa) i udzielenie rodzicom porady genetycznej.
Celem pracy jest:
(1) przedstawienie wyników stosowania najnowszych procedur biochemiczmych i molekularnych wykorzystywanych
w diagnostyce post– i prenatalnej tego zespołu oraz
(2) ocena wpływu diety wysokocholesterolowej z/bez podaży kwasów żółciowych na stan kliniczny oraz wybrane
parametry laboratoryjne u pacjentów z zespołem SLO.
(1) Materiał i metodyka. W IP-CZD weryfikację rozpoznania klinicznego przeprowadza się za pomocą badań
biochemicznych i diagnostyki genetycznej. Analiza biochemiczna polega na oznaczaniu 7-, 8-DHC i CH w surowicy
krwi oraz stosunku 7 (8)-dehydropregnantriolu do pregnantriolu w jednorazowej porcji moczu metodą GC/MS.
W badaniach prenatalnych tzw. inwazyjnych oznaczenia 7-, 8-DHC i CH wykonywane są w wodach płodowych (w 13/
14 Hbd), natomiast w tzw. nieinwazyjnej diagnostyce prenatalnej markerami choroby u płodu są 7-dehydrometabolity
steroidowe pochodzenia płodowego (7-dehydropregnantriol oraz 8-dehydroestriol) stwierdzane (od 12 Hbd) w moczu
matki. Uzupełnieniem diagnostyki jest identyfikacja mutacji w genie DHCR7, którą można wykorzystać w badaniach
prenatalnych (biopsja kosmówki w 11 Hbd).
Wyniki. Za pomocą badań biochemicznych i molekularnych kliniczne rozpoznanie zespołu SLO potwierdziliśmy u 39
pacjentów w wieku od 2 dni do 25. roku życia, ponadto wykonaliśmy 8 badań prenatalnych.
Wnioski. Dotychczasowe wyniki naszych badań wykazały pierwszorzędną rolę testów biochemicznych w pre–
i postnatalnej diagnostyce zespołu SLO. Identyfikacja mutacji w genie DHCR7 stanowi znakomite uzupełnienie tej
diagnostyki.
(2) Materiał i metodyka. Badaniem objęto 9 dzieci w wieku od 1m.ż.do 12 l i 3 m., średni czas leczenia wynosił 31
m. Pacjenci zostali podzieleni na 2 grupy: A-dzieci starsze i B-dzieci młodsze. Cholesterol stosowano w dawce 20-40100 mg/kg m.c./dobę, głównie pod postacią żółtek jaj kurzych. 6 pacjentów otrzymywało kwas ursodezoksycholowy
w dawce 20 mg/kg m.c./dobę. Ocena badanych obejmowała: stan kliniczny, pomiary antropometryczne (masa oraz
wzrost/długość ciała, obwód głowy), badanie neurologiczne i psychologiczne, parametry laboratoryjne – m.in. poziom
cholesterolu (CH) oraz 7– i 8– dehydrocholesterolu (7– i 8-DHC) w surowicy metodą GC/MS, gęstość receptorów dla
lipoprotein o małej gęstości (LDL) na monocytach.
Wyniki. U 9 dzieci stwierdzono poprawę stanu klinicznego: w gr. A głównie zachowania, w gr. B – niektórych
parametrów antropometrycznych oraz rozwoju psychomotorycznego. Nie u wszystkich uzyskano wzrost poziomu CH,
stwierdzono natomiast wzrost 7– i 8-DHC.
Wnioski. Stosowanie u dzieci z zespołem SLO diety bogatocholesterolowej ma wpływ na ich stan kliniczny, przy czym
zastosowanie kwasów żółciowych przypuszczalnie nie ma znaczenia. Wydaje się, że najkorzystniejszy efekt można
osiągnąć u dzieci najmłodszych. Stosowanie diety nie u wszystkich pacjentów powoduje wzrost poziomu cholesterolu
całkowitego w surowicy krwi. Można sądzić, że znaczenie kliniczne ma wzrost poziomu prekursorów cholesterolu:
7-DHC i 8-DHC. Ekspresja receptorów dla LDL u pacjentów z zespołem SLO pozostaje niezmieniona.
9
Warsztaty
5. Wczesna identyfikacja wad metabolizmu w praktyce lekarza pierwszego kontaktu
i specjalisty.
E. Pronicka
Oddział Chorób Metabolicznych, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa
Znaczenie wczesnej diagnozy choroby genetycznej, w tym wrodzonej wady metabolizmu (IEM, inborn error of
metabolism), nie podlega dyskusji. Poza względami medycznymi, społecznymi i rodzinnymi, za ustaleniem rozpoznania
jak najwcześniej przemawiają aspekty organizacyjne i ekonomiczne służby zdrowia. Dotyczy to zarówno przypadków
chorób metabolicznych, które poddają się leczeniu jak i tych uznanych dziś za nieuleczane.
Problem detekcji choroby w fazie bezobjawowej rozwiązują populacyjne badania przesiewowe noworodków. W Polsce
obejmują one tylko kilka (hiperfenyloalaninemie i niedoczynność tarczycy) spośród ponad 500 znanych zaburzeń
metabolicznych o uwarunkowaniu genetycznym (Scriver i wsp.: Metabolic and Molecular Bases of Metabolic Disease,
8 wydanie, 2001). W pozostałych przypadkach odpowiedzialność za ustalenie tła genetyczno-metabolicznego
choroby spoczywa na lekarzu pierwszego kontaktu i specjaliście wąskich podspecjalności, ich wnikliwości, wiedzy
i kompetencji.
Pediatra pracujący w poradni i oddziale o ogólnym profilu ma szansę napotkać dotychczas nierozpoznany przypadek
wady metabolizmu zaledwie kilka razy w czasie całej praktyki lekarskiej. Samodzielne ustalenie rozpoznania
utrudnia nieswoistość obrazu chorobowego, kosztowne i mało dostępne procedury diagnostyczne. Tylko nieliczne
IEM z jednoznacznym fenotypem klinicznym uwidoczniają się w badaniu przedmiotowym (mukopolisacharydozy,
ch. Zellwegera, ch. Menkesa, inne), rutynowych badaniach biochemicznych (hipoglikemia, kwasica metaboliczna) czy
konsultacjach (hepatopatia, kardiopatia, endokrynopatia, zmiany ocze, radiologiczne, inne). Jednak większość IEM
przybiera różnorodne maski często występujących chorób nabytych (zakażenie, uraz, zatrucie o nieznanej przyczynie),
także w oczach specjalistów wąskich specjalności. W klasycznej diagnostyce różnicowej rzadko występujące przyczyny
choroby/objawu rozpatruje się jako ostatnie. Pacjent z wadą metabolizmu jest w takim przypadku przegrany.
Z pomocą przychodzi skrining selektywny (inaczej skrining wczasnoobjawowy, „at risk”), program przesiewowy o typie
profilaktyki II stopnia. Osobą „przesiewajacą” jest najczęściej lekarz pierwszego kontaktu (ale czasem także rodzina
chorego dziecka). On, na podstawie prostych objawów klinicznych i biochemicznych, decyduje o wykonaniu skriningu
w kierunku IEM, raczej celem ich wykluczenia niż rozpoznania. Może spodziewać się negatywnego wyniku w 99 na 100
przeprowadzonych badań.
Drugim ogniwem skriningu selektywnego jest konsultacyjny ośrodek pediatrii metabolicznej. Tu, na podstawie
dostarczonych przez lekarza leczącego: opisu choroby i materiału biologicznego (zwykle tylko mocz i sucha kropla krwi
na bibule, ale także surowica, płyn mózgowo-rdzeniowy, materiał biopsyjny) wybiera się indywidualnie i wykonuje zestaw
badań skriningowych, dobrany z kilkunastu dostępnych testów, w sposób celowy. Podstawą skriningu selektywnego jest
analiza kwasów organicznych w moczu metodą GC-MS (chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią masową)
i analiza profilu aminokwasów i acylokarnityn w suchej kropli krwi metodą MS/MS (tandemowa spektrometria
mas). Zestaw obowiązujących metod skriningu selektywnego koordynuje i systematycznie kontroluje europejski
program jakości (Proficiency test, ERNDIM). Poza prostymi metodami skriningowymi, wykorzystuje się kosztowne
i skomplikowane metody biochemiczne, a także enzymatyczne i molekularne.
Program skriningu selektywnego w kierunku wad metabolizmu obejmuje w Polsce blisko półtora tysiąca chorych
dzieci rocznie i wykrywa około 50 nowych przypadków różnych wad metabolizmu. Liczba ta jest porównywalna
z liczbą nowych wykryć fenyloketonurii. Teoretycznie, częstość występowania chorób metabolicznych, które mogą być
zidentyfikowane w programie skriningu selektywnego wynosi 1:2700 urodzeń. W praktyce częstość ta wynosi obecnie
1:5700 w wybranych regionach kraju.
6. Molekularna diagnostyka chorób mitochondrialnych.
K. Tońska
Zakład Genetyki, Uniwersytet Warszawski, Warszawa
Badanie chorób mitochondrialnych nastręcza pewnych trudności ze względu na złożony układ jaki stanowią
mitochondria z jednej strony posiadające własny DNA i odrębny system transkrypcji i translacji, a z drugiej uzależnione
od białek kodowanych i eksprymowanych jądrowo. Podobne objawy mogą więc dawać zarówno mutacje jądrowe
jak i mitochondrialne. Dodatkowo obraz komplikuje możliwość istnienia w tkance cząsteczek mtDNA o różnych
sekwencjach, ich dystrybucja tkankowa i dziedziczenie.
Mutacje w mitochondrialnym DNA prowadzą najczęściej do zaburzeń pracy tkanek i narządów o dużych wymaganiach
10
Warsztaty
energetycznych takich jak układ nerwowy czy mięśnie, stąd większość chorób mitochondrialnych należy do schorzeń
neurologicznych.
Diagnostyka chorób mitochondrialnych wymaga ścisłej współpracy miedzy jednostkami odpowiedzialnymi za
przeprowadzenie kolejnych etapów badań: klinicznych, histochemicznych, biochemicznych i molekularnych. Przy
diagnostyce molekularnej istotny jest świadomy wybór tkanki do badania (wymóg ten związany jest z różnicami
w zawartości zmutowanych cząsteczek mtDNA między tkankami), metod przeprowadzania analiz i wykonania
niezbędnych kontroli. Wraz z rozwojem technik sekwencjonowania diagnostyka molekularna chorób mitochondrialnych
coraz częściej opiera się na sekwencjonowaniu całego genomu mitochondrialnego lub innych technik pozwalających na
przebadanie całej sekwencji mtDNA. Stwierdzenie różnicy między sekwencją pochodzącą od pacjenta, a sekwencją
prawidłowa niekoniecznie musi być związane z wykryciem patogennej mutacji (liczne polimorfizmy mtDNA). W takich
przypadkach patogenność mutacji należy potwierdzić innymi metodami.
7. Molekularna diagnostyka dystrofii mięśniowej Duchenne’a/Beckera – rodzaj mutacji
a przebieg choroby.
J. Zimowski
Zakład Genetyki, Instytut Psychiatrii i Neurologii, Warszawa
Dystrofia mięśniowa Duchenne’a/Beckera (DMD/BMD) polega na stopniowym i nieodwracalnym zaniku mięśni
i prowadzi w ostrej postaci (typ Duchenne’a) do utraty zdolności samodzielnego chodzenia (około 10. roku życia)
i do śmierci pacjenta przed 20 rokiem życia. W swej łagodnej postaci (typ Beckera) przebieg choroby jest wolniejszy.
DMD/BMD występuje z częstością 1: 3500 żywo urodzonych chłopców i dziedziczy się w sposób recesywny sprzężony
z płcią – gen dystrofiny położony jest w prążku Xp21. 60% przypadków zachorowań wywołanych jest delecjami, 30%
mutacjami punktowymi, pozostałe – duplikacjami części genu. Różny przebieg choroby (typ Duchenne’a versus typ
Beckera) tłumaczy teoria uszkodzenia lub zachowania przez mutację ramki odczytu. Całkowity brak dystrofiny na
skutek przesunięcia ramki odczytu powoduje pękanie błony włókien mięśniowych, ich degenerację a w konsekwencji
przerost mięśni tkanką łączną. Zachowana ramka odczytu pozwala na syntezę białka – dystrofiny. Powstaje wtedy białko
o zmienionej wielkości, ale zdolne w ograniczony sposób pełnić swoją funkcję w obrębie kompleksu glikoproteinowego
usytuowanego w sarkolemmie, odpowiedzialnego za stabilność błony włókna mięśniowego. W cząsteczce dystrofiny
wyodrębniono cztery domeny morfologiczno-funkcjonalne, których uszkodzenie daje nieco inny przebieg choroby.
Spotyka się pacjentów, u których delecje zachowujące ramkę odczytu powodują ciężki przebieg choroby ale również
takich, u których występują tylko kurcze i bóle mięśniowe.
Bardzo rzadko spotyka się DMD/BMD u kobiet. Choroba jest u nich wywołana, poza mutacją w genie dystrofiny,
zaburzoną losową inaktywacją chromosomu X lub translokacją chromosomową: X-autosom z pęknięciem w prążku
Xp21. W takiej sytuacji dochodzi do unieczynnienia prawidłowego chromosomu X.
Dwie trzecie przypadków DMD/BMD jest skutkiem mutacji przekazywanej synowi przez matkę-nosicielkę,
pozostałe wywołane są nowopowstałymi mutacjami. Za pomocą śledzenia dziedziczenia polimorficznych sekwencji
mikrosatelitarnych możliwe jest ustalanie i wykluczanie nosicielstwa u kobiet z rodzin dotkniętych DMD/BMD.
Niekiedy spotyka się kobiety, które urodziły dwóch chorych synów i u których wykluczono nosicielstwo mutacji, są one
mozaikami germinalnymi.
8. Nowe strategie terapii genowej.
J. Dulak
Zakład Biochemii Komórki, Uniwersytet Jagielloński, Kraków
Terapia genowa wykorzystuje kwasy nukleinowe w charakterze leków i ma na celu ograniczenie nie tylko objawów, ale
przede wszystkim eliminowanie przyczyn chorób. Metoda ta może być teoretycznie stosowana do leczenia wszystkich
chorób, bowiem każde schorzenie ma podłoże genetyczne. Ze zrozumiałych względów terapię genową po raz pierwszy
zastosowano do leczenia chorób wrodzonych, jednak obecnie jej wykorzystanie dotyczy w znacznie większym stopniu
chorób nabytych, w szczególności nowotworów. Pierwszą kontrolowaną próbę kliniczną terapii genowej wykonano
w roku 1990 u dzieci chorych na ciężki złożony niedobór odporności (SCID), spowodowany brakiem prawidłowego
genu deaminazy adenozynowej. Do chwili obecnej przeprowadzono lub rozpoczęto niemal osiemset prób klinicznych,
jednak sukces w postaci trwałego wyleczenia osiągnięto tylko u kilkunastu chłopców chorych na inną odmianę złożonego
niedoboru odporności, tzw. X-SCID. Niestety, u dwóch chłopców w dwa lata po udanym transferze brakującego genu
pojawiła się białaczka. Chorobę zainicjowało wbudowanie wektora retrowirusowego w obręb onkogenu LMO2.
11
Warsztaty
W takiej sytuacji nie dziwi fakt, że ograniczone sukcesy terapii genowej jak i ryzyko efektów ubocznych zachęcają do
poszukiwania nowych genów terapeutycznych i strategii ich dostarczania lub hamowania.
Obecnie największą uwagę przywiązuje się do opracowania skutecznych sposobów wprowadzania genów przy
wykorzystaniu wektorów wirusowych umożliwiających długotrwałą ekspresję transgenu przy znacznym zarazem
ograniczeniu procesów zapalnych rozwijających się w odpowiedzi na zastosowany nośnik. Do takiej grupy należą przede
wszystkim wektory AAV (adeno-asosciated virsues) oraz wektory adenowirusowe III generacji, tzw. helper-dependent.
Dodatkowe możliwości stwarza regulowana ekspresja genów terapeutycznych, przy wykorzystaniu endogennych
promotorów tych genów lub sekwencji umożliwiających ekspresję transgenu tylko w określonych warunkach,
np. w niedotlenionych tkankach. Modyfikacja kapsydu wektorów wirusowych oraz użycie promotorów tkankowo-specyficznych pozwoli ponadto na ukierunkowaną ekspresję genów tylko w komórkach wybranych narządów.
Zastosowanie wymienionych strategii jest brane pod uwagę m.in. w próbach leczenia miażdżycy i jej konsekwencji,
np. choroby niedokrwiennej czy zawału serca. Nowe możliwości stwarza także użycie genów, takich jak syntazy tlenku
azotu czy oksygenaza hemowa-1. Ich produkty (tlenek azotu oraz tlenek węgla, biliwerdyna i bilirubina) wykazują
działanie przeciwzapalne, ograniczają rozwój miażdżycy, uszkodzenie mięśnia sercowego spowodowane niedotlenieniem
i reperfuzją oraz stymulują powstawanie nowych naczyń krwionośnych.
Zwiększenie skuteczności terapii genowej nowotworów może być z kolei osiągnięte poprzez ukierunkowywane
hamowanie ekspresji tych samych genów. Geny przeciwzapalne mogą bowiem zwiększać oporność komórek
nowotworowych na działanie chemioterapeutyków, a także nasilać procesy angiogenezy stymulujące wzrost guzów.
Badacze zajmujący się ograniczaniem aktywności tych genów duże nadzieje wiążą z niedawno odkrytą specyficzną
metodą hamowania ekspresji genów przez małe, dwuniciowe cząsteczki interferującego RNA.
Pełne wykorzystanie informacji uzyskanych dzięki poznaniu sekwencji genomu człowieka umożliwi znalezienie
nowych celów w terapii genowej chorób wrodzonych i nabytych. Udoskonalenie metod transferu genów i stworzenie
skutecznych sposobów ich regulacji przyczynić się może do zwiększenia efektywności prób klinicznych i uzyskania
przez terapię genową statusu rzeczywistej metody leczniczej.
12
Wykłady inauguracyjne
Wykład inauguracyjny
W1.
Co wiemy, a czego nie wiemy, o historii Polskiego Towarzystwa Genetycznego?
Alicja Kulecka
Instytut Historyczny Uniwersytetu Warszawskiego
Dzieje Polskiego Towarzystwa Genetycznego są nierozłączną częścią historii i nauki polskiej. Rozwój tej instytucji
uwarunkowany był wieloma czynnikami. Do ich grona należał m.in. rozwój badań genetycznych, ich organizacja,
powstawanie środowisk uprawiających tą, interdyscyplinarną dziedzinę wiedzy. Dynamiczny rozwój genetyki stanowił
jedną z form realizacji ludzkich marzeń o poznaniu tajników istnienia – praw zmienności i dziedziczenia, decydujących
o biologicznej jakości życia na Ziemi. Powstanie Towarzystwa w 1966 r. zależne było również od sytuacji politycznej
w Polsce. Dopiero wydarzenia Października 1956 r., których konsekwencją była destalinizacja życia naukowego,
umożliwiły rozpoczęcie starań o utworzenie tej instytucji. Brak monograficznych badań, dotyczących procesu
decyzyjnego w nauce i instytucjach nią kierujących, uniemożliwia wyjaśnienie wszystkich zagadnień związanych z genezą
Towarzystwa. Zasadniczy problem zawiera się w pytaniu – co spowodowało, że tak długo zwlekano z wyrażeniem zgody
na działalność Polskiego Towarzystwa Genetycznego, czy był to przypadek szczególny, czy też stanowisko typowe wobec
wszystkich towarzystw naukowych? Trudno też udzielić odpowiedzi na pytanie – w jaki sposób przebiegały pertraktacje,
których celem miało być powołanie do życia towarzystwa skupiającego genetyków? Na podstawie dotychczas
wykorzystanych źródeł widoczna jest duża rola środowiska poznańskiego w tych staraniach. Szczególną rolę odgrywał
w nich profesor Stefan Barbacki, rolnik, genetyk, twórca pierwszego polskiego czasopisma naukowego poświęconego
sprawom genetyki. Efektem jego zabiegów było utworzenie Towarzystwa, uchwalenie statutu, wybór i organizacja
władz, rejestracja Towarzystwa. Po nich nastąpił rozwój struktury terytorialnej. Celem działania było upowszechnianie
wiedzy genetycznej, popularyzacja badań z zakresu genetyki, edukacja w zakresie genetyki i nauk pokrewnych. Program
ten był realizowany poprzez zebrania naukowe, odczyty, wystawy, publikacje, organizację konferencji, sympozjów,
seminariów, zjazdów. Władzą najwyższą Towarzystwa był organ kolegialny – Walne Zgromadzenie, od 1976 r. Walny
Zjazd. Statut Towarzystwa był dwukrotnie nowelizowany w 1976 i 1995 r. Pierwsza z tych nowelizacji wydłużyła
okres kadencyjny z dwóch do trzech lat. Ustanowiła zasadę wyboru przewodniczącego przez Zarząd Towarzystwa,
w miejsce obowiązującego poprzednio wyboru przez Walne Zgromadzenie. Nowelizacja z 1995 r. przywróciła
zasadę wyboru przewodniczącego przez Walny Zjazd. Zmiany w statucie w 1976 r. umożliwiły przyznawanie nagród
Polskiego Towarzystwa Genetycznego. Pierwszym przewodniczącym Towarzystwa został wybrany profesor Wacław
Gajewski, biolog, genetyk, związany z Uniwersytetem Warszawskim oraz Instytutem Biochemii i Biofizyki PAN. Pełnił
tę funkcję w okresie 1966-1974 i 1983-1986. Był osobą najdłużej sprawującą godność przewodniczącego. Funkcję tą
pełnili również profesorowie: Tadeusz Lachowicz (1974-1976), Czesław Tarkowski(1976-1979), Lucjan Wiśniewski
(1979-1983), Henryk Hübner (1986-1989), Janusz Limon (1989-1992), Jacek Zaremba(1992-1995), Andrzej
Paszewski(1995-1998), Stefan Malepszy(1998-2001), Marek Świtoński(2001-2004). Towarzystwo składało się początkowo
z pięciu oddziałów: krakowskiego, lubelskiego, poznańskiego, warszawskiego i wrocławskiego. Najliczniejsze były
oddziały warszawski i poznański. W latach 1969-1987 powstały kolejne oddziały w Białymstoku (1969), Gdańsku (1976),
Łodzi (1978), Szczecinie (1987) i na Śląsku (1987). W Towarzystwie istnieją także sekcje tematyczne – Cytogentyki
Zwierząt Gospodarskich oraz Mutagenezy Środowiskowej. Największą liczbę, 845 członków, Towarzystwo osiągnęło
w 1989 r. Podstawę działalności finansowej Towarzystwa stanowią składki członkowskie oraz dotacje państwowe
i prywatne. W gronie członków honorowych Towarzystwa znalazła się grupa wybitnych genetyków polskich m.in.
Stefan Barbacki, Wacław Gajewski, Antoni Horst, Laura Kaufman, Jerzy Korohoda, Władysław Kunicki Goldfinger,
Zbigniew Lorkiewicz, Edmund Malinowski, Tadeusz Ruebenbauer, Maria Skalińska, Andrzej Słaboński, Kazimierz
Świeżyński, Maria Ferguson-Smith, Andrzej Paszewski i Jacek Zaremba. Reprezentują różne środowiska prowadzące
badania z zakresu genetyki, zarówno terytorialne, jak i instytucjonalne i zawodowe. Towarzystwo wykształciło dwie
charakterystyczne dla siebie formy działalności: organizację Zjazdów Genetyków Polskich i nagrody za prace naukowe,
podręczniki i popularyzację. Zjazdy stanowią istotne forum wymiany poglądów i doświadczeń pomiędzy różnymi
środowiskami prowadzącymi badania z zakresu genetyki. Służą idei interdyscyplinarności Przyczyniają się do rozwoju
myśli i metod badań. Wzbogacają refleksję dotyczącą etyki uprawiania nauki, genetyki w szczególności. Nagrody
przyczyniają się do promocji badań z zakresu genetyki oraz pośrednio lepszego wyposażenia warsztatów badawczych.
Historia Polskiego Towarzystwa Genetycznego inspirować może do dalszych badań dotyczących dziejów genetyki
polskiej – dorobku poszczególnych ośrodków prowadzących badania z tego zakresu, kierunków badawczych, szkół
13
Wykłady inauguracyjne
badawczych, analizom i ocenom myśli wybitnych genetyków polskich. Służyć one będą pełniejszemu poznaniu dorobku
intelektualnego Polski oraz wkładu w dziedzictwo światowe.
W2.
Genome Architecture, rearrangements, evolution and genomic disorders.
J. R. Lupski
Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, USA.
The term “genomic disorder” refers to a disease that is caused by an alteration of the genome that results in complete
loss, gain, or disruption of the structural integrity of a dosage sensitive gene(s). In most of the common chromosome
deletion/duplication syndromes, the rearranged genomic segments are flanked by large (usually>10kb), highly
homologous low copy repeat (LCR) structures that can act as recombination substrates. Recombination between nonallelic LCR copies, also known as non-allelic homologous recombination (NAHR), can result in deletion or duplication
of the intervening segment. Recent findings suggest that other chromosomal rearrangements, including reciprocal,
Robertsonian, and jumping translocations, inversions, isochromosomes and small marker chromosomes, may also
involve susceptibility to rearrangements related to genome structure or architecture. In several cases, LCRs, AT-rich
palindromes and pericentromeric repeats are located at such rearrangement breakpoints. Analysis of the products of
recombination at the junctions of the rearrangements reveals both homologous recombination and non-homologous
end joining (NHEJ) as causative mechanisms. Thus, a more global concept of genomic disorders emerges in which
susceptibility to rearrangements occurs due to underlying complex genomic architecture. Interestingly, this architecture
plays a role not only in disease etiology through constitutional rearrangements, but also in somatic rearrangement
events associated with cancers and in primate genome evolution.
14
Genetyka człowieka
Neurogenetyka
Komunikaty ustne:
W3.
Ustalenie udziału genu MECP2 w patogenezie zespołu Retta i zespołów
Retto-podobnych.
Ewa Popowska (1), E. Ciara (1), D. Jurkiewicz (1), D. Piekutowska-Abramczuk (1), M. Borucka-Mankiewicz (1),
P. Kowalski (1), M. Gajdulewicz (1), K. Spodar (1), K. Chrzanowska (1), A. Tylki-Szymańska (2),
M. Krajewska-Walasek (1)
(1) Zakład Genetyki Medycznej
(2) Klinika Pediatrii, Instytut Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka, al. Dzieci Polskich 20, 04-730 Warszawa
Zespół Retta jest postępującą chorobą zaburzającą rozwój neurologiczny, która dziedziczy się w sposób dominujący
sprzężony z chromosomem X. Objawy kliniczne obserwowane są prawie wyłącznie u pacjentów płci żeńskiej, gdyż
choroba jest w większości przypadków śmiertelna dla płodów płci męskiej. W latach 1998 i 1999 zmapowano gen MECP2
w locus Xq28 i stwierdzono, że koduje białko chromosomalne MeCP2, które pełni funkcję transkrypcyjnego represora,
regulującego aktywność genów. W roku 1999 opisano pierwsze mutacje w genie MECP2 u pacjentów z zespołem Retta.
Ostatnio stwierdzono, że zmiany w budowie genu MECP2 są też odpowiedzialne za wariant PSV, nietypową formę zespołu
Retta, a także niektóre przypadki opóźnienia umysłowego i autyzmu oraz nieliczne przypadki klinicznie rozpoznanego
zespołu Angelmana, w których nie wykryto rozległych delecji i zmiany wzoru metylacji w regionie 15q11-13. Celem
prezentowanych badań było ustalenie udziału genu MECP2 w patogenezie zespołu Retta i zespołów Retto-podobnych
w populacji polskiej. Analizą molekularną objęto 123 pacjentki, u których wstępnie rozpoznano klasyczny zespół Retta
(77), zespół Retto-podobny (8) lub zespół Retta/zespół Angelmana (38). Analiza SSCP a następnie sekwencjonowanie
wykazało obecność zmian w budowie genu MECP2 u 42 pacjentek, pochodzących z wszystkich analizowanych grup.
Ogółem zidentyfikowano 24 różne mutacje, wynikające z substytucji nukleotydowych (12), delecji (9), insercji (2) lub
delecjo-insercji (1). Mutacje zlokalizowane są głównie w regionie kodującym domenę supresorową transkrypcji (TRD)
a także w regionie kodującym domenę wiążącą metylo-CpG (MBD) lub w końcowej części genu poza domenami. U dwu
pacjentek wykryto jednonukletydowe zmiany w konserwowanym regionie 3’UTR.
Badania były finansowane z grantu KBN nr 3P05E11222.
W4.
Mutacje genu ARX częstą przyczyną niepełnosprawności intelektualnej.
Magdalena Nawara (1), Karine Poirier (3), Krzysztof Szczałuba (1), Krystyna Chrzanowska (4), Jacek Pilch (5),
Jamel Chelly (3), Jerzy Bal (1), Tadeusz Mazurczak (1)
(1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Kaspraka 17a, 01-211 Warszawa
(2) Studium Medycyny Molekularnej
(3) Institut Cochin, Département de Génétique et Pathologie Moléculaire Equipe de Génétique et Physiopathologie des
Retards Mentaux 24, rue du Faubourg St Jacques, 75014 PARIS
(4) Instytut „Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka”, Zakład Genetyki Medycznej, Al. Dzieci Polskich 20, 04-730 Warszawa
(5) Klinika Pediatrii i Neurologii wieku Rozwojowego ŚAM, Medyków 16, 40-752 Katowice
Badania nad molekularnym podłożem izolowanych postaci niepełnosprawności intelektualnej (NI) doprowadziły
do zidentyfikowania 20 genów odpowiedzialnych za postać choroby sprzężoną z chromosomem X (MRX). Geny
15
Genetyka człowieka
te kodują różne białka wpływające m.in. na organizację włókien aktynowych w odpowiedzi na bodźce, uwalnianie
neurotransmitterów w synapsach i tworzenie połączeń między neuronami. Mutacje w poszczególnych genach są
odpowiedzialne jedynie za 0,5–1% przypadków NI. Wyjątkiem jest gen ARX (Aristaless Related Homeobox gene),
którego różne defekty identyfikowano w licznych rodzinach z MRX, zespołem Westa, zespołem Partingtona, XLAG
(X-linked lissencephaly with abnormal genitalia), ISSX (X-linked infantile spasms) i dystonią. ARX należy do genów
homeoboxu, kodujących czynniki transkrypcyjne kierujące rozwojem podczas embriogenezy.
Pacjenci: Do badań genu ARX wybrano 180 osób z niespecyficzną postacią NI, których historia rodziny wskazywała na
dziedziczenie choroby jako cechy sprzężonej z chromosomem X. U wszystkich badanych wykluczono zespół FRAXA
i FRAXE. Przeprowadzono test w kierunku najczęstszej mutacji (428-451 dup). Jednocześnie u wszystkich pacjentów
wykonano screening techniką DHPLC w kierunku mutacji punktowych w genie ARX.
Wyniki: Duplikację 24 pz (428-451dup) stwierdzono u 4 pacjentów. Do chwili obecnej w rodzinach 2 probantów
przeprowadzono analizę kosegregacji mutacji z fenotypem NI. W obu potwierdzono patogenny charakter mutacji.
W jednej z rodzin u matki dwóch chorych chłopców stwierdzono mozaikowatość germinalną pod względem badanej
mutacji. Analiza wyników DHPLC jest w trakcie.
Wnioski: Mutacja 428-451dup w ARX jest najczestszą znaną przyczyna MRX u chłopców. W przypadkach, gdy
w rodzinie jest kilku chorych mężczyzn, a NI jest przenoszona przez kobiety, po wykluczeniu zespołu FRAXA należy
wykonać badanie w kierunku duplikacji w genie ARX.
W5.
Uszkodzenie genu SLC1A2 u chłopca z niepełnosprawnością intelektualną, padaczką
i translokacją t(1;11)(p33; p13).
Magdalena Mayer (1), M. Wiśniewska (1), J. Kołowska (3), M. Hoeltzenbein M (2), V. M. Kalscheuer (2),
H. H. Ropers (2), A. Latos-Bieleńska A (1, 3)
(1) Katedra i Zakład Genetyki Medycznej, Poznań;
(2) Max Planck Institute for Molecular Genetics, Berlin-Dahlem, Niemcy;
(3) Centrum Genetyki Medycznej NZOZ, Poznań
Badania pacjentów, u których występowanie choroby związane jest z obecnością zrównoważonych aberracji
chromosomowych, umożliwiają identyfikację genów leżących u podstaw choroby oraz badanie korelacji genotyp-fenotyp.
W tym kontekście przeprowadzono analizę regionów pęknięć chromosomów u pacjenta z głęboką niepełnosprawnością
intelektualną, padaczką i zanikiem kory mózgowej, u którego wykryto zrównoważoną translokacją chromosomową de
novo t(1;11)(p33;p13).
Za pomocą FISH z użyciem sond BAC i PAC zidentyfikowano klony obejmujące miejsca pęknięć chromosomów
pary 1 i 11 zaangażowanych w translokację. Analizy in silico wykazały obecność genu SLC1A2 kodującego
transporter glutaminianu, w obrębie klonu zawierającego miejsce pęknięcia na chromosomie pary 11. Dalsze analizy
z wykorzystaniem technik mapowania restrykcyjnego i Southern blot wykazały pęknięcie genu SLC1A2 pomiędzy
eksonem 9 i 10.
Transporter glutaminianu odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu odpowiedniego stężenia zewnątrzkomórkowego
neurotransmitera pobudzającego –glutaminianu, jest zatem doskonałym genem kandydatem, którego uszkodzenie
może wiązać się z wyżej opisanym fenotypem pacjenta.
Na chromosomie pary 1, klon obejmujący miejsce pęknięcia zawiera niewielki fragment nie scharakteryzowanego,
nowego genu. Porównanie sekwencji tego genu z ludzkim i mysim mRNA i ESTs pochodzącymi z GenBanku, wskazuje,
że koniec 5’ tego genu jest prawdopodobnie niekompletny. Sklonowanie i zsekwencjonowanie fragmentów DNA
zawierających punkty pęknięć oraz eksperymenty RT-PCR w celu dokładnego określenia końca 5’ nowego genu wykażą
wkrótce, czy gen ten również uległ uszkodzeniu oraz czy w wyniku translokacji chromosomowej doszło do powstania
genu fuzyjnego.
Praca w ramach działalności statutowej Katedry Genetyki Medycznej w Poznaniu i współpracy z Max Planck Institut f.
Molekulare Genetik w Berlinie.
16
Genetyka człowieka
W6.
Spektrum fenotypowe chorób kręgu Charcot-Marie-Tooth, u chorych, u których
stwierdzono mutacje w genie MPZ.
Andrzej Kochański (1), Hanna Drac (1, 2), Dagmara Kabzińska (1), Adam Nowakowski (1),
Katarzyna Rowińska-Marcińska (1, 2), Barbara Ryniewicz (2), Irena Hausmanowa-Petrusewicz (1)
(1) Zespół Badawczo-Leczniczy Chorób Nerwowo-Miesniowych Instytutu Medycyny Doswiadczalnej i Klinicznej Polskiej
Akademii Nauk
(2) Klinika Neurologiczna Akademii Medycznej w Warszawie
Wstęp: Mutacje genu MPZ stwierdza się w różnych odmianach choroby Charcot-Marie-Tooth (CMT).
Cel pracy: Badanie genu MPZ w grupie chorych z fenotypem CMT1, CMT2 i wrodzoną neuropatią hipomielinizacyjną
(CHN).
Wyniki: Mutacje genu MPZ stwierdzono w czterech rodzinach. Mutacja Glu56Lys została stwierdzona u trzech chorych
z fenotypem CMT2 (1). Mutacja Asn131Lys (2) oraz Thr65Ala (3) została wykryta u 6 chorych z fenotypem tzw.
„ogniskowo pofałdowanej mieliny”. U jednej chorej z wczesnodziecięcą postacią choroby CMT1 stwierdzono mutację
Leu190fs (4); natomiast mutacja Thr124Lys została znaleziona u chorego z CHN(5).�
Wnioski: 1. Mutacje genu MPZ występują w chorobach CMT1B, CMT2 oraz CHN (6). 2. Typ substytucji aminokwasowej
wydaje się określać fenotyp CMT.
Piśmiennictwo:
1. An axonal form of Charcot-Marie-Tooth disease with a novel missense mutation in the MPZ gene. Journal of
Peripheral Nervous System 2004, Mar; 9(1): 1-2
2. Focally folded myelin in Charcot-Marie-Tooth type 1B disease is associated with Asn131Lys mutation in Myelin
Protein Zero gene. European Journal of Neurology 2003; 10: 547-549
3. The novel mutation, Thr65Ala, In the MPZ gene in the patient with Charcot-Marie-Tooth type 1B with focally folded
myelin. Neuromuscular Disorders, 2004; 14:229-232
4. Early onset Charcot-Marie-Tooth type 1B disease caused by a novel Leu190fs mutation in the myelin protein zero
gene. European Journal of Paediatric Neurology, 2004, w druku
5. A novel MPZ gene mutation in congenital neuropathy with hypomyelination Neurology, w druku
6. Mutations in the Myelin Protein Zero gene result in a spectrum of CMT phenotypes. Acta Myologica, w druku
W7.
Powtórzenia CAG/CAA w genie SCA17/TBP.
Dorota Hoffman-Zacharska (1, 2), Anna Sułek (2), Joanna Empel (3)
(1) Pracownia Neurogenetyki, Instytut Matki i Dziecka w Warszawie
(2) Zakład Genetyki, Instytut Psychiatrii i Neurologii w Warszawie
(3) Zakład Genetyki, Uniwersytet Warszawski
Ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typu 17 (SCA17 – spinocerebellar ataxia type 17) należy do grupy ataksji rdzeniowomóżdżkowych o dziedziczeniu autosomalnym dominującym (ADCA – autosomal dominant ataxia). Grupa ta, między
innymi, obejmuje 9 jednostek, których podłoże molekularne stanowi niestabilność trójnukleotydowych sekwencji (TNR
–trinucleotide repeats) tworzących ciągi powtórzeń w otwartej ramce odczytu genów lub regionach niekodujących.
Wszystkie te choroby zaliczane są do „rodziny chorób trójnukleotydowych” (TREDs – triplet repeats disorders)
charakteryzujących się wspólnym mechanizmem mutacji (tzw. mutacji dynamicznych) – ekspansją trójnukleotydowych
sekwencji mikrosatelitarnych w wyniku tendencji do tworzenia przez te sekwencje nietypowych struktur (np. struktura
szpilki do włosów) w trakcie procesu replikacji DNA.
SCA 17 opisana została w roku 1999 jako postępująca choroba neurodegeneracyjna o obrazie klinicznym
przypominającym chorobę Huntingtona, lecz spowodowana zwielokrotnieniem sekwencji CAG/CAA w otwartej ramce
odczytu genu kodującego czynnik transkrypcyjny TBP (TATA-binding protein). Mutacja nie zaburza ekspresji genu,
lecz prowadzi do syntezy białka o wydłużonej domenie poliglutaminowej na jego N-końcu. U osób zdrowych liczba
glutamin waha się w granicach 25 –42, zakres patogenny wyznaczono jako 45 –66. Obszar DNA kodujący glutaminy
w genie TBP można przedstawić jako układ pięciu motywów obejmujących dwa polimorficzne ciągi powtórzeń
(CAG)n:: [(CAG)3(CAA)3][(CAG)nI][CAA CAG CAA][(CAG)nII] [CAA CAG].Taki schemat został zaproponowany
na podstawie analizy 157 alleli z populacji ogólnej. Analiza sekwencji tego obszaru dla opisanych przypadków SCA17
wskazuje jednak, że nie zawsze taki układ motywów jest zachowany. Stwierdzono, że nie tylko ekspansja powtórzeń
CAG w rejonach polimorficznych może prowadzić do wydłużenia sekwencji kodującej glutaminy. Może dochodzić
również do zaburzenia podstawowego układu motywów poprzez ich częściowe delecje, co powoduje zwiększoną
niestabilność ciągów (CAG)n lub duplikacje. Na podstawie opublikowanych danych dotyczących sekwencji tego
17
Genetyka człowieka
obszaru jak i wyników własnych badań proponujemy nowy schemat jego organizacji, jako układ trzech motywów
[(CAG)3 (CAA)2][CAA(CAG)6-11CAA CAG][CAA(CAG)9-21CAA CAG]. Podstawowym motywem ulegającym
mutacji zgodnie z proponowanych schematem byłaby cała jednostka [CAA (CAG)n CAA CAG] –delecja jednej z takich
jednostek prowadziłaby do utraty stabilności i silnej ekspansji powtórzeń (CAG)n w pozostałej jednostce. Innym
mechanizmem prowadzącym do wydłużenia całego rejonu mogłaby być duplikacja całego motywu.
Przedstawione zostanie porównanie sekwencji DNA zmutowanego obszaru kodującego glutaminy dla opublikowanych
przypadków SCA17, których analiza pozwoliła nam na zaproponowanie nowego schematu jego organizacji.
W8.
The position of the aggregation-causing sequence affects both the rate and
the pattern of intracellular protein accumulation.
Daniel Bąk (1), Gary Cutting (2), Michał Milewski (1)
(1) Medical Genetics Department, Institute of Mother and Child, Kasprzaka 17A, Warsaw
(2) Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA
Protein aggregation is a common phenomenon accompanying so-called conformational (deposit) disorders e.g.
Parkinson’s, Huntington’s and Alzheimer’s diseases. The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)
is a commonly used model for the aggregation process. It has been previously shown that the aggregation of the Cterminal fragment of CFTR (CFTR C-ter) is caused by a 9-aa region, called the ag sequence. Two amino acids within
this region, histidine (H) and arginine (R), seem to be crucial for this aggregation. The aim of this study was to test
whether changing the position of the ag region or the HR motif within the CFTR C-terminal sequence will affect the
aggregation rate and the distribution of protein aggregates. We have found that the peptide’s ability to aggregate was not
always retained when the position of the ag sequence was altered. Additionally, the HR motif alone was usually unable
to enhance the aggregation rate, when introduced into different positions within the CFTR C-terminus. Interestingly,
the morphology of aggregates seemed to depend on the ag/HR position. The most relaxed structures were observed
when the ag sequence was located at the very end of the CFTR C-terminus, whereas the same location for the HR motif
resulted in the most compact aggregates. We conclude that both the rate of the aggregation process and the intracellular
distribution of aggregating protein can be modified by the sequences accompanying the aggregation-causing motifs.
Work partially financed from grant PBZ/KBN/042/P05/06.
W9.
Badania nad genetycznym uwarunkowaniem postaci rodzinnej i sporadycznej
choroby Alzheimera
Anna Kowalska (1), Wojciech Kozubski (2), Mieczysław Wender (3)
(1) Instytut Genetyki Człowieka PAN
(2) Katedra i Klinika Neurologii, Akademia Medyczna im. K.Marcinkowskiego, Poznań,
(3) Zespół Badawczo-Leczniczy Chorób Neuroimmunologicznych, Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej PAN,
Poznań
Genetyka choroby Alzheimera (AD: Alzheimer’s disease) jest złożona. Podłoże genetyczne AD jest niejednorodne, a typ
dziedziczenia zależy od postaci choroby. W klasyfikacji AD opartej na takich kryteriach jak: wiek chorego w okresie
wystąpienia pierwszych objawów choroby oraz liczba osób dotkniętych otępieniem w rodzinie chorego, wyróżnia się:
postać wczesną (<65 r.ż., EOAD) i postać późną (> 65 r.ż., LOAD) oraz postać rodzinną, (z co najmniej dwiema osobami
chorymi; FAD) i sporadyczną (bez uwarunkowań rodzinnych; SAD). W ok. 5% przypadków, najczęściej w rodzinach
z EOAD, choroba dziedziczy się według praw Mendla w sposób autosomalny dominujący (ADFAD). Wykryto dotąd trzy
geny odpowiedzialne za ADFAD (geny FAD): gen białka prekursora amyloidu (chromosom 21 q21.2), gen Preseniliny
1 (PS1, chromosom 14 q24.3), oraz gen Preseniliny 2 (chromosom 1 q31-42). Mutacje w genach FAD są odpowiedzialne
za rozwój choroby w 50% rodzin z ADFAD. Ponad 85% chorych stanowią przypadki sporadyczne późne, w których AD,
podobnie jak w rodzinach z LOAD, jest uwarunkowana wieloczynnikowo z udziałem zarówno czynników genetycznych,
jak i środowiskowych. Liczne polimorfizmy DNA w genach związanych z patogenezą AD o stosunkowo niskim stopniu
penetracji, ale wysokim rozpowszechnieniu w populacji są rozważane jako ew. czynniki ryzyka genetycznego.
Badaniami nad podłożem genetycznym AD objęto grupę 140 chorych z AD (kryteria NINCDS-ADRDA) z regionu woj.
poznańskiego. W grupie 55 chorych z EOAD wykonano analizę mutacji w genach FAD. Wykryto 4 mutacje w genie
PS1 w rodzinach z ADFAD: A246E, P267L, E3188G i L424R. W grupie przypadków sporadycznych z EOAD i LOAD
przeprowadzono analizę asocjacji pomiędzy AD a polimorfizmami DNA w genach m.in.: Alfa-chymotrypsyny, Alfa-2makroglobuliny, Apolipoproteiny E, Interleukiny 1α, Interleukiny 1β, Antagonisty receptorowego (IL-1RA), Inhibitora
18
Genetyka człowieka
proteaz, Katepsyny D, Kaweoliny 3, Preseniliny-1, Transferyny. Wyniki analizy statystycznej dotyczącej istotności
obserwowanych różnic w grupach osób chorych i kontrolnych oraz ew. interakcji pomiędzy badanymi polimorfizmami
DNA zostaną przedyskutowane w kontekście możliwości wykorzystania badań dla celów poradnictwa genetycznego.
Komunikaty plakatowe:
P1.
Algorytm postępowania w diagnostyce molekularnej chorób neurodegeneracyjnych
o obrazie klinicznym zbliżonym do choroby Huntingtona
Wioletta Krysa (1), Anna Sułek (2), Dorota Hoffman-Zacharska (3), prof. Jacek Zaremba (2)
(1) Instytut Psychiatrii i Neurologii, Zakład Genetyki, Pracownia Analizy DNA
(2) Instytut Psychiatrii i Neurologii, Zakład Genetyki
(3) Instytut Matki i Dziecka w Warszawie, Klinika Neurologii, Epileptologii i Zaburzeń Snu u Dzieci i Młodzieży, Pracownia
Neurogenetyki
Choroba Huntingtona (HD) należy do postępujących neurodegeneracyjnych chorób i cechuje się monogenowym
(IT15), autosomalnym (4p16.3), dominującym wzorem dziedziczenia. Czynnikiem etiologicznym HD jest mutacja
dynamiczna –ekspansja trójnukleotydowej sekwencji (CAG)n w I eksonie genu IT15 i powodująca zwiększenie liczby
reszt glutaminowych w kodowanym przez niego białku huntingtynie. Ekspresja kliniczna HD obejmuje m.in. ruchy
mimowolne tułowia i kończyn, zaburzenia psychiczne i osłabienie funkcji poznawczych.
Występowanie powyższych objawów klinicznych i dominującego typu dziedziczenia nie zawsze jest skutkiem mutacji
w genie IT15, czego dowodzi dość liczna grupa pacjentów, u których stwierdzono obecność tylko prawidłowych
alleli tego genu. Wobec tego do diagnostyki molekularnej chorób podobnie się manifestujących, ale z wykluczoną
mutacją w genie IT15, wprowadzono algorytm postępowania polegający na analizie trzech innych genów, w których
zwielokrotnienie powtórzeń CAG lub CTG prowadzi do wystąpienia objawów takich jak w chorobie Huntingtona.
1. Mutacja dynamiczna genu TBP (TATA Binding Protein) zaburza lub hamuje funkcje jego białkowego produktu,
będącego podstawowym czynnikiem inicjacji transkrypcji oraz wchodzącego w skład podjednostki polimerazy II RNA
wiążącej DNA o kluczowym znaczeniu dla ekspresji większości genów. Ekspansja trójek nukleotydowych CAG w tym
locus prowadzi do wystąpienia objawów choroby neurodegeneracyjnej zwanej SCA17 (Spinocerebellar Ataxia Type 17).
2. Mutacja w jednym z alleli JPH3 powoduje wystąpienie choroby nazwanej HDL-2 (Huntington Disease Like 2).
Produkt białkowy tego genu wchodzi w skład kompleksu odpowiadającego za utrzymanie prawidłowego stanu
polaryzacji błony komórkowej.
3. Ekspansja niestabilnej sekwencji trójkowej w obrębie genu CTG-B37 powoduje jednostkę chorobową nazwaną
z ang. DRPLA (Dentatorubral – pallidoluysian atrophy) charakteryzującą się autosomalnym dominującym sposobem
dziedziczenia.
Gen CTG-B37 koduje białko o jeszcze nie poznanej funkcji. W obrazie klinicznym w/w mutacji dynamicznych mieszczą
się liczne objawy charakterystyczne dla HD i kilku innych jednostek chorobowych. Dlatego badania genetyczne mają
znaczenie rozstrzygające dla rozpoznania, leczenia i prognozowania w poszczególnych przypadkach.
P2.
The −22 c/t polymorphism in presenilin 1 gene is not connected with late-onset
and early-onset familia Alzheimer’s disease.
Aleksandra Maruszak (1), Krzysztof Safranow (2), Dorota Religa (3), Magda Gacia (4), Violetta Dziedziejko (2),
Małgorzata Kobryś (4), Cezary Zekanowski (1, 4), Dariusz Chlubek (2), Maria Barcikowska (4, 5)
(1) Laboratory of Neurodegeneration, International Institute of Molecular and Cell Biology, Warszawa, Poland
(2) Department of Biochemistry and Chemistry, Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland.
(3) Department of Neurotec, Section of Experimental Geriatrics, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden
(4) Department of Neurodegenerative Disorders, Medical Research Centre, Polish Academy of Sciences, Warszawa, Poland
(5) Department of Neurology, MSWiA Hospital, Warszawa, Poland
The −22 c/t polymorphism in the promoter of the presenilin 1 gene (PSEN1) is associated with increased risk for
Alzheimer’s disease (AD) in some populations. It was shown that −22 c allele is connected with two-fold decrease in
promoter activity. We analyzed the impact of the polymorphism in groups of Polish late-onset, early-onset AD patients
and control subjects.
19
Genetyka człowieka
Our results suggest that −22 c/t polymorphism is not connected with AD in Polish population. The −22 t allele showed
a high degree of linkage disequillibrium with &#8211;2797 insertion of 13 bp. An additional –2897g/t polymorphism is
also not connected with −22 c/t one and is not a risk factor for AD.
P3.
Two novel mutations in presenilin 1 gene connected with familial, early-onset
Alzheimer’s disease.
Maciej Golan (1), Beata Pepłońska (1), Wanda Lipczyńska-Łojkowska (2), Krystiana Krzyśko (3),
Maria Styczyńska (1, 4), Elżbieta Łuczywek (4), Sławomir Filipek (3), Jerzy Kulczycki (2),
Maria Barcikowska (1, 4), Cezary Żekanowski (1), Jacek Kuźnicki (5)
(1) Department of Neurodegenerative Disorders, Medical Research Center, Polish Academy of Sciences, Warszawa, Poland
(2) 1st Department of Neurology, Institute o Psychiatry and Neurology, Warszawa, Poland
(3) Laboratory of Biomodelling, International Institute of Molecular and Cell Biology, Warszawa, Poland
(4) Department of Neurosurgery, Medical research Center, Polish Academy of Science, Warszawa, Poland
(5) Laboratory of Neurodegeneration, International Institute of Molecular and Cell Biology, Warszawa, Poland
Alzheimer’s disease (AD) and frontotemporal dementia (FTD) are main causes of neurodegenerative disorders.
In a minority of cases early-onset AD (EOAD) shows a pattern of autosomal dominant mode of inheritance with three
causative genes identified so far: amyloid precursor protein gene (APP), presenilin 1 gene (PSEN1) and presenilin 2 gene
(PSEN2). Familial FTD cases are connected with mutations at the MAPT gene, coding for tau protein. As the main
difficulty is to differentiate clinically FTD from EOAD, differential molecular diagnosis could be helpful.
We performed a screening for PSEN1 mutations in two patients: one with clinical diagnosis of probable EOAD and the
second with a clinical diagnosis of typical FTD, with no mutations in the MAPT gene identified.
Two novel mutations in the PSEN1 gene were identified: L424H and L226F, located in transmembrane domains V and
VIII respectively. Both mutations were absent in a group of 67 familial AD cases, and in a group of 50 healthy controls. In
silico analysis of L424H and L226F suggests influence on PS1 structure. Both mutations affect evolutionary conservative
residues, and both substitutions changes their biochemical character. Post-mortem brain examination revealed typical
histopathological AD features in the patient with L226F. Collected information strongly suggests that L424H and L226F
are disease-causing mutations.
P4.
Badanie sekwencji kodującej i promotorowej genu Myelin Protein Zero (MPZ)
w grupie 50 chorych z dziedziczną neuropatią ruchowo-czuciową
Adam Nowakowski, Dagmara Kabzińska, Andrzej Kochański
Zespół Badawczo-Leczniczy Chorób Nerwowo-Mięśniowych Instytutu Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej Polskiej
Akademii Nauk
Wstęp: Jak dotychczas opisano ponad 90 mutacji w genie MPZ u chorych z różnymi formami (HMSN).
Cel pracy: 1. Poszukiwanie mutacji w genie MPZ oraz określenie częstości występowania mutacji w genie MPZ
u chorych z HMSN. 2. Określenie przydatności metody polimorfizmu konformacji fragmentów jednoniciowych DNA
(SSCP) oraz heterodupleksów DNA (HD) w badaniach genetycznych genu MPZ.
Materiał i metody: Badanie sekwencji kodującej i promotorowej genu MPZ (SSCP, HD oraz sekwencjonowanie)
wykonano u 46 chorych z rozpoznaniem: demielinizacyjnej (15) i aksonalnej formy CMT (23), wrodzonej neuropatii
hipomielinizacyjnej (4) oraz choroby CMT o nieznanym podtypie (4)
Wyniki: Zidentyfikowano dwie mutacje patogenne tj. E56K (aksonalna forma choroby CMT) i T124K (wrodzona
neuropatia hipomielinizacyjna) oraz polimorfizm S228S. Nie stwierdzono mutacji w sekwencji promotorowej genu
MPZ .
Wnioski: Rozpoznanie wrodzonej neuropatii hipomielinizacyjnej i aksonalnej postaci choroby CMT powinno być
wskazaniem do badania genu MPZ.
Piśmiennictwo: A. Nowakowski, A. Kochański Screening of the myelin protein zero gene in patients with CharcotMarie-Tooth disease. Acta Biochimica Polonica 2004, 51(1), 273-280.
20
Genetyka człowieka
P5.
Nowa odmiana choroby Charcot-Marie-Tooth typu 2, charakterystyka kliniczna oraz
wykluczenie 7 loci choroby CMT2.
Andrzej Kochański (1), Marina Kennerson (2), Marta Kawulak (1), Barbara Ryniewicz (3),
Katarzyna Rowińska-Marcińska (1,3), Gina Walizada (2), Adam Nowakowski (1),
Irena Hausmanowa-Petrusewicz(1),Garth Nicholson (2)
(1) Zespół Badawczo-Leczniczy Chorób Nerwowo-Miesniowych Instytutu Medycyny Doswiadczalnej i Klinicznej Polskiej
Akademii Nauk
(2) University of Sydney Neurobiology Laboratory, Anazac Research Institute, Concord Hospital NSW 2139, Australia
(3) Katedra i Klinika Neurologii Akademii Medycznej w Warszawie
Wstęp: Choroba Charcot-Marie-Tooth typu 2 (CMT2) o dziedziczeniu autosomalnym jest heterogenna genetycznie (7
loci, 5 genów).
Cel pracy: 1. Określenie sprzężenia genetycznego do jednego z 7 loci choroby CMT 2 w pięciopokoleniowej rodzinie
z fenotypem CMT2.
2. Charakterystyka kliniczna i elektrofizjologiczna badanej rodziny.
Metody: W pięciopokoleniowej rodzinie CMT2 (9 chorych, 16 zdrowych członków rodziny) przeprowadzono badania
neurologiczne i elektromiograficzne (6 chorych) oraz wykonano badanie analizy sprzężeń genetycznych (7 loci).�
Wyniki: Wykluczono sprzężenie genetyczne na poziomie lod score <-2 z 7 loci dla CMT2 o dziedziczeniu autosomalnym
dominującym.
Wnioski: Wyniki przeprowadzonych badań wskazują, że w pięciopokoleniowej rodzinie występuje nowa odmiana
CMT2, która cechuje się wczesnym początkiem oraz łagodnym przebiegiem klinicznym. Wyniki badań są kolejnym
dowodem na heterogenność genetyczną choroby CMT2.
P6.
Analiza sekwencji eksonu 2-go genu LITAF/SIMPLE w grupie 35 chorych
z dziedziczną neuropatią ruchowo-czuciową.
Ewa Sołtysińska (1), G.M. Saifi (2), D. Kabzińska (1), A. Kochański (1), J. R. Lupski (2), �
I. Hausmanowa-Petrusewicz (1)
(1) Zespół Badawczo-Leczniczy Chorób Nerwowo-Miesniowych Instytutu Medycyny Doswiadczalnej i Klinicznej Polskiej
Akademii Nauk
(2) Baylor College of Medicine,Department of Molecular and Human Genetics, Houston, USA
Wstęp:
Jak dotychczas opisano trzy mutacje w eksonie 2-gim genu LITAF/SIMPLE u chorych z demielinizacyjną postacią
choroby Charcot-Marie-Tooth typu 1C (CMT1C).
Cel pracy:
Poszukiwanie mutacji w genie LITAF/SIMPLE w 35 osobowej grupie chorych.
Materiał i metoda:
Badanie sekwencji eksonu drugiego genu LITAF/SIMPLE metodą polimorfizmu konformacji fragmentów
jednoniciowych (SSCP) i heterodupleksów (HD) w grupie 35 chorych z CMT. W przypadku stwierdzenia innego niż
dziki wzoru migracji produkt PCR był sekwencjonowany.
Wyniki:
Wykryto dwie mutacje w genie LITAF/SIMPLE tj.: Ile92Val oraz Leu122Val.
Wnioski:
1.Substytucja Ile92Val jest polimorfizmem sekwencji genu LITAF/SIMPLE
2.Substytucja Leu122Val wydaje się być mutacją patogenną
21
Genetyka człowieka
P7.
Diagnostyka prenatalna w rdzeniowym zaniku mięśni. Wskazania, organiczenia,
interpretacja wyników.
Maria Jędrzejowska (1), Janusz Zimowski (2), Wojciech Wiszniewski (3), Danuta Sielska (3), Jerzy Bal (3),
Tadeusz Mazurczak (3), Irena Hausmanowa-Petrusewicz (1), Jacek Zaremba (2)
(1) Zespół Badawczy Chorób Nerwowo-Mięśniowych Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej PAN, Warszawa
(2) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Psychiatrii i Neurologii
(3) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka
Dosiebny dziecięcy i młodzieńczy rdzeniowy zanik mięśni (SMA) jest chorobą genetycznie uwarunkowaną, dziedziczoną
jako cecha autosomalna recesywna. Objawy choroby wywołane są mutacjami genu SMN1. Około 96,5% tych mutacji
stanowi obualliczna delecja eksonu 7 w genie SMN1. Jednorodność podłoża molekularnego choroby umożliwia objęcie
rodzin wysokiego ryzyka programem profilaktyki wtórnej.
W pracy przedstawiamy podsumowanie wyników diagnostyki prenatalnej w kierunku SMA, prowadzonej od 1998
roku w dwóch ośrodkach w Polsce. W tym okresie wykonano 55 badań prenatalnych w 50 rodzinach ryzyka SMA.
W 38 rodzinach, z 25% ryzykiem wystąpienia SMA u potomstwa, wykonano 43 badania prenatalne. W 8 przypadkach
(18,6%) zidentyfikowano genotyp z delecją eksonu 7 w obu allelach genu SMN1. W pozostałych 12 rodzinach, w których
prawdopodobieństwo wystąpienia choroby było niższe (różnego stopnia krewni probanta) lub nieznane (brak weryfikacji
molekularnej rozpoznania klinicznego probanta) uzyskano 1 wynik potwierdzający chorobę u płodu.
Na diagnostykę prenatalną decydowali się głównie rodzice, których dzieci cierpiały na ostrą postać SMA i którzy nie
mieli dotąd zdrowego potomstwa (73% rodzin).
P8.
Badanie sekwencji kodującej genu GDAP-1 w grupie 48 chorych z demielinizacyjną
i aksonalną postacią choroby Charcot-Marie-Tooth.
Dagmara Kabzińska (1), Andrzej Kochański (1), Hanna Drac (1, 2), Barbara Ryniewicz(2)
Irena Hausmanowa-Petrusewicz (1, 2)
(1) Zespół Badawczo-Leczniczy Chorób Nerwowo-Mięśniowych Instytutu Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej
im. M. Mossakowskiego Polskiej Akademii Nauk
(2) Katedra i Klinika Neurologii Akademii Medycznej w Warszawie
Wstęp: Choroba Charcot-Marie-Tooth typu 4A (CMT4A) stanowi najczęstszą odmianę dziedzicznych neuropatii
ruchowo-czuciowych dziedziczących się w sposób autosomalny recesywny. Jak dotychczas opisano zaledwie 16 mutacji
w genie GDAP-1 kodującym białko Ganglioside-induced differentation-associated protein 1 (Gdap1), o nieznanej jak
dotąd funkcji biologicznej. Mutacje w genie GDAP-1 opisano zarówno w demielinizacyjnej jak i aksonalnej odmianie
choroby Charcot-Marie-Tooth (CMT1 i CMT2). Cel pracy: Analiza sekwencji kodującej genu GDAP-1 w 48 osobowej
grupie chorych z demielinizacyjną i aksonalną postacią choroby CMT.
Materiał i metody: Badano sekwencję genu GDAP-1 metodami polimorfizmu fragmentów jednoniciowych (SSCP) oraz
heterodupleksów DNA (HTD), u których analiza rodowodu wskazywała na recesywny sposób dziedziczenia choroby.
Produkty Reakcji Łańcuchowej Polimerazy (PCR) o innym niż dziki wzorcu migracji w metodach SSCP i HTD
sekwencjonowano.
Wyniki: Zidentyfikowano trzy nowe mutacje w genie GDAP-1, tj. homozygotyczną mutacje Met116Thr u dwóch
chorych braci z trzypokoleniowej rodziny CMT oraz heterozygotyczną mutację Met116Thr u 6 zdrowych nosicieli oraz
dwie mutacje 318-1G>A/Ser130Cys u 7-letniego chłopca z CMT2, którego zdrowi rodzice są nosicielami mutacji 3181G>A oraz Ser130Cys. Biopsje nerwu u dwóch chorych braci i 7-letniego chłopca wykazały aksonopatie.
Wnioski: 1.Zidentyfikowano trzy nowe mutacje w genie GDAP-1 2.Wyniki badań potwierdzają związek mutacji
w genie GDAP-1 z aksonalną formą CMT 3.Badanie sekwencji genu GDAP-1 wskazane jest w przypadkach zarówno
sporadycznych, jak i rodzinnych choroby CMT2.
22
Genetyka człowieka
P9.
Analiza nietypowych wyników diagnostyki molekularnej zespołu łamliwego
chromosomu X.
Danuta Sielska, Michał Milewski, Jerzy Bal
Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Kasprzaka 17a, 01-211 Warszawa
Za występowanie zespołu łamliwego chromosomu X, będącego najczęstszą w Polsce dziedziczną postacią
niepełnosprawności intelektualnej, odpowiedzialna jest ekspansja (wydłużenie) niestabilnej sekwencji powtórzonej
(CGG)n w pierwszym eksonie genu FMR1. Pierwszy etap diagnostyki molekularnej zespołu, obejmujący analizę
przy użyciu testu PCR, ma charakter badania przesiewowego. Etap drugi, wykorzystujący hybrydyzację genomową
z zastosowaniem techniki Southerna, umożliwia ostateczną weryfikację diagnozy.�
Celem retrospektywnej analizy badań diagnostycznych, wykonanych u 1024 osób w ciągu trzech ostatnich lat, było
oszacowanie częstości występowania wyników nietypowych, które mogłyby wpłynąć na dokonanie ewentualnej
modyfikacji stosowanej procedury diagnostycznej.
Analizowane wyniki badań molekularnych obejmowały przykłady nietypowe, zasługujące na szczególną uwagę. Do
grupy tej zaliczyć można nietypowy wygląd/układ prążków obserwowanych w etapie badań przesiewowych oraz
przypadki mozaikowatości somatycznej u mężczyzn, u których obecności prawidłowego prążka towarzyszy czasami
pojawienie się nieco rozmytego sygnału (tzw. smearu), który może zostać łatwo przeoczony w rutynowym badaniu.
Analiza doświadczeń własnych wskazuje na konieczność kierowania wszelkich takich przypadków do drugiego etapu
badań, umożliwiającego przeprowadzenie ostatecznej weryfikacji wyniku.
Drugi istotny problem diagnostyczny stanowią stosunkowo liczne (12 osób w ciągu dwóch lat) przypadki występowania
alleli zaliczanych do tzw. “szarej strefy”, których długość odpowiada w przybliżeniu wartości pośredniej między allelem
prawidłowym a premutacją. Należy zaznaczyć, że jednoznaczne zaklasyfikowanie takich przypadków do którejkolwiek
z tradycyjnych klas alleli (alleli prawidłowych lub premutacyjnych) wiąże się ze znacznym ryzykiem późniejszego
błędnego oszacowania prawdopodobieństwa wystąpienia choroby u potomstwa badanych osób.
Otrzymane wyniki stanowią podstawę dla wprowadzenia konkretnych modyfikacji w praktycznej procedurze
diagnostyki molekularnej zespołu łamliwego chromosomu X.
P10.
Charakterystyka kliniczna i molekularna pacjentów z dystonią torsyjną
typu 1 – wstępne wyniki badań.
Krzysztof Szczałuba (1), Jerzy Bal (2), Bartosz Kądziołka (3), Adam Szołna (4), Tadeusz Mazurczak(5)
(1) Polskie Towarzystwo Genetyki Człowieka
(2) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Warszawa
(3) Klinika Neurochirurgii i Urazów Układu Nerwowego, Szpital Bródnowski, Warszawa
(4) Klinika Neurochirurgii i Chirurgii Głowy, Wojskowy Szpital Kliniczny, Bydgoszcz
(5) Klinika Neurologii AM w Warszawie
Dystonie stanowią grupę chorób układu pozapiramidowego charakteryzujących się przetrwałymi i mimowolnymi
skurczami mięśni, które powodują skręcające ruchy różnych części ciała (stąd dodatkowe określenie: torsyjne) i/lub
przyjmowanie nietypowych póz. Wśród genetycznie uwarunkowanych dystonii wyróżnia się 15 typów, w tym najczęściej
występującą, dziedziczącą się autosomalnie dominująco, dystonię torsyjną typu 1 (OMIM: 128100). U podłoża choroby
leży defekt w genie DYT1, kodującym torsynę A, polegający na delecji trzech par zasad GAG w piątym eksonie genu.
Przedstawiono charakterystykę cech klinicznych oraz wyniki analizy mutacji delGAG w genie DYT1 w grupie 40
pacjentów, w wieku 17-63 lat, z rozpoznaniem klinicznym dystonii pierwotnej. U 4 spośród nich (10%) zidentyfikowano
delecję GAG w pozycji 946-948nt genu DYT1 odpowiedzialną za wystąpienie objawów dystonii torsyjnej typu 1.
U wszystkich chorych pierwsze objawy dystonii pojawiły się przed ukończeniem 20 roku życia w obrębie kończyny
dolnej, a następnie rozszerzyły się na inne części ciała (postaci uogólniające się lub uogólnione). Charakterystyki
cech klinicznych wszystkich chorych dokonano na podstawie skali ruchowej dystonii wg Burke-Fahn-Marsden,
tzw. Dystonia Movement Scale. W skali uwzględniono m.in. lokalizację objawów i ich ciężkość. Ponadto omówiono
wyniki analizy rodowodów oraz badań molekularnych przeprowadzonych wśród krewnych probandów, u których
wykazano obecność mutacji w genie DYT1.
Badania są kontynuowane i mają na celu opracowanie algorytmu postępowania diagnostycznego w przypadkach
pierwotnej dystonii torsyjnej, także w kontekście wskazań do leczenia neurochirurgicznego (wszczepienia stymulatora
do prążkowia).
23
Genetyka człowieka
P11.
Epigenetyczna metoda klasyfikacji nowotworów mózgu
Mirosława Z. Barciszewska (1), Ryszard Żukiel (2), Stanisław Nowak (2), Anna-Maria Barciszewska (1, 2, 3),
Iwona Gawrońska (1), Jan Barciszewski (1)
(1) Instytut Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk, ul. Noskowskiego 12/14, 61-704 Poznań
(2) Katedra i Klinika Neurochirurgii i Neurotraumatologii Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego,
ul. Przybyszewskiego 49, 60-355 Poznań
(3) Wydzial Chemii Uniwersytetu im. Mickiewicza, ul. Grunwaldzka 6, Poznań
Nowotworzenie to wieloetapowy proces, który jest wynikiem kumulacji mutacji (modyfikacji i błędów) powstałych
zarówno w strukturze pierwszorzędowej genów, jak i w mechanizmach regulacji ich ekspresji. Jednym z nich jest
atenuacja transkrypcji informacji genetycznej poprzez metylację cytozyny w DNA. Okazało się, że u wszystkich
organizmów eukariotycznych oprócz czterech podstawowych zasad azotowych, adenozyny, guanozyny, tymidyny
i cytozyny, występuje również 5-metylocytozyna (m5C) w ilościach od 10 d0 20%. Znaczącej metylacji ulega ok. 80%
cytozyn w sekwencjach bogatych w dwunukleotyd CpG, zwanych i „wyspami CpG”. Rozkład metylowanych wysp CpG
jest specyficzny dla danego rodzaju komórek i określa swoisty sposób ekspresji genów, zwany epigenetycznym. Z licznych
badań wiadomo, że zmiany w metylacji DNA występują w większości nowotworów. Polegają one zarówno na globalnej
hipometylacji (zmniejszenie poziomu metylacji), jak również miejscowej hipermetylacji (zwiększonej metylacji).
Zmiany te następują najczęściej w obszarze promotorowym genów i mogą skutkować transkrypcyjnym wyłączeniem
(wyciszeniem) genów supresorowych albo, przeciwnie, nadekspresją onkogenów. Celem pracy było oznaczenie poziomu
metylacji DNA w nowotworach mózgu oraz jej korelacja ze stopniem złośliwości. DNA tkanki nowotworowej poddano
hydrolizie enzymatycznej do nukleotydów, które piętnowano radioaktywnym fosforem [32P]. Analizę znakowanych
nukleotydów przeprowadzano metodą cienkowarstwowej chromatografii. Wykorzystanie kliniczne oznaczeń poziomu
metylacji DNA pozwala na klasyfikację nowotworów oraz różnicowanie stopni złośliwości biologicznej, zwłaszcza
w przypadku wznowy nowotworu.
(Literatura – R. Żukiel et all. (2004) A simple epigenetic method for the diagnosis and classification of brain tumors,
Molecular Cancer Research (USA) 2, 1-7).
P12.
Genetic study of Alzheimer’s disease: presenilin-1 genes mutations in Polish
families.
Anna Kowalska (1), Danuta Pruchnik-Wolińska (2), Jolanta Florczak (2), Renata Modestowicz (2),
Józef Szczech (2), Wojciech Kozubski (2), Grzegorz Rossa (3), Mieczysław Wender (4)
(1) Institute of Human Genetics, Polish Academy of Sciences, 32 Strzeszyńska, 60-479 Poznań
(2) Dept. of Neurology, University of Medical Sciences, 49 Przybyszewskiego, 60-355 Poznań,
(3) Provincial Hospital for Neurological and Psychiatric Diseases
(4) Neuroimmunological Unit, Medical Research Center, Polish Academy of Sciences, 49 Przybyszewskiego, 60-355 Poznań
Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder characterized by two major brain lessions,
referred to as senile plaques (deposits of amyloid β– peptides; AB) and neurofibrillary tangles (NFT; filaments of
a hyperphosphorylated tau protein). According to the “amyloid cascade hypothesis”, the accumulation of Aβ peptides in
the brain is a primary event in the pathogenesis of AD. A series of endoproteolytic cleavages of the amyloid precursor
protein (APP) controlled by α-, β-, γ-secretases leads to a formation of non-amyloidogenic (the α-secretase pathway)
and amyloidogenic (the β-secretase pathway) products which are essential for neurodegenenaration. Other pathological
features in AD (neurofibrillary tangles, neuronal damage, and cell death) are regarded as secondary. A small number (15%) of familial AD cases associated mainly with the early-onset form of the disease (EOAD) is transmitted as a genetic
autosomal dominant trait with a classical Mendelian pattern of inheritance. To date, three genes responsible for familial
EOAD have been identified in the human genome: Amyloid precursor protein (APP) gene, Presenilin 1 (PS1) gene,
and Presenilin 2 (PS2) gene. Pathogenic mutations in these genes account for a majority (18-50%) of familial autosomal
dominant cases of EOAD. The mutations affect the APP processing causing increased production of a toxic Aβ42
peptide.
To contribute to our knowledge on a genetic basis of neurodegeneration in AD, we performed the analysis of mutations
in APP, PS1, and PS2 genes in a sample of 20 patients with familial AD from PoznaĂą region. We identified three
missense mutations in the PS1 gene: A246E (exon 7), P267L (exon 8), and a novel L424R one (exon 12) in three unrelated
families with autosomal dominant EOAD. A frequency of PS1 mutations was estimated at 15% (3/20) in a whole sample
of familial AD cases, or 50% (3/6) if the analysis was restricted to the families with a clear autosomal dominant mode
24
Genetyka człowieka
of inheritance. A lack of APP and PS2 mutations in the analyzed sample confirms their very rare occurrence among
patients. We discussed molecular effects of the mutations on APP metabolism and clinical phenotype upon the mutation
nature, its localization in the gene, patient’s Apoliporotein E genotype and other genetic factors.
P13.
Poszukiwanie nowych genów odpowiedzialnych za niepełnosprawność intelektualną
(NI) w rodzinach z X – recesywnym sposobem dziedziczenia. Analiza sprzężeń
z zastosowaniem pojedynczo-nukleotydowych polimorfizmów (SNP).
Bartłomiej Budny (1, 2), M. Badura (1), W. Chen (2), A. Tzschach (2), M. Wisniewska (1), A. Materna-Kiryluk (1),
R. Glazar (1) ,M. Krawczyński (1), M. Hoeltzenbein (2), V. M. Kalscheuer (2), S. Lenzner (2) , H. H. Ropers (2),
A. Latos-Bielenska (1)
(1) Katedra i Zakład Akademii Medycznej w Poznaniu
(2) Max-Planck-Institute for Molecular Genetics, Berlin, Germany
Niepełnosprawność intelektualna (definiowana jako IQ<70) jest częstą jednostką chorobową uwarunkowaną zarówno
czynnikami środowiskowymi jak i genetycznymi. Szacuje się ze dotyka 2-3% ogólnej populacji. U mężczyzn obserwuje
się wyższą częstość niepełnosprawności intelektualnej, co spowodowane jest mutacjami genów zlokalizowanych
w chromosomie X. Identyfikacja większości genów biorących udział w patogenezie NI, była możliwa dzięki zastosowaniu
metod określanych mianem klonowania pozycyjnego, takich jak badanie translokacji zrównoważonych oraz analiza
sprzężeń w dużych rodzinach. W ostatnich latach zmapowano ponad 80 rodzin MRX (ang. Mental Retardation Xlinked) a także zidentyfikowano 17 genów odpowiedzialnych za niespecyficzną, bądź będące częścią określonego
zespołu, niepełnosprawność intelektualną. Szacuje się, że w chromosomie X może znajdować się nawet około stu genów,
które w wyniku mutacji prowadza do znaczącego obniżenia sprawności intelektualnej. Praca prezentuje 2 nowe rodziny
z recesywnym, sprzężonym z chromosomem X sposobem dziedziczenia NI. W obydwu przypadkach wykonano analizę
parametryczna (dwu– i wielopunktową) mapując poszczególne rodziny, do regionów na chromosomie X (LodScore
> 2). Genotypowanie pacjentów oparto na analizie pojedynczo-nukleotydowych polimorfizmów SNP (ang, Single
Nuklotide Polymorphism), które posłużyły jako markery genetyczne. Zastosowanie 68 markerów w odstępach średnio
2-4 cM, pozwoliło uzyskać dokładną mapę chromosomu X i precyzyjne określić granice interwałów sprzężenia dla
poszczególnych rodzin. Dysponując danymi pochodzącymi z analizy sprzężeń ustalono strategie wyboru i screeningu
genów kandydatów, w celu wykrycia przyczynowych mutacji. W pierwszej kolejności analizowano znane geny
odpowiedzialne za NI.
Praca realizowana w ramach europejskiego grantu EURO-MRX we współpracy z Max-Planck Institut f. Molekulare
Genetik w Berlinie.
P14.
Bezobjawowa delecja w genie dystrofiny.
Janusz Zimowski (1), Elżbieta Fidziańska (1), Elżbieta Zdzienicka (1), Barbara Ryniewicz (2), Jacek Zaremba (1)
(1) Pracownia Analizy DNA, Zakład Genetyki, Instytut Psychiatrii i Neurologii, Al. Sobieskiego 9, 02-957 Warszawa
(2) Klinika Neurologii, Akademia Medyczna, Warszawa, ul. Banacha 1a
Dystrofia mięśniowa Duchenne’a/Beckera (DMD/BMD) polega na stopniowym i nieodwracalnym zaniku mięśni. Średnio
w 10 r. życia chory chłopiec przestaje chodzić; umiera średnio w 20 r. życia (typ Duchenne’a). DMD/BMD jest chorobą
sprzężoną z płcią i wywoływaną mutacjami w genie dystrofiny zlokalizowanym na krótkim ramieniu chromosomu
X (Xp21). Łagodną postać choroby (typ Beckera) charakteryzuje duża rozpiętość nasilenia objawów od nieco lżejszych
niż w typie Duchenne’a po bardzo łagodny przebieg choroby, w którym czas życia nie ulega skróceniu, a jedynymi
objawami bywają bóle i kurcze mięśniowe. Różny przebieg choroby tłumaczy teoria zachowania lub naruszenia ramki
odczytu przez mutację. Przy zachowanej ramce odczytu powstaje skrócone, ale częściowo funkcjonalne białko.
Przedstawiamy przypadek trzypokoleniowej rodziny, w której wykryto delecję w obrębie genu dystrofiny obejmującą
eksony 3-8 (bez naruszenia ramki). Mutację stwierdzono u trzech braci, ich matki, siostry matki i jej córki. Badanie
wykonano ze względu na nieznacznie podwyższony poziom kinazy kreatynowej (CPK). Klinicznie wszyscy mężczyźni
z delecją są zdrowi, starsi bracia uprawiają sport.
Wcześniejsze badania 1,2 wskazywały, że delecje obejmujące domenę N-końca, nawet przy zachowaniu ramki odczytu,
powodują cięższy przebieg choroby nazywany postacią pośrednią. Delecje z zachowaniem ramki występujące w domenie
“rod” powodują tylko kurcze i bóle mięśniowe a nawet mogą być bezobjawowe 3.
Brak zgody pacjentów na pobranie wycinka mięśniowego uniemożliwia zbadanie białkowego produktu genu –dystrofiny.
25
Genetyka człowieka
Nieznany jest mechanizm kompensacji braku części domeny N-końca odpowiedzialnej za wiązanie się dystrofiny z αaktyną, który chroni przed rozwojem choroby.
1 Koenig M, Beggs AH, Moyer M, et al. (1989) The molecular basis for Duchenne versus Becker muscular dystrophy:
correlation of severity with type of deletion. Am J Hum Genet 45: 498-506.
2 Beggs AH, Hoffman EP, Snyder JR, et al. (1991) Exploring the molecular basis for variability among patients with
Becker muscular dystrophy: dystrophin gene and protein studies. Am J Hum Genet 49: 54-67.
3 Dobosiewicz K, Fidziańska A, Zaremba J, et al. (2000) Bezobiawowa dystrofia mięśniowa typu Beckera. Badanie �
genetyczne i immunohistochemiczne. Neurol. Dziec. 9 (18): 191-198.
P15.
Analiza wariantów polimorficznych genu CHRNA4.
Agata Różycka (1), Barbara Steinborn (2), Marek Pietrzak (3), Andrzej Kostyrko (1), Bogumiła Ratajczak (1),
Wiesław H. Trzeciak (1)
(1) Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej AM w Poznaniu, ul. Święcickiego 6, 60-781 Poznań
(2) Katedra i Klinika Neurologii Wieku Rozwojowego, AM w Poznaniu
(3) Wielkopolskie Centrum Neurologii Dzieci i Młodzieży w Poznaniu
Przeprowadzone w ostatnim czasie badania genetyczne w jednej z form padaczek idiopatycznych, autosomalnej
dominującej padaczki czołowej z napadami nocnymi (autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy, ADNFLE),
dowodzą, że mutacje genu dla podjednostki &#61537;4 (CHRNA4) neuronalnego receptora acetylocholiny warunkują
wystąpienie objawów klinicznych tej choroby. W obrębie eksonu 5 genu CHRNA4 zidentyfikowano kilka wariantów
polimorficznych, które mogą służyć jako wewnątrzgenowe loci markerowe. Stwierdzono, iż u chorych z ADNFLE
częstość występowania dwóch z nich (FokI 651 C/T oraz CfoI 690 C/T) może być zwiększona, podczas gdy inne badania
zdają się zaprzeczać tej hipotezie. Wyniki kolejnych badań wskazują na związek polimorfizmu CfoI 690 C/T z wspólną
grupą podtypów idiopatycznych padaczek uogólnionych (idiopathic generalised epilepsy, IGE), do których zaliczono
młodzieńczą padaczkę miokloniczną (juvenile myoclonic epilepsy, JME).
Celem projektu było sprawdzenie czy istnieje związek polimorfizmów FokI 651 C/T i CfoI 690 C/T CHRNA4
z występowaniem obu postaci padaczek idiopatycznych (ADNFLE oraz JME) w populacji polskiej. Ponadto w obrębie
eksonu 5 genu CHRNA4 oraz flankujących go sekwencji intronowych zbadano częstość trzech innych, znanych
wariantów polimorficznych (CfoI 1641 T/C, CfoI 1671 A/G, StyI 1770+14 A/G) oraz zidentyfikowano nowy, wcześniej
nie opisany wariant (SsiI 1770+11 C/T).
Badaniami objęto grupę 77 chorych z padaczką idiopatyczną (54 chorych z ADNFLE i 23 chorych z JME) oraz grupę
kontrolną składającą się z 100 osób zdrowych. W celu określenia rodzaju wariantu polimorficznego, wybrane sekwencje
badanego genu amplifikowano przy użyciu specyficznych starterów i poddawano analizie restrykcyjnej. Produkty analizy
polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) rozdzielano na żelu agarozowym lub poliakryloamidowym.�
Częstości zmutowanych alleli dla polimorficznych loci wyniosły, odpowiednio w grupie chorych i kontrolnej: 0,08 i 0,07
(FokI 651 C/T); 0,03 i 0,04 (CfoI 690 C/T); 0,44 i 0,43 (CfoI 1641 T/C); 0,54 i 0,52 (CfoI 1671 A/G); 0,12 i 0,06 (SsiI
1770+11 C/T) oraz 0,32 i 0,35 (StyI 1770+14 A/G).
Na podstawie uzyskanych częstości alleli dla sześciu analizowanych polimorfizmów nie wykazano istotnych statystycznie
różnic pomiędzy grupą chorych z ADNFLE oraz JME a grupą kontrolną. Dlatego analizowane warianty polimorficzne
nie wykazują związku zarówno z ADNFLE jak i IGE, nie mogą więc służyć jako wewnątrzgenowe loci markerowe dla
badanych padaczek idiopatycznych.
Badania finansowane z grantu KBN 3PO5A11525.
P16.
The severe forms of Stargardt disease (STGD) are frequently caused by a new class
of mutations affecting ABCR localization.
Wojciech Wiszniewski, C. M. Zaremba, M. Jamrich, J. R. Lupski
Department of Human and Molecular Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA
Purpose: ABCR (ABCA4) is a photoreceptor-specific member of the ATP-binding cassette (ABC) family, and mutations
of ABCR are associated with many retinal phenotypes including Stargardt disease, Fundus Flavimaculatus, combined
cone-rod dystrophy and retinitis pigmentosa. Our purpose is to develop an experimental system for investigating
mechanisms regulating intracellular trafficking of ABCR and for testing mutations found in domains involved in cellular
localization of ABCR.
26
Genetyka człowieka
Methods: Our approach is to express a human ABCR transgene in photoreceptors of Xenopus laevis tadpoles. DNA
fragments containing both wild type and mutated (L541P, R602W and C1490Y) ABCR coding sequence were cloned
into the pXOP vector containing the promoter for the X. laevis rhodopsin gene, and used for transgenesis. The retinas
of 2-4 week old tadpoles were studied for the expression and localization of transgenic ABCR by immunofluorescence
methods.
Results: Expression was restricted to photoreceptor cells and was variable from cell to cell. In some cells very bright
staining of the rims of the discs was observed in rod outer segments (ROS). We found that some pathogenic mutations
cause mislocalization of ABCR with stacking of misfolded protein in the rod inner segment.
Conclusions: Human ABCR can be expressed from a transgene in Xenopus photoreceptors with appropriate localization
to the ROS. However, we have identified a new class of ABCR mutations, which lead to improper localization, thus
rendering a null effect. Mutations responsible for this effect are found with other null alleles in patients with severe
retinal degenerative phenotypes.
P17.
Choroba Hallervordena-Spatza– opis dwóch przypadków.
Iwona Płowaś (2), Zofia Helszer (1, 2), Bogdan Kałużewski (2)
(1) Zakład Genetyki Medycznej Katedry Biologii i Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, Al. Kościuszki 3,
90-419 Łódź
(2) Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, ul. Sterlinga 3, 91-425 Łódź
Choroba Hallervordena-Spatza należy do dziedzicznych chorób układu nerwowego o charakterze metabolicznym.
Choroba dziedziczona jest w sposób autosomalny recesywny. W większości przypadków chorobie towarzyszy mutacja
w genie PANK2 zlokalizowanym w regionie 20p13-p12.3. Objawy kliniczne choroby ulegają nasileniu w okresie
dzieciństwa lub dojrzewania. Najczęściej ostateczne rozpoznanie kliniczne jest stawiane na podstawie badania
rezonansu magnetycznego głowy, w którym obserwuje się zmiany o charakterze zwyrodnieniowo-barwnikowym
w gałkach bladych określane jako objaw „oka tygrysa”.
Pod opieką naszej poradni znajdowało się dwóch pacjentów z rozpoznaniem choroby Hallervordena-Spatza. W obu
przypadkach rozpoznanie wstępne potwierdzono badaniem rezonansu magnetycznego. Jednocześnie przeprowadzono
diagnostykę molekularną w kierunku wykrycia mutacji w genie PANK2. U pierwszego z pacjentów stwierdzono
mutację w genie PANK2, podczas gdy dotychczas przeprowadzone badania molekularne drugiego z pacjentów nie
potwierdziły wystąpienia mutacji. Powstaje ważne z klinicznego punktu widzenia pytanie, czy negatywny wynik badania
genu PANK2 w drugim przypadku usprawiedliwia postawienie ostatecznej diagnozy.
P18.
Wysoka liczba powtórzeń sekwencji pol MSRV u chorych na stwardnienie rozsiane
Mariola Zawada (1), Monika Pernak (3), Izabela Liwem (1), Danuta Januszkiewicz-Lewandowska (1, 2, 3),
Karina Nowicka (1), Jolanta Rembowska (1), Krzysztof Lewandowski (3), Hanna Hertmanowska (4),
Mieczysław Wender (5), Jerzy Nowak (1)
(1) Instytut Genetyki Człowieka PAN, Poznań
(2) Akademia Medyczna, Poznań
(3) Zakład Diagnostyki Medycznej, Poznań
(4) Oddział Neurologii, Szpital Wojewódzki, Poznań
(5) Zespół Neuroimmunologii, IMDiK PAN, Poznań
W rozwoju stwardnienia rozsianego istotną rolę odgrywają czynniki genetyczne, immunologiczne oraz infekcje
wirusowe. W 1997 Perron zasugerował udział nowoodkrytego wirusa MSRV (multiple sclerosis-related retrovirus)
w patogenezie SM.
W pracy przedstawiono porównanie liczby kopii sekwencji pol MSRV u 56 chorych na stwardnienie rozsiane w wieku
20–57 lat i 20 osób zdrowych w wieku 20–56 lat. Materiałem badawczym były jądra interfazowe i włókna chromatynowe
limfocytów krwi obwodowej pacjentów z SM i osób zdrowych.
Analizę liczby kopii sekwencji pol MSRV przeprowadzono metodą FISH
z użyciem jako sondy biotynowanego produktu PCR o długości 435 pz. Detekcję związanej sondy MSRV przeprowadzono
stosując reakcję: awidyną-FITC i anty-awidyną.
Stwierdzono, że liczba kopii sekwencji pol MSRV u chorych na SM była znacząco większa (od 1 do > 50 w jądrze
interfazowym) w porównaniu z osobami zdrowymi (od 1 do 20 w jądrze interfazowym).
Ponadto, u osób z SM sekwencje pol MSRV występowały na większej liczbie włókien chromatynowych w postaci
27
Genetyka człowieka
tandemowych powtórzeń, przy czym liczba powtórzeń była wyższa dwu-, a nawet trzykrotnie w porównaniu z osobami
zdrowymi.
Uzyskane wyniki bardzo mocno sugerują udział sekwencji pol MSRV w patogenezie stwardnienia rozsianego.
P19.
Dwie nowe mutacje (Ile 214 Met, Tyr 57 Cys) w genie NEFL u trzech chorych
z fenotypem choroby Charcot-Marie-Tooth typu 2E (CMT2E).
Dagmara Kabzińska (1), H. Drac (1,2), A. Łusakowska (2), B. Ryniewicz (2), A. Kochański (1)
(1) Zespół Badawczo-Leczniczy Chorób Nerwowo-Mięśniowych Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej
im. M. Mossakowskiego PAN
(2) Katedra i Klinika Neurologii Akademii Medycznej w Warszawie
Wstęp: Gen NEFL koduje białko neurofilamentów o małej masie cząsteczkowej (Neurofilament light chain polypeptide).
Mutacje w genie NEFL występują u chorych z fenotypem Charcot-Marie-Tooth typu 2E (CMT 2E), oraz CharcotMarie-Tooth typu 1F (CMT1F). Do tej pory poznano 12 mutacji w genie NEFL.
Cel pracy: Identyfikacja mutacji w genie NEFL w grupie 52 chorych z fenotypem CMT1 i CMT2
Materiał i Metody: Badano sekwencje genu NEFL u 52 chorych z fenotypami CMT1 i CMT2. Mutacji w genie NEFL
poszukiwano metodami: polimorfizmu fragmentów jednoniciowych (SSCP) oraz heterodupleksów (HD). Produkty
PCR o odmiennym względem dzikiego wzorcu migracji, sekwencjonowano.
Wyniki: Znaleziono dwie nowe mutacje w genie NEFL: Ile 214 Met u dwóch nie-spokrewnionych chorych. Druga
mutacja tj. Tyr 57 Cys została stwierdzonau jednego chorego.
P20.
CMT caused by EGR2 mutations: a natural history study of 10 patients.
Wojciech Wiszniewski, Kinga Szigeti, Gulam Mustafa Saifi and James R. Lupski
Department of Human and Molecular Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA
We have ascertained 10 consecutive patients with various EGR2 mutations and collected follow-up information
regarding disease progression. The mean follow-up was 17.5+/-10 years. Three patients were from an AD, 3 from an
AR family and in 4 patients CMT was caused by de novo mutations. Interestingly even the same mutations caused
different phenotypes. Respiratory compromise in the form of documented restrictive pulmonary disease was present in
3/7 (43 %) of the patients, in one case it resulted in respiratory failure and death at 6 years of age. Cranial nerve findings
were present in 60 %, and involved facial nerve, cranial nerve III, IX and XII. The progression of the disease was rapid,
moderate or mild, depending upon the various mutations. Interestingly the toxic gain of function mutations resulted
in moderate to severe progression, while the homozygous loss of function mutation in the recessive family with three
affected children had minimal if any progression of the neuropathy.
We have performed in vitro functional studies, including transcription activity, DNA binding and function
in apoptosis in transient transfection experiments utilizing constructs generated by in vitro mutagenesis.
We correlated the in vitro data with severity of diseases as measured by age of onset and rate of progression.
We did not find a correlation between mutations and outcome, thus it is extremely difficult to prognosticate
patients with EGR2 mutations. However our study confirmed that respiratory compromise and cranial nerve
dysfunction are commonly associated with EGR2 mutations and can be useful in guiding molecular diagnosis.
P21.
Encefalomiopatia mitochondrialna u 13-letniego chłopca.
Jacek Pilch (1), Katarzyna Wojaczyńska-Stanek (1), Elżbieta Marszał (1), Maciej Kajor (2), Ewa Pronicka (3),
Elżbieta Karczmarewicz (4)
(1) Klinika Pediatrii i Neurologii Wieku Rozwojowego ŚAM Katowice
(2) Katedra Patomorfologii ŚAM Katowice
(3) Klinika Chorób Metabolicznych Szpital Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka, Warszawa
(4) Zakład Biochemii Klinicznej Szpital Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka, Warszawa
Zaburzenia oksydatywnej fosforylacji uwarunkowane mutacjami mitochondrialnego DNA prowadzą do grupy chorób
określanych jako miopatie i encefalomiopatie mitochondrialne. Zależność genotypowo-fenotypowa nadal pozostaje
niewyjaśniona. Autorzy przedstawiają 13-letniego chłopca z występującymi od 9 roku życia epizodami wymiotów,
postępującym osłabieniem siły mięśniowej oraz złą tolerancją wysiłku. Obraz kliniczny – kwasica mleczanowa,
28
Genetyka człowieka
zwyrodnienie barwnikowe siatkówki oraz cechy ataksji – najbardziej przypominał zespół Kearns-Sayre’a. Nie
występowały natomiast główne objawy, jakimi są postępująca oftalmoplegia i zaburzenia przewodnictwa w obrębie
mięśnia sercowego. W obrazie MR głowy uwidoczniono zmiany o podwyższonym sygnale w jądrach podkorowych,
płatach czołowych i półkulach móżdżku. Zapis EMG oraz przewodnictwo nerwowo-mięśniowe prawidłowe.
W badaniach: histopatologicznym, histoenzymatycznym oraz ultrastrukturalnym mięśnia czworogłowego uda
uwidoczniono włókna poszarpane, nieprawidłowe mitochondria oraz brak aktywności COX. Stwierdzono również
zaburzenia aktywności enzymów łańcucha oddechowego: obniżenie aktywności kompleksu I, III i IV oraz znamienny
wzrost aktywności syntazy cytrynianowej. Przebieg choroby był niekorzystny. Chłopiec zmarł wśród objawów
niewydolności wielonarządowej. W toku pozostają badania molekularne.
P22.
Mutacja genu PLP1 w rodzinnej postaci choroby Pelizaeusa-Merzbachera
o zróżnicowanym obrazie klinicznym.
Elżbieta Marszał (1), Jacek Pilch (1), Ewa Jamroz (1), Isabelle Creveaux (2), Odile Boespflug-Tanguy (2)
(1) Klinika Pediatrii i Neurologii Wieku Rozwojowego ŚAM Katowice, Polska
(2) Inserm U384 and Fédération, de Génétique Humaine Auvergne, CHU Clermont-Ferrand, France
Gen PLP1 zlokalizowany jest na długim ramieniu chromosomu X (Xq22). Jego mutacje prowadzą do powstania
choroby Pelizaeusa-Merzbachera oraz sprzężonej z chromosomem X spastycznej paraplegii. Produktami genu są dwa
białka powstające na drodze alternatywnego składania: PLP1 oraz DM20. Są one głównymi białkami strukturalnymi
mieliny ośrodkowego układu nerwowego. Gen ulega ekspresji już we wczesnym okresie rozwoju zarodkowego
i prawdopodobnie pełni w tym okresie funkcje regulatorowe. Spektrum objawów klinicznych jest ciągłe i przyjmuje
obraz od najcięższej postaci wrodzonej po łagodne porażenie kurczowe. Autorzy prezentuja rodzinę, w której chorobą
dotkniętych jest pięć osób: troje chłopców z objawami postępującej encefalopatii oraz dwie osoby płci żeńskiej
z objawami porażenia kurczowego. Przedstawiono stan neurologiczny oraz neuroobrazowanie. W przeprowadzonych
badaniach molekularnych stwierdzono obecność mutacji typu „nonsens” w 5 eksonie genu PLP1 powodującej skrócenie
białek PLP/DM20 w pozycji cysteiny 227. Określono w rodzinie nosicielstwo mutacji.
P23.
Zespół Millera-Diekera u 2,5-letniego chłopca.
Jacek Pilch (1), Katarzyna Wojaczyńska-Stanek (1), Ilona Kopyta (1), Elżbieta Marszał (1), Anna Rokicka (2)
(1) Klinika Pediatrii i Neurologii Wieku Rozwojowego ŚAM Katowice
(2) Katedra i Zakład Biologii Ogólnej i Genetyki ŚAM Katowice
Zespół Millera-Diekera jest rzadkim zespołem przyległych genów. Przyczyną jest mikrodelecja okołoterminalna
krótkiego ramienia chromosomu 17 (17p13,3). Wśród różnorodnych objawów klinicznych (opóźnienie rozwoju, cechy
dysmorfii, wady narządów wewnętrznych) najbardziej stałym są wady z grupy zaburzeń migracji neuronalnej. Najczęściej
jest nią gładkomózgowie (lizencefalia). Autorzy przedstawiają 2,5-letniego chłopca z nieobciążonym wywiadem
ciążowo-porodowym i rodzinnym, u którego od 5 miesiąca życia występują polimorficzne napady padaczkowe. Rozwój
psychoruchowy znacznie opóźniony. W badaniu fizykalnym obecne dyskretne cechy dysmorfii twarzy, niedobór masy
a w badaniu neurologicznym hipotonia mięśniowa oraz ruchy mimowolne kończyn górnych. MR głowy wykazało
wadę rozwojową OUN pod postacią pachygyrii z zespołem okołosylwialnym. Badanie cytogenetyczne nie wykazało
nieprawidłowości, natomiast hybrydyzacja in situ po zastosowaniu sondy molekularnej dla regionu krytycznego MDS,
wykazała na krótkim ramieniu jednego z chromosomów pary 17 brak sygnału, co potwierdza obecność mikrodelecji.
29
Genetyka człowieka
P24.
Genisteina i jej pochodne potencjalnymi inhibitorami syntezy
glikozoaminoglikanów w leczeniu chorób lizosomalnych.
Ewa Piotrowska (1), Joanna Jakóbkiewicz-Banecka (2), Grzegorz Grynkiewicz (3), Ewa Skorupa (4),
Alicja Węgrzyn (5), Anna Tylki-Szymańska (4), Grzegorz Węgrzyn (1)
(1) Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, Gdańsk
(2) Instytut Oceanologii, Polska Akademia Nauk, Sopot
(3) Instytut Farmaceutyczny, Warszawa
(4) Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa
(5) Instytut Biochemii i Biofizyki, Polska Akademia Nauk, Gdańsk�
Mukopolisacharydozy (MPS) i mukolipidozy (ML) to choroby lizosomalne, których bezpośrednią przyczyną jest
brak lub obniżona aktywność enzymów zaangażowanych w rozkład glikozaminoglikanów (GAGs), prowadzące do
akumulacji tych związków w lizosomach, co powoduje postępującą utratę funkcji tkanek i narządów. W zależności
od brakującego enzymu wyróżnia się różne typy MPS i ML, przy czym skuteczne leczenie, w postaci enzymatycznej
terapii zastępczej (ERT), obecnie możliwe jest jedynie dla MPS I (dla MPS II i MPS VI trwają próby kliniczne).
ERT, bardzo skuteczna w leczeniu większości tkanek i narządów, z powodu istniejącej bariery krwio-mózgowej ma
znacznie obniżone działanie przy zmianach chorobowych dotykających ośrodkowy układ nerwowy (CNS). Częściowe
przyhamowanie syntezy GAGs mogłoby być alternatywną formą leczenia MPS i ML. Wydaje się, że metoda ta powinna
być szczególnie wydajna u pacjentów ze szczątkową aktywnością enzymu. Co więcej, jeśli potencjalny inhibitor syntezy
GAGs jest małą cząsteczką, powinien pokonywać barierę krwio-mózgową. Obecnie bada się analogi cukrów wcielanych
w czasie syntezy GAGs. Zakłada się, że analogi takie powinny osłabić aktywność specyficznych enzymów jako inhibitory
kompetytywne. Innym podejściem może być zatrzymanie ekspresji genów kodujących enzymy uczestniczące w syntezie
GAGs. Ekspresja przynajmniej kilku takich genów jest kontrolowana przez szlaki zależne od białka receptorowego
estrogenu i kinazy tyrozynowej (PKT). Wykazano, że genisteina, izoflawon sojowy przypominający strukturą estrogen,
hamuje aktywność PTK. Zbadaliśmy wpływ genisteiny oraz wybranych jej pochodnych na syntezę GAGs w kulturach
fibroblastów znakowanych rodioaktywnym siarczanem. Okazuje się, ze genisteina hamuje syntezę GAGs w hodowlach
komórkowych. Warto zatem kontynuować badania nad tym izoflawonem w kontekście rozwoju terapii chorób
lizosomalnych.
P25.
Badania molekularne genu MECP2 u pacjentów z objawami zespołu Retta
Zofia Helszer, Płowaś Iwona, Borkowska Edyta, Filipowska Anita, Lach Joanna, Kałużewski Bogdan
Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Zespół Retta jest chorobą neurogenetyczną, postępującą, cechującą się ciężkimi objawami klinicznymi. Rozpoznanie jest
stawiane na podstawie kryteriów klinicznych, typowych dla zespołu. W 70-80 % przypadków stwierdzono występowanie
mutacji w genie MECP2 zlokalizowanym w regionie Xq28, które mogą być odpowiedzialne za występowanie choroby.
U dwóch pacjentek z typowymi klinicznymi cechami zespołu Retta przeprowadzono badania molekularne. Za pomocą
metody PCR, w oparciu o specyficzne startery, amplifikowano trzy eksony genu MECP2. Do wykrywania mutacji
zastosowano metodę MSSCP (Multitemperature Single Strand Conformation Polymorphism). Przeprowadzona analiza
nie wykazała zmian mobilności poszczególnych produktów genu w obydwu badanych przypadkach. .Powstaje ważne
z klinicznego punktu widzenia pytanie, czy negatywny wynik badania genu MECP2 wskazuje na konieczność dalszej
poszerzonej diagnostyki molekularnej, czy też powszechnie przyjęte kryteria kliniczne są wystarczające dla postawienia
ostatecznej diagnozy.
30
Genetyka człowieka
Genetyka Kliniczna
Komunikaty ustne:
W10.
Mutacje genów LDLR i APOB u 103 pacjentów z hipercholesterolemią rodzinną.
M. Chmara (1), J. Kubalska (4), H. Mierzewska (2), A. Wierzbicka (3), E. Pronicka (2), J. Limon (1)
(1) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki, Akademia Medyczna w Gdańsku,
(2) Klinika Chorób Metabolicznych
(3) Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa
(4) Zakład Genetyki, Instytut Psychiatrii i Neurologii, Warszawa
Hipercholesterolemia rodzinna (FH) i rodzinny defekt apolipoproteiny B-100 (FDB) to choroby jednogenowe
o autosomalnym dominującym sposobie dziedziczenia. Częstość występowania heterozygot w obu jednostkach
klinicznych w populacji europejskiej wynosi od 1:500 do 1:700 żywych urodzeń.
Na podstawie kryteriów klinicznych FH (WHO) została wyłoniona grupa 103 probantów. Od pacjentów, będących pod
opieką Kliniki Chorób Metabolicznych, Instytutu „Pomnika – Centrum Zdrowia Dziecka” w Warszawie, została pobrana
krew a następnie wyizolowany DNA do badań molekularnych. Do analizy genów LDLR i APOB zastosowano technikę
amplifikacji PCR, a następnie bezpośrednie sekwencjonowanie przy użyciu sekwenatora automatycznego ABI 310.
W genie LDLR przebadane zostały wszystkie jego eksony wraz z przylegającymi fragmentami intronów oraz sekwencją
promotorową. W przypadku genu APOB analizowano fragment eksonu 26, w którym jak dotąd znajdują się wszystkie
poznane mutacje APOB prowadzące do FDB.
Wśród 103 pacjentów wykryto różne mutacje w genie LDLR w 53 (51%), natomiast w genie APOB wykryto wyłącznie
mutację R3500Q w 10 przypadkach. Najczęstszą mutacją w genie LDLR była mutacja punktowa G571E w eksonie
12, która została wykryta u 14 probantów (13.6%). Większość znalezionych mutacji została już opisana w literaturze,
natomiast 11 spośród nich wykryto po raz pierwszy (E10K, D36N, E119D, C176W, W422R, S426P, V485M, A699G,
ekson 15: 2298 del AC, intron 9: 1359-3 del C, intron 12: 1846-2 A>C).
Diagnostyka mutacji w genach LDLR i APOB umożliwia objęcie rodzin z FH i FDB poradnictwem genetycznym oraz
wczesną profilaktyką co w wysokim stopniu może je uchronić przed klinicznymi konsekwencjami hipercholesterolemii
rodzinnej.
W11.
The emerging clinical phenotype of the dup(17)(p11.2p11.2) syndrome:
the homologous recombination reciprocal of the Smith-Magenis microdeletion
Lorraine Potocki (1, 5, 6), Diane Treadwell-Deering (2, 4, 5, 6), Kevin Krull (2, 4, 5,6 ) , Daniel Glaze (3, 4, 5, 6),
C. J. Shaw (1, 5), M. Horz (1, 5, 6), P. Stankiewicz (1, 5), James R. Lupski (1, 4, 5 ,6)
(1) Department of Molecular and Human Genetics
(2) Department of Psychiatry and Behavioral Sciences
(3) Department of Neurology
(4) Department of Pediatrics
(5) Baylor College of Medicine
(6) Texas Children’s Hospital, Houston
Nonallelic homologous recombination within region-specific low-copy repeats is known to give rise to DNA
rearrangements associated with many genetic disorders. Smith-Magenis syndrome (SMS) is a multiple congenital
anomalies syndrome due to a heterozygous deletion within 17p11.2. We previously described 7 persons with
dup(17)(p11.2p11.2) which is the homologous recombination reciprocal of the SMS deletion, and commented on the
relatively mild phenotype as compared to individuals with del(17)(p11.2p11.2). Herein we present the molecular and
clinical data on 8 patients with dup(17)(p11.2p11.2) who were evaluated through a multidisciplinary clinical protocol.
Each patient harbors a de novo duplication of 17p11.2 of the same size as determined by pulsed-field gel electrophoresis
31
Genetyka człowieka
and/or FISH. Clinical features include dysmorphic craniofacial features, hypotonia and failure to thrive, oropharyngeal
dysphasia, neurocognitive impairment, and behavioral problems including autistic, aggressive and self-injurious
behavior. Structural cardiac anomalies and aortic root enlargement have also been identified. Sleep disturbances are
seen in all patients yet the findings are distinct from those of deletion 17p11.2. There is marked variability in the physical
features and behavioral profile between patients with dup(17)(p11.2p11.2). This variability cannot be attributed to
duplication size, and does not seem to be associated with parent-of-origin effect. It is predicted that the incidence of
dup(17)(p11.2p11.2) is equal to that of SMS; however as this duplication is difficult to detect by routine cytogenetic
analysis, many of these patients are not ascertained. Systematic clinical evaluation of several more patients will be
necessary to determine the features most characteristic of this microduplication syndrome.
W12.
Clinical molecular analysis of PTPN11 gene mutations in patients with Noonan
syndrome.
Joanna Wiszniewska, A. James, J. Lescher, K. Hoon, and B. B. Roa
Baylor Medical Genetics Laboratories, Department of Human and Molecular Genetics, Baylor College of Medicine, Houston,
Texas, USA
Noonan syndrome (NS) is a genetically heterogeneous disorder inherited in an autosomal dominant manner. The
prevalence of this disease is estimated at approximately 1 in 1,000 – 2,500. Facial dysmorphia, growth retardation,
skeletal malformations and congenital heart disease are the most common features associated with Noonan syndrome.
Mutations in the PTPN11 gene encoding the non-receptor protein tyrosine phosphatase SHP-2, were identified to cause
NS in approximately 50% of both familial and sporadic cases.
We studied a cohort of 80 patients referred for Noonan syndrome molecular testing. This included 5 patients with
a definite diagnosis (full NS phenotype), and 75 with a possible diagnosis (partial NS phenotype). Analysis of 15 coding
exons and exon/intron boundaries of the PTPN11 gene was performed by PCR amplification and bi-directional DNA
sequencing.
Mutations of PTPN11 gene were found in 1 patient with a definite diagnosis and in 19 patients with a possible diagnosis
of NS. Sixteen different mutation alleles were identified, including one novel mutation. The majority (70%) of mutations
were found in exons 3 and 13.
The study confirms the phenotypic variation among patients with mutations in the PTPN11 gene, and demonstrates the
value of PTPN11 mutation analysis in patients for whom a diagnosis of Noonan syndrome is being considered.
W13.
10 lat doświadczeń w diagnostyce molekularnej zespołu Pradera-Williego.
A. Szpecht-Potocka (1), E. Obersztyn (1), J. Bal (1), E. Bocian(1), E. Kostyk (2), A. Kruczek (2), M. Lassota (3),
A. Midro (4), B. Dawydzik (5), I. Jałowiec (6), A. Latos-Bieleńska (7), J. Pilch (8), R. Glazar (9), C. Cybulski (10),
T Mazurczak (1)
(1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Warszawa
(2) Zakład Genetyki Medycznej, Collegium Medicum UJ, Kraków;
(3) ZOZ Przychodnia Specjalistyczna Nr 1, Rzeszów;
(4) Zakład Genetyki Klinicznej, Białystok;
(5) Pediatryczna Poradnia Zaburzeń Metabolicznych, Instytut Zdrowia Matki Polki, Łódź;
(6) Wojewódzki Specjalistyczny Szpital Dziecięcy, Kielce;
(7) Katedra i Zakład Genetyki Medycznej AM, Poznań;
(8) Szpital Kliniczny nr 6 ŚAM, Katowice;
(9) PG Centrum Genetyki Medycznej, Poznań;
(10) Zakład Genetyki i Patomorfologii PAM, Szczecin
The Prader-Willi Syndrome (PWS) is a genetic and neurologic behavioral disorder linked to abnormalities in imprinted
domain on chromosome 15q11-q13, characterized inter alia by hypotonia, hyperphagia in early childhood resulting
in obesity, hypogonadism, short stature and moderate mental retardation. All of genetic abnormalities in PWS are
associated with loss of expression of paternally derived alleles. Using karyotyping, FISH and methylation analysis we
have examined 292 patients, diagnosed in different medical centers in Poland, susspected to be PWS and we confirmed
PWS diagnosis in 102 cases (35%). We identified 51 cases of paternal deletion (50%), 16 patients with mUPD (16%)
and 3 patients with imprinting defect (3%). In 5 cases we could not detect molecular defect because of noninformative
microsatellite analysis. All of PWS patients have classical phenotype for deletion, mUPD and ID what we present in
32
Genetyka człowieka
details. Four of patients of our 292 cohort have shown PWS-like phenotype but we did not find any abnormalities on
chromosome 15. Because of PWS is a multigenic disorder it is possible that gene mutation may occur in these patients.
We also conclude that there is significant difference between correct clinical diagnosis of PWS in specialty treatment
centers then in others. In specialty treatment Polish medical centers the propotion of confirming PWS and sharing of
particular molecular defects are consistent with those observed in tested cohort in other caucasian population.
W14.
Position effects due to chromosome breakpoints mapping ~ 1 Mb upstream and ~
1.3 Mb downstream of SOX9 in two cases with campomelic dysplasia.
Paweł Stankiewicz (1), Gabriel Bien-Willner (1), James R. Lupski (1, 2 ,3), Jill K. Northup (4),
Lillian H. Lockhart (5), Syed M. Jalal (6), Gopalrao V. N. Velagaleti (4, 5)
(1) Department of Molecular & Human Genetics Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA
(2) Pediatrics, Baylor College of Medicine, Houston, TX
(3) Texas Children Hospital, Houston, TX,
(4) Depts of Pathology
(5) Pediatrics, University of Texas Medical Branch, Galveston, TX
(6) Department of Pathology, Mayo Clinic, Rochester, MN.
Campomelic dysplasia (CD) is a semilethal skeletal malformation syndrome with or without XY sex reversal. In
addition to multiple mutations within the SOX9 gene on 17q24.3, several chromosome translocations and inversions
with breakpoints scattered over 1 Mb upstream to SOX9 leading to haploinsufficiency have been described (Pfeifer
et al. 1999). Here, we present an apparently balanced translocation t(4;17)(q28.3;q24.3), segregating in a family with
a mild acampomelic CD and Robin sequence. Both breakpoints have been identified by FISH within single BAC clones.
The 17q breakpoint maps ~ 1 Mb upstream of SOX9, within the same BAC clone as in the previously reported case.
A somatic cell hybrid has been generated in our case and the breakpoint is being currently sequenced. DNA sequence
analysis revealed a region conserved in human, chimpanzee, and mouse and candidate transcripts have been identified.
Interestingly, Jamshidi et al. (2004) reported an isolated Robin sequence in a family segregating with a balanced
translocation t(2;17)(q24.1;q24.3). The 17q breakpoint in this family maps very close to our breakpoint. We also report
a prenatal identification of acampomelic CD with a male to female sex reversal in a fetus with a de novo apparently
balanced complex karyotype 46,XY,t(4;7;8;17)(4qter->4p15.2::17q25->17qter;7qter->7p15::4p15.2->4pter;8pter>8q12.2::7p21.2->7pter;17pter->17q25::8q12.2->8qter). All breakpoints have been mapped within single BAC clones.
Surprisingly, the 17q breakpoint maps ~1.3 Mb downstream of SOX9. This is the first report of CD with the chromosome
breakpoint mapping distal to SOX9. We discuss the possible molecular mechanisms responsible for the position effect.
W15.
Nieprawidłowy obraz USG płodu wskazaniem do inwazyjnej diagnostyki
prenatalnej.
A. Ilnicka (1), B. Pawłowska (1), J. Bogdanowicz (1), A. Tomankiewicz-Zawadzka (1), J. Czyżewska (1),
W. Szirkowiec (1), E. Zdzienicka (1), J. Kubalska (1), T. Roszkowski (2), J. Garwoliński (2), R. Dębski (2),
R. Szczecina (3), T. Lipiński (3), J. Zaremba (1)
(1) Zakład Genetyki Instytutu Psychiatrii i Neurologii, Warszawa
(2) Klinika Położnictwa i Ginekologii CMKP, Warszawa
(3) Klinika Ginekologii i Położnictwa AM, Warszawa
W latach 1999–2003 w Zakładzie Genetyki IPiN przeprowadzono 4032 cytogenetyczne badania prenatalne. Z roku
na rok wzrasta liczba pacjentek, u których wykonuje się diagnostykę z powodu stwierdzenia wad płodu w badaniu
ultrasonograficznym (USG). W roku 1999 wskazanie to stanowiło 10%, a ostatnio 18% wykonywanych badań. Wśród
575 pacjentek z powyższej grupy wskazań nieprawidłowy wynik badania cytogenetycznego (głównie aneuploidie)
stwierdzono w 114 przypadkach (20%). Stanowi to aż 28% nieprawidłowych kariotypów wykrytych łącznie we wszystkich
grupach wskazań.
W analizowanej grupie stwierdzono 30 przypadków trisomii chromosomu 18 (zespół Edwardsa); w badaniu
ultrosonagraficznym u prawie wszystkich płodów z tą aberracją stwierdzono wadę serca, u 17 wentrikulomegalię,
a u 5 przepuklinę pępowinową.
Wśród 27 płodów z zespołem Downa u 12 w obrazie USG obserwowano zwiększony wymiar przezierności karku (NT),
u 9 wadę serca, u 14 skrócenie kości udowych.
33
Genetyka człowieka
We wszystkich (24) przypadkach płodów dotkniętych zespołem Turnera badanie ultrasonograficzne ujawniło wodniak
karku (często policystyczny), a u 14 płodów dodatkowo występował obrzęk tkanki podskórnej.
W 7 przypadkach zespołu Patau’a w obrazie USG najczęściej stwierdzano u płodów holoprozencefalię i wadę serca – po
4 przypadki.
U wszystkich 9 płodów z triploidią ultrasonograficznie obserwowano asymetryczną hipotrofię; u niektórych stwierdzono
ponadto wadę serca i/lub hiperechogenne jelito. W czterech przypadkach triploidii towarzyszyło małowodzie.
U 11 płodów stwierdzono aberracje strukturalne niezrównoważone – w tym 9 de novo.
Komunikaty plakatowe:
P26.
Niepełnosprawność intelektualna w wyniku submikroskopowej delecji
towarzyszącej złożonej translokacji t(3;12) – mapowanie punktów złamań metodą
FISH z klonami bakteryjnymi.
K. Borg (1), E. Bocian (1), P. Stankiewicz (3), A. Kruczek (2), E. Obersztyn (1), T. Mazurczak (1), J. Lupski (3)
(1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Warszawa
(2) Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński, Kraków;
(3) Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, USA.
Nieprawidłowy fenotyp w przypadkach zrównoważonych aberracji strukturalnych chromosomów stwierdzany jest w ok.
6% przypadków. Aberracje takie mogą bowiem w różny sposób uszkadzać i inaktywować geny znajdujące się w miejscach
złamań. Opublikowane ostatnio wyniki analizy miejsc złamań w przypadkach zrównoważonych cytogenetycznie
aberracji stwierdzonych u osób z nieprawidłowym fenotypem wykazały, że w ~10% takich przypadków obecna jest
submikroskopowa delecja. Przedstawiono przypadek złożonej translokacji chromosomowej powstałej de novo t(3;12)
u osoby z cechami upośledzenia umysłowego. Dokonano analizy molekularnej miejsc złamań z zastosowaniem
specyficznych, wyznakowanych fluorescencyjnie, sond molekularnych izolowanych z klonów bakteryjnych (BAC).
Stwierdzono bardziej złożony charakter rearanżacji aniżeli w pierwotnej analizie metodą klasyczną. Wykazano, że
w wyniku 6 złamań nastąpiła wzajemna translokacja terminalnych fragmentów 3p24.1 –>pter i 12q23.1->qter oraz
insercja w pozycji 3q26.31 trzech fragmentów pochodzących z chromosomu 3p i 12q. Translokację określono jako:
t(3;12)(3qter→3q26.31::12q23.1→12q22::3p22.3→3p24.1::12q22→12q14.1::3q26.31→3p22.3::12q23.1→ 12qter;12pter→
12q14.1::3p24.1→3pter). Wykazano także obecność niewidocznej w analizie prążkowej chromosomów mikrodelecji
w regionie 3q26.31. Jej wielkość oceniono na ~ 0,5 Mpz. Stwierdzono, że w wyniku translokacji jeden ze zmapowanych
ostatnio w 3p25 genów (MEGAP) odpowiedzialnych za upośledzenie umysłowe został przeniesiony na chromosom 12q.
Nie można więc wykluczyć wpływu tzw. efektu pozycji tego genu na nieprawidłowy fenotyp probanda. Analiza metodą
FISH wykazała również obecność u pacjentki drugiej, zrównoważonej translokacji wzajemnej, t(11;21)(p14.1q;22.11).
Nie stwierdzono ubytku materiału genetycznego w punktach złamań tej translokacji. Wyniki przeprowadzonych
badań uzasadniają konieczność wykonywania analizy molekularnej w przypadkach cytogenetycznie zrównoważonych
translokacji powstałych de novo, którym towarzyszy nieprawidłowy fenotyp.
Praca realizowana w ramach Projektu Badawczego Zamawianego Nr PBZ-KBN-042/P05/2001.
P27.
Rodzinna aneusomia regionów subtelomerowych chromosomu 5 jako skutek
inwersji inv(5)(p15.33q35.3) i przyczyna upośledzenia umysłowego.
K. Suchenek, E. Bocian, E. Obersztyn, B. Nowakowska, A. Kutkowska-Kaźmierczak, T. Mazurczak
Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Warszawa
Szacuje się, że submikroskopowe aberracje regionów subtelomerowych chromosomów odpowiedzialne są za około
5 % przypadków upośledzenia umysłowego (UU) o nieznanej etiologii. Wśród 148 opisanych dotychczas aberracji
subtelomerowych stwierdzono zaledwie trzy przypadki aneusomii powstałych w wyniku rekombinacji w obrębie
rodzicielskiej inwersji. Przedstawiamy pierwszy przypadek rodzinnej inwersji chromosomu 5 z punktami złamań
w regionach subtelomerowych obu ramion tego chromosomu. U probanda, sześcioletniej dziewczynki z cechami
lekkiego upośledzenia psychoruchowego i prawidłowym kariotypem dzięki zastosowaniu techniki FISH z zestawem
sond subtelomerowych (Chromoprobe Multiprobe – T System) wykazano trisomię regionu subtelomerowego 5q. Dalsze
badania w rodzinie probanda wykazały, że nieprawidłowy chromosom 5 pary u dziecka jest pochodną rekombinacji
dużej inwersji pericentrycznej inv(5)(p15.3q35.3) obecnej u ojca dziecka. Inwersję stwierdzono także u jego brata
34
Genetyka człowieka
bliźniaka a częściową trisomię 5q u jego dwóch córek wykazujących cechy upośledzenia umysłowego. Zastosowanie
licznych sond specyficznych dla obszarów subtelomerowych krótkiego i długiego ramienia chromosomu 5, pozyskanych
z klonów bakteryjnych umożliwiło precyzyjne określenie punktów złamań w obu regionach subtelomerowych oraz
wykazanie, że częściowej trisomii regionu subtelomerowego 5q towarzyszy delecja zlokalizowana powyżej subtelomeru
5p. Aberrację stwierdzoną u dzieci określono jako rec(5)dup(5)(q35.3)inv(5)(p15.33q35.3)pat. Wielkość duplikacji 5q
oszacowano na ~ 4,6 Mpz a delecji 5p na <1 Mpz. Weryfikacja kariotypu dzieci metodą HR-CGH potwierdziła obecność
dup(5q) nie wykazała natomiast obecności towarzyszącej jej del(5p). Obecność zrekombinowanego chromosomu 5 pary
u trojga dzieci w rodzinie potwierdza fakt, że w przypadkach dużych inwersji pericentrycznych ryzyko powstania
aneusomii u potomstwa jest też duże. Przedstawiony przypadek wskazuje na przydatność i zasadność stosowania
w celach diagnostycznych innych sond subtelomerowych niż te, które zawarte są w zestawie komercyjnym.
Praca realizowana w ramach projektu badawczego zamawianego Nr PBZ-KBN-042/P05/2001.
P28.
Analiza abberacji chromosomowych u pacjentów z wadami wrodzonymi w materiale
Zakładu Genetyki Akademii Medycznej we Wrocławiu.
R. Ślęzak (1), A. Stembalska (1), H. Busza (1), H. Czemarmazowicz (1), J. Kozłowska (1), R. Plewa (1),
I. Łaczmańska (1), K. Bartusiak (1), R. Śmigiel (2), M. Sąsiadek (1)
(1) Zakład Genetyki Akademii Medycznej we Wrocławiu, Kierownik: Prof. dr hab. Maria Sąsiadek
(2) Zakład Patofizjologii Akademii Medycznej we Wrocławiu. Kierownik Prof. dr hab. Józef Jagielski�
Wrodzone wady rozwojowe obejmują powstałe w okresie życia płodowego zaburzenia prawidłowego rozwoju,
morfogenezy narządu lub histogenezy tkanek. Przyczyny wad wrodzonych są różnorodne etiologicznie. Warunkują
je czynniki genetyczne i środowiskowe pochodzenia endogennego i egzogennego. Około 35% wrodzonych wad
rozwojowych o znanej etiologii uwarunkowanych jest monogenowo i chromosomowo.
Celem pracy była analiza aberracji chromosomów u pacjentów z wadami wrodzonymi, cechami dysmorficznymi
oraz upośledzeniem umysłowym.
W latach 2000–2003 w Zakładzie Genetyki Akademii Medycznej we Wrocławiu wykonano 1363 badań genetycznych
u pacjentów z wadami wrodzonymi i członków ich rodzin. Chromosomy do badań uzyskiwano z limfocytów krwi
obwodowej oraz fibroblastów skóry. Chromosomy barwiono technikami prążkowymi GTG, CBG i NOR. W diagnostyce
dodatkowej zastosowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z użyciem sond malujących, centromerowych,
punktowych oraz zestawów sond telomerowych. W części przypadków stosowano technikę PCR celem identyfikacji
sekwencji chromosomowej.
Nieprawidłowości kariotypu stwierdzono u 12 % badanych pacjentów. Najczęściej stwierdzano aberracje liczbowe,
które zdiagnozowano u 100 pacjentów (łącznie z przypadkami mozaicyzmu). U 56 pacjentów stwierdzono trisomię
chromosomu 21, u 7 chromosomu 18, u 2 chromosomu 13, a w jednym przypadku trisomię chromosomu 8. Aberracje
liczbowe chromosomów płciowych stwierdzono u 34 pacjentów, w tym monosomię chromosomu X u 19 osób, trisomię
chromosomu X u 3, zespół Klinefeltera u 8 pacjentów, dodatkowy chromosom Y u 3 pacjentów, w jednym przypadku
zidentyfikowano tetrasomię chromosomu X (49,XXXXY). Aberracje strukturalne stwierdzono u 39 pacjentów,
w tym u 14 pacjentów wykazano niezrównoważoną translokację interchromosomową. U 6 pacjentów stwierdzono
rzadko występujące aberracje strukturalne. U kolejnych 3 pacjentów stwierdzono niezidentyfikowany naddatek na
chromosomach 9, 14 i 15. Zespoły uwarunkowane mikrodelecją zdiagnozowane w badaniu FISH stwierdzono u 14
pacjentów (u 5 – zespół Prader-Willi, u 4 – zespół Angelmana, u kolejnych 4 zespół Williamsa, u jednego pacjenta
zespół DiGeorgea).
P29.
Mutacje genu TCOF1 jako główna przyczyna powstawania zespołu Treacher Collins.
Bożena Marszałek (1), Piotr Wójcicki (2), Kazimierz Kobus (2), Wiesław H. Trzeciak (1)
(1) Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej Akademii Medycznej, Poznań
(2) Szpital Chirurgii Plastycznej, Polanica Zdrój
U podłoża zaburzeń rozwoju twarzoczaszki leżą nieprawidłowości różnicowania I i II łuku gardłowego, powodujące
zespół Treacher Collins (TCS), zaliczany do twarzowo-żuchwowych wad kostnienia (mandibulofacial dysostosis,
MFD1). Zespół ten występujący w populacji ogólnej z częstością około 1/50000 żywych urodzeń, jest autosomalnie
dominującym zaburzeniem, spowodowanym mutacjami genu TCOF1, który koduje białko treacle, uczestniczące
w transporcie pomiędzy cytoplazmą a jąderkiem. Chorych charakteryzuje m. in. niedorozwój żuchwy i kości
jarzmowych, antymongoidalne ustawienie szpar powiekowych oraz niedorozwój małżowiny usznej. Około 70% znanych
35
Genetyka człowieka
mutacji TCOF1 stanowią delecje, prowadzące do powstania kodonu terminującego i skrócenia produktu białkowego.
Dotychczas opisano 106 mutacji TCOF1 odpowiedzialnych za TCS.
Celem projektu była próba ustalenia molekularnego podłoża zaburzeń rozwoju twarzoczaszki poprzez poszukiwanie
mutacji w TCOF1 u ok. 60 chorych z zespołem Treacher Collins oraz u 35 ich najbliższych krewnych.
Genomowy DNA z limfocytów krwi obwodowej amplifikowano za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
Produkty amplifikacji poddano analizie konformacji polimorfizmu pojedynczych nici DNA w gradiencie temperatury
(MSSCP), analizie sekwencyjnej oraz analizie restrykcyjnej, a także dokonano pomiaru temperatury topnienia
fragmentów zawierających delecje przy pomocy systemu LightCycler. Analiza sekwencyjna fragmentu zawierającego
ekson 7 TCOF1 u jednego chorego pozwoliła wykazać występowanie wcześniej opisanej mutacji c.786-787delAG,
która powoduje przesunięcie ramki odczytu i wytworzenie kodonu terminującego przy aa 270. Analiza sekwencyjna
eksonu 15 u innych chorych wykazała występowanie nowej c.2373-2374delAG, która powoduje wytworzenie kodonu
terminującego przy aa 794 oraz nowej tranzycji c.2344C>T, która powoduje zamianę Gln782Ter. Amplifikacja
fragmentów zawierających ekson 7 i 15, w których wykryto delecje, wykazała różnicę w temperaturze topnienia
fragmentów zawierających allele: prawidłowy i zmutowany z użyciem systemu LightCycler. Natomiast w eksonie 23
zidentyfikowano nową c.3880G>T transwersję powodującą zamianę Glu1294Ter. Ponadto w eksonie 16 został wykryty
polimorfizm: c. 2429T>C, powodujący zamianę Ala810Val oraz w intronie 15 c.2428-24delCTCTC. �
Wyniki tych badań pozwolą na wdrożenie strategii wykrywania mutacji oraz polimorfizmów TCOF1 u chorych
z zespołem Treacher Collins.
Badania finansowane z grantu KBN nr 2PO4A 037 26.
P30.
Wpływ mutacji w regionie przełącznikowym domeny NBD2 na proces dojrzewania
białka CFTR.
Michał Milewski (1), Krzysztof Dołowy (2), Garry Cutting (3)
(1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Warszawa
(2) Zakład Biofizyki, Wydział Technologii Drewna SGGW, Warszawa�
(3) Institute of Genetic Medicine, JHU, Baltimore, USA
Mutacje w genie CFTR są odpowiedzialne za mukowiscydozę – najczęstszą w Polsce nieuleczalną chorobę genetyczną
dziedziczoną w sposób autosomalny recesywny. Białko CFTR, tworzące kanał chlorkowy w błonie komórek
nabłonkowych, należy do rodziny białek ABC, charakteryzujących się obecnoÂścią domeny wiążącej nukleotydy
(NBD). Celem prezentowanego projektu jest zbadanie roli aminokwasów z regionu przełącznikowego domeny NBD2
w procesie dojrzewania białka CFTR i jego funkcjonowania jako kanału chlorkowego.
Po wprowadzenia odpowiednich zmian w wybranych pozycjach aminokwasowych białka przy pomocy mutagenezy
in vitro, analizowano ekspresję poszczególnych konstruktów stosując transfekcję komórek IB3-1, immunoprecypitację
białka CFTR i jego radioaktywne znakowanie przy użyciu [32P]dATP oraz kinazy białkowej A (PKA). Stopień
glikozylacji białka CFTR, odpowiadający poszczególnym etapom jego biosyntezy, oceniano na podstawie tempa
migracji białka w żelu poliakryloamidowym.
Usunięcie całego regionu przełącznikowego skutkowało znacznym zahamowaniem procesu dojrzewania CFTR,
co przejawiało się w produkowaniu białka o niepełnej glikozylacji, które nie docierało do błony cytoplazmatycznej
komórki. Z kolei wprowadzenie mutacji V1397E, jedynej naturalnie występującej mutacji w tym regionie CFTR, a także
podstawień alaninowych w najbardziej konserwowanych pozycji regionu przełącznikowego NBD2 (H1402A, R1403)
nie zaburzało procesu dojrzewania białka. Uzyskane wyniki sugerują, że choć region przełącznikowy jest zapewne
istotnym dla procesu fałdowania elementem strukturalnym domeny NBD, to pełni on także dodatkową ważną rolę,
związaną prawdopodobnie z funkcjonowaniem kanału chlorkowego. Kolejny etap badań obejmować więc będzie
analizę elektrofizjologiczną otrzymanych konstruktów.�
Badania prowadzano w ramach projektu badawczego KBN 3 P05A 069 23.
P31.
Inwersja pericentryczna chromosomu 10 a ryzyko genetyczne.
Z. Helszer, I. Płowaś, A. Barczyk, B. Kałużewski
Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, ul. Sterlinga 3, 91-425 Łódź
Częstość występowania inwersji pericentrycznych w populacji ludzkiej szacuje się na ok. 0,12–0,7 ‰. Inwersje
pericentryczne chromosomu 10 są stosunkowo częstą aberracją tego chromosomu. Potencjalne znaczenie
patogenetyczne, w tym wpływ na rozród człowieka, jest dyskutowane. Przebadano 9 rodzin z inwersją pericentryczną
36
Genetyka człowieka
chromosomu 10. Wśród 20 członków rodzin wykryto 14 przypadków tego typu aberracji chromosomowej, w tym
w badaniach prenatalnych 4 przypadki. Punkty złamań chromosomowych w badanych przypadkach miały różną
lokalizację. Podjęto próbę określenia korelacji pomiędzy wielkością regionu chromosomu zaangażowanego w inwersję
a skutkami fenotypowymi oraz oceny ryzyka wystąpienia objawów klinicznych u płodu.
P32.
Analiza kliniczno-rodowodowa przypadków rodzinnych i sporadycznych
zwyrodnienia barwnikowego siatkówki.
Maciej R. Krawczyński
Katedra i Zakład Genetyki Medycznej AM w Poznaniu
Zwyrodnienie barwnikowe siatkówki (RP) stanowi najczęstsze rozpoznanie wśród pacjentów Pracowni Poradnictwa
Genetycznego w Chorobach Narządu Wzroku. W okresie 4 lat, rozpoznanie takie postawiono u 117 pacjentów w 39
rodzinach (tj. 18,0% wszystkich przyjętych rodzin i 36,1% rodzin z dystrofiami siatkówki). �
W 20 rodzinach ujawniono przypadki sporadyczne choroby, zaś w 19 rodzinach choroba powtarzała się u większej
liczby chorych. Analiza rodowodowa pozwoliła na stwierdzenie: dziedziczenia sprzężonego z chromosomem X w 20,5%
rodzin, dziedziczenia autosomalnego dominującego w 17,9%, dziedziczenia autosomalnego recesywnego w 15,4% oraz
przypadków sporadycznych w 46,2% rodzin.
Dziedziczenie sprzężone z chromosomem X związane było z najwyższą powtarzalnością rodzinną (rodziny
wielopokoleniowe), najcięższym przebiegiem choroby (pierwsze objawy u chłopców przed 5 rokiem życia, a przed
40 rokiem życia całkowita lub niemal całkowita ślepota), częstym zjawiskiem częściowej dominacji i częstym
skojarzeniem RP z zespołem dyskinezji rzęsek.
Dziedziczenie autosomalne dominujące związane było z niższą powtarzalnością rodzinną i najłagodniejszym
przebiegiem. Pierwsze objawy występowały około 20 roku życia lub później, a bardzo długo utrzymywała się użyteczna
lub nawet pełna, centralna ostrość wzroku.
Dziedziczenie autosomalne recesywne związane było z pośrednią ciężkością choroby (pierwsze objawy u nastolatków)
i długim utrzymywaniem się użytecznej ostrości wzroku. W dwóch przypadkach sporadycznych rozpoznano zespół
Ushera. W pozostałych 18 przypadkach sporadycznych RP, dane kliniczne (wiek wystąpienia pierwszych objawów,
dynamika przebiegu choroby) pozwoliły sugerować możliwość dziedziczenia autosomalnego dominującego
w 7 przypadkach, autosomalnego recesywnego w 9 przypadkach i sprzężonego z X w 1 przypadku. Wobec olbrzymiej
heterogenności genetycznej RP i braku dostępnych badań molekularnych (ponad 40 genów), dane kliniczne stanowią
jedyną wskazówkę, pozwalająca na sugestie dotyczące rokowania i ryzyka genetycznego.
P33.
Mutacje genów LPL I APOC2 w hiperlipoproteinemii typu I
Magdalena Chmara (1), Kubalska J. (4), Wierzbicka A. (3), Brożek I.(1), Pronicka E.( 2), Limon J. (1)
(1) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki, Akademia Medyczna w Gdańsku
(2) Klinika Chorób Metabolicznych
(3) Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa
(4) Zakład Genetyki, Instytut Psychiatrii i Neurologii, Warszawa
Hiperlipoproteinemia typu I jest rzadko występującą chorobą jednogenową. Może być efektem zarówno niedoboru lipazy
lipoproteinowej (hiperlipoproteinemia IA) jak i apolipoproteiny C-II (hiperlipoproteinemia IB). Charakterystyczna
dla chorych z hiperlipoproteinemią jest chylomikronemia wywołana zaburzeniami lipolizy trójglicerydów z powodu
obniżonej aktywności lipazy lipoproteinowej (LPL). Obniżenie aktywności LPL może być spowodowane zmniejszoną
syntezą tego enzymu lub utratą jego aktywności. Ponadto, może wiązać się z zaburzonym działaniem apolipoproteiny
C-II (APOC2) – białka będącego aktywatorem lipazy lipoproteinowej.
Obecnie uważa się, że podwyższony poziom trójglicerydów w surowicy jest niezależnym czynnikiem ryzyka miażdżycy.
U osób z hiperlipoproteinemią typu I rozwój miażdżycy może prowadzić do choroby niedokrwiennej serca i/lub ostrego
zapalenia trzustki.
Do analizy genów LPL oraz APOC2 zastosowano technikę amplifikacji PCR, a następnie bezpośrednie sekwencjonowanie
przy użyciu sekwenatora automatycznego ABI 310. W celu wykrycia mutacji przebadane zostały sekwencje promotorowe
oraz wszystkie eksony tych genów, wraz z przylegającymi fragmentami intronów.
Badania zostały przeprowadzone w grupie 10 dzieci z rozpoznaniem klinicznym hiperlipoproteinemii typu I. Mutacje
genu LPL zostały wykryte w pięciu przypadkach. Jedna z tych mutacji (S244P, ekson 6) nie została jak dotąd opisana
w literaturze. Mutacji w genie APOC2 nie wykryto. Są to pierwsze badania molekularne rodzin z hiperlipoproteinemią
typu I w Polsce. Prowadzone są dalsze badania w celu wykrycia spektrum mutacji tych genów w populacji polskiej.
37
Genetyka człowieka
Epidemiologia genetyczna
Komunikaty ustne:
W16.
Zespół Smitha, Lemlego i Opitza: ustalenie częstości występowania
heterozygotycznego nosicielstwa dwóch najczęstszych mutacji – W151X i V326L.
Elżbieta Ciara, E. Popowska, D. Piekutowska-Abramczuk, M. Borucka-Mankiewicz, D. Jurkiewicz, P. Kowalski,
M. Krajewska-Walasek
Zakład Genetyki Medycznej, „Instytut-Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa
Zespół Smitha, Lemlego i Opitza (SLOS) jest monogenową chorobą autosomalną recesywną, charakteryzującą się
występowaniem zespołu mnogich wad wrodzonych o szerokim i zmiennym spektrum objawów. Choroba wynika
z defektu reduktazy ?7-dehydrocholesterolu (DHCR7), która katalizuje ostatni etap w biosyntezie cholesterolu. Gen
DHCR7 kodujący białko enzymatyczne zlokalizowany jest na chromosomie 11 w pozycji q13. Badania molekularne
przeprowadzone w populacji polskiej przez Pracownię Genetyki Molekularnej Zakładu Genetyki Medycznej IP-CZD
ujawniły obecność 15 różnych mutacji w genie DHCR7, z których dwie, W151X i V326L, wystąpiły na 60% przebadanych
alleli genu. Wysoka częstość występowania obu mutacji umożliwia ich wykorzystanie jako markerów nosicielstwa
choroby w badaniach przesiewowych. Celem prezentowanych badań było ustalenie frekwencji dwóch najczęstszych
mutacji genu DHCR7 w anonimowej grupie noworodków oraz określenie częstości występowania zespołu SLO
w populacji polskiej. Przebadano 1650 preparatów DNA na obecność mutacji W151X oraz 1250 preparatów DNA na
obecność mutacji V326L. Zidentyfikowano 30 heterozygotycznych nosicieli mutacji W151X oraz 9 heterozygotycznych
nosicieli mutacji V326L. Na podstawie uzyskanych wyników oszacowano, że całkowita częstość nosicielstwa choroby
wynosi od 5.22% (1 na 19) do 3.32% (1 na 30), a częstość występowania zespołu SLO w populacji polskiej od 1 : 3623 do
1 : 1440 żywo urodzonych dzieci. Rezultaty dotychczasowych badań wskazują, że częstość nosicielstwa zespołu Smitha,
Lemlego i Opitza w Polsce jest wyższa niż w innych krajach Europy Środkowej (Czechy i Słowacja, 2%) i znacznie
wyższa niż w krajach Europy Zachodniej i Ameryki Północnej (1%-1,4%).
Badania były częściowo finansowane z projektu KBN No. PBZ-KBN-042/PO5/2001.
W17.
Zespół Leigha : Częstość występowania nosicielstwa mutacji genu SURF1
w populacji polskiej.
Dorota Piekutowska-Abramczuk (1), E. Popowska (1), E. Ciara (1), D. Jurkiewicz (1), M. Borucka-Mankiewicz (1),
P. Kowalski (1), M. Pronicki (2), J. Sykut-Cegielska (3), M. Krajewska-Walasek (1), E. Pronicka (3)
(1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa
(2) Zakład Patomorfologii, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa
(3) Klinika Pediatrii, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa
Zespół Leigha, związany z deficytem kompleksu oksydazy cytochromu c (LSCOX-), dziedziczony w sposób
autosomalnie recesywny, należy do częściej występujących zaburzeń neurodegeneracyjnych okresu niemowlęcego
i dziecięcego. W klasycznej postaci choroby objawy pojawiają się po kilku miesiącach prawidłowego rozwoju i narastają
gwałtownie. Dochodzi do zahamowania tempa rozwoju psychomotorycznego, wymiotów i zaburzeń rytmu oddychania.
Charakterystyczne jest zaburzenie koordynacji ruchów gałek ocznych, ataksja, dystonia oraz wiotkość mięśni. Obserwuje
się podwyższenie poziomu mleczanów w płynie mózgowo-rdzeniowym i surowicy krwi. Choroba prowadzi do zgonu
z powodu niewydolności oddechowej zwykle między 2 a 5 rokiem życia. W badaniu autopsyjnym lub CT/MRI
identyfikowane są charakterystyczne symetryczne ogniska martwicze w pniu mózgu, okolicy wzgórza wzrokowego,
rdzeniu przedłużonym i górnym odcinku rdzenia kręgowego. Prace zmierzające do wyjaśnienia molekularnego podłoża
zespołu doprowadziły w roku 1998 do wykrycia zmian w budowie genu SURF1, odpowiedzialnych za większość
przypadków tej choroby. Przeprowadzone przez nas uprzednio badania 31 pacjentów z zespołem Leigha, ujawniły
obecność pięciu różnych mutacji: M235T, Y274C, 312insATdel10, 758delCA, 845delCT. Najczęściej identyfikowaną
38
Genetyka człowieka
mutacją w genie SURF1 jest delecja 845delCT w egzonie 9, występująca u wszystkich badanych (w tym 57% w formie
homozygotycznej). Znacząca dominacja 845delCT pozwoliła na wybranie tej mutacji jako markera, służącego do określenia
częstości występowania nosicielstwa uszkodzonego genu SURF1 w Polsce. Badania przesiewowe, przeprowadzone na
grupie 2000 anonimowych noworodków, doprowadziły do wykrycia sześciu heterozygotycznych nosicieli powszechnej
mutacji 845delCT (1:333). Biorąc pod uwagę fakt, iż mutacja ta wykrywana jest na 81% zmutowanych alleli wyliczono,
że częstość występowania zespołu Leigha sprzężonego z deficytem kompleksu COX w Polsce wynosi 2,7 : 1000000
żywych urodzeń.
Badania były finansowane z projektu KBN nr 3P05E09525.
W18.
Związek polimorfizmu Trp64Arg genu receptora beta 3-adrenergicznego z
występowaniem cukrzycy typu 2 i chorób naczyniowo-sercowych w populacji
polskiej.
Janusz Błasiak (1), Karolina Przybyłowska (1), Ireneusz Majsterek (1), Katarzyna Bąbol (1), Jacek Kasznicki (2),
Józef Drzewoski (2)
(1) Katedra Genetyki Molekularnej, Uniwersytet Łódzki, Łódź
(2) Zakład Farmakologii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny, Łódź
Receptor beta 3-adrenergiczny (beta3-AR ) jest odpowiedzialny za termogenezę i metabolizm lipidów, dlatego
polimorfizm Trp64Arg w jego genie może być związany z predyspozycją do otyłości oraz występowaniem chorób z nią
związanych takich jak cukrzyca i miażdżyca naczyń wieńcowych. Wykazano zależność między tym polimorfizmem
i występowaniem insulinooporności u pacjentów z cukrzycą typu 2 (DM2) w różnych populacjach. Celem pracy
było określenie znaczenia polimorfizmu Trp64Arg genu receptora beta 3-AR dla występowania DM2 w populacji
kaukaskiej w Polsce. Analizę wariantów polimorficznych przeprowadzono metodą RFLP-PCR z użyciem enzymu MspI.
Przebadano 332 pacjentów, wśród których były 154 osoby otyłe (BMI > 27kg/m2), 105 osób z cukrzycą typu 2, 143
osoby z nadciśnieniem, 126 osób z chorobą wieńcową (CHD) oraz 178 osób z prawidłowym metabolizmem glukozy.
Częstość allelu Arg była znacząco wyższa w grupie osób z DM2 w porównaniu z grupą, w której DM2 nie stwierdzono
(20% vs 12%; OR 1,71, 95% PU 1,01-,2,89) oraz grupie osób z CHD porównywanej z grupą osób bez CHD (19% vs 13%;
OR 1,69, 95% PU 1,03-2,78) Otrzymane wyniki wskazują, że allel Arg polimorfizmu Trp64Arg genu beta3-AR może być
związany z występowaniem DM2 w populacji w Polsce, jak również może mieć wpływ na rozwój choroby naczyniowosercowej współistniejącej z DM2.
Praca finansowana z badań własnych: grant Uniwersytetu Łódzkiego nr 505/450 (JB, KP, IM) oraz grantu Uniwersytetu
Medycznego w Łodzi nr 503-123-2 (JK, JD).
W19.
Wysoka częstość mutacji 313del14 genu GJB2 w populacji polskiej w porównaniu
z innymi populacjami rasy białej.
Agnieszka Pollak (1), R. Płoski (1,2), M. Mueller-Malesińska (1), J. Waligóra (1, 2), A. Skórka (1, 2),
L. Korniszewski (1, 2) , H. Skarżyński (1)
(1) Instytut Fizjologii i Patologii Słuchu w Warszawie, ul Pstrowskiego 1, 01-943, Warszawa
(2) Klinika Diabetologii Patologii Noworodka i Wad Wrodzonych Akademii Medycznej w Warszawie
U podłoża niedosłuchu uwarunkowanego genetycznie najczęściej leżą mutacje w II egzonie genu GJB2, a w szczególności
delecja guaniny w pozycji 35 (35 delG). Dane literaturowe wskazują także na występowanie szeregu innych, różnych
od 35delG recesywnych, mutacji chorobotwórczych w genie Cx26, rzadziej występujących jako przyczyna niedosłuchu
i wykazujących różnice w częstości występowania w różnych populacjach. Nietrudno zauważyć iż mutacje wywołujące
niedosłuch mają różne częstości występowania wśród analizowanych populacji, ale zwykle co najmniej dwie poza 35 delG
stanowią znakomita większość wywołującą niedosłuch– pozostałe tworzą swojego rodzaju tło będąc w mniejszości.
W przedstawianej pracy analizowano mutacje w genie GJB2 wśród polskich pacjentów z niedosłuchem w celu znalezienia
innych niż 35delG mutacji o stosunkowo wysokiej częstości, których znajomość może być istotna w diagnostyce
genetycznie uwarunkowanego niedosłuchu w naszej populacji.
Analiza oparta na sekwencjonowaniu prowadzona wśród heterozygot 35delG wykazała, że drugą co do częstości
patogenną mutacją w GJB2 jest 313del14. Wyniki te potwierdzają opublikowane dane (Wiszniewski i wsp. 2001).
W celu precyzyjnego określenia częstości występowania tej mutacji wśród pacjentów w Polsce przebadano 421
niespokrewnionych osób z niedosłuchem. Wyniki pozwoliły określić częstość występowania 313del14 u pacjentów
z niedosłuchem na 1,54% (95% przedział ufności 0,7%–2,4%). Dane literaturowe wskazują, że 313del14 występuje także
39
Genetyka człowieka
w innych populacjach rasy białej ale zdecydowanie rzadziej niż w Polsce.
Otrzymane wyniki pozwalają stwierdzić iż mutacja 313del14 stanowi drugą w kolejności po 35delG przyczynę
niedosłuchu uwarunkowanego genetycznie w populacji polskiej, a test na jej obecność powinien być wykonywany
u każdego pacjenta podejrzanego o niedosłuch uwarunkowany genetycznie równolegle z testem na obecność 35delG.
Statystycznie istotna wyższa częstość mutacji 313del14 w Polsce w porównaniu z innymi populacjami rasy białej
sugeruje, że mutacja ta mogła powstać w rejonie Europy Środkowej.
W20.
Częstości alleli niedoborowych alfa-1-antytrypsyny w losowej próbie populacji
Krakowa.
Marcin Kaczor, Marek Sanak, Andrzej Szczeklik
II Katedra Chorób Wewnętrznych, Collegium Medicum, Uniwersytetu Jagiellońskiego, ul. Skawińska 8, 31-066 Kraków
Ciężki niedobór alfa-1-antytrypsyny, prowadzący do chorób płuc i wątroby, występuje u homozygot Z i jest jedną
z częstszych chorób genetycznych wśród rasy białej. Brak jest wiarygodnych oszacowań częstości najpowszechniejszych
alleli niedoborowych Z i S w polskiej populacji. Celem niniejszej pracy jest ocena ich rzeczywistej częstości na podstawie
analizy reprezentatywnej próby populacyjnej metodami genetycznymi.
Badanie przeprowadzono techniką PCR z użyciem pary sond znakowanych fluorescencyjnie i detekcją „real-time”
produktu. Genotypowano losową próbę 550 mieszkańców Krakowa. Częstości alleliczne wyniosły: w przypadku
Z – 0,0109 (95% CI: 0,0057-0,0190), natomiast S – 0,0172 (95% CI: 0,0104-0,0268). Nie stwierdzono znamiennych
różnic z wcześniej zebraną populacja spośród mieszkańców Kazimierza – jednej z dzielnic Krakowa. Połączono obie
grupy, łącznie przebadano 859 osób, znajdując 18 heterozygot MZ, 28 heterozygot MS i jedną homozygotę S. Wykazano
zgodność częstości obserwowanych genotypów z oczekiwanymi na podstawie równowagi Hardy’ego-Weinberga.
W połączonych grupach częstość allela Z wyniosła 0,0105 (95% CI: 0,0062-0,0165), zaś allela S – 0,0175 (95% CI:
0,0118-0,0248).
W Polskiej populacji należy oczekiwać 4 197 (95% CI: 1 470-10 408) homozygot Z. Wczesne wykrycie predyspozycji
genetycznej, w połączeniu z prawidłową opieką lekarską i zmianą trybu życia, prowadzić może do uniknięcia lub
opóźnienia rozwoju choroby. Należy rozważyć wprowadzenie w Polsce diagnostyki genetycznej niedoborów do
powszechnej praktyki klinicznej, zgodnie ze wspólnymi wytycznymi American Thoracic Society i European Respiratory
Society.
W21.
Mutacje genów CFTR, PRSS1 i SPINK1 u pacjentów z zapaleniem trzustki.
Agnieszka Sobczyńska-Tomaszewska (1), Daniel Bąk (1, 2), Kamila Czerska (1, 6), Beata Oralewska (3), Grzegorz
Oracz (3), Mikołaj Teisseyre (3), Jerzy Socha (3), Marek Zagulski (4), Aleksandra Norek (1, 5), Jerzy Bal (1)
(1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka
(2) Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski
(3) Klinika Gastroenterologii i Hepatologii, Instytut-Centrum Zdrowia Dziecka
(4) Pracownia Sekwencjonowania, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawa
(5) Politechnika Łódzka, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Łódź
(6) Studium Medycyny Molekularnej, Akademia Medyczna, Warszawa
Zapalenie trzustki należy do stosunkowo rzadko rozpoznawanych chorób u dzieci (10-15/100 000), ale z uwagi na
poważne rokowanie stanowi istotny problem w pediatrii. Jak się sądzi, u podłoża molekularnego zapalenia trzustki leżą
mutacje w wielu różnych genach.
Badania molekularne genów CFTR, PRSS1 i SPINK1 przeprowadzono w grupie 85 pacjentów w wieku 3-19 lat.
Identyfikowano mutacje w następujących genach: CFTR – 30 mutacji (50 pacjentów), dla pozostałej grupy – 2 najczęstsze
mutacje (delF508 i dele2,3(21kb)), u wszystkich pacjentów analizowano wariant IVS8-5T, PRSS1 – mutacje R122H,
R122C, N29I i A16V, dodatkowo u 30 pacjentów przeprowadzono badanie przesiewowe (poszukiwanie mutacji
rzadkich), SPINK1 – mutacja N34S.
U 24 pacjentów (28%, P=0,033) zidentyfikowano mutacje w co najmniej jednym badanym genie. W genie PRSS1
mutacje wykryto u 10 pacjentów (12%, P=0,013). U dwóch pacjentów oprócz mutacji w genie PRSS1 zidentyfikowano
współistniejące defekty w pozostałych badanych genach: CFTR i SPINK1. W genie CFTR zidentyfikowano mutacje
lub wariant 5T u 10 pacjentów (12%, P=1,000): u 7 pacjentów wyłącznie w genie CFTR, u 2 w CFTR i w SPINK1 oraz
u 1 pacjenta w genach CFTR i PRSS1. Częstość występowania mutacji w genie CFTR (wyłączając IVS8-5T) u pacjentów
z zapaleniem trzustki była 1.5 razy wyższa niż w populacji polskiej (5/85 (6%) vs. 1/25 (4%)). Nie stwierdzono wyższej
40
Genetyka człowieka
częstości występowania wariantu IVS8-5T w badanej grupie chorych. Natomiast mutację N34S w genie SPINK1 wykryto
u 8 pacjentów (9%, P=0.153), u 3 z nich stwierdzono współistnienie mutacji w innych badanych genach.
Mutacje w genie PRSS1 występują nie tylko w przypadkach rodzinnej postaci choroby, ale także u pacjentów bez
pozytywnego wywiadu rodzinnego. Ponieważ u pacjentów z mutacjami w genie PRSS1 jest ok. 50 razy wyższe
prawdopodobieństwo zachorowania na raka trzustki niż dla populacji ogólnej, istnieje potrzeba włączenia badań
molekularnych genu PRSS1 do panelu badań przeprowadzanych u pacjentów z zapaleniem trzustki. Badania molekularne
powinny także obejmować analizę najczęstszych mutacji w genach CFTR i SPINK1.
Badania wykonywano w ramach realizacji projektu badawczego KBN: 3 P05E 132 23.
W22.
Serial segmental duplications during primate evolution result in complex human
genome architecture.
Paweł Stankiewicz (1), Christine J. Shaw (1), Marjorie Withers (1), Ken Inoue (1), James R. Lupski (1, 2, 3)
(1) Department of Molecular & Human Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA
(2) Pediatrics, Baylor College of Medicine, 3Texas Children Hospital, Houston, Texas 77030, USA
(3) Texas Children Hospital, Houston, TX, 4Depts of Pathology and 5Pediatrics, University of Texas Medical Branch,
Galveston, TX, 6Department of Pathology, Mayo Clinic, Rochester, MN
The human genome is particularly rich in low-copy repeats (LCRs) or segmental duplications (5-10%), and this
characteristic distinguishes us from lower mammals such as rodents. How and why the complex human genome
architecture consisting of multiple LCRs has evolved, remains an open question. Using molecular and computational
analyses of human and progenitor primate genomic regions, we analyzed the structure and evolution of LCRs that
resulted in complex architectural features of the human genome in proximal 17p. We found that multiple LCRs of
different origins are situated adjacent to one another, whereas each LCR evolved at different time points > 25 to 3-7
million years ago, during primate speciation. Evolutionary studies in primates indicated abundant communication
between the LCRs by gene conversion. The DNA transposable element MER1-Charlie3 and retroviral ERVL elements
were identified at the breakpoint of the t(4;19) chromosome translocation in Gorilla gorilla, suggesting a potential role
for transpositions in evolution of the primate genome. Thus, a series of consecutive segmental duplication events during
primate evolution resulted in complex genome architecture in proximal 17p. Some of the more recent events led to the
creation of novel genes that in human are expressed primarily in the brain. Our observations support the contention that
serial segmental duplication events orchestrated primate speciation both by the generation of novel fusion/fission genes
as well as by genomic inversion associated with decreased recombination rates further facilitating gene divergence.
W23.
Wady wrodzone przedniej ściany brzucha i wybrane czynniki ryzyka ich
występowania – dane z Polskiego Rejestru Wrodzonych Wad Rozwojowych (PRWW).
Anna Materna-Kiryluk (1), K. Wiśniewska (1, 2) M. Badura (1) J.P. Mejnartowicz (1) M. Czerwionka-Szaflarska (3)
E. Gajewska (4) M. Krawczyński (5) J. Limon (6) M. Walczak (7) A. Latos-Bieleńska (1)
(1) Katedra i Zakład Genetyki Medycznej AM, Poznań
(2) Katedra Profilaktyki Zdrowotnej AM, Poznań�
(3) Katedra i Klinika Pediatrii, Alergologii i Gastroenterologii AM, Bydgoszcz
(4) Klinika Neonatologii AM, Wrocław
(5) Klinika Gastroenterologii Dziecięcej i Chorób Metabolicznych AM, Poznań
(6) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki AM, Gdańsk; 7-Katedra Chorób Dzieci PAM, Szczecin
Od lat 70-tych w wielu krajach Europy Zachodniej, USA i Australii obserwuje się wzrost częstości występowania
wytrzewienia. Obserwowany wzrost nie dotyczy jednak częstości występowania przepukliny pępowinowej. Na podstawie
danych z PRWWR określono wskaźnik częstości występowania wytrzewienia i przepukliny pępowinowej wśród
dzieci urodzonych w latach 1998-2001 na terenie województw dolnośląskiego, kujawsko-pomorskiego, lubuskiego,
opolskiego, pomorskiego, wielkopolskiego i zachodniopomorskiego (43% powierzchni kraju) oraz podjęto próbę
identyfikacji wybranych czynników ryzyka występowania tych wad. Na terenie objętym analizą w latach 1998-2001
zarejestrowano 576 509 urodzeń żywych (uż). Do PRWWR zgłoszono 104 żywo urodzone dzieci z wytrzewieniem.
Częstość występowania wytrzewienia wynosiła 1,80/1000 uż (71,2% przypadki izolowane, a 28,8% zespoły wad).
Stwierdzono zróżnicowanie terytorialne częstości występowania wytrzewienia; najwyższy współczynnik częstości
stwierdzono w województwie zachodniopomorskim (2,51/1000 uż). Stwierdzono większą częstość występowania
wytrzewienia u dzieci płci męskiej. Wytrzewienie częściej występowało u noworodków z niską masą urodzeniową ciała
41
Genetyka człowieka
1500-1999 g (32,22/1000 uż); a także wśród potomstwa kobiety poniżej 19 roku życia (4,43/1000 uż). Wyższa częstość
występowania wytrzewienia wśród dzieci tej grupy kobiet dotyczyła zarówno przypadków izolowanego wytrzewienia jak
i zespołów wad (odpowiednio 3,62 i 0,81 na 1000 uż). Najczęstszymi wadami towarzyszącymi wytrzewieniu były wady
układu mięśniowo-szkieletowego inne niż wytrzewienie (34%) i wady układu nerwowego (17%). Wśród populacji badanej
przepuklinę sznura pępowinowego stwierdzono u 88 dzieci (częstość występowania 1,53/10000 uż), 50% przypadków
przepukliny pępowinowej występowało jako wada izolowana, a 50% w zespołach wad. Przepuklinę pępowinową
stwierdzano częściej na terenach wiejskich (1,6/1000 uż) niż miejskich (1,35/1000 uż); najczęściej u noworodków z niską
masą urodzeniową ciała 1000-1499 g (23,13/1000 uż); u potomstwa kobiet w wieku powyżej 35 lat (2,18/1000 uż).
Jednak najwyższy współczynnik częstości występowania izolowanej przepukliny pępowinowej stwierdzono, podobnie
jak w przypadku wytrzewienia, wśród dzieci kobiet w wieku poniżej 19 lat (1,01/ 1000 uż). Najczęstszymi wadami
towarzyszącymi przepuklinie pępowinowej były wady serca (27,6%) i wady układu mięśniowo-szkieletowego (18,7%).
W24.
Analiza mechanizmów zdrowego starzenia – badania cytogenetyczne polskich
stulatków.
Alina Wojda, E. Ziętkiewicz, M. Lubka, M. Witt
Instytut Genetyki Człowieka PAN, Poznań, ul. Strzeszyńska 32
Proces starzenia definiowany jest jako zahamowanie zdolności komórki do proliferacji, spowodowane zmianami
zachodzącymi z wiekiem komórki (nagromadzenie uszkodzeń DNA, obniżenie zdolności naprawczych DNA,
zahamowanie syntezy DNA). Na poziomie cytogenetycznym zmiany te są obserwowane jako aberracje liczby i struktury
chromosomów oraz zahamowanie cyklu komórkowego.
W celu określenia biomarkera procesu starzenia na poziomie cytogenetycznym przeprowadzono badania limfocytów krwi
obwodowej, z zastosowaniem klasycznych i molekularnych (FISH) technik cytogenetycznych. Badania przeprowadzono
u 47 kobiet i 7 mężczyzn w wieku od 100 do 107 lat oraz u 60 osób z grupy kontrolnej w przedziałach wiekowych 21–30
lat, 41–50 lat, 61–68 lat, 69–78 lat.
W pojedynczych komórkach badanych osób stwierdzono występowanie różnych aberracji chromosomowych, nie
znaleziono jednak aberracji charakterystycznych dla danej grupy wiekowej. Tym, co odróżniało poszczególne grupy
wiekowe, była częstotliwość występowania komórek, w których obserwowano spontaniczne pęknięcia i złamania
chromosomów, najwyższa w grupie wiekowej 61-68 lat.
Analiza wyników w grupach podzielonych wg wieku i płci wykazała, że u kobiet częstotliwość aberracji struktury
chromosomów początkowo wzrasta z wiekiem, osiągając najwyższe wartości w grupie 61-68 lat, po czym u kobiet
starszych i stuletnich stopniowo maleje. U mężczyzn częstotliwość występowania aberracji struktury chromosomów
wzrasta systematycznie wraz z wiekiem, jednak wolniej niż u kobiet: w grupie 61-68 lat częstotliwość aberracji
struktury jest dużo niższa u mężczyzn, podczas gdy w grupie stulatków odpowiednie wartości dla kobiet i mężczyzn
są porównywalne. Częstotliwość występowania aneuploidii chromosomów wzrasta z wiekiem zarówno u kobiet, jak
i u mężczyzn; u mężczyzn jednak wzrost ten jest wolniejszy niż u kobiet. Częstotliwość występowania mikrojąder
w komórkach dwujądrowych wzrasta z wiekiem zarówno u kobiet i mężczyzn. W ok. 90% przypadków utracie na
drodze tworzenia mikrojąder ulegają całe chromosomy, głównie chromosomy płci; chromosomy autosomowe ulegają
utracie głównie na drodze nondysjunkcji.
W starszych grupach wiekowych dominują osoby charakteryzujące się niską częstotliwością występowania uszkodzeń
chromosomowych. Prawdopodobnie wraz z wiekiem następuje eliminacja z populacji osób o podwyższonej skłonności do
akumulacji różnych uszkodzeń chromosomów. Można zatem stwierdzić, że stabilność genomu odgrywa fundamentalną
rolę w determinacji długości życia.
W25.
Określenie prawdopodobieństwa wystąpienia patologii u potomstwa nosicieli
translokacji robertsonowskich der(13;14) dwu i jednocentromerowych.
Anna Jelska (1), Gesa Schwanitz (2), Barbara Panasiuk (1), Anna Latos-Bieleńska (3), Janusz Limon (4),
Olga Haus (5), Jacek Pilch (6), Maria Lassota (7), Alina T. Midro (1)
(1) Zakład Genetyki Klinicznej AM, Białystok
(2) Institut für Humangenetik, Bonn, Germany
(3) Katedra i Zakład Genetyki Medycznej AM, Poznań
(4) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki AM, Gdańsk
(5) Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej AM w Bydgoszczy
42
Genetyka człowieka
(6) Pracownia Cytogenetyczna, Klinika Neurologii Wieku Rozwojowego, GCZD i M, Katowice
(7) Poradnia Genetyczna Wojewódzkiego Szpitala Dziecięcego, Rzeszów
Obecność nosicielstwa translokacji chromosomowej robertsonowskiej der(13;14) kwalifikuje je do grupy niskiego
prawdopodobieństwa urodzenia dziecka z niezrównoważonym kariotypem (zespołu Patau) oraz z ojcowską lub
matczyną disomią chromosomu 14. Ograniczona możliwość przeżycia in utero płodów w przypadku niektórych form
niezrównoważenia kariotypu prowadzi do zwiększonej częstości występowania poronień samoistnych, ciąż obumarłych
i wczesnych zgonów noworodków wpływając na wielkość ryzyka genetycznego. Dokładne rozpoznanie cytogenetyczne
uwzględnia czy der (13;14) jest jedno czy dwucentromerowa. Celem pracy jest określenie prawdopodobieństwa
wystąpienia poszczególnych patologii spowodowanych stanem nosicielstwa der (13;14) w zależności od liczby
centromerów obecnych w translokacji der(13;14). Materiał do badań stanowiło 456 ciąż z 151 rodzin nosicieli 85
rodowodów nosicieli der (13;14) identyfikowanych przy użyciu technik prążkowych GTG, CBG i QFQ. Wielkość
prawdopodobieństwa wystąpienia poszczególnych patologii oszacowano metodą wg Stengel-Rutkowski i wsp.
z uwzględnieniem korekty oszacowania wg Stene. Stwierdzono, że prawdopodobieństwo urodzenia dziecka z trisomią
13 (0/313, tj. poniżej 0,2%), oraz ryzyko ciąż obumarłych i wczesnych zgonów (4/177, tj. poniżej 2,2%), są znacznie
niższe niż ryzyko poronień samoistnych (45/313, tj. 14,4%) Wielkość ryzyka poronień samoistnych jest porównywalna
do wyniku oszacowania wielkości prawdopodobieństwa niezrównoważenia w diagnostyce prenatalnej (3/23, tj. 13,7%)
co potwierdza, że poronienia samoistne mogły wystąpić w wyniku niezrównoważonego kariotypu. Wyższe ryzyko
poronień samoistnych u nosicieli translokacji chromosomowych dwucentromerowych tj. 19% (15/79) w porównaniu
do jednocentromerowych, tj. 10% (6/57) sugeruje potrzebę dyskryminacji rodzaju translokacji robertsonowskich w ich
diagnostyce do celów poradnictwa genetycznego.
W26.
Wpływ nosicielstwa translokacji zrównoważonych na niepowodzenia ciążowe.
Magdalena Pasińska (1), Ewa Duszeńko (2), Barbara Mucha (1), Katarzyna Skonieczka (1),
Anna Lauda-Świeciak (1), Olga Haus (1, 2)
(1) Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej AM w Bydgoszczy
(2) Pracownia Cytogenetyczna Kliniki Hematologii AM we Wrocławiu
Uważa się, że za 2,8-13,4% przypadków niepowodzeń ciążowych odpowiada nieprawidłowy kariotyp jednego
z partnerów. Najczęściej spotykaną nieprawidłowością jest nosicielstwo aberracji zrównoważonej.
Celem badań było przeprowadzenie analizy rodzaju niepowodzeń ciążowych u nosicieli translokacji wzajemnych oraz
określenie czy istnieje zależność między rodzajem aberracji a typem niepowodzenia ciążowego, które było wskazaniem
do badania kariotypu oraz zależność między rodzajem translokacji a płcią pacjenta.
Analizie poddawano chromosomy metafazowe lub prometafazowe, które uzyskiwano z 72 godzinnych hodowli
limfocytów krwi obwodowej. U każdego pacjenta analizowano zgodnie z ICSN 1995 co najmniej 20 metafaz
udokumentowanych na odbitkach fotograficznych albo wydrukach komputerowych. Dodatkowo w wybranych
przypadkach zastosowano technikę FISH z sondami malującymi i specyficznymi. �
U par z niepłodnością pierwotną translokacje występowały wyłącznie u mężczyzn, u par z poronieniami nawykowymi,
głównie u kobiet a u par z poronieniami i urodzeniem dziecka z wadami z jednakową częstością u obu płci.
U 12 badanych; 6 kobiet i 6 mężczyzn znaleziono translokacje wzajemne. W parach z niepłodnością pierwotną
translokacje stwierdzono wyłącznie u mężczyzn. Były to: t(1;19)(p35;q13.3), t(15;16)(q13;p13.3), t(14;21)(q10;q10).
W parach, w których wystąpiły same poronienia, translokacje znaleziono u 3 kobiet i 1 mężczyzny; 46,XX,t(7;19)(p1
3;p13.1), 46,XX,t(8;16)(q24;q22), 46,XX,t(3;8)(q21;p21), 46,XY,t(13;18)(q14;q21.1). Wśród par, w których wystąpiły
poronienia oraz urodzenie dziecka z wadami, translokacje rozpoznano u 6 osób; 3 kobiet i 3 mężczyzn. W 4 przypadkach
były to translokacje zrównoważone wzajemne: t(4;13)(q34;q31) – u mężczyzny – ojca trojga dzieci z niezrównoważonym
kariotypem, t(1;10)(q21;q22) – u ojca chłopca z zaburzeniami cielesno-płciowymi, t(1;7)(q23;q11.2) – u matki dziecka
z niezrównoważonym kariotypem i opóźnieniem rozwoju psycho – ruchowego oraz t(5;13)(p11;q14) – u ojca dziecka
z niezrównoważonym kariotypem i klinicznymi objawami zespołu cri du chat. W 2 przypadkach wystąpiły translokacje
robertsonowskie; t(14;21)(q10;q10) – u kobiety z 4 poronieniami i dzieckiem z wadami i t(13;14)(q10;q10) – u kobiety,
która urodziła dziecko z zespołem Patau.
43
Genetyka człowieka
W27.
Ocena przydatności pomiarów przezierności karkowej oraz oznaczeń białka
ciążowego A i wolnej podjednostki beta gonadotropiny kosmówkowej
w badaniach płodu.
Lech Dudarewicz (1), Jolanta Lukamowicz (2), Ewa Świątkowska (2), Lucjusz Jakubowski (1)
(1) Zakład Genetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki
(2) Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki
Cel pracy: Określenie zakresu prawidłowej zmienności badanych parametrów i analiza ich rozkładu w grupach płodów
zdrowych (dla poszczególnych tygodni ciąży) oraz odniesienie do tak zdefiniowanych przedziałów wyników badań
wykonanych w ciążach z rozpoznaną u płodu aberracją chromosomową.
Materiał: grupa ciąż pojedynczych, w których wykonano ultrasonograficzne pomiary przezierności karkowej (NT)
u płodu zgodnie z protokołem Fundacji Medycyny Płodowej oraz pomiary stężeń surowiczych białka ciążowego
A (PAPP-A) i wolnej podjednostki beta gonadotropiny kosmówkowej w surowicy krwi ciężarnych. Analizę danych
przeprowadzono przy pomocy dostępnego oprogramowania.
Wyniki: Określono zakresy norm dla ocenianych parametrów z uwzględnieniem wieku ciążowego oraz innych danych
klinicznych i demograficznych.
Opisano zakres ich fizjologicznej zmienności zależnie od stosowanej metody oznaczeń biochemicznych.�
Wniosek: Rozkład ryzyka wystąpienia wybranych typów aneuploidii określonego na podstawie pomiaru NT u płodu
oraz oceny stężeń surowiczych PAPP-A i f beta-hCG oraz wieku matki jest znamiennie statystycznie różny w grupie
płodów zdrowych w porównaniu z grupą płodów z aberracjami chromosomowymi. Pozwala to na wykorzystanie
zastosowanego schematu postępowania w badaniach przesiewowych pod kątem wczesnego wykrywania wybranych
typów aneuploidii.
Badania były częściowo finansowane w oparciu o grant KBN nr 3 PO5E 156 22.
Komunikaty plakatowe:
P34.
Mutacja zmiany sensu w eksonie 12 u chorego z łagodną postacią hemofilii A.
Jadwiga Sawecka (1), J. Skulimowska (1), A. Klukowska (2), J. Kościelak (1)
(1) Zakład Biochemii, Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie
(2) Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii AM w Warszawie
Oznaczono mutację u pacjenta z łagodną postacią hemofilii A. W eksonie 12 wykryto mutację typu zmiany sensu,
w której 593 kodon genu czynnika VIII, CGC był zastąpiony kodonem TGC, co spowodowało zamianę argininy na
cysteinę.
W bazie danych znaleziono 33 doniesienia o tego rodzaju mutacji u pacjentów z łagodną bądź umiarkowaną hemofilią
A. Tę samą mutację zidentyfikowano również u chorego na łagodną hemofilię A brata bliźniaka pacjenta. �
Do oznaczenia mutacji zastosowano cykliczną metodę sekwencjonowania DNA z użyciem polimerazy DNA Ampli Taq,
FS i terminatorów znakowanych 4 barwnikami fluorescencyjnymi, pochodnymi dichloroaminy (A-dR6G, C-dROX, GR110, T-dTAMRA). Namnożone eksony metodą PCR poddano sekwencjonowaniu w obu kierunkach i elektroforezie
w warunkach denaturujących w temperaturze 51oC na 4% żelu poliakryloamidowym o grubości 0,2 mm i długości
36 cm zawierającym 6M mocznik, przy napięciu 1680 V, natężeniu 50 mA i mocy lasera 40mW na sekwenatorze ABI
PRISM 377.
P35.
Genotyp IL-10 (-1082G/A) w kontekście zachorowalności na gruźlicę.
Magdalena Druszczyńska (1) , D. Strapagiel (1), J. Karhukorpi (2), R. Karttunen (2), W. Rudnicka (1)
(1) Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Instytut Mikrobiologii i Immunologii, Uniwersytet Łódzki
(2) Department of Medical Microbiology, University of Oulu, Finlandia
Genetyczne uwarunkowanie podatności na zachorowanie na gruźlicę uważa się za jedną z przyczyn zróżnicowanego
przebiegu zakażenia Mycobacterium tuberculosis. Do wystąpienia objawów jawnej klinicznie choroby dochodzi
u nie więcej niż 10% zakażonych osób. Pełny rozwój prątków uniemożliwia działanie mechanizmów protekcyjnej
44
Genetyka człowieka
odpowiedzi immunologicznej opartej na współdziałaniu makrofagów i limfocytów T oraz wydzielanych przez nie
cytokin. Prowadzone na szeroką skalę badania mają na celu wskazanie genu lub zespołu genów odpowiedzialnych
za odporność na zachorowanie na tę chorobę. Biorąc pod uwagę, iż poznanie genetycznego podłoża podatności na
gruźlicę jest niezbędne dla przygotowania bardziej efektywnej niż BCG szczepionki przeciwgruźliczej oraz opracowania
lepszego niż test tuberkulinowy sposobu monitorowania jej skuteczności, celem badań było określenie częstości
występowania poszczególnych wariantów allelicznych (A/A, G/G, A/G) genu kodującego IL-10 (pozycja –1082 regionu
promotorowego) u 68 pacjentów chorych na gruźlicę płuc oraz 89 zdrowych osób, z których żadna nie chorowała na
gruźlicę. Polimorfizm genu kodującego IL-10 określano wykorzystując reakcję łańcuchowej polimerazy (PCR).�
Nie stwierdzono różnicy w częstości występowania poszczególnych genotypów IL-10 – A/A, G/G, A/G w grupie
pacjentów z gruźlicą i osób zdrowych. Heterozygotami A/G było 36 spośród 68 (53%) pacjentów z gruźlicą oraz 38
spośród 89 (43%) zdrowych ochotników. Genotyp A/A lub G/G stwierdzono odpowiednio u około 30% lub 20%
pacjentów chorych na gruźlicę i osób zdrowych.
Na podstawie uzyskanych wyników można sugerować, że genotyp IL-10 (-1082G/A) nie ma związku z zachorowalnością
na gruźlicę.
Badania finansowane z grantu KBN, Nr 3PO5B 091 24.
P36. Analiza danych z wywiadu ginekologiczno-położniczego 21 kobiet nosicielek
premutacji w genie FMR1.
Małgorzata Lisik
Katedra i Zakład Biologii Ogólnej, Molekularnej i Genetyki, Śląska Akademia Medyczna, ul. Medyków 18, 40-752 Katowice
Nosicielstwo premutacji w genie FMR 1 jest związane z przedwczesnym wygaśnięciem funkcji jajników lub menopauzą
przed 40 rokiem życia.
Wśród 21 kobiet, nosicielek premutacji w genie FMR1, o liczbie powtórzeń trójki nukleotydów CGG 60–160,
przeprowadzono ankietę dotyczącą danych z wywiadu ginekologiczno-położniczego, obejmującej: wiek wystąpienia
pierwszej miesiączki, czas trwania cyklu, jego zaburzenia, liczbę ciąż, niepowodzenia rozrodu, datę ostatniej miesiączki.
Wiek pacjentek wahał się w granicach 31–49 (średni wiek 41 lat). Pacjentki podzielono na dwie grupy wiekowe,
9-osobową w wieku 31–39 lat oraz 12-osobową w wieku 41–49 lat. Wiek wystąpienia pierwszej miesiączki wahał się
w granicach 11–18 lat, (średni 12 lat). Czas trwania cyklu wahał się w granicach 20–30 dni (średnio 26 dni), nieregularne
cykle występowały u 3 pacjentek. Liczba ciąż wynosiła 1 do 6 (średnio 2,67), a liczba porodów 1 do 5, (średnio
2,24). Niepowodzenia rozrodu wystąpiły u 6 kobiet, w tym poronienia u 4 pacjentek, urodzenie martwego dziecka
u 2, zaśniad groniasty u 1. Ciąża bliźniacza wystąpiła u 2 pacjentek. Wczesna menopauza, około 40 roku życia, wystąpiła
u 3 pacjentek, tj. u 14%.
Ryzyko wczesnego wygaśnięcia funkcji jajników u nosicielek premutacji ma swoje implikacje kliniczne, które należy
uwzględnić przy udzielaniu porady genetycznej.
P37.
Polimorfizm CD14 a podatność na gruźlicę.
Dominik Strapagiel (1), M. Druszczyńska (1), J. Karhukorpi (2), R. Karttunen (2), W. Rudnicka (1)
(1) Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Instytut Mikrobiologii i Immunologii, Uniwersytet Łódzki
(2) Department of Medical Microbiology, University of Oulu, Finlandia
Glikoproteina CD14 jest receptorem sygnałowym wiążącym różnorodne ligandy bakteryjne, w tym lipopolisacharyd
bakterii Gram-ujemnych oraz lipoarabinomannan (LAM) ściany komórkowej prątków, uznawany za jeden z głównych
czynników chorobotwórczości mykobakterii. Receptory CD14 są zawsze obecne na powierzchni makrofagów
i granulocytów oraz w formie rozpuszczalnej w surowicy (sCD14). Interakcja pomiędzy receptorami CD14 i LAM
ma kluczowe znaczenie dla przebiegu zakażenia gruźliczego. Reakcja ta może zarówno uruchamiać mechanizmy
pochłaniania, zabijania i trawienia prątków w fagocytach, jak również promować wewnątrzkomórkowe przeżywanie
i rozwój tych bakterii. Biorąc pod uwagę istotne znaczenie produktów genu CD14 dla przebiegu interakcji prątków
z makrofagami, celem badań była ocena polimorfizmu genu CD14 C-159-T oraz surowiczego poziomu sCD14 u 76
pacjentów z gruźlicą płuc i 69 zdrowych osób nigdy nie chorujących na gruźlicę. Polimorfizm genu CD14 określano
wykorzystując reakcję łańcuchowej polimerazy (PCR). Produkty PCR o wielkości 227-bp dla allelu C oraz 381-bp
dla allelu T uwidaczniano po elektroforezie w 2% żelu agarozowym i barwieniu bromkiem etydyny. Stężenie sCD14
w surowicach oceniano immunoenzymatycznie (QuantikineTM sCD14; R&D).
Nie stwierdzono różnicy w częstości występowania poszczególnych genotypów CD14 – C/C, T/T, C/T w grupie
45
Genetyka człowieka
pacjentów z gruźlicą i osób zdrowych. Genotyp C/T stwierdzono u ponad połowy pacjentów z gruźlicą oraz zdrowych
ochotników. Homozygotami C/C lub T/T było odpowiednio około 30% lub 20% chorych na gruźlicę i osób zdrowych.
Zarówno wśród zdrowych ochotników, jak i chorych na gruźlicę nie obserwowano różnicy w średnim poziomie sCD14
w surowicach osób o różnym genotypie CD14, jakkolwiek w surowicach pacjentów z gruźlicą stwierdzono dwukrotnie
wyższy średni poziom sCD14 w porównaniu do surowic osób zdrowych.
Wyniki pozwalają sugerować, że genotyp CD14 nie odgrywa roli w podatności ludzi na gruźlicę. Obserwowany
w surowicach chorych na gruźlicę podwyższony poziom sCD14 nie jest uwarunkowany genetycznie, lecz
prawdopodobnie jest konsekwencją trwającego zakażenia M. tuberculosis.
Badania finansowane z grantu KBN, Nr 3PO5B 091 24.
P38.
Mutacje i tło genetyczne w zespole Lebera.
Katarzyna Tońska (1), Janusz Piechota (1), Dorota Ratajska (1), Ewa Bartnik (1, 2)
(1) Zakład Genetyki, Instytut Botaniki, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski
(2) Instytut Biochemii i Biofizyki PAN
Zespół Lebera jest najczęstszą chorobą mitochondrialną, dziedziczącą się w linii matczynej, charakteryzującą się utratą
wzroku w młodym wieku, której rzadko towarzyszą dodatkowe objawy neurologiczne. 90 % przypadków zespołu Lebera
jest powodowanych przez jedną z trzech podstawowych mutacji w mitochondrialnym DNA (nukleotydy 3460, 11778,
14484). Oprócz powyższych, znanych jest kilkanaście rzadko występujących mutacji odpowiedzialnych za tę chorobę.
Wciąż trwają dyskusje o roli dodatkowych zmian w mitochondrialnym DNA, zwanych mutacjami drugorzędowymi na
obraz choroby.
Podjęte badania obejmują zarówno diagnostykę podstawowych mutacji prowadzących do zespołu Lebera jak
i określenie mitochondrialnego tła genetycznego (przynależność do haplogrup mitochondrialnego DNA) u pacjentów
ze zdiagnozowaną chorobą, a także wyniki poszukiwania nowych mutacji u pacjentów ze wskazaniami klinicznymi.
P39.
Zespół Allgrove’a u 7-letniego chłopca – rozpoznanie kliniczne choroby
i jej molekularne potwierdzenie.
Franciszek Iwańczak (1), Śmigiel Robert (1, 2), Blitek Aleksander (1), Heubner Angela (3)
(1) II Katedra i Klinika Pediatrii, Gastroenterologii i Żywienia AM we Wrocławiu
(2) Katedra Patofizjologii AM we Wrocławiu�
(3) Universitaets – Kinderklinik Medizinisch – Theoretisches Zentrum, Dresden, Germany
Zespół Allgovea, zwany inaczej zespołem 3A (triple A syndrome) jest rzadkim schorzeniem dziedziczonym w sposób
autosomalny recesywny. Charakteryzuje się triadą chorób: achalazją przełyku, niedoczynnością kory nadnerczy oraz
zaburzeniem wydzielania łez (alakrimią). U niektórych pacjentów występują dodatkowo zaburzenia neurologiczne
oraz dermatologiczne. Ostatnio zidentyfikowano gen na długim ramieniu chromosomu 12 (12q13) nazywanym AAAS
(ALADIN lub ADRACALIN), którego mutacje są przyczyną fenotypu zespołu trzech A.
Autorzy pracy przedstawiają opis przypadku 7-letniego chłopca z zespołem Allgrove’a. Chłopiec, młodych, zdrowych
rodziców spokrewnionych w trzecim pokoleniu, urodzony z CII,PII. W okresie niemowlęcym i pierwszych latach
życia chłopiec rozwijał się prawidłowo, nie chorował. Już od pierwszych miesięcy życia rodzice zauważyli u chłopca
brak łez, w piątym roku życia rozpoznano niedoczynność kory nadnerczy. W siódmym roku życia na podstawie
obrazu klinicznego, badania kontrastowego, scyntygraficznego i manometrycznego przełyku rozpoznano achalazję
przełyku. Rozpoznanie zespołu Allgrovea potwierdzono badaniem genetycznym wykonanym w Dziecięcym Szpitalu
Uniwersyteckim w Dreźnie, identyfikując mutację zmiany sensu w eksonie 8 genu AAAS (869T>C). Powoduje
ona zmianę seryny na prolinę w kodonie 263 (S263P). W literaturze opisano kilkanaście homozygotycznych
i heterozygotycznych mutacji w genie AAAS, które powodują powstanie uszkodzonego, skróconego białka, prowadzące
do utraty jego funkcji. Leczenie tego zespołu polega na substytucji hormonalnej niewydolności kory nadnerczy, leczeniu
operacyjnym achalazji, leczeniu objawów ocznych.
46
Genetyka człowieka
P40.
Ustalenie molekularnego podłoża zespołu Alagille’a w populacji polskiej.
Dorota Jurkiewicz (1), E. Popowska (1), C. Gloser (2), D. Piekutowska-Abramczuk (1), E. Ciara (1),
M. Borucka-Mankiewicz (1), P. Kowalski (1), M. Gajdulewicz (1), K. Chrzanowska (1), K. Spodar (1),
I. Hansmann (2), M. Krajewska-Walasek (1)
(1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa
(2) Institut fur Humangenetik und Medizinische Biologie, MLU Halle-Wittenberg, Halle
Zespół Alagille’a (AGS, MIM 118450) jest wieloukładowym zespołem zaburzeń rozwojowych, charakteryzującym się
występowaniem nieprawidłowości w budowie wątroby, serca, kręgosłupa, narządu wzroku oraz typowym wyglądem
twarzy. AGS dziedziczy się w sposób autosomalny dominujący ze zmienną ekspresją objawów i występuje z częstością
1:70000 żywych urodzeń. Zespół Alagille’a wywołany jest mutacjami w genie JAG1, kodującym białko będące ligandem
dla receptora Notch, biorącego udział w silnie konserwowanym mechanizmie przekazywania sygnału między
komórkami. Celem badań było ustalenie molekularnego podłoża zespołu Alagille’a w populacji polskiej. Badaniami
objęto grupę 31 pacjentów z klinicznie rozpoznanym zespołem Alagille’a. Zidentyfikowano 16 różnych mutacji, w tym
12 nie opisywanych dotychczas w literaturze. Wykryto 7 mutacji zmieniających ramkę odczytu, 5 mutacji typu stop
kodon, 2 mutacje zaburzające wycinanie intronów i 4 mutacje powodujące zmianę informacji kodonów. Przewiduje
się, że większość zidentyfikowanych mutacji prowadzi do syntezy skróconego białka JAG1. Stwierdzono, że czterdzieści
procent mutacji występuje w egzonach 2 i 4, kodujących silnie konserwowane regiony białka JAG1. Pozostałe mutacje
są rozproszone wzdłuż całej kodującej sekwencji genu. Badania wykazały, że w tylko w trzech z jedenastu przebadanych
rodzin specyficzna mutacja została odziedziczona od rodziców, co wskazuje, że w większości przypadków mutacje
powstają de novo.
Badania były częściowo finansowane z Subsydium FNP nr 6/2000 i projektu KBN nr 3 PO5E12625.
P41.
Dziedziczna mutacja 657del5 w genie NBS1 w grupie pediatrycznych pacjentów
z chłoniakami złośliwymi.
Krystyna H. Chrzanowska (1), D. Piekutowska-Abramczuk (1), E. Popowska (1), A. Balcerska (3),
W. Balwierz (4), J. Bodalski (5), H. Bubała (6), A. Chybicka (2), A. Gadomski (7), M. Gajdulewicz (1),
A. Gaworczyk (8), M. Gładkowska-Dura (9), B. Kazanowska (2), M. Korzon (11), J. Kowalczyk (8),
M. Krajewska-Walasek (1), M. Krawczuk-Rybak (12), M. Kuźmicz (12), T. Luszawska-Kutrzeba (4),
L. Maciejka-Kapuścińska (3), J. Małdyk (13), M. Matysiak (7), D. Perek (14), R. Rokicka-Milewska (7),
D. Sońta-Jakimczyk (6), K. Spodar (1), M. Stolarska (5), K. Stefańska (10), M. Syczewska (15), T. Szczepański (6),
K. Sznurkowska (11), J. Wachowiak (10), A. Wakulińska (14), M. Wieczorek (16), E. Wyrobek (4), B. Zapolska (12)
(1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Pomnik-Centrum Zdrowia Dziecka, Warszawa
(2) Katedra i Klinika Onkologii i Hematologii Dziecięcej, AM, Wrocław
(3) Klinika Pediatrii, Hematologii, Onkologii i Endokrynologii, AM, Gdańsk
(4) Klinika Onkologii i Hematologii Dziecięcej, PA Instytut Pediatrii, CM UJ, Kraków
(5) Klinika Chorób Dzieci, UM, Łódź
(6) Katedra i Klinika Hematologii i Chemioterapii, ŚLAM, Zabrze
(7) Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii, AM, Warszawa
(8) Klinika Hematologii i Onkologii Dziecięcej, AM, Lublin
(9) Zakład Patologii, IP-CZD, Warszawa
(10) Klinika Hematologii i Onkologii Dziecięcej, AM, Poznań
(11) Klinika Pediatrii, Gastroenterologii, i Onkologii, AM, Gdańsk
(12) Klinika Onkologii Dziecięcej, SPDSK, AM, Białystok
(13) Zakład Patomorfologii, AM, Warszawa
(14) Klinika Onkologii Dziecięcej, IP-CZD, Warszawa
(15) Klinika Rehabilitacji Pediatrycznej, IP-CZD, Warszawa
(16) Oddział Hematologii i Onkologii, ChCPiR, Chorzów
Wstęp: Zespół Nijmegen (Nijmegen breakage syndrome; NBS) jest rzadkim schorzeniem, którego podłożem są
dziedziczne mutacje w genie NBS1. Produkt białkowy tego genu, nibryna, wchodzi w skład kompleksu N/M/R
uczestniczącego w naprawie dwuniciowych uszkodzeń DNA. W Polsce przyczyną wszystkich znanych zachorowań jest
homozygotyczna mutacja 657del5. Ponad 50% chorych z NBS zapada w młodym wieku na nowotwory, w szczególności
na nieziarnicze chłoniaki złośliwe (NHL) i ostre białaczki limfoblastyczne (ALL).
Cel badań: Celem badań było określenie częstości występowania mutacji genu NBS1 (657del5) w grupie pediatrycznych
47
Genetyka człowieka
pacjentów z NHL i ALL w Polsce.
Materiał i metody: Analizie poddano materiał uzyskany od 456 pacjentów z 12 ośrodków zintegrowanych w Polskiej
Pediatrycznej Grupie ds. Leczenia Białaczek i Chłoniaków Złośliwych. Genetyczne badania molekularne przeprowadzono
techniką PCR-SSCP. Źródłem genomowego DNA była sucha kropla krwi pobranej na bibułę.
Wyniki: W badanej grupie 456 chorych wykryto 5 heterozygotycznych nosicieli mutacji 657del5 (liczba oczekiwana
2,5), odpowiednio u 2/208 pacjentów z NHL i u 3/248 pacjentów z ALL. Przeprowadzone badania umożliwiły także
rozpoznanie 6 nowych przypadków zespołu Nijmegen.
Wnioski: Mutacja 657del5 występowała w badanej grupie około dwukrotnie częściej (1,1%) niż w populacji ogólnej
(0,56%). Wyjaśnienie potencjalnej roli zmutowanego genu NBS1 w patogenezie rozrostów z układu chłonnego u dzieci
młodzieży wymaga dalszych badań. Zidentyfikowanie 6 nowych chorych z NBS potwierdza wcześniejsze obserwacje
wskazujące, że nadal w znacznym odsetku przypadków rozpoznanie tego zespołu ustalane jest dopiero po wystąpieniu
nowotworu.
Pracę wykonano w ramach projektów finansowanych przez Komitet Badań Naukowych (nr 3P05A16622 oraz częściowo
PBZ-KBN-090/P05/17).
P42.
Analiza aberracji chromosomowych, częstości wymian chromatyd siostrzanych
(SCE) oraz częstości występowania mikrojąder w hodowli limfocytów od osób
z boreliozą.
Wanda Bratkowska (2), Henryk Stróżyński (1), Dobrosława Łopaczyńska (2), Anna Mordalska (2),
Daniela Dworniak (1), Jolanta Stróżyńska (2), Juliusz Kamerys (2), Tomasz Ferenc (2)
(1) Katedra i Klinika Chorób Zakaźnych Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
(2) Zakład Biologii i Genetyki Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Borelioza jest chorobą odzwierzęcą wywołaną przez krętek Borrelia burgdorferi, która rozprzestrzenia się za
pośrednictwem kleszczy. Hamowanie odpowiedzi komórkowej i udział limfocytów T w zjawiskach immunologicznych
może mieć znaczącą rolę w patogenezie tej choroby, jej ciężkiego i przewlekłego przebiegu. Jak do tej pory, nie
wykonywano badań cytogenetycznych i oceny ewentualnego działania genotoksycznego metabolitów w przebiegu
zakażenia boreliozą.
Materiał i metody: W pracy analizowano częstość aberracji chromosomowych i wymian chromatyd siostrzanych
(SCE) w metafazach uzyskanych z hodowli limfocytów krwi obwodowej od 11 osób z boreliozą (3 osoby z ostrą
i 8 osób z przewlekłą postacią boreliozy). Test mikrojądrowy z zastosowaniem cytochalazyny B w stężeniu 4,5 mg / ml
przeprowadzono w 72-godzinnej hodowli limfocytów krwi obwodowej. Od każdej osoby analizowano 1000 komórek
i oceniano częstość występowania komórek dwujądrowych i częstość występowania mikrojąder w tych komórkach.
Wyniki: Średni odsetek komórek z aberracjami wynosił 2,39%. Średnia liczba SCE przypadająca na jedną komórkę
wynosiła 6,25. Średnie wartości odsetka komórek z aberracjami i średnie wartości SCE nie różniły się istotnie
w porównaniu z kontrolą.Wyniki testu mikrojądrowego dla osób z boreliozą nie różniły istotnie w porównaniu
z kontrolą. Wstępne wyniki badań nie wykazały działania genotoksycznego metabolitów w przebiegu zakażenia
boreliozą.
P43.
Poziom MMP-1 oraz polimorfizmy regionu promotorowego genu MMP-1 w cukrzycy
typu 2 współistniejącej z chorobą naczyniowo-sercową.
Karolina Przybyłowska (1), Ireneusz Majsterek (1), Agnieszka Sikora (1), Jacek Kasznicki (2),
Józef Drzewoski (2), Janusz Błasiak (1)
(1) Katedra Genetyki Molekularnej, Uniwersytet Łódzki, Łódź
(2) Zakład Farmakologii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny, Łódź
Jednym z głównych powikłań towarzyszących cukrzycy jest choroba naczyniowo-sercowa, która związana jest
z aktywnością metaloproteaz macierzowych (MMP) sprzyjających rozwojowi miażdżycy. Celem pracy było określenie
związku między poziomem MMP-1 w krwi pacjentów z cukrzycą typu 2 (DM2) i rozwojem CHD, a także określenie
wpływu polimorfizmów regionu promotorowego genu MMP-1 na poziom MMP-1 i występowanie CHD. Analizowano
dwa polimorfizmy 1G/2G i A/G z wykorzystaniem metody RFLP przy użyciu enzymów restrykcyjnych odpowiednio
XmnI i KpnI. Do oceny poziomu MMP-1 wykorzystano test ELISA. Określono genotyp 115 pacjentów z DM2, wśród
których 66 miało CHD oraz 150 osób bez DM2 stanowiących grupę kontrolną. Wykazano znacząco wyższy poziom
MMP-1 w krwi pacjentów z DM2 w porównaniu z poziomem u osób z prawidłową przemianą glukozy. Wysoki poziom
48
Genetyka człowieka
MMP-1 dodatnio korelował z wysoką częstością allelu G polimorfizmu A/G u cukrzyków z CHD w porównaniu z grupą
kontrolną (OR 1.64; 95% PU (1.01; 2,65)). Wyniki badań wskazują, że DM2 jest związana z podwyższonym poziomem
MMP-1 w krwi, a allel G polimorfizmu A/G może wpływać na występowanie cukrzycy typu 2 współistniejącej z CHD.�
Praca finansowana z badań własnych: grant Uniwersytetu Łódzkiego nr 505/450 (KP, IM, JB) oraz z grantu Uniwersytetu
Medycznego w Łodzi nr 503-123-2 (JK, JD).
P44.
Familial acrocentric pericentromeric cryptic translocation 14;22 ascertained by
miscarriages.
Alina Teresa Midro (1), S. Langer (2, 3), B. Panasiuk (1), R. Leśniewicz (1), M. Speicher (2, 3)
(1) Department of Clinical Genetics, Medical University, Białystok, Poland
(2) Institut für Humangenetik, Technische Universität München, München, Germany
(3) Institut für Humangenetik, GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, Neuherberg, Germany
We describe a family in which several family members had recurrent miscarriages. Routine GTG and RBG banding
chromosomes in one family member revealed the presence of a de novo supernumerary marker chromosome (SMC).
To characterize this marker we used AcroM-FISH [Langer et al (2001) Hum Genet 109:152-158]. As most marker
chromosomes are derived from acrocentric chromosomes, AcroM-FISH uses a special probe mix consisting of painting
probes for all acrocentric chromosomes, centromere probes for chromosomes 13/21, 14/22, 22, 15, and a probe specific
for rDNA, each labeled with a specific combination of fluorochromes. The SMC was stained with the centromere probe
for chromosomes 13/21. There was no signal for the rDNA probe or for a painting probe and we described the marker
as der(13or21)(pter&reg;q10)(D13/21Z1+). However, we found in addition a rearranged chromosome 14, where the
centromeric region was found to be derived from chromosome 22. Acrocentric pericentromeric abnormalities were
recently found in high frequencies in couples with three or more miscarriages [Cockwell et al. (2003) Hum Genet 112:
298-302]. These abnormalities may be the underlying cause of recurrent miscarriages as they may result in abnormal
pairing configurations at meiosis. Therefore, we analyzed the patient’s mother who also had a history of recurrent
miscarriages. Using AcroM-FISH, we found the same t(14;22). Currently, we are analyzing other family members,
including the grandmother and siblings who have no history of recurrent miscarriages. If the t(14;22) segregates
together with the history of miscarriages, it could represent a further indication that cryptic acrocentric pericentromeric
abnormalities may represent a cause for miscarriages. AcroM-FISH appears to be an efficient approach to identify such
chromosomal changes and may be included in the work-up of couples after miscarriages.
P45.
Fenotyp niedosłuchu u pacjentów heterozygot złożonych dla mutacji w genie GJB2.
Jarosław Waligóra (1), Agata Skórka (1), Agnieszka Pollak (2), Małgorzata Mueller-Malesińska (2),
Rafał Płoski (3), Lech Korniszewski (1), Henryk Skarżyński (2)
(1) Klinika Diabetologii, Patologii Noworodka i Wad Wrodzonych Akademii Medycznej w Warszawie
(2) Instytut Fizjologii i Patologii Słuchu w Warszawie
(3) Katedra i Zakład Medycyny Sądowej Akademii Medycznej w Warszawie
Niedosłuch genetycznie uwarunkowany stanowi ok. 60% wszystkich przypadków niedosłuchu. Spośród genów których
mutacje powodują niedosłuch izolowany największe kliniczne znaczenie ma gen GJB2 kodujący koneksynę 26. Mutacje
w tym genie są odpowiedzialne w zależności od stopnia niedosłuchu za ok. 30 do 60% przypadków niedosłuchu
izolowanego. Najczęstszą mutacją powodującą niedosłuch w populacjach europejskich jest mutacja 35delG.
Na podstawie wcześniejszych badań ustalono że mutacja 314del14 jest drugą co do częstości mutacją genu GJB2 u osób
niesłyszących w populacji polskiej. Do wykrywania między innymi tej mutacji użyto metody polegającej na równoczesnej
amplifikacji części 12-72 oraz 306-464 regionu kodującego genu GJB2 przy użyciu znakowanych starterów. Uzyskane
produkty są następnie analizowane pod względem długości przy użyciu aparatu ABI 377.
Mutacja 314del14 została stwierdzona w 24 przypadkach pacjentów z niedosłuchem będących heterozygotami pod
względem mutacji 35delG. U jednego pacjenta mutacja 314del14 wystąpiła w postaci homozygotycznej. Według naszej
wiedzy jest to dotychczas pierwszy pacjent opisany pacjent z takim genotypem.
Zostały przeanalizowane badania audiologicznej pacjentów heterozygot złożonych 314del14/35delG pod kątem nasilenia
niedosłuchu, momentu wystąpienia niedosłuchu. U większości pacjentów niedosłuch był głębokiego i ciężkiego stopnia.
W pracy porównano fenetyp niedosłuchu pacjentów heterozygot złożonych 314del14/35delG do homozygot 35delG
w genie GJB2 oraz innych heterozygot złożonych.
49
Genetyka człowieka
P46.
Problemy diagnostyczne w cytogenetycznych badaniach prenatalnych.
Joanna Bogdanowicz, A. Ilnicka, B. Pawłowska, A. Tomankiewicz-Zawadzka, J. Czyżewska, J. Purzycka,
B. Sobiczewska, J. Zaremba
Zakład Genetyki, Instytut Psychiatrii i Neurologii Al. Sobieskiego 9, 02-957 Warszawa
Przedstawiamy 5 przypadków cytogenetycznych badań prenatalnych, w których do diagnozy aberracji chromosomowych
konieczne było zastosowanie metody FISH z wykorzystaniem sond malujących i subtelomerowych.
W pierwszym przypadku metodą prążkową stwierdzono obecność dodatkowego fragmentu na górnych ramionach
chromosomu 13. Po zastosowaniu techniki FISH z sondami malującymi okazało się, że pochodzi on z chromosomu 21.
Aberracja ta jest pochodzenia ojcowskiego. Stosując sondę 21q22 wykluczono trisomię regionu odpowiedzialnego za
zespół Downa. W tym przypadku mimo zastosowania FISH nie udało się ustalić, czy kariotyp płodu był zrównoważony,
a także czy ojciec posiadał zrównoważoną translokację.
W drugim przypadku stwierdzono translokację 6;12 de novo. Po zastosowaniu sond subtelomerowych okazało się, że
punkt pęknięcia na chromosomie 6 znajdował się dystalnie w stosunku do użytej sondy. Nie wiadomo więc, czy kariotyp
był zrównoważony.
W trzecim przypadku zastosowanie sond subtelomerowych było konieczne do ustalenia, czy stwierdzana u płodu
pochodzenia ojcowskiego translokacja 1;17 była zrównoważona. Punkt pęknięcia na chromosomie 17 znajdował się
blisko regionu subtelomerowego.
W czwartym przypadku badaniem prążkowym stwierdzono u płodu addycję na dolnych ramionach chromosomu 7.
Była ona jednak na tyle mała, że do ustalenia pochodzenia tego fragmentu konieczne było zastosowanie FISH. Okazało
się, że u płodu obecna jest niezrównoważona translokacja 4;7 pochodzenia matczynego.
W piątym przypadku sondy subtelomerowe zastosowano do diagnozy u płodu niezrównoważonej translokacji
pochodzenia matczynego.
Obecnie technika FISH jest coraz częściej wykorzystywana w prenatalnej diagnostyce cytogenetycznej. Okazuje się
jednak, że zastosowanie komercyjnie dostępnych sond molekularnych nie wystarcza do identyfikacji niektórych
mikroaberracji chromosomowych.
P47.
Diagnostyka genetyczna Toxoplasma gondii.
Adam Master (1) Karolina Świtaj (2), Magdalena Skrzypczak (1), Piotr Zaborowski (2), Andrzej Płucienniczak (1)
(1) Instytut Badań DNA
(2) Klinika Chorób Odzwierzęcych i Tropikalnych Instytutu Chorób Zakaźnych i Pasożytniczych Akademii Medycznej
w Warszawie
Toksoplazmoza jest chorobą wywoływaną przez pierwotniaka Toxoplasma gondii, bezwzględnego pasożyta
wewnątrzkomórkowego powszechnie zarażającego wiele ssaków w tym ludzi. W Polsce zarażeni stanowią ponad
59% populacji, a każdego roku odnotowuje się 200-400 przypadków toksoplazmozy wrodzonej. Ustalenie właściwego
rozpoznania choroby utrudnia jej skąpo– lub bezobjawowy przebieg i wymaga wykonania wielu badań diagnostycznych,
które mają znaczące ograniczenia. Jak dotąd nie ma wystandaryzowanej procedury szybkiego i pewnego wykrywania
zarażeń Toxoplasma gondii. Autorzy niniejszego doniesienia prezentują metodę genetycznej diagnostyki zarażeń
poprzez wykrywanie i analizę DNA pasożyta izolowanego bezpośrednio z krwi pacjenta. W badaniach zastosowano
techniką PCR w połączeniu z elektroforezą kapilarną i laserową detekcją fluorescencji. Identyfikacja pasożyta oparta
jest na wykrywaniu sekwencji wielokopijnych genów B1 (35 kopii/genom) oraz 529 bp (200-300 kopii/genom), wysoce
specyficznych dla Toxoplasma gondii. Szczegółowa charakterystyka pasożyta bazuje na analizie genetycznej fragmentów
genu GRA6, HSP70 oraz wybranych sekwencji STR, wykazujących polimorfizm determinujący przynależność do
określonego szczepu. Metodę przetestowano na próbkach kontrolnych: zawiesiny płynu otrzewnowego pobranego od
myszy zarażonych szczepem RH Toxoplasma gondii (kontrola pozytywna) oraz wymazu z jamy ustnej niemowlęcia,
u którego matki nie stwierdzono obecności przeciwciał przeciwko pasożytowi (kontrola negatywna). W kontroli
pozytywnej wykryto produkty specyficzne dla sekwencji B1 oraz 529 bp o oczekiwanej długości, natomiast analiza
produktów PCR ze starterami specyficznymi dla GRA6 i HSP70 wykazała obecność fragmentów o długości
charakterystycznej dla szczepu RH. W próbce kontroli negatywnej nie wykryto żadnych produktów PCR. Wstępne
badania próbek pełnej krwi obwodowej pacjentów, u których toksoplazmozę podejrzewano lub stwierdzono
w oparciu o testy immunologiczne wykazały obecność DNA pasożyta. Uzyskane wyniki świadczą o przydatności
metody do wczesnej, szybkiej, swoistej, czułej i jednoznacznej diagnostyki zarażeń wywoływanych przez Toxoplasma
gondii i jej potencjalnym szerokim zastosowaniu w medycynie i weterynarii nie tylko w zwalczaniu, ale i badaniach
przesiewowych.
50
Genetyka człowieka
P48.
Mutacje w genie AIRE wśród polskich pacjentów z zespołem poliendokrynopatii
typu 1 (APS1, APECED).
Rafał Płoski (1), L. Korniszewski (2), B. Stolarski (1), E. Rowińska (3) , M. Gremida (3) i E. Pronicka (3)
(1) Pracownia Genetyki Molekularnej Człowieka Zakładu Medycyny Sądowej i Klinki Diabetologii i
Wad Wrodzonych Akademii Medycznej w Warszawie
(2) Klinika Diabetologii, Patologii Noworodka i Wad Wrodzonych Akademii Medycznej w Warszawie
(3) Odział Chorób Metabolicznych Kliniki Pediatrii Instytut „Pomnik– Centrum Zdrowia Dziecka”
APS1 (APECED) jest rzadkim genetycznie uwarunkowanym zespołem zaburzeń układu odpornościowego (dziedziczony
w sposób autosomalny recesywny). Do typowych objawów schorzenia należą uporczywa grzybica, autoimmunologicznie
uwarunkowana niewydolność przytarczyc oraz choroba Addisona. Ostatnio wykazano, że APECED jest spowodowany
mutacjami w genie AIRE, którego produkt warunkuje ektopową ekspresję antygenów obwodowych w grasicy, co jest
istotne dla rozwoju tolerancji immunologicznej.
Celem pracy była oparta na bezpośrednim sekwencjonowaniu regionu kodującego analiza mutacji w genie AIRE wśród
polskich pacjentów (N=14), u których rozpoznano APECED w oparciu o standardowe kryteria (obecność dwóch
spośród ww. typowych zaburzeń).
Stwierdzone mutacje pokazano w tabeli poniżej (numeracja zgodna z sekwencją cDNA bazy ENSEMBL – www.ensembl.
org).
Mutacje
[R257>X] + [R257>X]
[R257>X] + [M1>L]
[R257>X] + [1058delT]
[R257>X] + [IVS1+5Gdel]
[R257>X] + [S278>R]
[1094-1104del13] + [?]
[R303>P] + [?]
Liczba
pacjentów
7
1
1
1
2
1
1
Uwagi
mutacja częsta w innych populacjach
nowa mutacja
nowa mutacja
prawdopodobnie zaburza splicing
frameshift
mutacja częsta w innych populacjach
nowa mutacja
Przedstawione wyniki wskazują, że w Polsce dominuje częsta w innych populacjach mutacja R257X (68% alleli).
Interesujące jest także występowanie w naszej populacji 3 nieopisanych wcześniej mutacji. Obecność tylko jednej
patogennej (1094-1104del13) lub potencjalnie patogennej (R303>P) mutacji u 2 pacjentów sugeruje możliwość
występowania mutacji w AIRE także poza regionem kodującym.
P49.
Rodzinna zbalansowana translokacja t(13;14).
Rafał Dmowski, Jerzy R. Kowalczyk, Anna Gaworczyk, Bariusz Babicz, Monika Lejman
Pracownia Cytogenetyczna Dziecięcego Szpitala Klinicznego w Lublinie, Klinika Hematologii i Onkologii Klinicznej,
[email protected]
Trisomia chromosomu 13 jest jedną z lepiej poznanych anomalii cytogenetycznych. Częstość jej występowania
u noworodków wg różnych autorów zawiera się w przedziale pomiędzy 1:4000 a 1:12000.
Narodziny dziecka z trisomią chromosomu 13 są dużym obciążeniem dla rodziców – dzieci te rodzą się z deformacjami
ciała, wadami narządów wewnętrznych oraz upośledzeniem umysłowym. Do najczęstszych anomalii fenotypowych
w tym zespole należą: wady oczu, nisko osadzone i zdeformowane małżowiny uszne, rozszczep warg i podniebienia,
polidaktylia, rzadziej: wąskie paznokcie, przepuklina pępkowa, niedorozwój moszny i wnętrostwo u chłopców.
Z wad narządów wewnętrznych do najczęstszych należą: wady serca, dodatkowa śledziona, anomalie układu
moczowo-płciowego oraz dwurożna macica u dziewczynek. Długość życia jest krótka – blisko 15% dzieci umiera
w okresie pierwszego miesiąca życia a 90% w ciągu pierwszego półrocza.
W 80% przypadków trisomia charakteryzuje się obecnością dodatkowego wolnego chromosomu 13, a w 20% obecny
jest mozaicyzm lub trisomia związana z translokacją zbalansowaną. Najczęściej jest to translokacja Roberts’onowska
t(13;grupa D) i może występować de novo lub być przekazywana przez jednego z rodziców.
W pracy przedstawiamy opis rodziny trójpokoleniowej z aberracjami chromosomowymi stwierdzanymi w badaniu
cytogenetycznym metodą prążków G:
51
Genetyka człowieka
Pokolenie 1:
1. Pacjent 1 – płci męskiej, kariotyp: 45, XY, t(13;14) – zdrowy
Pokolenie 2:
2. Pacjentka 2 – płci żeńskiej, córka pacjenta 1, kariotyp: 45, XX, t(13;14) – zdrowa
3. Pacjentka 3 – płci żeńskiej, córka pacjenta 1, kariotyp: 45, XX, t(13;14) – zdrowa
Pokolenie 3:
4. Pacjent 4 – płci żeńskiej, córka pacjentki 2, kariotyp: 46, XX – zdrowa
5. Pacjent 5 – płci męskiej, syn pacjentki 2, kariotyp: 45, XY, +13, t(13;14) (q10;q10)/47, XY, +13 – fenotypowe cechy
trisomii 13 – dziecko zmarło.
6. Pacjent 6 – płci męskiej, syn pacjentki 3, kariotyp: 46, XY – zdrowy
Fenotypowe cechy charakterystyczne dla zespołu trisomii 13 obserwowane są również u pacjentów z innymi aberacjami
chromomowymi niż czysta trisomia 13, a nosicielstwo translokacji t(13;14) nie wyklucza możliwości urodzenia dziecka
z prawidłowym kariotypem.
P50.
Oszacowanie wielkości prawdopodobieństwa urodzenia dziecka
z niezrównoważonym kariotypem u nosicieli translokacji chromosomowych
wzajemnych z udziałem krótkiego ramienia chromosomu 4.
Barbara Panasiuk (1), A. Spółczyńska (2), A. Sawicka (1), A. T. Midro (1)
(1) Zakład Genetyki Klinicznej AM, Białystok
(2) Studenckie Koło Naukowe przy Zakładzie Genetyki Klinicznej AM, Białystok
Gromadzenie danych empirycznych z rodowodów nosicieli translokacji chromosomowych wzajemnych (TCW) ma na
celu uzyskanie informacji do oszacowania indywidualnego ryzyka genetycznego (urodzenia dziecka z niezrównoważonym
kariotypem prowadzącym do wad wrodzonych, ryzyko ciąż obumarłych/ wczesnych zgonów noworodków i ryzyko
poronień samoistnych). Celem pracy jest określenie ryzyka u nosicieli translokacji chromosomowych wzajemnych
z udziałem krótkiego ramienia.
W grupie 150 ciąż z 47 rodzin należących do 25 rodowodów nosicieli TCW, wyselekcjonowanych ze 139 TCW określono
wskaźniki ryzyka genetycznego po segregacji 2:2 rozdziale przyległym typu 1 metodą wg Stengel-Rutkowski i wsp.
z uwzględnieniem korekty oszacowania wg Stene. Stwierdzono mniejsze wartości prawdopodobieństwa urodzenia
dziecka z niezrównoważonym kariotypem u żeńskich nosicieli (3,2±3,3%, 1/ 31) niż u męskich (19,6±5,8%, 11/ 89).
Uzyskano większe wartości ryzyka urodzenia dziecka z niezrównoważonym kariotypem (33,3±15,7%, 3/ 9) w przypadku
segmentu krótszego: 4p15→pter, natomiast mniejsze (4,8±4,6%, 2/ 21) dla segmentu dłuższego 4p11→pter. Ryzyko
poronień samoistnych było mniejsze (<5,4%, 0/ 9) dla segmentu krótszego: 4p15→pter natomiast większe (9,4±6,4%,
2/ 21) dla segmentu dłuższego: 4p11→pter. Stwierdzono mniejsze prawdopodobieństwo (11,1±10,5%, 1/ 9) martwych
urodzeń wczesnych zgonów noworodków w przypadku krótszego segmentu: 4p15→pter, większe (42,8±10,8%, 9/ 21)
dla segmentu dłuższego 4p11→pter. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że ryzyko zależy od czasu
trwania ciąży, płci nosiciela i wielkości segmentu chromosomowego. Uzyskane wskaźniki zastosowano do określenia
indywidualnego ryzyka genetycznego u nosicieli TCW z udziałem krótkiego ramienia chromosomu 4.
P51.
Frequency of occurrence of 3849+10kb C>T mutation in Polish CF patients is
significantly higher than in most of other populations.
Kamila Czerska, A. Sobczyńska-Tomaszewska, J. Bal
Instytut Matki i Dziecka, ul. Kasprzaka 17A, 01-211 Warszawa, Polskie Towarzystwo Genetyki Człowieka
The 3849+10kb C>T mutation belongs to the group of splicing CFTR gene defects. It creates a partially active splice site
in intron 19 that can lead to the insertion of a new 84-bp cryptic exon containing an in-frame stop codon. This mutation
has been found to be associated with a milder form of disease manifestation. Patients carrying this mutation in one
allele are characterised by: better nutritional status, older age of onset, normal or slightly elevated chloride values (in
comparison to homozygotes for delF508 mutation).
Till now there have been 30 CF patients genotyped in our laboratory who have 3849+10kb C>T mutation in at least one
allele of CFTR gene. There are 26 patients in this group with genotype: 3849+10kb C>T / delF508. There are also two
patients who are homozygotes for 3849+10kb C>T mutation, whose clinical data are being currently collected. They are
members of two unrelated families. This genotype is very rare in Poland and in the world. In case of the other patients
second mutation has been also identified.
52
Genetyka człowieka
5 patients are carriers of this mutation in one allele and any other mutation in second allele has not been found.
Mutation 3849+10kb C>T is found in Polish population with frequency of 3,9% of CF alleles which places this mutation
at second position after delF508 (53%).
In comparison to the frequency in world population (0,2%) it`s significantly higher score. That is why the identification
of this mutation is a part of the routine diagnostics provided by our laboratory.
P52.
Częstość występowania heterozygotycznych nosicieli mutacji 657del(5) w genie
NBS1 w populacji województwa wielkopolskiego.
Maria Mosor, Iwona Ziółkowska, Jerzy Nowak
Instytut Genetyki Człowieka, Polskiej Akademii Nauk, Strzeszyńska 32, Poznań
Homozygoty germinalnej mutacji 657del5 w genie NBS1 rozwijają zespół Nijmegen. Do podstawowych objawów
klinicznych zespołu zalicza się małogłowie, zaburzenia wzrostu, niedobór odporności. Zespołowi temu towarzyszy
zwiększona predyspozycja do rozwoju nowotworów złośliwych w młodym wieku. Również u heterozygotycznych
nosicieli mutacji 657del5 występuje zwiększone ryzyko rozwoju nowotworu. Celem naszych badań było określenie
częstości występowania heterozygotycznych nosicieli mutacji 657del5 w genie NBS1 w populacji województwa
Wielkopolskiego. Materiałem do badań były próbki DNA wyizolowane z anonimowych, niewykorzystanych bibuł
Guthriego. Przeanalizowano 2090 bibuł z całego województwa poprzez zastosownaie analizy fragmentów DNA na
automatycznym sekwenatorze ALFExpress. W związku z tak dużą liczbą próbek, zaprojektowano 2 startery reverse
dające produkty różniące się wielkością 50 pz. Umożliwiło to równoległą analizę podwojonej liczby prób. Próbki ze
zmienionym wzorem zostały zsekwencjonowane. W grupie tej zidentyfikowano 14 nosicieli mutacji 657del5, co daje
częstość 1/149. Jest to częstość wyższa aniżeli ustalona wcześniej (1/190) dla populacji zamieszkującej inne obszary
Polski. Zaobserwowano również terytorialne zróżnicowanie częstości nosicieli. W 464 próbach z obszarów wschodnich
województwa znaleziono 6 heterozygot mutacji 657del5 (1/77). W powiatach południowych nie zidentyfikowano
żadnego nosiciela wśród 625 badanych próbek.
Uzyskane wyniki wskazują na stosunkowo częste występowanie (1/149) heterozygot mutacji 657del5 w województwie
Wielkopolskim, co może być czynnikiem zwiększonego ryzyka rozwoju chorób nowotworowych w tym obszarze.
P53.
Mutacje i polimorfizmy w genie glukokinazy u ciężarnych z cukrzycą typu MODY.
Magdalena Żurawek (1), E. Wender-Ożegowska (2), D. Januszkiewicz- Lewandowska (1, 3), A. Zawiejska (2),
J. Nowak (1)
(1) Instytut Genetyki Człowieka PAN
(2) Klinika Położnictwa i Chorób Kobiecych AM
(3) Klinika Onkologii, Hematologii i Transplantologii Pediatrycznej AM Poznań
MODY (Maturity–Onset Diabetes of the Young) to klinicznie i genetycznie zróżnicowana postać cukrzycy typu II
o autosomalnie dominującym sposobie dziedziczenia charakteryzująca się rozwojem przed 25 rokiem życia oraz
możliwością wyrównania glikemii bez użycia insuliny przez okres dłuższy niż dwa lata. Wyróżnia się 6 typów MODY
o różnej lokalizacji defektu genetycznego. Najczęściej spotykana jest postać MODY 2, zwłaszcza u kobiet z cukrzycą
ciążową i dzieci z łagodną hiperglikemią. Związana jest z mutacjami w genie kodującym glukokinazę (GCK) – enzym
szlaku glikolitycznego. Celem badań było określenie częstości mutacji i polimorfizmów w genie GCK w grupie
ciężarnych z cukrzycą ciążową, spełniających następujące kryteria: wiek poniżej 35 roku życia, indeks masy ciała poniżej
25, niewielki wzrost glikemii w dwugodzinnym teście obciążenia glukozą (poniżej 3 mmol/l), występowanie cukrzycy
u krewnych pierwszego stopnia lub cukrzycy ciążowej w rodzinie. Do wykrywania zmian w genie GCK wykorzystano
analizę polimorfizmu konformacji jednoniciowego DNA oraz sekwencjonowanie metodą dideoksy. W grupie 130
pacjentek u 10 (~8%) wykryto trzy nie opisane wcześniej zmiany w regionach kodujących genu GCK: Y215Y, E312Q,
GfsinsG, jedną znaną mutację S383L oraz trzy zmiany w sekwencjach intronowych: IVS2-12C>T, IVS3-8G>A, IVS713A>G. Na podstawie uzyskanych wyników należy stwierdzić, że mutacje w genie GCK stosunkowo rzadko występującą
u ciężarnych z cukrzycą typu MODY.
53
Genetyka człowieka
P54.
Mutacje w genach DNAI1 i DNAH5 u polskich chorych z pierwotną dyskinezą rzęsek
i/lub zespołem Kartagenera.
Maciej Geremek, E. Ziętkiewicz, E. Rutkiewicz, J. Borowski, K. Modrzyńska, J. Pilc, U. Skrzypczak,
K. Więckiewicz i M. Witt
Zespół Genetyki Molekularnej i Klinicznej, Instytut Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu
Pierwotna dyskineza rzęsek (primary ciliary dyskinesia, PCD) jest chorobą, u której podstaw leżą zaburzenia struktury
i funkcji aparatu rzęskowego. W około połowie przypadków dodatkowym objawem jest całkowite przełożenie trzewi
(wtedy – zespół Kartagenera, KS). PCD/KS cechuje duża heterogenność genetyczna; dziedziczenie w większości
autosomalne recesywne. Dwa geny, których rola w patogenezie choroby została potwierdzona, to geny dynein, DNAI1
(9p13-21) oraz DNAH5 (5p15.2). Kodują one łańcuchy dyneiny aksonemalnej (odpowiednio, średni typu 1 i ciężki typu
5) wchodzące w skład ramion dyneinowych, ważnego elementu ultrastruktury rzęsek.
W ramach niniejszej pracy poszukiwano mutacji (SSCP, sekwencjonowanie) w tych genach u ponad 80 pacjentów
z polskich rodzin z PCD/KS. Przebadano 15 spośród 20 eksonów genu DNAI1; u jednego pacjenta potwierdzono
obecność najczęściej opisywanej w literaturze mutacji tego genu, w intronie 1 (w połączeniu z inną, niescharakteryzowaną
jeszcze mutacją w eksonie 1); u innego pacjenta wykryto homozygotyczną substytucję w eksonie 17; potwierdzono też
dwa opisane wcześniej częste polimorfizmy w eksonach 1 i 11. W genie DNAH5 przebadano 9 spośród 79 eksonów,
w których w literaturze opisano mutacje u chorych z PCD/KS. Stwierdzono obecność zarówno rzadkich wariantów
(heterozygotyczny wzór migracji u pojedynczych pacjentów) jak i częstych polimorfizmów. Na 11 opisanych w literaturze
mutacji, potwierdzono tylko jedną substytucję w eksonie 34, powodującą zmianę ramki odczytu i wprowadzającą
przedwczesny kodon stop. Znaleziono dwie nowe mutacje powodujące przedwczesną terminację translacji (w eksonach
32 i 62) oraz dwie nowe substytucje (w eksonach 34 i 53). Spośród siedmiu substytucji nie zmieniających kodowanego
białka, cztery są powszechnie występującymi polimorfizmami. Badania dodatkowych 7 eksonów są w toku. Uzyskane
wyniki potwierdzają pogląd o heterogenności genetycznej PCD oraz wskazują na dużą heterogenność alleliczną zmian
w genie DNAH5.
Granty KBN 3P05E 01923 (MW), 3P05E 03824 (EZ).
P55.
Biometria nosa płodu w drugim trymestrze ciąży.
Lech Dudarewicz
Zakład Genetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi
Cel pracy: Ustalenie optymalnych warunków oceny nosa płodu w drugim trymestrze ciąży oraz określenie zakresu
prawidłowej zmienności badanych parametrów. Wstępna ocena przydatności biometrii nosa dla badań przesiewowych
w kierunku aneuploidii płodu, przez porównanie płodów z liczbowymi aberracjami chromosomowymi z grupą płodów
zdrowych.
Materiał: Ultrasonograficzne pomiary długości kości nosowych oraz szerokości nosa u płodów zdrowych oraz płodów
z liczbowymi aberracjami chromosomowymi.
Wyniki: Określono wpływ wieku ciążowego oraz położenia płodu na badane parametry biometryczne oraz opisano
zakres ich fizjologicznej zmienności. Stwierdzono skrócenie kości nosowych oraz poszerzenie nosa w grupie płodów
z trisomią 21, lecz mała liczebność grupy badanej nie pozwala na wyciągnięcie statystycznie uzasadnionych wniosków.
Wniosek: Biometria nosa płodu wydaje się być wartościowym markerem trisomii 21 w drugim trymestrze ciąży,
wymagającym dalszych badań.
Badania były finansowane w oparciu o grant KBN nr 3 PO5E 156 22.
54
Genetyka człowieka
P56.
Analiza wskazań do diagnostyki przedurodzeniowej w przypadkach zespołu
Turnera.
Grzegorz Nowicki (1), Wojciech Ałaszewski (1), Katarzyna Janiak (2), Maria Respondek-Liberska (2),
Dariusz Borowski (3), Magdalena Kozłowska(1), Wanda Hawuła (1), Lucjusz Jakubowski (1)
(1) Zakład Genetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki
(2) Zakład Diagnostyki i Profilaktyki Wad Wrodzonych I CZMP
(3) Zakład Ultrasonografii Ginekologiczno-Położniczej I CZMP�
Analiza wyników badań cytogenetycznych wykonanych w ramach inwazyjnej diagnostyki przedurodzeniowej
w materiale Zakładu Genetyki ICZMP, pozwoliła na wykazanie zadziwiająco często rozpoznawanego zespołu Turnera
(ZT) w postaci monosomii 45,X, mozaikowej czy izochromosomu w stosunku do całkowitej liczby badań i innych
typów aberracji chromosowowych.
Wśród klasycznych wskazań do wykonania inwazyjnej diagnostyki przedurodzeniowej najczęstszym jest wiek
pacjentki. Dynamiczny rozwój ultrasonografii położniczej sprawił, że coraz częściej i stosunkowo wcześnie rozpoznaje
się zmiany rozwojowe płodu określane jako ultrasonograficzne markery genetyczne, sugerujące występowanie chorób
uwarunkowanych genetycznie. Mogą one być wskazaniem do wykonania inwazyjnej diagnostyki prenatalnej.
W prezentowanej pracy przeanalizowano wskazania do diagnostyki przedurodzeniowej, w wyniku której rozpoznano
ZT.
Analizowano badania płynu owodniowego lub krwi pępowinowej przeprowadzone w Zakładzie Genetyki I CZMP
w latach 1992-2004. W okresie tym na wykonanych ogółem 2327 badań rozpoznano przedurodzeniowo 28 przypadków
monosomii 45,X (w tym 2 rozpoznane po przeprowadzeniu kordocentezy), 3 przypadki kariotypu mozaikowego
45,X/46,XX oraz 2 przypadki kariotypu 46,X,i(X)(q10).
U 24 ciężarnych (86% rozpoznanych przypadków) wskazaniem do diagnostyki przedurodzeniowej był nieprawidłowy
obraz ultrasonograficzny płodu, a wiek ciężarnej jedynie w 4 przypadkach (14%).�
Najczęściej powtarzającymi się zmianami w obrazie usg były: uogólniony obrzęk płodu, obrzęk w obrębie główki płodu,
torbiel szyjna (hygroma colli). Do rzadziej występujących wad towarzyszących należy zaliczyć wady serca, wodobrzusze,
płyn w klatce piersiowej, wodonercze.
Wynik analizy wskazuje, że obraz usg płodu jest zasadniczym wskazaniem do wykonania inwazyjnej diagnostyki
przedurodzeniowej w kierunku ZT. Droga ta pozwala również na postępowanie różnicujące w przypadkach obrzęku
płodu pochodzenia immunologicznego czy infekcyjnego
P57.
Analiza sprzężeń wskazuje na obecność genu zespołu Kartagenera
w chromosomie 15.
Maciej Geremek (1), E. Ziętkiewicz (1), D. F. Wyszynski (3), M. Khoshnevisan (3), C. Sun (3), S. Wang (3),
Y. J. Zhang (3), E. Rutkiewicz (1), J. Pawlik (4), A. Kapellerova (5), S. R. Diehl (3), Michał Witt (1, 2)
(1) Zespół Genetyki Molekularnej i Klinicznej, Instytut Genetyki Człowiek PAN, Poznań
(2) Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej, Warszawa
(3) National Institute of Dental and Craniofacial Research, NIH, Bethesda, USA
(4) Instytut Grużlicy i Chorób Płuc, Rabka
(5) II Klinika Pediatrii Uniwersytetu w Bratysławie
Pierwotna dyskineza rzęsek (ang. primary ciliary dyskinesia, PCD) jest chorobą dziedziczną, u której podstaw leżą
zaburzenia struktury i funkcji aparatu rzęskowego. Na obraz kliniczny choroby składają się nawracające infekcje
dróg oddechowych, zapalenie zatok, rozstrzenie oskrzeli i często bezpłodność męska. W około połowie przypadków
dodatkowym objawem jest całkowite przełożenie trzewi (situs inversus) – tę formę choroby określa się jako zespól
Kartagenera (ang. Kartagener syndrome, KS). PCD dziedziczy się w większości przypadków jako choroba autosomalna
recesywna. Pierwotna dyskineza rzęsek jest choroba genetycznie heterogenną. Jak dotąd poznano dwa geny
odpowiedzialne za pojawienie się choroby. Mutacje w tych genach nie wyjaśniają jednak większości przypadków.
Grupa badana obejmująca 70 rodzin, została podzielona na rodziny z zespołem Kartagenera (51 rodzin,
168 genotypowanych członków, 61 chorych) i rodziny z PCD bez przełożenia trzewi (19 rodzin, 52 genotypowanych
członków,22 chorych).
Przy pomocy zestawu 462 markerów mikrosatelitarnych szukano markerów genomowych sprzężonych z chorobą.
Maksymalny wynik LOD równy 3.16 uzyskano w rodzinach z zespołem Kartagenera, dla markera D15S205
zlokalizowanego w chromosomie 15. Badanie pogłębiono używając 65 mikrosatelit rozmieszczonych w ramieniu
55
Genetyka człowieka
długim chromosomu 15.Uzyskany wynik LOD = 4.22 dla markera D15S154 oraz wstępna analiza wielopunktowego
sprzężenia wskazały na obszar 4.8 cM miedzy markerami D15S1037 i D15S189 jako potencjalnie zawierający locus
choroby. Ujemny wynik LOD (podwójny jak i wielopunktowy) w rodzinach bez odwrócenia trzewi wykluczył sprzężenie
z chromosomem 15 w tej grupie. Trwa analiza genów znajdujących się w otoczeniu markera D15S154,w celu wyłonienia
najbardziej prawdopodobnych kandydatur na geny związane z patogenezą zespołu Kartagenera.
Grant KBN 3P05E 01923 (MW).
P58.
Bakteryjny model w badaniach ludzkich mutacji – badania in vivo na przykładzie
polimorfizmu genu MTHFR.
Joanna Jakóbkiewicz-Banecka (1), Anna Kloska (1), Magdalena Stepnowska (2), Bogdan Banecki (3),
Alicja Węgrzyn (4), Grzegorz Węgrzyn (1)
(1) Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański
(2) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki, Akademia Medyczna w Gdańsku
(3) Katedra Biologii Molekularnej i Komórkowej, Wydział Biotechnologii UG-AMG
(4) Instytut Biochemii i Biofizyki, PAN, Gdańsk�
Homocysteina jest intermediatem w szlaku biosyntezy takich aminokwasów jak metionina i cysteina. W metabolizm
homocysteiny zaangażowane są trzy enzymy – reduktaza metylenotetrahydrofolianowa (MTHFR), syntaza metioninowa
(MS) oraz beta-syntaza cystationiny (CBS). Deficyty w aktywności któregoś z enzymów szlaku mogą być przyczyną
hiperhomocysteinemii, a ta jest jednym z czynników ryzyka chorób sercowo-naczyniowych, w tym udarów mózgu.
Aktywność enzymów tego szlaku zależy od witamin z grupy B (B2, B6, B12, kwas foliowy), które pełnią rolę kofaktorów.
Szereg doniesień wskazuje na znaczącą rolę witamin z grupy B w obniżaniu poziomu homocysteiny we krwi.
W populacji ludzkiej zidentyfikowano dwa powszechne polimorfizmy genu MTHFR. Jeden z nich to polimorfizm C677T
(Ala222Val) powiązany z temperaturowrażliwością reduktazy MTHFR oraz spadkiem aktywności enzymu nawet o 60%.
Reduktaza metylenotetrahydrofolianowa z Escherichia coli (MetF) wykazuje wysoki stopień homologii względem
ludzkiej reduktazy MTHFR, a mutacja C530T (Ala177Val) w bakteryjnym genie metF jest analogiczna do mutacji
C677T ludzkiego genu MTHFR. Dlatego też skonstruowaliśmy bakteryjny system, który umożliwiałby zbadanie efektów
fenotypowych tej mutacji oraz opracowanie potencjalnej terapii witaminowej chorych z hiperhomocysteinemią.
W celu zbadania funkcji dwóch wariantów reduktazy skonstruowaliśmy szczep z delecją chromosomalnej kopii genu
metF (szczep ten jest auksotrofem metioninowym) oraz serię plazmidów niosących gen metF „dzikiego” typu lub gen
metF177 (z mutacją punktową C530T) pod kontrolą różnych promotorów (plac, ptet, para). Następnie skonstruowaliśmy
szereg merozygotycznych szczepów E. coli, niosących różne kombinacje alleli genu metF na plazmidach. Szczepy te miały
symulować różne sytuacje diploidalnej komórki człowieka niosącej dwa allele genu MTHFR. Wyniki przeprowadzonych
doświadczeń in vivo potwierdziły, że wariant Ala177Val reduktazy MetF, charakteryzuje się znacznie obniżoną
aktywnością oraz temperaturowrażliwością. Wykazaliśmy także, że suplementacja witaminami z grupy B wywiera
znaczący wpływ na wzrost aktywności defektywnej reduktazy MetF oraz znosi temperaturowrażliwy fenotyp enzymu.
Charakterystyka ludzkiego polimorfizmu C677T genu MTHFR przeprowadzona na modelu bakteryjnym wykazała
istotną przydatność tego systemu w badaniu efektów fenotypowych mutacji w ludzkich genach. System ten dodatkowo
pozwolił określić wpływ witamin z grupy B na znoszenie skutków fenotypowych badanej mutacji.
P59.
Analiza molekularna genów związanych z metabolizmem homocysteiny u chorych
z niedokrwiennym udarem mózgu.
Joanna Jakóbkiewicz-Banecka (1), Leszek Kadziński (1), Zyta Banecka-Majkutewicz (2), Wojciech Sawuła (3),
Bogdan Banecki (3), Alicja Węgrzyn (4), Grzegorz Węgrzyn (1), Walenty Nyka (2)
(1) Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański
(2) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki, Akademia Medyczna w Gdańsku
(3) Katedra Biologii Molekularnej i Komórkowej, Wydział Biotechnologii UG-AMG
(4) Instytut Biochemii i Biofizyki, PAN, Gdańsk�
Udary mózgu są jedną z najczęstszych przyczyn zgonów na świecie. Wyższą zapadalność na udary notuje się m. in. wśród
osób starszych oraz wśród mężczyzn. Poza tym istnieje szereg czynników ryzyka, które predysponują do zachorowania
na udar. Jednym z niezależnych czynników ryzyka niedokrwiennego udaru mózgu jest hiperhomocysteinemia, czyli
podwyższone stężenie we krwi homocysteiny – produktu pośredniego w metabolizmie metioniny. Dwa spośród szeregu
enzymów uczestniczących w metabolizmie metioniny, reduktaza metylenotetrahydrofolianu (MTHFR) oraz beta-
56
Genetyka człowieka
syntaza cystationiny (CBS) zdają się mieć istotne znaczenie w utrzymaniu prawidłowego stężenia homocysteiny we
krwi. Mutacje pojawiające się w genach kodujących powyższe enzymy, mogą powodować wzrost stężenia homocysteiny
we krwi i w konsekwencji doprowadzić do wystąpienia udaru. Celem niniejszych badań było określenie częstości
występowania dwóch mutacji w genie CBS (D22 w eksonie 4; T833C/ins68 w eksonie 8) i dwóch w genie MTHFR
(C677T w eksonie 4; A1298C w eksonie 7) oraz zbadanie zależności pomiędzy tymi mutacjami a zachorowalnością
na niedokrwienny udar mózgu. Badania nie wykazały znamiennego statystycznie związku pomiędzy występowaniem
mutacji w genach CBS i MTHFR a zachorowalnością na niedokrwienny udar mózgu. Wykazano natomiast powiązanie
zachorowalności na niedokrwienny udar mózgu z podniesionym poziomem homocysteiny (p=0,000001) oraz
zaobserwowano występowanie korelacji pomiędzy stężeniem homocysteiny we krwi a typem mutacji w pozycji 677
genu MTHFR (p=0,0464).
Wykłady plenarne:
W28.
Future trends in medical genetics.
Pier Franco Pignatti
Section of Biology and Genetics University of Verona, Italy
[email protected]
Medical genetics has greatly profited from recent advances in the human genome project with the identification of
several disease genes and haplotypes, and with the provision of new methods for rapid molecular genetic analysis.
The future holds promise for increased biological knowledge, and for practical health applications in the field of
monogenic diseases with the identification of new disease genes, genetic modifiers, and their mechanism of action,
and in the field of mutifactorial phenotypes with the identification of susceptibility genes and environmental factors,
predictive genetic testing, and the development of new therapeutic approaches (1).
Genetic testing will become increasingly important in disease prevention, clinical management, and drug treatment.
These advancements will change medical practice and the formation of physicians in order to obtain the potential
benefits of genomic-based medicine. The final proof of an effective transfer of this progress from the laboratory to affect
people’s lives will be in the verification that the genetic test results will motivate a behavioural change in the persons who
have undergone testing (2).
The talk will delineate possible trends in medical genetics examining the area of complex diseases at first, then the area
of pharmacogenetics, in order to conclude with a perspective on the development of predictive genetic tests.
A brief description will be given of cardiovascular disease genetics, with a demonstration of the possible use of testing
for genetic polymorphisms in several disease related genes, and the practical measures that could be taken when found
to be at increased risk, as for hyperhomocysteinemia in hypofolatemic individuals with the MTHFR 677 C/T or T/T
genotype (3) or for miocardial infarction in coronaropathic smoking individuals with the PON2 311 Cys/Cys genotype
(4).
A pharmacogenetic summary will then be given, with examples of genes for drug metabolism and pharmacodynamics,
and their possible interactions to determine the individual’s response to a particular drug, as in the case of beta2ADR 16
Gly/Gly diminished effect of a beta 2 agonist in asthma therapy (5).
Finally, the evolution of genetic tests will be discussed, and the difference between a diagnostic and a predictive test will
be highlighted, as the latter test will be used for complex diseases, touching on the ethical, legal, and social implications
of these tests, and the widely perceived need to inform and educate the public at large on the indications and the limits
of genetic testing for mutifactorial phenotypes in the medical and the non-medical setting (6).
References
1.Collins FC. The case for a US prospective cohort study of genes and environment. Nature 429:475-7, 2004
2. Collins FS, ED Green, AE Guttmacher, MS Guyer on behalf of the US NHGR. A vision for the future of genomics
research. Nature 422: 835-47, 2003
3. Girelli D, N Martinelli, F Pizzolo, S Frigo, O Olivieri, C Stranieri, E Trabetti, G Faccini, E Tinazzi, PF Pignatti,
R Corrocher. The interaction between MTHFR 677 C->T genotype and folate status is a determinant of coronary
atherosclerosis risk. J Nutr 133:1281-5, 2003
4. Martinelli N, D Girelli, O Olivieri, C Stranieri, E Trabetti, F Pizzolo, S Friso, I Tenuti, S Cheng, MA Grow,
PF Pignatti, R Corrocher. Interaction between smoking and PON2 Ser311Cys polymorphism as a determinant
of the risk of myocardial infarction. Eur J Clin Invest 34:14-20, 2004
57
Genetyka człowieka
5. PF Pignatti. Trends in pharmacogenomics of drugs used in the treatment of asthma. Pharmacological
Res 49:343-9, 2004
6. Hodgson SV & S Popat. Polymorphic sequence variants in medicine: a challenge and an opportunity.
Clin Med 3:260-4, 2003
W29.
Therapies for LSDs – enzyme augmentation and substrate reduction.
J. E. Wraith
Willink Biochemical Genetics Unit, Royal Manchester Children’s Hospital Manchester M27 4HA, UK
Some 50 different lysosomal disorders are known in humans. They result from the defective function of a specific protein
or enzyme which leads ultimately to the progressive accumulation within the lysosome of either undgraded substrate(s)
or catabolic products that are unable to escape from this organelle. Most disorders are inherited in an autosomal
recessive manner and the disease process is generally progressive and unremitting.
The lysosomal disorders, like many other metabolic diseases, show a remarkably varied clinical phenotype. In some
patients, the presentation may be in utero or the newborn period, whereas in others, even with the same enzyme
deficiency (but probably a different genetic mutation), onset may be in late adulthood. However, for most patients the
onset of symptoms may be in the first months or years of life following an often unremarkable and apparently normal
early development. The first signs may be some slowing of development and other neurological signs; in other patients
some organomegaly or a dysmorphic facial appearance may be noted. Recognition of these clinical signs will assist in the
selection of appropriate diagnostic tests.
Treatment of LSDs includes haematopoetic stem cell transplant (HSCT), enzyme replacement therapy (ERT) and
substrate reduction therapy (SRT), but many disorders remain untreatable. The involvement of the central nervous
system is a particular challenge and we have to rethink our therapeutic approach in these LSDs. A combination of
enzyme augmentation and substrate reduction is likely to necessary for some disorders. SRT is limited by the single
product currently available for use and the side effect profile of the product. Second generation products may be more
effective and safer. Cost of therapy remains a challenge whatever approach is selected.
W30.
The Future of Lysosomal Storage Diseases Therapeutics: Enzymes for New Diseases,
Gene Therapy, and The Brain.
Dr R. Mościcki
Genzyme Co., Combridge, MA, USA
It is an exciting era for Lysosomal Storage Disorders. Success was observed first in the treatment of Gaucher disease with
enzyme replacement therapy (ERT) which has now provided more than 10 years of
experience. These technologies are now also being applied to other lysosomal storage diseases. Successful enzyme
replacement therapy for Fabry disease and mucopolysaccharidosis I is now available. Similarly, enzyme therapy is in
advanced stages of development for other MPS disorders. Initial clinical results from the US and Europe using ERT
for Pompe disease are also suggesting improved survival for infants and other clinical improvements such as reduced
cardiomegaly and improved muscle function for some patients. Details of the studies in Pompe disease will be presented.
Animal studies
in models of Niemann-Pick disease are supportive of clinical trials of ERT for Niemann-Pick B to begin soon.
Both animal and human studies have provided encouragement regarding the use of gene therapy for lysosomal storage
disorders. The monogenetic pathogenesis and success of ERT have long suggested that many of these diseases would
be appropriate targets for such an approach. Initial approaches focused primarily on stem cell transfection. More
recentlyanimal models such as those for Fabry disease have been very encouraging that non-stem cell approaches may
also have an important role, ie use of the liver as a depot organ to produce enzyme. Experiments in Fabry mouse models
have demonstrated long term enzyme expression and substrateclearance after only o ne administration of a viral vector
containing the enzyme gene. These findings have now been extended to other lysosomal disorders in animal models.
Neurologic disease is a prominent and devastating feature of many lysosomal storage disorders and may not be amenable
to systemic administration of enzyme. Gene therapy may also prove useful as one of the approaches being tested in
addressing neurologic disease inlysosomal storage disorders. Experiments in animal models demonstratesremarkable
spread through the CNS, production of enzyme within the CNS,and clearance of substrate. Small molecules, which
pass the blood brain barrier, may also play an important role for lysosomal neurologic disease of some types. Although
existing small molecule therapies based onsugar analogs have to date been disappointing with poor efficacy and
58
Genetyka człowieka
significant safety issues, newer agents such as ceremide analogs may prove to be an important advance. These agents
are more potent and specific and demonstrate entrance into the brain with clearance of substrate within the brain.
Early evidence also supports the possibility that neurologic stem cells may also provide an opportunity for regenerative
approaches to the brain and function as agents for enzyme production within the CNS in models of lysosomal storage
disease. These cells are shown to migrate, produce enzyme, and clear substrate. Most recently the expression of enzyme
in the CNS has also been shown to improve CNS function in animals.
Dysmorfologia
Komunikaty ustne:
W31.
Aberracje subtelomerowe jako przyczyna upośledzenia umysłowego – badania
kliniczne i cytogenetyczno-molekularne w 96 rodzinach.
Ewa Obersztyn (1), Z. Helias-Rodzewicz (1), Kamila Suchenek (1), Ewa Bocian(1),
Anna Kutkowska-Kaźmnierczak (1), Ewa Kostyk (2), Tadeusz Mazurczak (1)
(1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Warszawa
(2) Zakład Genetyki Medycznej, Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków
Aberracje regionów subtelomerowych chromosomów odpowiedzialne są za około 3-9% przypadków tzw. idiopatycznego
upośledzenia umysłowego w stopniu umiarkowanym/głębokim oraz 0,5% przypadków upośledzenia w stopniu lekkim
współistniejących z cechami dysmorfiii i / lub wadami wrodzonymi.
Celem pracy była ocena częstości występowania aberracji subtelomerowych w grupie 96 chorych z cechami
upośledzenia umysłowego, dokonanie szczegółowej charakterystyki cech klinicznych oraz ocena użyteczności techniki
FISH w diagnostyce niepełnosprawności intelektualnej.
Podstawę kwalifikacji chorych do badań stanowiły następujące kryteria włączenia: upośledzenie umysłowe
współistniejące z cechami dysmorfii i/lub wadami wrodzonymi, upośledzenie umysłowe wśród krewnych probanda
(nieobligatoryjne), prawidłowy kariotyp oraz wykluczenie mutacji w genie FMR1. Do przeprowadzenia badań techniką
FISH (Multiprobe Chromoprobe T system) zakwalifikowano: 41 chorych z głębokim, 28 z umiarkowanym oraz 22
z lekkim stopniem upośledzenia umysłowego. W 54 przypadkach upośledzenie miało charakter rodzinny.
Obecność aberracji subtelomerowych wykazano u 9/96 (9,4%) probandów. W większości przypadków, aberracje miały
charakter rodzinny (7/9), i były pochodzenia ojcowskiego (6/9). W jednej rodzinie wykazano obecność zrównoważonej
translokacji wzajemnej oraz translokacji subtelomerowej. Wśród najczęściej występujących objawów stwierdzono: cechy
dyzmorfii twarzy (9/9), głęboki stopień upośledzenia umysłowego (5/9), hipotonię (6/9), małogłowie (6/9) oraz wady
wrodzone, w szczególności OUN, serca i narządów płciowych.
Przeprowadzono charakterystykę porównawczą cech klinicznych grupy chorych z potwierdzoną oraz wykluczoną
obecnością aberracji subtelomerowej w kontekście kryteriów które stanowią wskazania do przeprowadzenia testu
subtelomerowego.
W32.
Oro-facio-digital syndrom typ I – charakterystyka kliniczna i molekularna
2 przypadków.
Aleksandra Jezela-Stanek (1), A. Pyrkosz (2), E. GŁłuszkiewicz (2), J. Paprocka (3), M. Krajewska-Walasek (1)
(1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut „Pomnik-Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa
(2) Katedra i Zakład Biologii Ogólnej, Molekularnej i Genetyki Śląskiej AM, Katowice
(3) Klinika Pediatrii i Neurologii Wieku Rozwojowego Śląskiej AM, Katowice
Zespół ustno-twarzowo-palcowy typu I (orofaciodigital syndrome type I, OFDS I; [MIM 311200]) należy do
heterogennej grupy zaburzeń rozwojowych, dotyczących struktur jamy ustnej, twarzy oraz palców, z którymi bardzo
często współistnieją wady ośrodkowego układu nerwowego oraz torbielowatość nerek. Po raz pierwszy został opisany
w 1954 roku przez francuskich stomatologów Papillon-Lasage i Psaume. Nazwę wprowadził natomiast Gorlin w roku
59
Genetyka człowieka
1961. Dotychczas scharakteryzowano jego 9 typów (OFD I-IX), różniących się konstelacją wad oraz sposobem
dziedziczenia.
OFDS typu I dziedziczony jest w sposób dominujący sprzężony z chromosomem X, stąd dla większości płodów męskich
jest letalny. Występuje z częstością około 1 na 250 000 żywych urodzeń. Około 75% to przypadki sporadyczne. Jedyny
poznany gen, mutacje którego wiążą się z wystąpieniem omawianego zaburzenia – gen OFD I jest zlokalizowany na
krótkim ramieniu chromosomu X, w regionie Xp22.2-p22.3. Jest również określony jako gen CXORF5 (Chromosome
X Open Reading Frame 5). Kodowane przez niego białko przypuszczalnie odgrywa rolę w interakcjach białko-białko we
wczesnych etapach rozwoju, warunkując prawidłowy przebieg organogenezy, aczkolwiek jego rola nie została ostatecznie
poznana. Zidentyfikowano dotychczas mutacje zarówno w obrębie eksonów, jak i intronów genu OFD I, przy czym
większość z nich warunkuje wystąpienie zaburzeń elongacji.
Celem prezentowanej pracy jest przedstawienie 2 przypadków zespołu OFD typu I, gdzie rozpoznanie kliniczne zostało
zweryfikowane poprzez analizę genu CXORF5.�
W33.
Zespół paznokciowo-rzepkowy – przypadek spowodowany nową mutacją
w genie LMX1B.
Krzysztof Szczałuba (1), Ewa Obersztyn (1), Roberto Ravazzolo (2), Bożena Gołąbek (3), Tadeusz Mazurczak (1)
(1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytutu Matki i Dziecka, Warszawa
(2) Laboratorio di Genetica Moleculare, Instituto G. Gaslini, Genua, Włochy
Zespół paznokciowo-rzepkowy (Nail-patella syndrome) (OMIM: 161200) jest chorobą monogenową o toku dziedziczenia
autosomalnym dominującym, charakteryzującą się obecnością licznych malformacji tkanek wywodzących się z ekto–
i mezodermy. W obrazie klinicznym choroby dominują symetryczne wady układu kostnego, w tym hipoplazja rzepek,
zmiany dystroficzne paznokci oraz zaburzenia funkcji nerek. Za ekspresję kliniczną choroby odpowiedzialne są mutacje
w genie LMX1B, zmapowanym w locus 9q34. Przedstawiono charakterystykę cech klinicznych przypadku rodzinnego
(u matki i syna) zespołu paznokciowo-rzepkowego oraz wyniki przeprowadzonych badań molekularnych.
Wśród cech klinicznych zespołu paznokciowo-rzepkowego, które wystąpiły zarówno u matki jak i jej 4-letniego
syna należy wymienić: obustronne „rogi biodrowe”, hipoplastyczne rzepki, zmiany dystroficzne paznokci obu dłoni,
przykurcze z ograniczeniem ruchomości w zakresie dużych stawów oraz hipoplazję bliższych odcinków kości
promieniowych. W wykonanych badaniach dodatkowych stwierdzono prawidłowe parametry wydolności nerek
u obojga, chociaż tylko u matki obserwowano obecność krwinkomoczu i białkomoczu.
Wyniki przeprowadzonych badań molekularnych wykazały u obojga pacjentów obecność nowej mutacji typu „missense”
(C:G) w kodonie 245 genu LMX1B. Mutacja powoduje zamianę glutaminy w kwas glutaminowy w kodowanym przez
gen białku i prawdopodobnie upośledza jego wiązanie z odpowiednimi sekwencjami docelowego DNA.
Omówiono znaczenie badań molekularnych dla poradnictwa genetycznego w rodzinie probanda.
W34.
Zespół MERRF u trzech sióstr z mnogą symetryczną tłuszczakowatością.
Magdalena Badura (1), Anna Materna-Kiryluk (1), Katarzyna Tońska (2), Ewa Bartnik (2,3)
Anna Latos-Bieleńska (1)
(1) Katedra i Zakład Genetyki Medycznej Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
(2) Zakład Genetyki Uniwersytetu Warszawskiego
(3) Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawa
Prezentujemy opis kliniczny trzech sióstr, u których rozpoznano w 4. dekadzie życia mnogą symetryczną tłuszczakowatość
i obustronną zaćmę. Mnoga symetryczna tłuszczakowatość (choroba Madelunga, tłuszczakowatość Launois-Bensaude,
MIM 151800) charakteryzuje się nagromadzeniem pod skórą karku, ramion, okolicy nadobojczykowej i nadłopatkowej
symetrycznych tłuszczaków. Na świecie opisano jedynie 200 przypadków tej choroby, nie ma zgodności co do etiologii
choroby. Ze względu na to, że u brata badanych kobiet rozpoznano na podstawie analizy bioptatu mięśnia szkieletowego
miopatię mitochondrialną, wykonano badania molekularne w kierunku znanych mutacji w genomie mitochondrialnym
u wszystkich członków rodziny. U chorującego na miopatię brata oraz u jednej z sióstr potwierdzono występowanie
w genomie mitochondrialnym mutacji A-G 8344 w genie dla tRNA (Lys). Mutacja konstytucjonalna (A-G 8344)
w genomie mitochondrialnym leży u podłoża zespołu MERRF (Myoclonic Epilepsy and Ragged Red Fiber Disease).
W klasycznej formie zespół ten charakteryzuje się występowaniem padaczki mioklonicznej, miopatii mitochondrialnej
i wolno postępującego otępienia. U pacjentów może występować jednak daleka od klasycznej konfiguracja objawów
(mowa skandowana, atrofia nerwu wzrokowego, utrata słuchu, niskorosłość, neuropatia obwodowa). Badanie
60
Genetyka człowieka
biopsyjne wycinka mięśnia szkieletowego ujawnia obecność tzw. czerwonych poszarpanych włókien. W literaturze
nie było dotąd doniesień o rodzinnie występującej mnogiej symetrycznej tłuszczakowatości z obecnością konkretnej
mutacji w genomie mitochondrialnym. Istnieje natomiast wiele doniesień o dysfunkcji mitochondriów w lipodystrofii
pojawiającej się w trakcie terapii antyretrowirusowej u pacjentów z AIDS oraz w etiopatogenezie zaćmy.
Praca ma na celu zwrócenie uwagi klinicystów na rolę analizy rodowodu i badań molekularnych genomu
mitochondrialnego w przypadku pacjentów z mnogą symetryczną tłuszczakowatością.
W35.
Duplikacja 8p u dwójki dzieci skierowanych z rozpoznaniem mózgowego porażenia
dziecięcego.
Renata Glazar (1), Marzena Wiśniewska (1), Jolanta Kołowska (2)
(1) Katedra i Zakład Genetyki Medycznej AM w Poznaniu
(2) Centrum Genetyki Medycznej NZOZ w Poznaniu
Mózgowe porażenie dziecięce (mpd) jest częstą przyczyną kierowania pacjentów do poradni genetycznej. Szczegółowa
diagnostyka przeprowadzona u tych dzieci wskazuje na to, że tylko w 30% przypadków rozpoznanie to jest prawidłowe,
a w 70% kryje się za tym choroba genetycznie uwarunkowana.
U dwójki dzieci płci żeńskiej, skierowanych do poradni genetycznej z rozpoznaniem mpd, stwierdzono obecność cech
dysmorfii z towarzyszącym opóźnieniem rozwoju psychomotorycznego oraz wrodzoną wadą serca. Dzieci trafiły po
raz pierwszy do poradni genetycznej w wieku niemowlęcym: 3 m.ż. i 12 m.ż. Zaobserwowano u nich występowanie
podobnych cech dysmorfii: wydłużona i wygładzona rynienka podnosowa, wąska górna warga, micrognathia, wąskie
i wysokie podniebienie, w obrębie kończyn górnych pogłębione bruzdy zgięciowe. Badanie echokardiograficzne serca
w obydwu przypadkach wykazało obecność ubytku w przegrodzie międzyprzedsionkowej.
W przeprowadzonych badaniach cytogenetycznych zidentyfikowano aberrację chromosomową – duplikację w obrębie
ramienia krótkiego chromosomu pary 8: dup(8)(p23.1p11.23). Kariotypy rodziców obu dziewczynek były prawidłowe.
Omawiany przypadek wskazuje na konieczność wykonywania badania kariotypu w każdej sytuacji, w której u dziecka
stwierdza się opóźnienie rozwoju psychomotorycznego oraz cechy dysmorfii, mimo postawionego wcześniej innego
rozpoznania.
Badanie wykonano w ramach programu rządowego: „Program monitorowania i poprawy pierwotnej profilaktyki
wrodzonych wad rozwojowych w Polsce” oraz działalności statutowej KZGM nr 502-1-05-01.
W36.
Zespół Proteusa i zespół znamienia naskórkowego: nakładanie się cech
fenotypowych.
Monika Ołdak (1, 2), Dorota Gieruszczak-Białek (1), Agata Skórka (1), Jarosław Waligóra (1),
Lech Korniszewski (1)
(1) Klinika Diabetologii, Patologii Noworodka i Wad Wrodzonych, Akademia Medyczna w Warszawie,
(2) Katedra i Zakład Histologii i Embriologii, Centrum Biostruktury, Akademia Medyczna w Warszawie
Hemihipertrofia i hemimegalencefalia mogą występować w różnych zespołach wad wrodzonych takich jak wariant
neurologiczny zespółu znamienia naskórkowego, zespół Klippel-Trenaunay-Webera, Proteusa, neurofibromatozie
i hipomelanozie Ito. Chociaż kryteria diagnostyczne istnieją dla wielu z tych zespołów, ustalenie rozpoznania jest często
trudne ze względu na znaczna zmienność ekspresji i nakładanie się niektórych objawów klinicznych. Przedstawiany
przypadek pacjenta z zespołem Proteusa ilustruje ten problem. Obecnie trzyletni chłopiec urodził się w 35 tygodniu
pierwszej ciąży bliźniaczej po zapłodnieniu in vitro, rozwiązanej cięciem cesarskim. Siostra bliźniaczka jest zdrowa, jej
masa urodzeniowa wynosiła 2190g. Masa urodzeniowa chłopca wynosiła 3180g. Nie było dowodów na transfuzję krwi
między bliźniętami. W badaniu przedmiotowym przy urodzeniu zwracały uwagę hemihipertrofia twarzy i lewej połowy
ciała, naczyniaki na obu kończynach górnych i na lewej kończynie dolnej oraz znamię naskórkowe po lewej stronie na
szyi i lewym przedramieniu wzdłuż linii Blaschko a także liczne tłuszczaki w powłokach brzusznych. Badanie rezonansu
magnetycznego głowy wykazało znaczną hemimegalencefalię, asymetrię mózgu i móżdżku z licznymi anomaliami
naczyniowymi bardziej zanaczonymi po stronie lewej. U chłopca obserwuje się także ogniskowe zaburzenia pigmentacji
owłosionej skóry głowy szczególnie po stronie lewej. Interesujace, że podobne „mozaikowe” różnice w kolorze
owłosienia stwierdziliśmy u pacjenta z zespołem znamienia naskórkowego, w którym poza zmianami skórnymi
typu nevus stwierdza się hemihipertrofię twarzy z hemimegalencefalią. Może to wskazywać na patogenetyczną rolę
mozaikowatości somatycznej w obu zespołach.
61
Genetyka człowieka
W37.
Zespół Nooan, zespół sercowo-twarzowo-skórny i zespół Costello – trudności
diagnostyczne u dziecka z ciężką postacią zespołu Costello.
Agata Skórka, L. Korniszewski, D. Gieruszczak-Bialek, J. Waligora
Klinika Diabetologii, Patologii Noworodka i Wad Wrodzonych w Warszawie
Zespół sercowo-twarzowo-skórny (zespół CFC, cardio-facio-cutaneous syndrome) charakteryzuje się niedoborem
wzrostu, typową dysmorfią, wadami serca, zaburzeniami ektodermalnymi oraz upośledzeniem rozwoju umysłowego.
W zespole Noonan stwierdza się wiele cech klinicznych podobnych do objawów występujących u pacjentów z zespołem
CFC. W literaturze wciąż toczy się debata czy oba te zespoły stanowią dwie odrębne jednostki kliniczne czy też są związane
z różną ekspresją tego samego zaburzenia. W 2001 roku zlokalizowano gen odpowiedzialny za występowanie zespołu
Noonan (PTPN11, zlokalizowany w locus 22.q24.1). Mutacje tego genu stwierdza się u około 60% pacjentów z zepołem
Noonan. Jak do tej pory nie stwierdzono mutacji tego genu u pacjentów z zespołem CFC. Kolejnym zespołem, który
sprawia trudności w diagnostyce różnicowej pacjentów z fenotypem CFC/Noonan jest zespół Costello, charakteryzujący
się typowymi cechami dysmorfii, opóźnieniem rozwoju psychoruchowego i fizycznego, wadami serca. Zwykle u tych
pacjentów z wiekiem pojawia się charakterystyczne pogrubienie rysów twarzy, oraz bardzo charakterystyczny wygląd
skóry dłoni i stóp (znaczny nadmiar skóry, skóra aksamitna, miękka z bardzo licznymi bruzdami).
Przedstawiamy 7-letniego chłopca, u którego po urodzeniu postawiono rozpoznanie zespołu Noonan ze względu na
charakterystyczne cechy twarzoczaszki, krótką płetwiastą szyję, obrzęki dłoni i stóp, złożoną wadę serca (VSD, ASD,
PS). Ze względu na znaczne opóźnienie rozwoju psychoruchowego, niedobór wzrost oraz zaburzenia ektodermalne
(zaburzenia dotyczące włosów, skóry i zębów) zmieniono rozpoznanie na zespół CFC. Dopiero nasilające się z wiekiem
pogrubienie rysów twarzy oraz bardzo charakterystyczne wygląd skóry dłoni i stóp naprowadził na postawienie
właściwego rozpoznania zespołu Costello.
W38.
Porównanie efektywności diagnostyki zespołów CATCH 22 i Williamsa opartej
o metodę FISH.
Małgorzata Piotrowicz (1), Tatiana Chilarska (1), Wanda Hawuła (1), Anna Ulańska (1),
Nina Wieczorek-Cichecka (1), Jadwiga Moll (2), Katarzyna Ostrowska (2), Jolanta Kiełbasiewicz-Binikowska (2),
Anna Gutkowska (3), Małgorzata Krajewska-Walasek (3), Lucjusz Jakubowski (1)
(1) Zakład Genetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi
(2) Klinika Kardiologii Instytutu CZMP w Łodzi
(3) Zakład Genetyki Instytutu CZD w Warszawie
Zespoły CATCH 22 (Di George/VCF syndrome) oraz Williamsa wiążą się z mnogimi wadami rozwojowymi, wśród
których jedną z wiodących nieprawidłowości jest wada układu sercowo-naczyniowego. Najczęstszą przyczyną obu
zespołów są mikrodelecje chromosomowe.
Analizie poddano pacjentów kwalifikowanych do diagnostyki cytogenetycznej z wykorzystaniem techniki
fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ’ (FISH) na podstawie obecności charakterystycznych dla każdego z zespołów
cech dysmorfii i/lub typowej wady serca: wady rozwojowej pnia i stożka naczyniowego w zespole CATCH 22;
nadzastawkowego zwężenia aorty i/lub łagodnego zwężenia tętnicy płucnej w zespole Williamsa. U pacjentów
z podejrzeniem mikrodelecji 22q11.2 potwierdzenie diagnozy uzyskano u 12 chorych (41% badanych). Byli to prawie
wyłącznie pacjenci z fenotypowymi cechami zespołu Di George’a lub zespołu podniebienno-sercowo-twarzowego.
Wśród 16 pacjentów diagnozowanych w kierunku zespołu Williamsa obecność mikrodelecji 7q11.23 potwierdzono
w 9 przypadkach (56%). Byli to także pacjenci z typowymi cechami dysmorfii, którym w ponad 60% towarzyszyła wada
zastawkowa dużych naczyń. W obu grupach nie stwierdzano mikrodelecji u pacjentów z charakterystyczną wadą serca
lecz cechami dysmorfii odbiegającymi od klasycznych opisów cech obserwowanych w tych jednostkach chorobowych.�
Efektywność diagnostyki techniką FISH przy kwalifikacji opartej o pełne kryteria kliniczne jest znacznie wyższa. Biorąc
pod uwagę istotne problemy kliniczne związane z zespołami mikrodelecji (m.in. hipercalcemię w zespole Williamsa,
hipokalcemię i zaburzenia odporności w zespole CATCH 22) uważamy jednak, że obecność nawet dyskretnie
wyrażonych cech fenotypowych oraz typowej wady serca u noworodków i niemowląt stwarza konieczność wykluczenia
w/w mikrodelecji także w przypadkach wątpliwych. Poddano dalszej dyskusji kryteria kliniczne kwalifikujące pacjentów
do badań w kierunku ww. delecji.
62
Genetyka człowieka
W39.
Zespół PEHO/”PEHO – like” u dziewczynki.
Stanisław Zajączek (1), Zdzisława Rosińska (2), Maria Giżewska (3), Mieczysław Walczak (3),
Katarzyna Hnatyszyn (4), Wojciech Lubiński (5)
(1) Zakład Genetyki i Patomorfologii Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie
(2) Specjalistyczny Zespół Opieki Zdrowotnej nad Matką i Dzieckiem-Szpital „Zdroje”
(3) II Klinika Chorób Dzieci PAM
(4) Klinika Neonatologii PAM
(5) Katedra i Klinika Okulistyki PAM
Zespół PEHO (Progressive Encephalopathy,Hipsarrythmia,Optic atrophy,Oedema) jest bardzo rzadkim schorzeniem
neurodegeneracyjnym, opisanym u ok. 30 rodzin z Finlandii i w pojedynczych rodzinach z innych krajów. Nie opisano
dotąd zespołu w Polsce.
Pacjenci „PEHO” i „PEHO-like” różnią się głównie nasileniem i dynamiką zmian obserwowanych w MRI; nasileneim
towarzyszących im drgawkom, hipsarytmiom i opóźnieniem PNR, z objawami dotyczącymi zazwyczaj móżdżku i pnia
a także nasileniem zmian ocznych przy wspólnym fenotypie dysmorficznym.
W skład bardzo charakterystycznych dysmorfii wchodzą: obrzęk dłoni, stóp i policzków, charakterystyczny wygląd
dolnego i środkowego piętra twarzy, znaczny przerost dziąsęł i in. Stałym objawem są zwężąjące się szpiczasto zakończone
palce z małymi paznokciami.
Zespół jest prawdopodobnie uwarunkowany AR a w jego patomechaniźmie znaczącą rolę odgrywa nadmiar
w neuronach tlenku azotu, wywołany z kolei niedoborem działającego ochronnie IGF1.
Przedstawiamy obserwacje 4 –letniej dziewczynki, prezentującej pełny zespół cech dysmorficznych PEHO z opóźnieniem
PNR i drgawkami. O kwalifikacji do grupy PEHO lub PEHO – like zadecyduje w przyszłości ocena dynamiki zmian
neuroradiologicznych i ocznych.
W40.
Współistnienie agenezji i hipoplazji ciała modzelowatego z innymi wadami
rozwojowymi.
Jolanta Wierzba (1), Małgorzata Lemka (2), Barbara Mańkowska (2), M. Iliszko (3)
(1) Klinika Pediatrii, Hematologii, Onkologii i Endokrynologii AM w Gdańsku
(Kierownik Kliniki prof. dr hab. med. Anna Balcerska)
(2) Klinika Neurologii Rozwojowej AM w Gdańsku ( Kierownik Kliniki prof. dr hab. med. Ewa Dilling– Ostrowska )
(3) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki AM w Gdańsku ( Kierownik Katedry prof. dr hab. med. Janusz Limon)
Ciało modzelowate (corpus callosum; CC) jest strukturą mózgowia zespalającą i integrującą jego półkule. Wady
rozwojowe CC występują stosunkowo rzadko. Niejednokrotnie opisywano współistnienie niedorozwoju (hipoplazja),
lub braku (agenezja) ciała modzelowatego (ACC) z innymi wadami ośrodkowego układu nerwowego (OUN), a także
z wadami innych narządów.
Celem prezentowanych badań była analiza współistnienia ACC z innymi wadami OUN oraz z wadami innych
narządów.
Przedstawiono materiał kliniczny dotyczący 24 dzieci w wieku od 4 miesięcy do 15 lat (7 dziewczynek, 17 chłopców),
u których stwierdzono całkowitą (N = 14), lub częściową (N = 10) ACC. U większości dzieci wstępne rozpoznanie wady
postawiono na podstawie badania ultrasonograficznego i potwierdzono badaniami TK i/ lub NMR mózgowia.
U 12 dzieci (50%) ACC była izolowaną wadą, u pozostałych 12 stwierdzono współistnienie innych wad OUN (m. in.
holoprosencefalia, poszerzenie komór mózgu, poszerzenie zbiornika wielkiego, torbiele pajęczynówki, zaburzenia
migracji neuroblastów, wady móżdżku). U 75% dzieci z ACC występowały wady rozwojowe innych narządów, w tym
wady serca (33%), narządu wzroku (25%), układu mięśniowo– szkieletowego (33%) oraz układu moczo– płciowego
(16%). U jednej z dziewczynek rozpoznano zespół Aperta, u jednego chłopca zespół Toriello-Carey’a, u innego chłopca
obraz kliniczny odpowiadał sekwencji VATER, jedna z dziewczynek obserwowana jest w kierunku zespołu Aicardi. Jedno
z dzieci przebyło w okresie prenatalnym zakażenie cytomegalowirusem. U 22 spośród 23 dzieci, u których wykonano
badanie cytogenetyczne, nie wykazano aberracji chromosomowych. U jednego chłopca dziecka z małogłowiem,
holoprosencefalią, zanikiem nerwu wzrokowego, wadą serca i niedorozwojem narządów płciowych wykryto mozaikowy
kariotyp: mos46,XY,r(7)(p22q36)/46,XY,r(7,7) (p22q36,p22q36).
Reasumując, ACC najczęściej współistnieje z innymi wadami rozwojowymi i jest sporadycznie uwarunkowana aberracją
chromosomalną. Znalezienie patologii struktur ciała modzelowatego jest nie tylko wskazaniem do szczegółowej
diagnostyki OUN, ale także do rutynowego wykonania badań pozostałych narządów. Stwierdzenie współistnienia wad
towarzyszących, może mieć podstawowe znaczenie dla udzielenia prawidłowej porady genetycznej.
63
Genetyka człowieka
W41.
Identyfikacja sekwencji specyficznych dla chromosomu Y z wykorzystaniem PCR
oraz FISH w przypadkach mozaikowości z udziałem chromosomu markerowego
u chorych z cechami zespołu Turnera.
Lucjusz Jakubowski (1), Anna Jeziorowska (2), Tatiana Chilarska (1), Iwona Pinkier (1),
Agnieszka Potrzebowska (1), Wanda Hawuła (1), Anna Ulańska (1), Anna Krzymińska (3), Hanna Nalewajek (4),
Maciej Hilczer (2)
(1) Zakład Genetyki, UM w Łodzi
(2) Klinika Endokrynologii i Terapii Izotopowej, UM w Łodzi
(3) Zakład Patofizjologii Katedry Patofizjologii UM w Łodzi�
(4) Poradnia Endokrynologiczna Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi
Identyfikacja chromosomów markerowych pochodzących z chromosomu Y przy użyciu klasycznych metod
cytogenetycznych przysparza trudności ze względu na jego małe rozmiary i ubogi wzór prążkowy. Tym trudniejsza jest
lokalizacja punktów złamań prowadzących do powstania chromosomu markerowego.
Zaprezentowano analizę sekwencji specyficznych dla chromosomu Y u dwóch pacjentek z klinicznymi cechami zespołu
Turnera i kariotypami mozaikowymi 45,X/46,X,+mar, przy pomocy techniki PCR i w oparciu o mapę delecyjną
chromosomu Y. Badano sekwencje dla poszczególnych regionów//interwałów chromosomu Y: Yp11.3//1A– PABY,
SRY, Yp11.2//3 – TSPY; Ycen//4A-4B – DYZ3; Yq11.21-11.22//5C– sY83, sY86, //5EwejsY182 (KALY); //5M wejsY116;
//5N wejsY122; Yq11.22-11.23//6AwejsY134, sY207; //6B – sY138; //6CwejsY141; //6DwejsY254, sY255 (DAZ); //6E
wejsY149, sY150, sY269, sY203, sY152; 6FwejsY156, sY166, sY167, sY158; Yq12//7 – DYZ1(sY160), DYZ2 (sY159).
Nie potwierdzono jedynie obecności sekwencji specyficznych dla regionu Yq12, ustalając tym samym punkt złamania
poniżej sekwencji sY158. Niezależnie od identyfikacji sekwencji Y-specyficznych w genomowym DNA, pochodzenie
chromosomów markerowych z chromosomu Y potwierdzono przy pomocy FISH z wykorzystaniem Chromosome X/Y
Cocktail Probe (Qbiogene). Stwierdzono izodicentryczną strukturę obu chromosomów markerowych.
U obu pacjentek na podstawie badań hormonalnych podejrzewa się obustronną dysgenezję gonad. Stwierdzenie
sekwencji specyficznych dla chromosomu Y było podstawą do ustalenia w obu przypadkach wskazań do obustronnej
gonadektomii ze względu na ryzyko pojawienia się w gonadach zmian nowotworowych. Dalsze badania cytogenetyczne
i histologiczne gonad mogą pozwolić na wyjaśnienie przyczyn cech niewielkiej maskulinizacji zewnętrznych
narządów płciowych u jednej z pacjentek. Omówiono trudności w poszukiwaniu korelacji fenotypowo-genotypowych
w przypadkach mozaikowych kariotypów z udziałem monosomii 45,X oraz chromosomu Y pacjentów z cechami
somatycznymi zespołu Turnera.
Praca finansowana z grantu KBN nr 6 PO5E 135 21
Komunikaty plakatowe:
P60.
Delecja 18pz w eksonie 5 genu ektodysplazyny-A u chorego z objawami
anhydrotycznej dysplazji ektodermalnej.
Alicja Kujawa (1), M. Zadurska (2), W. H. Trzeciak (1)
(1) Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej Akademii Medycznej w Poznaniu.
(2) Zakład Ortodoncji Instytut Stomatologii Akademii Medycznej w Warszawie
Dysplazje ektodermalne obejmują około 180 zespołów klinicznych cechujących się nieprawidłowościami rozwojowymi
przydatków skóry, w szczególności: zębów, włosów oraz gruczołów potowych. Najczęściej występującą formą dysplazji
ektodermalnej jest jej postać anhydrotyczna, spowodowana nieprawidłowym różnicowaniem się przydatków skóry
w okresie życia płodowego, które wymaga wzajemnego oddziaływania komórek wywodzących się z ektodermy
i mezenchymy. Uważa się, że podstawową przyczyną objawów klinicznych anhydrotycznej dysplazji ektodermalnej u ludzi
są mutacje w genach: EDA, EDAR, EDARADD, XEDAR oraz TRAF6, przy czym ok. 95% mutacji odpowiadających
za powstanie dysplazji ektodermalnej zlokalizowanych jest w obrębie genu EDA. Gen EDA koduje białko błonowe
ektodysplazynę-A (EDA-A) występującą w postaci trimeru. EDA-A w domenie zewnątrzkomórkowej zawiera motyw
kolagenopodobny z dwoma ciągami: 4 i 19 powtórzeń Gly-X-Y oraz motyw homologiczny do TNFα i może występować
w postaci izoform: A1 i A2 różniących się dwoma aminokwasami: Glu308 i Val309 w sekwencji homologicznej do
TNFα. Celem pracy było poszukiwanie i identyfikacja mutacji u chorych z anhydrotyczną dysplazją ektodermalną.
64
Genetyka człowieka
Od 4 chorych pobrano krew obwodową i wyizolowano DNA. Następnie wykonano reakcję PCR z zastosowaniem
odpowiednich par starterów dla 9 eksonów genu EDA. Obecność mutacji punktowych w amplifikowanych fragmentach
wykrywano za pomocą analizy polimorfizmu konformacji pojedynczej nici DNA w gradiencie temperatur (MSSCP).
U jednego chorego zaobserwowano zmianę we wzorze prążkowym eksonu 5. Analiza sekwencyjna na sekwenatorze
ALFexpress II przy użyciu startera znakowanego Cy5 wykazała EDA 801/814 del 18pz delecję 2 z 19 powtórzeń GlyX-Y. Wykryta mutacja może prowadzić do zaburzenia procesu trimeryzacji ektodysplazyny i blokować przekazywanie
sygnału z ektodermy do mezenchymy co uważa się za jedną z przyczyn wystąpienia dysplazji ektodermalnej.
P61.
Diagnostyka prenatalna zespołu Crouzona w rodzinie wysokiego ryzyka
genetycznego.
Anna Kutkowska-Kaźmierczak (1), Ewa Obersztyn (1), Renata Jaczyńska (2), Piotr Sucharski (3),
Tadeusz Mazurczak (1)
(1) Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Warszawa
(2) Klinika Położnictwa i Ginekologii, Instytutu Matki i Dziecka, Warszawa
(3) Zakład Genetyki Medycznej, Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków
Zespół Crouzona (OMIM 123500) należy do grupy genetycznie uwarunkowanych dyzostoz czaszkowo-twarzowych,
o autosomalnym dominującym toku dziedziczenia. Wśród typowych dla choroby objawów wymienia się: przedwczesne
zarastanie szwów czaszkowych, hipoplazję środkowej części twarzy, wytrzeszcz gałek ocznych oraz prognatyzm Za
wystąpienie objawów choroby odpowiedzialna jest mutacja w genie receptora czynnika wzrostu fibroblastów (FGFR2).
Znanych jest ponad 30 mutacji genu FGFR2, z czego 25% stanowią mutacje powstałe de novo.
Przedstawiono przypadek rodzinny zespołu Crouzona, w którym chorobę rozpoznano prenatalnie na podstawie oceny
ultrasonograficznej płodu oraz wyniku badania molekularnego. W badaniu obrazowym wykonanym w 28 tygodniu
ciąży metodą ultrasonografii trójwymiarowej, stwierdzono deformację kości czaszki okolicy skroniowej oraz cechy
dysmorficzne twarzoczaszki takie jak: wytrzeszcz gałek ocznych, szeroką, płaską nasadę nosa i prognatyzm, które
w kontekście danych rodowodowych uzasadniały podejrzenie zespołu Crouzona u płodu. Uzyskany wynik analizy
DNA wyizolowanego z amniocytów potwierdził obecność u płodu tej samej, co u ojca mutacji S267P w eksonie
7 genu FGFR2. Wynik badania MR płodu wykazał jedynie niewielkiego stopnia spłaszczenie kości czaszki w okolicy
skroniowo-ciemieniowej.
Przedstawiany przypadek należy do nielicznych rozpoznanych prenatalnie dyzostoz twarzowo-czaszkowych typu
Crouzona. Dokumentuje znaczenie nowoczesnych technik obrazowania płodu, w tym ultrasonografii trójwymiarowej
oraz rezonansu magnetycznego w diagnostyce zespołów dysmorficznych. Diagnostyka molekularna pozostaje nadal
metodą z wyboru w rodzinach ryzyka genetycznego, weryfikującą podejrzenie zespołu Crouzona rozpoznanego
prenatalnie.
P62.
Mutacje w genie PTPN11 w grupie 8 pacjentów z zespołem Noonan.
Jakub Klapecki, Agnieszka Szpecht-Potocka, Mikołaj Łaniewski-Wołłk, Ewa Obersztyn, Jerzy Bal,
Tadeusz Mazurczak
Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Warszawa
Zespół Noonan (OMIM 163950) jest chorobą genetycznie uwarunkowaną o toku dziedziczenia autosomalnym
dominującym o częstości występowania 1 na 2500 wśród żywourodzonych. W obrazie klinicznym choroby wymienia
się takie objawy, jak: niedobór wysokości ciała, wady wrodzone serca (najczęściej zwężenie zastawki tętnicy płucnej),
deformacje klatki piersiowej, płetwista krótka szyja, szerokie rozstawienie brodawek sutkowych, upośledzenie umysłowe
stopnia lekkiego/umiarkowanego, oraz charakterystyczne cechy dysmorfii twarzy: hiperteloryzm, zmarszczki nakątne,
pogrubiały obrąbek ucha. U podstaw molekularnych zespołu leży mutacja w genie PTPN11 zlokalizowanym na
chromosomie 12 p 24.1.
Przedstawiono wstępne wyniki oceny cech klinicznych oraz badań molekularnych w grupie chorych z rozpoznaniem
klinicznym zespołu Noonan. Analiza mutacji w genie PTPN11 obejmie sekwencjonowanie kolejnych eksonów genu od
2 do 15.
65
Genetyka człowieka
P63.
Zespół kociego krzyku (Cri-du Chat) – trudności diagnostyczne – opis przypadku.
Izabela Łaczmańska, Justyna Gil, Agnieszka Stembalska, Małgorzata Sąsiadek
Zakład Genetyki Akademii Medycznej we Wrocławiu
Do Zakładu Genetyki AM we Wrocławiu został skierowany 8-dniowy noworodek płci żeńskiej z podejrzeniem zespołu
Cri-du-Chat. Dziecko urodzone z CIPI w stanie ogólnym dobrym, z masą ciała 3200 g, ocenione na 10 punktów w skali
Apgar (ciąża rozwiazana w 39 tygodniu cięciem cesarskim z powodu słabej czynności skurczowej macicy).
U noworodka w przeprowadzonym badaniu fizykalnym stwierdzono dysmorfizm nie odpowiadający obrazowi
charakterystycznemu dla zespołu Cri-du-Chat: dość dużą mózgoczaszkę, trójkatną twarz, trójkatną bródkę, uszy nisko
osadzone, zrotowane ku tyłowi oraz nieprawidłowości w zakresie kończyn dolnych (piętowe ustawienie stóp, utrudnione
odwodzenie w stawach biodrowych). W wykonanym badaniu USG serca stwierdzono wrodzoną wadę w postaci ASD,
VSD. Zwracał uwagę charakterystyczny płacz dziecka, przypominający miauczenie kota.
Ze względu na cechy dysmorficzne oraz wady towarzyszące u dziecka wykonano badanie kariotypu metodą barwienia
prążkowego chromosomów GTG. Stwierdzono delecję ramienia krótkiego chromosomu 5 w części terminalnej.
W celu potwierdzenia rozpoznania zespołu Cri-du-Chat wykonano dodatkowo badanie FISH (Fluorescent In Situ
Hybridization) z zastosowaniem sondy Cri-du-Chat Chromosome Region (CDCR) Probe with 5qter Control Probe
o wielkości 140 kpz firmy Qbiogene. Sonda obejmuje regiony 5p15.2 (Cri-du-Chat critical region) i 5p15.3 (cat-like cry
critical region).
Analiza 50 metafaz i 50 jąder interfazalnych wykazała obecność dwóch prawidłowych sygnałów dla badanego regionu.
Ponieważ sonda skierowana jest na obszary 5p15.2 i 5p15.3 wynik badania FISH nie wyklucza delecji tylko jednego
z tych obszarów.
U dziecka przyjęto jako ostateczny wynik badania delecję w regionie 5p15.3.
Dla potwierdzenia wyniku wskazane jest wykonanie badań z zastosowaniem sondy subtelomerowej 5p lub oddzielnych
sond na regiony 15p15.2 i 15p15.3.
P64.
Zespół Wildervanck’a: zaburzenia migracji neuronalnej jako możliwy
patomechanizm?
Antoni Pyrkosz (1), Beata Klimek (2), Isabelle Alice Dyrek (3), Aleksander L. Sieroń (1), Elżbieta Marszał (2)
(1) Katedra i Zakład Biologii Ogólnej, Molekularnej i Genetyki ŚlAM
(2) Klinika Neurologii Wieku Rozwojowego ŚlAM
(3) Oddział Anestezjologii i Intensywnej Terapii Dzieci ŚlAM
Zespół Wildervanck’a (Cervico-Oculo-Acoustic Syndrome, MIM 314600) to uwarunkowany genetycznie zespół zaburzeń,
na który składają się: anomalia Klippela Feil`a, Duane`a oraz wrodzona głuchota. Etiologia i patogeneza zespołu jest
dotychczas nieznana. Z uwagi na występowanie powyższego zaburzenia prawie wyłącznie u płci żeńskiej, przyjmuje się
dziedziczenie dominujące, sprzężone z chromosomem X i letalnością hemizygotycznych płodów męskich.
Prezentujemy 3-letniego chłopca z pełną ekspresją zespołu Wildervanck`a. U dziecka stwierdzono – obustronną
głuchotę, anomalię Klippel-Feil`a, zez zbieżny oka lewego z anomalią Duane`a, asymetrię twarzy (niedorozwój
lewej połowy), wyrośla przeduszne po stronie lewej (usunięte operacyjnie w 12 mż), przymusowe ustawienie głowy,
krótka, płetwista szyja z niską linią owłosienia. Badaniem neurologicznym i psychologicznym stwierdzono zaburzenia
równowagi i nieznaczne opóźnienie rozwoju umysłowego. Wykonane rutynowe badanie cytogenetyczne chłopca
wykazało prawidłowy męski kariotyp.
Uwagę zwróciły nie opisywane dotychczas drobne odbarwienia i na lewym udzie pojedyncza zmiana typu kawy
z mlekiem. W wywiadzie rodzinnym ze strony ojca stwierdzono heterochromię u dziadka probanta, wiele przypadków
choroby Hirschsprunga, po jednym głuchoty oraz cukrzycy typu II. Ze strony matki u babci probanta stwierdzano
głuchotę na przypuszczalnym pozapalnym tle.
Biorąc pod uwagę całokształt obrazu klinicznego narzuca się spostrzeżenie powiązania powyższych cech z zespołem
Waardenburg – Shah, uwarunkowanego defektem w genie endoteliny 3 (*131242) / receptora endoteliny typu 3
DNRB – *131244).
66
Genetyka człowieka
P65.
Rzadki przypadek częściowej trisomii ramion krótkich chromosomu 12 u dziecka
z licznymi cechami dysmorficznymi.
Ryszard Ślęzak, Izabela Łaczmańska, Halina Busza, Halina Czemarmazowicz
Zakład Genetyki Akademii Medycznej we Wrocławiu, Kierownik: Prof. dr hab. Maria Sąsiadek
Izolowana trisomia ramion krótkich chromosomu 12 jest schorzeniem rzadko opisywanym w literaturze medycznej.
W obrazie klinicznym zwykle dominują objawy ciężkiego upośledzenia czynności ruchowych z uogólnioną hipotonią,
upośledzenie umysłowe i charakterystyczny wygląd twarzy. W pracy przedstawiamy powstały “de novo” przypadek
mozaikowej postaci trisomii ramienia krótkiego chromosomu 12, powstałej w wyniku translokacji 12p na ramię krótkie
chromosomu 5. W badaniu klinicznym dziecka stwierdzono opóźnienie rozwoju ruchowego z hipotonią mięśniową,
cechy dysmorficzne (hiperteloryzm, płaski profil okrągłej twarzy z wystającymi guzami czołowymi, niska nasada nosa,
krótki nosek, usta z wydatna wargą dolną, kąciki ust skierowane ku dołowi, niewielki niedorozwój żuchwy, krótka
szyja).
Badanie cytogenetyczne wykonano z limfocytów krwi obwodowej przy użyciu standardowych metod i barwienia
GTG. Badanie wykazało obecność dwóch linii komórkowychwej jednej prawidłowej, drugiej z obecnością naddatku
na ramieniu krótkim chromosomu pary 5. Badania cytogenetyczne rodziców nie wykazały żadnych zmian w zakresie
składu i budowy chromosomów. Badania metodą FISH wykonano przy użyciu zestawu sond malujących dla wszystkich
chromosomów (Multiprobe Octachrome firmy Cytocell) a następnie zestawu sond telomerowych (Chromoprobe
Multiprobe-T System firmy Cytocell). Badania te wykazały, że dodatkowy fragment na ramieniu krótkim chromosomu
5 pochodzi z ramienia krótkiego chromosomu 12. Badania sekwencji telomerowych wykazały, że translokacja dystalnej
części ramienia krótkiego chromosomu pary 12 na ramię krótkie chromosomu 5 wystąpiła bez utraty materiału
chromosomu 5.
P66.
Kompleksowe przegrupowanie chromosomowe u dziecka z wadą serca, mikrosomią
i opóźnionym rozwojem psycho-ruchowym.
Magdalena Białecka, A. Gutkowska, K. Spodar, M. Krajewska-Walasek
Zakład Genetyki Medycznej, Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka”, Al. Dzieci Polskich 20, 04-730 Warszawa
9-miesięczny chłopiec M.U. ze zwężeniem i niedomykalnością zastawki aortalnej, niedoborem masy ciała i wzrostu,
opóźnieniem rozwoju psychoruchowego, hipotonią mięśniową i zaburzeniami gospodarki wapniowo-fosforanowej
został skierowany do Poradni Genetycznej z podejrzeniem zespołu Williamsa. W badaniu przedmiotowym stwierdzono
następujące cechy dysmorfii twarzy: wydatne guzy czołowe, długi nos, małą żuchwę i wysokie podniebienie. �
Dziecko z nieobciążonym wywiadem rodzinnym, urodzone z ciąży pierwszej, powikłanej zagrażającym poronieniem
i niedoczynnością tarczycy u matki, z rodziców w wieku: matka 31 lat, ojciec 32 lata. Chłopiec urodził się w 42
tygodniu ciąży z cechami infekcji wewnątrzmacicznej, z wagą 4100g i długością 60 cm, oceniony został na 10 pkt Apgar.
W pierwszym tygodniu życia stwierdzono fizjologiczny spadek masy ciała. Obecnie mimo dużego apetytu obserwuje się
słaby przyrost masy ciała. Pomiary antropometryczne wykazały masę ciała poniżej 3 centyla i wysokość na poziomie 10
centyla. Obserwuje się opóźnienie rozwoju ruchowego.
Badanie metodą FISH z zastosowaniem sondy unikalnej ELN wykazało obecność sygnałów w obu chromosomach 7, co
wykluczyło postawioną wcześniej diagnozę zespołu Williamsa. Analiza kariotypu u pacjenta M.U. wykazała obecność
trzech nieprawidłowych chromosomów tzn. del(4), add(5) i add(9). Przy pomocy metody FISH z zastosowaniem
sond malujących (WCP) zlokalizowano przegrupowane fragmenty. Ostatecznie zmiany te oceniono jako przykład
CCR (Complex chromosomal rearrangement) – kompleksowego przegrupowania chromosomowego i zapisano jako
translokację trzech chromosomów:
46,XY,der(9)t(4;5;9)(4pter->4q28:;5pter->
5q33::9q22->9qter;9pter->9q22::4q28->4qter::5q28->5qter
Kariotypy rodziców są prawidłowe.
Pomimo zastosowania metod cytogenetyki klasycznej i molekularnej, trudno stwierdzić jednoznacznie czy mamy
do czynienia z translokacją zrównoważoną. Ze względu na obserwowane nieprawidłowości fenotypowe u dziecka,
sugerujące niezrównoważony kariotyp, planujemy poszerzenie badań.
67
Genetyka człowieka
P67.
Wstępna analiza ilościowa cech fenotypu morfologicznego w zespole
monosomii 5p.
Renata Posmyk (1), B. Panasiuk (1), Latos-Bieleńska (2), Wolnik-Brzozowska (2), M. Piotrowicz (3) ,
V. Kucinskas (4), O. Haus (5), L. Korniszewski (6), B. Kozak-Klonowska (7), A. Jakubiuk-Tomaszuk (1),
A. T. Midro (1)
1. Zakład Genetyki Klinicznej Akademii Medyczne, Białystok
2. Katedra i Zakład Genetyki Medycznej AM, Poznań
3. Zakład Genetyki ICZMP, Łódź
4. Zmogaus Genetikos Centras, Vilnius, Lietuva
5. Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej AM, Bydgoszcz
6. Klinika Diabetologii Dziecięcej i Wad Wrodzonych AM, Warszawa
7. Poradnia Genetyczna, Świętokrzyski Ośrodek Onkologiczny, Kielce
Zespół monosomii 5p („krzyku kociego”) (OMIM#123450) należy do klasycznych zespołów wywołanych aberracjami
chromosomowymi, który cechuje występowanie charakterystycznych cech dysmorficznych twarzy oraz zaburzenie
rozwoju psychoruchowego. Spektrum opisywanych cech dysmorficznych i wad rozwojowych jest szerokie, lecz dotychczas
nie podejmowano analizy ilościowej cech fenotypu morfologicznego za pomocą jednorodnego, usystematyzowanego
protokółu cech. Celem pracy jest określenie, które z cech fenotypu morfologicznego wykazują powtarzalność
niezależnie od wieku i wielkości utraconego materiału chromosomowego. Materiał do badań stanowiła grupa 22 dzieci
w wieku od 1 miesiąca do 18 lat z monosomią 5p (prosta delecja terminalna) potwierdzoną klasycznym badaniem
cytogenetycznym z zastosowaniem technik prążkowych o rozdzielczości 550 prążków. Do badań wykorzystano katalog
807 cech morfologicznych i klinicznych z bazy danych MDDB opracowanych przez Stengel-Rutkowski. Stwierdzono, że
z częstością powyżej 50% cech występują 44 cechy, co stanowi (ok. 5% cech ujętych w katalogu). Do nich należą: 15 cech
anamnestycznych oraz 29 cech klinicznych, z których najczęstsze to: niski wzrost, niska masa ciała, małogłowie, szeroko
rozstawione i skośnie w górę skierowane szpary powiekowe, zmarszczka nakątna, krótkie philtrum, zgryz otwarty,
wysokie, wąskie podniebienie. Wyniki porównano z historią naturalną pacjentki z monosomii 5p pozostającej pod
naszą obserwacją przez okres18 lat. Proponowane spektrum cech może być przydatne w klinicznym rozpoznawaniu
fenotypu morfologicznego monosomii 5p oraz do tworzenia ekspertowych baz danych do wspomagania diagnozowania
tego zespołu przy użyciu oprogramowania komputerowego.
P68.
Wewnątrzrodzinna zmienność ekspresji cech fenotypu morfologicznego w zespole
BOF (Branchio-Oculo-Facial syndrome) (skrzelowo-oczno-twarzowym).
Anna Jakubiuk-Tomaszuk (1), E. Hubert (2) , R. Posmyk (1), A. T. Midro (1)
(1) Zakład Genetyki Klinicznej AM, Białystok
(2) Klinika Chirurgii Szczękowo-Twarzowej AM, Białystok
Zespół skrzelowo-oczno-twarzowy (BOF, Branchio-oculo-facial syndrome) (OMIM # 113620) jest rzadkim,
wyodrębnionym stosunkowo niedawno (1982r) zespołem z przedwczesnym starzeniem się i z różnorodną ekspresją
cech w zakresie oczu, uszu i układu stomatognatycznego. Dotychczas opisano około 50 przypadków, w tym tylko siedem
form rodzinnych. Zakres zmienności ekspresji wewnątrzrodzinnej jest więc mało poznany. Celem pracy jest prezentacja
fenotypu morfologicznego 6-letniej dziewczynki i jej ojca. U obydwojga stwierdzono: krótki grzbiet nosa z szerokim,
skierowanym do dołu wierzchołkiem nosa, krótki odstęp nosowo-wargowy, zgrubiałe kolumny philtrum, rozszczep
podniebienia twardego, zdeformowane, nisko osadzone, małe, zrotowane do tyłu małżowiny uszy, klinodaktylię
5 palców dłoni, skórną syndaktylię 2–3 palców stóp. Ponadto u dziewczynki zwracały uwagę: niedobór masy ciała
i wzrostu, małogłowie, wydatny szew czołowy, rzadkie, nierównomierne owłosienie głowy (niedobór w okolicy
skroniowej), obustronne blizny po przetokach skrzelowych w okolicy szyi poniżej małżowin usznych, szczelina
tęczówki, niedrożny kanalik łzowy oka lewego, skórną syndaktylię 2-3 palców stóp. U ojca stwierdzono przedwczesne
siwienie. Na tej podstawie rozpoznano zespół BOF ze zmienną ekspresją cech u obydwojga badanych. Dane rodzinne
wskazują, że u dziadka wystąpił rozszczep wargi i podniebienia, co łącznie sugeruje autosomalny dominujący sposób
dziedziczenia zespołu.
68
Genetyka człowieka
P69.
Zespół TAR (Thrombocytopenia – absent radius): opis przypadku z agenezją ciała
modzelowatego, hipoplazją robaka móżdżku i nerką podkowiastą.
Agata Skórka (1), Lech Korniszewski (1), Jolanta Bielicka-Cymermann (2)
(1) Klinika Diabetologii, Patologii Noworodka i Wad Wrodzonych Akademii Medycznej w Warszawie
(2) Oddział Neurologii i Epileptologii Warszawskiego Szpitala dla Dzieci, Warszawa, ul. Kopernika
Zespół TAR, thrombocytopenia – absent radius syndrome (MIM 274000) jest zespołem wad wrodzonych, w którym
stwierdza się obustronny brak kości promieniowej z zachowanymi kciukami oraz trombocytopenię ze znacznie
zmniejszoną liczbą megakariocytów w szpiku lub ich brakiem. U części pacjentów występują dodatkowo wady serca
oraz inne anomalie układu kostnego, ale dopiero w ostatnich latach ukazały się pojedyncze doniesienia o występowaniu
wad ośrodkowego układu nerwowego i wad nerek. Częstość upośledzenia umysłowego w zespole TAR ocenia się na 7%
i zwykle jest ono skutkiem krwawienia do ośrodkowego układu nerwowego. Okres noworodkowy i niemowlęcy, zwykle
powikłany jest epizodami krwawień z powodu małopłytkowości i epizodami ostrych biegunek; objawy te nasilają się
w związku z częstą u tych dzieci alergią na białka mleka krowiego. W 1994 roku po raz pierwszy opisano dziewczynkę
z zespołem TAR i agenezją robaka móżdżku oraz ciała modzelowatego a w roku 2003 kolejnego pacjenta z dysgenezją
(?) móżdżku. W ostatnich latach opisano również występowanie u 3 pacjentów z tym zespołem nerki podkowiastej.
Przedstawiamy 3 letnią dziewczynkę z zespołem TAR, ciężkim upośledzeniem rozwoju psychoruchowego, całkowitą
agenezją ciała modzelowatego, niedorozwojem robaka móżdżku i nerką podkowiastą. Jest to pierwszy przypadek,
w którym stwierdzono występowanie anomalii OUN oraz nerki podkowiastej u jednego pacjenta z zespołem TAR.
P70.
Aplazja kości strzałkowej z ektrodaktylią
Dorota Gieruszczak-Białek, A. Skórka, J. Waligóra, M. Ołdak, L. Korniszewski
Klinika Diabetologii, Patologii Noworodka i Wad Wrodzonych Akademia Medyczna w Warszawie
Aplazja kości strzałkowej z ektrodaktylią jest rzadko występującym zaburzeniem, o ograniczonej penetracji
i zmiennym fenotypie. Dziedziczy się w sposób autosomalny dominujący, często występuje sporadycznie. Do tej pory,
w piśmiennictwie zostało opisanych 47 rodzinnych i sporadycznych przypadków. Przedstawiamy nowy przypadek aplazji
kości strzałkowej z ektrodaktylią i porównujemy z innymi opisanymi w literaturze. Nasza pacjentka jest pierwszym
dzieckiem zdrowych, młodych, niespokrewnionych rodziców. Urodziła się w 34 Hbd z masą ciała 2080g i długością 44
cm. Po urodzeniu stwierdzono skrócenie i łukowate wygięcie prawego przedramienia, skrócenie podudzi, oligodakytlię
rąk i stóp, syndaktylię prawej ręki. Rtg prawego przedramienia wykazał skrócenie kości łokciowej, ścienczenie i wygięcie
kości promieniowej. W badaniu rtg podudzi stwierdzono brak kości strzałkowej i ścieńczenie kości piszczelowej.
Kariotyp prawidłowy 46 XX. Wywiad rodzinny jest negatywny, co ma istotne znaczenia dla różnicowania sporadycznego
i rodzinnego wstępowania aplazji kości strzałkowej z ektrodaktylią.
P71.
Zespół Walker-Warburg u noworodka.
Jarosław Waligóra (1), Elżbieta Lipska (1), Dorota Gieruszczak-Białek (1), Monika Ołdak (1), Agata Skórka (1),
Lech Korniszewski (1), Anna Kamińska (2)
(1) Klinika Diabetologii, Patologii Noworodka i Wad Wrodzonych Akademii Medycznej w Warszawie
(2) Klinika Neurologii Akademii Medycznej w Warszawie
Zespół Walker-Warburg (MIM 236670) jest rzadką, letalną chorobą genetyczną należącą do wrodzonych dystrofii
mięśniowych skojarzonych z wadami OUN. W grupie tej znajdują się również dwa inne genetycznie uwarunkowane
zespoły: Wrodzona dystrofia mięśniowa Fukuyamy (FCMD) oraz Muscle-eye-brain disease (MEB). Zespół WalkerWarburg jest chorobą heterogenną pod względem etiologii. Do tej pory zmapowane zostały, co najmniej trzy lokus
genowe a jeden z genów został sklonowany. Mutacje w genie POMT1 zlokalizowanym na 9q34.1 są odpowiedzialne za
około 20% wszystkich przypadków zespołu.
W naszej pracy przedstawiamy przypadek zespołu Walker-Warburg u noworodka. Dziecko ur z C3, P3 w 41 hbd,
PSN, 1-2-4-7 Apgar z masą ciała 2780g. W badaniu przedmiotowym stwierdzono: uogólnioną hipotonię mięśniową,
przepuklinę oponowo-mózgową w okolicy ciemienia tylnego, gotyckie podniebienie, nakładanie drugiego palca na
trzeci u stóp. W badaniu OUN rezonansem magnetycznym wykazano całkowity brak zakrętów i bruzd między zakrętami
kory mózgowej o typie agyrii, hipoplastyczne ciało modzelowate, poszerzenie komór bocznych mózgu, wadę rozwojową
móżdżku oraz przepuklinę oponowo-mózgową w okolicy potylicznej. Obraz MR odpowiada wadzie rozwojowej typu
69
Genetyka człowieka
lisencefalii typ II.
W badaniu oczu stwierdzono obustronną jaskrę z anomalią Petersa i zmętnieniem. W badaniach dodatkowych
wykazano znaczny wzrost CPK > 20000U/l. Biopsja mięśnia potwierdziła rozpoznanie dystrofii mięśniowej.�
Na podstawie powyższych objawów rozpoznano zespół Walker-Warburg. W pracy omówiono objawy kliniczne oraz
diagnostykę różnicową.
P72.
Translokacja pomiędzy chromosomem 7 i 16 u dziecka z zespołem wad.
Jarosław Waligóra (1), Zofia Konarska (1), Joanna Brycz-Witkowska (2), Halina Stańczak (3), �
Dorota Gieruszczak-Białek (1), Agata Skórka (1), Monika Ołdak (1), Lech Korniszewski (1)
(1) Klinika Diabetologii, Patologii Noworodka i Wad Wrodzonych Akakdemii Medycznej w Warszawie
(2) Zakładu Anatomii Patologicznej, Pracownia Cytogenetyczna, Akademia Medyczna w Warszawie
(3) Zakład Patomorfologii Wieku Rozwojowego, Pracownia Cytogenetyczna, Samodzielny Publiczny Dziecięcy Szpital
Kliniczny w Warszawie
Przedstawiono przypadek zespołu wad wrodzonych u dziecka z niezrównoważoną translokacją 7;16.
Niemowlę płci żeńskiej, CII, PI (I ciąża obumarła w 9 Hbd) ur. w 38 Hbd, PSN, położenie miednicowe płodu, masa
ur.1400g/ 41cm, obw. głowy 24 cm, kl.p.26 cm, 3-7-8 pkt w skali Apgar. W badaniu fizykalnym stwierdzono cechy
dysmorfii: małogłowie, rozszczep wargi i podniebienia z hiperteloryzmem i fenotypem holoprozencefalii, nakładanie
palców dłoni. W badaniu USG ośrodkowego układu nerwowego potwierdzono obecność holoprosencephalii z brakami
przegrody międzykomorowej oraz wodogłowie dwukomorowe.
W wykonywanym ECHO serca stwierdzono VSD oraz zwężenie zastawki tętnicy płucnej. Kariotyp wykazał aberację
chromosomową 46XX, der(7) t(7;16) (q32.3;q22.1). Kariotyp ojca – zrównoważoną translokację wzajemną pomiędzy
długimi ramionami chromosomów 7 i 16 pary (46 XY, t(7;16) (q32.3;q22,1)). Wynik badania u dziecka i ojca został
potwierdzony FISH z sondami malującymi dla 7 i 16 pary chromosomów.
Monosomia części długiego ramienia chromosomu 7 i trisomia części długiego ramienia chromosomu 16 pary są
odpowiedzialne za obawy zespołu wad u przedstawianego pacjenta. Holoprosencephalia jest najprawdopodobniej
wynikiem utraty jednego allelu genu SHH na 7q36, którego mutacje powodują izolowaną postać tej wady. W pracy
przedstawiono porównanie fenotypu opisanego pacjenta z opisanymi w literaturze pacjentami z delecją części długiego
ramienia chromosomu 7 i duplikacją części długiego ramienia chromosomu 16 pary.
P73.
Cytogenetyczno-molekularna oraz kliniczna charakterystyka dwóch nowych
przypadków neocentrycznych chromosomów markerowych w NMCs.
Maria Constantinou, Iwona Płowaś, Bogdan Kałużewski
Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, 91-425 Łódź, ul. Sterlinga 1/3
Chromosomy markerowe, które wykazują obecność centromerów, bez sekwencji alfa-satelitarnego DNA reprezentują
interesującą grupę nieprawidłowych strukturalnie chromosomów. W/w markery nie dają pozytywnych sygnałów po
hybrydyzacji z odpowiednimi sondami centromerowymi i są w literaturze opisywane jako neocentryczne chromosomy
markerowewejNMCs. Uważa się, że stabilność mitotyczna NMCs jest związana z powstaniem neocentromeru
w predysponowanych do takich rearanżacji regionach chromosomowych. Prezentujemy kliniczną i molekularną
charakterystykę dwóch przypadków NMCs. W obydwu przypadkach technika FISH z sondą pancentromerową nie
wykazała obecności sekwencji alfa-satelitarnego DNA w obrębie NMCs. W przypadku 1, diagnozowanym prenatalnie,
technika CGH pozwoliła na stwierdzenie, że NMC pochodzi z chromosomu 1 i obejmuje dwa prążki 1q21 i 1q22. W 24
hbd stwierdzono wewnątrzmaciczną atrofię płodu z nieznacznymi cechami opóźnienia rozwoju płodu. Po autopsji
potwierdzono atrofię u dziecka. Jednakże wrodzonych wad rozwojowych nie stwierdzono. Przypadek 2 trafił do
Poradni Genetyki z wstępnym rozpoznaniem klinicznym zespołu Klinefeltera. Dodatkowo stwierdzono przyspieszony
w stosunku do wieku rozwój fizykalny, otyłość oraz nieliczne cechy dysmorfii w obrębie twarzoczaszki. Zastosowanie
sond malujących dla chromosomów X i Y wykluczyło gonosomalne pochodzenie NMC. Technika CGH umożliwiła
stwierdzenie, że NMC obejmuje jeden prążek – 15q22 z ramienia długiego chromosomu 15. Dodatkowo zastosowanie
techniki FISH z sondą specyficzną dla lokus PML (15q22) potwierdziło obecność tego lokus w obrębie NMC. W obydwu
przypadkach pochodzenie chromosomowe NMCs potwierdzono przy użyciu techniki M-FISH. Prezentowane
chromosomy markerowe są jednymi z najmniejszych NMCs opisanych w literaturze. Dodatkowo przypadek 2 jest
pierwszym przypadkiem NMC pochodzącym z chromosomu 15 z takimi puktami złamań chromosomowych.
70
Genetyka człowieka
P74.
Zespół fenyloketonurii matczynej w diagnostyce małogłowia i upośledzenia
umysłowego.
Ewa Starostecka (1), Agata Lange (1), Małgorzata Piotrowicz (2), Jarosława Przygocka (3)
(1) Poradnia Zaburzeń Metabolicznych, Specjalistyczna Przychodnia Pediatryczna, Instytut „Centrum Zdrowia Matki Polki”
w Łodzi 93-338 Łódź, ul.Rzgowska 281/289
(2) Zakład Genetyki Instytutu „Centrum Zdrowia Matki Polki”
(3) Samodzielna Pracownia Psychologii Klinicznej Instytutu „Centrum Zdrowia Matki Polki”
Fenyloketonuria (PKU) jest jedną z najczęstszych chorób metabolicznych. W Polsce rozpoznawana jest u 1: 8500
nowonarodzonych. Badania przesiewowe wszystkich noworodków, wczesne rozpoznanie i leczenie umożliwiają
prawidłowy rozwój umysłowy chorych dzieci. Problemem pozostaje nadal populacja chorych kobiet urodzonych przed
wprowadzeniem badań przesiewowych w kierunku PKU. Niektóre z nich mimo braku leczenia, osiągają zbliżony do
normy rozwój intelektualny. Dzieci urodzone przez te matki demonstrują objawy zespołu fenyloketonurii matczynej tj.
małogłowie, dysmorfię, inne wady wrodzone, opóźnienie rozwoju psychoruchowego będące wynikiem teratogennego
działania fenyloalaniny na płód.
W pracy przedstawiamy 6 dzieci w wieku od 3–13 lat pochodzących z 3 rodzin. Dzieci te były diagnozowane z powodu
małogłowia i upośledzenia rozwoju umysłowego, IQ – średnio 56. Wielokierunkowa diagnostyka tych pacjentów nie
pozwoliła na ustalenie przyczyny małogłowia. Ponownie zebrany wywiad rodzinny,a przede wszystkim analiza rozwoju
intelektualnego matek nasunęły podejrzenie zespołu fenyloketonurii matczynej, co zostało potwierdzone badaniami
biochemicznymi (stężenie fenyloalaniny u matek wynosiło 21,8 – 25,3 mg/dl).
Dzieci objęto stałą opieką wielospecjalistyczną (psycholog, kardiolog, nefrolog, neurolog) z uwagi na stwierdzane wady
wrodzone. Wdrożona stymulacja rozwoju nie przynosi niestety poprawy w zakresie rozwoju umysłowego.
W diagnostyce małogłowia, zwłaszcza współwystępującego rodzinnie należy brać pod uwagę nierozpoznaną
fenyloketonurię matczyną. Nie wykrycie tego zespołu u pierwszego dziecka skutkuje urodzeniem przez chorą matkę
kolejnych upośledzonych dzieci.
O aktualności problemu może świadczyć kolejna, będąca w trakcie diagnostyki rodzina, w której rozpoznanie PKU
u matki postawiono diagnozując najmłodsze upośledzone dziecko
P75. Submikroskopowa delecja 1qter u chłopca z wybitną dysmorfią twarzoczaszki
i opóźnieniem rozwoju psychoruchowego znacznego stopnia.
Anna Gutkowska, K. Spodar, A. Marczak, B. Goryluk-Kozakiewicz, M. Krajewska-Walasek
Zakład Genetyki Medycznej, Instytut-Pomnik „Centrum Zdrowia Dziecka”
Pacjenci z delecją 1q (q42 albo q43-gter) rozpoznaną za pomocą klasycznej analizy chromosomów, mają na tyle
charakterystyczny fenotyp, że doświadczony dysmorfolog na podstawie wyglądu dziecka i występujących anomalii może
przepowiedzieć tę aberrację przed wykonaniem badania cytogenetycznego. Podczas gdy duże delecje 1q stwierdzane
są stosunkowo często (opisano ponad 30 przypadków), opublikowano tylko 2 przypadki mikrodelecji tego regionu.
Prezentujemy chłopca z częściową trisomią dystalnego regionu 3p i submikroskopową dystalną delecją 1q.
U chłopca z ciąży trzeciej, porodu drugiego o czasie (z CI PI zdrowy syn, ciąża II zakończyła się wczesnym poronieniem
samoistnym), zakończonego cięciem cesarskim z powodu wahania tętna płodu, po urodzeniu stwierdzono: hipotrofię
(waga 2280 g, długość 48 cm, obwód głowy 32 cm), dysmorfię twarzoczaszki, wnętrostwo, koślawą prawą stopę oraz
obustronne zwichnięcie stawów biodrowych. Wykonane badanie cytogenetyczne wykazało prawidłowy kariotyp męski.
Dziecko w wieku 3 lat zostało skierowane do Poradni Genetycznej IP-CZD. U dziecka z głębokim niedoborem masy
ciała i wzrostu (poniżej – 3 SD) oraz małogłowiem (– 5 SD) stwierdzono: trigonocefalię z wyraźnie zaznaczonym
grzebieniem kości czołowej, głęboko i mongoidalnie ustawione szpary powiekowe, zmarszczki nakątne, szeroki i płaski
grzbiet nosa, wydatne prolabium oraz cofniętą żuchwę. Ponadto obserwowano bruzdę poprzeczną lewej ręki, zachodzące
na siebie palce stóp, obustronne wnętrostwo i hipoplastyczne zewnętrzne narządy płciowe. U pacjenta występowało
znaczne opóźnienie rozwoju psychoruchowego, w wieku 3 lat zaczynał samodzielnie siadać. Analiza rodowodu ujawniła
występowanie licznych przypadków upośledzenia rozwoju w rodzinie ojca probanda (u dwóch braci ojca oraz 5 osób
spośród jego ciotecznego rodzeństwa). Wykonane badanie za pomocą techniki FISH z zestawem sond subtelomerowych
wykazało brak sygnału z regionu (jednego) 1qter. Badania rodziców pozwoliły na ustalenie, że zmiana u dziecka jest
efektem translokacji zrównoważonej u ojca, w której uczestniczą dystalne regiony 1q i 3p. Kariotyp dziecka: 46,XY,der(
1)t(1;3)(q44;p25)pat, wskazuje na monosomię subtelomerowego regionu 1q oraz trisomię subtelomerowego regionu 3p.
Analiza fenotypowa i cytogenetyczna pozostałych członków tej rodziny być może pozwoli nam odpowiedzieć na pytanie,
71
Genetyka człowieka
czy istotnie fenotyp delecji 1qter, podobnie jak to obserwuje się w niektórych mikrodelecjach, jest na tyle specyficzny,
że może zasugerować ten defekt.
P76.
Zespół Walcott – Rallison u dziewczynki z mozaikową delecją(15)(q11-12).
Stanisław Zajączek (1), Elżbieta Petriczko (2), Mieczysław Walczak (2), Łukasz Kołodziej (3),
Krystyna Lisiecka (4)
(1) Zakład Genetyki i Patomorfologii Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie
(2) II Klinika Chorob Dzieci,
(3) Katedra i Klinika Ortopedii Dziecięcej,
(4) Zakład Stomatologii DziecięcejPomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie
WRS jest bardzo rzadką dysplazją nasadową z towarzyszącym zespołem dysmorficznym, opóźnieniem PNR i cukrzycą
typu I; jest on warunkowany AR mutacją genu czynnika inicjacji EIF2AK3 a gen jest zlokalizowany w 2p12. Czynnik ten
posiada przynajmniej cztery białka regulacyjne o nieznanej lokalizacji genowej.
Przedstawiono 5-letnie obserwacje 19 letniej pacjentki u której rozpoznano ostatnio, na podstawie typowych anomalii
kostnych i uzębienia, cech dysmorficznych, zaburzeń gospodarki węglowodanowej i opóźnienia PNR WRS.�
U dziewczynki stwierdzono początkowo delecję mos46,XX,del(15)(q11-12)/46,XX –25% vs.75% a diagnostyke
prowadzono w kierunku WPS lub bloku sterydów nadnerczowych. Jednakże badania techniką FISH (Doc.Dr Ewa
Bocian, Zakład Genetyki IMID) z trzech badanych markerów regionu WP(D15S11,SNRPN i D15S10) potwierdziły
delecję jedynie dla sondy SNRPN a zatem delecja znajduje się powyżej rejonu WPS.
Opisano dotąd zaledwie jeden przypadek WRS z delecją mozaikową 15q11-12 w 65 % metafaz (Stewart F.J.Clin.Genet,
1996,49,152-153) i o znacznie cięższym przebiegu. Można zatem przypuszczać,że w rejonie tym zlokalizowany jest gen
jednego z białek regulacyjnych dla EIF2AK3 – właściwego genu WRS.
P77.
Terminalna delecja (4)(q32) u dziewczynki z cechami fenotypowymi
odpowiadającymi CATCH 22.
Tatiana Chilarska (1), Agnieszka Potrzebowska (1), Wanda Hawuła (1), Anna Ulańska (1),
Katarzyna Ostrowska (2), Małgorzata Piotrowicz (1), Lucjusz Jakubowski (1)
(1) Zakład Genetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi
(2) Klinika Kardiologii Instytutu CZMP w Łodzi
Delecje terminalne ramion długich chromosomu 4 (4q) od poziomu prążka 4q31 wiążą się ze zmiennym obrazem
fenotypowym, obejmującym opóźnienie rozwoju umysłowego, rozszczep podniebienia, wady serca, nieprawidłowości /
anomalie w obrębie kończyn oraz charakterystyczne cechy dysmorfii. �
Delecje obejmujące odcinki położone dystalnie od prążka 4q32 są rzadsze i wiążące się z nimi cechy fenotypowe są
mniej charakterystyczne. Towarzyszy im łagodniejsze także opóźnienie rozwoju umysłowego.
Opisano 15-letnią pacjentkę skierowaną do Poradni Genetycznej z wrodzoną wadą serca (PS + RVOTO + VSD),
rozszczepem podniebienia (z towarzyszącymi problemami w żywieniu), mową nosową, nieznacznym niedosłuchem,
cechami dysmorficznymi w obrębie twarzoczaszki, klinodaktylią V palca obu rąk oraz upośledzeniem umysłowym
w stopniu umiarkowanym. W wywiadzie odnotowano także częste infekcje. Podjęto decyzję o badaniu kariotypu, gdyż
niektóre cechy mogły odpowiadać zespołowi CATCH22 i konieczne było postępowanie różnicujące w tym kierunku.
W rutynowym badaniu cytogenetycznym rozpoznano kariotyp 46,XX,del(4)(q32). Nie potwierdzono współistnienia
delecji w obrębie regionu krytycznego dla CATCH 22 po zastosowaniu sondy dla lokus D22S75.
Porównano i poddano dyskusji podobieństwa i różnice w obrazie fenotypowym pacjentki w stosunku do innych
chorych opisanych w literaturze.
72
Genetyka człowieka
P78.
Trisomia chromosomu 8 w kariotypie mozaikowym u 7-letniego chłopca.
Małgorzata Piotrowicz (1), Tatiana Chilarska (2), Anna Ulańska (1), Tadeusz Biegański (2), Renata Stawerska (3),
Barbara Wiśniewska (4), Lucjusz Jakubowski (1)
(1) Zakład Genetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi
(2) Zakład Diagnostyki Obrazowej
(3) Klinika Endokrynologii I CZMP w Łodzi
(4) Poradnia Psychologiczna Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi
Trisomię chromosomu 8 opisano po raz pierwszy w roku 1971. Większość jej przypadków rozpoznano w kariotypie
mozaikowym. Forma niemozaikowa jest zwykle letalna. Częstość występowania trisomii chromosomu 8 ocenia się
na 1:25000 do 1:50000 urodzeń z przewagą płci męskiej (5:1). Obserwowano, że w kariotypach mozaikowych linia
komórkowa z tą trisomią ma tendencję do zanikania z limfocytów krwi obwodowej wraz z wiekiem. U starszych
pacjentów może być widoczna jedynie w kariotypie fibroblastów skóry. Charakterystyczne dla tej aberracji cechy
fenotypowe opisał po raz pierwszy Pfeiffer w 1977 roku. Najczęściej obserwuje się długą, wąską twarz, płetwistość szyi,
wady układu kostno-stawowego i wady nerek, a rozwój umysłowy jest opóźniony w stopniu lekkim lub umiarkowanym.
Przeżywalność pacjentów z formą mozaikową trisomii 8 nie odbiega od przeciętnej dla populacji.
Przedstawiono przypadek 7-letniego chłopca urodzonego o czasie, siłami natury, z CIII, PIII, z masą urodzeniową
3350g, w stanie ocenionym w skali Apgar na 9 punktów. Dziecko skierowano do Poradni Genetycznej ze względu na
dysproporcje w budowie ciała, nieznacznie opóźniony rozwój psychoruchowy oraz obserwowane przymglenie rogówki
oka lewego. Stwierdzano ponadto cechy dysmorfii twarzy, wadę klatki piersiowej, młotkowatość palców stóp oraz
wnętrostwo prawostronne.
W rentgenogramach kośćca stwierdzono osteopenię, poszerzenie przynasad kości długich ze stosunkowo cienkimi
trzonami, hipoplastyczne rzepki, liczne anomalie kości stóp, hipoplazję panewki stawu ramiennego, zmniejszenie wymiaru
poprzecznego klatki piersiowej i szerokie żebra. Ogólną sprawność intelektualną chłopca oceniono na pogranicze rozwoju
prawidłowego z wyraźnie jednak opóźnionym rozwojem mowy czynnej. W toku diagnostyki cytogenetycznej rozpoznano
u pacjenta kariotyp 47,XY,+8[8]/46,XY[42]. Opisywane cechy fenotypu korelują z innymi przypadkami tego typu.
P79.
Trudności diagnostyczne u 5-letniej dziewczynki z cechami dysmorfii, makrocefalią,
zespołem Chiarii I, szczeliną tęczówki, hypotonią i opóźnieniem rozwoju.
Małgorzata Piotrowicz (1), Tatiana Chilarska (1), Agata Lange (2), Emilia Nowosławska (3),
Danuta Łosowska-Kaniewska (4), Barbara Wiśniewska (5), Lucjusz Jakubowski (1)
(1) Zakład Genetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki
(2) Poradnia Metaboliczna I CZMP
(3) Klinika Neurochirurgii, I CZMP
(4) Zakład Diagnostyki Obrazowej I CZMP
(5) Poradnia Psychologiczna Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi
Zaprezentowano przypadek 5-letniej dziewczynki obserwowanej od okresu noworodkowego ze względu na stwierdzaną
makrosomię, makrocefalię, hipotonię, szczelinę tęczówki oka lewego, cechy dysmorfii, nadmierne owłosienie, głębokie
bruzdy podeszwowe i dłoniowe, głos o niskim brzmieniu oraz opóźnienie rozwoju psychoruchowego. Pacjentka jest
drugim dzieckiem zdrowych, niespokrewnionych rodziców; ma zdrową, starszą siostrę.
W pierwszych miesiącach życia obraz fenotypowy sugerował wykluczenie szeregu chorób metabolicznych, wrodzonej
niedoczynności tarczycy oraz aberracji chromosomowych. Otrzymano wyniki prawidłowe. W 10 miesiącu życia
obraz tomograficzny mózgowia oraz wynik badania RM pozwoliły na zdiagnozowanie obecności wodogłowia
nadnamiotowego z radiologicznymi cechami zespołu Chiarii I. Po wszczepieniu zastawki komorowo-otrzewnowej oraz
następowej kraniektomii podpotylicznej i laminektomii C1-C2 stan dziewczynki zaczął ulegać stopniowej poprawie.
Nadal utrzymywała się jednak niewielka wiotkość, makrosomia i opóźnienie rozwoju psychoruchowego z dominującym
opóźnieniem rozwoju mowy czynnej. Około 2 roku życia zaobserwowano niewielką hyperpigmentację skóry
z pojedynczymi plamami odbarwieniowymi na skórze brzucha, a w 5 roku życia linijną plamę „cafe au lait” w obrębie
skóry tułowia.
W diagnostyce różnicowej uwzględniono: zespół Costello (MIM 218040), zespół Noonan (MIM 163950), hypomelanozę
Ito (MIM 300337), zespół Weaver (MIM 277590), zespół Teebi (MIM 277590) oraz zespół makrocefalii z wrodzoną
marmurkowatością i teleangiektatycznością skóry (macrocephaly-cutis marmorata teleangiectatica congenita syndrome;
MIM 602501).
73
Genetyka człowieka
P80.
Mikrodelecja 22q11.2 [del(22q11.2)] u dzieci z wrodzonymi wadami serca.
Bożenna Goryluk-Kozakiewicz, L. Ziółkowska, M. Czerwiecka, E. Sośnierz-Chmielińska, A. Gutkowska,
M. Gajdulewicz, K. Chrzanowska, K. Spodar, W. Kawalec, M. Krajewska-Walasek
Zakład Genetyki Medycznej, Klinika Kardiologii, Instytut-Pomnik „Centrum Zdrowia Dziecka”
Del(22q11.2) występuje z częstością ok. 1 na 2000 w populacji generalnej i charakteryzuje się znaczną zmiennością
objawów u poszczególnych pacjentów. Wśród objawów obserwuje się m.in. specyficzną dysmorfię twarzy, aplazję
grasicy, hipoplazję przytarczyc, niedobory immunologiczne, nieprawidłowości w zakresie budowy i funkcji podniebienia
i gardła, zaburzenia psychiczne oraz wiele innych objawów. Aż u 75% chorych z del(22q11.2) rozpoznaje się wadę/wady
serca. Najczęściej są to wady rozwojowe serca i wielkich naczyń dotyczące podziału stożka i pnia naczyniowego. Szacuje
się, że u dzieci z izolowaną wadą serca stożka i pnia naczyniowego del(22q11) występuje z częstością od 10-29%.
Badaniami objęto grupę 300 dzieci w wieku 18 lat, u których stwierdzono występowanie różnych wrodzonych wad
serca, w tym m.in. stożka i pnia naczyniowego, w formie izolowanej oraz współistniejących z dysmorfią twarzy
i innymi anomaliami. Badania cytogenetyczne wykonano na limfocytach krwi obwodowej. Analizę kariotypów
prowadzono wg metod standardowych, del(22q11.2) identyfikowano przy zastosowaniu techniki FISH. Stwierdzono
występowanie del(22q11.2) u 16 dzieci (5,3% całej grupy badanej), w tym u jednego poza del(22q11.2) stwierdzono
obecność dodatkowego chromosomu X [47,XXY.ish del(22)(q11.2q11.2)(D22S75-)]. U rodziców dzieci z del(22q11.2)
identyczna zmiana została wykryta u 2 matek na 7 badanych dotychczas par rodzicielskich (28%). Ponadto w badanej
grupie wykryto trzy aberracje chromosomowe powstałe de novo: 46,XY,t(1;13)(q42;q14); 47,XYY, 46,XX/47,XX,+mar,
oraz jedną translokację niezrównoważoną [46,Y,der(X)t(5;X)(q33.2;p22.3)] pochodzenia matczynego.
Wstępna analiza wyników wskazuje na istotny udział del(22q11.2) w powstawaniu wad wrodzonych serca.
W przypadkach izolowanych wad stożka i pnia naczyniowego występuje rzadko (ok. 3%), natomiast jeśli wady te
współistnieją z typową dysmorfią twarzy i/lub bez innych anomalii, delecja ta stwierdzana jest u ponad 40% takich
chorych. W ponad 25% przypadków delecja występuje rodzinnie, a rodzic ją posiadający może nie wykazywać żadnych
objawów klinicznych.
Praca wykonana w ramach projektu KBN nr 0553/P05/2002/22
P81.
Częściowa trisomia 4q i monosomia 9p u dziecka – opis przypadku.
Anna Lauda-Świeciak (1), Danuta Kurylak (2), Ewa Duszeńko (3), Krystyna Soszyńska (1,3)
(1) Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej AM w Bydgoszczy
(2) Wojewódzki Szpital Dziecięcy w Bydgoszczy
(3) Pracownia Cytogenetyczna, Katedra i Klinika Hematologii AM we Wrocławiu
Nieprawidłowości chromosomowe stanowią znaczny odsetek chorób genetycznie uwarunkowanych. Niezrównoważone
aberracje autosomalne są jedną z głównych przyczyn wad wrodzonych i upośledzenia umysłowego.
Celem pracy była analiza korelacji zmian cytogenetycznych z fenotypem 5-miesięcznego niemowlęcia płci żeńskiej,
skierowanego do Poradni Genetycznej z powodu cech dysmorficznych i zespołu wad wrodzonych. Dziewczynka ze
środowiska wiejskiego, rodziców młodych, zdrowych, niespokrewnionych, urodzona w 40 Hbd z mc 2880g .
W wywiadzie rodzinnym: rodzice dziecka przez 2 lata mieli trudności z poczęciem, u siostry ojca dziecka dwukrotnie
nastąpiła utrata ciąży. W pierwszych godzinach po urodzeniu stwierdzono u dziecka cechy dysmorfii (mała, guzowata
czaszka z wystającymi szwami, wąskie, krótkie szpary powiekowe, hipoplastyczny nos z niewykształconymi skrzydełkami,
obustronnie przed małżowinami usznymi pozostałości łuków skrzelowych w postaci otworów, hipoplastyczne paznokcie,
“małpia bruzda” na prawej dłoni, klinodaktylia dystalnych policzków V palców dłoni, czoło, boczne powierzchnie
twarzy, ramiona, uda, pokryte krótkimi, czarnymi włoskami), obrzęki, wadę serca (koarktacja aorty, ubytek przegrody
międzyprzedsionkowej typu ASD II, przetrwały przewód tętniczy) oraz drgawki, prawdopodobnie hipoglikemiczne.
W trakcie dalszej diagnostyki rozpoznano niedoczynność tarczycy oraz obustronny refluks pęcherzowo-moczowodowy;
napady hipoglikemii utrzymują się.
Występujące cechy dysmorfii oraz zaobserwowane zaburzenia endokrynologiczne i neurologiczne są podobne do
opisywanych w literaturze przypadków częściowej trisomii 4q.
Badanie cytogenetyczne limfocytów krwi obwodowej wykonane techniką GTG oraz FISH z sondami WCP4 i WCP9
wykazało u dziecka obecność nieprawidłowego kariotypu 46,XX,der(9)t(4;9)(q21;p22), inv(9)(p12q12) z częściową
trisomią ramienia długiego chromosomu4 i częściową monosomią ramienia krótkiego chromosomu 9. U matki dziecka
stwierdzono kariotyp prawidłowy żeński z inwersją inv(9)(p12q12). Ojciec dziecka nie zgłosił się do Poradni Genetycznej
74
Genetyka człowieka
P82.
Trisomia translokacyjna ramion krótkich chromosomu 9 u dziewczynki
z 46,XX,15, +t(9;15)(q10;q10).
Anetta Juraszek (1), Krystyna Soszyńska (1), Sylwia Cettler (2), Ewa Duszeńko(3), Olga Haus (1,3)
(1) Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej AM w Bydgoszczy
(2) Wojewódzki Szpital Zespolony w Toruniu
(3) Pracownia Cytogenetyczna, Katedra i Klinika Hematologii AM we Wrocławiu
Aberracje chromosomu 9 są jedną z przyczyn występowania zespołów wad rozwojowych u noworodków. Najczęściej
opisywana jest całkowita trisomia ramion krótkich, rzadziej inne niezrównoważone aberracje oraz bardzo rzadko
trisomia ramion długich. U noworodków z trisomią 9p opisywano zmniejszenie masy i długości ciała, hipotonię
mięśniową, objawy dysmorfii czaszkowo-twarzowej (mikrocefalia, wąskie, mongoloidalnie ustawione szpary powiekowe,
głęboko osadzone gałki oczne, hiperteloryzm, wydatny nos, zniekształcenie małżowin usznych, gotyckie podniebienie
lub jego rozszczep), zmiany kostne oraz wady serca i układu moczowo-płciowego.
Celem pracy była analiza korelacji kariotypowo-fenotypowych u 2-miesięcznej dziewczynki skierowanej do Poradni
Genetycznej z powodu podejrzenia zespołu Downa.
Dziewczynka ze środowiska miejskiego, rodziców młodych, zdrowych, nie spokrewnionych, urodzona siłami natury
w 39 Hbd, z ciąży pierwszej, w stanie ogólnym dobrym (8 pkt wg skali Apgar), z masą urodzeniową 2400 g. W trakcie ciąży
matka była trzykrotnie hospitalizowana z powodu wielowodzia i hipotrofii płodu. Po porodzie u matki stwierdzono
wysokie miana przeciwciał TOXO-IgM i IgG. U dziecka od urodzenia obserwowano zaburzenia oddychania
i policytemię.
W badaniu przedmiotowym stwierdzono drobną budowę ciała, duże ciemię tylne, trójkątną twarz, fałd nakątny, zez
zbieżny oka prawego, nisko osadzone, asymetryczne małżowiny uszne, trójkątne usta, wysokie podniebienie, obustronną
“małpią bruzdę”, klinodaktylię V palców rąk, hipoplazję paznokci kończyn górnych i dolnych, prężenia kończyn dolnych,
objaw Raynauda w obrębie kończyn górnych.
Badanie cytogenetyczne limfocytów krwi obwodowej wykonane techniką GTG oraz FISH z sondami WCP9 i WCP15
wykazało u dziecka obecność nieprawidłowego kariotypu 46,XX,-15,+t(9;15)(q10;q10). Wyniki badania kariotypu
rodziców były prawidłowe.
Konstelacja objawów fenotypowych u dziewczynki wydaje się być wynikiem obecności nieprawidłowego kariotypu oraz
współistnienia wrodzonego zakażenia Toxoplasma gondii.
P83.
Częściowa trisomia 7p w dwóch kolejnych ciążach z rozpoznanymi wadami
rozwojowymi u płodów, jako efekt matczynej zrównoważonej translokacji między
chromosomami 7 i 22 [t(7;22)].
Grzegorz Nowicki (1), Wojciech Ałaszewski (1), Maria Respondek-Liberska (2), Marek Kozarzewski (3),
Magdalena Kozłowska (1), Wanda Hawuła (1), Iwona Pinkier (1), Anna Jelska (4), Alina Midro (4),
Lucjusz Jakubowski (1)
(1) Zakład Genetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi
(2) Zakład Diagnostyki i Profilaktyki Wad Wrodzonych I CZMP
(3) Zakład Ultrasonografii Ginekologiczno-Położniczej I CZMP�
(4) Zakład Genetyki Klinicznej AM w Białymstoku
Przedstawiono przypadek dwukrotnego niepowodzenia w donoszeniu ciąży u pacjentki z nosicielstwem translokacji
zrównoważonej t(7;22)(p11.2?;p11.2?) lub t(7;22)(q11.2?;q11.2?).
W ciąży I ze względu na opisywaną w badaniu usg hipotrofię płodu, nieprawidłowy obraz główki oraz przerost mięśnia
sercowego wykonano kordocentezę genetyczną w 33/37 tygodniu ciąży i stwierdzono częściową trisomię ramion krótkich
chromosomu 7, w wyniku ich translokacji na chromosom 22. Badania kariotypu rodziców pozwoliły na rozpoznanie
translokacji zrównoważonej t(7;22) u matki. Opis sekcyjny noworodka wykazał dodatkowo torbielowatą prawą nerkę
oraz cechy dysmorfii twarzowej, a także zmiany w budowie mózgu o typie DandywejWalkera.�
W ciąży II ze względu na stwierdzoną u matki translokację w 15 tygodniu ciąży wykonano diagnostyke przedurodzeniową.
Podobnie jak w ciąży I rozpoznano częściową trisomię 7p. Wykonane szczegółowe badanie usg wskazywało na hipotrofię
płodu, wadę serca, wodonercze, nieprawidłową budowę mózgu z cechami pozwalającymi podobnie jak w ciąży
pierwszej podejrzewać zespół DandywejWalkera. Ocena morfotyczna płodu była trudniejsza ze względu na mniejsze
zaawansowanie ciąży (17/20 tydzień) w stosunku do ciąży pierwszej (37 tydzień).
Analiza punktów złamań, wskazuje że mogły wystąpić dwa warianty: t(7;22)(p11.2;p11.2) lub t(7;22)(q11.2;q11.2).
75
Genetyka człowieka
Dla pierwszego ryzyko niezrównoważenia kariotypu u dziecka wynosi 4,35 +– 3,01% (2/46) zarówno w przypadku
nosicielstwa translokacji przez matkę jak i przez ojca. Dla drugiej opcji jest zerowe.
W kolejnej, trzeciej ciąży, diagnozowanej przedurodzeniowo stwierdzono prawidłowy, męski kariotyp płodu. Pacjentka
urodziła zdrowego, donoszonego chłopca.
P84.
Dysplazja czołowo-przynasadowa w rodzinie ze zmienną ekspresywnością cech
fenotypowych.
Izabela Brożek (1), K. Ochman (1), J. Wierzba (2), J. Limon (1)
(1) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Akademia Medyczna w Gdańsku
(2) Klinika Pediatrii, Hematologii, Onkologii i Endokrynologii Akademii Medycznej w Gdańsku
Dysplazja czołowo-przynasadowa (FMD) jest niezwykle rzadką genetycznie uwarunkowaną chorobą zajmującą układ
kostno-stawowy oraz tkankę łączną. W około 50% przypadków stwierdza się mutację genu filaminy A zlokalizowanego
w chromosomie X. Najbardziej charakterystyczną cechą choroby jest charakterystyczny wygląd twarzy, w którym zwraca
uwagę nadoczodołowe zgrubienie kostne oraz inne cechy dysplazji kostnej. Choroba wykazuje znaczną zmienność
kliniczną i przebiega zwykle ciężej u mężczyzn.
Przedstawiamy rodzinę, w której występuje FMD zarówno u kobiet, jak i u mężczyzn, wśród których są przypadki
o bardzo skąpej symptomatyce. Probantka, 14-letnia dziewczynka prezentuje typowe cechy choroby: małogłowie,
wydatne zgrubienia nadoczodołowe, krótka rynienka podnosowa, mała broda, mikro- i retrognacja, drobne zęby,
nisko schodząca na czoło linia włosów, krzaczaste brwi, arachnodaktylia, boczne skrzywienie kręgosłupa. Sylwetka
dziewczynki jest marfanoidalna, mięśnie szkieletowe słabo rozwinięte. Badanie TK3D uwidoczniło nadmierne
kostnienie w okolicy oczodołów, brak prawidłowego modelowania przynasad kości długich. U 22-letniej siostry
probantki obserwuje się dyskretne objawy dysplazji kostnej. Pozostali członkowie rodziny wykazujący cechy choroby
to brat ojca matki i jego syn. Matka i dziadek probantki nie wykazują cech choroby mimo, że ze względu na miejsce
w rodowodzie są oni potencjalnymi nosicielami mutacji. Badania molekularne (mutacje genu filaminy A) zarówno
u probantki, jak i jej siostry są w trakcie. Zmienność ekspresywności objawów fenotypowych w obrębie rodziny może
wskazywać na udział innych genów w rozwoju choroby.
Wykłady plenarne:
W42.
Genetic Services in Europe: the way forward
Jean-Jacques Cassiman
Center for Human Genetics, KU Leuven, Belgium
Genetic services in Europe, while based on high quality scientific know-how, suffer from an intolerably high level of
technical errors and poor reporting, caused by a lack of structuring and complementarity at the European level and the
absence of a common European objective to provide quality services to all its consumers now and in the future. Diverse
and heterogeneous quality schemes, lack of reference systems and differing Member State (MS) regulations, have added
to the overall disorganization and fragmentation of services.
Nevertheless, genetic services face an ever-increasing number of requests for testing, while widespread susceptibility
testing and pharmacogenetic tests are lurking on the horizon.
With the active participation of stakeholders, an EU funded network of excellence has been set up that twill stat its
activities in 2005. The EUROGENTEST NoE intends to structure, harmonize and improve the overall quality of these
services, while paying substantial attention to issues resulting from testing including legal, health policies and health
economic impact, IPR (Intellectual Property Rights), ethical and social questions: confidentiality, informed consent,
employment and insurance.
The EUROGENTEST NoE will attempt to improve the organization and harmonization of external quality assessment/
assurance schemes, facilitate the development of guidelines and support the accreditation/certification of the genetic
services. In addition, collaboration between academic centers and the private sector on technology development and
the validation of genetic tests, should generate more rapid translation and accurate, more economical and overall better
testing technologies. A quality website, with all relevant information will be developed and made accessible to experts
and customers.
With the help of Parent and Patient Support Groups, the EUROGENTEST NoE will collect quality tools for education
76
Genetyka człowieka
of different categories of stakeholders. Training for personnel both from within and from outside the EU will be
provided.
The already substantial number of female scientists involved in the EUROGENTEST NoE, will be further increased and
a female scientist will assume responsibility of supervising gender issues.
Finally, the EUROGENTEST NoE aims at becoming a model for similar initiatives in developing countries and will
provide appropriate support for their development.
The EUROGENTEST network aims at developing the necessary infrastructure, tools, resources, guidelines and
procedures leading to the establishment of harmonized, quality genetic testing services in Europe, which can interact
with, stand as a model for, or help to achieve similar services on other continents.
This will be achieved by bringing together, in a real long-term partnership, experts and expert centers available in
Europe engaged on different aspects of testing, including researchers, small and medium enterprises (SMEs), testing
laboratories, quality management and public health experts, ethicists, lawyers, sociologists, educational authorities and
consumers.
The tools used to achieve the goals of the network will be (1) the promotion of research, proper utilization, quality
assurance and control, and adequate management of genetic tests, (2) the creation of quality information resources that
can be readily accessed, ultimately facilitating the emergence of new tests (e.g. for rare diseases for which tests are not
available) and the improvement of existing ones (higher accessibility and improvement of genotyping techniques in terms
of lower costs, higher efficiency and specificity), (3) agreement on best practice guidelines and protocols, strengthening,
unification and organization of quality assessment schemes and accreditation of laboratories to achieve harmonization
and high quality of the services offered across the EU, (4) establishing a knowledge and technology platform to facilitate
impact assessment and information flow, and (5) joining resources in the area of rare disease services, where uniform
patient access and quality standards are even more limited by the low number of affected individuals.
The EUROGENTEST NoE will focus on the quality of genetic services, measured against existing European and
international or developing quality norms for laboratory bench tests in the cytogenetics, molecular and biochemical
genetics sectors (accreditation and certification as appropriate through ISO 17025, ISO15189, Good Laboratory
Practice (GLP). In addition the network will consider the quality of informatic systems, which are or will be available to
stakeholders including researchers, medical and non-medical clinical and laboratory personnel, consumers, authorities
and legislators. In addition, ethical, legal, intellectual property and societal issues related to these services will be
evaluated and recommendations for their appropriate management will be formulated. A network of Health Technology
Assessment units, from a number of different member states (MS) will evaluate the impact of genetic testing services
on public health policies and economics. Recommendations to address potential problems will be drafted. An audit
of quality educational material relevant to genetic services will be performed and disseminated and new educational
materials will be developed and made available to key member state representatives. Through interactions with SMEs
a network will be created which should allow the appropriate, quality controlled and focused development of new
technologies for testing.
W43.
Complex traits – a new challenge for clinical genetics
Jacek J. Pietrzyk
Department of Medical Genetics, Chair of Pediatrics, Medical Faculty, Jagiellonian University
The term “complex traits” refers to the diseases, whose inheritance does not follow the simple Mendelian pattern. They
are usually defined as disorders where one or more genes acting in the concert together with or without environmental
factors increase or diminish the risk of trait occurrence. Therefore, in broad sense, complex traits comprise disorders
with oligogenic, poligenic and multifactorial etiology. In contrast to the rare Mendelian diseases, complex traits represent
relatively common disorders responsible for significant population burden. In addition to the “big three” represented
by cancer, psychiatric diseases and cardiovascular diseases, this group comprises also a vast majority of congenital
malformations, diabetes, asthma and rheumatoid arthritis, just to mention the most common entities. These traits are
characterized by significant phenotype variation and in many instances reveal a quantitative phenotype. Therefore,
loci carrying the determinants of these traits are termed “quantitative trait loci” (QTL). In comparison to Mendelian
disorders, where many responsible genes have been cloned, the number of identified genes, which contribute to the
etiology of complex trait is really low. The major causes, which make gene identification so difficult, are represented by:
locus heterogeneity, epistasis, different penetrance and expressivity, pleiotropy and limited statistical power of genetic
analyses. Since in many complex traits there is a significant influence of environmental factors, one would like to measure
the contribution of genetic, heritable factors to the etiology and phenotype of complex diseases. The most commonly
used parameter is heritability expressing the proportion of phenotype variation of a trait in a given population, which is
due to genetic determinants. Heritability can be estimated from twins concordance or parent sib correlations. Assuming
77
Genetyka człowieka
a significant impact of complex traits on the population well-being in general, a search for genes, which underlie complex
disorders is highly warranted. This very complicated and tedious task needs a bunch of analytical procedures applied
in a stepwise approach. The first step is to establish a significant linkage or association between the locus or allele and
the trait in question. Linkage analysis based on the co-segregation of the genetic marker and the trait within a family
may provide the first information about the chromosomal fragment carrying disease gene(s). As an initial procedure,
a genome-wide screen applying several hundreds of highly polymorphic genetic markers evenly distributed over the
genome may be used. With the access to large, multigeneration pedigrees, or with a proper selection of a substantial
number of nuclear families with at least two affected siblings, linkage analysis is a powerful method for localizing the
locus with a disease gene. Another approach is based on association analysis, which compares the frequency of specific
markers between the group of unrelated cases and healthy controls. This method is population-based and has two
major requirements: unbiased selection and precisely defined phenotypes eliminating heterogeneity. An alternative
to association is linkage disequilibrium representing nonrandom association of two alleles. Linkage and association
analyses represent low resolution methods, which permit to focus on the 10-30 cM chromosomal fragment possibly
containing disease genes. The next step is a fine mapping reducing the critical region to the minimal interval of 1 cM
with the modest number of potential candidate genes, which makes sequence analysis and functional studies feasible.
When the information about the potential involvement of particular gene in disease patomechanism is available, then
gene candidate approach based on specific linkage and/or association analysis is used. This can be performed as casecontrol, simplex and multiplex families studies. The most conclusive evidence on the candidate gene being involved in
the patomechanism of the disease is functional test based on knock-in or knock-out technology in model animals with
human diseases.
There are many thresholds in the identification of genes responsible for complex traits. Firstly, due to the fact that these
traits are in majority polygenic. Secondly, very little is known about the interaction and modifying effects of these
genes and it is supposed that complex traits may result from polymorphic variants in non-coding regulatory sequences.
Thirdly, dissecting the interaction between the environment and the genes is extremely difficult, because of the lifelong
cumulative outcome. Fourthly, a highly efficient and powerful statistical test should be available in an attempt to avoid
bias and spurious linkage/association results.
Therefore, what is the best approach to the elusive matter of complex diseases? There is general consent that such
a strategy should be based on large epidemiological studies of many different populations, including isolates.
Collaborative multicenter studies including data banking and sharing for pooled analyses are needed for identification
of genes of major effects, but especially for identification of many genes of small cumulative effects which contribute to
the etiology of complex diseases. A special emphasis should be placed on the outcome of combined effect of genotypeenvironmental interaction.
References:
1. Cooper R.S. Gene-environment interactions and the etiology of common complex disease. Ann. Intern.
Med. 2003; 139; 437–440
2. Darvasi A., Pisanté-Shalom A. Complexities in the genetic dissection of quantitative trait loci. Trends Genet.
2002; 18; 489-491
3. Glazier A.M., Nadeau J.N., Aitman T.J. Finding genes that underlie complex traits. Science. 2002; 298; 2345–2349
4. Kraft P., Horvath S. The genetics of gene expression and gene mapping. Trends Biotechnol. 2003; 21; 377–378
5. Peltonen L., McKusick V.A. Genomics and medicine. Dissecting human disease in the postgenomic era.
Science. 2001; 291; 1224–1229
6. Rees J. Complex disease and the new clinical sciences. Science. 2002; 296; 698–701
7. Thomson G., Esposito M.S. The genetics of complex diseases. Trends Cell Biol. 1999; 9; M17–20
78
Genetyka człowieka
Choroby wieloczynnikowe
Komunikaty ustne:
W44.
Polimorfizmy genu MTHFR u osób z chorobą niedokrwienną serca o różnym stopniu
zaawansowania zmian miażdżycowych w tętnicach wieńcowych.
Joanna Sokołowska, Włodzimierz Skorupski, Andrzej Cieśliński, Wiesław H. Trzeciak
Instytut Kardiologii AM w Poznaniu
Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej AM w Poznaniu
Choroba niedokrwienna serca (CNS) jest schorzeniem o etiologii wieloczynnikowej, rozwijającym się na podłożu
genetycznym. Jednym z intensywnie badanych czynników ryzyka CNS jest endogenny aminokwas homocysteina
(Hcy) oraz zaburzenia jego przemiany, spowodowane występowaniem mutacji i polimorfizmów w genach kodujących
enzymy metabolizmu Hcy, zwłaszcza reduktazy metylenotetrahydrofolianowej. Celem pracy było oszacowanie
korelacji polimorfizmów C677T, A1298C, G1793A genu MTHFR z występowaniem CNS, zaawansowaniem zmian
miażdżycowych w tętnicach wieńcowych oraz stężeniem Hcy u 260 chorych z populacji polskiej. Ponadto podjęto próbę
korelacji stężenia Hcy z wiekiem, płcią, zaawansowaniem zmian miażdżycowych oraz stężeniem metioniny w osoczu.
Potwierdzono, że stężenie homocysteiny rośnie z wiekiem i jest wyższe u mężczyzn oraz u osób z CNS oraz najwyższe
u chorych z trzema zaatakowanymi naczyniami. Nie stwierdzono różnego rozkładu genotypów polimorfizmu C677T
pomiędzy grupą chorych i kontrolną. Potwierdzono też, że nie ma korelacji pomiędzy A1298C, a wystąpieniem choroby,
a częstość genotypów tego polimorfizmu u osób z CNS oznaczono w Polsce po raz pierwszy. Podjęto też po raz pierwszy
na świecie, próbę korelacji pomiędzy polimorfizmem G1793A, a wystąpieniem choroby, która jednak nie wykazała
takiego związku. Nie wykazano też zależności zaawansowania miażdżycy od genotypu wszystkich trzech polimorfizmów.
Stwierdzono, że poziom Hcy jest wyższy u nosicieli allelu T polimorfizmu C677T, a polimorfizmy A1298C oraz G1793A
nie wpływają na jej stężenie. Równocześnie wykazano, że stężenie metioniny nie różni się istotnie pomiędzy grupą chorych
i grupą kontrolna, a jej poziom nie zależy od żadnego z badanych polimorfizmów. Wnioskuje się, że występowanie
polimorfizmów C677T, A1298C, G1793A genu MTHFR nie jest czynnikiem ryzyka CNS w populacji polskiej.
W45.
Próba wyjaśnienia molekularnego podłoża wrodzonego zespołu wydłużonego QT
w populacji polskiej.
M. Borucka-Mankiewicz, E. Popowska, P. Kowalski, E. Ciara, D. Piekutowska-Abramczuk, D. Jurkiewicz,
K. Bieganowska, M. Krajewska-Walasek
Zakład Genetyki Medycznej, Zakład Kardiologii IPCZD.
Wrodzony zespół wydłużonego QT (LQTS) charakteryzuje się stałym lub okresowym nieprawidłowym wydłużeniem
odstępu QT w zapisie elektrokardiograficznym. Choroba może występować jako zespół Jervella i Lange-Nielsena
(odmiana 1, JLN1 i odmiana 2, JNL2), dziedziczonym w trybie autosomalnym recesywnym lub jako zespół Romano
i Warda (odmiany 1-6, LQT1-6), dziedziczonym w trybie autosomalnym dominującym. Celem prezentowanej pracy jest
próba ustalenia genetycznego podłoża wrodzonego zespołu wydłużonego QT w populacji polskiej z uwzględnieniem
trybu dziedziczenia i odmiany choroby. Badania polegały na określeniu uszkodzonego regionu i identyfikacja
mutacji w genach KVLQT1, HERG i KCNE1, kodujących białka kanałów potasowych IKs i IKr, biorących udział
w repolaryzacji komórek mięśnia sercowego. Badaniami objęto 30 pacjentów, pochodzących z 26 nie spokrewnionych
rodzin. Przeprowadzone sekwencjonowanie ujawniło obecność kilku różnych substytucji nukleotydowych, z których
jedne wprowadzały zmianę informacji kodonu i są prawdziwymi mutacjami (gen KVLQT1 – R243H, V254M, A341V,
C445X; gen HERG – P1122L) lub są uznawane za polimorfizmy (gen KCNE1 – G38S, D85N) a drugie nie prowadziły
do zmiany informacji kodonu (gen KVLQT1 – F485F, S546S; gen HERG – I489I, L564L) i miały charakter typowych
zmian polimorficznych. Stwierdzono, że w jednej rodzinie mutacja wystąpiła na jednym allelu genu KVLQT1 i jest
przyczyną dominującego zespołu LQT1, natomiast w dwu innych rodzinach mutacje wystąpiły na obu allelach genu
79
Genetyka człowieka
KVLQT1 i spowodowały wystąpienie recesywnego zespołu JLN1 (z głuchotą) i nietypowej recesywnej odmiany LQT1.
W jednej rodzinie wystąpiła dominująca odmiana LQT2, która była wynikiem mutacji w genie HERG. W 11 rodzinach
wykryto jedynie zmiany polimorficzne, a w następnych 11 rodzinach nie wykryto ani mutacji ani polimorfizmów
w analizowanych genach KVLQT1, HERG i KCNE1.
Badania były finansowane z projektu KBN nr 6P05E15021.
W46.
Równoczesne nosicielstwo allelu 5G genu PAI-1 i allelu C genu PPARα ma związek
z wczesną chorobą niedokrwienną serca – wyniki badań pilotażowych.
Beata Sarecka (1), Anna Balcerzyk (1), Paweł Niemiec (1), Iwona Żak (1), Jolanta Krauze(2), Maria Trusz-Gluza(1)
(1) Katedra i Zakład Biochemii i Genetyki Medycznej Śląskiej Akademi Medycznej ul. Medyków, 18, 40– 752 Katowice
(2) I Katedra i Klinika Kardiologi Ślaskiej Akademi Medycznej ul. Ziołowa 45/47, 40-635 Katowice
Wstęp
Inhibitor aktywatora plazminogenu-1 (PAI-1) jest głównym inhibitorem fibrynolizy. Polimorfizm 4G/5G promotora
genu PAI-1, w pozycji –675 ma związek z poziomem stężenia PAI-1 i w ten sposób wpływa na fibrynolizę. Receptor
aktywowany przez proliferatory peroksysomów α (PPARα) należy do rodziny jądrowych receptorów hormonów i jest
czynnikiem transkrypcyjnym aktywowanym przez ligandy, takie jak kwasy tłuszczowe lub związki z grupy fibratów.
Reguluje on ekspresję genów kodujących białka, które związane są z metabolizmem lipidów i odpowiedzią na stany
zapalne.
Cel
Określenie związku polimorfizmu 4G/5G genu PAI-1 i polimorfizmu G→C w intronie 7 genu PPARα z wczesną chorobą
niedokrwienną serca (ChNS).
Materiały i Metody
Badaniami objęto 171 osób rasy kaukaskiej, grupa 1 – pacjenci z wczesną chorobą niedokrwienną serca potwierdzoną
koronarograficznie (n=85, wiek 46±6.5), grupa 2 – dobrowolni dawcy krwi bez obciążeń chorobami sercowonaczyniowymi w wywiadzie (n=86, wiek 35±9.7). Polimorfizmy analizowano techniką PCR-RFLP. Produkty amplifikacji
trawiono odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi: BseLI dla PAI-1,TaqI dla PPARα a następnie rozdzielano
elektroforetycznie na 8% żelu poliakrylamidowym i uwidaczniano przez barwienie AgNO3.
Wyniki
Częstości alleli wśród pacjentów z ChNS w porównaniu z kontrolą dla polimorfizmu PAI-1 4G/5G wynoszą
odpowiednio: 4G 0.55 vs. 0.59, 5G 0.45 vs. 0.41, dla polimorfizmu PPARα G→C w intronie 7: G 0.82 vs. 0.88, C 0.18 vs.
0.12. Częstości genotypów wśród chorych w porównaniu
z kontrolą dla polimorfizmu PAI-1 4G/5G wynoszą odpowiednio: 4G/4G 0.31 vs. 0.37, 4G/5G 0.48 vs. 0.44, 5G/5G
0.21 vs. 0.19, dla polimorfizmu PPARα G→C w intronie 7: GG 0.66 vs. 0.77, GC 0.33 vs. 0.22, CC 0.01 vs. 0.01. Brak
znamiennych różnic w częstościach poszczególnych alleli
i genotypów między badanymi grupami.
Podwójne heterozygoty (4G/5G + GC) występują znamiennie częściej
w grupie z ChNS (0.16) w porównaniu z kontrolą (0.05) (p=0.0118, OR=4.04, 95%CI 1.26-12.94).
Równoczesne nosicielstwo allelu PAI-1 5G i PPARα C [(4G/5G + GC) + (4G/5G + CC) + (5G/5G + GC) + (5G/5G +
CC)] jest znamiennie wyższe wśród pacjentów z ChNS (0.25) niż u krwiodawców (0.10) (p=0.0144, OR=2.807, 95%CI
1.19-6.597).
Wnioski
Równoczesne nosicielstwo allelu 5G polimorfizmu 4G/5G genu PAI-1 i allelu C polimorfizmu G→C genu PPARα ma
związek z wczesną chorobą niedokrwienną serca.
W47.
Efekt funkcjonalny polimorfizmu G-765C genu dla cyklooksygenazy-2 w astmie
oskrzelowej.
Wojciech Szczeklik, Marek Sanak, Sylwia Dziedzina, Anna Gielicz, Grażyna Pulka, Andrzej Szczeklik
II Katedra Chorób Wewnętrznych Collegium Medicum UJ.
Wprowadzenie:
Polimorfizm G-765C, znajduje się w regionie promotorowym genu dla cyklooksygenazy-2 (COX-2), kluczowego
enzymu dla syntezy prostaglandyn w chorobach zapalnych. Zmiana ekspresji COX-2 może mieć wpływ na produkcję
prostaglandyn oraz przebieg astmy oskrzelowej.
80
Genetyka człowieka
Cele pracy:
Celem pracy była ocena częstości polimorfizmu G-765C w zdrowej populacji polskiej, oraz w grupie chorych na astmę.
Efekt czynnościowy polimorfizmu sprawdzono przez pomiar produkcji prostaglandyn w monocytach.
Metody:
Genotypowano losową próbę populacji (n=547), oraz chorych na astmę oskrzelową (n=310); uwzględniono chorych
dobrze tolerujących niesteroidowe leki przeciwzapalne (ATA ; n=198) oraz chorych na astmę aspirynową (AIA;n=112).
Monocty z krwi obwodowej izolowano od chorych ATA o przeciwstawnych genotypach: CC (n=8) i GG (n=9),
poziom prostaglandyn oznaczono techniką GC/MS w warunkach podstawowych oraz po pobudzeniu LPS. Pomiary
standaryzowano na transkrypt b;-aktyny.
Wyniki:
Częstości alleliczne w grupach chorych były podobne (AIA=0,18; ATA=0,19)
i nie różniły się od kontroli (0,17). Homozygoty CC były częstsze wśród kobiet chorych na astmę niż u kontroli (OR=
3,08; 95%CI 1,35-6,63; p=0,01). W grupie AIA, pacjenci z genotypem CC wykazywali cięższy przebieg choroby, co
wyrażało się większym zapotrzebowaniem na glikokortykosteroidy doustne (p=0,002). Produkcja prostaglandyn przez
monocyty była ponad 10-krotnie wyższa u homozygot CC niż u homozygot GG, zarówno w warunkach podstawowych
jak i po stymulacji LPS.
Wnioski:
Asocjacja polimorfizmu G-765C z astmą obserwowana jest tylko u kobiet, charakteryzuje ją cięższy przebieg choroby
w grupie AIA. U homozygot CC polimorfizm manifestuje się o rząd wielkości zwiększoną produkcją prostaglandyn
przez monocyty.
W48.
Brak asocjacji pomiędzy polimorfizmem C-270T genu BDNF a schizofrenią.
Maria Skibińska (1, 2), Aleksandra Szczepankiewicz (1), Agnieszka Słopień (3),
Anna Leszczyńska-Rodziewicz (2), Piotr Czerski (1), Paweł Kapelski (2), Monika Dmitrzak-Węglarz (1,3 ),
Joanna Hauser (1, 2)
(1) Pracownia Genetyki Psychiatrycznej Akademii Medycznej w Poznaniu
(2) Klinika Psychiatrii Dorosłych Akademii Medycznej w Poznaniu
(3) Klinika Psychiatrii Dzieci i Młodzieży Akademii Medycznej w Poznaniu
Cel badania:
Brain Derived Neurotrophic Factor należy do rodziny neurotrofin. BDNF odgrywa istotną rolę w neuroprotekcji
i plastyczności synaptycznej w centralnym układzie nerwowym. W nawiązaniu do neurorozwojowej koncepcji
etiologii schizofrenii wskazuje się na udział BDNF w patofizjologii tej choroby (Takahashi i wsp., 2000). Opisano także
związek BDNF z wczesnym wiekiem początku choroby (Krebs i wsp., 2000). Gen kodujący BDNF jest więc genem
kandydującym w schizofrenii. Wyniki badań Szekeres i wsp. (2003) wskazują na asocjację polimorfizmu C-270T BDNF
ze schizofrenią.
Metoda:
Grupę badaną stanowiło 409 pacjentów z rozpoznaniem schizofrenii i 173 osoby z grupy kontrolnej (dawcy krwi oraz
studenci). Badany polimorfizm genu BDNF polega na substytucji C/T w pozycji –270 w sekwencji niekodującej. Analizę
polimorfizmu przeprowadzono z zastosowaniem metody PCR-RFLP przy użyciu enzymu restrykcyjnego HinfI. Badana
grupa była w równowadze prawa Hardy’ego-Weinberga.
Wyniki:
Nie stwierdzono istotnej statystycznie różnicy w częstości występowania genotypów jak i alleli C-270T genu BDNF
pomiędzy grupą chorych na schizofrenię a grupą kontrolną (p=0,262 dla genotypów, p=0,359 dla alleli). Prowadząc
analogiczną analizę w podgrupach uwzględniających podział ze względu na wiek początku choroby nie stwierdzono
różnic istotnych statystycznie zarówno w częstości genotypów (p=0,399) jak i alleli (p=0,177).
Wnioski:
Nie stwierdziliśmy związku pomiędzy badanym polimorfizmem genu BDNF i ryzykiem zachorowania na schizofrenię.�
81
Genetyka człowieka
W49.
Dominujące mutacje genu NANOS1 są przyczyną niepłodności męskiej.
Kamila Kusz (1), Anna Spik (1), Anna Latos-Bieleńska (2), Maciej Kotecki (1), Joanna Bierła (3),
Piotr Jędrzejczak (4), Leszek Pawelczyk (4), Jadwiga Jaruzelska (1)
(1) Instytut Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu
(2) Zakład i Katedra Genetyki Medycznej, Akademii Medycznej w Poznaniu
(3) Zakład Histologii, Akademii Medycznej w Poznaniu
(4) Klinika Niepłodności i Endokrynologii Rozrodu Akademii Medycznej w Poznaniu
Białko Nanos jest represorem translacji specyficznych mRNA w morfogenezie i rozwoju komórek germinalnych D.
melanogaster. W procesach tych Nanos działa w kompleksie z Pumilio. Niedawno wykryto ludzkie homologi obu białek
– NANOS1 i PUMILIO2. Ulegają one specyficznej ekspresji w komórkach germinalnych dorosłych mężczyzn. Silnie
zakonserwowana interakcja tych białek sugeruje, że mogą one odgrywać ważną rolę w spermatogenezie człowieka.
W niniejszych badaniach wykryto trzy typy mutacji punktowych genu NANOS1 powodujących fenotyp czystej
niepłodności mężczyzn. Wszystkie mutacje były związane z całkowitym brakiem komórek linii germinalnej w kanalikach
plemnikotwórczych pacjentów. Wyniki te sugerują, że NANOS1 może brać udział w powstawaniu i/lub samoodnawianiu
macierzystych komórek germinalnych spermatogoniów. Analiza rodowodów wskazuje, że dziedziczenie genu NANOS1
jest dominujące, a penetracja mutacji ograniczona do płci męskiej. Jest to pierwsze doniesienie o mutacji autosomalnego
genu komórek germinalnych, która powoduje fenotyp czystej niepłodności męskiej.
Komunikaty plakatowe:
P85.
Udział ludzkich białek Hsp 40 w wywoływaniu reumatoidalnego zapalenia stawów.
Agnieszka Kotlarz, Konrad Krzewski, Barbara Lipińska
Katedra Biochemii, Uniwersytet Gdański, Kładki 24, 80-822 Gdańsk
Prezentowana praca jest częścią projektu obejmującego badania nad rolą ludzkich homologów bakteryjnego białka
szoku termicznego DnaJ (Hsp40), w wywoływaniu reumatoidalnego zapalenia stawów (RA). Celem projektu jest
zweryfikowanie hipotezy dotyczącej udziału białka DnaJ E. coli w indukcji odpowiedzi autoimmunologicznej,
w przypadku chorób reumatycznych. Kontynuacją badań było sprawdzenie czy ludzkie białka HDJ-2 i HDJ-3,
homologi białka DnaJ, mogą być celem odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez antygen bakteryjny. Uprzednio
wykazaliśmy, że w surowicach osób chorych na RA poziom przeciwciał przeciwko białku DnaJ oraz ludzkiemu Hsp40,
HDJ-1, jest w sposób znaczący podwyższony, przy czym brak jest istotnej pozytywnej korelacji między odpowiedziami
anty-DnaJ i anty-HDJ-1. Oczyszczono ludzkie białka HDJ-2 i HDJ-3 nadprodukowane w komórkach bakterii E. coli
a następnie, wykorzystując immunoenzymatyczny test ELISA, zbadano reaktywność 43 surowic osób chorych i 35
surowic osób zdrowych z oczyszczonymi białkami. Stwierdzono około 5-krotne podwyższenie poziomu przeciwciał
anty-HDJ-2 i 2.5-krotne przeciwciał anty-HDJ-3 w grupie osób chorych w stosunku do poziomu obserwowanego
w grupie osób zdrowych. Wynik uzyskany dla białka HDJ-2 przekraczał wartości poziomów reakcji otrzymane
wcześniej dla białka DnaJ bakterii Escherichia coli i ludzkiego białka HDJ-1. Analiza statystyczna wyników wykazała
obecność statystycznie istotnej, pozytywnej korelacji pomiędzy poziomem reakcji przeciwciał z białkiem DnaJ
względem poziomu reakcji z białkiem HDJ-2, u osób chorych. Brak istnienia takiej korelacji w przypadku białek HDJ-3
i HDJ-1 sugeruje istnienie niezależnych odpowiedzi immunologicznych: anty-DnaJ, anty-HDJ-1 i anty-HDJ-3. Wyniki
wskazują, że w przeciwieństwie do pozostałych ludzkich homologów (HDJ-1, HDJ-3), białko HDJ-2 może stanowić cel
odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez bakteryjny antygen i może być zaangażowane w procesie wywoływania
RA. Istotny wzrost poziomu reakcji surowicy krwi ludzi chorych względem białek HDJ-3 i HDJ-1 sugeruje, że białka te
mogą uczestniczyć w późniejszych stadiach rozwoju i podtrzymywania choroby.
82
Genetyka człowieka
P86.
Identyfikacja nowej mutacji genu PAX9 odpowiedzialnej za rodzinnie występującą
postać oligodoncji.
Adrianna Mostowska (2), Barbara Biedziak (1), Wiesław H. Trzeciak (2)
(1) Katedra Ortodoncji, AM w Poznaniu
(2) Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, AM w Poznaniu
Wrodzony brak zawiązków zębów stałych jest najczęstszą wadą rozwojową uzębienia, która występuje u około 2 do 10%
osób w populacji ogólnej. Dane te nie obejmują trzecich zębów trzonowych, których brak stwierdza się u 20-25% osób.
Dotychczas, jedynymi genami, których mutacje są odpowiedzialne za powstawanie tej nieprawidłowości rozwojowej są
MSX1 oraz PAX9, które kodują czynniki transkrypcyjne ogrywające kluczową rolę podczas odontogenezy.
Celem projektu było poszukiwanie mutacji genów MSX1 oraz PAX9 u osób z wrodzonym brakiem zawiązków zębów
stałych.
Badaniami objęto 9 osób należących do tej samej rodziny (w tym 5 osób z oligodoncją) oraz grupę 150 osób
o prawidłowym uzębieniu. W celu wykrycia mutacji sekwencje eksonów genów MSX1 oraz PAX9 amplifikowano
z użyciem specyficznych starterów oraz analizowano za pomocą metody polimorfizmu konformacji pojedynczych nici
DNA przeprowadzanej w zmiennej temperaturze. Analiza MSSCP eksonu 2 genu PAX9 wykazała zmiany w ruchliwości
elektroforetycznej pojedynczoniciowych fragmentów DNA u wszystkich pięciu osób z oligodoncją. Bezpośrednie
sekwencjonowanie DNA wykazało obecność nowej, heterozygotycznej mutacji 619_621delATCinsTACCGACCAAG
GTAGGGCATCCCT, która nie występowała u innych członków rodziny, jak też u 150 osób o prawidłowym uzębieniu.
Nowa insercja może prowadzić do przedwczesnej terminacji translacji przy 210 reszcie aminokwasowej lub też zaburzać
splicing, powodować przesunięcie ramki odczytu oraz przedwczesną terminację translacji przy 314 reszcie aminokwas
owej(prawdopodobieństwo 0,97 i 0,95, odpowiednio). U osób należących do badanej rodziny zidentyfikowano ponadto
polimorfizmy genu MSX1: *6C>T, 452-15delT oraz PAX9: 717C>T, 718G>C, które jednakże nie wykazują związku
z występowaniem oligodoncji.
Uzyskane wyniki potwierdzają przypuszczenie, że mutacje genu PAX9 stanowią główny czynnik odpowiedzialny
za powstawanie niesyndromicznej, rodzinnie występującej postaci oligodoncji. Nowa mutacja może powodować
brak zawiązków zębów stałych u badanych chorych w wyniku zmniejszenia zdolności transaktywacyjnej czynnika
transkrypcyjnego PAX9, za którą są odpowiedzialne reszty aminokwasowe zlokalizowane na C-końcu białka.
Badania finansowane z grantu KBN 2P05A 092 26
P87.
Badanie asocjacyjne alleli genu kodującego czynnik nekrozy komórkowej TNFα;
w jadłowstręcie psychicznym.
Monika Dmitrzak-Węglarz (1, 3) Agnieszka Słopień (1), Filip Rybakowski (1), Piotr Czerski (2, 3),
Joanna Hauser (2, 3), Andrzej Rajewski (1)
(1) Klinika Psychiatrii Dzieci i Młodzieży Akademii Medycznej w Poznaniu
(2) Klinika Psychiatrii Dorosłych Akademii Medycznej w Poznaniu
(3) Pracownia Genetyki Psychiatrycznej Akademii Medycznej w Poznaniu
Cel badania:
Jadłowstręt psychiczny jest chorobą o wieloczynnikowej etiologii, w której postuluje się udział czynników genetycznych
i modulujący wpływ czynników środowiskowych. Z tego względu model dziedziczenia jest dotąd nieznany, choć zakłada
się udział kilku nawet kilkunastu genów o relatywnie niewielkim wpływie, których efekt kumuluje się. W niniejszej pracy
podjęto badanie asocjacyjne polimorfizmu genu kodującego czynnik martwicy nowotworów (TNFα) z jadłowstrętem
psychicznym (anorexia nervosa; AN).
Osoby badane:
Grupę badaną stanowiło 91 pacjentek z rozpoznaniem jadłowstrętu psychicznego, spełniających kryteria diagnostyczne
DSM-IV oraz ICD-10. Grupa kontrolna składała się z 66 kobiet. Średnia wieku dla grupy badanej 18,22 (SD=3,13),
średnia wieku dla grupy kontrolnej 27,49 (SD=5,52)
Metoda:
Polimorfizm badanych genów analizowano przy wykorzystaniu metod PCR-RFLP
1. Polimorfizm genu TNF45; polega na substytucji (-308G/A) w rejonie promotora.
Wyniki:
TNF: Nie stwierdziliśmy istotnej statystycznie różnicy w częstości występowania genotypów i alleli –308G/A genu
TNF45; pomiędzy grupą chorych na jadłowstręt psychiczny a grupą kontrolną (p=0,084 dla genotypów, p=0,076 dla
83
Genetyka człowieka
alleli). Prowadząc analogiczną analizę w podgrupach uwzględniających podział ze względu na podtyp jadłowstrętu, nie
stwierdzono istotnych statystycznie różnic w częstości genotypów (p=0,700), jak i alleli (p=0,305)
Wnioski:
W przypadku genu TNFa; uzyskano trend częstszego występowania, allelu –308A w grupie osób chorych, jednak
nieosiągającego w badanej grupie istotności statystycznej.
P88.
Comparison of the angiotensin-converting enzyme (ACE) gene polymorphism
in patients with abdominal aortic aneurysm (AAA) versus patients with occlusiv
disease.
Aleksandra Korcz (1), Krzysztof Waliszewski (2), Marcin Gabriel (2), Grzegorz Oszkinis (2), Stanisław Zapalski
(2), Ryszard Słomski (1)
(1) Institute of Human Genetics, Polish Academy of Sciences, Poznań, Poland,
(2) University of Medical Sciences, Poznań, Poland
Abdominal aortic aneurysm (AAA) is a life-threatening condition affecting 4-9% of population with a risk increasing
with age. Other risk factors include hypertension, atherosclerosis and smoking. Familial occurrence of abdominal
aortic aneurysm indicates involvement of genetic factors in development of AAA. Angiotensin I-converting enzyme
(ACE) is one of the key factors affecting blood pressure regulation and electrolyte balance. It was shown that half of the
individual variability of the ACE plasma concentration is determined by an insertion (I)/deletion (D) polymorphism
in intron 16 of the ACE gene. The relationship between insertion/deletion polymorphism in the ACE gene and number
of cardiovascular diseases was observed however in case of abdominal aortic aneurysm contradictory results were
obtained. In our studies we included patients with AAA and patients with occlusive disease treated in the Department
of Vascular Surgery at University of Medical Sciences in Poznan to find if there is a correlation of the ACE genotype
and susceptibility to aortic disease. Based on the PCR analysis of DNA samples extracted from peripheral blood we
determined ACE genotypes in 3 selected groups: patients with AAA, patients with occlusive disease who underwent
surgery and Polish population group. Clinical characteristics of patient from two groups included following data: age,
sex, hypertension, hypercholesterolaemia, history of myocardial infarction, diabetes or emphysema and smoking. The
frequency of ACE genotypes in two groups of patients was analyzed in relation to type of disease and clinical parameters,
especially hypertension, and compared to Polish population group.
P89.
Występowanie polimorfizmów MTHFR i PON1 u kobiet z zespołem jajników
policystycznych.
Katarzyna Mel (1), Bartosz Kempisty (1) Joanna Sokołowska (1), Mariusz Łaciński (1),
Alina Warenik-Szymankiewicz (2), Wiesław H. Trzeciak (1)
(1) Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej,
(2) Katedra i Klinika Endokrynologii Ginekologicznej, Akademia Medyczna im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu
Zespół jajników policystycznych (PCOS) jest jednym z najczęstszych schorzeń endokrynologicznych występujących
u kobiet w wieku rozrodczym. Do najważniejszych objawów klinicznych należą: hiperandrogenizm, zaburzenia
miesiączkowania, niepłodność oraz hiperinsulinemia. Najnowsze prace wskazują na podwyższenie poziomu
homocysteiny (Hcy) w surowicy krwi kobiet z PCOS, wynikające przypuszczalnie z zaburzeń metabolizmu tego
aminokwasu. Najczęstszą przyczyną hiperhomocysteinemii są mutacje lub polimorfizmy genów kodujących:
reduktazę metylenotetrahydrofolianową (MTHFR), która katalizuje przemianę 5,10-metylenotetrahydrofolianu do
5-metylotetrahydrofolianu (donora grupy metylowej w reakcji remetylacji Hcy do Met) i paraoksonazę (PON1),
rozszczepiającą tiolakton Hcy, cytotoksyczną formę tego aminokwasu. Tiolakton Hcy jest donorem reszt acylowych
w reakcji homocysteinylacji białek, czego skutkiem jest obniżenie ich właściwości katalitycznych. Wcześniejsze prace
odnosiły się wyłącznie do polimorfizmu C677T genu MTHFR. Brak jest natomiast doniesień dotyczących pozostałych
polimorfizmów. Celem pracy było zbadanie częstości polimorfizmów: C677T, A1298C, G1793A genu MTHFR oraz
A192G genu PON1 u kobiet z PCOS.
Materiał do badań stanowiło DNA wyizolowane z krwi obwodowej 60 kobiet z PCOS oraz 100 kobiet zdrowych,
stanowiących grupę kontrolną. Identyfikacji genotypów dokonano w oparciu o analizę RFLP-PCR, wykorzystując
następujące enzymy restrykcyjne: HinfI (C677T), MboII (A1298C), MbiI (G1793A) oraz MboI (A192G). Częstości
genotypów C677T, G1793A oraz A192G w badanych grupach nie wykazywały odstępstw od równowagi Hardy’egoWeinberga. W zakresie tych polimorfizmów nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic między grupą badaną
84
Genetyka człowieka
a kontrolną, zarówno pod względem częstości genotypów, jak i częstości alleli. Częstość genotypów polimorfizmu
A1298C w grupie z PCOS znacząco odbiega od równowagi Hardy&#8217;ego-Weinberga (p<10-6). Różnice częstości
genotypów A1298C pomiędzy grupą badaną a kontrolną są istotne statystyczne (p=0.038). Uzyskane wyniki sugerują,
że heterozygotyczność A1298C mogłaby zmniejszać ryzyko pojawienia się objawów PCOS.
P90.
Ocena roli polimorfizmów Pro12Ala i Pro115Gln genu PPAR-gamma w etiologii
otyłości i cukrzycy typu II.
Ryszard Ślęzak (1), Marek Demissie (2), Bożena Bidzińska (2), Urszula Tworowska (2), Tadeusz Dobosz (3),
Andrzej Milewicz (2)
(1) Zakład Genetyki Akademii Medycznej we Wrocławiu
(2) Klinika Endokrynologii i Diabetologii Akademii Medycznej we Wrocławiu.
(3) Zakład Medycyny Sądowej Akademii Medycznej we Wrocławiu.
PPAR-gamma; (peroxisome proliferator activated receptor-gamma) jest czynnikiem transkrypcyjnym z grupy
jądrowych receptorów sterydowych, uczestniczącym w procesie różnicowania się adipocytów i w metabolizmie lipidów
oraz w homeostazie glukozy i insuliny. Sugeruje się, że PPAR poprzez udział w powstawaniu procesu zapalnego w ścianie
naczyniowej oraz jako komponent zespołu oporności na insulinę może odgrywać kluczową rolę w powstawaniu
naczyniowych powikłań w różnych zespołach metabolicznych. Nadmierna ekspresja PPAR w fibroblastach może
prowadzić do przekształcania się tych komórek w komórki tłuszczowe. Wszystkie te dane mogą sugerować ważną rolę
tego genu w etiologii otyłości, cukrzycy typu II i miażdżycy.Cel pracy: Przedstawiona praca miała na celu określenie
związku między różnymi wariantami polimorficznymi genu PPAR– gamma; z otyłością oraz cukrzycą typu II.Materiał
i Metody: Przebadano 220 osób (167 kobiet i 53 mężczyzn) w tym 126 osób z otyłością (BMI30kg/m2) korelując
warianty polimorficzne Pro12Ala i Pro115Gln genu PPAR– gamma; z pomiarami antropometrycznymi (BMI, wskaźnik
talia-biodro, pomiar ciśnienia tętniczego). W grupie badanej osób otyłych analizowano osobno grupę 53 osób z cukrzycą
typu II. DNA wyizolowano z limfocytów krwi obwodowej metodą solno-fenolową, a do reakcji PCR wykorzystano
startery flankujące obszary zawierające dwa ww warianty polimorficzne genu PPAR– 2. Produkt amplifikacji poddano
działaniu enzymów restrykcyjnych HpaII i HindII.
Wyniki: Genotyp Pro12Pro stwierdzono u 56% badanych (59% osób otyłych, 54% z należną masą ciała, 55% kobiet i 54%
mężczyzn). Wariant heterozygotyczny Pro12Ala w całej grupie występował u 32%, w tym u 24% otyłych i 38% u osób
z BMI< 25kg/m2, u 31% kobiet i 32% mężczyzn. Wariant Ala12Ala obserwowano u 12% osób badanych (17% otyłych
i 8% grupy kontrolnej, 13% kobiet i 14% mężczyzn). Częstość allela Ala wynosiła w całej grupie 28%, u osób otyłych
29%, w grupie kontrolnej 27%, u kobiet 29% a u mężczyzn 30%. W grupie chorych na cukrzycę typu II częstość allela
Ala wyniosła 25%. Nie stwierdzono znaczących statystycznie różnic w częstości występowania tego allela między grupą
osób otyłych a grupą kontrolną, ani między kobietami a mężczyznami oraz w grupie chorych na cukrzycę. Obecność
allela Ala nie miała także wpływu na ciśnienie tętnicze krwi. Osoby z wariantem Ala12Ala miały jednak wyższy BMI
w porównaniu z grupami Pro12Pro i Pro12Ala. U żadnej z badanych osób nie stwierdzono wariantu Pro115Gln genu
PPAR– gamma.
P91.
Wielokrotne nosicielstwo wariantów polimorficznych genów kandydujących
różnicuje osoby z wczesną chorobą niedokrwienną serca od krwiodawców – wyniki
badań pilotowych, część 1.
Beata Sarecka (1), Anna Balcerzyk (1), Paweł Niemiec (1), Iwona Żak (1), Jolanta Krauze (2),
Maria Trusz-Gluza (1)
(1) Katedra i Zakład Biochemii i Genetyki Medycznej Śląskiej Akademi Medycznej ul. Medyków 18, 40– 752 Katowice
(2) I Katedra i Klinika Kardiologi Ślaskiej Akademi Medycznej ul. Ziołowa 45/47, 40-635 Katowice
Wstęp
Choroba niedokrwienna serca (CHNS) jest chorobą wieloczynnikową. Polimorfizmy genów kandydujących,
których produkty mogą promować inicjację, progresję lub regresję zmian miażdżycowych mogą mieć znaczenie
w determinowaniu dziedzicznych predyspozycji do wystąpienia CHNS. Udział pojedynczych genów w patogenezie
CHNS jest stosunkowo niewielki. Jednoczesne nosicielstwo wielu wariantów polimorficznych genów kandydujących
może być związane z klinicznym obrazem choroby.
Cel pracy
Ocena zróżnicowania pacjentów z wczesną chorobą niedokrwienną serca oraz krwiodawców pod względem
85
Genetyka człowieka
wielokrotnego nosicielstwa wariantów polimorficznych genów kandydujących.�
Materiał i metody
Badano 168 osób: grupa 1 – pacjenci z wczesną CHNS udokumentowaną koronarograficznie (n=80, wiek śr. 46.8);
grupa 2 – krwiodawcy bez ostrych incydentów sercowo-naczyniowych i obciążeń rodzinnych chorobami sercowonaczyniowymi w wywiadzie (n=88, wiek śr 34.7). Genotypowano 9 polimorfizmów genów: polimorfizm I/D genu ACE,
epsilon genu APOE, C242T genu CYBA, K469E genu ICAM-1, G→C w intronie 7 genu PPAR, C677T genu MTHFR,
A561C genu dla CD62 E i polimorfizmy genu dla fibrynogenu α Thr312Ala i β G455A. Polimorfizm ACE genotypowano
metodą PCR, pozostałe PCR-RLFP. Wyniki analizowano w programie STATISTICA 6.0.
Wyniki
W grupie chorych stwierdzono większą liczbę nosicieli kilku „promiażdżycowych” wariantów polimorficznych
jednocześnie w porównaniu z grupą krwiodawców. Obserwacja ta stała się podstawą podziału obu grup na podgrupy
A i B, uwzględniające liczbę nosicielskich wariantów polimorficznych (homozygoty jednego rodzaju + heterozygoty):
podgrupa A – nosiciele 1 – 4 „promiażdżycowych” wariantów polimorficznych (<50%), podgrupa B – nosiciele
5 – 8 „promiażdżycowych” wariantów polimorficznych (>50%).
U żadnej badanej osoby nie wykryto nosicielstwa wszystkich 9 wariantów polimorficznych. W grupie 1 stwierdzono, że
połowa osób jest nosicielami 5 do 8 wariantów polimorficznych. W grupie 2 nosiciele 5-7 wariantów polimorficznych
stanowią 29.5% a nosiciele 1-4 wariantów – 70.5%. W grupie 2 u żadnej osoby nie stwierdzono nosicielstwa 8 wariantów
polimorficznych. Ponad połowa badanych wariantów polimorficznych występuje znacznie częściej wśród chorych niż
u krwiodawców (p=0.0067, OR=2.38, CI; 1.26-4.51).
Wnioski
Wielokrotne nosicielstwo wariantów polimorficznych genów kandydujących różnicuje osoby z wczesną chorobą
niedokrwienną serca od krwiodawców.
P92.
Analiza wielokrotnego nosicielstwa wariantów polimorficznych 9 genów
kandydujących u osób z wczesną chorobą niedokrwienną serca
– wyniki badań pilotowych, część 2.
Beata Sarecka (1), Anna Balcerzyk (1), Paweł Niemiec (1), Iwona Żak (1), Jolanta Krauze (2),
Maria Trusz-Gluza (1)
(1) Katedra i Zakład Biochemii i Genetyki Medycznej Śląskiej Akademi Medycznej ul. Medyków 18, 40– 752 Katowice
(2) I Katedra i Klinika Kardiologi Ślaskiej Akademi Medycznej ul.Ziołowa 45/47, 40-635 Katowice
Wstęp
Etiologia choroby niedokrwiennej serca (CHNS) jest najczęściej miażdżycopochodna i wynika z współdziałania
licznych czynników genetycznych i środowiskowych. Na podłoże genetyczne, predysponujące do miażdżycy mogą
składać się polimorficzne geny kandydujące, których produkty pełnią rolę w patogenezie tej choroby.�
Cel pracy
Wstępne określenie charakterystycznych wariantów polimorficznych dla pacjentów z CHNS – będących wielokrotnymi
nosicielami (5-8 wariantów polimorficznych).
Materiał i metody
Badano 168 osób: grupa 1 – pacjenci z wczesną chorobą niedokrwienną serca potwierdzoną koronarograficznie
(n=80, wiek śr. 46.8); grupa 2 – krwiodawcy bez obciążeń chorobami sercowo-naczyniowymi, także w rodzinie
(n=88, wiek śr. 34.7). Genotypowano dziewięć polimorfizmów genów: polimorfizm I/D genu ACE, epsilon genu
APOE, C242T genu CYBA, K469E genu ICAM-1, G→C w intronie 7 genu PPARα, C677T genu MTHFR, A561C
genu dla CD62 E i polimorfizmy genu fibrynogenu (Fb) α Thr312Ala i β G455A. Polimorfizm ACE genotypowano
metodą PCR, pozostałe PCR-RLFP. Osoby w obrębie obu badanych grup podzielono na podgrupy A i B, na podstawie
liczby „promiażdżycowych” nosicielskich wariantów polimorficznych (homozygoty jednego rodzaju + heterozygoty):
podgrupa A – nosiciele 0-4 „promiażdżycowych” wariantów polimorficznych (<50%), podgrupa B – nosiciele 5-9
promiażdżycowych wariantów polimorficznych (>50%).
Wyniki
Częstości „promiażdżycowych” wariantów polimorficznych wszystkich badanych genów w grupie 1B są wyższe,
zarówno od odpowiednich wartości w grupie 1A i w grupie 2A. W grupie 1B częstości „promiażdżycowych” wariantów
polimorficznych sześciu genów: ACE, Fbα, CYBA, MTHFR, APOE, ICAM-1 są wyższe; trzech genów: Fbβ, CD62 E,
PPARα są niższe od odpowiednich wartości w grupie 2B. W grupie 1B 70% pacjentów jest jednoczesnymi nosicielami
„promiażdżycowych” wariantów polimorficznych genów ACE i CYBA, podczas gdy w grupie B krwiodawców wartość
ta wynosiła 46%. W grupie 1B 55% osób jest jednoczesnymi nosicielami trzech „promiażdżycowych” wariantów
86
Genetyka człowieka
polimorficznych ACE, CYBA i ICAM-1, natomiast 50% nosicielami w genach ACE, CYBA i MTHFR. W grupie 2B
wartości te wynosiły odpowiednio 31% i 35%.
Wnioski
Współwystępowanie „promiażdżycowych” wariantów polimorficznych genów ACE, CYBA, ICAM-1 lub ACE,
CYBA, MTHFR jest charakterystyczne dla pacjentów z CHNS, którzy są wielokrotnymi nosicielami (5-8 wariantów
polimorficznych).
P93.
Różnice w profilach polimorficznych alleli genów MTHFR, PON1 i ACE u chorych
z zawałem mięśnia sercowego w zależności od współwystępowania nadciśnienia
tętniczego i cukrzycy.
Ewa Strauss (1), Andrzej L. Pawlak (1), Anna Safian (1), Mikołaj Pawlak (2), Jerzy Głuszek (3)
(1) Instytut Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu
(2) Klinika Neurologii Akademii Medycznej w Poznaniu
(3) Klinika Nadciśnienia i Chorób Naczyń Akademii Medycznej w Poznaniu
Polimorficzne genotypy MTHFR 677C>T, 1298A>C, PON1 –108C>T i ACE I/D oznaczono w grupie 107 mężczyzn
z zawałem serca (ang. myocardial infarction, MI) oraz w grupie kontrolnej 45 zdrowych mężczyzn bez nadciśnienia
tętniczego (AH) i cukrzycy typu 2 (T2DM). W grupie chorych u 33 osób (31%) stwierdzono zaburzenia metabolizmu
glukozy, w tym u 31 osób (29%) rozpoznano T2DM, a u 2 osób (2%) nietolerancję glukozy (IGT). Nadciśnienie tętnicze,
definiowane jako ciśnienie krwi powyżej 140/90 mm Hg, występowało u 59 osób (55%). U 24 osób (22%) stwierdzono
współwystępowanie T2DM/IGT i AH, a 39 chorych (36%) nie miało zaburzeń metabolizmu glukozy i nadciśnienia.
W grupie osób z MI stwierdzono podwyższenie częstości genotypów MTHFR 677CT/1298AA, 677CT/1298AC, 677TT/
1298AA, 677CC/1298CC (67%) w stosunku do grupy kontrolnej (p=0,03), w której genotypy te występowały z częstością
47% (OR=2; 95%CI=1-4). Genotyp PON1 –108TT wiązał się z 2-krotnym wzrostem ryzyka MI (95%CI=1-5).
W grupie chorych, u których współwystępowały T2DM/IGT i AH stwierdzono podwyższenie częstości genotypów
MTHFR 677CT/1298AA, 677TT/1298AA, 677CC/1298CC (71%) w stosunku do grupy kontrolnej (p=0,003), w której
genotypy te występowały z częstością 36% (OR= 4,4; 95%CI=1,5-12,9). W grupie tej stwierdzono również podwyższenie
genotypów ACE II i ID (96%) wobec 78% w grupie kontrolnej (p=0,03; OR=6,6; 95%CI=0,8-54,9).
W grupie chorych bez T2DM/IGT i nadciśnienia stwierdzono podwyższenie częstości homozygot MTHFR (41%)
w stosunku do grupy kontrolnej (p=0,005), w której genotypy te występowały z częstością 16% (OR=3,8; 95%CI=1,410,6). W grupie tej stwierdzono również podwyższenie genotypów PON1 –108TT (36%) wobec 18% w grupie kontrolnej
(p=0,03; OR=2,6; 95%CI=0,9-7,1).
Granty nr KBN/AM 501-2-02-05 (J.G), KBN 3P05A 121 24 (E.S i A.P)
P94.
Polimorfizmy genów kodujących enzymy folianozależnych szlaków metabolicznych
a ryzyko wystąpienia spina bifida.
Jacek J. Pietrzyk, Mirosław Bik-Multanowski
Katedra Pediatrii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie, e-mail: [email protected]
Wstęp: Wady cewy nerwowej (WCN) należą do najczęstszych i najcięższych wad wrodzonych. Wystąpienie wady z tej
grupy zazwyczaj prowadzi do śmierci lub ciężkiego kalectwa dziecka.
Okołokoncepcyjna podaż kwasu foliowego jest znanym czynnikiem zmniejszającym o około 50-70% częstość
występowania WCN. W ostatnich latach wykazano, że obecność polimorfizmów genów kodujących enzymy i białka
związane z folianozależnymi szlakami metabolicznymi (reduktaza 5,10-metylenotetrahydrofolianowa, reduktaza
syntazy metioniny, transkobalamina II) może stanowić czynnik ryzyka urodzenia dziecka z WCN.
Celem pracy była ocena całkowitej częstości polimorfizmów genowych uznanych za czynniki ryzyka urodzenia dziecka
z WCN w grupie matek dzieci z taką wadą.
Metodyka: Badana populacja obejmowała 110 matek dzieci z izolowaną wadą cewy nerwowej o typie spina bifida
(najczęściej występujący w Polsce rodzaj WCN). Zastosowano technikę PCR-RFLP umożliwiającą stwierdzenie
obecności genotypów 677TT, 1298CC i 677T+1298C (gen reduktazy 5,10-metylenotetrahydrofolianowej), 66GG (gen
reduktazy syntazy metioniny), 776GG (gen transkobalaminy II) uznanych za czynniki ryzyka wystąpienia WCN.
Wyniki: Występowanie co najmniej jednego z powyższych genotypów stwierdzono u 55 (50%) matek. U 18 uczestniczek
87
Genetyka człowieka
badania stwierdzono obecność dwóch a u 1 osoby trzech spośród badanych czynników ryzyka wystąpienia WCN.
Wnioski: U około 50% matek dzieci z WCN można stwierdzić co najmniej jeden ze znanych genetycznych czynników
ryzyka urodzenia dziecka z wadą. W związku z tym badania w kierunku obecności wymienionych polimorfizmów
genowych powinny być rutynowo stosowane w ramach poradnictwa genetycznego w rodzinach obciążonych
wystąpieniem spina bifida.
Farmakogenetyka
Komunikaty ustne:
W50.
Farmakogenetyczne aspekty skutecznej i bezpiecznej farmakoterapii.
Barbara Gawrońska-Szklarz
Zakład Farmakokinetyki i Terapii Monitorowanej, Katedra Farmakologii, Pomorska Akademia Medyczna w Szczecinie
Wykrycie genetycznych różnic w aktywności enzymów metabolizujących leki (polimorfizm) pozwoliło na wyjaśnienie
osobniczych różnic w działaniu i skuteczności stosowanej farmakoterapii i zapoczątkowało rozwój nowej dziedziny
– farmakogenetyki. W związku z tym staje się bardziej zrozumiałe, dlaczego u niektórych osób ta sama dawka leku jest
mniej skuteczna, a u innych wywołuje działania niepożądane. Ma to istotne znaczenie dla leków toksycznych, o wąskim
współczynniku terapeutycznym. Różnorodność działania farmakologicznego tego samego leku u poszczególnych
osób spowodowana jest zmianami w genotypie pacjenta, w szczególności gdy enzym metabolizujący lek, kodowany
jest przez pojedynczy gen, w locus którego mogą występować różne allele. Oznacza to, że w danej populacji możemy
wyróżnić fenotypowo odmienne grupy: osoby szybko metabolizujące leki (EM – extensive metabolizers), osoby
z defektem enzymatycznym, które źle lub słabo metabolizują niektóre leki (PM – poor metabolizers) lub tzw.
ultra-szybkich metabolizerów, wymagających znacznie większych dawek dla zapewnienia efektu terapeutycznego.
Dotychczas zidentyfikowano kilkanaście enzymów, które wykazują genetyczny polimorfizm. Do najlepiej poznanych
i ważnych z klinicznego punktu widzenia należą: izoenzymy cytochromu P450 (CYP450) odpowiedzialne za reakcje
utleniania leków (CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2E1, CYP2D6, CYP3A4/5), enzym katalizujący reakcję
acetylacji – N-acetylotransferaza (NAT2), metylotransferaza tiopuryny (TPMT) oraz metylotransferaza tiolowa
(TMT) katalizujące reakcje metylacji, dehydrogenaza dihydropirymidyny (DPD) odpowiedzialna za katabolizm
5-fluorouracylu. Genetyczny polimorfizm wykazują także S-transferazy glutationu (GSTT, GSTM), które biorą
udział w procesie sprzęgania ze zredukowanym glutationem związków epoksydowych lub aktywnych metabolitów
powstałych w reakcjach utleniania. U osobników wolno metabolizujących obserwuje się kumulację leków, nasilone
działanie farmakologiczne, ale też częściej występują działania niepożądane, a nawet toksyczne. Niepożądane działania
leków mogą być także wynikiem interakcji między stosowanymi jednocześnie lekami, lekiem a składnikami diety lub
stosowanymi używkami, które mogą indukować lub hamować aktywność enzymów cytochromu P450. Ma to szczególne
znaczenie dla leków immunosupresyjnych, przeciwnowotworowych, hipolipemicznych, leków blokujących kanały
wapniowe, psychotropowych i innych.
Po sensacyjnych odkryciach końca XX wieku i poznaniu sekwencji wielu genów człowieka okazało się, że efekt
farmakologiczny zależy nie tylko od genetycznie uwarunkowanej aktywności enzymów metabolizujących leki, ale także
od ekspresji genów kodujących białka biorące udział w mechanizmie działania leków (kanały jonowe, receptory) oraz
transporterów dla leków (gen MDR1 kodujący glikoproteinę P). Czynniki genetyczne w istotny sposób mogą zmieniać
zarówno procesy farmakokinetyczne (wchłanianie, dystrybucja, metabolizm, wydalanie), którym podlegają leki
w organizmie, jak i efekt farmakodynamiczny w miejscu działania leku.
Osobnym zagadnieniem, którmu poświęca się obecnie wiele uwagi jest wyjaśnienie mechanizmów i poszukiwanie
czynników regulujących ekspresję genów kodujących enzymy, receptory i białka transportujące leki.
88
Genetyka człowieka
W51.
Badania genotoksycznych właściwości etoksyquinu i jego pochodnych.
Alina Błaszczyk (2), Janusz Skolimowski (1), Magdalena Górniak (2)
(1) Katerda Chemii Organicznej, Uniwersytet Łódzki, ul. Narutowicza 68, 90-136 Łódź
(2) Zakład Cytogenetyki i Biologii Molekularnej Roślin, Uniwersytet Łódzki, ul. Banacha 12/16, 90-237 Łódź
Etoksyquin (1,2-dihydro-2,2,4-trimetylochinolina) jest związkiem o właściwościach przeciwutleniających i stosowany
jest jako antyutleniacz w żywności oraz w paszy dla zwierząt. W wielu badaniach stwierdzono, że związek ten posiada
właściwości antymutagenne i antykarcynogenne. W ostatnich latach jednak pojawiły się doniesienia o chorobach
zwierząt karmionych paszą zawierającą etoksyquin, obserwuje się również niekorzystny jego wpływ na zdrowie osób
zawodowo narażonych na jego działanie. W związku z powyższym prowadzone są prace nad poszukiwaniem nowych
związków (w tym także analogów etoksyquinu), które miałyby równie silne właściwości antyoksydacyjne, a jednocześnie
takich, które nie wpływałyby niekorzystnie na zdrowie człowieka i zwierząt.
W niniejszej pracy przedstawiono wyniki badania wpływu etoksyquinu i jego pochodnych (chlorowodorku i fosforanu)
na materiał genetyczny limfocytów człowieka. Badania przeprowadzono z zastosowaniem testu komety oraz testu
mikrojądrowego; analizowano również zdolność tych związków do indukcji apoptozy (metoda TUNEL). Wyniki badań
wskazują, że etoksyquin zastosowany w dawkach 0,01 – 0,05 mM ma zdolność do indukcji uszkodzeń DNA w teście
komety oraz w wyższych stężeniach (0,05-0,25 mM) indukuje również powstawanie mikrojąder. Badane pochodne
etoksyquinu posiadają słabsze właściwości genotoksyczne. Etoksyquin posiada również zdolność do indukowania
apoptozy w hodowanych limfocytach człowieka, szczególnie po zastosowaniu go w stężeniach 0,25 i 0,5 mM.
Praca finansowana z grantu KBN nr 3 PO4C 021 24.
W52.
Poziom uszkodzeń endogennych oraz wydajność systemów naprawy DNA
w komórkach błony śluzowej żołądka zainfekowanych H. pylori.
Michał Arabski (1), Maria Kasprzak (2), Grażyna Klupińska (2), Maria Wiśniewska-Jarosińska (3), Paweł
Kaźmierczak (3), Józef Drzewoski (4), Jan Chojnacki (2), Janusz Błasiak (1)
(1) Katedra Genetyki Molekularnej, Uniwersytet Łódźki
(2) Klinika Gastroenterologii i Chorób Wewnętrznych, Uniwersytet Medyczny
(3) Pracownia Gastroenterologiczna, Szpital Zakonu Bonifratrów Św. Jana Bożego
(4) Katedra Farmakologii, Zakład Farmakologii Klinicznej z Oddziałem Chorób Wewnętrznych, Uniwersytet Medyczny
Helicobacter pylori jest powszechnym patogenem człowieka, który może odgrywać znaczącą rolę w kancerogenezie
komórek błony śluzowej żołądka. Rozwój choroby nowotworowej może być związany z obniżeniem wydajności naprawy
uszkodzeń DNA oraz wzrostu wrażliwości na mutageny środowiskowe. Ponadto, wydajność naprawy DNA może być
zaburzona przez efekty uboczne chemioterapii oraz oporność komórkową na leki stosowane w eradykacji H. pylori.
Celem pracy było określenie związku pomiędzy poziomem infekcji H. pylori a wydajnością systemów naprawy komórek
żołądka. Zamierzone cele zrealizowaliśmy poprzez: 1) ocenę kinetyki naprawy uszkodzeń DNA komórek błony śluzowej
żołądka wywołanych nadtlenkiem wodoru i antybiotykiem-amoksycyliną, 2) określenie poziomu oksydacyjnych
i alkilacyjnych uszkodzeń endogennych w komórkach żołądka w zależności od poziomu infekcji H. pylori. W badaniach
zastosowaliśmy wersję alkaiczną testu kometkowego (comet assay). Uszkodzenia oksydacyjne i alkilacyjne ocenialiśmy
przez zastosowanie glikozylazy formamidopirymidynowej DNA (Fpg) oraz glikozylazy 3-metyloadeninowej DNA II
(AlkA). Uzyskane wyniki wskazują na wolniejszą kinetykę naprawy uszkodzeń DNA komórek błony śluzowej żołądka
wywołanych nadtlenkiem wodoru i amoksycyliną od osób z infekcją H. pylori w stosunku do grupy kontrolnej. Poziom
oksydacyjnych i metylacyjnych uszkodzeń spontanicznych był wyższy u osób z infekcją H. pylori. Uzyskane wyniki
wskazują na genotoksyczny efekt infekcji H. pylori, który może odgrywać znaczącą rolę w mechanizmie kancerogenezy.
Ocena poziomu uszkodzeń DNA oraz wydajność ich naprawy w powiązaniu z infekcją bakteryjną może stanowić
marker rozwoju raka żołądka.
Praca wykonana w ramach grantu UŁ 505/450 (MA, JB).
89
Genetyka człowieka
W53.
Inhibitor kinaz tyrozynowych STI571 przełamuje oporność komórek białaczkowych
na doksorubicynę w mechanizmie zależnym do naprawy DNA.
Ireneusz Majsterek, Tomasz Śliwiński, Dariusz Pytel, Janusz Błasiak
Katedra Genetyki Molekularnej, Uniwersytet Łódzki
STI571 (Imatinib mesylate) jest specyficznym inhibitorem onkogennej kinazy tyrozynowej BCR/ABL stosowanym
z dużym powodzeniem w leczeniu przewlekłej białaczki szpikowej (CML). Pomimo to dokładny mechanizm odpowiedzi
na hamowanie aktywności BCR/ABL przez STI571 jest ciągle niejasny. W naszych badaniach stwierdziliśmy, że
jednym z mechanizmów aktywności STI571 może być hamowanie naprawy DNA, a w następstwie przełamywanie
lekooporności towarzyszącej leczeniu białaczek. W tym celu posłużyliśmy się komórkami K562 pobranym od BCR/
ABL-pozytywnych pacjentów z CML (K562S) oraz komórkami charakteryzującymi się nabytą opornością na leczenie
doksorubicyną (K562R). Lekooporność określana była na podstawie testu przeżywalności MTT. Posługując się metodą
elektroforezy pojedynczych komórek (comet assay) wykazaliśmy, że w przeciwieństwie do komórek K562S, komórki
z nabyta opornością charakteryzowały się wzmożoną kinetyką naprawy uszkodzeń DNA indukowanych działaniem
doksorubicyny w stężeniach 0,5 i 1 mM. Wstępna inkubacja komórek z inhibitorem STI571 w stężeniu 1 mM
efektywnie odwracała oporność i powodowała hamowanie naprawy DNA. Analiza Western Blot z przeciwciałami
dla białka adaptorowego CRKL szlaku BCR/ABL, wykazała blokowanie jego fosforylacji w odpowiedzi na STI571, co
potwierdziło hamowanie aktywności kinazy. Uzyskane wyniki sugerują że jednym z molekularnych mechanizmów
aktywności STI571 w komórkach z ekspresją BCR/ABL może być modulowanie szlaku naprawy DNA, co w następstwie
prowadzić może do przełamania lekooporności podczas terapii białaczek.
Praca finansowana z grantu KBN 3P04 A03325.
W54.
Asocjacja wariantu allelicznego syntazy leukotrienu C4 z nadwrażliwością na
niesteroidowe leki przeciwzapalne.
Marek Sanak, Lucyna Mastalerz, Małgorzata Setkowicz, Daniel Potaczek, Andrzej Szczeklik
II Katedra Chorób Wewnętrznych, Collegium Medicum UJ, ul. Skawińska 8, 31-066 Kraków
Nadwrażliwość na niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) dotyczy 0,5-1% populacji ogólnej i 5-10% chorych
na astmę. Manifestuje się wysypką, łzawieniem i/lub napadem astmy oskrzelowej po przyjęciu leku. Objawy te mają
związek z uwalnianiem mediatorów zapalnych z mastocytów, a chorych charakteryzuje nadprodukcja leukotrienów
cysteinylowych i eozynofilia.
Celem badania było ustalenie związku między nadwrażliwością na NLPZ a promotorowym polimorfizmem genu dla
syntazy leukotrienu C4 (LTC4S). Enzym ten kontroluje biosyntezę leukotrienów, pochodnych szlaku 5-lipoksygenacji
kwasu arachidonowego.
Zbadano 186 chorych na astmę, 74 na przewlekłą pokrzywkę idopatyczną i 75 zdrowych. Nadwrażliwość na NLPZ
potwierdzono doustną lub wziewną próbą prowokacyjną z kwasem acetylosalicylowym. Polimorfizm A-444>C LTC4S
genotypowano techniką PCR-RFLP, wydalanie leukotrienów cysteinylowych (LTE4) mierzono w moczu ELISA.
U 76 chorych na astmę i 30 chorych na pokrzywkę wynik prowokacji kwasem acetylosalicylowym był dodatni. Częstość
allela – 444C LTC4S była u nich znamiennie większa (astma-0,39, pokrzywka-0,41, p<0,05) niż u chorych tolerujących
NLPZ (astma-0,27, pokrzywka-0,22). U zdrowych częstość allela – 444C była jak u chorych tolerujących NLPZ (0.27).
Wydalanie LTE4 u chorych z nadwrażliwością na NLPZ było znamiennie większe niż u tolerujących te leki, czy też
kontroli. W 2 i 4 godzinie po próbie prowokacyjnej stwierdzono większe przyrosty LTE4 w moczu u nosicieli – 444C
niż u homozygot AA.
NLPZ, ogólnie dostępne i najczęściej przyjmowane leki, powodują napad astmy lub pokrzywkę u chorych z nadprodukcją
leukotrienów cysteinylowych. Wykazano asocjację nadwrażliwości na NLPZ z promotorowym wariantem – 444C
LTC4S.
90
Genetyka człowieka
Komunikaty plakatowe:
P95.
Porównanie częstości aberracji chromosomowych, wymian chromatyd siostrzanych
(SCE) i kinetyki podziałów komórkowych w hodowli limfocytów poddanych
działaniu substancji z Ascaris – frakcji białek i oczyszczonego inhibitora trypsyny.
Tomasz Ferenc (1), Wanda Bratkowska (1), Dobrosława Łopaczyńska (1), Henryk Stróżyński (2),
Joanna Błaszkowska (3)
(1) Zakład Biologii i Genetyki UM w Łodzi, 90-647 Łódź, Plac Hallera 1
(2) Katedra i Klinika Chorób Zakaźnych UM w Łodzi, 91-347 Łódź, ul. Kniaziewicza 1/5
(3) Zakład Biologii i Parazytologii Lekarskiej UM w Łodzi, 90-647 Łódź, Plac Hallera 1
Wcześniejsze badania własne aktywności biologicznej substancji pochodzących z Ascaris suum wykazały, że białka
glisty o właściwościach antytryptycznych zaburzają rozwój zarodkowy zwierząt doświadczalnych.
Celem pracy było porównanie ewentualnych właściwości mitostatycznych i genotoksycznych związków otrzymanych
z tego nicienia – frakcji białek wykazujących aktywność antytryptyczną i wyizolowanego z tej frakcji inhibitora
trypsyny.
Białka frakcji SF5 (nie oczyszczony inhibitor trypsyny –NIT) otrzymano z homogenatu wora powłokowo-mięśniowego
Ascaris suum zmodyfikowaną metodą Roli i Pudlesa. Izolację i oczyszczenie inhibitora trypsyny (IT) z frakcji
SF5 homogenatu prowadzono wykonując filtrację żelową na Sephadexie G-25. Otrzymaną frakcję po sączeniu
molekularnym poddano elektroforezie SDS-PAGE. Oczyszczony IT wykazywał 10– krotnie wyższą aktywność inhibicją
wobec krystalicznej trypsyny w porównaniu z NIT. Ocenę genotoksyczności prowadzono na płytkach metafazowych
uzyskanych na drodze makrohodowli limfocytów krwi obwodowej człowieka. Przeprowadzono test aberracji
strukturalnych chromosomów (hodowla 48 godz.) i test wymian chromatyd siostrzanych (hodowla 72 godz.). Zarówno
IT jak i NIT dodawano na starcie hodowli w obu testach, w dawkach: 25, 50, 100 mg/ml (ekspozycja ciągła). Kinetykę
podziałów komórkowych określano za pomocą indeksu replikacyjnego (IR). Indeks mitotyczny (IM) wyrażano jako
liczbę metafaz w odniesieniu do 1000 analizowanych jąder.
Wstępne wyniki badań przedstawiają ocenę genotoksyczności IT oraz NIT bez egzogennej aktywacji metabolicznej.
Badane za pomocą testu aberracji chromosomowych związki ( IT, NIT) nie zwiększały częstości aberracji
chromosomowych w porównaniu z kontrolą, natomiast istotnie obniżały wartość indeksu mitotycznego. W teście SCE
zanotowano zwiększoną częstość wymian chromatyd siostrzanych po ekspozycji limfocytów zarówno na IT jak i NIT.
Analiza wartości IR wykazała stymulujący wpływ na dynamikę podziałów komórkowych obu badanych związków
z Ascaris. W zastosowanych testach nie stwierdzono zależności efekt-dawka dla IT i NIT. Uzyskane wyniki dla IT i NIT
w testowanych dawkach były zbieżne. Wstępne wyniki wykazały, że różny stopień aktywności antytryptycznej badanych
białek z Ascaris nie ma znaczącego wpływu na aktywność mitotyczną limfocytów.
*/ Praca finansowana przez UM w Łodzi w ramach tematu własnego nr 502-11-771(5).
P96.
Ocena cyto– i genotoksyczności cis-dichlorobis(dietylo-pirydyn-4-ylometylofosforano-κΝ) platyna II, nowego analogu
cis-diamminodichloroplatyny II w komórkach niedrobnokomórkowego
raka płuca A549.
Katarzyna Dinkler (1), Ksenia Matławska (1), Urszula Kalinowska (2), Renata Kontek (1), Regina Osiecka (1),
Justyn Ochocki (2)
(1) Zakład Cytogenetyki i Biologii Molekularnej Roślin, Uniwersytet Łódzki
(2) Zakład Chemii Bionieorganicznej, Uniwersytet Medyczny, Łódź
Cis-diamminodichloroplatyna (II) (cis-DDP) jest obecnie jednym z najczęściej stosowanych leków
przeciwnowotworowych. Wykorzystuje się ja m.in. w chemioterapii zarodkowych nowotworów jądra, jajnika,
niedrobnokomórkowego i drobnokomórkowego raka płuca, raka pęcherza moczowego, raka szyjki macicy, sutka,
żołądka. Cis-DDP powoduje jednak szereg skutków ubocznych takich jak, nefrotoksyczność, neurotoksyczność,
mielotoksyczność, ototoksyczność, zaburzenia żołądkowo-jelitowe, co poważnie ogranicza jej zastosowanie
91
Genetyka człowieka
w chemioterapii przeciwnowotworowej. Z tego względu nieustannie poszukuje się nowych pochodnych związków
platyny, równie skutecznych w eliminowaniu komórek nowotworowych ale charakteryzujących się obniżoną
toksycznością w stosunku do zdrowych tkanek i narządów. W Zakładzie Chemii Bionieorganicznej Uniwersytetu
Medycznego w Łodzi zsyntetyzowano nowy analog cis-DDP: cis-dichlorobis-(dietylo-pirydyn-4-ylometylofosforano–
κΝ) platyna II, (PtEMPA(IV)).
Celem badań było oszacowanie potencjalnej cytotoksyczności (test MTT) i genotoksyczności (test elektroforezy
pojedynczych komórek w żelu agarozowym – „comet assay”) PtEMPA(IV) w komórkach linii niedrobnokomórkowego
raka płuc A549.
Uzyskane wyniki wskazują, iż nowy analog cis-DDP wywiera silny efekt cyto– i genotoksyczny na komórki linii A549
w porównaniu z cis-DDP. Otrzymane rezultaty wydają się być bardzo obiecujące i rodzą konieczność kontynuacji
badań.
Projekt częściowo finansowany z grantu UM 503-100-3.
P97.
Izomery 5– i 6– fosforanowych pochodnych pirymidyn
(analogi 5-fluorouracylu) – ocena potencjalnej genotoksyczności testem komety
w linii niedrobnokomórkowego raka płuca A549.
Ksenia Matławska (1), Katarzyna Dinkler (1), Kamila Domińska (1), Ewa Złobecka (1), Renata Kontek (1), Urszula
Kalinowska (2), Regina Osiecka (1), Justyn Ochocki (2)
(1) Zakład Cytogenetyki i Biologii Molekularnej Roślin, Uniwersytet Łódzki
(2) Zakład Chemii Bionieorganicznej, Uniwersytet Medyczny, Łódź
Niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC; ang. non-small cell lung cancer) stanowi 75 % wszystkich nowotworów
płuc (ok. 400 tys. przypadków rocznie w krajach rozwiniętych). Pozostałe rozpoznawane przypadki nowotworów płuca
stanowi rak drobnokomórkowy (SCLC). W Polsce co roku na raka płuca zapada ok. 20 tys. osób. NSCLC charakteryzuje
się dużą frakcja wzrostową oraz krótkim czasem podwojenia, co wiąże się z jego wrażliwością na cytostatyki.
W chemioterapii niedrobnokomórkowego raka płuca czynnikiem ograniczającym jej stosowanie jest szerokie spektrum
skutków ubocznych spowodowanych dużą toksycznością aplikowanych leków. Te obserwacje rodzą konieczność
poszukiwania nowych związków skutecznych w chemioterapii, ale charakteryzujących się obniżoną toksycznością
w stosunku do zdrowych komórek. Zsyntetyzowano fosforanowe pochodne pirymidyn będące nowymi analogami 5fluorouracylu: kwas 5-uracylometylofosfonowy (5-umpa), ester dimetylowy 5-umpa (5umpm), ester dietylowy 5-umpa
(5-umpe), kwas 6-uracylometylofosfonowy (6-umpa), ester dimetylowy 6-umpa (6-umpm) i ester dietylowy 6-umpa
(6-umpe). Celem badań było oszacowanie potencjalnej genotoksyczności 5-fluorouracylu oraz wyżej wymienionych
jego pochodnych w komórkach linii niedrobnokomórkowego raka płuc A549. Jako podstawę oceny skuteczności
biologicznej wybrano pomiar poziomu uszkodzeń DNA metodą elektroforezy pojedynczych komórek w żelu
agarozowym (test komety). Przeprowadzono alkaliczną wersję testu komety. Uzyskane wyniki wskazują, iż 5-umpa, 5umpm, 5-umpe, 6-umpa, 6-umpm, 6-umpe wywierają efekt genotoksyczny na komórki A549, w zakresie zastosowanych
stężeń. Wyniki te wydają się być niezmiernie istotne ze względu na niewielką genotoksyczność ww. nowych analogów
5-fluorouracylu w stosunku do zdrowych komórek – limfocytów krwi obwodowej człowieka [Matławska i wsp., npbl.].
Kontynuacja badań pozwoli w przyszłości na wybranie związku najbardziej aktywnego i selektywnie eliminującego
komórki zmodyfikowane nowotworowo.
Badania częściowo finansowane z grantu UM 503-100-3.
P98.
Analiza cytotoksyczności kompleksu trans-Pd EMPA(II) i trans-Pd EMPA(IV)
w prawidłowych limfocytach w porównaniu z cis-DDP.
Renata Kontek (1), Ksenia Matławska (1), Urszula Kalinowska (2), Justyn Ochocki (2), Regina Osiecka (2)
(1) Zakład Cytogenetyki i Biologii Molekularnej Roślin, Uniwersytet Łódzki
(2) Zakład Chemii Bionieorganicznej, Uniwersytet Medyczny, Łódź
Cis-DDP (cisplatyna) należy do leków powszechnie stosowanych w chemioterapii wielu nowotworów, zwłaszcza raka
pęcherza moczowego, jajnika, jądra, piersi, głowy i szyi.
Cis-DDP jest lekiem alkilującym, działającym niezależnie od cyklu komórkowego. tworzy wewnątrzkomórkowe oraz
międzyniciowe wiązania krzyżowe z DNA, jak również połączenia z białkiem i monoaddukty. Pomimo dużej skuteczności
terapeutycznej cis-DDP wykazuje szereg działań niepożądanych, dlatego też współcześnie podejmuje się próby uzyskania
nowych analogów cis-DDP, które byłyby skuteczne w chemioterapii przy równoczesnym obniżeniu cytotosyczności.
92
Genetyka człowieka
Do badań wykorzystano test MTT {3(4,5-dimethylthaziol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide], który polega na
określeniu metabolizmu energetycznego komórek przez pomiar aktywności jednego z enzymów oddechowych. Wyniki
ww. testu pozwoliły oszacować wartości IC50 czyli stężenia związku, które powoduje 50% zahamowanie wzrostu
komórek po ich inkubacji przez 72h. Prace zostały przeprowadzone na komórkach prawidłowych – limfocytach krwi
obwodowej, pochodzących od 2-3 zdrowych, niepalących dawców. Do badań wykorzystano nowe analogi cis-DDP:
trans-PdEMPA(II) tj. trans-dichlorobis(dietylo-pirydyn-2-ylometylofosforano– kN)pallad(II) oraz trans-PdEMPA(IV)
tj. trans-dichlorobis(dietylo-pirydyn-4-ylometylofosforano– κΝ)pallad(II).
Na podstawie przeprowadzonego testu MTT wartość IC50 dla PdEMPA(II) wynosiła 215,49 µΜ, dla PdEMPA(IV)
255,08 µΜ, natomiast dla cis-DDP 6,83 µΜ. Wyniki te wskazują na znacznie niższą cytotoksyczność badanych związków
w porównaniu z cis-DDP w prawidłowych limfocytach krwi obwodowej człowieka.
Badania częściowo finansowane z grantu UM 503-100-3.
Onkogenetyka
Komunikaty plakatowe:
W55.
A High Proportion of Founder BRCA1 Mutations in Polish Breast Cancer Families.
B. Górski (1), A. Jakubowska (1), T. Huzarski (1), T. Byrski (1), J. Gronwald (1), E. Grzybowska (2),
A. Mackiewicz (3), M. Stawicka (4), M. Bębenek (5), D. Sorokin (5) , Ł. Fiszer-Maliszewska (6), O. Haus (7),
H. Janiszewska (7), S. Niepsuj (8), S. Góźdź (9), L. Zaremba (10), M. Posmyk (10) , M. Płużańska (11), E. Kilar (12),
D. Czudowska (13), B. Waśko (14), R. Miturski (15), J. R. Kowalczyk (16), K. Urbański (17), M. Szwiec (18),
J. Koc (17), A .Rozmiarek (19), T. Dębniak (1), C. Cybulski (1), E. Kowalska (1), A. Tołoczko-Grabarek (1),
S. Zajączek (1), J. Menkiszak (20) , K. Mędrek (1), B. Masojć (1), M. Mierzejewski (1), S. Narod (21), J. Lubiński (1)
(1) Department of Genetics and Pathology, International Hereditary Cancer Center Pomeranian Medical University, Szczecin,
Poland
(2) Department of Clinical Genetics, Bydgoszcz Medical University, Poland
(3) Department of Cancer Immunology,Great Poland Cancer Center and University School of Medical Sciences, Poznań,
Poland
(4) Prophylactic and Epidemiology Center, Poznań, Poland
(5) Regional Oncology Center, Wrocław, Poland
(6) Institute of Immunology & Experimental Therapy, Wrocław, Poland
(7) Department of Tumor Biology, Maria Skłodowska-Curie Memorial Institute Gliwice, Poland
(8) Department of Pulmonology and Oncology, Regional Oncology Hospital, Olsztyn, Poland
(9) Holycross Oncology Center, Kielce, Poland
(10) Regional Oncology Center, Białystok, Poland
(11) Department of Chemotherapy, Medical Academy, Łódź, Poland
(12) Department of Chemotherapy, Regional Hospital, Świdnica, Poland
(13) Oncology Diagnostic Center, Legnica, Poland
(14) Regional Hospital No 1, Rzeszów, Poland
(15) Department of Gynecology, Medical Academy, Lublin, Poland
(16) Cancer Genetics Counseling Unit Medical University, Lublin, Poland
(17) Regional Oncology Center, Kraków, Poland
(18) Regional Oncology Hospital, Opole, Poland
(19) Regional Oncology Hospital, Zielona Góra, Poland
(20) Chair and Clinic of Surgical Gynecology and Gynecological Oncology of Adults and Adolescents, Pomeranian
Medical University, Szczecin, Poland
(21) Centre for Research in Women`s Health, University of Toronto, Canada
Three mutations in BRCA1 (5382insC, C61G and 4153delA) are common in Poland and account for the majority
of mutations identified to date in Polish breast and breast-ovarian cancer families. It is not known, however, to what
93
Genetyka człowieka
extent these three founder mutations account for all of the BRCA mutations distributed throughout the country. This
question has important implications for health policy and for the design of epidemiologic studies. To establish the
relative contributions of founder and non-founder BRCA mutations, we established the entire spectrum of BRCA1 and
BRCA2 mutations in large set of breast/ovarian cancer families with origins in all regions of Poland. We sequenced the
entire coding regions of the BRCA1 and BRCA2 genes in 100 Polish families with three or more cases of breast cancer
and in 100 families with cases of both breast and ovarian cancer. A mutation in BRCA1 or BRCA2 was detected in 66%
of the breast cancer families and in 63% of the breast-ovarian cancer families. 122 of 129 mutations were in BRCA1
(94.6%) and seven were in BRCA2 (5.4%). Of the 122 families with BRCA1 mutations, 119 (97.5%) had a recurrent
mutation (i.e. one that was seen in at least two families). In particular, 111 families (91.0%) carried one of three common
founder mutations. The mutation spectrum was not different between families with and without ovarian cancer. These
findings suggest that a rapid and inexpensive assay directed at identifying three common founder mutations will have
a sensitivity of 86%, compared to a much more costly and labor intensive full sequence analysis of both genes. This rapid
test will facilitate large-scale national epidemiology and clinical studies of hereditary breast cancer, including potentially
studies of chemoprevention.
W56.
Analiza częstości mutacji i utraty heterozygotyczności (LOH) w genie PTEN w rakach
jajnika.
Iwona Kolasa (1), A. Janiec-Jankowska (2), J. Plisiecka-Hałasa (1), A. Dansonka-Mieszkowska (1), B. Konopka (2)
Kupryjańczyk (1)
(1) Zakład Patologii Molekularnej, Centrum Onkologii-Instytut, ul. Roentgena 5, 02-781 Warszawa
(2) Zakład Endokrynologii, Centrum Onkologii-Instytut, ul. Roentgena 5, 02-781 Warszawa
Mutacje genu supresorowego PTEN, zlokalizowanego na chromosomie 10q23.3, występują w wielu typach sporadycznych
nowotworów. PTEN koduje fosfatazę o podwójnej specyficzności substratowej. Jako fosfataza fosfoinozytolu hamuje
aktywację kinazy białkowej AKT, natomiast jako fosfataza białkowa bierze udział w regulacji migracji i inwazyjności
komórek.
Zbadano 107 guzów jajnika (w tym 62 raki surowicze, 17 endometrioidalnych, 12 śluzowych, 8 jasnokomórkowych
i inne) pod kątem zaburzeń genu PTEN. Mutacji poszukiwano we wszystkich 9 egzonach genu techniką PCR-SSCP
i sekwencjonowania.
Mutacje w genie PTEN stwierdzono w 6 rakach jajnika (ok. 6%): w 4 endometrioidalnych, jednym jasnokomórkowym
i jednym surowiczym. Trzy mutacje (Ala126Asp, Arg130Stop, Arg142Trp) wykryto w egzonie 5, kodującym domenę
katalityczną fosfatazy, dwie w egzonie 3 (delecję 37 pz i insercję A) oraz jedną w egzonie 7 (delecja 5 pz). W 6 guzach
stwierdzono neutralny polimorfizm genetyczny GGC&#61614;GGT (Gly44Gly) w egzonie 2.
Badanie utraty heterozygotyczności (LOH) wykonano na materiale 76 guzów przy użyciu 6 markerów DNA.
Poszczególne loci genu z tkanki nowotworowej i kontrolnej amplifikowano metodą fluorescencyjną i rozdzielano na
sekwenatorze. LOH stwierdzono w 25 guzach, co stanowi 32% analizowanych przypadków. LOH wykryto w 58% raków
endometrioidalnych, 29% jasnokomórkowych i 29% surowiczych oraz w 25% śluzowych.
Uzyskane wyniki pokazują, że mutacje w genie PTEN w rakach jajnika są rzadkie (6%). Znacznie częściej występuje
utrata drugiego allelu genu (32%). Powyższe zmiany są najliczniejsze w typie endometrioidalnym raka.
W57.
BMP-1 variants in leiomyoma and other tumors.
Aleksandra Auguściak (1), Marta Lesiak (1), Martyna Dubrawska (1), Ksymena Urbanek (1), Maciej Kajor (2),
Dariusz Gołka (2), Anna Zborek (3), Gene C. Kopen (4), Aleksander L. Sieroń (1)
(1) Katedra i Zakład Biologii Ogólnej, Molekularnej i Genetyki, Śląska Akademia Medyczna, Katowice, Poland
(2) Zakład Patomorfologii, Śląska Akademia Medyczna, Katowice, Poland
(3) Zakład Biologii Molekularnej, Instytut Onkologii, Gliwice, Poland
(4) Neuronyx, Inc., Malvern, PA.
http://biolmolgen.slam.katowice.pl
Three products of BMP-1 gene that are crucial for conversion of type I, II, III, and V procollagens to self-assembling
monomers, activation of laminin-5, prolysyl oxidase, probiglycan, and morphogenetic molecules BMP-2 and BMP-4
have been localized in 21 different human tumors. In most tumors it localized predominantly in extra cellular matrix.
However, in leiomyoma and epithelioid sarcoma the protein additionally localized in cytoplasm and nuclei of tumor
cells. Distinguished signal for BMP-1 variants in blood vessels was obtained in Ewing tumors. The RT-PCR analysis
94
Genetyka człowieka
revealed that the variants detected by immunostaining in non tumor tissues of human uterus were mainly BMP-1 and
BMP-1/His (83%). The largest variant of BMP-1 gene product (mTLD) has been detected in 50% of non tumor samples.
In leiomyoma the mRNAs for all three variants have been found in 83% of the patients but they expression differed in
different patients. In general there has been no evidence of consistence in variants expression regardless of tumor type,
thus, it could indicate disregulation of the alternative mRNA splicing under pathological conditions. Therefore, we
believe that the enzymes could be potentially an attractive target for development of inhibitors of matrix formation and
consequently an inhibition of angiogenesis in tumors.
W58.
Amplifikacja hTERT i hTERC a aktywność telomerazy w wybranych nowotworach
wieku dziecięcego.
Jerzy Nowak, D. Januszkiewicz-Lewandowska, M. Zawada, M. Pernak, P. Makowski, K. Nowicka, J. Rembowska,
K. Lewandowski
Instytut Genetyki Człowieka PAN, Klinika Hematologii i Onkologii Dziecięcej Akademii Medycznej, Zakład Diagnostyki
Medycznej Poznań
Telomeraza jest kompleksem rybonukleoproteinowym złożonym z odwrotnej transkryptazy (hTERT), białka (TP1)
i RNA (hTR) stanowiącego matrycę do syntezy telomerowego DNA. Reaktywacja telomerazy odgrywa istotną rolę
w procesie immortalizacji komórki oraz w rozwoju procesu nowotworowego. W wybranych guzach litych (guz Wilmsa,
neuroblastoma) oraz w schorzeniach limfoproliferacyjnych (ostra białaczka limfoblastyczna-ALL i nielimfoblastycznaANLL) u dzieci stwierdzono wysoką aktywność telomerazy pozwalającą na odróżnienie komórek nowotworowych od
prawidłowych. Podobnie badania ekspresji trzech podjednostek telomerazy udowodniły znaczące różnice ilościowe
pomiędzy komórkami prawidłowymi i nowotworowymi. Uzyskane wyniki wskazują, że ilościowe oznaczenie
aktywności i ekspresji telomerazy może stanowić pomocny marker diagnostyczny i prognostyczny rozwoju procesu
nowotworowego. Ponadto w przypadku guzów litych wyższa aktywność i ekspresja telomerazy sugeruje występowanie
mikroprzerzutów w materiale pobranym z obrzeża guza, węzłów chłonnych i szpiku. Badania z zastosowaniem
techniki FISH wykazały amplifikację genów hTERT i hTERC w komórkach guzów litych i ostrych białaczek białaczek
dzieci. Uzyskane wyniki wskazują, że wysoka aktywność i ekspresja telomerazy w komórkach nowotworowych
najprawdopodobniej jest spowodowana amplifikację genów hTERT i hTERC.�
Praca wykonana w ramach projektów PBZ-KBN-090/PO5/2003 oraz KBN 6PO5E 10220.
W59.
Zwiększenie czułości techniki CESH na przykładzie analizy przypadku nowotworu
jądra.
Beata Grygalewicz (1), Barbara Pieńkowska-Grela (1), Brenda Summersgill (2), Alan Mcintyre (2),
Janet Shipley (2)
(1) Samodzielna Pracownia Cytogenetyki, Centrum Onkologii Instytut Warszawa ul. Roentgena 5
(2) Male Uriological Cancer Research Centre, Institute of Cancer Research, 15 Cotswold Road, Sutton, UK
Zarodkowe guzy jąder stanowią jedynie około 2% wszystkich nowotworów, lecz jednocześnie są najczęściej
diagnozowanym nowotworem występującym u młodych dorosłych mężczyzn.
Pod względem cytogenetycznym guzy jąder charakteryzują się okołotriploidalną zawartością DNA. Najbardziej
charakterystyczną zmianą kariotypową, w tej grupie nowotworów, jest występowanie dodatkowych kopii krótkiego
ramienia chromosomu 12, głównie w formie izochromosomu i(12p) jak również pod postacią markerów substytutywnych
niosących powielony materiał 12p.
Zastosowanie techniki CESH (Comparative Expressed Sequence Hybridisation) umożliwia detekcję profilu ekspresji
genów wzdłuż poszczególnych chromosomów. Zasada działania tej techniki jest analogiczna do metody CGH
(Comparative Genomic Hybridisation), z tą różnicą, że materiałem wyjściowym do analizy CESH jest RNA, podczas
gdy analizę CGH przeprowadza się na podstawie DNA.
Obecna praca przedstawia analizę ekspresji przypadku guza przeprowadzoną dwoma metodami: oryginalną,
wykorzystującą amplifikację DOP oraz nową, polegającą na bezpośrednim znakowaniu fluorescencyjnym cDNA,
z pominięciem etapu amplifikacji DOP. Porównanie uzyskanych wyników wykazało, że użycie zmodyfikowanego
protokołu ujawniło znacznie większy poziom ekspresji genów znajdujących się na krótkim ramieniu chromosomu
12 jak również obecność amplikonu na długim ramieniu chromosomu 4 obejmujący locus genu c-kit, który nie był
ujawniony przy zastosowaniu oryginalnej metody. Nadekspresja genu c-kit została potwierdzona metodą real-time/
quantitative Taq-Man PCR.
95
Genetyka człowieka
W60.
Nieinwazyjna diagnostyka raka pęcherza moczowego przy użyciu testu UroVysion.
Próba indywidualnej prognozy klinicznej.
Aleksandra Binka-Kowalska (1), Edyta Borkowska (1), Maria Constantinou (1), Ewa Zając (1),
Agnieszka Nawrocka (2), Józef Matych (3), Bogdan Kałużewski (1)
(1).Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
(2). Zakład Patomorfologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
(3). Oddział Urologii i Transplantacji Nerek Szpitala im. Pirogowa w Łodzi
Rak pęcherza moczowego jest w Polsce czwartym pod względem częstości zachorowań nowotworem złośliwym i szóstą
co do częstości przyczyną zgonów z przyczyn nowotworowych wśród mężczyzn. W badaniu wzięło udział 111 pacjentów
pierwotnie diagnozowanych lub monitorowanych w kierunku raka pęcherza moczowego. W celu analizy aberracji
chromosomowych w jądrach interfazowych komórek z osadu moczu wykonano oparty na wielobarwnej technice
FISH test UroVysion, zawierający trzy sondy centromerowe dla chromosomów 3, 7 i 17 oraz sondę unikalną dla locus
9p21. Dla guzów pierwotnych pęcherza moczowego czułość testu UroVysion wyniosła 96%, dla guzów nawrotowych
87,5%. Aplikacja testu UroVysion potwierdziła jego wysoką czułość umożliwiając diagnostykę zarówno pierwotnych jak
i nawrotowych raków pęcherza moczowego. Test UroVysion pozwolił na wykrycie 100% inwazyjnych raków pęcherza
moczowego. Obecność guza naciekającego mięśniówkę można więc praktycznie wykluczyć, gdy wynik testu UroVysion
jest negatywny. Pentasomia lub wyższa polisomia chromosomu 17 oraz homozygotyczna delecja w locus 9p21 okazały
się czynnikami prognostycznymi dla oceny ryzyka nawrotu guzów pęcherza moczowego.
W61.
Analiza profilu metylacji DNA w raku pęcherza moczowego.
Małgorzata Presler (1), Marcin Matuszewski (1), Beata Schlichtholz (2)
(1) Katedra i Zakład Biochemii, Akademia Medyczna w Gdańsku, ul. Dębinki 1, 80-210 Gdańsk
(3) Katedra i Klinika Urologii, Akademia Medyczna w Gdańsku, ul. Kieturakisa 1, 80-742 Gdańsk
Epigenetyczna modyfikacja DNA związana z metylacją reszt cytozyny w promotorowym regionie antyonkogenów jest
obecnie uznana za alternatywny mechanizm inaktywacji genów w chorobach nowotworowych. Metylacji ulega cytozyna
w dinukleotydowej sekwencji CpG. Celem badań była analiza hipermetylacji promotorów dwóch genów związanych
z naprawą DNA, tj. hMLH1 i metylotransferazy DNA O 6-metyloguaniny (MGMT) oraz proapoptotycznej kinazy
DAP u 46 pacjentów z rakiem pęcherza moczowego z nabłonka przejściowego (Ta/T1 = 20, T2-T4 = 26). W badaniach
zastosowano technikę MSP (ang. methylation-specific PCR), która umożliwia analizę metylacji wybranej sekwencji
w oparciu o modyfikację DNA pirosiarczynem sodu. Analiza DNA tkanki nowotworowej wykazała hipermetylację
promotora genu hMLH1 w 20 % (9/46) przypadków, MGMT w 35% (1 6/46) natomiast kinazy DAP w 43% (20/
46). Istotną statystycznie zależność zaobserwowano pomiędzy hipermetylacją promotora genu MGMT a stopniem
zaawansowania nowotworu (p = 0,05, dwustronny test Fishera) oraz pomiędzy hipermetylacją hMLH1 a stopniem
złośliwości (p = 0,04). Ponadto analiza przeżycia wykazała istnienie korelacji pomiędzy skróconym czasem przeżycia
a hipermetylacją promotora MGMT (p = 0,01, test log-rank) oraz hMLH1 (p = 0,008). Badania te wskazują, że
hipermetylacja CpG w regionie promotorowym MGMT, hMLH1 i kinazy DAP odgrywa istotną rolę w patogenezie raka
pęcherza moczowego oraz zwracają uwagę na potencjalne wykorzystanie, zwłaszcza analizy hipermetylacji promotora
MGMT oraz hMLH1, w diagnostyce i prognostyce tego nowotworu.
W62.
Cell cycle and phenotype changes in C6 rat glioma cells transfected with triple-helix
inhibiting IGF-I expression; implications for glioma patients gene therapy
Agnieszka Stefańska (1), A. Szpechciński (1), P. Kopiński (1), M. Bierwagen (2), P. Jarocki (3), H. Kasprzak (2),
J. Trojan (1, 3)
(1) Dept. of Gene Therapy, L Rydygier University School of Medicine, Bydgoszcz
(2) Dept. of Neurosurgery, L Rydygier University School of Medicine, Bydgoszcz
(3) I Dept. of General Surgery, Collegium Medicum, UJ, Krakow
BACKGROUND. Brain tumors expressing Insuline-like Growth Factor-I (IGF-I) lose their malignancy after transfection
with vectors encoding 23-oligonucleotide sequence forming triple-helix (triplex) with IGF-I gene promoter. Current
clinical trials assess the efficiency of anti-IGF-I triplex based vaccines in gene therapy of glioma patients.
METHODS. C6 rat glioma and primary human glioma cell cultures were transfected with anti-IGF-I triplex. Transfected
96
Genetyka człowieka
and nontransfected cell lines were examined with flow cytometry for cell cycle, percentage of apoptotic cells and
superficial MHC I, MHC II, CD80 and CD86 expression. IGF-I gene expression was assessed with RT-PCR in both
transfected and nontransfected C6 line.
RESULTS. Anti-IGF-I triplex transfected cells, as compared with non-transfected equivalents, revealed increased MHC
I, CD80 and CD86 expression (both in rat and human cells, examined for mean fluorescence intensity and percentage of
positive cells), extensive apoptosis and reduced number of G2/S/M cells. We did not find significant changes in MHC II
expression. Enhanced expression of MHC I gene was detected in CNS-1 cells after transfection.
CONCLUSIONS. Anti-IGF-I triplex transfected glioma cells enter apoptosis and express phenotype changes that can be
relevant to reduced glioma malignancy and immune stimulation in vaccinated patients.
Komunikaty plakatowe:
P99.
Monitorowanie chimeryzmu z użyciem zestawu AmpFlSTR SGM Plus u chorych po
przeszczepie szpiku aliogenicznego.
Jadwiga Sawecka (1), J. Skulimowska (1), B. Mariańska (2), J. Kościelak (1
(1) Zakład Biochemii, Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa
(2) Klinika Przeszczepiania Komórek Krwiotwórczych, Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa
Badanie chimeryzmu u chorych na białaczkę leczonych metodą transplantacji allogenicznego szpiku (allo BMT)
umożliwia wczesne wykrycie przyjęcia przeszczepu, nawrotu choroby i odrzucenia przeszczepu.
Celem prezentowanej pracy było wprowadzenie oznaczeń chimeryzmu u chorych po przeszczepie szpiku
allogenicznego, metodą opartą na analizie krótkich tandemowych powtórzeń (STR– short tandem repeats) w dziesięciu
lokusach (D3S1358, vWA, D16S539, D2S1338, D8S117, D21S11, D18S51, D19S433, THO1, FGA) oraz badaniu genu
amelogeniny. W pierwszym etapie metody w reakcji multipleks PCR namnaża się odpowiednie fragmenty DNA, przy
czym jeden z prajmerów dla danego lokusa jest znakowany fluorescencyjnie (5-FAM, JOE bądź NED). Następnie
w warunkach denaturujących przeprowadza się rozdział elektroforetyczny namnożonego materiału na sekwenatorze
ABI PRISM 377. Uzyskane wyniki analizuje się z użyciem programów komputerowych Gene Scan i Genotyper.
Wstępne badania przeprowadzono u 6 pacjentów z Kliniki Przeszczepiania Komórek Krwiotwórczych Instytutu
Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie. Chimeryzm oznaczano w różnych odstępach czasu po przeszczepie
allogenicznego szpiku (na ogół w 30, 60, 90 dobie oraz 6,9,12, miesiącu po przeszczepie). W pięciu przypadkach
DNA dawcy szpiku zastąpił 100% DNA biorcy w 30 dniu po przeszczepie, a w szóstym po 60 dniach. U wszystkich
przebadanych pacjentów dotychczas utrzymuje się chimeryzm całkowity. Obecnie zamierzamy podjąć rutynowe
badania chimeryzmu i do współpracy zapraszamy inne ośrodki hematologiczne.
P100.
Aktywność telomerazy w moczu potencjalnym markerem diagnostycznym w raku
pęcherza moczowego.
Agnieszka Dettlaff-Pokora (1), M. Matuszewski (2), B. Schlichtholz (1)
(1) Katedra i Zakład Biochemii Akademii Medycznej w Gdańsku, ul. Dębinki 1, Gdańsk
(2) Katedra i Klinika Urologii Akademii Medycznej w Gdańsku, ul. Kieturakisa 1, Gdańsk
Przejściowokomórkowy rak pęcherza moczowego powoduje rokrocznie w Polsce ponad 2000 zgonów. Jest to
nowotwór dotykający osób w podeszłym wieku i charakteryzujący się częstymi wznowami. Optymalne leczenie
wymaga wczesnej diagnozy, zaś rutynowa diagnostyka cytologiczna moczu obarczona jest dużym odsetkiem wyników
fałszywie negatywnych, co powoduje potrzebę poszukiwania innych markerów nowotworowych. Telomeraza
jest rybonukleoproteiną jądrową, której przydatność diagnostyczna jest dyskutowana od kilku lat. Jest to enzym
odpowiedzialny za wydłużanie końcówek chromosomów zwanych telomerami, aktywny w okresie embrionalnym
oraz w komórkach pnia. Aktywność telomerazy stwierdzono również w około 85% ludzkich nowotworów i linii
nowotworowych. W raku pęcherza moczowego bardzo dobrym materiałem do badań, z uwagi na łatwą dostępność
i nieinwazyjność pobierania, jest mocz. Do analizy aktywności telomerazy wykorzystano test oparty na wydłużeniu
przez telomerazę sztucznego substratu, powieleniu produktu telomerazy w reakcji PCR oraz detekcji produktów
reakcji PCR. W przypadku tkanek detekcję wykonywano przy użyciu testu immunoenzymatycznego, zaś w przypadku
moczu przy wykorzystaniu elektroforezy poliakrylamidowej i barwienia srebrem. Analizę moczu wykonywano dla
różnych ilości białka na test w celu uniknięcia wpływu inhibitorów reakcji PCR obecnych w moczu na otrzymane
97
Genetyka człowieka
wyniki. Przeanalizowano łącznie tkanki nowotworowe oraz mocz 52 pacjentów chorych na raka pęcherza moczowego.
Aktywność telomerazy stwierdzono w 48 tkankach nowotworowych (92%). Aktywność telomerazy w tkance była
zgodna z aktywnością w osadzie komórek z moczu w 51 przypadkach, co daje specyficzność na poziomie 98%. Analiza
aktywności telomerazy w moczu może okazać się bardzo czułą i specyficzną metodą wykrywania zmian nowotworowych
zarówno we wczesnej diagnostyce jak i wykrywaniu nawrotów choroby.
P101.
Analiza niestabilności genomowej w raku pęcherza moczowego z zastosowaniem
wybranych markerów mikrosatelitarnych.
Jacek Turyn (2), Marcin Matuszewski (1), Beata Schlichtholz (2)
(1) Katedra i Klinika Urologii Akademii Medycznej w Gdańsku; ul. Kieturakisa 1; 80-742 Gdańsk
(2) Katedra i Zakład Biochemii Akademii Medycznej w Gdańsku; ul. Dębinki 1; 80-211 Gdańsk
Cechą charakterystyczną raka pęcherza moczowego jest niestabilność genomowa. W pracy wykonano analizę zmian
w sekwencjach mikrosatelitarnych na chromosomach 2p, 3p, 8q, 9p, 9q, 12q, 13q, 18q i 17p u 15 pacjentów z guzami
powierzchownymi (T1) i u 31 pacjentów z guzami naciekającymi mięśniówkę (T2-4). Analizę przeprowadzono na DNA
izolowanym z: tkanki nowotworowej i osadów komórkowych uzyskanych z moczu, jak również na DNA występującym
w osoczu pochodzącym od 16 pacjentów. Do badań zastosowano 12 markerów mikrosatelitarnych. Łączna częstość
występowania, utraty heterozygotyczności loci mikrosatelitarnych (LOH) i niestabilności mikrosatelitarnej (MSI)
wyniosła 67% (31/46). 41% (19/46) wykazywała zmiany w 2 i więcej loci. LOH/MSI występowało w 73% (11/15) guzów
powierzchniowych (T1) oraz u 65% (20/32) pacjentów z nowotworem naciekającym mięśniówkę pęcherza (T2-4).
Dwa mikrosatelity, D2S242 i D2S252 były niestabilne u 74% (23/31) pacjentów z wykrytymi zmianami w sekwencjach
mikrosatelitarnych. 46% z wszystkich obserwowanych zmian (28/61) znaleźliśmy w tkance nowotworowej
i w odpowiadających im osadach komórkowych z moczu. Trzy z 16 zmian (19%) stwierdzono w DNA izolowanym
z osocza. Nie znaleziono istotnych statystycznie korelacji pomiędzy występowaniem zmian w mikrosatelitach a czasem
przeżycia i częstością wznowy. W badaniach wykazano bardzo wysoką przydatność markerów D9S242 i D9S252
w analizie zmian w sekwencjach mikrosatelitarnych w raku pęcherza moczowego zarówno w tkance nowotworowej, jak
i osadach komórkowych z moczu
P102.
Nietypowa aberracja t(2;11) z rearanżacją genu CCND1 w przypadku chłoniaka
z komórek płaszcza.
Barbara Pieńkowska-Grela (1), Renata Woroniecka (1) Grzegorz Rymkiewicz (2), Renata Maryniak (2)
(1) Samodzielna Pracownia Cytogenetyki, Centrum Onkologii-Instytut Warszawa
(2) Zakład Patologii, Centrum Onkologii-Instytut Warszawa
Chłoniak z komórek płaszcza (MCL) charakteryzuje się obecnością translokacji t(11;14)(q13;q32), widocznej w ponad
80% kariotypowanych przypadków. Translokacja ta powoduje rearanżację genu CCND1, zlokalizowanego w prążku
11q13, z jego przeniesieniem w rejon promotora genu IGH (14q32). Deregulacja CCND1, kodującego cyklinę D1, jest
krytycznym wydarzeniem w patogenezie tych chłoniaków. Silna nadekspresja tej cykliny jest specyficznie związana
z komórkami MCL.
Przedstawiamy przypadek 53-letniego pacjenta z rozpoznanym w badaniu histopatologicznym B-komórkowym
chłoniakiem nieziarniczym z komórek płaszcza. Analiza w cytometrze przepływowym potwierdziła nadekspresję
cykliny D1, stwierdzoną w barwieniu immunohistochemicznym.
Badanie cytogenetyczne zostało wykonane po krótkotrwałej hodowli komórek węzła chłonnego. Wykonano
standardowe badanie metafaz (GTG). Badanie FISH wykonano przy użyciu dwukolorowej sondy, hybrydyzującej do
rejonów CCND1/11q13 i IGH/14q32 (Vysis). Sondy znakujące inne lokalizacje na krótkim ramieniu chromosomu 2,
w tym IGK/2p12, otrzymano dzięki uprzejmości prof. I. Włodarskiej (KU, Leuven, Belgia).
W badanym materiale występowały metafazy z licznymi zmianami kariotypowymi, bez typowego markera
t(11;14)(q13;q32). Obraz prążkowy sugerował obecność translokacji t(2;11) z p.p. w ramieniu 2p i w regionie CCND1/
11p13. Badanie FISH przy użyciu sondy IgH/CCND1 wykazało brak typowej dla MCL translokacji, jednak 12% komórek
wykazywało atypowy wzór sygnałów. Analiza znakowanych metafaz wykazała przeniesienie jednego z sygnałów CCND1
na 2p, podczas gdy sygnały IGH pozostawały niezmienione na obu kopiach chromosomu 14. Badanie FISH potwierdziło
rearanżację genu CCND1. Dalsze badania przy użyciu sond znakujących regiony krótkiego ramienia chromosomu
2 wykonano dla lokalizacji punktu pęknięcia na tym chromosomie.
98
Genetyka człowieka
P103.
Clonal bcr/tcr rearrangements as markers for quantitative mrd evaluation in
childhood ALL.
Monika Jurkowska, Iwona Malinowska, Michał Matysiak, Jerzy Bal
Department of Medical Genetics, Institute of Mother and Child and Department of. Paediatric, Haematology and Oncology,
Medical University, Warsaw, Poland.
Minimal residual disease level in acute lymphoblastic leukaemia treatment is becoming an important prognostic factor
that may also influence the therapeutic strategies in this entity.
We investigated the applicability of BCR/TCR rearrangements as quantitative markers for minimal residual disease in
childhood ALL. IGH and TCR clonal markers were identified in 73.6% of ALL patients. Illegitimate rearrangements
were identified in 27% of cases. 50% of samples represented IGH clonality (16% of oligoclonal), 31% and 35% of samples
represented TCRγ; and TCRδ; clonal receptors, respectively, with 10% of oligoclonality range.
Eventually the applicability of sixteen TCRG (VgJ1) and fourteen TCRD (Vd2Dd3) gene rearrangements as targets
for MRD detection by real-time quantitative PCR analysis was investigated. Allele-specific primers were designed and
applied in combination with germline primers and TaqMan probes.
Reproducible detection of tumor DNA diluted 104 or 105 in “normal” DNA (that reflexes bone marrow status in
responding patient) was obtained in 8/12 TCRD but only in 4/9 TCRG targets. Primer efficacy was determined by
the characteristics of the junction. In Vd2Dd3 target, overall changes within the junction and correspondent primer
sequence (N-nucleotides and deletion of terminal nucleotides) have determined its utility. In VgJ1 rearrangement,
diversity of junction expressed in N-nucleotide gains but not in deletions was crucial. Thus efficiency of a specific
oligonucleotide depends on the characteristic of the junction within particular marker’s group. The sensitivity of MRD
range 10-3/10-5 is possible to obtain with RQ-PCR and TaqMan probes.
The project was partially supported by KBN grant 3PO5E 082 24.
P104.
Utrata heterozygotyczności w chłoniakach indukowanych promieniami gamma
u myszy z krzyżówek (BALB/cW x C57BL/10W)F1 i (C57BL/10W x BALB/cW)F1.
Mirosława Sitarz, Elżbieta Wirth-Dzięciołowska
Zakład Genetyki i Hodowli Zwierząt Laboratoryjnych, Centrum Onkologii-Instytut, Warszawa
Podjęto próbę poszukiwania genów supresorowych nowotworów, których udziału nie stwierdzono dotychczas
w chłoniakach popromiennych u myszy. W tym celu rozpoczęto testowanie utraty heterozygotyczności (LOH) w DNA
chłoniaków indukowanych promieniami gamma w grasicy myszy z krzyżówek przeciwstawnych (BALB/cW x C57BL/
10W)F1 i (C57BL/10W x BALB/cW)F1. Analizę utraty alleli przeprowadzono w DNA 44 chłoniaków indukowanych
w grasicy myszy z krzyżówki (BALB/cW x C57BL/10W)F1 i w DNA 45 chłoniaków indukowanych w grasicy myszy
z krzyżówki (C57BL/10W x BALB/cW)F1. Badania utraty heterozygotyczności przeprowadzano przy użyciu markerów
mikrosatelitarnych. Dotychczas użyto 50 informatywnych mikrosatelitów zlokalizowanych w różnych miejscach
mysiego genomu. Utratę alleli wykryto w 17 loci. Wysoką częstość utraty heterozygotyczności (>20%) w DNA badanych
chłoniaków stwierdzono dla mikrosatelitów z chromosomów: 4, 11, 12, 15, 19. Z piśmiennictwa są znane LOH u myszy
w chłoniakach popromiennych na chromosomach: 4, 11, 12, 19. Utrata alelli w loci na chromosomie 15 nie była
dotychczas analizowana i stanowi przedmiot aktualnych badań.
P105.
Analiza utraty heterozygotycznosci w regionie 13q w płaskonabłonkowych rakach
krtani.
Agnieszka Stembalska (2), Nikolaus Blin (1), Sąsiadek Maria (2)
(1) Instytut Antropologii i Genetyki Człowieka, Tubingen, Niemcy
(2) Zakład Genetyki, Akademia Medyczna we Wrocławiu, ul.Marcinkowskiego 1, 50-368 Wrocławiu
Wyniki wielu badań potwierdzają tezę o udziale genów supresorowych zlokalizowanych na długim ramieniu
chromosomu 13 w progresji nowotworów głowy i szyi (HNSCC; head-and-neck squamous cell carcinoma). Fakt, że
zarówno gen RB1 jak i BRCA 2 nie są inaktywowane w większości przypadków HNSCC sugeruje obecność innych
genów supresorowych w regionie 13q.
W niniejszej pracy autorzy prezentują wyniki badań własnych nad zmianami genetycznymi w rakach krtani. W pierwszym
etapie pracy, na podstawie wyników badań CGH w grupie 52 pierwotnych płaskonabłonkowych raków krtani
99
Genetyka człowieka
oznaczono regiony najczęściej ulegające delecji (>40% badanych przypadków). Jako krytyczne wytypowano następujące
obszary: 13q21-32 oraz 13q34. Następnie, w celu określenia minimalnego regionu krytycznego delecji przeprowadzono
analizę utraty heterozygotyczności (LOH – loss of heterozygosity). Wykorzystano 15 markerów mikrosatelitarnych
zlokalizowanych w regionie krytycznym oraz jeden marker dla locus RB (13q14). Badania przeprowadzono na 16
guzach, w których stwierdzono delecję w CGH i 16 w których delecji nie stwierdzono.
Znacząco wysoką częstość LOH obserwowano dla markerów zlokalizowanych w: 13q21.1, 13q21.2-q22, 13q31– 32,
13q32.3 oraz 13q34 (test wskaźnika struktury, p<0,001).
Stwierdzono istotną statystycznie korelację w występowaniu LOH w markerach zlokalizowanych w regionach 13q21.1
i 13q34, 13q21.1 i 13q31.1 oraz 13q31.1 i 13q31-32 (dokładny test Fishera, p<0,01).
P106.
Expression of genes involved in DNA repair in lung tissues of non-small lung cancer
patients.
Maja Zielińska, Elżbieta Speina, Barbara Tudek
Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, Warsaw, Poland
Lung cancer is one of the most common cancers worldwide. Formation of reactive oxygen species, which accompanies
inflammatory processes, was demonstrated to be involved in the induction of lung cancer. We investigated the expression
of several DNA repair genes involved in the repair of oxidative DNA damage. Examinated genes encoded for DNA
glycosylases: OGG1, ANPG, and TDG, which eliminate from DNA 8-oxoguanine (8-oxoG), 1,N6-ethenoadenine (eA),
and 3,N4-ethenocytosine (eC), respectively. We also assayed genes encoding for AP endonuclease (APE) and enzymes
of nucleotide excision repair pathway (XPA, XPG, XPD, and XPF). Gene’s expression level was measured using RNase
protection assay in normal lung or lung tumor tissue. Our results show that the expression levels of OGG1, ANPG,
and TDG glycosylases are much lower than those observed for APE, in both normal lung and lung tumor. Moreover,
high individual differences in expression of DNA glycosylases were observed. In contrast, the expression levels of all
four types of XP genes were similar for each patient, in both lung tissues. We also investigated repair activities for 8oxoG, eA, and eC using oligodeoxynucleotides with a single modified base. Interestingly, in numerous tissue samples
repair activities did not reflect expression profiles of DNA glycosylases. Repair activities in some, but not in all tissues
were correlated with the expression of AP-endonuclease. Other factors determining repair activities for oxidative DNA
damage are being investigated.
P107.
Geny MLH1 oraz CDKN2A jako potencjalne molekularne markery wczesnego
i późnego procesu karcynogenezy w nowotworach krtani
Robert Smigiel (1), Agnieszka Stembalska (2), David Ramsey (3), Tuncay Kayademir (4), Maria Nikolaus Blin (4),
Małgorzata Sasiadek (2)
(1) Katedra Patofizjologii
(2) Zakład Genetyki, Akademia Medyczna, Wrocław
(3) Instytut Matematyki Politechniki Wrocławskiej, Wrocław
(4) Division of Molecular Genetics, Eberhard Karls University, Tübingen, Germany
Mimo intensywnych badań nad genetyczną etiologią raków krtani, nie jest znany model zmian genetycznych leżących
u podstaw powstania i rozwoju raka krtani. Celem prezentowanej pracy było wyjaśnienie znaczenia wybranych genów
w etiologii genetycznej raków krtani (HPC, APC, MET, nieznany gen supresorowy w 8p22 (TSG), TFF1, TFF2,
NM23, CDKN2A, RB1, MSH2, MLH1). Badaną grupę stanowiło 62 pacjentów leczonych operacyjnie z powodu
nowotworu krtani. Analizę oparto na ocenie utraty heterozygotyczności (LOH) badanych genów i ocenie wzoru
metylacji promotorów genów MLH1, CDKN2A. Wyniki te porównano z poziomem ekspresji białek kodowanych
przez geny, u których stwierdzono najwyższą częstość występowania LOH [CDKN2A (55.4%), MLH1 (46.0%), RB1
(35.7%)]. Stwierdzono pozytywną korelację pomiędzy częstością występowania LOH oraz nieprawidłowej metylacji
w genie CDKN2A oraz MLH1, a utratą ekspresji. Analiza statystyczna wykazała, ze LOH w badanych genach ma
tendencje do występowania w parach lub tripletach. Pary MLH1 / CDKN2A oraz triplety MLH1 / TSG w 8p22 /
CDKN2A, a także MLH1 / CDKN2A / RB1, wykazują korelację z stopniem zaawansowania klinicznego (staging)
oraz histopatologicznego nowotworu (G, grading). Stwierdzono, że LOH w MLH1 koreluję z najniższym stopniem
zaawansowania histopatologicznego G1, natomiast LOH w CDKN2A z najwyższym stopniem G3.
100
Genetyka człowieka
P108.
Zmiany chromosomu 22 pary w złożonych kariotypach u pacjentów z Zespołem
Mielodysplastycznym
Małgorzata Jakóbczyk, Zoriana Salamanczuk, Aleksander B. Skotnicki
Klinika i Katedra Hematologii CM UJ w Krakowie
Zespoły Mielodysplastyczne (MDS) de novo stanowią heterogenną grupę chorób, powstających w wyniku klonalnych
nieprawidłowości wielopotencjalnej komórki macierzystej. Klonalne zmiany kariotypu ujawniane w tej chorobie
posiadają znaczenie prognostyczne uwzględniane w International Prognostic Scoring System (IPSS). Złożone zmiany
uznawane za jeden z niekorzystnych czynników rokowniczych, obecne są w komórkach szpiku kostnego u 15-30%
pacjentów w chwili diagnozy. W tej grupie pacjentów bardzo rzadko dochodzi do ujawnienia powtarzających się
aberracji chromosomalnych, a mechanizm molekularny, który stanowi podłoże procesu nowotworowego pozostaje
niejasny. Analiza złożonych zmian kariotypu z użyciem techniki prążków GTG, jest niewystarczającą z uwagi na
obecność fragmentów chromosomów o nieustalonym pochodzeniu. To ograniczenie pokonuje Spektralna analiza
kariotypu (SKY), umożliwiając dokładną identyfikację markerów i fragmentów chromosomów w niezrównoważonych
translokacjach.
Z grupy pacjentów Kliniki Hematologii CM UJ z de novo rozpoznanym MDS wybrano 8 pacjentów, u których analiza
kariotypu komórek szpiku kostnego wykazała obecność złożonych aberracji. Badanie cytogenetyczne wykonano
w chwili diagnozy, na 24 i 48 godzinnych hodowlach komórek szpiku kostnego zgodnie z obowiązującym protokołem.
Chromosomy analizowano z użyciem techniki prążków GTG, zmiany klasyfikowano zgodnie z ICSN 95. W prawie
wszystkich przypadkach stwierdzono aberracje chromosomu 22 pary. U trzech pacjentów z powodu obecności
markerów w następujących kariotypach: 48, XY, der(1)(q23-q33?), der (2)(?), der(3)(?), der(4)(q31?), i(6)(p10), +18
[pacjent nr1], 42-47, XY, –3, del(5)(q31), +11, –17, –18, +21, +mar1, +mar2 [pacjent 2]; 47, XX, +1, –4, –5, +8, –16, –17,
–18, t(22;?)(p10;?), +mar1, +mar2, +mar3, +mar4 [pacjent 3], przeprowadzono analizę spektralną. W tej grupie wykryto
obecność następujących translokacji z udziałem chromosomu 22 pary: t(2;22), t(3;22), t(10;22), t(21;22). Nasze wyniki
podobne są do wcześniej publikowanych i potwierdzają, że zmiany 22q mogą być często zaangażowane w złożonych
kariotypach u pacjentów z MDS. Przebieg choroby u naszych pacjentów był gwałtowny, bez odpowiedzi na stosowaną
terapię, z krótkim czasem całkowitego przeżycia, niezależnie od podtypu WHO. Może to wskazywać na znaczącą rolę
zmian chromosomu 22 pary w procesie MDS.
P109.
Polimorfizmy w genach kodujących kluczowe enzymy biosyntezy testosteronu
a obraz kliniczny raka prostaty
Monika Gos (1), Małgorzata Sadowska (2), Tomasz Demkow (2), Przemysław Janik (1)
(1) Zakład Biologii Komórki
(2) Klinika Nowotworów Układu Moczowego Centrum Onkologii-Instytut, ul. Roentgena 502-781 Warszawa
Rak prostaty jest jednym z najczęściej diagnozowanych nowotworów złośliwych u mężczyzn. Około 90% zachorowań
na ten typ nowotworu to przypadki sporadyczne, w których rozwój choroby zależy od kombinacji czynników
środowiskowych (wiek, dieta) oraz genetycznych. Niewątpliwą podstawą dla rozwoju raka stercza jest zaburzony
metabolizm androgenów, co może wynikać z mutacji o charakterze polimorficznym w kluczowych genach biosyntezy
testosteronu. Od zmian tych może również zależeć odpowiedź na leczenie, rozwój hormonooporności oraz ogólny obraz
kliniczny nowotworu.
Kluczowymi enzymami biorącymi udział w metabolizmie androgenów są: cytochrom P450c17α oraz 5α-reduktaza.
Pierwszy z nich bierze udział w przekształceniu progesteronu w androstendion, zaś drugi redukuje testosteron do
jego aktywniejszej formy dihydrotestosteronu. Białka te kodowane są przez geny CYP17 i SRD5A2, zaś polimorfizmy
zidentyfikowane w tych genach mogą wpływać na poziom hormonów sterydowych.�
Celem przeprowadzonych badań jest stwierdzenie, czy zmiany polimorficzne w tych genach mogą stanowić ewentualną
predyspozycję do wystąpienia nowotworu gruczołu krokowego. Ponadto częstość występowania polimorfizmów
skorelowano z obrazem klinicznym nowotworu.
Wśród pacjentów chorych na raka stercza (107) oraz mężczyzn, u których nie zdiagnozowano tego nowotworu (154),
została przeprowadzona analiza następujących polimorfizmów: T/C w promotorze genu CYP17 oraz V89L i A49T
w SRD5A2.
Nie stwierdzono znaczących różnic w częstościach występowania poszczególnych genotypów i alleli w grupie osób
chorych i kontrolnych. Jednakże wydaje się, że u mężczyzn posiadających genotyp CC (CYP17) lub kombinację 49AT
101
Genetyka człowieka
i 89VV (SRD5A2) częściej rozwija się choroba uogólniona lub w stadium zaawansowania T3/T4. Wariant 89VV może
również korelować z wiekiem zachorowania na nowotwór gruczołu krokowego oraz rozwojem hormonooporności.
P110.
Ocena ekspresji cykliny D1 u pacjentów z chłoniakiem z komórek płaszcza (MCL)
oraz z innymi chłoniakami nieziarniczymi.
Paweł Swoboda (1), M. Gos (1), G. Rymkiewicz (2), J. Walewski (3), P. Janik (1)
(1) Zakład Biologii Komórki
(2) Zakład Patologii
(3) Klinika Nowotworów Układu Chłonnego Centrum Onkologii – Instytut
Chłoniak z komórek płaszcza (mantle cell lymphoma, MCL), dawniej określany jako centrocytarny, wywodzi się
z obwodowych komórek B i stanowi około 6-9% wszystkich przypadków chłoniaków nieziarniczych (non-Hodgkin
lymphoma, NHL) na świecie. Charakterystycznym i powtarzalnym markerem MCL jest translokacja t(11;14)(q13;q32).
Jej następstwem jest przeniesienie genu CCND1 (BCL-1, PRAD1) kodującego cyklinę D1 z chromosomu 11 pod
znajdujące się na chromosomie 14 sekwencje regulatorowe genu IGH kodującego łańcuch ciężki immunoglobulin.
Wynikiem translokacji jest nadekspresja mRNA dla cykliny D1 oraz wzrost poziomu białka. Dodatkowo podwyższony
poziom mRNA wykryto w innych typach chłoniaków linii B.
Obecnie szacuje się, że nawet 40% MCL może być źle lub niedokładnie zdiagnozowanych. Metody oparte na technice
RT-PCR, pozwalające na ilościowe oznaczenie poziomu mRNA dla cykliny D1, mogą mieć znaczenie diagnostycznoterapeutyczne.
Celem pracy było oznaczenie poziomu ekspresji mRNA dla cykliny D1 u chorych z chłoniakiem z komórek płaszcza oraz
porównanie go do poziomu ekspresji występującego w przypadku innych chłoniaków nieziarniczych. Materiał w postaci
krwi, szpiku lub komórek pochodzących z punkcji cienkoigłowej węzłów chłonnych pobrano od 100 pacjentów ze
zdiagnozowanym chłoniakiem z komórek płaszcza oraz innymi chłoniakami nieziarniczymi. Wyizolowane RNA
poddano reakcji odwrotnej transkrypcji. Następnie cDNA zostało poddane reakcji PCR z zastosowaniem specyficznych
starterów. Poziom ekspresji cykliny D1 w testowanych próbkach został oznaczony w stosunku do poziomu ekspresji
markerowego genu β-aktyny.
P111. The NOD2 3020insC mutation and the risk of colorectal cancer.
Grzegorz Kurzawski (1), Janina Suchy( 1)*, Józef Kładny (2), Ewa Grabowska (3)*, Marek Mierzejewski( 1),
Anna Jakubowska (1), Tadeusz Dębniak (1), Cezary Cybulski (1), Elżbieta Kowalska( 1), Zbigniew Szych( 4),
Wenancjusz Domagała (5), Rodney J. Scott (6), Jan Lubiński (1)
(1) Hereditary Cancer Center – Dept. of Genetics and Pathology, Pomeranian Medical University Szczecin 70-115, Poland,
ul. Polabska 4
email: [email protected]
(2) Department of General and Vascular Surgery
(3) Inter – University Unit of Molecular Biology, University of Szczecin and Pomeranian Academy of Medicine
(4) Department of Hygiene and Epidemiology
(5) Department of Pathology Pomeranian Medical University
(6) Discipline of Medical Genetics, Faculty of Health, University of Newcastle, NSW Australia.
email: [email protected]
* Janina Suchy and Ewa Grabowska are the recipients of a scholarship from the Postgraduate School of Molecular Medicine
affiliated with the Medical University of Warsaw. The authors were partially supported by the grant The Leopold
Kronenberg Foundation.
Several predispositions to colorectal cancer have been identified but little is known about genetic susceptibilities to
disease in older persons.
Colorectal cancer is a risk in Crohn’s Disease and is believed to be associated with an inappropriate inflammatory
response. Recently, the NOD2 gene has been associated with Crohn’s Disease, which further strengthens the notion
that the inflammatory response plays a crucial role in this disease. Several mutations have been identified in the NOD2
gene, which appear with significantly higher frequency in patients with the disease. One such mutation (3020insC) is
102
Genetyka człowieka
believed to be clearly causative as it results in a prematurely truncated protein with a predicted reduction in functional
efficiency.
In this report we have examined the frequency of the 3020insC mutation in a series of 856 individuals including 556
patients with colorectal cancer. The frequency of the 3020insC mutation in a consecutive series of 250 non-HNPCC
colorectal cancer patients over the age of 50 years was significantly elevated compared to the control population
– OR=2.23, p=0.0046. The results indicate that NOD2 may be a predisposing factor to colorectal cancer characterized
by an older average age of disease onset in persons who do not harbor any other genetic predisposition to disease.
Key words: NOD2, colorectal cancer, 3020insC, predisposing factor
P112. Nuclear pedigree criteria of suspected HNPCC.
Józef Kładny (1), G. Möslein (2), T. Myrhřj (3), G. Kurzawski (4), A. Jakubowska (4), T. Debniak (4),
W. Petriczko (1), M. Kozlowski (1), T. Al-Amawi (5), M. Brzosko (6), J. Flicinski (6), A. Jawien (7), A. Banaszkiewicz
(7), P. Rychter (8), J. Lubinski (4).
(1) International Hereditary Cancer Center, Department of Surgical Oncology, Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin,
Poland
(2) Department of Surgery, University of Duesseldorf, Duesseldorf, Germany
(3) The Danish HNPCC Register, Department of Surgical Gastroenterology, Hvidovre Hospital, University of Copenhagen,
Denmark
(4) Department of Genetics and Pathology, Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin, Poland
(5) Department of Hygiene and Epidemiology, Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin, Poland
(6) Department of Rheumatology, Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin, Poland
(7) Department of General Surgery, Medical University, Bydgoszcz, Poland
(8) Department of Surgical Gastroenterology, Medical College, Jagiellonian University, Cracow, Poland
Criteria of ICG-HNPCC are very restrictive and they do not allow to diagnose a large number of so-called “suspected
HNPCC” cases – this is families without fulfillment of all Amsterdam criteria, but presenting several pedigree and
clinical features characteristic for HNPCC. In different series of families “suspected of HNPCC” germline mutations
were found in 8-60%. Therefore ICG-HNPCC has been working on pedigree/clinical criteria diagnostic for suspected
HNPCC.
Material and methods. Part I . The study was based on two series of colorectal cancer (CRC) cases: 1) HNPCC – this
group comprised 190 patients affected by CRC from randomly selected families which fulfiled the Amsterdam
II criteria registered in Dusseldorf (102 cases of CRC), Denmark (18 CRCs), Leiden (23 CRCs) and Szczecin (47
CRCs). 2) Consecutive CRCs – this group comprised 629 (78,0%) of 806 individuals with newly diagnosed CRC in
a period 1991-1997 in the city of Szczecin (ca. 400,000 of inhabitants), Poland. Nuclear pedigrees in both groups were
compared for frequency of occurrence of clinical features that have been shown to be associated with HNPCC. Part II.
52 consecutive CRC cases from Szczecin, matching criteria recognized in part I as appropriate for diagnosis of cases
“suspected of HNPCC” were studied for the occurrence of germline hMSH2/hMLH1 constitutional mutations using
“exon by exon” sequencing. Results Combination of features – occurrence of HNPCC associated cancer (CRC or cancer
of the endometrium, small bowel or urinary tract) in 1st degree relative of CRC patient; at least one of this cancers is
diagnosed under age of 50 – appeared to be strongly associated to HNPCC with an OR – 431. Constitutional mutations
were identified in 18 (10 MLH1 and 8 MSH2 mutations) of 52 (34%) cases matching above features. Conclusions: The
results of our studies strongly suggest that it is possible to diagnose HNPCC with a high degree of accuracy just on the
basis of nuclear pedigree data and clinical features.
P113.
Mutation analysis and clinical course in NF2 Polish patients.
Mikołaj Łaniewski-Wołłk (1), A. Koziarski (2), A. Wojtkiewicz (3), A. Szpecht-Potocka (1)
(1) Institute of Mother and Child, Warsaw
(2) Clinic of Neurosurgery CSKWAM, Warsaw
(3) Paediatric, Hematology and Oncology Clinic of Medical Academy, Bydgoszcz
Neurofibromatosis type 2 (NF2) is an autosomal dominant disease of the nervous system characterized by a tumor
predisposition in which affected individuals develop multiple schwannomas, meningiomas and ependynomas. NF2
gene has been hypothesized to function as a tumor suppressor gene. We were looking for mutations in NF2 gene in
23 patients (17 families) with clinical features of NF2, sending from different medical centers in Poland. Using SSCP
103
Genetyka człowieka
as a screening method for detection of mutations in blood and tumor samples and sequencing DNA we have found
5 germline nonsense mutations in our tested group. Three of these mutations are known: c.52 C.T in exon 1; c.169 C.T in
exon 2; c.592 C.T in exon 6. Two mutations in exon 11 are new: c.1002_1003insG and c.1029_1030insCC. After detailed
clinical analysis we conclude that all of these defects correlate with severe clinical course (they generate truncating
protein-product). What is very interesting that we did not find any somatic mutations in tested tumor samples
suggesting that there are may be any other mechanisms, except of Knudson’s two hit hypotesis, which are involved
in expression of NF2 gene. Clinical observations of our patients are consistent with D.Evans’s group results (2002)
concerning mortality of NF2 patiens and recommendation that they could be reffered to specialty treatment centers.
P114.
Mutations in the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene in central nervous
system hemangioblastomas.
Cezary Cybulski (1), Joanna Matyjasik (1), Marianna Soroka (2), Janusz Szymaś (3), Bohdan Górski (1),
Tadeusz Dębniak (1), Anna Jakubowska (1), Andrzej Bernaczyk (4), Lech Zimnoch (5),
Grażyna Bierzyńska-Macyszyn (6), Tomasz Trojanowski (7), Teresa Wierzba-Bobrowicz (8), Edmund Prudlak (9),
Alicja Markowska-Wojciechowska (10), Przemysław Nowacki (11), Andrzej Roszkiewicz (12),
Radzisław Kordek (13), Tadeusz Szylberg (14), Ewa Matyja (15), Krzysztof Zieliński (16), J. Stańczyk (17),
Bogdan Woźniewicz (18), Anna Taraszewska (19), Wojciech Kozłowski (20), Rodney J. Scott (21), Jan Lubiński (1)
(1) International Hereditary Cancer Center Department of Genetics and Pathology, Pomeranian Medical ul. Połabska 4,
70-115 Szczecin. Tel: 00 48 91 466 1532
(2) Department of Biology, University in Szczecin.
(3) Department of Clinical Pathology, Medical Academy, Poznań
(4) Department of Pathology, Regional Clinical Hospital, Częstochowa
(5) Department of Pathology, Medical University, Białystok
(6) Department of Pathology, Medical Academy, Katowice
(7) Department of Neurosurgery, University Medical School, Lublin
(8) Department of Neuropathology, Institute of Psychiatry and Neurology, Warsaw
(9) Department of Pathology, Medical Academy, Wroclaw.
(10) Department Otolaryngology, Medical Academy, Wrocław.
(11) Department of Neurology, Pomeranian Medical University, Szczecin
(12) Department Pathology, Medical University of Gdansk
(13) Department of Pathology, Copernicus Memorial Hospital, Lodz
(14) Department of Pathomorphology, Military Clinical Hospital, Bydgoszcz.
(15) Department of Neuropathology, Medical Research Centre, Polish Academy of Sciences, Warsaw
(16) Department of Pathology, Military Clinical Hospital, Łódź
(17) Department of Pathology, Regional Hospital, Gorzów
(18) Department of Pathomorphology, Child Health Center, Warsaw
(19) Department of Neuropathology, Medical Research Centre, Polish Academy of Sciences, Warsaw.
(20) Department of Pathology, Military Clinical Hospital, WAM, Warsaw
(21) Discipline of Medical Genetics, Faculty of Health, University of Newcastle, Newcastle, Australia
Central nervous system hemangioblastomas (cHAB) are rare tumors, which most commonly arise in the cerebellum.
Most tumors are sporadic, but as many as one third of cHABs occur in the course of the hereditary disorder – von
Hippel-Linadu disease (VHL). In order to diagnose new VHL families in Poland we performed sequencing of the entire
VHL gene in archival material (paraffin embedded hemangioblastoma tissues) in a large series of 203 unselected patients
with cHAB. VHL gene mutations were detected in 70(41%) of 171 tumor samples from which DNA of relatively good
quality was isolated. We were able to obtain blood samples from 19 of the mutation positive cases. Eight (42%) of these
harbored germline mutations in persons from distinct undiagnosed VHL families.
104
Genetyka człowieka
P115.
Comparison of genomic abnormalities between BRCAX and sporadic breast cancers
studied by comparative genomic hybridization.
Jacek Gronwald (1), Anna Jauch (2), Cezary Cybulski (1), Brigitte Schoell (2), Marcin Lenner (3),
Ewa Grabowska (3), Bohdan Górski (1), Barbara Boehm-Steuer (2), Anna Jakubowska (1), Rodney Scott (4),
Jan Lubiński (1)
(1) Department of Genetics and Pathology, International Hereditary Cancer Center, Pomeranian Medical University,
Szczecin 70-115, Połabska 4, Poland
(2) Institute of Human Genetics, University of Heidelberg, Germany
(3) Inter-University Unit of Molecular Biology, University of Szczecin and Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin, Poland
(4) Discipline of Medical Genetics, Faculty of Health, University of Newcastle, Newcastle, Australia
Chromosomal regions harbouring genes involved in initiation and progression of BRCAX-assiociated breast cancers
are poorly known. In this study we applied comparative genomic hybridization (CGH) to identify the most frequent
genomic abnormalities in 18 BRCAX hereditary breast cancers and compared them to abnormalities detected in a group
of 27 sporadic breast cancers. The most frequently observed aberrations in BRCAX tumors were gains of 8q (83%), 19q
(67%), 19p (61%), 20q (61%), 1q (56%), 17q (56%) and losses of 8p (56%), 11q (44%) and 13q (33%). The sporadic
cases most frequently showed gains of 1q (67%), 8q (48%), 17q (37%), 16p (33%), 19q (33%) and losses of 11q (26%),
8p (22%) and 16q (19%). Losses of 8p and gains 8q, 19 as well as gains of 20q (with respect to ductal tumors only)
were significantly more often detected in BRCAX than in sporadic breast cancers. Analysis of 8p-losses and 8q-gains
indicated that they are early events in tumorigenesis of BRCAX tumors. The findings of this report indicate that there are
significant similarities between BRCAX tumors and BRCA2 tumours suggesting a common pathway of disease.
P116.
Germline mutation and large deletion analysis of the CDKN2A/ARF genes
in families with multiple melanomas and in families with an aggregation
of malignant melanoma.
Tadeusz Dębniak (1), B. Górski (1), R. J. Scott (2), C. Cybulski (1), K. Mędrek (1), E. Złowocka (1), G. Kurzawski (1),
B. Dębniak (3), J. Kładny (4), S. Bielecka-Grzela (5), R. Maleszka (5), J. Lubiński (1)
(1) Department of Genetics and Pathology, International Hereditary Cancer Center, Pomeranian Medical University,
Szczecin, Poland
(2) Discipline of Medical Genetics, Faculty of Health, University of Newcastle, Newcastle, Australia
(3) Regional Hospital, Gorzow Wlkp, Poland
(4) III Department of Surgery, Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland
(5) Department of Dermatology and Venerology, Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland
The CDKN2A/ARF genes have been associated with an increased risk of malignant melanoma in families where there are
multiple members affected by disease and in families characterized by the constellation of breast cancer and malignant
melanoma. The exact contribution of CDKN2A/ARF to disease risk remains poorly characterized especially in diverse
populations. In this report the contribution of CDKN2A/ARF germline mutations and large rearrangements to disease
in Polish familial melanoma (FMM) and aggregations of breast cancer and malignant melanoma (MM) were assessed
using a strategy that included genomic sequencing, RFLP analysis and multiplex ligation-dependent probe amplification
(MLPA) analysis. We examined 16 FMM cases (group 1), 44 MM probands with a cancer family aggregation (CFA) that
included at least one breast cancer in the family (group 2), and 22 breast cancer probands with a CFA and MM in the
family (group 3). The results revealed a paucity of mutations in CDKN2A/ARF suggesting that in the Polish population
this gene does not contribute significantly to either FMM or MM within the context of a cancer family aggregation of
disease.
105
Genetyka człowieka
P117.
Rarity of germline 1100delC mutation in the CHK2 gene in patients with malignant
melanoma of the skin.
Tadeusz Dębniak (1), Bohdan Górski (1), Cezary Cybulski (1), Grzegorz Kurzawski (1), Elżbieta Złowocka (1),
Józef Kładny (2), Maria Chosia (3), Jan Lubiński (1)
(1) Department of Genetics and Pathology, Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin 70-111, Al.Powst.Wlkp.72, Poland
(2) III Department of Surgery, Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin 70-111, Al.Powst.Wlkp.72, Poland
(3) Department of Pathology, Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin 70-111, ul. Unii Lubelskiej 1, Poland
Objectives. In this paper the proportion of consecutive and familial malignant melanoma (MM) cases harbouring the
1100delC of exon 10 of the CHK2 gene was determined to assess whether it is associated with the occurrence of MM. The
study consisted of three groups of patients: a series of consecutive 101 patients with histologically confirmed malignant
melanoma of the skin, diagnosed in the city of Szczecin; a series of 16 MM patients with a family history of MM in their
first degree relatives; and a series of consecutive 1024 individuals selected at random by family doctors from the city of
Szczecin. Molecular examination included allele specific polymerase chain reaction assay for CHK2 founder mutation
(1100delC), genomic sequencing, LOH analysis using CA-repeat microsatellite markers, and haplotype analysis. Results.
CHK2 founder mutation was detected in 1 out of 101 (1%) MM cases, no familial MMs and in 2 out of 1024 individuals
(0.2%) from general population. The difference between groups of patients was statistically not significant.
The MM patient with CHk2 founder mutation was 56 years old female with a history of brain tumors at age 33 and
40, sarcoma at age 41 and finally MM at age 55. Examination of tumorous DNA isolated from MM and sarcoma from
patient with CHK2 mutation revealed no loss of heterozygosity in both tumors.
Conclusion. It seems that examination of neither consecutive nor familial MM cases in search for 1100delC germline
mutation in CHK2 gene is justified. To evaluate whether CHK2 founder mutation is associated with MM in patients with
LFS syndrome, more MM cases from LFS families should be examined.
P118.
NBS1 is a Prostate Cancer Susceptibility Gene.
Cezary Cybulski (1), B. Górski (1), T. Dębniak (1), B. Gliniewicz (2), M. Mierzejewski (1), B. Masojć (1), A.
Jakubowska (1), J. Matyjasik (1), E. Złowocka (1), A. Sikorski (2), S. A. Narod (3), J. Lubiński (1)
(1) International Hereditary Cancer Center, Department of Genetics and Pathology, Pomeranian Medical University,
ul. Połabska 4, 70-115 Szczecin
(2) Clinic of Urology, Pomeranian Academy of Medicine, Al. Powstancow Wlkp. 72, 70-112 Szczecin
(3) Centre for Research on Womens Health, 790 Bay Street, Toronto Ontario, M5G 1N8
To evaluate whether an inactivating mutation in the gene for the Nijmegen Breakage Syndrome (NBS1) plays a role in
the etiology of prostate cancer we compared the prevalence
of the 657del5 NBS1 founder allele in 56 patients with familial prostate cancer, in 305 nonfamilial prostate cancer
patients and in 1500 controls from Poland. Loss of heterozygosity analysis was also performed on DNA samples isolated
from 17 micro-dissected prostate cancers, including eight from carriers of the 657del5 mutation. The NBS1 founder
mutation was present in five of 56 (9%) patients with familial prostate cancer (OR = 16; p < 0.0001), in 7 of 305 (2.2%)
patients with non-familial prostate cancer (OR = 3.9; p= 0.01) and in 9 of 1500 controls (0.6%). The wild-type NBS1
allele was lost in seven of eight prostate tumors from carriers of the 657del5 allele, but loss of heterozygosity was seen in
only one of nine tumors from non-carriers (p = 0.003). These findings suggest that heterozygous carriers of the NBS1
founder mutation exhibit increased susceptibility to prostate cancer, and that the cancers that develop in the prostates of
carriers are functionally homozygous for the mutation.
P119.
Usefulness of polymorphic markers analysis in exclusion of BRCA1/BRCA2 mutations
carrier status in families with aggregation of breast/ovarian cancers.
Bohdan Górski, Tadeusz Dębniak, Anna Jakubowska, Cezary Cybulski, Tomasz Huzarski, Tomasz Byrski,
Elżbieta Złowocka, Jan Lubiński
Department of Genetics and Pathology, Pomeranian Medical University, Ul .Polabska 4, Szczecin 70-115, Poland
Founder mutations can account for large proportion of BRCA1/BRCA2 genes abnormalities in a given population.
However there is still a need to study the entire gene in many families, even in countries where founder mutations have
been identified. It is possible to decrease the number of cases which are studied by complex and expensive sequencing/
106
Genetyka człowieka
Southern blot analyses of BRCA1/BRCA2 genes by exclusion of common BRCA1/BRCA2 alleles in a given family by
using polymorphic dinucleotide markers. The goal of our study was to describe effectiveness of such methodology in
exclusion of BRCA1/BRCA2 constitutional mutations.
In each family blood samples for genetic analyses were taken from two affected relatives from the same generation. Six
polymorphic microsatellite markers linked to BRCA1/BRCA2 genes were analysed. Results obtained with these markers
were verified by applying BRCA1 testing for the most common founder mutations in Poland and using “exon by exon”
sequencing of coding fragments of the BRCA2 gene.
Polymorphic markers useful in BRCA1/BRCA2 analyses included only 3 of 6 examined – D17S855, D13S260 and
D13S267. Occurrences of common alleles of BRCA1 were excluded in 3 families and BRCA2 in 5 out of 30 families.
Results obtained by testing for BRCA1 Polish founder mutations and BRCA2 sequencing were in agreement with
BRCA1findings using polymorphic markers. The only exception was family No 994 with BRCA1 exon 5 300T/G
mutation in which BRCA1 mutation carrier was excluded by using D17S855.
Among 14 families without BRCA1 Polish founder mutations abnormalities in this gene were excluded in 2 families and
BRCA2 mutation was excluded in one family.
P120. A Novel Founder CHEK2 Mutation is Associated with Increased Prostate Cancer Risk.
Cezary Cybulski (1), T Huzarski (1), B. Górski (1), B. Masojć (1), M. Mierzejewski (1), T. Dębniak (1),
B. Gliniewicz (2), J. Matyjasik (1), E. Złowocka (1), G. Kurzawski (1), A. Sikorski (2), M. Posmyk (3), M. Szwiec (4),
R. Czajka (5), S.A. Narod (6), J. Lubiński (1)
(1) International Hereditary Cancer Center, Department of Genetics and Pathology, Pomeranian Medical University,
Szczecin, Poland
(2) Clinic of Urology, Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin, Poland
(3) Regional Oncology Hospital, Białystok, Poland
(4) Regional Oncology Hospital, Olsztyn, Poland
(5) Department of Obstetrics and Perinatology, Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland
(6) Centre for Research on Women’s Health, Toronto Ontario, Canada
Variants in the CHEK2 have been found to be associated with prostate cancer risk in the USA and Finland. We sequenced
CHEK2 gene in 140 Polish patients with prostate cancer, and then genotyped the three detected variants in a larger series
of prostate cancer cases and controls. CHEK2 truncating mutations (IVS2+1G>A or 1100delC) were identified in nine
of 1921 controls (0.5%), and in eleven of 690 (1.6%) unselected patients with prostate cancer (OR 3.4; p = 0.004). These
mutations were found in four of 98 familial prostate cases (OR 9.0; p = 0.0002). The missense variant I157T was also
more frequent in men with prostate cancer (7.8%) than in controls (4.8%), but the relative risk was more modest (OR
1.7; p = 0.03). I157T was identified in 16% of men with familial prostate cancer (OR 3.8;p=0.00002). Loss of the wild type
CHEK2 allele was not observed in any of prostate cancers from five men who carried CHEK2 truncating mutations. Our
results provide evidence that the two truncating mutations of CHEK2 confer a moderate risk of prostate cancer in Polish
men, and that the missense change appears to confer a modest risk.
P121.
A high frequency of BRCA2 gene mutations in Polish families with ovarian and
stomach cancer.
Anna Jakubowska, R. Scott, J. Menkiszak, J. Gronwald, T. Byrski, T. Huzarski, B. Gorski, C. Cybulski, T. Debniak,
E. Kowalska, T. Starzynska, M. Lawniczak, S. Narod, J.Lubinski
Department of Genetics and Pathology, Pomeranian Academy of Medicine, Szczecin, Poland. [email protected]
Germ-line mutations in the BRCA2 gene are associated with a wide range of cancer types, including the breast, ovary,
pancreas, prostate and melanoma. In this study, we evaluated the importance of a family history of stomach cancer in
predicting the presence of a BRCA2 mutation in Polish patients with ovarian cancer. A BRCA2 mutation was found in
eight of 34 women with ovarian cancer and a family history of stomach cancer versus three of 75 women with ovarian
cancer and a family history of ovarian cancer, but not of stomach cancer (odds ratio=7.4; 95% CI 1.8-30; P=0.004). The
results of this study suggest that, in the Polish population, the constellation of ovarian and stomach cancer predicts
the presence of a germ-line BRCA2 mutation and confirms that stomach cancer is part of the spectrum of BRCA2
mutations. It is expected that the penetrance of BRCA2 mutations for stomach cancer will vary from country to country,
reflecting local environmental and lifestyle factors.
107
Genetyka człowieka
P122. The NOD2 3020insC mutation is the risk of familial pancreatic cancer.
Katarzyna Nej (1), Detlef K. Bartsch (2), Mercedes Sina-Frey (3), Harald Rieder (3), Stephan A. Hahn (4),
Jan Lubiński (5)
(1) Inter-University Unit of Molecular Biology, University of Szczecin and Pomeranian Medica l University, Szczecin, Poland,
[email protected]
(2) Department of Surgery, Philipps-University, Marburg, Germany
(3) Institute of Clinical Genetics, Philipps-University, Marburg, Germany
(4) Department of Internal Medicine, Hospital Langendreer, Ruhr-University, Bochum, Germany
(5) International Hereditary Cancer Center, Department of Genetics and Pathology, Szczecin, Poland
Pancreatic cancer is an aggressive disease with a poor prognosis but despite much investigation little is known about
genetic susceptibilities to this cancer. There are several studies showing pancreatic abnormalities in patients with Crohn’s
disease.
Recently in patients with Crohn’s disease mutations in CARD15/NOD2 have been found. Since the risk of cancers at
various sites has been characterized among patients with Crohn’s disease, it was considered to be justified studying the
relationship between NOD2 gene mutations and different cancer risks. Here, we report the analyses of the 3020insC
mutation in the NOD2 gene in patients with pancreatic cancer.
Initially, we have examined the frequency of the 3020insC mutation in 3 groups:
1. consecutive pancreatic cancers;
2. familial cases;
3. healthy children of pancreatic cancer patients from families with at least two pancreatic cancer cases where DNA
samples from affected individuals were not available.
The control group consisted of 300 consecutive newborns from the clinical hospitals of Szczecin.
The frequency of the 3020insC mutation in the control group was 7%. In the group of consecutive cases six C-insertion
mutations were identified (4.7%; 6/127). In the four independent familial pancreatic cancer patients no mutation was
found, but four changes (14.8%; 4/27) were detected in the group of healthy children of pancreatic cancer patients
derived from families with aggregations of these tumors.
Since our results indicated there was an increased frequency of 3020insC mutation in familial pancreatic cancer cases
we decided to enlarge this group. 30 additional familial pancreatic cancer patients from the German National Case
Collection for Familial Pancreatic Cancer of the Deutsche Krebshilfe (FaPaCa) were included in this study. The frequency
of the mutant allele in this group did not confirm our initial result since only two changes were found (6.7%; 2/30).
However, even if Polish and German familial cases are combined it is still open question whether 3020insC is related to
a predisposition to familial pancreatic cancers. Further investigations on larger numbers of cases are needed.
In summary we can not conclude that NOD2 is not involved in familial pancreatic cancer but it appears not to be
associated with sporadic cases of disease.
P123.
Ocena czułości wykrywania mutacji punktowych w genie TP53 za pomocą
wielotemperaturowego SSCP (MSSCP).
Radosław Kaczanowski (2), Agnieszka Dansonka-Mieszkowska (1), Jolanta Kupryjańczyk (1),
Krzysztof Kucharczyk (2)
(1) Zakład Patologii Molekularnej, Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej Curie, ul. W. Roentgena 5,
02-781 Warszawa
(2) Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne, ul. Dzieci Warszawy 31/20, 02-495 Warszawa
Planując eksperyment z zakresu genomiki funkcjonalnej należy wybrać taką metodę przesiewowej analizy zmienności
genetycznej, aby cały eksperyment zakończył się w określonym czasie przy zazwyczaj określonym budżecie. Dlatego też,
do podstawowych parametrów branych pod uwagę przy wyborze przesiewowej metody analizy zmienności genetycznej
należą: koszt i czas jednostkowego badania oraz czułość analityczna danej metody. Jedną z powszechnie stosowanych
metod do tych celów jest metoda SSCP. W celu zwiększenia jej zdolności do wykrywania mutacji oraz zmniejszenia
kosztów i skrócenia czasu analizy opracowaliśmy metodę wielotemperaturowego SSCP (Multitemperature SSCP
– MSSCP). W celu porównania czułości analitycznej wykrywania mutacji punktowych oraz małych delecji za pomocą
MSSCP, analizowaliśmy tą metodą 104 produkty reakcji PCR zawierające zmiany genetyczne z eksonów 4-8 oraz eksonu
10 ludzkiego genu TP53. Metoda MSSCP wykazała wyższą wykrywalność dowolnych zmian genetycznych w porównaniu
z jednotemperaturową analizą SSCP. W przypadku analizowanych prób wykrywalność zmian genetycznych metodą
MSSCP wyniosła 89% w porównaniu z 73 % przy zastosowaniu SSCP wykonanego w 5°C, 68 % przy zastosowaniu SSCP
108
Genetyka człowieka
wykonanego w 15 °C, oraz 30 % przy zastosowaniu SSCP w 35°C. Interesującym wynikiem było uzyskanie znacząco
wyższej wykrywalności zmian genetycznych w produktach PCR przy zastosowaniu wielotemperaturowego SSCP
(MSSCP) niż w przypadku SSCP wykonanego w temperaturze będącej średnią arytmetyczną z temperatur użytych
w MSSCP – 89 vs. 70%. Wynik ten sugeruje, że fakt zmiany temperatur podczas analizy ruchliwości jednoniciowych
konformerów DNA (ssDNA) jest niezależnym czynnikiem zwiększającym prawdopodobieństwo wykrycia zmian
genetycznych w produktach reakcji PCR metodą SSCP. Metoda wielotemperaturowego SSCP, (MSSCP) jest szybką
i efektywna techniką przesiewową dla wykrywania zmian genetycznych.
P124.
Detekcja mutacji genu P53 przy użyciu metody MSSCP u chorych na raka pęcherza
moczowego
Edyta Borkowska (1), Aleksandra Binka-Kowalska (1), Maria Constantinou (1), Hubert Tomczyk (1),
Józef Matych (2), Agnieszka Nawrocka (3), Bogdan Kałużewski (1)
(1) Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
(2) Oddział Urologii i Transplantacji Nerek Szpitala im. Pirogowa w Łodzi
(3) Zakład Patomorfologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Rak pęcherza moczowego jest w Polsce szóstą co do częstości przyczyną zgonów na nowotwory złośliwe mężczyzn.
Wyższe ryzyko zachorowania mają osoby palące tytoń oraz zawodowo narażone na kontakt z niektórymi mutagenami
chemicznymi (np.: benzopiren, aminy aromatyczne). Wykrycie mutacji genu P53, w komórkach nowotworu pęcherza
moczowego może stanowić niezależny czynnik predykcyjny progresji i nawrotu choroby.
Celem badań było ustalenie warunków detekcji mutacji w eksonach 5-8 genu P53, przy użyciu metody MSSCP
(Multitemperature Single-Strand Conformation Polymorphism) w próbkach DNA uzyskanych z osadu moczu jak
również określenie rodzaju i częstości tych mutacji w różnych stopniach zaawansowania klinicznego raka pęcherza
moczowego. Analizie poddano 67 mężczyzn i 15 kobiet z rozpoznanym klinicznie guzem pęcherza moczowego. Grupę
odniesienia stanowiło DNA pochodzące od 202 zdrowych osób. Otrzymane wyniki porównano z rezultatami analizy
utraty heterozygotyczności genu P53 (LOH), nadekspresji białka P53 i antygenu Ki-67 (testy immunohistochemiczne).
Częstość mutacji w eksonach 5-8 genu P53 u chorych na raka pęcherza moczowego okazała się niższa niż przewidywana
na podstawie danych literaturowych, ale zgodna z obserwacjami, że mutacje te występują głównie w wyższych stadiach
zaawansowania klinicznego choroby i stadium carcinoma in situ. W przeprowadzonych badaniach w grupie chorych
wykazano wyższy odsetek osób posiadających polimorfizm w kodonie 213 genu P53 (5,88%), w stosunku do grupy
odniesienia (2,48%). Nie da się zatem wykluczyć, że obserwowany w/w polimorfizm może być jednym z czynników
predysponujących do rozwoju raka pęcherza moczowego.
P125.
The HtrA1 serine protease is down-regulated during estrogen-induced
carcinogenesis in male Syrian hamster kidney.
Dorota Żurawa-Janicka (1), Jarosław Kobiela (2), Tomasz Stefaniak (2), Adam Figarski (2), Barbara Lipińska (1),
Michał Woźniak (2)
(1) Katedra Biochemii, Uniwersytet Gdański, Kładki 24, 80-822 Gdańsk
(2) Katedra i Zakład Chemii Medycznej, Akademia Medyczna w Gdańsku, Dębinki 1, 80-211, Gdańsk
Estrogens are associated with the causation of variety of human cancers, including breast, endometrium, ovary, prostate,
and possibly, brain cancers. Chronic administration of estrogens induces a high frequency of mammary neoplasms in
rats and malignant kidney tumors in Syrian hamster.
Estrogen-induced and –dependent renal cancer of male Syrian hamster is generated by prolonged exposure to estradiol
which causes kidney tumors within 9-12 months.
humHtrA1 belongs to the HtrA family of serine proteases, the members of which are involved in a cellular stress
response, including heat shock and inflammation process.
The humHtrA1 gene is down-modulated in SV-40 transformed human fibroblasts. Down-regulation of the gene, in close
correlation with the malignant progression and metastasis, has been observed in ovarian cancers and melanomas. These
observations raise the possibility of HtrA1 as a candidate tumor suppressor gene.
The aim of this study was to find out whether prolonged estrogenization, accompanying nephrocarcinogenesis of male
Syrian hamster, causes any significant changes in expression of the htrA1 gene.
To achieve this goal we used a multiplex semi-quantitative RT-PCR method to estimate the mRNA levels in kidneys after
1, 3 and 6 months from the initial implantation of estradiol.
109
Genetyka człowieka
An 870 cDNA fragment of hamster htrA1 gene was successfully obtained using RT-PCR method with primers
complementary to rat htrA1 gene coding sequence, cloned into pUC18 wector and sequenced with universal primers.
Based on the hamster htrA1 sequence information, specific PCR primers were designed. The primers were then used
for amplification of the htrA1 cDNA 750 bp fragment in a multiplex semi-quantitative RT-PCR, with 654 bp cDNA of
beta-actin as a reference.
Although no significant changes in the expression of the gene were detected following 3 months of estrogenization, the
htrA1 mRNA level was significantly (p=0.05) decreased by 15% after 6 months of estradiol treatment. These observations
were supported by the results of Western blotting analysis, which showed reduced level of the HtrA1 protein in kidney
tissues after 6 months of estrogenization.
Our results suggest that reduced level of the htrA1 gene expression can be correlated with cancer development during
estrogen-induced carcinogenesis in male Syrian hamster.
P126.
Mutacje i polimorfizmy w genie NBS1 u dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną
Maria Mosor (1), Danuta Januszkiewicz-Lewandowska (1, 2), Iwona Ziółkowska (1), Jerzy Nowak (1)
(1) Instytut Genetyki Człowieka, Polska Akademia Nauk, Strzeszyńska 32, Poznań
(2) Klinika Onkologii, Hematologii i Transplantologii Pediatrycznej, Akademia Medyczna, Fredry 10, Poznań
Germinalne mutacje dwóch alleli genu NBS1 związane są z rozwojem zespołu Nijmegen, w którym zaobserwowano
zwiększoną predyspozycję do rozwoju nowotworów złośliwych. Występowanie heterozygotycznej mutacji 657del5
w genie NBS1 jest związane z ryzykiem rozwoju niektórych nowotworów zwłaszcza raka piersi i jajnika, czerniaka
złośliwego czy rdzeniaka. Brak jest natomiast jednoznacznych danych na temat występowania heterozygotycznych
mutacji w genie NBS1 w schorzeniach limfoproliferacyjnych.
Celem pracy było określenie częstości występowania mutacji i polimorfizmów w genie NBS1 u dzieci z ostrą białaczką
limfoblastyczną (ALL). Materiał badawczy stanowił DNA wyizolowany z komórek krwi obwodowej/szpiku w chwili
rozpoznania i/lub remisji choroby. Dodatkowo u części chorych celem różnicowania pomiędzy mutacją germinalną
a somatyczną badania przeprowadzono na DNA izolowanym z komórek śluzówki jamy ustnej. W grupie 113 dzieci
z ALL przeanalizowano wszystkie 16 eksonów genu NBS1. Jako metodę przesiewową wykorzystano analizę polimorfizmu
konformacji jednoniciowych fragmentów DNA. Reakcję sekwencjonowania zastosowano do bezpośredniej analizy
wykrytych mutacji i polimorfizmów. W grupie badanej wykryto 6 nosicieli mutacji w genie NBS1. W trzech przypadkach
zidentyfikowano mutację I171V w eksonie 5 genu NBS1. W trzech pozostałych mutacje: 657del5, R215W oraz V210F
w eksonie 6 genu NBS1. Analiza DNA z wymazu śluzówki jamy ustnej potwierdziła germinalne pochodzenie wszystkich
wykrytych mutacji. Ponadto w kilkunastu przypadkach zidentyfikowano nowe zmiany w sekwencjach intronowych:
IVS8-42 G/C (1/113), IVS15+88C/G (7/113)oraz IVS7-18G/A (12/113). Uzyskane wyniki sugerują, że germinalne
mutacje w genie NBS1 mogą być czynnikiem ryzyka predysponującym do rozwoju ostrej białaczki limfoblastycznej
u dzieci.
Praca finansowana z grantu PBZ-KBN-090/005/2003.
P127. Wpływ 5-fluorouracylu na ekspresję genu mdr1 oraz bcl-2 w komórkach raka jelita
grubego in vitro.
Jolanta Rzymowska, Piotr Maj
Zakład Medycyny Nuklearnej, Akademia Medyczna Lublin
Celem naszych badań było określenie korelacji pomiędzy ekspresją badanych genów a działaniem cytostatyku, to jest
5-fluorouracylu. Badanymi genami był gen oporności wielolekowej (mdr1) oraz gen antyapoptotyczny – bcl-2.�
Badania wykonano w układzie in vitro, to jest w hodowli komórek raka jelita grubego – COLO. Komórki hodowli in
vitro inkubowane w standardowych warunkach z terapeutyczną dawką 5-fluorouracylu. Po 72 godzinnej inkubacji
z cytostatykiem wykorzystywano metodę hybrydyzacji in situ z użyciem znakowanych fluoresceiną starterów dla genów
mdr1 oraz bcl-2. Określano także ilość komórek obumierających na drodze apoptozy pod wpływem 5-fluorouracylu.
Ilość komórek apoptotycznych analizowano w mikroskopie konfokalnym po wybarwieniu komórek anneksyną oraz
jodkiem propidionowym.
110
Genetyka człowieka
P128.
Analiza cytogenetyczna oraz badanie fuzji genowych w ostrej białaczce
limfoblastycznej (ALL) u dzieci.
Krystyna Soszyńska, Barbara Mucha, Katarzyna Skonieczka, Ewa Duszenko, Izabela Makowska, Robert Dębski,
Mariusz Wysocki, Olga Haus
Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej AM w Bydgoszczy
Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii AM w Bydgoszczy,
Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku AM we Wrocławiu
W komórkach szpiku dzieci chorych na ostrą białaczkę limfoblastyczną (ALL) zidentyfikowano wiele aberracji liczbowych
i strukturalnych chromosomów. Obecność określonej zmiany genetycznej ma wpływ na rozwój determinowanego przez
nią typu białaczki, a co za tym idzie na przebieg kliniczny choroby oraz odpowiedź na leczenie. Badania cytogenetyczne
i molekularne komórek szpiku mają znaczenie na każdym etapie procesu diagnostycznego i terapeutycznego ALL,
a wynik badania jest niezależnym czynnikiem rokowniczym w tej chorobie.
PACJENCI: Badania przeprowadzono u 80 dzieci w wieku od 1 do 18 lat (43 dziewczynki i 37 chłopców)
hospitalizowanych w Klinice Pediatrii Hematologii i Onkologii AM w Bydgoszczy, z rozpoznaniem ALL. W tej grupie
u 70 dzieci rozpoznano ALL linii B komórkowej (39 dziewczynek + 31 chłopców), u 9 dzieci rozpoznano T– komórkową
ALL (3 dziewczynki + 6 chłopców), oraz u 1 dziewczynki rozpoznano „null”ALL.
MATERIAŁ badań stanowiły komórki szpiku kostnego poddane stymulowanej i niestymulowanej hodowli komórkowej
oraz RNA wyizolowane z komórek szpiku kostnego
METODY. Dla każdego pacjenta przeprowadzono: 1) analizę cytogenetyczną techniką prążków GTG i CBG, 2) analizę
molekularną metodą RT– PCR w celu określenia obecności lub braku 4 fuzji genowych (BCR/ABL, TEL/AML1, E2A/
PBX1, MLL/AF), 4) analizę techniką FISH do chromosomów metafazowych oraz jąder interfazowych w celu uściślenia
lub weryfikacji rozpoznania cytogenetycznego u 16 dzieci.
CELEM PRACY była analiza komórek szpiku pochodzących od dzieci z rozpoznaniem ALL pod kątem korelacji zmian
cytogenetycznych z obecnością fuzji genowych oraz analiza korelacji genetyczno-klinicznych u tych dzieci.
WYNIKI. Kariotyp uzyskano u 68 dzieci. Kariotyp prawidłowy w chwili rozpoznania stwierdzono u 28 dzieci,
kariotyp nieprawidłowy u 40 dzieci. Kariotyp hyperdiploidalny >50 chromosomów stwierdzono u 9 dzieci, kariotyp
hyperdiploidalny 47-49 chromosomów u 7, pseudodiploidalny u 19, diploidalny u 28 oraz hypodiploidalny < 46
chromosomów u 5. Metodami molekularnymi (RT-PCR) i molekularno-cytogenetycznymi (FISH) określono obecność
następujących fuzji genowych:
1.BCR/ABL – odpowiadająca t(9;22)(q34;q11) – u 2 dzieci (u 1 korelowała z wynikiem badania cytogenetycznego,
u drugiego translokacja Ph była zamaskowana wariantem translokacyjnym t(19;22).
2.MLL/AF4 – odpowiadająca t(4;11)(q21;q23) – nie znaleziono, natomiast u 5 dzieci stwierdzono aberracje 11q23
(u 1 dziecka jako jedyną aberrację w kariotypie, u 4 dzieci – w kariotypie złożonym), potwierdzone obecnością
rearanżacji MLL w technice FISH.
3.E2A/PBX1 – odpowiadająca t(1;19)(q23;p13) – u 2 dzieci (u 1 jako zrównoważona t(1;19)(q23;p13), u drugiego
w formie der(19) t(1;19)(q23;p13).
4.TEL/AML1 – odpowiadająca t(12;21)(p13q22) – u 10 dzieci (u 3 towarzyszyła aberracjom widocznym mikroskopowo,
u 7 występowała jako pojedyncza aberracja).
P129.
Dysgerminoma (seminoma), gonadoblastoma oraz guz mieszany z komórek
płciowych i komórek sznurów płciowych u dwóch dorosłych kobiet leczonych
od 16 roku życia.
(1) Zakład Genetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi
(2) Klinika Endokrynologii i Terapii Izotopowej I CZMP
(3) Klinika Medycyny Matczyno-Płodowej I CZMP
(4) Zakład Patomorfologii Klinicznej I CZMP
(5) Zakład Andrologii i Endokrynologii Płodności Instytutu Endokrynologii UM w Łodzi
Zaprezentowano dwie fenotypowe kobiety w wieku 19 i 26 lat, skierowane do Poradni Genetycznej ze względu na
pierwotny brak miesiączki. Z tego powodu obie pacjentki były okresowo leczone od 16 roku życia preparatami
estrogenowo-progesteronowymi. Plamienia z dróg rodnych pojawiały się wyłącznie po podstawieniu cyklu.
W obu przypadkach stwierdzono kariotyp 46,XY. Analiza hormonalna pozwoliła na wykazanie hipogonadyzmu
hipergonadotropowego (FSH i LH odpowiednio 67,08 i 28,45 oraz 38,18 i 11,66 mIU/ml). U każdej z pacjentek
111
Genetyka człowieka
rozpoznano czystą dysgenezję gonad. Ze względu na obecność w kariotypie chromosomu Y i związane z tym ryzyko
wyjścia z dysgenetycznych gonad zmian nowotworowych, pacjentki zakwalifikowano do obustronnej gonadektomii
metodą laparoskopową. Ocena histologiczna umożliwiła wykazanie w dysgenetycznych gonadach u starszej z pacjentek
zmian nowotworowych o typie gonadoblastoma z ogniskami dysgerminoma (seminoma). U młodszej chorej w gonadzie
prawej stwierdzono guz mieszany z komórek płciowych i komórek sznurów płciowych (mixed cell-sex cord-stromal
tumor), współistniejący z dużych rozmiarów dysgerminoma w lewej gonadzie. Przeprowadzono analizę molekularną
chromosomu Y, w tym także genu SRY. U starszej pacjentki wykluczono mutację tego genu. W drugim przypadku
wstępna analiza SSCP sugeruje możliwość wystąpienia mutacji w obrębie genu SRY. Dyskusji poddano możliwy wpływ
leczenia hormonalnego na rozwój nowotworów wywodzących się z płodowych komórek płciowych, wdrożonego bez
wstępnej diagnostyki klinicznej. Przedstawione przypadki potwierdzają konieczność przeprowadzania gonadektomii
u fenotypowych kobiet z dysgenezją gonad i kariotypem 46,XY, przed podjęciem terapii substytucyjnej. Gonadektomia
wykonana drogą laparoskopową wydaje się być zabiegiem oszczędzającym dla pacjentek i godnym polecenia.
Praca finansowana w części z grantu KBN nr 6 PO5E 135 21
P130.
Wstępne badania korelacji ekspresji genu MDR1 w limfoblastach, poddanych
in vitro działaniu prednizolonu, z przebiegiem klinicznym ostrej białaczki
limfoblastycznej.
Hanna Janiszewska (1), Jan Styczyński (2), Olga Haus (1), Mariusz Wysocki (2)
(1) Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej AM w Bydgoszczy
(2) Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii AM w Bydgoszczy
Oporność komórek na cytostatyki stanowi jeden z głównych czynników ograniczających skuteczność terapii
przeciwbiałaczkowej. Może dotyczyć pojedynczego leku lub mieć charakter oporności wielolekowej. Za proces ten
odpowiedzialne są białka przezbłonowe, tzw.wielolekowe transportery, ktorych ekspresja w błonie komórek opornych
jest znacznie większa. Głównym tego typu białkiem jest glikoproteina-P kodowana przez gen MDR1 (multidrug
resistance), zlokalizowany w regionie q21.1 chromosomu 7. Celem pracy była ocena wpływu in vitro prednizolonu na
ekspresję genu MDR1 i jego związek z wynikami terapii dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną. Materiał stanowiły
limfoblasty pochodzące od 30 dzieci (wiek od 1 miesiąca do 15,5 lat) z ALL (26 de novo, 4 wznowy), które poddano 72
godzinnej inkubacji z prednizolonem. Dwukrotnie, przed i po terapii prednizolonem, wykonano: półilościowe badanie
ekspresji genu MDR1 metodą RT-PCR, badanie ekspresji białka P-gp metodą cytometrii przepływowej oraz retencji
rodaminy R123 w/bez obecności cyklosporyny A. Ponadto dokonano oceny wyników leczenia przeciwbiałaczkowego
w zależności od ekspresji MDR1 w limfoblastach przed i po inkubacji z prednizolonem. U 47% pacjentów (w tym u 2/4
ze wznową) nie stwierdzono ekspresji MDR1, zarówno w dniu 0, jak i w 3 dniu inkubacji limfoblastów z prednizolonem.
53% pacjentów (w tym 2/4 ze wznową) wykazywala ekspresję MDR1 w momencie rozpoznania choroby. Wśród tej
grupy u 62% pacjentów (w tym u 1 ze wznową) obserwowano utrzymywanie się ekspresji, lecz z tendencją spadkową
w 3 dniu inkubacji z prednizolonem, natomiast u pozostałych 38% (w tym u 1 ze wznową) nie stwierdzono już ekspresji
MDR1 po 3 dniach inkubacji limfoblastów z lekiem. Nie stwierdzono korelacji pomiędzy ekspresją MDR1 i ekspresją Pgp, zarówno przed, jak i po inkubacji z prednizolonem (test korelacji Spermana). U pacjentów z ekspresją MDR1 w dniu
0 oraz w dniu 3, zaobserwowano większą retencję rodaminy w obecności cyklosporyny, co wskazuje na blokowanie
funkcji glikoproteiny-P przez jej inhibitor cyklosporynę A.
P131.
Znaczenie polimorfizmu w genie cykliny D1 (CCND1) w kształtowaniu ryzyka
wystąpienia nowotworów krtani.
Małgorzata Rydzanicz (1), Paweł Golusiński (2), Daniela Mielcarek-Kuchta (2), Krzysztof Szyfter (1, 2)
(1) Instytut Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu, ul. Strzeszyńska 32, 60-479 Poznań
(2) Klinika Otolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Cyklina D1 jest kluczowym enzymem kontrolującym przejście z fazy G1 do fazy S cyklu komórkowego. Nadekspresja
tego białka wiązana jest z rozwojem wielu nowotworów, w tym raków krtani. Jedną z proponowanych przyczyn
prowadzących do deregulacji cykliny D1 jest polimorfizm w genie CCND1. Substytucja G870A w kodonie 242
moduluje częstość alternatywnego splicingu. Białko kodowane przez genotyp z allelem A ma unikatowy, krótszy Ckoniec pozbawiony dwóch sekwencji regulatorowych odpowiedzialnych za transport cykliny D1 z jądra do cytoplazmy
i jej degradację. W ten sposób może powstać białko o dłuższym okresie półtrwania, co prowadzi do akumulacji cykliny
D1 w komórce, zwiększonej proliferacji komórkowej, a tym samym do inicjacji procesu nowotworowego.
112
Genetyka człowieka
Stosując technikę PCR-RFLP przeanalizowano rozkład częstości genotypów genu CCND1 w grupie 63 chorych
z rakiem krtani, u których wcześniej badano ekspresję cykliny D1 metodami immunohistochemicznymi oraz grupie 102
zdrowych osób. Genotyp GA oraz kombinacja genotypów GA i AA, związany był ze wzrostem ryzyka rozwoju choroby
nowotworowej (odpowiednio: OR=3,02, p=0,004 i OR=2.52, p=0.013). Częstość allelu A była wyższa u chorych (0,484)
niż u osób zdrowych (0,416) i nieznacznie wpływała na podwyższenie ryzyka raka krtani (OR-1,34, 95% CI-0,84-2,05).
Genotyp AA częściej występował u osób, u których wcześniej rozwinął się nowotwór (mediana 51.5) w porównaniu
z genotypem GG (mediana 63.0) i związany był z obecnością przerzutów do węzłów chłonnych (OR=3.26). Najwyższy
poziom ekspresji cykliny D1 obserwowano głównie w przypadkach z homozygotycznym genotypem AA.
Wyniki badań sugerują, że polimorfizm w genie CCND1 może zwiększać podatność na rozwój nowotworów krtani,
wpływać na ich progresję i rokowania dla pacjenta.
P132.
Badania ilościowe chimeryzmu komórek hematopoetycznych u dzieci poddanych
allogenicznej transplantacji szpiku kostnego (allo-BMT).
Małgorzata Dawidowska (1), J. Jółkowska (1), M. Witt (1), J. Wachowiak (2)
(1) Instytut Genetyki Człowieka Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu, Zespół Genetyki Molekularnej i Klinicznej
(2) Klinika Hematologii i Onkologii Dziecięcej Akademii Medycznej im.Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Ostra białaczka limfoblastyczna (ALL) stanowi najczęstsze wskazanie do allogenicznej transplantacji komórek
hamatopoetycznych (allo-HSCT) u dzieci. Chimeryzm poprzeszczepowy, definiowany jako współwystępowanie
w organizmie biorcy własnych komórek hematopoetycznych z komórkami dawcy, pozwala ocenić rekonstytucję
hematologiczną, stwierdzić odrzucenie przeszczepu, oraz wykryć molekularne symptomy wznowy i choroby przeszczep
przeciw gospodarzowi (GvHD). Stwarza to możliwość modyfikacji procesu terapeutycznego i zwiększenia jego
skuteczności. Wartość prognostyczna badań chimeryzmu została przez nas potwierdzona, we wcześniejszych badaniach,
obejmujących pacjentów po allo-BMT z powodu różnych wskazań.
Obecnie, szczególny obiekt zainteresowania stanowi grupa dzieci z ALL, u których zamierzamy rozszerzyć
monitorowanie potransplantacyjne o badania poziomu choroby resztkowej (MRD), charakteryzujące się większą
czułością oraz przydatnością na różnych etapach terapii ALL, nie tylko po transplantacji.
Badania chimeryzmu wykonano w oparciu o analizę markerów mikrosatelitarnych, amplifikowanych przy użyciu
starterów znakowanych fluorescencyjnie i rozdzielanych elektroforetycznie w sekwenatorze DNA ALF Express
(Pharmacia Biotech). Identyfikację genotypów i analizę ilościową przeprowadzono z użyciem programu komputerowego
Fragment Manager (Pharmacia Biotech). Materiał do badań stanowiły krew obwodowa i szpik kostny, niekiedy
mononukleary i limfocyty CD3 izolowane z krwi/szpiku kostnego pacjentów przed transplantacją i w określonych
odstępach czasu po zabiegu, oraz krew/szpik dawców.
Dotychczas, ilościową analizę chimeryzmu przeprowadzono u 15 dzieci z ALL, identyfikując pełen chimeryzm dawcy
u 7 pacjentów, chimeryzm mieszany u 1, oraz zmienny status chimeryzmu w 7 przypadkach. Stwierdzono także
korelację wyników badań ze stanem klinicznym pacjentów, co stanowi potwierdzenie przydatności badań chimeryzmu
w terapii białaczek, argument za ich upowszechnieniem w rutynowych badaniach po transplantacji allogenicznej, oraz
punkt wyjścia do badań porównujących przydatność monitorowania chimeryzmu i choroby resztkowej.
P133.
Ostra białaczka promielocytowa u pacjenta z zespołem XYY.
Ewa Wasilewska (1), K. Głażewska (1), M. Klimiuk (1), B. Panasiuk (2), J. Kłoczko (1)
(1) Klinika Hematologii AM w Białymstoku
(2) Zakład Genetyki Klinicznej AM w Białymstoku
Przedstawiamy kolejną własną obserwację występowania ostrej białaczki szpikowej u 55-letniego mężczyzny
z kariotypem 47,XYY. Zespół XYY został wykryty u pacjenta w wyniku badania kariotypu szpiku z powodu ostrej
białaczki promielocytowej (AML/M3). Badaniem klinicznym nie obserwowano odchyleń fenotypowych. W badaniu
biochemicznym stwierdzono obniżony poziom testosteronu. Ocenę kariotypu komórek szpiku przeprowadzonego3krotnie: w okresie remisji (dwukrotnie) i nawrotu choroby. Stwierdzono występowanie typowej dla tego typu białaczki
translokacji chromosomowej wzajemnej t(15;17)(q22;q21). Przedstawiona obserwacja współwystępowania kariotypu
konstytucyjnego XYY z białaczką może mieć znaczenie w poradnictwie genetycznym mężczyzn XYY, w aspekcie
występowania ryzyka choroby nowotworowej.
113
Genetyka człowieka
P134.
Wykrywanie wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV) typu 16 w rakach przełyku.
Jarosław Sawiniec (1), Henryk Berbeć (2), Magdalena Dmoszyńska-Graniczka (2), Andrzej Dąbrowski (3),
Rafał Sawicki (1), Krzysztof Borkowski (1)
(1) Katedra i Zakład Biochemii AM Lublin, ul. Chodzki 1
(2) Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej AM Lublin,
(3) II Katedra i Klinika Chirurgii Ogólnej AM Lublin
Z danych epidemiologicznych ostatnich lat wynika, że przewód pokarmowy jest jedną z najczęstszych lokalizacji
nowotworów złośliwych na świecie. Szansa przeżycia chorego zależy przede wszystkim od stadium zaawansowania
procesu rozrostowego w chwili jego wykrycia. Rak przełyku cechuje się nikłą symptomatologią we wczesnym okresie, zaś
zaawansowane jego postacie charakteryzują się bardzo złymi wynikami leczenia. Dlatego też celowe jest poszukiwanie
czynników odpowiedzialnych za transformację nowotworową.
Wirus brodawczaka ludzkiego, ze swoim szczególnym tropizmem do komórek płaskonabłonkowych, uważany jest za
ważny czynnik onkogenny w rakach szyjki macicy i rakach krtani. Istnieją natomiast kontrowersyjne doniesienia co do
obecności i roli HPV w rozwoju raka przełyku.
Celem niniejszej pracy było wykrycie obecności wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16 w materiale klinicznym
pochodzącym z guzów usuniętych w czasie leczenia operacyjnego 45 przypadków raka przełyku.
Matrycowe DNA wyizolowano metodą Blina i wsp. Obecność wirusa wykrywano z zastosowaniem techniki „nested
PCR” wykorzystując „Zestaw do wykrywania HPV 16” firmy „DNA-Gdańsk s.c” w modyfikacji własnej. Obecność
sekwencji wirusa HPV stwierdzono w 31 (69%) przypadkach. Powyższą metodę wykrywania HPV zastosowano także
do identyfikacji jego obecności w materiale klinicznym pochodzącym z 10 guzów płuca. W tym wypadku każdorazowo
uzyskiwano rezultat negatywny.
Otrzymane wyniki wskazują na współwystępowanie raka przełyku z infekcją wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16, co
może wskazywać na istotną rolę tego wirusa w procesie nowotworzenia.
P135.
Translokacje chromosomowe w zespołach mielodysplastycznych (MDS).
Olga Haus (1), Ewa Duszeńko (2) Izabela Makowska (2), Katarzyna Skonieczka (1), Barbara Mucha (1),
Krystyna Soszyńska (1)
(1) Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej AM w Bydgoszczy
(2) Katedra i Klinika Hematologii AM we Wrocławiu
Aberracje chromosomów w zespołach mielodysplastycznych są z reguły niezrównoważone. Najczęstszymi z nich
są monosomie i delecje długich ramion chromosomów 5 i 7 oraz trisomia 8. Translokacje, w których dochodzi do
powstania genów fuzyjnych, należą do rzadkości; występują u ok. 10-15% pacjentów z aberracjami. Celem badań
było poznanie częstości i rodzajów translokacji występujących w MDS oraz ich związku z przebiegiem klinicznym
choroby. Badania cytogenetyczne komórek szpiku wykonano u 200 nieleczonych chorych z MDS. Komórki do analizy
uzyskiwano z 24– i 48-godzinnych, niestymulowanych i stymulowanych GM-CSF, hodowli. U każdego chorego
analizowano conajmniej 15 metafaz wybarwionych w technice GTG. Technikę FISH z sondami centromerowymi
i malującymi stosowano w celu znalezienia ukrytych aberracji chromosomów 5, 7 i 8 oraz wyjaśnienia charakteru
niektórych translokacji. Nieprawidłowy kariotyp stwierdzono u 96 chorych (48%). Najczęstszymi aberracjami były
5q-,+8,7q-,-7,-5,-Y,chromosomy koliste, +21, aberracje 11q23,-18, 6q-. U 12 chorych (12.5% chorych z aberracjami)
znaleziono translokacje; u 3 były to translokacje typowe dla ostrych białaczek; t(9;22) – 2x i t(8;21) – 1x. U 9 pacjentów
znaleziono rzadkie translokacje o nieprzypadkowych punktach złamań chromosomów. Były to np: niezrównoważona
t(1;7)(q10;p10) połączona z delecją 7q i częściową trisomią 7p, która wystąpiła u chorego z hipoplastycznym MDS,
zrównoważona t(1;3)(p36;q21), połączona prawdopodobnie z fuzją genów MEL i ryboforyny 1, u chorego z dysplazją
trójukładową i niezrównoważona t(17;20)(q21;q13.1) u pacjenta z RARS. Translokacje, nawet zrównoważone, mają
niekorzystne znaczenie rokownicze w MDS. W badanej grupie kojarzyły się z cięższym przebiegiem choroby i krótszym
czasem przeżycia w stosunku do analogicznych parametrów klinicznych w grupie chorych bez aberracji i z aberracjami
liczbowymi.
114
Genetyka człowieka
P136.
Nowe warianty swoistej translokacji t(X;18) w pięciu guzach mięsaka
maziówkowego u człowieka.
Mariola Iliszko (1), Janusz Ryś (2), Maria Dębiec-Rychter (4), Maria Chosia (3), Janusz Limon (1)
(1) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Akademii Medycznej w Gdańsku
(2) Zakład Patologii, Centrum Onkologii Oddział w Krakowie
(3) Katedra Patomorfologii Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie
(4) Zakład Genetyki Człowieka Uniwersytetu w Leuven, Belgia
Mięsaki maziówkowe stanowią 10% wszystkich rodzajów mięsaków i charakteryzują się występowaniem wysoce
swoistej chromosomowej translokacji wzajemnej t(X;18)(p11;q11) lub jej wariantów.
Materiałem badawczym było pięć guzów, z których wyprowadzono pierwotne hodowle komórkowe in vitro a otrzymane
metafazy barwiono metodą prążków G. W wyniku analizy cytogenetycznej stwierdzono następujące kariotypy:
Guz I: 46,X,t(X;18;3)(p11;q11;q11)[15];
Guz II: 46,X,t(X;15;18)(p11;p11;q11)[15]
Guz III: 52,der(X)t(X;18)(p11;q11),+ der(X)t(X;18)(p11;q11),
Y,+Y,+3,inv(5)(p15.3q13),del(6)(p23),+7,+8,der(9)t
(X;9)(p11;p13),+12,-13,+14,add(16)(q12),add (18)
(p11),add(19)(p13)[cp14]
Guz IV: 69-73,der(X)t(X;18)(p11;q11)x2,Y,del(1)(q32),
der(1) t(1;3)(p36.3;p23),-3,-4,der(5)t(5;10)(q13;q22)
x3,+5,-6,+7,inv(9)(p11q21.2)x2c?,-11,+12,
der(13)t(4;13)(p12;q22),-14,der(18)t(5;18)(q13;q11)
x2,+18,+der(19)t(8;19)(p13;q13)x2,+21,mar[cp14]
Guz V: 91-97,t(X;17;18)(p11;p11;q11)x2,YY,+add(6)(q13),
del(11)(p11.2),+12,+15[cp8]
W dwóch przypadkach (I –II) stwierdzono kariotyp prosty, a w pozostałych złożony. We wszystkich badanych guzach
wykryto nie opisane dotąd warianty swoistej translokacji (wytłuszczonym drukiem), gdzie obok chromosomów X i 18
dodatkowo zaangażowane są kolejno chromosomy: 3 w guzie I, 15 w II, 9 w III, 5 w IV oraz 17 w guzie V.
Oprócz translokacji swoistej, w trzech ostatnich guzach występują liczne wtórne aberracje chromosomowe. Wspólną
zmianą wtórną dla tych guzów jest dodatkowa kopia chromosomu 12, a w guzach III i IV także chromosomu 7. Są to
najczęściej obserwowane wtórne zmiany liczbowe w mięsaku maziówkowym.
Wykrycie aberracji swoistej we wszystkich przypadkach potwierdziło histopatologiczne rozpoznanie mięsaka
maziówkowego.
P137.
Analiza mutacji genu BRCA1 w 137 rodzinach obciążonych rakiem piersi
i / lub jajnika.
Magdalena Perkowska (1), I. Brożek (1), E. Senkus (2), G. Palomba (3), M. Pisano (3), G. Palmieri (3), A. Borg (4),
J. Limon (1)
(1) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki AMG
(2) Katedra i Klinika Onkologii i Radioterapi AMG
(3) Institute of Molecular Genetics, Consiglio Nazionale Ricerche, Alghero
(4) Department of Oncology, Lund University, Sweden.
3% zachorowań na raka piersi oraz 5-10% zachorowań na raka jajnika ma podłoże genetyczne i jest związane z mutacjami
w dwóch genach supresorowych BRCA1 (17q12-21) i BRCA2 (13q12-13). Zmutowane geny charakteryzują się niepełną
penetracją z tym że penetracja dla raka piersi jest znacznie wyższa (70% ) niż w raku jajnika (25%). Mutacje w genie
BRCA1 stanowią 80% wszystkich wykrytych mutacji w rodzinach z dziedzicznym rakiem piersi i/lub jajnika.
Celem przedstawionej pracy było wykonanie kompletnej analizy mutacji genu BRCA1 w grupie 137 pacjentów
w rodzinach, w których występowała agregacja zachorowań na raka piersi i/lub jajnika. Materiał do badań stanowił,
wyizolowany z limfocytów krwi obwodowej metodą fenol/chloroform DNA, pacjentów chorych na raka piersi i/lub
jajnika. Analizę badanych próbek wykonano przy pomocy denaturacyjnej wysokosprawnościowej chromatografii
cieczowej (DHPLC). Wszystkie próbki DNA, w których wzór pików różnił się od kontrolnego, były poddane
sekwencjonowaniu.
Mutacje w genie BRCA1 wykryto u 43 pacjentów (31%). Mutacje założycielskie, które występują najczęściej w populacji
115
Genetyka człowieka
Polskiej: 5382insC oraz Cys61Gly stanowiły odpowiednio 45% i 24% przypadków. Zwraca uwagę wysoka częstość (37%)
mutacji innych niż założycielskie: 3819del5, 185delAG, L1086X, G855X, 2991del5, IVS14+1G/A, 5465G/A.
Uzyskane wyniki wskazują, że w przypadku negatywnych wyników dla mutacji założycielskich należy przeprowadzić
pełną analizę genu BRCA1
P138.
Analiza LOH genu BRCA1 w sporadycznych i dziedzicznych rakach jajnika.
Karolina Ochman (1), I. Brożek (1), J. Dębniak (2), M. Stukan (2), J. Emerich (2), J. Limon (1)
(1) Katedra i Zakład Biologii i Genetyki
(2) Instytut Położnictwa i Ginekologii Akademii Medycznej w Gdańsku
85-90% dziedzicznych przypadków raka jajnika związane jest z obecnością germinalnych mutacji genów supresorowych
BRCA1 lub BRCA2. Utrata allela „dzikiego” prowadząca do utraty heterozygotyczności (LOH) stanowi zasadniczy
mechanizm inaktywacji tych genów w guzie.
Celem pracy była analiza częstości zjawiska LOH w dziedzicznej (spowodowanej mutacją genu BRCA1) i sporadycznej
postaci raka jajnika oraz analiza zależności pomiędzy LOH, a wybranymi parametrami klinicznymi.
Analizą LOH objęliśmy grupę 103 pacjentek z rozpoznaniem raka jajnika operowanych w Instytucie Ginekologii
i Położnictwa AM w Gdańsku. DNA wyizolowano z mrożonych fragmentów guza i krwi. Do analizy użyto ośmiu
markerów mikrosatelitarnych zlokalizowanych w chromosomie 17. Badanie LOH wykonywano z użyciem elektroforezy
kapilarnej systemu ABI PRISM 310 oraz GENESCAN software.
Zjawisko LOH dotyczące przynajmniej jednego locus zostało wykryte w 72 guzach (66,9%). W 37 (35.9%) przypadkach
zjawisko to występowało w co najmniej pięciu loci, co wskazuje na utratę dużych fragmentów chromosomu 17, a w trzech
guzach – ośmiu loci, co może świadczyć o utracie całego chromosomu 17. Przeprowadzono także analizę zależności
pomiędzy utratą markera D17S1323, zlokalizowanego w intronie 12 genu BRCA1, a stopniem złośliwości histologicznej
guza. Utrata markera była statystycznie częściej obserwowana u chorych z 3/4 stopniem złośliwości w porównaniu
z chorymi z 1/2 stopniem (p=0,0047). Zaobserwowano także tendencję w kierunku znamienności porównując liczbę
LOH w dwóch grupach pacjentek: z mutacją germinalną (10 pacjentek) oraz bez mutacji (93). U pacjentek z mutacją
częściej obserwowano liczne (>4) utraty allela „dzikiego” (p=0,03).
P139.
Ocena znaczenia klasycznej techniki cytogenetycznej oraz metody hybrydyzacji
in situ (FISH) w skutecznym monitorowaniu odpowiedzi na leczenie interferonem
alfa(IFN)-doświadczenia własne.
Renata Kroll, M. Prątnicka, A. Balcerzak, M. Komarnicki
Katedra i Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych Układu Krwiotwórczego AM im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu
W przewlekłej białaczce szpikowej (p.b.sz.) stwierdza się obecność typowej aberracji cytogenetycznej, którą określa
się mianem chromosomu Filadelfia (translokacja t(9;22)(q34;q11) odpowiadająca fuzji genów BCR/ABL). Jednym ze
sposobów leczenia, służącym przedłużeniu życia chorych na p.b.sz. jest terapia za pomoc interferonu-alfa. Wymaga ona
jednak stałego monitorowania cytogenetycznego dla określenia odpowiedzi na stosowane leczenie. Otrzymanie wyniku
badania cytogenetycznego wiąże się z koniecznością uzyskania odpowiedniej liczby komórek w stadium metafazy.
Technika FISH pozwala na analizę komórek interfazowych. Celem pracy jest przedstawienie wyników porównania obu
technik badawczych.
Badaniami objęto 15 chorych na p.b.sz., w tym 8 mężczyzn i 7 kobiet w wieku 49 (34-70) lat otrzymujących IFN,
ocenianych po 12 miesiącach leczenia. Badania wykonywano technik FISH i k.m.c., używając automatycznego systemu
do detekcji chromosomów METASYSTEM z programami IKAROS oraz ISIS. Oceniano całkowitą liczbę metafaz, liczbę
metafaz Ph+ oraz obecność fuzji genu BCR/ABL w jądrach metafazowych i interfazowych .
Uzyskane wyniki wskazują, i technika FISH charakteryzuje się wyższą czułością oznaczeń w porównaniu z klasycznym
badaniem cytogenetycznym. Pozwala ona na wykrycie pojedynczej komórki z onkogenem BCR/ABL. Jednakże, ze
względu na dotychczas małą liczbę przeprowadzonych badań nie można jednoznacznie określić stopnia przydatności
FISH w ocenie wyników leczenia IFN-em u chorych na p.b.sz. Uzasadnia to kontynuację dalszych bada .
116
Genetyka człowieka
P140.
Hereditary cancer program in Latvia
Arvids Irmejs (1), Andris Gardovskis (1), Viktors Borosenko (1), Marianna Bitina (1), Diana Aigare (1),
Grzegorz Kurzawski (2), Janina Suchy (2), Bohdan Gorski (2), Janis Gardovskis(1)
(1) Hereditary Cancer Institute, Riga Stradins University, Latvia
(2) International Hereditary Cancer Center, Pomeranian Medical University, Poland
Introduction. Clinical genetics of cancer family syndromes in Latvia has been initiated on larger scale beginning from
1998 due to EC Copernicus multicenter project on Fenotype – genotype correlations in HNPCC and MENI and had
it’s successful continuation due to the next EC project entitled Development of network of cancer family syndrome
registries in Eastern Europe. In 2001 Hereditary Cancer Institute was established by Riga Stradins University. The main
aim of this institute is to study the hereditary cancer syndromes in Latvia and to introduce the obtained knowledge into
clinical practice. Materials and methods. From 02/1999 – 09/2002 in several hospitals of Latvia cancer family history
was collected from 865 patients with colorectal cancer. Since 2002 cancer family history has been collected also for 148
patients with breast cancer who asked for genetic counseling. In families suspected of hereditary cancer syndromes,
DNA testing for MLH1, MSH2 and MSH6 genes in colorectal cancer cases and BRCA1 gene in breast cancer cases was
performed. In colorectal cancer cases immunohistochemical (IH) examination of the normal and cancer tissue from
large bowel for protein expression in MSH2 and MSH6 genes was performed before DNA sequencing. Results. Among
865 colorectal cancer no one cancer in relatives was recognized in 402 (46.47%) cases. In 463 (53.53%) colorectal
cancer cases there was at least one more cancer in relatives. Only 3 (0.35%) pedigrees fulfilled Amsterdam II criteria of
Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (HNPCC) although histopathological confirmation of cancer in affected
family members of those 3 pedigrees was not possible. 15 cases (1.73%) were suspected of HNPCC. In 69 cases (8%)
so called cancer family aggregation (CFA) was detected. Until now 27 immunohistochemical examinations have been
performed and in 3 cancers homogenous lack of MSH2 or MSH6 protein was found. In 1 of these cases mutation
in MSH6 gene was identified. In 18 patients suspected of HNPCC or matching Amsterdam criteria, DNA DHPLC/
sequencing “exon by exon” for MLH1 and MSH2 founder mutations was performed. Two mutations were found.
Among 148 breast cancer patients, 7 (4.7%) fulfilled hereditary breast cancer site-specific (HBC-SS) criteria, 2 (1.4%)
– hereditary breast–ovarian cancer (HBOC) criteria, 35 (23.6%) were suspected of HBC-SS and 3 (2%) were suspected
of HBOC. In 18 (12.2%) cases, CFA criteria were fulfilled. Until now 22 patients fulfilling the criteria of HBC-SS or
HBOC were tested for BRCA1 mutations – 5382insC, C61G and 4153delA. In 5 families mutations were found. For all
of families with HNPCC, HBC-SS or HBO diagnosed definitely or with high probability appropriate recommendations
concerning prophylactics, surveillance and treatment were elaborated and transmitted in written form. 3 of above
families with HBC-SS or HBO participated earlier in another hereditary breast cancer project realized in Latvia. None
of these families, including one with identified BRCA1 constitutional mutation, received appropriate special clinical
recommendations.
Conclusions. Existing pedigree/clinical data suggest that in Latvia the frequency of HNPCC is around 2% of consecutive
colorectal cancer patients and features of hereditary breast cancer can be found in almost 30% of breast cancer
patients asking genetic counseling. It is crucial that genetics counseling is the integral part of cancer family syndrome
programmes.
117
Genetyka człowieka
Doniesienia różne
Komunikaty plakatowe:
P141.
Użycie wysokorozdzielczej hybrydyzacji porównawczej genomu
(High Resolution-Comparative Genomic Hybridization HR-CGH)
do identyfikacji chromosomów markerowych.
Mariusz Babicz , Jerzy R. Kowalczyk, Monika Lejman, Anna Gaworczyk, Dorota Winnicka, Rafał Dmowski,
Marta Holweg
Dziecięcy Szpital Kliniczny AM w Lublinie, Klinika Hematologii i Onkologii Dziecięcej AM w Lublinie
Pracownia Cytogenetyczna, ul. Chodźki 2, 20-093 Lublin
Chromosom markerowy jest definiowany jako mały, dodatkowy chromosom o nieznanym mechanizmie powstawania.
Ok. 90 % chromosomów może pochodzić z krótkich ramion i regionów okołocentromerowych chromosomów
akrocentrycznych grupy D i chromosomów metacentrycznych grupy F. Chromosomy markerowe to chromosomy
metacentryczne lub akrocentryczne, często zawierające jeden lub dwa centromery, lub przybierające morfologię
chromosomów pierścieniowych. Bardzo trudne do identyfikacji za pomocą znanych i dostępnych cytogenetycznych
technik prążkowych. Wysokorozdzielcza hybrydyzacja porównawcza genomu (High resolution comparative genomic
hybridization HR-CGH) dostarcza informację screening’ową aberracji niezrównoważonych podczas pojedynczej
hybrydyzacji do prawidłowych chromosomów ludzkich in situ przygotowanego odpowiednio genomowego DNA
badanego i wzorcowego. Rozdzielczość metody jest określana na ok. 5000 par zasad co daje szerokie możliwości
w identyfikacji niezrównoważonych nieprawidłowości chromosomowych, a w szczególności trudnych do identyfikacji
chromosomów markerowych. Zastosowaliśmy HR-CGH do identyfikacji chromosomów markerowych u pięciu
pacjentów z różnymi wskazaniami klinicznymi przyjętych do Poradni Genetycznej Dziecięcego Szpitala Klinicznego
w Lublinie. Przy zastosowaniu dostępnych metod prążkowych (G, Q, C, R, NOR, DAPI) identyfikacja poszczególnych
markerów była niemożliwa. W 100 % przypadków dodatkowy materiał chromosomowy został zidentyfikowany
i przyporządkowany odpowiednim regionom na chromosomach metafazalnych; markery zostały również potwierdzone
przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Stosując HR-CGH otrzymaliśmy: {1} izochromosom
ramion krótkich chromosomu 18 u pacjenta z kariotypem 47, XY,+ mar[50]. rev ish enh(18p) z cechami klinicznymi
dysmorfii twarzowej czaszki, wadami CUN, wnętroctwem; {2} delecję regionu q31;q34 chromosomu 13 u pacjenta
z kariotypem 46, XY, del(13)(p;q15)?[63]. rev ish dim(13q31qter) z cechami klinicznymi dysmorfii twarzowej czaszki;
{3} izochromosom ramion q chromosomu X u pacjentki z kariotypem 46, X, i(Xq)?[85]. rev ish dim(Xp), enh(Xq)
z cechami klinicznymi zespołu Turnera; {4} amplifikację regionu okołocentromerowego chromosomu X (p11.3;q13)
u pacjentki z kariotypem 46, XO,+mar[75]. rev ish enh(Xp11.3;q13) z cechami klinicznymi zespołu Turnera; {5}
amplifikację regionu terminalnego ramion p chromosomu X (p21;pter) u pacjentki z kariotypem 46, XO,+mar[67].
rev ish enh(Xp21:pter) z cechami klinicznymi zespołu Turnera. Podsumowując, znaczenie kliniczne chromosomÓw
markerowych jest szerokie i nie zawsze koreluje z fenotypem badanego pacjenta a wysokorozdzielcza hybrydyzacja
porównawcza genomu jest szybką i efektywną metodą ich identyfikacji.
118
Genetyka człowieka
P142.
Analiza molekularna genów kandydackich odpowiedzialnych za powstawanie
niesyndromicznej postaci rozszczepów wargi i podniebienia.
Adrianna Mostowska (1), Barbara Biedziak (2), Piotr Wójcicki (3), Kazimierz Kobus (3), Wiesław H. Trzeciak (1)
(1) Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, AM Poznań
(2) Katedra Ortodoncji, AM Poznań
(3) Szpital Chirurgii Plastycznej, Polanica Zdrój
Rozszczepy wargi i podniebienia występują w populacji ogólnej z częstością około 2/1000 żywych urodzeń. Etiologia
izolowanych postaci tej wady rozwojowej jest bardzo złożona, a w jej powstawaniu bierze udział wiele czynników,
zarówno genetycznych jak i środowiskowych. Liczne badania molekularne oraz analizy sprzężeń pozwoliły wyznaczyć
szereg genów, których mutacje lub też polimorfizmy są odpowiedzialne za powstawanie CL/P lub też zwiększają
ryzyko wystąpienia tej nieprawidłowości rozwojowej. Jednakże dane dotyczące znaczenia wariantów polimorficznych
w etiologii CL/P różnią się między sobą i ściśle zależą od badanej populacji.
Celem projektu było sprawdzenie czy istnieje związek mutacji oraz polimorfizmów najważniejszych genów kandydackich
z występowaniem izolowanych postaci CL/P w populacji polskiej oraz poszukiwanie nowych mutacji genów MSX1 oraz
IRF6 u osób z wadami rozszczepowymi twarzy.
Badaniami objęto grupę 150 osób z izolowaną postacią CL/P oraz grupę kontrolną składającą się z 150 osób, u których
nie występowały żadne nieprawidłowości rozwojowe twarzoczaszki. W celu określenia rodzaju wariantu polimorficznego
odpowiednie sekwencje badanych genów kandydackich (TGFA, MTHFR, MSX1 oraz RARA) amplifikowano przy użyciu
specyficznych starterów i poddawano analizie restrykcyjnej lub też analizie MSSCP. Przeprowadzone badania pozwoliły
wykazać istotny związek polimorfizmów BamHI oraz RsaI genu TGFA z występowaniem CL/P w populacji polskiej (p=
0,0058 i 0,0402 odpowiednio) oraz nie wykazały związku pozostałych badanych polimorfizmów z występowaniem wad
rozszczepowych twarzoczaszki. W celu wykrycia mutacji sekwencje eksonów genów MSX1 oraz IRF6 amplifikowano
z użyciem specyficznych starterów oraz analizowano za pomocą metody MSSCP. Analiza ta oraz bezpośrednie
sekwencjonowanie DNA pozwoliły wykryć obecność wielu wariantów polimorficznych, które jednakże nie wykazują
związku z występowaniem rozszczepów wargi i podniebienia w populacji polskiej.
Uzyskane wyniki wskazują, że gen TGFA jest jednym z głównych genów kandydackich, którego mutacje / polimorfizmy
są odpowiedzialne za powstawanie CL/P lub też zwiększenie ryzyka wystąpienia tej nieprawidłowości w populacji
polskiej. Badane warianty polimorficzne pozostałych genów kandydackich, w odróżnieniu od innych populacji, nie
wykazują związku z występowaniem CL/P.
Badania finansowane z grantu KBN 2P05A 092 26.
P143.
Zmiana konserwowanej argininy w domenie błonowej białka pasma 3 przyczyną
sferocytozy wrodzonej.
Monika Maciąg (1), Justyna Spychalska (2), Ewa Jabłońska-Skwiecińska (1), Piotr Centkowski (2),
Jerzy Kościelak (2), Ewa Zdebska (2), Anna Adamowicz-Salach (3) i Beata Burzyńska (1)
(1) Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa
(2) Instytut Hematologii i Transfuzjologii, ul. Chocimska 5, 00-957 Warszawa
(3) Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii AM w Warszawie, ul Marszałkowska 24, 00-576 Warszawa
Sferocytoza wrodzona jest w Polsce najczęstszą wadą wrodzoną krwinek czerwonych i zależy od zaburzeń budowy
białek błonowych erytrocytów. Ocenia się, że sferocytoza wrodzona występuje z częstością 1:2000. Obraz kliniczny
sferocytozy wrodzonej jest bardzo zróżnicowany: od przypadków lekkich, z chorobą hemolityczną wyrównaną, do
przypadków ciężkich wymagających systematycznych przetaczań krwi. Choroba dziedziczy się w sposób autosomalny
dominujący, a rzadziej – autosomalny recesywny.
Przedstawiamy analizę molekularną i biochemiczną przypadku sferocytozy wrodzonej; choroba dotyczy 40-letniego
mężczyzny pozostającego od 20 lat pod opieką lekarska z powodu niedokrwistości z towarzyszącą żółtaczką
i powiększeniem śledziony. Żółtaczkę i powiększenie śledziony obserwowano także u ojca i babki chorego. U trzech
synów chorego nie stwierdzono klinicznych ani laboratoryjnych cech niedokrwistości hemolitycznej.
W wyniku przeprowadzonych badań u chorego wykryto zaburzenia składu białek błonowych krwinek czerwonych,
wyrażające się obniżeniem ilości białka pasma 3 i ankiryny. Analiza sekwencji genów kodujących białka błonowe
wykazała obecność mutacji powodujących zmiany aminokwasów w trzech białkach: w białku pasma 3 zamiana argininy
na histydynę (R808H), w ankirynie zamiana izoleucyny na treoninę (I1075T) i w beta-spektrynie zamiana seryny na
asparaginę (S439N).
119
Genetyka człowieka
Mutacje dotyczące genów ankiryny i beta-spektryny znaleziono także u synów chorego, natomiast żaden z nich nie miał
mutacji w genie białka pasma 3.
Wydaje się więc że, mutacją odpowiedzialną za wystąpienie objawów sferocytozy wrodzonej jest mutacja genu pasma
3; mutacja znajduje się w części genu kodującego domenę błonową białka pasma 3, a powoduje zmianę konserwowanej
argininy.
P144.
Analiza budowy transkryptu receptora CCR5 występującego w dojrzałych
plemnikach człowieka.
Anna Kozłowska (1), Radosław Januchowski (1) , Andrzej Bręborowicz (2), Leszek Pawelczyk (2),
Piotr Jędrzejczak (2), Paweł P. Jagodziński (1)
(1) Katedra Biochemii i Biologii Molekularnej, Akademia Medyczna im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
(2) Klinika Niepłodności i Endokrynologii Rozrodu, Akademia Medyczna im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Wykazano, że dojrzałe plemniki zawierają zestaw mRNA, który może dostarczyć informacji o ekspresji genów
zachodzącej podczas spermatogenezy. Istnieją również dowody, że niektóre cząsteczki mRNA mogą być wykorzystane
podczas wczesnej embriogenezy.
Najnowsze badania wskazują na udział chemokin w żeńskim i męskim przedziale rozrodczym. Odkryto, że chemokiny
mogą odgrywać istotną funkcje w procesach owulacji, menstruacji, implantacji oraz chemotaksji plemników.
Zaobserwowano, że chemokina RANTES (ang. Regulated upon Activation of Normal T-cells Expressed and Secreted)
wiążąca się z receptorem CCR5 może powodować chemotaksję plemników człowieka.
Celem pracy była analiza budowy transkryptu receptora chemokin CCR5 oraz określenie jego ilości w ludzkich
plemnikach.
Plemniki izolowano metodą “swim-up” z nasienia płodnych mężczyzn. Z krwi obwodowej tych samych dawców
izolowano monojądrzaste komórki krwi (PBMC). Całkowity RNA izolowano z dojrzałych plemników oraz PMBC
metodą Chomczyńskiego i Sacchi. RNA traktowano DNazą I i poddano działaniu odwrotnej transkryptazy. Uzyskany
cDNA poddano analizie wykorzystującej ilościową reakcje łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (ang.
Quantitative Real Time-PCR).
Wykorzystując startery komplementarne do różnych egsonów transkryptu CCR5 wykazano, że mRNA uzyskany
z ludzkich plemników jest krótszy od transkryptu wyizolowanego z leukocytów krwi obwodowej i składa się
z 3 i 4 egsonu.
Zidentyfikowana izoforma mRNA receptora chemokin CCR5 może reprezentować bardziej trwały transkrypt, który
przypuszczalnie jest wykorzystany w biosyntezie tego białka podczas spermatogenezy lub wczesnej embriogenezy.
Badania finansowane przez Akademię Medycznej im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu.
(Badania własne 501-1-08-05 i 501-1-02-30).
P145.
Analiza profilu metylacji wybranych genów u chorych z rakiem pęcherza
moczowego.
Hubert Tomczyk (1), Maria Constantinou (1), Aleksandra Binka-Kowalska (1), Edyta Borkowska (1),
Józef Matych (2), Agnieszka Nawrocka (3), Bogdan Kałużewski (1)
(1) Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
(2) Oddział Urologii i Transplantacji Nerek Szpitala im. Pirogowa w Łodzi
(3) Zakład Patomorfologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Wyciszanie genów poprzez metylację sekwencji promotorowych jest zjawiskiem powszechnym w chorobie
nowotworowej i stanowi alternatywny mechanizm inaktywacji genów supresorowych, uzupełniając hipotezę dwóch
uderzeń Knudson’a. Lista poznanych genów inaktywowanych w ten sposób szybko się wydłuża. Najciekawszy jest chyba
jednak fakt, że każdy z badanych nowotworów wykazuje specyficzny dla siebie wzór metylacji, co otwiera możliwości
nowych strategii diagnostycznych. Badanym przez nas nowotworem jest rak pęcherza moczowego, stanowiący szóstą co
do częstości przyczynę zgonów na nowotwory złośliwe. Badania przeprowadzone zostały na DNA izolowanym z moczu.
Opierając się na danych literaturowych zostały wyselekcjonowane geny, które przy użyciu metody MSP (methylation
specyfic PCR) są poddane analizie, mającej na celu między innymi odpowiedź na pytanie: czy profil metylacyjny może
stanowić czynnik rokowniczy i diagnostyczny?
120
Genetyka człowieka
P146.
Ludzka hybrydoma źródłem rekombinowanych fragmentów Fab specyficznych dla
antygenów powierzchniowych plemnika.
Dorota Fiszer, Natalia Rozwadowska, Tomasz Pawlukowiec, Beata Grygielska, Alina Domagała, Ewa Wiland,
Maciej Kurpisz
Instytut Genetyki Człowieka PAN, ul. Strzeszyńska 32, 60-479 Poznań
Linie hybrydoma często są niestabilne, tracą zdolność produkowania przeciwciał i/lub wykazują niski poziom ich
sekrecji. W tych przypadkach celowym jest zabezpieczenie (swoistości) łańcuchów ciężkich i lekkich produkowanych
przez te linie, powodując ich ekspresję na powierzchni fagów i efektywną amplifikację w bakteriach. Celem pracy jest
konstrukcja fagowej biblioteki fragmentów Fab skierowanym przeciw antygenom powierzchniowym plemnika. Źródło
mRNA stanowiło siedem ludzkich linii hybrydoma wytwarzających przeciwciała przeciwplemnikowe, co zostało
udokumentowanie w testach: ELISA, aglutynacji i testach funkcjonalnych. Po odwrotnej transkrypcji amplifikowano
łańcuch ciężki (g) i łańcuchy lekkie (k i l), a następnie klonowano je do fagemidu pComb3HSS. Fragmenty Fab
poddawane były ekspresji w bakteriach E. coli (XL-1 Blue) przy użyciu faga pomocniczego VCSM13. Selekcja
specyficznych fragmentów Fab prowadzona była wobec całych komórek plemnikowych. Przy pomocy techniki ekspresji
rekombinowanych fragmentów Fab na powierzchni faga, spodziewane jest wzbogacenie puli przeciwciał wytwarzanych
przez linie hybrydoma, specyficznych dla antygenów powierzchniowych plemników.
P147.
Rola mitotycznej niestabilności w spermatogenezie.
Ewa Wiland, Magdalena Zając, Maciej Kurpisz
Instytut Genetyki Człowieka PAN, ul. Strzeszyńska 32, 60-479 Poznań
U mężczyzn o prawidłowym kariotypie somatycznym aneuploidia chromosomów plemnikowych powstają najczęściej
de novo w wyniku błędów w mejozie. U płodnych mężczyzn podział mejotyczny może przebiegać nieprawidłowo
nawet w kilku procentach komórek, przy czym średni poziom disomii poszczególnych chromosomów wynosi od
0,01% do 0,3%, zaś średni poziom diploidii od 0,05% do 0,2%. Jednocześnie wiadomo, że istnieje duża zmienność
osobnicza w częstości aneuploidii poszczególnych chromosomów w plemnikach, przy czym u części mężczyzn
obserwuje się znacząco wyższą częstość aneuploidii niektórych chromosomów. Przyczyny tych indywidualnych
różnic są nieznane. Wiadomo również, że w grupie mężczyzn z niepowodzeniami rozrodu (o prawidłowym kariotypie
w limfocytach krwi obwodowej), średni poziom disomii i diploidii w plemnikach jest istotnie wyższy w porównaniu
z grupą płodnych mężczyzn. Dotyczy to mężczyzn z różnymi typami niepłodności a także ojców dzieci z trisomią.
Również w grupie mężczyzn z niepowodzeniami rozrodu występują istotne różnice osobnicze dotyczące częstości
aneuploidii autosomów i chromosomów płciowych w plemnikach. Różnic tych nie udało się dotychczas skorelować
z określonymi typami niepowodzeń rozrodu. Uważa się jednak, że wzrost częstości aneuploidii w plemnikach może
być jednym z wykładników zaburzonego procesu spermatogenezy, stąd aberracjom chromosomowym w plemnikach
mężczyzn o prawidłowym kariotypie somatycznym przypisuje się dużą rolę w etiologii niepowodzeń rozrodu. Celem
prezentowanych badań była ocena występowania ewentualnych korelacji między podwyższonym poziomem aneuploidii
w plemnikach i w komórkach somatycznych (limfocytach krwi obwodowej) u tego samego mężczyzny. Warunkiem
zaobserwowania takiej korelacji była ocena poziomu aneuploidii w dużej liczbie komórek, tj. kilku tysiącach plemników
i jąder interfazowych limfocytów. Ocenę poziomu aneuploidii prowadzono metodą FISH z zastosowaniem sond
centromerowych i telomerowych dla chromosomów 7, 13, 15, 18, 21, X i Y. Badania prowadzono zarówno w grupie
kontrolnej płodnych mężczyzn jak i w grupie mężczyzn z niepowodzeniami rozrodu różnego typu. Uzyskane dotychczas
wyniki badań własnych, jak i nieliczne dane literaturowe sugerują, że istnieje istotna korelacja pomiędzy kontrolą mitozy
w komórkach somatycznych a procesem różnicowania i proliferacji komórek w trakcie spermatogenezy.
P148.
Układ genów IL-1 – ilościowa analiza ekspresji w prawidłowej lub patologicznej
ludzkiej gonadzie męskiej.
Natalia Rozwadowska, Dorota Fiszer, Maciej Kurpisz
Instytut Genetyki Człowieka PAN, ul. Strzeszyńska 32, 60-479 Poznań
Spermatogeneza jest procesem, w którym spotykają się i współzawodniczą: proliferacja i apoptoza. Nieznaczne
zachwianie proporcji pomiędzy nimi może prowadzić do patologii, jakimi są np. zaburzenia płodności (przy nadmiernej
apoptozie) czy rozrosty nowotworowe przy zbyt dużej proliferacji. Układ genów IL-1 obejmuje geny biorące udział
121
Genetyka człowieka
w obu tych procesach.
Przy pomocy techniki PCR w czasie rzeczywistym oceniono ilościowo poziom ekspresji genów układu IL-1 w męskiej
gonadzie prawidłowej z zachowaną spermatogenezą, w tkance nowotworowej oraz w próbkach z różnymi blokami
dojrzewania komórek rozrodczych. Oceniono poziom transkrypcji dla genów: IL-1a (interleukina-1 alfa), IL-1b
(interleukina-1 beta), IL-1RA (antagonista receptorowy interleukiny-1), IL-1RI (receptor I dla inetrleukiny-1), IL-1RII
(receptor II dla interleukiny-1), IL-1RAcP (cząsteczka związana ze receptorem interleukiny-1), ICE (konwertaza-1),
IL-18 (interleukina-18), IL-18Ra (łańcuch alfa receptora dla interleukiny-18) oraz IL-18Rb (łańcuch beta receptora dla
interleukiny –18) w cDNA pochodzącym z następujących frakcji: komórki gametogeniczne, komórki interstycjalne,
limfocyty krwi obwodowej. Następnie porównano poziomy ekspresji z tkanki zdrowej gonady do ekspresji tych samych
genów w gonadzie z blokami dojrzewania oraz w tkance nowotworowej jądra. Dokładniejsze poznanie molekularnych
podstaw tych zjawisk przybliża nas do poznania mechanizmu produkcji gamet oraz utworzenia unikatowego
tolerogennego mikrośrodowiska niezbędnego do ich powstawania. Będzie to pomocne w dalszych działaniach
terapeutycznych.
122
Genetyka zwierząt
Ekspresja genów, mapy genomowe,
polimorfizm genetyczny, ewolucja
Komunikaty ustne:
W63.
Geny cech ilościowych (QTL) u zwierząt gospodarskich
Jolanta Kurył
Zakład Immunogenetyki Zwierząt, Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN, Jastrzębiec
Streszczenie w suplemencie
W64.
Zastosowanie polimorfizmu markerów mikrosatelitarnych w kontroli genetycznej
myszy szczepów wsobnych kongenicznie opornych utrzymywanych w CO-I.
Marcin Choim (1), M. Gajewska (1, 2), E. Wirth-Dzięciołowska (1, 2)
(1) Centrum Onkologii-Instytut, ul. Roentgena 5, Warszawa
(2) Muzeum i Instytut Zoologii PAN, ul. Wilcza 64, Warszawa
Kontrola genetyczna zwierząt laboratoryjnych ma na celu sprawdzanie modelu badawczego ze standardem.
Systematycznie i rutynowo prowadzona analiza pozwala na wyeliminowanie błędnych wyników badań.
W Zakładzie Genetyki i Hodowli Zwierząt Laboratoryjnych w Centrum Onkologii – Instytut, myszy szczepów
kongenicznych opornych poddano kontroli genetycznej przy pomocy markerów mikrosatelitarnych. Badane szczepy
kongeniczne różniły się fragmentem chromosomu zawierającym geny głównego kompleksu zgodności tkankowej
(H-2).
Celem pracy była ocena homozygotyczności myszy badanych szczepów, ocena zgodności tła genetycznego z genotypem
szczepu C57BL10/W, zbadanie polimorfizmu genetycznego szczepów kongenicznych w obrębie kompleksu H2 oraz
opracowanie panelu mikrosatelitarnego do monitoringu genetycznego myszy ze szczepów kongenicznych.
Materiał genetyczny pochodził od myszy dziewięciu szczepów kongenicznie opornych; B10.A, B10.A(2R), B10.A(5R),
B10.AKM, B10.BN, B10.BR, B10.P, B10.RBP, B10.S, oraz od myszy szczepu tła C57BL10/W, stosowanego jako kontroli.
Ocenę polimorfizmu genetycznego prowadzono przy zastosowani reakcji PCR. Produkty amplifikacji rozdzielano
elektroforetycznie na żelu agarozowym.
Na podstawie uzyskanych wyników analizy opracowano panel kontrolny do oceny genetycznej myszy szczepów
kongenicznych. Zawiera on markery z chromosomu 17, do kontroli genotypów w obrębie kompleksu H2, a także
markery z pozostałych chromosomów do oceny zgodności genotypu ze szczepem tła.
123
Genetyka zwierząt
W65.
Polimorfizm rejonów kodujących i regulacyjnych genów MYOD1 (MYF3) i MYF5
świni.
Paweł Urbański, Jolanta Kurył
Zakład Immunogenetyki Zwierząt, Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN, Jastrzębiec
Geny MYOD1 i MYF5 należą do rodziny genów MYOD. Produkty tych genów są czynnikami transkrypcyjnymi typu
bHLH odpowiedzialnymi za prawidłowy przebieg procesu miogenezy oraz transkrypcji genów specyficznych dla
mięśni szkieletowych. Białka MYOD1 i MYF 5 są niezbędne w kontroli proliferacji pierwotnych komórek mięśniowych
w początkowych etapach miogenezy zarodkowej.
Materiał doświadczalny stanowiło około 1000 zwierząt ras: pbz, wbp, duroc, hampshire, linia 990, linia PIC, Torhyb. Do
identyfikacji polimorfizmu zastosowano metody: PCR –SSCP, sekwencjonowanie, PCR –RFLP. W obrębie genu MYOD1
zidentyfikowano jeden SNP w rejonie promotora (nie rozpoznawany przez żaden enzym restrykcyjny) oraz dwa SNPs
w eksonie 1 rozpoznawane endonukleazą BssSI, natomiast w obrębie genu MYF5 zidentyfikowano trzy SNPs w rejonie
promotorowym rozpoznawane enzymami AciI, FokI, HinPI i jeden SNP w 3 eksonie (mutacja nie rozpoznawana przez
żaden enzym restrykcyjny).
Dwie z mutacji znalezionych w eksonach powodują zamianę sekwencji aminokwasów (Leu – Pro)
Częstości genotypów względem każdej z badanych mutacji różnią się w poszczególnych rasach zwierząt.
Zostanie oceniony wpływ mutacji w rejonie 5’ flankującym genów na ich ekspresję.�
W66.
Analiza zależności pomiędzy różnymi wariantami genu ESR/PvuII a cechami nasienia
knurów reprodukcyjnych.
Marek Kmieć, Arkadiusz Terman
Agricultural University of Szczecin, Department of Genetics and Animal Breeding,
ul. Doktora Judyma 6, 71-466 Szczecin, Poland
Prowadzone w ostatnich latach badania wskazują na możliwość wykorzystania niektórych genów jako markerów
dla cech użytkowości rozrodczej u świń, co z kolei może zostać wykorzystane we wczesnej selekcji, która ma na celu
zwiększenie skuteczności zapładniania loch, jak również liczby prosiąt w miocie. Na oba te parametry znaczny wpływ
wywierają cechy nasienia knurów wykorzystanych do rozpłodu. Istotną rolę w procesach rozrodczych odgrywają
między innymi estrogeny, które wpływają na zachowanie płciowe knurów oraz regulujące proces spermatogenezy.
U świń, locus genu ESR znajduje się w chromosomie 1. Celem niniejszych badań było określenie częstości występowania
genotypów i alleli genu ESR/PvuII u knurów użytkowanych w SHiUZ oraz ustalenie zależności pomiędzy określonymi
genotypami a badanymi cechami ilościowymi i jakościowymi nasienia. Genotypy ESR oznaczano poprzez zastosowanie
techniki PCR-RFLP. Amplifikowano fragment DNA o długości 120 par zasad, stosując specyficzne sekwencje
starterowe. Produkt PCR trawiono 3 jednostkami endonukleazy PvuII przez 3 godziny w temperaturze 37oC i następnie
elektroforetycznie rozdzielano w 2,5 % żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny a wyniki odczytywano
w świetle UV. Analizę zależności pomiędzy genotypem ESR a badanymi cechami użytkowości rozpłodowej knurów
przeprowadzono przy zastosowaniu analizy wariancji, wykorzystując pakiet statystyczny SAS. W analizowanym stadzie
knurów stwierdzono występowanie dwóch alleli genu receptora estrogenowego: ESRC (0.8348) oraz ESRD (0.1652), jak
również trzech genotypów: ESRCESRC (0.7296), ESRCESRD (0.2103) oraz ESRDESRD (0.0601). W przeprowadzonych
badaniach wykazano istotne statystycznie (P≤0,01) zależności pomiędzy genotypami ESR dla wszystkich badanych cech
nasienia knurów reprodukcyjnych. Otrzymane wyniki z przeprowadzonych badań sugerują możliwości wykorzystania
istniejącego polimorfizmu genu ESR w doskonaleniu niektórych cech użytkowości rozpłodowej knurów.�
W67.
Zależność pomiędzy polimorfizmem w genie defenzyny.
Katarzyna Wojdak-Maksymiec, Marek Kmieć
Department of Genetics and Animal Breeding, Agricultural University of Szczecin, ul. Doktora Judyma 6, 71– 466 Szczecin,
Poland
Niespecyficzna antybiotyczna i cytotoksyczna aktywność defenzyny może być skierowana przeciwko bakteriom,
wirusom oraz grzybom, także tym wywołujący zapalenia wymienia u krów mlecznych. Te właściwości decydują
o możliwości wykorzystania defenzyny jako potencjalnego markera odporności (podatności) krów na mastitis. Badania
naukowe potwierdzają tezę o wysokim polimorfizmie w genie defenzyny oraz o statystycznie istotnych związkach
124
Genetyka zwierząt
pomiędzy wariantami defenzyny, a podatnością na zapalania wymienia i mlecznością krów.
Badaniami objęto 184 krowy mleczne rasy jersey. Łącznie przeanalizowano zawartość komórek somatycznych w 2532
próbkach mleka, zbieranych podczas próbnych udojów. Od wszystkich krów pobrano krew obwodową a następnie
wyizolowano DNA. Na uzyskanym DNA amplifikowano fragment genu DEF. Reakcję PCR przeprowadzono przy
wykorzystaniu metodyki zaproponowanej przez Ryniewicz i wsp. Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych
w genie defenzyny określono przy użyciu enzymu TaqI.
Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej. Określone zostały frekwencje genotypów defenzyny. Analiza
statystyczna objęła również poszukiwania zależności pomiędzy polimorfizmem laktoferyny a ilością komórek
somatycznych w mleku. Jako źródło zmienności uwzględniono ponadto takie cechy jak: rok badania, sezon, kolejność
i stadium laktacji, a także wpływ ojca. Zawartość komórek somatycznych w mleku transformowano na skalę
logarytmiczną (logarytm naturalny) w celu zrównoważenia rozkładu.
Zidentyfikowano łącznie 12 różnych genotypów. Z największą częstością występował heterozygotyczny genotyp
A1A2B1B2C1C2. Wpływ badanych genotypów na zawartość komórek somatycznych w mleku okazał się statystycznie
wysoko istotny. Zaobserwowano także potwierdzoną statystycznie zależność pomiędzy zawartością komórek w mleku
a takimi czynnikami jak ojciec, sezon i stadium laktacji oraz rok badania. Jedynie wpływ kolejnej laktacji okazał się
statystycznie nieistotny
W68.
Wstępne badania QTL związanych z nieśnością kur przy dużym zagęszczeniu
markerowymi loci w chromosomie 4.
Małgorzata Korczak (1), Barbara Wardęcka (1), Grzegorz Zieba (2), Kazimierz Jaszczak (1).
(1) Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt Polskiej Akademi Nauk w Jastrzębcu
(2) Akademia Rolnicza w Lublinie, ul. Akademicka 13
Celem badań jest dokładne określenie w chromosomie czwartym rejonów w których znajdują się loci cech nieśności
i jakości jaja poprzez analizę ich sprzężeń z gęsto rozmieszczonymi markerami mikrosatelitarnymi. Badania prowadzone
są na wielopokoleniowej referencyjnej populacji kur powstałych ze skrzyżowania dwu ras zielononóżki kuropatwianej
(Zk) i Rhode Island Red (RIR).
Do badań wybrano z bazy danych Roslin Institute 25 sekwencji mikrosatelitarnych (ADL0241, ADL0288, LEI0100,
MCW0251, MCW0005, ADL0246, MCW0085, ADL0266, LEI0144, MCW0284, LEI0076, LEI0081, ADL0331,
ADL0317, ADL0203, MCW0295, LEI0073, LEI0063, LEI0078, LEI0122, MCW0129, ADL0255, ADL0194, ADL240,
MCW122) znajdujących się w chromosomie 4.
Amplifikację (PCR) poszczególnych mikrosatelitów przeprowadzono z użyciem starterów wyznakowanych
flurescencyjnie (Cy-5). Produkty reakcji PCR poddawano elektroforezie w 6% żelu poliakrylamidowym przy użyciu
automatycznego sekwenatora ALFexpress. Dotychczas przeprowadzono, przy pomocy programu Allele Links 1.01,
analizę długości 19 sekwencji mikrosatelitarnych. Cztery spośród nich są nieprzydatne do dalszych analiz ze względu na
swą homozygotyczność. Wśród 15 sekwencji mikrosatelitarnych przydatnych do dalszych analiz liczba występujących
alleli dla badanych cech wynosi od 3 do 6, średnio 4 na jeden locus. Analiza 13 loci mikrosatelitarnych wykazała
występowanie alleli charakterystycznych dla rasy zielononóżka kuropatwiana i Rhode Island Red.
Wstępna analiza statystyczna przy użyciu programu QTL express i metody interwałowego mapowania wykazała
obecność pięciu QTL sprzężonych z cechami nieśności (tempo nieśności hodowlanej, nieśność hodowlana, masa ciała,
masa żółtka, masa białka) w chromosomie 4.
W69.
Wykorzystanie polimorfizmu sekwencji genu cytochromu b do rozpoznawania
anonimowych śladów biologicznych oraz w ochronie przyrody.
Beata Prusak (1), Tomasz Grzybowski (2), Jarosław Bednarek (2)
(1) Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN, Jastrzębiec
(2) Zakład Genetyki Molekularnej i Sądowej, Akademia Medyczna Bydgoszcz
Na podstawie analizy polimorfizmu sekwencji genu cytochromu b mtDNA dokonano identyfikacji gatunkowej trzech
anonimowych próbek biologicznych: plamy krwi, fragmentu tkanki mięśniowej egzotycznego gada oraz włosa znalezionego
w ptasim gnieździe. Amplifikację analizowanego fragmentu genu prowadzono w termocyklerze GenAmp PCR System
9600 Thermal Cycler (AB). Oczyszczone produkty PCR (o długości ok. 300 pz) sekwencjonowano wykorzystując zestaw
Big Dye Primer Cycle Sequencing RR Kit (ABI Prism) i rozdzielano na automatycznym skwenatorze ABI PISM 377.
Anonimowe sekwencje „własne” wykorzystano do określenia gatunkowego pochodzenia śladów poprzez porównanie
125
Genetyka zwierząt
z sekwencjami znanych gatunków, opublikowanymi w bazie GenBank. Dla sekwencji genu cytb zidentyfikowanej
w DNA z plamy krwi znaleziono w bazie sekwencję łosia, podobną w 98% do sekwencji „własnej” Natomiast najbardziej
podobną do sekwencji zidentyfikowanej w DNA z tkanki mięśniowej gada, była sekwencja pytona tygrysiego
(podobieństwo 99%). Uzyskanie tak wysokich wartości podobieństwa pozwala przyjąć, iż analizowane anonimowe
próbki pochodzą odpowiednio od łosia i pytona tygrysiego, a wystąpienie nieznacznych różnic w sekwencjach można
wytłumaczyć istnieniem osobniczej zmienności w obrębie każdego z tych gatunków. Sekwencja genu cytb z mtDNA
włosa znalezionego w ptasim gnieździe była identyczna z sekwencją kozy opublikowaną w GenBanku oraz z sekwencją
kozy ze stada hodowlanego w Jastrzębcu. Można więc stwierdzić z prawdopodobieństwem tożsamym z pewnością iż jest
to włos kozy. Wyniki wskazują, że analiza sekwencji genu cytb mtDNA może być przydatnym narzędziem w nadzorze
nad produktami pochodzenia zwierzęcego oraz w logistyce z zakresu ochrony przyrody.
W70. Zespół genów kodujących rRNA jako narzędzie w identyfikacji i ewolucji gatunków
rodzaju Gyrodactylus.
Marek S. Ziętara (1), Jaakko Lumme (2)
(1) Stacja Biologiczna Uniwersytetu Gdańskiego, ul. Ornitologów 26, 80-680 Gdańsk
(2) Instytut Biologii Uniwersytetu w Oulu, POB 3000, 90014 Finlandia
Zespół genów kodujących rybosomalne RNA (rRNA) składa się z trzech odcinków kodujących podjednostki rRNA (18S,
5.8S i 28S) i czterech łączników, trzech podlegających transkrypcji (ETS, ITS1 i ITS2) i jednego (IGS) oddzielającego
powtórzone zespoły od siebie. Poszczególne odcinki zespołu ewoluują w różnym tempie, co umożliwia często analizę
porównawczą zarówno poniżej poziomu rodzaju jak i powyżej poziomu rodziny.
Gatunki rodzaju Gyrodactylus (Plathyleminthes, Monogenea) są liczną grupą, bardzo trudną do identyfikacji ze względu
na ich mikroskopijną wielkość i uproszczoną budowę ciała. Około 400 opisanych dotychczas gatunków stanowi mniej
niż 2% ich przewidywanej ilości. Prawie wszystkie dotąd opisane gatunki są pasożytami ryb, a niektóre z nich groźnymi
gatunkami patogenicznymi. Cechy taksonomiczne poszczególnych gatunków, ograniczające się przede wszystkim do
drobnych różnic w budowie organu czepnego. Wykazują one dość wysoka zmienność osobnicza, co w dużym stopniu
może utrudniać bezbłędną identyfikację poszczególnych osobników. Różnice w budowie narządu protonefrydialnego
posłużyły do wydzielenia sześciu podrodzajów: G. (Gyrodactylus), G. (Mesonephrotus), G. (Metanephrotus), G.
(Paranephrotus), G. (Neonephrotus) i G. (Limnonephrotus) i określenia powiązań filogenetycznych między nimi. �
Dopiero wykorzystanie w ostatnich kilku latach sekwencji rDNA umożliwiło nie tylko bezbłędna identyfikację gatunków,
ale stworzyło również nowe możliwości badania powiązań między poszczególnymi gatunkami i grupami gatunków.
Okazało się ponadto, że sekwencje tego regionu umożliwiają śledzenie procesów radiacji gatunków Gyrodactylus po
ostatnim zlodowaceniu.
Choć analiza filogenetyczna oparta na sekwencjach różnych fragmentów zespołu genów rRNA wykazuje pewne
niezgodności z klasyczną filogenezą opartą na budowie sytemu protonefrydialnego to nowe podejście wydaje się
obiecujące.
W71.
Zależności ewolucyjne w obrębie heterochromatyny konstytutywnej
i chromosomów B u 7 gatunków z rodziny psowatych (Canidae).
Aldona Pieńkowska-Schelling (1) Mariola Zawada (2), Magdalena Przywecka (1), Claude Schelling (3)
(1) Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza w Poznaniu
(2) Instytut Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu
(3) Department of Animal Science, ETH and UNI Zürich
Badania przeprowadzono na następujących gatunkach psowatych: jenot (Nyctereutes procyonoides procyonoides),
otocjon (Otocyon megalotis), wilk grzywiasty (Chrysocyon brachyurus), fenek (Fenecus zerda), lis polarny (Alopex
lagopus), lis pospolity (Vulpes vulpes), pies (Canis familiaris).
Celem pracy było: a) ustalenie prawdopodobnego udziału chromosomu B w zmianach ewolucyjnych kariotypów
poszczególnych gatunków; b) określenie etiologii chromosomu B jenota euroazjatyckiego i heterochromatyny
konstytutywnej lisa polarnego; c) zbadanie homologii pomiędzy materiałem genetycznym zawartym w chromosomach
B, a ramionami heterochromatynowymi.
Materiałem badawczym były chromosomy metafazowe z limfocytów krwi obwodowej 7 gatunków psowatych.
Badanie prowadzono przy użyciu techniki FISH z biotynowanymi sondami uzyskanymi w wyniku mikrodysekcji
i DOP-PCR chromosomów B jenota euroazjatyckiego i ramion heterochromatynowych lisa polarnego. Detekcję sond
126
Genetyka zwierząt
przeprowadzono z użyciem systemu przeciwciał: awidyna-FITC i biotynowana anty-awidyna.
Ustalono, że prawdopodobnie chromosomy B jenota są pochodnymi archaicznych chromosomów, z których
wyewoluowały heterosomy. Stwierdzono, że istnieje częściowa homologia pomiędzy badanymi strukturami. Wykazano
udział sekwencji zawartych w chromosomach B w ewolucji kariotypów poszczególnych gatunków.
W72. Zwiększając efektywność mapowania genów.
Maciej Szydłowski
Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu
Metody obliczeniowe oparte na liczbach losowych mogą zwiększyć szansę lokalizacji chromosomowej genów. Nie
ma jednak efektywnych generatorów losowych działających poprawnie, niezależnie od stopnia złożoności rodowodu
i typu markerów genetycznych. Zaproponowano generator hybrydowy, który potencjalnie łączy zalety dwóch
znanych algorytmów bazujących na metodzie Monte Carlo Markov Chain. Jego aplikację zilustrowano na danych
wysymulowanych dla prawdziwej czteropokoleniowej rodziny o złożonej strukturze. Metodę zastosowano do analizy
genów identycznych przez pochodzenie (IBD sharing) oraz asocjacji typu allel-cecha (test HHRR). Wykazano, że
algorytm zwiększa szansę lokalizacji chromosomowej genu odpowiedzialnego za monogenową chorobę recesywną.
W73
Polimorfizm genu H-FABP i jego związek z cechami otłuszczenia świni.
Agata Chmurzyńska, Marek Świtoński
Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza, Poznań
Transport kwasów tłuszczowych poprzez błony komórkowe oraz w obrębie cytoplazmy zachodzi m. in. z udziałem
białek wiążących kwasy tłuszczowe (ang. fatty acid-binding protein –FABP). Białka te kodowane są przez 9 tkankowo
specyficznych genów o identycznej budowie (4 eksony rozdzielone 3 intronami). Gen H-FABP podlega ekspresji
w komórkach mięśnia sercowego i mięśniach szkieletowych. U świni zlokalizowany jest w chromosomie 6, w regionie,
w którym wykazano istnienie QTL (ang. quantitative trait loci) dla cech otłuszczenia.
Oceniano przydatność 3 polimorfizmów typu SNP (ang. single nucleotide polymorphism) genu H-FABP (jeden
w regionie 5’ UTR, a dwa w intronie drugim) świni jako markerów dla cech otłuszczenia. Ponadto, poszukiwano
nowych polimorfizmów w rejonie 5’ UTR tego genu. Badaniami objęto osobniki należące do dwóch ras (wielka biała
polska i polska biała zwisłoucha) i jednej syntetycznej linii świń (990). Analiza statystyczna, w której uwzględniono
również wpływ polimorfizmu C1843T genu RYR1, nie wykazała bezpośredniego wpływu analizowanych mutacji na
cechy otłuszczenia świń. Poszukiwanie polimorfizmu techniką SSCP wykazało istnienie kilku wzorów prążkowych.
Sekwencjonowanie ujawniło występowanie trzech nieznanych dotąd polimorfizmów typu SNP (C/T, T/G, C/G)
w regionie promotorowym genu. Sekwencja z zaznaczonymi miejscami polimorficznymi została umieszczona w bazie
GenBank.
W74.
Rekombinacja w DNA mitochondrialnym małży z rodzaju Mytilus.
Artur Burzyński, Małgorzata Zbawicka, Roman Wenne
Zakład Genetyki i Biotechnologii Morskiej, Instytut Oceanologii PAN w Sopocie
Obowiązujący paradygmat zakłada, że DNA mitochondrialny jest w królestwie zwierząt dziedziczony wyłącznie w linii
matki i nie podlega rekombinacji. Taki sposób dziedziczenia zapobiega rozprzestrzenianiu się defektywnych genomów
mitochondrialnych poza potomstwo jednej samicy.
Małże z rodzaju Mytilus charakteryzują się unikalnym sposobem dziedziczenia mtDNA. Oprócz klasycznych genomów
dziedziczonych w linii matki (F) samce tych małży mają drugi genom mitochondrialny o znacznym stopniu dywergencji
(M), który jest dziedziczony wyłącznie w linii męskiej (dziedziczenie podwójnie uniparentalne, DUI).
Nasze badania rejonu kontrolnego mtDNA omułka bałtyckiego ujawniły obecność w tej populacji genomów będących
produktami rekombinacji pomiędzy genomami F i M.
127
Genetyka zwierząt
W75.
Zróżnicowanie północnoeuropejskich populacji dorsza atlantyckiego
(Gadus morhua, L.) na podstawie analizy układów heteroplazmatycznych mtDNA
Agnieszka Kijewska (1), Barbara Wiśniewska-Wojtasik (2), Artur Burzyński (1), Roman Wenne (2, 3)
(1) Zakład Genetyki i Biotechnologii Morskiej, Instytut Oceanologii PAN w Sopocie
(2) The University of Hull, Department of Biological Sciences, Molecular Ecology and Fisheries Group, Hull HU6 7RX, UK
(3) Katedra Genetyki, Uniwersytet Gdański, 80 – 822 Gdańsk
W mitochondrialnym DNA region kontrolny (CR), zwany również regionem D-loop, podlega najszybszym zmianom.
Długość tego odcinka DNA jest często zróżnicowana w obrębie gatunku ze względu na obecność powtarzających się
sekwencji nukleotydów. U ryb powtórzenia te mają długość do kilku tysięcy par zasad. U dorsza atlantyckiego (Gadus
morhua) mtDNA CR zawiera na końcu 5’ elementy repetytywne o długości 40 pz. Obserwowano maksymalnie osiem
powtórzeń w danej sekwencji. U tego gatunku jest obserwowana ponadto heteroplazmia związana z występowaniem
innej liczby powtórzeń w różnych kopiach mtDNA. Poszczególne osobniki charakteryzują się zmienną liczbą i układem
wariantów wielkości.
Przeprowadzono analizy odcinka regionu niekodującego, zawierającego powtórzenia sekwencji amplifikując odcinek
5’ mitochondrialnego CR metodą PCR. Na podstawie wyników uwidocznionych za pomocą elektroforezy na żelu
agarozowym zliczono częstotliwość występowania poszczególnych wariantów wielkości dla populacji dorsza z Morza
Bałtyckiego, Morza Północnego i Morza Barentsa (Wyspa Niedźwiedzia, Sorkapp i trawers Hornsundu).
Opracowana metoda różnicowania oparta na analizie frekwencji wariantów wielości jest wystarczająco czuła by
rozróżnić populacje lokalizowane nawet w niewielkiej odległości od siebie (Morze Barentsa). Analiza statystyczna
wykazała, że populacja „hornsundzka” jest istotnie różna od pozostałych z Morza Barentsa, które nie różnią się od siebie.
Różnice pomiędzy każdą z populacji z Morza Barentsa a północnomorską i bałtycką były również statystycznie istotne.
Uzyskane wyniki są zgodne z publikowanymi wcześniej oraz z przeprowadzoną dla prób z Morza Barentsa analizą
izoenzymatyczną. Wyniki analizy uzyskane dla prób z Morza Barentsa sugerują ponadto, że u wybrzeży południowo
– zachodniego Spitsbergenu znajduje się granica zasięgu wschodniej populacji dorsza atlantyckiego.
W76.
Profil ekspresji genów w komórkach nowotworowych mysiego czerniaka B16(F10)
hodowanych in vitro w warunkach hipoksji.
Aleksander Sochanik, Joanna Jazowiecka, Magdalena Olbryt
Zakład Biologii Molekularnej, Centrum Onkologii-Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie, Oddział w Gliwicach
Słabe utlenowanie guzów jest wynikiem zaburzeń przepływu krwi lub ograniczonej dyfuzji tlenu. Hipoksja towarzyszy
guzom litym (90%)>1mm3. Hipoksja wpływa na wzrost i proliferację guza, niestabilność genetyczną, angiogenezę
i apoptozę. Transdukcja sygnału indukowanego hipoksją wpływa na różne czynniki transkrypcyjne. Niedotlenowanie
guzów jest zawadą w radioterapii zmniejszając utrwalanie uszkodzeń DNA wywołanych przez promieniowanie jonizujące.
Hipoksja powoduje też oporność na chemioterapeutyki zmniejszając tempo podziałów komórki (chemioterapeutyki
działają skuteczniej na komórki szybko dzielące się) i modyfikując naczynia kapilarne w pobliżu guza. �
Porównano profil ekspresji genów w komórkach mysiego czerniaka B16(F10) hodowanych z dodatkiem chlorku
kobaltu, w komorze Billupsa-Rothenberga (1% O2) lub w inkubatorze hipoksyjnym (1% tlenu). Izolowano całkowity
RNA, syntezowano cDNA i cRNA. Ekspresję analizowano za pomocą mikromacierzy.
Analizę danych przeprowadzono metodą opartą na rozkładzie macierzy względem wartości szczególnych (SVD).
Klasteryzacja dla genów wybranych metodą SVD uwidoczniła bardzo wyraźny podział próbek doświadczalnych
i kontrolnych. Chlorek kobaltu (chemiczna mimikra hipoksji) powoduje indukcję ekspresji odmiennego zbioru genów
niż zastosowanie obniżonego stężenia tlenu.
Eksperyment gwałtownie zmienia profil ekspresji genów przy obniżeniu stężenia tlenu. Wśród genów różnicujących
dominują geny o wyraźnym wzroście ekspresji (chlorek kobaltu –80/109, komora Billupsa –86/97, inkubator hipoksyjny
– 60/85). We wszystkich 3 metodach zanotowano silny wzrost ekspresji dwu genów: białka indukowanego interferonem
i białka wiążącego galaktozę; przy obniżeniu stężenia tlenu – białka wiążącego selen i prekursora peptydu związanego
z wydalaniem sodu. Przy obniżeniu stężenia tlenu silnie wzrasta ekspresja winkuliny, czynnika wzrostowego tkanki
łącznej, VEGF oraz Cyr61.
128
Genetyka zwierząt
Komunikaty plakatowe:
P149.
Ocena ekspresji genów kaspaz w hipokampie w eksperymentalnym zwierzęcym
modelu ludzkiej padaczki płata skroniowego.
Małgorzata Grabek-Gawłowicz (1), K. Borowicz (2), B. Marzec (1), J. Gawłowicz (1), S. Czuczwar (2),
J. Wojcierowski (1)
(1) Zakład Genetyki Medycznej Akademii Medycznej w Lublinie
(2) Zakład Patofizjologii Akademii Medycznej w Lublinie
Kindling polega na wytwarzaniu eksperymentalngo modelu padaczki poprzez powtarzalną stymulację elektryczną
mózgu, co powoduje indukcję aktywności drgawkowej. Kindling z ciała migdałowatego u szczura jest uważany za
model ludzkiej padaczki płata skroniowego. Relacje miedzy mechanizmem kindlingu a zmianami patomorfologicznymi
w ognisku padaczkorodnym pozostają niewyjaśnione. Nasilenie ich występuje m. in. w hipokampie. Wydaje się,
że pewną rolę odgrywa tu apoptoza. Apoptoza u ssaków jest regulowana przez białka rodziny nbcl-2, białko Apaf1 i grupę kaspaz. Celem naszej pracy było badnie ekspresji genów kaspaz ( cas-2, cas-3) w hipokampie szczurów,
u których stosowano kindling. Materiałem badań były szczury podzielone na następujace grupy:1/ kontrola – zwierzęta
z elektrodą implantowaną do ciała migdałowatego, 2/zwierzęta po kindlingu nie wykazujące zmian w EEG; bez drgawek,
3/ zwierzęta po kindlingu z typowymi zmianami w EEG; bez drgawek, 4/ zwierzęta po kindlingu ze zmianami w EEG;
z drgawkami behawioralnymi. W każdej grupie badano 6 zwierząt. Z hipokampów szczurów izolowano RNA. Ekspresję
genów badano metodą RPA (RNA-se Protection Assay). Uzyskane wyniki nie wykazywały istotności statystycznej.
W naszej ocenie przyczyną tego stanu może być bardzo mała liczba komórek ulegających apoptozie w stosunku do
liczby komórek otaczających.
P150.
Nowy SNP/EcoRI w genie bydlęcej katepsyny B.
Stanisław Józef Rosochacki, E. Juszczuk-Kubiak., T. Sakowski
Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt, Polska Akademia Nauk, Jastrzębiec,05-552 Wólka Kosowska
Katepsyny – lizosomalne kwaśne proteinazy uczestniczą w procesie degradacji białek w organizmach żywych jak
i w stanie post-mortem. Są to enzymy o masie od 20-40 kDa. Należa do nich – wykazujące aktywność endopeptydaz
katepsyny D i L oraz aktywność mieszaną – katepsyny B i H. Katepsyna D jest proteinazą asparaginową, podczas gdy
katepsyny B, H, L są katepsynami siarczkowymi. Uczestniczą one w degradowaniu miozyny i aktyny oraz innych białek
mięśniowych, a także mają wpływ na kruchość mięsa w stanie post-mortem. Gen katepsyby B leży na chromosomie
8 i składa się z 10 eksonów i dłuższych 9 intronów. Wykazano powiązanie genotypów z aktywnością endogennych
enzymów proteolitycznych, a kontrolując genetykę populacji bydła rzeźnego, można lepiej poznać mechanizmy
dziedziczenia kruchości wołowiny. Badanie markerów genetycznych powiązanych z proteolizą białka w mięśniach
przeprowadzono na bydle czarno-białym pochodzącym z fermy hodowlanej w Jastrzębcu. Wykonano oznaczenie
polimorfizmu wybranych genów stosując techniki SSCP, RFLP i sekwencjonowania. Polimorfizm genu katepsyny
B (CTSB) bydlęcej określono przy użyciu enzymów EcoRI (na 65 sztukach) i NlaIII (na 31 osobnikach) i wykazano
genotypy AB (59) i AA (6) oraz AB (4), AA (26) i BB (1) dla odpowiednich enzymów. Frekwencja alleli wynosiła: A=0.94
i B=0.06 dla EcoRI i dla NlaIII A=0.89 i B=0.11. Nie stwierdzono polimorfizmu dla tego genu przy pomocy enzymów
MboII, AluI i NcoI. Analiza sekwencji potwierdziła wystapienie tranzycji C/T przy pomocy enzymu EcoRI w pozycji 390
pz oraz transwersji G/T w pozycji 187 pz (GenBank AF230197) rozpoznawanej przez enzym NlaIII. Wykryte mutacje
wystepują w sekwencji niekodującej –w intronie 9. Zależność tego polimorfizmu a cechami fizyko-chemicznymi oraz
sensorycznymi są w trakcie obliczeń statystycznych.
129
Genetyka zwierząt
P151.
Polimorfizm genów GH i GHR u bydła rasy jersey i limousine.
Arkadiusz Michalak, Jolanta Komisarek, Zbigniew Dorynek
Katedra Hodowli Bydła, Akademia Rolnicza im. A. Cieszkowskiego w Poznaniu, ul. Wojska Polskiego 71 A, 60-625 Poznań
Celem badań było określenie polimorfizmu genów hormonu wzrostu (GH) oraz jego receptora (GHR) w populacji
bydła rasy jersey oraz limousine. W locus hormonu wzrostu analizowanopolimorfizm C/G w eksonie V, powodujący
zastąpienie leucyny przez walinę w pozycji 127 łańcucha polipeptydowego (L127V). Mutacja F279Y w genie receptora
hormonu wzrostu polegała na substytucji T/A w eksonie VIII i prowadziła do zamiany fenyloalaniny na tyrozynę
w kodowanym białku. Badania prowadzono w populacji obejmującej 99 krów rasy jersey oraz 34 krowy rasy limousine.
Genotypy GH i GHR identyfikowano metodą PCR-RFLP. Produkt amplifikacji genu GH o wielkości 404 par zasad (pz),
po trawieniu enzymem restrykcyjnym AluI widoczny był na żelu w postaci 3 prążków o długości 36, 132 i 236 pz dla
wariantu V kodującego walinę, lub 4 prążków o długości 36, 51, 132 i 185 pz dla wariantu L kodującego leucynę. Allele
F i Y genu GHR, identyfikowane przy pomocy enzymu restrykcyjnego VspI, charakteryzowały się wielkością prążków
odpowiednio ok. 180pz i ok. 160 i 20 pz.
Uzyskane frekwencje genotypów przedstawiały się następująco:
Locus GH: LL – 0.28 (jersey), 0.22 (limousine); LV – 0.39 (jersey), 0.43 (limousine);
VV – 0.33 (jersey), 0.35 (limousine)
Locus GHR: FF – 0.06 (jersey), 0.38 (limousine);
FY – 0.43 (jersey), 0.06 (limousine); YY – 0.51 (jersey), 0.56 (limousine)
P152.
Genetyczne relacje miedzy bydłem Rathi (Bos indicus) a bydłem polskim czerwonym
oraz białogrzbietym określone na podstawie analizy sekwencji genu
Grzegorz Grzybowski (1), Beata Prusak (1), Chandra Pareek (2)
(1) Zakład Immunogenetyki Zwierząt, Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN, Jastrzębiec
(2) Katedra Genetyki Zwierząt, Wydział Bioinżynierii Zwierząt, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie
Według klasyfikacji Linneusza, bydło garbate (zebu) oraz bezgarbne są odrębnymi gatunkami: odpowiednio – Bos
indicus oraz Bos taurus. Trafność takiego podziału jest przedmiotem wielu kontrowersji. Krzyżówki zebu z taurine są
płodne i dlatego Bos taurus i Bos indicus są przez niektórych uważane za geograficzne warianty jednego gatunku. Inni
badacze argumentują, że duże różnice w eksterierze, a także różnice w polimorfizmie i częstości występowania pewnych
izoenzymów, są dowodem na odrębną pozycję systematyczną tych typów. Celem badań było przeprowadzenie porównań
filogenetycznych między Bos taurus (bydło polskie czerwone oraz bydło białogrzbiete) a Bos indicus (bydło Rathi/zebu
z Radżastanu w Indiach), opartych na polimorfizmie sekwencji genu cytb mtDNA. Modelem i ewolucyjnym tłem przy
określaniu różnic między Bos taurus i Bos indicus były sekwencje gatunków: Bison bonasus – żubr europejski i Bison bison
– bizon amerykański, które uważane są za gatunki bardzo pokrewne (lub podgatunki w obrębie rodzaju Bison). mtDNA
ekstrahowano z sierści (zebu, żubry, bizony) oraz z komórek krwi (pc, białogrzbiety). Produkty PCR o długości ok. 300
pz sekwerncjonowano z wykorzystaniem znakowanych (starterów)a następnie rozdzielano na sekwenatorze ABI PISM
377. Najmniejsza liczba podstawień w sekwencji wynosiła 14 (bizony ↔ zebu, pc, białogrzbiety), a największa 22 (bizony
↔ żubry). Sekwencje genu cytb mtDNA zidentyfikowane u Rathi oraz u bydła polskiego czerwonego i białogrzbietów
z hodowli zachowawczej były identyczne. W światowej bazie GenBank znaleziono sekwencje w 100% homologiczne
z sekwencją bydła Rathi, pc i białogrzbietów, zidentyfikowane u innych ras bydła Bos taurus oraz Bos indicus. Uzyskane
wyniki wskazują, że założycielskie linie żeńskie dla „gatunku” Bos taurus i Bos indicus są identyczne.
P153.
Struktura genetyczna wybranych ras owiec na podstwie polimorfizmu białek
surowicy krwi.
Barbara Bojczuk (1), Tadeusz Rychlik (2)
(1) Akademia Świętokrzyska, Instytut Biologii, Zakład Genetyki, ul. Świętokrzyska 15, 25 – 406 Kielce
(2) Instytut Zootechniki, Zakład Immuno-Cytogenetyki Zwierząt, 32 – 083 Balice koło Krakowa, ul. Krakowska
Celem pracy było wykazanie różnic w częstści występowania allei i genotypów transferyny, albuminy i prealbuminy
w surowicy krwi owiec. Badaniami objęto 759 zwierząt rasy wrzosówka oraz mieszańce polskiej owcy nizinnej z mouton
charolaise i mieszańce merynosa polskiego z mouton charolaise. Polimorficzne formy albuminy i prealbuminy
oznaczano za pomocą elektroforezy w żelu skrobiowym, natomiast polimorfizm transeryny w żelu poliakrylamidowym.
130
Genetyka zwierząt
Przeprowadzone badania w trzech stadach owiec wykazały duże róznice wewnątrz i międzyrasowe w częstości alleli jak
i genotypów. W analizowanym materiale wykryto 15 alleli transferyny warunkujących 55 genotypów, 2 allele albuminy
warunkujące 2 genotypy oraz 3 allele prealbuminy warunkujące 6 genotypów. Spośród badanych stad owiec wrzosówka
okazała się najbardziej zróżnicowaną genetycznie. Stwierdzono u niej 44 genotypy transferyny. Genotyp TF C1 D1
(!6,3%) oraz allele transferyny C1 (0,3089) i D1 (0,1789) występowały z najwyższą częstością. Polimorfizm transferyny
stwierdzono jedynie u wrzosówki, pozostałe dwa badane stada były monomorficzne. Między badanymi stadami owiec
stwierdzono istotne różnice w częstości występowania alleli i genotypów transferyny, albuminy i prealbuminy
P154.
Autoradiograficzna identyfikacja amplikonów genów kodujących glikoproteiny
ciążowe PAG (Pregnancy-Associated Glycoprotein) w genomach taksonów:
Carnivora, Cetacea oraz Aves.
Grzegorz Panasiewicz (1), Marta Majewska (1), Krzysztof Kuber (1), Ewa Chmielnicka (1),
Kazimierz Zalewski (2), Bożena Szafrańska (1)
(1) Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie, Wydział Biologii, Katedra Fizjologii Zwierząt
(2) Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie, Wydział Biologii, Katedra Fizjologii i Biotechnologii Roślin
Kosmówkową lokalizację mRNA genów PAG zidentyfikowano na matrycach komplementarnego DNA (cDNA)
transkryptomów różnych łożyskowców (Placentalia: Artiodactyla, Perissodactyla, Carnivora, Rodentia). Dotychczas,
sekwencje cDNA genów PAG sklonowano (GenBank) jedynie u świń, bydła, owiec, kóz, klaczy, zebry, kotki, myszy oraz
jelenia. Celem badań była identyfikacja amplikonów PAG na matrycach genomowego DNA (gDNA) wyizolowanych
z leukocytów (LgDNA), cebulek włosowych (HRgDNA), lub archiwalnych tkanek kostnych (ARgDNA). Metodą PCR
amplifikowano gDNA taksonów drapieżnych (Carnivora): tchórza (Mustela putorius, Mustelidae-łasicowate), jenota
(Nyctereutes procyonoides, Canidae-psowate); ssaków morskich: walenia (Cetacea); lub ptaków (Aves): gęsi (Anser
anser) oraz kur (Gallus gallus domesticus). Autoradiograficzną identyfikację amplikonów PAG metodą Southern
wykonano z sondami wyprodukowanymi na matrycach cDNA genów klonowanych u świń: pPAG5 oraz pPAG8 (ORF:
404-1014 bp), które wyizolowano z trofoblastycznej biblioteki genowej, a następnie amplifikowano w plazmidach
transfekowanych bakterii E. coli szczepu XL1-Blue. Po raz pierwszy wykazano amplikony genów PAG-podobnych
w genomach taksonów: Mustelidae, Canidae, Cetacea oraz Aves, u których nie sklonowano dotychczas cDNA genów
PAG. Identyfikacja PCR/Southern wykazała różne genotypy PAG u poszczególnych osobników. Zidentyfikowano liczne
amplikony PAG na różnych matrycach genomowych: HRgDNA drapieżnych (tchórza: 490, 690 bp; jenota: dodatkowo
860 bp), LgDNA ptaków (gęsi: 329, 436, 544 bp; kur: 329, 436 i 865 bp) oraz ARgDNA walenia (570 i 760 bp). Uzyskane
wyniki identyfikacji Southern amplikonów PAG-podobnych powinny ułatwić klonowanie łożyskowego cDNA genów
PAG, natomiast zidentyfikowane sekwencje genów PAG mogą być wykorzystane do przygotowania selekcyjnych
testów genetycznych, pozwalających na przewidywanie zdolności reprodukcyjnych młodych osobników w oparciu
o identyfikację genotypu PAG na różnorodnych matrycach gDNA. *PBZKBN084/P06/02/3.4 oraz UWM020600.805�
P155.
Polimorfizm genu alfa-laktoalbuminy u krów naturalnie zakażonych wirusem
białaczki bydła.
Barbara Bojarojć-Nosowicz, Emilia Bongarc, Joanna Małolepszy, Ewa Kaczmarczyk
Katedra Genetyki Zwierząt, Wydział Bioinżynierii Zwierząt, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie
Gen alfa-laktoalbuminy (LALBA) wykazuje polimorfizm w części regulacyjnej genu. Wykazuje ponadto znaczną
homologię budowy z genem lizozymu. Sądzi się, że białkowy produkt genu LALBA uczestniczy w procesach
immunologicznych, lecz jego rola nie została dotychczas dokładnie poznana. Celem podjętych badań było określenie
zależności między polimorfizmem genu LALBA a podatnością krów na zakażenie naturalne wirusem białaczki bydła
(BLV). Badaniami objęto krowy w wieku 3-9 lat z jednego stada. Zakażenie BLV diagnozowano stosując serologiczny
test ELISA oraz molekularny test PCR. Polimorfizm genu LALBA identyfikowano w poz. –1689 regionu regulatorowego
genu stosując test PCR-RFLP. Amplifikowano fragment genu o długości 483 pz, a uzyskany produkt poddawano
trawieniu enzymem restrykcyjnym SduI. Uzyskane wyniki wskazują na częstsze występowanie zakażenia BLV u krów
o genotypach BB i AB.
131
Genetyka zwierząt
P156.
Polimorfizm restrykcyjny genu prolaktyny (PRL/RsaI) w stadzie krów o mlecznym
kierunku użytkowania.
Marek Kmieć (1), Zbigniew Sobek (2), Joanna Strzałka (1)
(1) Agricultural University of Szczecin, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Doktora Judyma 6, 71-466 Szczecin,
Poland
(2) Department of Genetics and Animal Breeding, August Cieszkowski Agricultural University of Poznań, ul. Wołyńska 33,
60-637 Poznań, Poland
Prolaktyna jest jednym z najbardziej wszechstronnych hormonów w organizmie i jako hormon białkowy wydzielana jest
przez część gruczołową przysadki mózgowej. Pełni ona w organizmach ssaków wiele funkcji biologicznych wpływając
m.in. na regulację funkcji reprodukcyjnych, odpornościowych, wzrost i różnicowanie komórek, jak również pełni
kluczową rolę w zapoczątkowaniu i podtrzymywaniu laktacji. Odpowiada również za syntezę białek, laktozy i tłuszczów
mleka oraz działa na pęcherzyki mlekotwórcze wzmagając syntezę oraz sekrecję białek mleka.
Gen prolaktyny ze względu na fizjologiczne funkcje jego produktu białkowego jest potencjalnym „genem kandydatem”
dla cech ilościowych i został on zlokalizowany w chromosomie 23. Wykazano już w nim istnienie kilku miejsc
polimorficznych, wśród których mutacja punktowa A→G w III eksonie rozpoznawana przez endonukleazę RsaI, która
nie powoduje zmiany w produkcie białkowym.
Badania przeprowadzono na 186 krowach rasy jersey utrzymywanych w jednym stadzie na terenie Wielkopolski.
Przy użyciu metody PCR-RFLP analizowano polimorfizm fragmentu genu o długości 156 pz z miejscem rozpoznawanym
przez enzym restrykcyjny RsaI rozpoznającym sekwencje GT↓AC. Analiza restrykcyjna pozwoliła na wykazanie
obecności dwóch alleli: PRLA – brak miejsca restrykcyjnego dla RsaI (156 pz) występującego z częstością 0,3090 oraz
allelu PRLB z miejscem restrykcji dla RsaI (82 i 74 pz) którego frekwencja wynosiła 0,6910. Stwierdzono występowanie
trzech genotypów na trzy możliwe: PRLAPRLA (0,0910), PRLAPRLB (0,4360) oraz PRLBPRLB (0,4730).
Przeprowadzona analiza zależności pomiędzy polimorfizmem genu prolaktyny PRL/RsaI a niektórymi cechami
użytkowości mlecznej w trzech pierwszych laktacjach, analizowanego stada krów rasy jersey wykazała istotne statystycznie
różnice pomiędzy zwierzętami o różnych genotypach PRL/RsaI w wydajności tłuszczu i białka w I laktacji.
P157.
Kształtowanie się niektórych cech użytkowości mlecznej w stadzie krów czerwonobiałych z różnymi wariantami genu somatoliberyny (GHRH/HaeIII).
Marek Kmieć (1), Inga Kowalewska (1), Hanna Kulig (1), Adam Lepczyński (1), Heliodor Wierzbicki (2),
Witold Pietrzyk (1)
(1) Agricultural University of Szczecin, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Doktora Judyma 6, 71-466 Szczecin,
Poland
(2) Agricultural University of Wrocław, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Kożuchowska 7, 51-631 Wrocław,
Poland
Somatoliberyna (GHRH) jest hormonem przysadkowym, który stymuluje syntezę i wydzielanie przysadkowego hormonu
wzrostu (GH). Powoduje ona wzrost stężenia endogennego hormonu wzrostu surowicy krwi, zwiększając średnie oraz
pulsacyjne uwalnianie somatotropiny, przez co wpływa na zwiększenie produkcyjności krów, stymulując wytwarzanie
mleka podobnie jak bST. Gen somatoliberyny (GHRH) zlokalizowano u bydła w chromosomie 13 i wchodzi on w skład
grupy syntenicznej U11. Chcąc doskonalić wydajność i jakość mleka, które są cechami ilościowymi, należy skupić się
na identyfikacji loci genów odpowiedzialnych za dziedziczenie tych cech tzw. QTL (quantitative trait loci) bądź genów
z nimi sprzężonych tzw. markerów genetycznych. Badania zależności między QTL lub markerami genetycznymi
a cechami użytkowości mlecznej prowadzone są na szeroką skalę.
Celem przeprowadzonych badań była detekcja mutacji w genie somatoliberyny oraz ustalenie zależności pomiędzy
polimorficznymi formami genu GHRH/HaeIII, a cechami użytkowości mlecznej. Badaniami objęto stado 721 krów
czerwono-białych z różnym udziałem genów bydła holsztyńsko-fryzyjskiego. Genotypy GHRH oznaczano poprzez
zastosowanie techniki PCR-RFLP. Amplifikowano fragment DNA o długości 297 par zasad, stosując specyficzne
sekwencje starterowe. Analiza restrykcyjna prowadzona przy użyciu endonukleazy HaeIII wykazała istnienie
polimorfizmu w wybranym fragmencie genu. Stwierdzono następujące częstości genotypów: GHRHAGHRHA – 0,0957;
GHRHAGHRHB – 0,3689 oraz GHRHBGHRHB – 0,5354. Częstość alleli wynosiła dla allelu GHRHA – 0,2802 i dla allelu
GHRH B – 0,7198. Otrzymane wyniki z przeprowadzonej analizy zależności dla trzech kolejnych laktacji pomiędzy
genotypami GHRH/HaeIII a badanymi cechami użytkowości mlecznej (wydajność mleka, tłuszczu i białka; zawartość
132
Genetyka zwierząt
tłuszczu i białka; suma wydajności tłuszczu i białka) sugerują możliwości wykorzystania istniejącego polimorfizmu
genu GHRH w doskonaleniu niektórych cech użytkowości mlecznej krów czerwono-białych.
P158.
Polimorfizm genu hormonu wzrostu (GH/AluI & GH/MspI) w stadzie krów
o mlecznym kierunku użytkowania.
Marek Kmieć (1), Inga Kowalewska (1), Witold Pietrzyk (1), Heliodor Wierzbicki (2)
(1) Agricultural University of Szczecin, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Doktora Judyma 6, 71-466 Szczecin,
Poland
(2) Agricultural University of Wrocław, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Kożuchowska 7, 51-631 Wrocław,
Poland
Hormon wzrostu jest białkiem produkowanym w przednim płacie przysadki mózgowej. Jest hormonem typu
anabolicznego, dlatego stymuluje tempo podziałów komórkowych i jest odpowiedzialny za proces różnicowania się
niektórych typów komórek. Wykazano doświadczalnie jego wpływ na proces produkcji mleka u bydła i przyrosty
masy ciała u zwierząt hodowlanych. Poznane funkcje fizjologiczne i biochemiczne hormonu wzrostu spowodowały, że
gen hormonu wzrostu został wytypowany jako jeden z „genów kandydatów” typowanych jako przypuszczalne loci dla
cech ilościowych u bydła. Celem obecnie prowadzonych badań nad wpływem polimorfizmu na cechy użytkowe bydła
jest zidentyfikowanie polimorfizmu na poziomie DNA, który powstał w wyniku mutacji punktowych w obrębie genu,
bowiem mutacje w częściach strukturalnych oraz regulatorowych genów mogą wpływać na poziom cech ilościowych.
W przeprowadzonych badaniach wykorzystano technikę PCR-RFLP do określenia wpływu polimorfizmu w V eksonie
(AluI) oraz w III intronie (MspI) genu hormonu wzrostu w stadzie liczącym 724 krowy rasy czerwono-białej hodowanych
na terenie Opolszczyzny na wybrane cechy użytkowości mlecznej. W analizowanym stadzie wykazano występowanie
dwóch alleli dla polimorfizmu GH/AluI: GHL (0,9040) oraz GHV (0,0960) oraz występowanie dwóch genotypów na
trzy możliwe GHLGHL występującego z częstością 0,8080 oraz genotypu GHLGHV występującego z częstością 0,1920.
Genotypu GHVGHV w badanym stadzie krów mlecznych nie stwierdzono. Natomiast analiza polimorfizmu GH/MspI
wykazała obecność dwóch alleli: GH+, który występował z częstością 0,8174 oraz GH– występującego z frekwencja 0,1826.
Frekwencja genotypu GH+GH+ wynosiła 0,6460, genotypu GH+GH– – 0,3430, natomiast genotypu GH-GH– – 0,0110.
Analiza statystyczna wykazała zróżnicowanie cech użytkowych w badanym stadzie krów mlecznych w zależności tylko
od polimorfizmu GH/MspI w genie hormonu wzrostu.
P159.
Wpływ polimorfizmu LEP/HphI na wybrane cechy użytkowości mlecznej stada krów
rasy nizinnej czerwono-białej.
Marek Kmieć, Hanna Kulig, Witold Pietrzyk
Agricultural University of Szczecin, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Doktora Judyma 6, 71-466 Szczecin,
Poland
Chcąc doskonalić wydajność i jakość mleka, które są cechami ilościowymi, należy skupić się na identyfikacji loci
genów odpowiedzialnych za dziedziczenie tych cech tzw. QTL (quantitative trait loci) bądź genów z nimi sprzężonych
tzw. markerów genetycznych. Badania zależności między QTL lub markerami genetycznymi a cechami użytkowości
mlecznej prowadzone są na szeroką skalę. Szczególnym zainteresowaniem cieszą się dwie grupy cech, mianowicie
wydajność mleka, białka i tłuszczu (kg) oraz zawartość białka i tłuszczu w mleku (%). Polimorfizm sekwencji DNA
może wpływać na zróżnicowanie cech ilościowych, a to skłania do poszukiwania zależności miedzy polimorfizmem
PCR-RFLP a cechami użytkowymi. Celem przeprowadzonych badań była detekcja mutacji w genie leptyny oraz
ustalenie średniej wydajności mleka, tłuszczu, białka i procentowej zawartości tłuszczu i białka w mleku krów z różnymi
wariantami genetycznymi genu leptyny. Badaniami objęto stado 197 krów nizinnych czerwono-białych. Miejsce
polimorficzne zlokalizowane w drugim eksonie genu, w którym zachodzi tranzycja C→T, a na poziomie białka następuje
substytucja Ala/Val, wykrywano endonukleazą HphI po zastosowaniu specyficznych sekwencji starterowych. Analiza
restrykcyjna wykazała istnienie polimorfizmu w wybranym fragmencie genu wielkości 331 pz. Stwierdzono następujące
częstości genotypów: LEPALEPA – 0,5888; LEPALEPB – 0,3756 oraz LEPBLEPB – 0,0356. Częstość alleli wynosiła dla
allelu LEPA 0,7766 i dla allelu LEPB – 0,2234. Statystyczna analiza zależności przeprowadzona dla trzech kolejnych
laktacji (średnia wydajność mleka w laktacji wynosiła: dla I laktacji – 6322kg; II laktacji – 7352 kg oraz w III laktacji
– 7940 kg) wykazała istotne (P ≤ 0,05) zależności pomiędzy genotypami LEP/HphI a badanymi cechami użytkowości
mlecznej krów czerwono-białych hodowanych w jednym z ośrodków hodowlanych na terenie Opolszczyzny.
133
Genetyka zwierząt
P160.
Polimorfizm w genie CYP21/HaeIII stada loch rasy wielka biała polska.
Marek Kmieć, Arkadiusz Terman
Agricultural University of Szczecin, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Doktora Judyma 6, 71-466 Szczecin,
Poland
Postęp w badaniach genomu świni umożliwił identyfikację polimorficznych loci pojedynczych genów kontrolujących
cechy reprodukcyjne, o których wiadomo, że mają albo mogą mieć wpływ na poziom reprodukcji tych zwierząt. Gen
21– (hydroksylazy) steroidowej zlokalizowany jest w 7 chromosomie świni w segmencie DNA pomiędzy regionami SLA
klasy I i SLA klasy II. Składa się on z około 3050 par zasad, zawiera 10 eksonów oddzielonych przez introny i koduje
białko o 492 aminokwasach. Celem przeprowadzonych badań była detekcja mutacji w genie CYP21 oraz ustalenie
zależności między poszczególnymi wariantami genetycznymi CYP21 a wybranymi cechami użytkowości rozrodczej
loch.
Badania przeprowadzono w stadzie świń rasy wielkiej białej polskiej składającym się z 248 loch. Metodą PCR-RFLP
określono częstość występowania mutacji w genie CYP21 przy użyciu enzymu restrykcyjnego HaeIII. Zastosowano
następujący profil termiczny reakcji PCR: denaturacja wstępna 95şC – 3 min, następnie 30 cykli – (95şC/1 min, 72şC/1
min) wydłużanie końcowe 72şC/5 min. Produkt PCR wielkości 1271 pz trawiono 5 jednostkami endonukleazy HaeIII.
Rozdział fragmentów restrykcyjnych DNA prowadzono w 2% żelach agarozowych. Zidentyfikowano dwa allele genu
CYP21: allel CYP21A– 448 pz i allel CYP21B – 350 i 98 pz. Alel CYP21A występował z częstością 0,2742, natomiast
allel CYP21B z częstością 0,7258. W badanym stadzie świń genotyp CYP21ACYP21A występował z częstością 0,0242,
CYP21ACYP21B z częstością 0,5000 natomiast genotyp CYP21B CYP21B z częstością równą 0,4758. Prowadzona analiza
zależności między wariantami genetycznymi genu CYP21/HaeIII, a cechami charakteryzującymi użytkowość rozrodczą
loch (liczba prosiąt urodzonych żywych i martwych oraz liczba prosiąt odchowanych jak i odsetkiem upadków w okresie
odchowu) wykazała szereg różnic pomiędzy lochami z różnymi genotypami CYP
P161.
Polimorfizm genu hormonu wzrostu (GH/ApaI & GH/CfoI) w stadzie świn rasy
wielkiej białej polskiej (WBP).
Marek Kmieć, Inga Kowalewska, Filip Napierała
Agricultural University of Szczecin, Department of Genetics and Animal Breeding,
ul. Doktora Judyma 6, 71-466 Szczecin, Poland
Wyniki projektu badania genomu świni (PigMap) umożliwiają rozszerzenie badań nad poszukiwaniem kolejnych
polimorficznych loci pojedynczych genów, których produkty białkowe wpływają na kształtowanie się cech ilościowych
– QTL (quantitative trait locus). W ostatnich latach pojawiły się doniesienia o bezpośrednim oddziaływaniu GH
na męskie i żeńskie procesy rozrodcze. Celem przeprowadzonych badań była detekcja mutacji w genie GH oraz
ustalenie zależności między poszczególnymi wariantami genetycznymi genu hormonu wzrostu (GH/ApaI & GH/CfoI)
a badanymi cechami reprodukcyjnymi stada świń (liczba prosiąt żywo i martwo urodzonych w I, II, III, IV i dalszych
miotach loch, liczba prosiąt odsadzonych, wiek loch w dniu oproszenia). Badania przeprowadzono w stadzie 227 loch
rasy wbp. Polimorfizm genu GH określoną metodą PCR-RFLP. W wyniku zastosowania specyficznych sekwencji
starterowych uzyskiwano produkt wielkości 605 pz, który poddawany był działaniu dwóch endonukleaz – ApaI oraz
CfoI. Dla polimorfizmu GH/ApaI zidentyfikowano dwa allele: GHA (0,4955) i GHB (0,5045), które kontrolowały
występowanie trzech genotypów: GHAGHA (0,1810), GHAGHB (0,6290) oraz genotypu GHBGHB (0,1900). Obliczone
frekwencje genotypów oraz frekwencje genotypów homozygotycznych istotnie (P ≤ 0,01) odbiegały od frekwencji
przewidywanych dla populacji w stanie równowagi genetycznej.
Analizując polimorfizm GH/CfoI wykazano obecność czterech alleli: C1 (0,0903), C2 (0,0529), C3 (0,0661) oraz allelu
C4 (0,7907), które kontrolowały występowanie pięciu genotypów: C1C3 – 0,0040; C1C4 – 0,1760; C2C4 – 0,1060; C3C4
– 0,1280 oraz genotypu C4C4 – 0,5860. Obliczone frekwencje genotypów oraz frekwencje genotypów homozygotycznych
nie odbiegały istotnie od frekwencji przewidywanych dla populacji w stanie równowagi genetycznej.
Uzyskane wyniki z przeprowadzonej analizy zależności wskazują na możliwości wykorzystania polimorfizmu GH/ApaI
i GH/CfoI w doskonaleniu cech użytkowości rozrodczej świń.
134
Genetyka zwierząt
P162.
Polimorfizm w genie leptyny w powiązaniu z ilością komórek somatycznych
i dzienną wydajnością mleka u bydła mlecznego.
Hanna Kulig, Marek Kmieć, Katarzyna Wojdak-Maksymiec, Inga Kowalewska, Arkadiusz Terman
Department of Genetics and Animal Breeding, Agricultural University of Szczecin, ul. Doktora Judyma 6, 71– 466 Szczecin,
Poland
Sugeruje się, że gen leptyny może być ważnym markerem dla cech użytkowych bydła. Leptyna jest hormonem
polipeptydowym o masie cząsteczkowej 16 kDa, produkowanym głównie przez komórki tłuszczowe. Mniejsze ilości
leptyny są także syntetyzowane w łożysku i gruczole mlekowym w czasie laktacji. Bierze ona udział w regulacji pobierania
pokarmu i wydatkowania energii. Ponadto wpływa na reprodukcję oraz działanie układu wewnątrzwydzielniczego
i odpornościowego.
Podjęte badania miały na celu ustalenie czy istnieją zależności między genotypami leptyny (LEP/HphI) a zawartością
komórek somatycznych i dzienną wydajnością mleka u bydła o mlecznym kierunku użytkowania.
Badaniami objęto 124 krowy rasy czarno-białej z różnym udziałem genów bydła hf utrzymywanych w jednym stadzie
na terenie Pomorza. Oznaczanie genotypów przeprowadzono przy użyciu metody PCR-RFLP. Amplifikowano fragment
genu leptyny o długości 331 par zasad zlokalizowany w trzecim (drugim ulegającym translacji) eksonie. Częstość
występowania genotypów i alleli LEP/HphI była następująca: AA – 0,605, AB – 0,363, BB – 0,032, A – 0,786, B – 0,214.
Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w zawartości komórek somatycznych w mleku pomiędzy krowami
o różnych genotypach. Osobniki te różniły się natomiast statystycznie istotnie (P≤0,01) w zakresie dziennej wydajności
mleka. Najwyższe wartości tej cechy osiągały krowy z genotypem AA. Analiza uzyskanych wyników wskazuje na
możliwość wykorzystania polimorfizmu LEP/HphI w doskonaleniu dziennej wydajności mleka. Doskonaląc tę cechę,
należałoby preferować krowy z genotypem LEP/HphI AA. Kontynuowanie badań w tym zakresie pozwoli zweryfikować
otrzymane wyniki przed ich ewentualnym wykorzystaniem w programach selekcji bydła mlecznego.
P163.
Porównanie metod izolacji DNA z archiwalnych łusek troci (Salmo trutta).
Aleksandra Benedycka, Robert Szymańczak, Jerzy Sell
Katedra Genetyki i Cytologii, Uniwersytet Gdański, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk
Gromadzone systematycznie od ponad wieku łuski ryb z rodzaju Salmo można znaleźć w wielu instytutach rybactwa na
całym świecie. Zbiory te stały się nieocenionym źródłem DNA, umożliwiając badania zmian zróżnicowania genetycznego
populacji tych ryb w czasie. Pozyskiwanie i analizy DNA pochodzącego z muzealnych zbiorów łusek ryb napotykają na
szereg problemów technicznych i metodycznych. Na przykładzie gatunku Salmo trutta autorzy przedstawiają sposoby
rozwiązania tych trudności oraz wykorzystania otrzymanych wyników w zakresie genetyki populacyjnej ryb.
P164.
Wpływ polimorfizmu w rejonie promotorowym genu STAT5a na ekspresję genu
w wątrobie u bydła i wiązanie czynnika transkrypcyjnego HNF3.
Krzysztof Flisikowski, Rafał Radosław Starzyński, Lech Zwierzchowski
Zakład Biologii Molekularnej, Instytut Genetyki i Hodowli Zwierzat, Polska Akademia Nauk, Jastrzębiec, 05-552 Wólka
Kosowska
Czynnik transkrypcyjny STAT5a należy do rodziny przekaźników sygnałów i aktywatorów transkrypcji. Pośredniczy
w aktywacji przez prolaktynę genów białek mleka oraz w aktywacji genów regulowanych przez hormon wzrostu (GH).
W wyniku aktywacji receptora prolaktyny lub GH na powierzchni komórki przez odpowiedni ligand dochodzi do
uaktywnienia cytoplazmatycznego czynnika STAT5, który migruje do jądra komórkowego i łącząc się z sekwencją
określaną mianem GAS γ-interferon activated sequence) w promotorach genów docelowych powoduje aktywację
transkrypcji genu. Różne formy polimorficzne czynnika STAT5a mogą wykazywać różne powinowactwo do genów
białek mleka powodując różnice ich ekspresji, co może mieć wpływ na wydajność mleczną, skład mleka lub tempo
wzrostu. Dlatego geny STAT5 są oczywistymi kandydatami na markery cech ilościowych u zwierząt gospodarskich.
Przy wykorzystaniu techniki PCR-HD i sekwencjonowania zidentyfikowaliśmy nowy polimorfizm w pozycji –488
pz (substytucja A/G) w promotorze genu STAT5a bydła. W miejscu tym zlokalizowane jest miejsce dla przyłączania
się czynnika transkrypcyjnego HNF-3, dlatego też mutacja może mieć wpływ na ekspresję genu STAT5a. Używając
RT-PCR, Real-Time PCR i Western blotting, stwierdziliśmy statystycznie istotnie wyższa ekspresję genu STAT5A
w wątrobach pobranych od zwierząt o genotypie AA niż u tych o genotypie GG. Dodatkowo, przeprowadzając analizę
135
Genetyka zwierząt
EMSA stwierdziliśmy, że tranzycja A→G w pozycji –488 pz zwiększa wiązanie sondy (zawierającej miejsce przyłączanie
dla czynnika transkrypcyjnego HNF-3) do białek jądrowych wyizolowanych z bydlęcej wątroby. Nasze wyniki sugerują
regulatorowe znaczenie tego miejsca dla działania czynnika STAT5A.
P165.
Analiza preferencji w składzie nukleotydowym genu cytochromu b mtDNA
u kręgowców.
Beata Prusak (1), Tomasz Grzybowski (2)
(1) Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN, Jastrzębiec
(2) Zakład Genetyki Molekularnej i Sądowej, Akademia Medyczna Bydgoszcz
Cytochrom b jest centralnym ogniwem III kompleksu oksydacyjnofosforylacyjnego i jako jedyne białko tego kompleksu
kodowane jest przez gen umiejscowiony w genomie mitochondrialnym. Białko to odgrywa kluczową rolę w procesie
oddychania komórkowego. W związku z występowaniem specyficznych mutacji w genie cytochromu b u ludzi i zwierząt,
rozpoznano szereg dysfunkcji mitochondrialnych, zwłaszcza miopatii. Celem przeprowadzonych badań była analiza
polimorfizmu sekwencji genu cytochromu b u 14 gatunków kręgowców pod kątem określenia występowania preferencji
w składzie nukleotydowym, co mogłoby być miernikiem konserwatywności sekwencji genu i sprawności biologicznej
białka. Zidentyfikowane sekwencje nukleotydowe przetwarzano na odpowiadające im sekwencje aminokwasowe
wykorzystując program BioEdit Sequence Alingment Editor. Wykazano, że w poszczególnych pozycjach występują
charakterystyczne preferencje w składzie kodonów (określane jako codon bias), które są najsilniejsze dla trzeciej pozycji.
Ponadto u większości badanych gatunków występowała w nici lekkiej znaczna przewaga adeniny nad cytozyną, a gatunki
z rzędu parzystokopytnych charakteryzowały się znaczną przewagą puryn. Większość podstawień występujących
w sekwencjach aminokwasowych dotyczyła aminokwasów hydrofobowych. Region obejmujący fragment centrum Qo
oraz charakterystyczne dla cytochromu b pozycje histydyny (nr 82 i nr 96) będące ligandami hemu, były u wszystkich
wysoce konserwatywne (100 %). Wyniki wskazują, że polimorfizm sekwencji genu cytb mtDNA jest znaczny, lecz
zmiany te mają charakter podstawień synonimowych. Analiza różnic występujących w sekwencji nukleotydowej
u różnych grup systematycznych jest więc dobrym modelem przy dokonywaniu porównań filogenetycznych. Natomiast
ogromna konserwatywność sekwencji białka cytochromu b jest dogodnym narzędziem do diagnozowania dysfunkcji
w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym.
P166.
Warianty alleliczne histonu H1.z różnią się w C-końcowych rejonach cząsteczek.
Andrzej Kowalski, Jan Pałyga, Ewa Górnicka-Michalska
Zakład Genetyki, Instytut Biologii, Akademia Świętokrzyska, Kielce
Różnorodność histonów H1 warunkują warianty niealleliczne, które niejednokrotnie wykazują charakter polimorficzny.
We wszystkich zbadanych dotychczas przypadkach formy alleliczne odróżnia występowanie zmiennych fragmentów
w domenach N– lub C-końcowych ich cząsteczek.
Histony H1.z erytrocytów kaczki pekińskiej (Pałyga i wsp., 1993) i piżmowej (Kowalski i wsp., 2004) są białkami
polimorficznymi. W populacjach obu gatunków kaczki wykryto dwie izoformy H1.z1 i H1.z2, które w dwuwymiarowym
żelu poliakryloamidowym różniły się ruchliwością elektroforetyczną, wykazując jednocześnie charakterystyczne dla
danego gatunku położenie względem najbliżej wędrującego podtypu H1.a.
Do specyficznego trawienia polimorficznych form H1.z zastosowano N-bromoimid kwasu bursztynowego (NBS), który
rozkłada cząsteczkę histonu H1 przy pojedynczej reszcie tyrozyny. W żelu poliakryloamidowym zawierającym sodowy
dodecylosiarczan (SDS), porównano mapy polipeptydowe otrzymane w wyniku cięcia NBS-em histonów H1.z1 i H1.z2
kaczki piżmowej i pekińskiej. Różnice w ruchliwości elektroforetycznej C-peptydów otrzymanych z izoform H1.z1 i H1.
z2 kaczki piżmowej przypominały wzory elektroforetyczne C-peptydów uzyskanych pod wpływem działania NBS-u na
histony H1.z1 i H1.z2 kaczki pekińskiej (Pałyga i wsp., 1993).
Analizy przeprowadzone z użyciem NBS-u wskazują, że zmiany w składzie aminokwasowym, warunkujące występowanie
odmian allelicznych histonów H1.z obu badanych gatunków kaczki, lokalizują się w części C-końcowej cząsteczki.
Pałyga, J., Górnicka-Michalska, E., Kowalski, A. (1993) Genetic polymorphism of histone H1.z in duck erythrocytes.
Biochem. J. 294, 859-863
Kowalski, A., Pałyga, J., Górnicka-Michalska, E. (2004) Identification of histone H1.z components in a Muscovy duck
(Cairina moschata L.) population. Comp. Biochem. Physiol. Part B 137, 151-157
136
Genetyka zwierząt
P167.
Specjacja wewnątrzjeziorna na przykładzie endemicznych równonogów (Isopoda)
z reliktowego Jeziora Ochrydzkiego.
Tadeusz Sywula, Jerzy Sell, Adrianna Kozera, Marta Budny, Karolina Nowopolska, Lucyna Pobłocka
Katedra Genetyki i Cytologii, Uniwersytet Gdański, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk
Jezioro Ochrydzkie znajdujące się na granicy Macedonii i Albanii i otoczone wysokimi łańcuchami górskimi, zajmuje
unikalną pozycję wśród europejskich jezior. Jest to duże (powierzchnia 358.176 m2), głębokie (średnia głębokość
wynosi 163,71 m), oligotroficzne, reliktowe jezioro bogate w endemiczną faunę, która przetrwała tutaj od trzeciorzędu,
stanowiąc obecnie doskonały materiał do badań nad procesami specjacji wewnątrzjeziornej.
Jezioro Ochrydzkie zamieszkują cztery gatunki ośliczek należące do rodzaju Asellus: A. remyi Monod (1932),
A. arnautovici Remy (1932), A. gjorgievici Karaman (1932), i A. aqaticus Linneusz (1758). Pierwsze trzy są endemiczne
i należą do podrodzaju Proasellus, a A. aquaticus należy do podrodzaju nominatywnego.
Każdy z trzech endemicznych gatunków jest reprezentowany przez dwie lub trzy formy. Tak więc A. gjorgjevici posiada
dwie formy (gjorgjevici i litoralis), A. remyi trzy formy (remyi, acutangulus, nudus), A. aranautovici dwie (aranautovici,
elongatus). Dla porównania na obszarze Polski występują tylko dwa gatunki rodzaju Asellus, nie zróżnicowane na
formy.
Badania enzymogenetyczne ujawniły istotne statystycznie różnice we frekwencjach alleli między formami
morfologicznymi poszczególnych gatunków, zasiedlającymi strefy jeziora o odmiennych warunkach środowiskowych,
do poziomu alleli prywatnych włącznie. Co więcej, zróżnicowanie genetyczne zaobserwowano także między populacjami
formy ze źródeł i sublitoralu A. remyi var. remyi ze źródeł i sublitoralu.
Przyczyn stwierdzonego zróżnicowania genetycznego badanych form można upatrywać w procesach specjacyjnych
o podłożu ekologicznym.
P168.
Czy endemiczne ośliczki z Jeziora Ochrydzkiego stanowią grupę monofiletyczną?
Adrianna Kozera, Anna Wysocka
Uniwersytet Gdański, Katedra Genetyki i Cytologii, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk
Jezioro Ochrydzkie (powierzchnia 358.176 m2) usytuowane na granicy dwóch państw: Macedonii i Albanii i otoczone
wysokimi łańcuchami górskimi zajmuje unikalną pozycję wśród europejskich jezior. Jest to głębokie (średnia głębokość
wynosi 163,71 m), oligotroficzne, reliktowe jezioro bogate w endemiczną faunę, która przetrwała tutaj od trzeciorzędu,
stanowiąc obecnie doskonały materiał do badań nad procesami specjacji wewnątrzjeziornej.
Jezioro Ochrydzkie zamieszkują cztery gatunki ośliczek należące do rodzaju Asellus. Wśród nich wyróżniamy trzy
endemiczne gatunki zaliczane do podrodzaju Proasellus, z których każdy jest reprezentowany przez dwie lub trzy
formy. Tak więc A. remyi Monod (1932) posiada trzy formy (remyi, acutangulus, nudus), A. arnautovici Remy (1932)
dwie (aranutovici, elongatus), A. gjorgievici Karaman (1932) dwie (gjorgjevici i litoralis). Czwartym gatunkiem
obserwowanym w jeziorze jest szeroko rozpowszechniony w Europie A. aqaticus Linneusz (1758), należący do
podrodzaju nominatywnego.
Celem badań jest ustalenie relacji filogenetycznych pomiędzy wymienionymi gatunkami z podrodzaju Proasellus przy
A. (Asellus) aquaticus jako grupie zewnętrznej na podstawie analizy sekwencji genu COI mtDNA i 16SrDNA.
Wstępne analizy filogenetyczne wskazują na prawdopodobną polifiletyczność grupy endemicznych gatunków ośliczek
z Jeziora Ochrydzkiego. Na szczególną uwagę zasługują bliższe związki A. arnautovici var. elongatus z A. gjorgjevici
niż z formą nominatywną A. arnautovici var. arnautovici. determinują selekcjonowaną cechę aktywności w otwartym
polu.
P169.
Badanie ekspresji genów receptora gonadoliberyny, podjednostki β lutropiny oraz
genu receptora progesteronu w przysadce mózgowej i podwzgórzu szczura.
Bartosz Kempisty, Katarzyna Mel, Wiesław H. Trzeciak
Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej Akademii Medycznej im. K. Marcinkowskiego, ul. Święcickiego 6,
60-781 Poznań
Zespół policystycznych jajników (PCOS) jest złożonym schorzeniem ednokrynologicznym występującym u kobiet
w wieku rozrodczym. Do najważniejszych objawów klinicznych należą podwyższony poziom lutropiny (LH),
hiperandrogenizm oraz hiperinsulinemia. Dużą rolę w patogenezie PCOS odgrywa układ podwzgórzowo-przysadkowy,
137
Genetyka zwierząt
aktywujący syntezę androgenów poprzez stymulujący wpływ LH na komórki osłonki pęcherzyków.Celem pracy było
zbadanie ekspresji genów GnRHR, LHβ oraz PR w przysadce mózgowej i podwzgórzu szczura w warunkach in vivo
po iniekcji insuliny oraz in vitro po inkubacji z GnRH i progesteronem. Materiał do badań stanowiły samice szczurów
szczepu Wistar w wieku około 120 dni. W doświadczeniu in vivo szczury poddawano domięśniowej iniekcji insuliną
w dawce 4 jednostek/100 g m.c. Po 12 godz. zwierzęta dekapitowano, po czym pobierano przysadkę mózgową oraz
podwzgórze.W doświadczeniu in vitro hodowano komórki przedniego płata przysadki mózgowej do osiągnięcia
monowarstwy ciągłej. Komórki inkubowano przez 24 godz. z GnRH (50 lub 100 pmol/ml) oraz progesteronem (50 lub
100 pmol/ml). Z podwzgórza i przysadki mózgowej, jak również z inkubowanych komórek wyizolowano RNA, a PoliA+
RNA przepisywano odwrotnie (RT-PCR). cDNA odpowiadające GnRHR, LHb oraz PR amplifikowano przy użyciu
specyficznych starterów. Poziomu ekspresji genów oszacowano densytometrycznie wykorzystując program LabImage
2.7 Demo. Wykazano: stymulujące działanie GnRH na ekspresję LHβ, hamujący wpływ progesteronu na ekspresję LHβ
w przysadce mózgowej oraz zbliżony poziom ekspresji PR w przysadce mózgowej i podwzgórzu. Wykazano stymulujące
działanie insuliny na poziom ekspresji GnRHR w przysadce mózgowej. Ponadto stwierdzono, że insulina działa hamująco
na ekspresję PR na poziomie przysadki. Znacznie słabszy jest hamujący wpływ insuliny na ekspresję PR na poziomie
podwzgórza.. Uzyskane wyniki pozwalają przypuszczać, że zwiększenie ekspresji GnRHR pod wpływem insuliny może
powodować zwiększenie wydzielania GnRH przez komórki podwzgórza. GnRH z kolei pobudza ekspresję genu LHβ
Z drugiej zaś strony insulina blokuje ekspresję PR, a więc mogłaby osłabiać efekt hamowania wydzielania LH przez
komórki przedniego płata przysadki mózgowej.
P170.
Struktura genów czynników transkrypcyjnych CREB i CEBPα świni, zaangażowanych
w adipogenezę.
Agata Chmurzyńska, Marek Świtoński
Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza, Poznań
Adipogeneza jest wieloetapowym procesem różnicowania komórek, rozumianym jako zmiana ekspresji genów
powodująca przejście komórki od stanu multipotentnego do końcowego fenotypu dojrzałych adipocytów. Na
adipogenezę wpływa łączne oddziaływanie wielu czynników, w tym hormonów, czynników wzrostowych, cytokin,
prostaglandyn, składników macierzy wewnątrzkomórkowej, a także kilku rodzin czynników transkrypcyjnych. Za
kluczowe, spośród czynników transkrypcyjnych, uważa się przede wszystkim białka (ang. CCAAT/enhancer-binding
protein), PPARγ (ang. peroxisome proliferator-activated receptor), a być może również CREB (ang. cAMP response
element binding protein).Gen C/EBPα zbudowany jest z jednego eksonu, natomiast CREB składa się z 11 eksonów,
które w wyniku alternatywnego splicingu tworzą odmienne formy białka.
Celem badań było poszukiwanie polimorfizmu w obrębie części kodującej genów CREB i C/EBPα świni. Analizą objęto
zwierzęta następujących ras: wielka biała polska, polska biała zwisłoucha, duroc, hampshire, pietrain, złotnicka biała,
złotnicka pstra, puławska, wietnamska oraz jedną syntetyczną linię świń, a także dzika.
Poszukiwanie polimorfizmu wykonywano techniką SSCP, w różnych warunkach temperaturowych oraz w żelach
z dodatkiem lub bez dodatku glicerolu. Przeanalizowano dotychczas siedem eksonów genu CREB i w żadnym z nich
nie znaleziono wariantów allelicznych. Ponadto, badano dwa fragmenty DNA tworzące 3’-końcową część genu C/EBPα.
Również w tym przypadku nie znaleziono żadnego polimorfizmu. Analizowane fragmenty DNA sekwencjonowano,
a otrzymane sekwencje nukleotydowe porównywano z ich odpowiednikami u człowieka.
P171.
Porównawcza lokalizacja chromosomowa ośmiu genów w genomie czterech
gatunków z rodziny Canidae.
I. Szczerbal (1), J. Klukowska (2), A.Piasecka-Wengi (3), C. Schelling (3), A. Gmur (2), G. Dolf (2), M. Świtoński (1)
(1) Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza im. A.Cieszkowskiego w Poznaniu
(2) Uniwersytet w Bernie (Szwajcaria)
(3) Szwajcarski Federalny Instytut Technologiczny w Zurychu
Badaniami objęto cztery gatunki z rodziny psowatych (Canidae): psa (Canis familiaris), lisa pospolitego (Vulpes
vulpes),lisa polarnego (Alopex lagopus) i jenota chińskiego (Nyctereutes procyonoides procyonides). Wykorzystując
ludzkie startery dla genów: ABCA4, ESR2, LEP, INSL3, HBB, TPH, ATPA2 i PAX3 przeszukiwano genomową bibliotekę
psa, sklonowaną w wektorach BAC-owych. W wyselekcjonowanych klonach poza sekwencjami charakterystycznymi
dla wybranych genów zidentyfikowano również sekwencje mikrosatelitarne. Sondy użyto w eksperymentach FISH,
na preparatach cytogenetycznych poddanych barwieniu prążkami Q. Lokalizacja chromosomowa wykorzystanych
138
Genetyka zwierząt
sond była zgodna z wcześniejszymi wynikami uzyskanymi przez innych autorów za pomocą techniki „malowania
chromosomów”. Porównawcza analiza położenia wybranych markerów w chromosomach czterech gatunków psowatych
wskazała na wystąpienie, w ewolucji kariotypów tych gatunków, inwersji paracentrycznej fragmentu chromosomowego,
w którym zlokalizowany jest gen ATPA2.Wykonane badania istotnie zwiększają nasycenie cytogenetycznej mapy
genomu lisów i jenota, a także psa.
P172.
Polimorfizm w promotorze genu leptyny bydła oraz jego wpływ na wiązanie
czynnika transkrypcyjnego Sp1.
Tatiana Adamowicz (1), Krzysztof Flisikowski (2) Rafał Radosław Starzyński (2), Lech Zwierzchowski (2),
Marek Świtoński (1)
(1) Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli ZwierzątAkademia Rolnicza w Poznaniu
(2) Zakład Biologii Molekularnej, Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN w Jastrzębcu
Leptyna (LEP) jest białkiem wydzielanym głównie przez komórki tłuszczowe, wpływającym na proces pobierania
pokarmu, metabolizm, cechy reprodukcyjne oraz system odpornościowy ssaków. Do tej pory wskazano na istnienie
licznych związków pomiędzy polimorfizmem tego genu i cechami produkcyjnymi bydła (wydajność mleczna, cechy
reprodukcyjne oraz otłuszczenie). W obrębie promotora leptyny zidentyfikowano aż 18 miejsc polimorficznych typu
SNP (single nucleotide polymorphism) oraz dwa typu InDel (insertion/deletion). W pozycji –105 występuje miejsce
polimorficzne C/G w sekwencji przyłączania czynnika transkrypcyjnego Sp1. Celem badań było poszukiwanie nowych
mutacji w promotorze genu leptyny bydła oraz ocena wpływu substytucji C/G w pozycji 105 pz na wiązanie białek
jądrowych. Do badań wykorzystano panel rasowy (HF, Limousine, Piemontese, Hereford, Simental, Charolaise, Angus,
Białogrzbietka) obejmujący 200 osobników. Analizowano dwa fragmenty (-186 pz do +28 pz oraz –944 pz do –594 pz)
promotora genu leptyny, techniką SSCP oraz HD. Zidentyfikowano trzy znane SNP (pozycje –170, –147 oraz –105).
Nie wykryto natomiast nowych miejsc polimorficznych. Analizę wiązania białek jądrowych, wyizolowanych z wątroby,
tkanki tłuszczowej, przysadki i mięśni zwierząt rasy HF, z dwiema sondami DNA, różniącymi się jednym nukleotydem
C lub G w pozycji –105 genu leptyny, przeprowadzano stosując technikę EMSA (electrophoretic mobility shift assay).
Sondy molekularne, o długości 20 pz, znakowano radioaktywnie [32P]ATP. Wykazano, że transwersja C/Gpozycji –105
pz wyraźnie obniżała wiązanie białek jądrowych, przypuszczalnie czynnika transkrypcyjnego SP1. Uzyskane wyniki
wskazują, iż analizowany rejon promotorowy może odgrywać istotną rolę w ekspresji genu leptyny u bydła.
P173.
Polimorfizm mikrosatelitarnych sekwencji DNA u jelenia szlachetnego
(Cervus elaphus).
Andrzej Jacek Rutkowski, Maciej Żurkowski, Chandra Shekhar Pareek
Katedra Owczarstwa, Łowiectwa i Hodowli Kóz, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski, Olsztyn 10-718
Przebadana zostanie homologia 95 bydlęcych markerów mikrosatelitanych u jelenia szlachetnego. Bydlęce markery
STR zostaną zoptymalizowane na genomowym DNA jelenia szlachetnego. Systematyczna optymalizacja zostanie
przeprowadzona początkowo przy użyciu polimerazy DNA (Dyna II), a nastepnie przy użyciu polimerazy Dynazyme
EXT przy różnej koncentracji MgCl2 oraz DMSO. W naszej prezentacji przedstawiona zostanie frekwencja alleli
zoptymalizowanych markerów mikrosatelitarnych, stopień ich heterozygotyczności oraz Polimorphism information
content(PIC), w dwóch różnych populacjach mazurskiego jelenia szlachetnego (n=100).
P174.
Ilościowa analiza ekspresji genu leptyny (LEP) w tkance tłuszczowej świni.
Zofia Madeja, Dorota Lechniak
Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza w Poznaniu im. A. Cieszkowskiego, ul. Wołyńska 33,
60-277 Poznań
We współczesnej hodowli zwierząt gospodarskich główny nacisk kładziony jest na poszukiwanie tzw. genów głównych
(QTL) wywierających duże efekty na cechy użytkowe zwierząt. Geny leptyny (LEP) oraz jej receptora (LEPR) znajdują
się w kręgu zainteresowania jako potencjalne loci QTL wpływające na otłuszczenie tuszy. U dorosłych osobników
leptyna jest czynnikiem bezpośrednio odpowiedzialnym za regulację wydatków energetycznych oraz procesy związane
z pobieraniem pokarmu. Przedmiotem niniejszych badań jest analiza ekspresji genu LEP w tkance tłuszczowej świni
w celu określenia ilościowej zmienności mRNA w zależności od lokalizacji tkanki oraz od rasy zwierząt.
139
Genetyka zwierząt
Badaniami objęto 30 osobników, 10 rasy polskiej białej zwisłouchej (pbz), 10 rasy wielkiej białej polskiej (wbp) oraz 10
należących do linii 990. Badania prowadzono na pozyskanym poubojowo tłuszczu podskórnym, sródmięśniowym oraz
okołonerkowym. Rasy te różnią się odkładaniem tkanki tłuszczowej, której najwięcej jest w linii 990. RNA izolowano
stosując TRIZOL, ekstrakcję chloroformem oraz precypitację alkoholem. Odwrotną transkrypcję (RT) przeprowadzono
z wykorzystaniem mieszaniny starterów oligo dT oraz random hexameres. Ilościowa ekspresja genu LEP prowadzona
jest techniką Real-Time PCR (barwnik fluorescencyjny SYBR Green, urządzenie Light Cycler, Roche) z zastosowaniem
starterów obejmujących ekson 2 i 3 genu LEP (produkt PCR długości 186 pz).
Na podstawie wstępnych wyników można stwierdzić, że poziom transkryptów genu LEP zmienia się w zależności
od analizowanej tkanki, przy czym najniższą ekspresję stwierdzono w tłuszczu podskórnym. W dalszej części badań
analizowane będą zależności pomiędzy poziomem transkryptów dla genu LEP a zawartością tłuszczu w zależności od
rodzaju tłuszczu i rasy zwierzęcia, z uwzględnieniem genotypu w locus receptora rianodyny (CT843T) związanego
z syndromem gorączki złośliwej.
P175.
Zróżnicowanie populacyjne europejskich małży Mytilus na poziomie DNA
mitochondrialnego.
Beata Śmietanka, Roman Wenne
Zakład Genetyki i Biotechnologii Morskiej, Instytut Oceanologii PAN w Sopocie
Małże słonowodne należące do rodzaju Mytilus charakteryzują się unikalnym sposobem dziedziczenia genomu
mitochondrialnego (mtDNA). W świecie zwierzęcym mtDNA dziedziczony jest z reguły w sposób uniparentalny w linii
matki. U małży Mytilus genom mitochondrialny dziedziczony jest podwójnie uniparentalnie – w linii matki (genom F)
i ojca (genom M). Genom matczyny przekazywany jest zarówno samcom jak i samicom, genom ojcowski tylko samcom,
powszechne jest zatem występowanie zjawiska heteroplazmii u samców.
Badania prowadzono w oparciu o trzy występujące w Europie gatunki Mytilus: M. edulis, M. trossulus i M.
galloprovincialis z wybrzeży europejskich od Morza Azowskiego do Morza Białego. Analizowano fragment rejonu
kodującego (ND2-COIII) oraz główny rejon niekodujący (D-loop) w genomie mitochondrialnym żeńskim i męskim.
Zastosowano metodę PCR-RFLP oraz wybiórczo sekwencjonowanie. Zaobserwowano wysoki polimorfizm mtDNA
oraz istnienie introgresji pomiędzy populacjami. Genom męski charakteryzuje się znacznie wyższym stopniem
dywergencji w stosunku do genomu żeńskiego. Najniższe zróżnicowanie genomu żeńskiego zaobserwowano
u bałtyckiego M. trossulus oraz M. galloprovincialis z Morza Azowskiego, co może wynikać z młodego geologicznie
wieku obu mórz. Zaobserwowano bardzo słaby przepływ mtDNA pomiędzy M. galloprovincialis z Atlantyku i Morza
Środziemnego. Atlantycki M. galloprovincialis jest genetycznie bliższy atlantyckiemu M. edulis aniżeli populacji M.
galloprovincialis z Morza Śródziemnego. U samców we wszystkich badanych populacjach z wyjątkiem bałtyckiego M.
trossulus, stwierdzono obecność genomu M o wysokim stopniu dywergencji sekwencji. U małży bałtyckich dochodzi
prawdopodobnie do maskulinizacji genomu żeńskiego, który u samców przejmuje rolę genomu męskiego i dziedziczy
się w linii męskiej. Analiza zmienności mtDNA wydaje się bardzo użyteczna do ustalania filogeografii oraz śledzenia
zmian bioróżnorodności organizmów morskich.
P176.
Rearanżacje genowe w obrębie głównego rejonu niekodującego genomu
mitochondrialnego małży Mytilus.
Monika Filipowicz, Artur Burzyński, Beata Śmietanka, Roman Wenne
Zakład Genetyki i Biotechnologii Organizmów Morskich, Instytut Oceanologii PAN w Sopocie
Gatunki Mytilus są ciekawym obiektem badań ze względu na obecność heteroplazmii w obrębie mitochondrialnego
DNA oraz unikalny sposób dziedziczenia mtDNA – DUI (double uniparental inheritance). Polega on na współistnieniu
dwóch genomów mtDNA: żeńskiego F oraz męskiego M o wysokim stopniu dywergencji. Zakłada, że istnieją dwie
niezależne drogi transmisji mtDNA do potomstwa. Genom F przekazywany jest w linii matki do córek i synów,
a genom M tylko w lini ojca do synów. Ponadto dane literaturowe świadczą o występowaniu rekombinacji w obrębie
głównego rejonu niekodującego genomu M mtDNA omułków bałtyckich, a także w rejonie kodującym COIII Mytilus
z M Czarnego.
Z uwagi na to, że doniesienia na temat rekombinacji dotyczą genomów męskich rozpoczęto poszukiwania rearanżacji
genowych w puli osobników, u których stwierdzono obecność genomu M.
Badano genomy M omułków pochodzących z M.Czarnego, M. Azowskiego, Bałtyku, M. Śródziemnego oraz zachodnich
wybrzeży Atlantyku. Przeprowadzono reakcje PCR z zastosowaniem różnych kombinacji starterów komplementarnych
140
Genetyka zwierząt
do sekwencji głównego rejonu niekodującego. Uzyskano produkty reakcji PCR z zastosowaniem odwróconych
starterów na matrycach DNA osobników pochodzących z M. Azowskiego oraz z Zatoki Biskajskiej. Stanowiło to
przesłankę do sformułowania hipotezy o występowaniu duplikacji fragmentu rejonu niekodującego wśród małży
Mytilus pochodzących z tych akwenów i skłoniło do podjęcia szczegółowych analiz sekwencji tych osobników. Analiza
porównawcza sekwencji osobników z M. Azowskiego oraz Zatoki Biskajskiej z sekwencjami omułków bałtyckich
wykazała, że w obrębie głównego rejonu niekodującego tych małży występują rearanżcje genowe podobne do
zaobserwowanych wśród małży bałtyckich.
Dalsze badania mają na celu dokładne określenie sekwencji zrearanżowanych wariantów oraz ustalenie zasięgu ich
występowania, co umożliwiłoby wyjaśnienie korelacji między występowaniem rearanżacji w rejonie kontrolnym
mtDNA i hybrydyzacją międzygatunkową.
P177.
Występowanie transpozonów w genomach ryb morskich.
Anita Poćwierz-Kotus, Artur Burzyński, Roman Wenne
Instytut Oceanologii PAN w Sopocie
Transpozony są elementami genetycznymi zdolnymi do zmiany miejsca położenia w genomie, czyli do transpozycji.
Mogą rozprzestrzeniać się zarówno w obrębie pojedynczej komórki, jak i między gatunkami podczas horyzontalnego
transferu. Ich aktywność może wywoływać rearanżacje w strukturze genomów prowadzące do zróżnicowania ich
wielkości.
Transpozony Tc1 stanowią nadrodziną eukariotycznych transpozonów zidentyfikowanych u wielu organizmów,
szczególnie zaś wydają się być rozpowszechnione u ryb i płazów. Elementy te zawierają gen kodujący transpozazę oraz
54-nukleotydowe powtórzenia flankujące ten gen. Transpozycja odgrywa rolę w ewolucji genomów ryb i może mieć
znaczenie w utrzymywaniu różnorodności populacji.
Badano występowanie transpozonów Tc1 w bałtyckich populacjach Platichthys flesus (stornia) i Pleuronectes platessa
(gładzica) oraz w pojedynczych próbach ryb i płazów: Scopthalmus maximus (turbot), Salmo salar (łosoś), Reinhardtius
hippoglossoides (halibut), Esox lucius (szczupak), Clupea harengus (śledź), Salmo trutta (pstrąg), Neogobius
melanostomus (babka), Gadus morhua (dorsz), Perca fluviatilis (okoń), Merluccius merluccius (morszczuk), Rana
temporaria (żaba). Na podstawie sekwencji nukleotydowych transpozonów Tc1 u gładzicy, łososia i żaby udostępnianych
przez GenBank zaprojektowano parę starterów APK1/APK2 umożliwiających amplifikację fragmentu genu kodującego
enzym transpozazę. Użyto również pojedynczego starteru Leaver komplementarnego do odwróconych powtórzeń
sekwencji transpozonowej Tc1, o opublikowanej sekwencji (Leaver, 2001). Przeprowadzano reakcje PCR z użyciem
pary starterów APK1/APK2 oraz starteru Leaver. Dla wybranych gatunków ryb stosowano także metodę hybrydyzacji
typu Southern, gdzie genomowy DNA trawiony enzymami restrykcyjnymi PvuII, BamHI i HindIII hybrydyzowano
z sondą wyznakowaną DIG-dUTP. Stwierdzono w ten sposób występowanie transpozonu Tc1 u storni, gładzicy, łososia,
szczupaka, pstrąga, babki, okonia, żaby.
Przeprowadzenie analizy molekularnej i sekwencjonowania transpozonów Tc1 pozwoli na zbadanie
wewnątrzpopulacyjnego polimorfizmu u różnych gatunków ryb morskich.�
Leaver M. J. (2001) A family of Tc1 –like transposons from the genomes of fishes and frogs: evidence for horizontal
transmission. Gene 271, 203-214.
P178. Zmienność mitochondrialnego DNA w strefie hybrydyzacji i introgresji u zwierząt
z podwójnie uniparentalnym dziedziczeniem mtDNA. Mytilus edulis i Mytilus trossulus.
Tomasz Kijewski (1), Roman Wenne (2)
(1) Instytut Oceanologii PAN w Sopocie
(2) Instytut Oceanologii PAN, Molecular Ecology and Fisheries Genetics Group, Department of Biological Sciences, University
of Hull, Hull, HU6 7RX, UK
Zbadano zróżnicowanie mtDNA w 8 populacjach omułka ze strefy hybrydyzacji między Mytilus trossulus i M. edulis
w Cieśninach Duńskich i Morzu Bałtyckim. Analizowano rejon kodujący ND2-COIII z zastosowaniem metody PCRRFLP. Stwierdzono występowanie istotnych statystycznie różnic między populacjami z północnej części Cieśnin
Duńskich oraz populacjami z południowej części Cieśnin Duńskich i Bałtyku. We wszystkich populacjach stwierdzono
występowanie heteroplazmii związanej ze zjawiskiem podwójnie uniparentalnego dziedziczenia mtDNA. W północnej
części Cieśnin Duńskich heteroplazmia związana była z występowaniem 2 genomów mitochondrialnych o wysokiej
dywergencji, w pozostałych populacjach –genomów o niskiej dywergencji, co jest wiązane ze zjawiskiem maskulinizacji
141
Genetyka zwierząt
żeńskiego genomu mitochondrialnego w warunkach hybrydyzacji międzygatunkowej. Uzyskane wyniki świadczą
o introgresji genomów mitochondrialnych w kierunku wschodnim.
P179.
Polimorfizm regionu 5’UTR genu leptyny świni.
Mariusz Maćkowski, Marek Świtoński
Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu
Gen leptyny, kodujący hormon odpowiedzialny za regulacje gospodarki tłuszczowej organizmu, zbudowany jest
z trzech eksonów przedzielonych dwoma intronami. Pomimo tego, że u ssaków wykazuje wysoki konserwatyzm
dotąd nie ustalono całkowitej sekwencji genomowej tego genu świni. Znana jest sekwencja fragmentu o długości
5920 pz, obejmującego cały ekson drugi i trzeci oraz fragment intronu pierwszego i cały intron drugi. W sekwencji tej
zidentyfikowano dotąd pięć mutacji punktowych (SNP), z czego dwie znajdują się w części kodującej genu, jednak żadna
z nich nie wpływa na zmianę sekwencji aminokwasowej.
W niniejszych badaniach podjęto próbę poszukiwania mutacji w rejonie promotorowym genu leptyny świni. Na
podstawie sekwencji fragmentu promotora genu leptyny bydła zaprojektowano cztery zestawy starterów. Przy użyciu
jednej z tych par uzyskano specyficzny fragment o długości 246 pz. Fragment ten został poddany sekwencjonowaniu
i przeprowadzono analizę porównawczą z odpowiednim fragmentem pochodzącym z genomu bydła i człowieka,
która wykazała wysoki stopień podobieństwa, odpowiednio 80% i 70%. W kolejnym etapie badań poszukiwano miejsc
polimorficznych przy pomocy techniki SSCP. Wśród 173 zwierząt, reprezentujących rasy: wbp, pbz, duroc, pietrain,
hampshire i linię syntetyczną 990, zidentyfikowano 21 zwierząt o odmiennym wzorze SSCP. Sekwencjonowanie
fragmentów pochodzących od tych zwierząt ujawniło występowanie kilku mutacji punktowych a szczegółowy ich opis
będzie zaprezentowany.
Badania finansowane przez KBN (grant PBZ-KBN-036/P06/14).
P180.
Cechy nasienia knurów z różnymi wariantami genu hormonu wzrostu (GH/MspI &
GH/HaeII).
Marek Kmieć (1), Heliodor Wierzbicki (2), Sławomir Zych (1)
(1) Agricultural University of Szczecin, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Doktora Judyma 6, 71-466 Szczecin,
Poland
(2) Agricultural University of Wrocław, Department of Genetics and Animal Breeding, ul. Kożuchowska 7, 51-631 Wrocław,
Poland
Reprodukcja zwierząt gospodarskich odgrywa istotną rolę w pracy hodowlanej. Dynamiczny rozwój genetyki
molekularnej stworzył warunki dla poszukiwań genów istotnie wpływających na użytkowość zwierząt. Nadzieje wiąże
się z genami wpływającymi na kształtowanie się cech ilościowych – QTL (quantitative trait locus). Hormon wzrostu
(GH) jest białkiem produkowanym w przednim płacie przysadki mózgowej. W ostatnich latach pojawiły się doniesienia
o oddziaływaniu GH na męskie i żeńskie procesy rozrodcze. Hormon ten wpływać może na nie bezpośrednio lub
pośrednio za pomocą mediatorów (IGF-I). Znaleziono specyficzne receptory na wszystkich typach komórek w jądrach
knura. Obserwuje się także wpływ GH na ruchliwość plemników i ich zdolność do zapłodnienia. Analizowano
zależności pomiędzy polimorfizmem PCR-RFLP genu hormonu wzrostu a cechami nasienia 204 knurów (52 – Polish
Landrace; 43 – Duroc x Pietrain; 35 – Polish Large White; 25 – Hampshire x Pietrain; 18 – PIC line; 11 – Pietrain;
8 – Polish Syntetic Line; 6 – Duroc x Hampshire; 4 – Duroc and 2 – Hampshire) użytkowanych w SHiUZ. Produkt PCR
wielkości 506 pz trawiono endonukleazą MspI oraz HaeII. W analizowanym stadzie knurów rozpłodowych częstość
występowania alleli dla polimorfizmu GH/MspI wynosiła odpowiednio: allelu GHA – 0.7549 i allelu GHB – 0.2451.
Natomiast dla polimorfizmu GH/HaeII częstość występowania alleli wynosiła odpowiednio: allelu GHA – 0.5522 oraz
allelu GHB – 0.4478. Uzyskane wyniki analizy zależności między cechami nasienia knurów a wariantami genetycznymi
genu hormonu wzrostu u knurów sugerują możliwości wykorzystania polimorfizmów GH/MspI oraz GH/HaeII
w doskonaleniu cech użytkowości rozpłodowej knurów. Najwyższe wartości badanych cech nasienia występowały
zawsze u osobników, u których występował genotyp GHBGHB w przypadku obydwu miejsc polimorficznych genu
hormonu wzrostu.
142
Genetyka zwierząt
Inżynieria genetyczna, biotechnologia
Komunikaty ustne:
W77.
Klonowanie somatyczne saków: perspektywy dla hodowli i ochrony zagrorzonych
gatunków oraz farmacji i medycyny.
Prof. J. A. Modliński
Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt, Polska Akademia Nauk, Jastrzębiec
W78.
Manipulacje komórkami zarodkowymi u ptaków.
Marek Bednarczyk
Katedra Biotechnologii Zwierząt, Akademii Techniczno-Rolniczej w Bydgoszczy
Tworzenie chimer kręgowców, w wyniku manipulacji ich komórkami znane jest od dawna. W ostatnim dziesięcioleciu
uzyskano praktyczne możliwości manipulacji komórkami embrionalnymi ptaków, wykorzystuje się do tego celu
komórki blastodermalne (BC), izolowane z tarczki zarodkowej po zniesieniu jaja lub pierwotne komórki płciowe (PGC),
izolowane ze smugi pierwotnej, krwi lub gonad zarodków.
Manipulacje komórkami embrionalnymi ptaków dotyczą dwóch podstawowych kierunków badawczych: produkcji
ptaków transenicznych oraz biokonserwacji genotypów metodą ex situ. Interesujące są ponadto obserwacje interakcji
pomiędzy różnymi genotypami komórek dawców i biorców w organizmie chimery, a zwłaszcza wpływu egzogennych
komórek zarodkowych na rozwój gonad i funkcje płciowe chimer, w tym ocena możliwości sterowania płcią ptaków.
Zaproponowana w naszym laboratorium metoda tworzenia chimer z wykorzystaniem BC charakteryzująca się
znaczną efektywnością (41% wylęgu, 87% chimer fenotypowych) pozwala na rutynową produkcję nie tylko chimer
fenotypowych, ale przede wszystkim chimer płciowych (30%), umożliwiając rozwój różnorodnych, często potencjalnych
do tej pory kierunków badawczych. Omówiona zostanie realizowana w ostatnich latach problematyka badawcza z tego
zakresu, dotycząca: • doskonalenia metod produkcji chimer •poprawy przeżywalności zarodków chimer po iniekcji
komórek dawców • metod identyfikacji chimer • zwiększenia stopnia chimeryzmu • metod transfekcji komórek BC
i PGC • obserwacji fizjologicznych, genetycznych i produkcyjnych aspektów chimeryzmu, itd.
Badania finansowane przez KBN, granty: 2 P06D 029 26 i PBZ-KBN-084/P06/2002
W79.
Konstytutywna i regulowana niedotlenieniem nadekspresja oksygenazy hemowej-1
w systemie wektorów AAV: potencjalne zastosowanie w terapii genowej.
Barbara Węgiel, Jarosław Cisowski, Alicja Józkowicz, Józef Dulak
Zakład Biochemii Komórki, Wydział Biotechnologii UJ, ul. Gronostajowa 7, 30-387 Kraków
Oksygenaza hemowa-1 (HO-1), enzym indukowany przez liczne czynniki stresowe, rozkłada hem do biliwerdyny,
CO i jonów żelaza. HO-1 i jej produkty wykazują szerokie działanie cytoprotekcyjne i przeciwzapalne, odgrywają
także istotną rolę w angiogenezie. Badania wskazują na szczególnie korzystną rolę HO-1 w ograniczaniu miażdżycy
i uszkodzeniu serca po zawale. Efekt ten może jednak być znacznie osłabiony u pacjentów, bowiem niedotlenienie
nie stymuluje, a nawet może hamować ekspresję HO-1 w ludzkich komórkach. Dlatego zastosowanie wektorów
umożliwiających stałą lub indukowaną ekspresję HO-1 w niedotlenionych tkankach może mieć duże znaczenie
w terapii genowej. Skuteczność takiej strategii może być dodatkowo zwiększona poprzez wykorzystanie wektorów
umożliwiających trwałą ekspresję transgenu i nie wywołujących procesów zapalnych. Warunki takie spełniają wektory
oparte na wirusach AAV (ang. adeno-associated viruses).
Wektory AAV konstruowano przy pomocy AAV Helper Free System (Stratagene). Sekwencję kodującą cDNA HO-1
uzyskano z biblioteki cDNA ludzkich komórek HepG2. Skonstruowano wektor hHO-1-AAV zawierający cDNA HO-1
143
Genetyka zwierząt
pod kontrolą konstytutywnego promotora CMV oraz wektor HRE-hHO-1-AAV, w którym transkrypcja HO-1 zależy
od aktywacji sekwencji HRE (ang. hypoxia responsive element), wiążącej czynnik transkrypcyjny HIF-1, indukowany
w niedotlenieniu. Zastosowanie wektora reporterowego AAV-β-gal wykazało, że transdukcja jest wydajna w komórkach
śródbłonka mikrowaskularnego HMEC-1, natomiast ekspresja po transdukcji keratynocytów HaCaT jest bardzo
niska. Po transdukcji hHO-1-AAV stwierdzono w HMEC-1 zwiększoną ekspresję HO-1, potwierdzoną przez RTPCR i Western blot. W HMEC-1 transdukowanych HRE-hHO-1-AAV niska ekspresja HO-1 wzrastała co najmniej
kilkakrotnie po aktywacji czynnika HIF-1.
Skonstruowany system regulowanej nadekspresji HO-1 w wektorach AAV stwarza możliwości do badań in vivo nad
protekcyjną rolą HO-1 w niedotlenieniu tkanek.
W80.
Cytogenetyczna ocena transgenezy zwierząt.
Ewa Michalak (1), Daniel Lipiński (2) Ryszard Słomski (1, 2),
(1) Katedra Biochemii i Biotechnologii, Akademia Rolnicza w Poznaniu, ul. Wołyńska 35, 60-637 Poznań
(2) Insytut Genetyki Człowieka PAN Poznań
Ocena badań nad transgenezą w pierwszym etapie wykonywana jest na poziomie molekularnym za pomocą PCR.
W wielu przypadkach konieczna jest jednak ocena kariotypu zwierząt transgenicznych, a także cytogeneczne
zmapowanie transgenu. A tym celu najczęściej stosuje się fluoroscencyjną hybrydyzację in situ, w której sondą
molekularną jest transgen. W naszym zespole udało się uzyskać ród transgenicznych królików WAP6xHisHGH
wywarzających w mleku hormon wzrostu człowieka.
Celem niniejszej pracy było potwierdzenie lokalizacji transgenu w chromosomie 7q26-27 (FISH), rozróżnienie
homozygot od heterozygot, a ponadto próba określenia liczby kopii transgenu (fiber FISH) wśród 5 transgenicznych
królików.
Materiałem badawczym były hodowane in vitro fibroblasty uszne 5 królików, z których wykonano preparaty
cytogenetyczne, w tym halo DNA. Sondę molekularną stanowił plazmid zawierajacy transgen WAP6xHisHGH
znakowany biotyną przy użyciu reakcji random priming. FISH przeprowadzono wg standardowej procedury.
Wykonanie badań metodą FISH potwierdziło u wszystkich królików lokalizację transgenu 7q26-27, a także pozwoliło
na wyróżnienie 1 homozygoty i 4 heterozygot. Jednocześnie wykazano stabilność integracji transgenu w kolejnych
pokoleniach zwierząt i pasażach linii komórkowych rozluźnionej. Sygnały hybrydyzacyjne w postaci liniowej na
preparatach z rozluźnioną chromatyną wskazują na wbudowanie znacznej liczby kopii transgenu, jednak szczegółowe
poznanie orientacji transgenu wymaga zastosowania innych technik.
W81.
Skład pożywki do dojrzewania in vitro a występowanie apoptozy w oocytach
bydlęcych.
Ewelina Warzych, Kamila Matulewicz, Anna Nogowska, Dorota Lechniak
Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza w Poznaniu, ul. Wołyńska 33, 60-637 Poznań, e-mail:
[email protected]
Apoptoza odgrywa ważną rolę w regulacji wzrostu pęcherzyków jajnikowych i oocytów ssaków. Zjawisko to obserwuje
się we wszystkich stadiach oogenezy m.in. u człowieka, myszy i bydła. Częstość występowania apoptozy jest stosunkowo
niska w oocytach niedojrzałych (u bydła 7%), przy czym wzrasta w oocytach po dojrzewaniu in vitro (23%). Wykazano,
że hodowla oocytów w warunkach laboratoryjnych, określanych mianem suboptymalnych, zwiększa udział komórek
apoptotycznych. Duże znaczenie ma w tym zakresie skład i rodzaj pożywki do dojrzewania.
Celem niniejszych badań jest analiza wpływu warunków dojrzewania in vitro na częstotliwość występowania apoptozy
w oocytach bydlęcych. Oocyty hodowano w trzech pożywkach bazujących na podłożu TCM199, różniących się źródłem
białka (FCS, faf BSA, PVP). Do detekcji komórek apoptotycznych zastosowano technikę TUNEL.
Dotychczasowe badania objęły 290 oocytów, w tym 64 niedojrzałych i 226 po dojrzewaniu. Zaobserwowano małą częstość
komórek apoptotycznych wśród oocytów niedojrzałych (3.1%) oraz wzrost ich udziału po dojrzewaniu in vitro (15.5%).
Ponadto stwierdzono pewne różnice pomiędzy stosowanymi pożywkami, najwyższy udział oocytów apoptotycznych
zaobserwowano w pożywce z PVP –22.4% (FCS –12.7%, BSA –12.5%). Pożywka z PVP charakteryzowała się również
najniższym udziałem oocytów dojrzałych do zapłodnienia w stadium metafazy drugiej (MII) –67.1% (FCS –85.7%, BSA
144
Genetyka zwierząt
– 79,1%). Oocyty apoptotyczne występowały znacznie częściej wśród komórek niedojrzałych (41.7%) w porównaniu
z oocytami w stadium MII (12.9%).
Praca naukowa finansowana ze środków KBN w latach 2003-2005 jako projekt badawczy zamawiany nr PBZ/KBN-084/
P06/2002
Komunikaty plakatowe:
P181.
Charakterystyka genetyczna populacji strusi w Polsce przy użyciu metody DNA
fingerprinting.
Magdalena Kawka (1), Jarosław O. Horbańczuk (1), Mariusz Sacharczuk (2), Rafał Parada (2),
Kinga Boruszewska (2)
(1) Zakład Doskonalenia Zwierząt, Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN
(2) Zakład Cytogenetyki Molekularnej, Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN
Hodowla strusi w Polsce jest jedną z najmłodszych gałęzi produkcji zwierzęcej. Pierwsza ferma powstała w 1993 roku
– w Garczynie, koło Gdańska. Dynamiczny rozwój hodowli tych ptaków, nie tylko na świecie, ale również i w Polsce
spowodował deficyt wysokiej jakości materiału hodowlanego. Poza tym możliwości prowadzenia pracy hodowlanej
za pomocą tradycyjnych metod genetyki populacji są ograniczone m.in. z powodu krótkiego okresu hodowli strusi
oraz małej ich liczby w stadzie (Horbańczuk, 2003). Jednak dzięki rozwojowi nowych metod analitycznych genetyki
molekularnej staje się możliwe przeprowadzenie analizy genetycznej krajowej populacji strusi, co nie było czynione do
tej pory. Techniki te wykorzystują sekwencje mini– i mikrosatelitarne oraz markery chromosomowe. Struś jest ptakiem
o mało znanym genomie. Liczba znanych sekwencji mikrosatelitarnych strusia nie jest do końca znana. Pojawia się
coraz więcej prac dotyczących odkrycia nowych par starterów u tych gatunków ptaków (Tang, 2003). Na razie jednak
najlepszą metodą stosowaną w charakterystyce genetycznej tych ptaków jest analiza sekwencji minisatelitarnych
wielopozycyjną techniką DNA fingerprinting. Uzyskiwane wzory prążkowe znajdują szerokie zastosowanie prawie
we wszystkich badaniach poznawczych i praktycznych: m.in. w identyfikacji osobników, rodzin, ras czy linii zarówno
u ludzi, zwierząt jak i roślin; do mapowania i identyfikacji markerów sprzężonych z QTLs; do oceny autentyczności
klonowanych zwierząt; do ustalenia stopnia inbredu. W naszym Instytucie analizę DNA fingerprinting stosuje się
w genetycznej charakterystyce zwierząt. Za jej pomocą zidentyfikowano dwujajowe oraz jednojajowe bliźnięta strusia
(Sacharczuk i wsp., 2001). Poza tym Jaszczak i wsp. (2001) wykazali skuteczność tej metody w poszukiwaniu genów,
jak i eliminacji osobników mających genetyczne predyspozycje do wad szkieletu oraz w określeniu genetycznej
charakterystyki gęsi o różnym kariotypie. Obecnie metoda ta używana jest do genetycznej analizy trzech ras strusi
(czerwono-, niebiesko– i czarnoszyich). Badania te obejmują określenie zmienności genetycznej wewnątrz i między
rasami a także określenie dystansu genetycznego pomiędzy badanymi populacjami strusi. DNA było izolowane z piór
tradycyjną metodą z użyciem proteinazy K. Następnie zostało ono poddane trawieniu enzymem Hinf I, elektroforezie
w 0,8% żelu agarozowym i hybrydyzacji z sondą minisatelitarną 33.6. Wstępne badania wykonane na małej liczbie
osobników potwierdzają przypuszczenia, że największa zmienność genetyczna występuje u strusi czerwonoszyich,
najmniejsza zaś u strusi czarnych.
P182.
Wpływ składu pożywki na zaburzenia wrzeciona podziałowego w oocytach
bydlęcych dojrzewających in vitro.
Jarosław Sosnowski, Wioletta Pijacka, Izabela Woźniczko, Dorota Lechniak
Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza w Poznaniu
Celem niniejszych badań była analiza wpływu stosowanych pożywek do dojrzewania in vitro oocytów bydlęcych
na występowanie zaburzeń wrzeciona podziałowego. Oocyty hodowano w pożywkach na bazie medium TCM199
uzupełnianego FCS lub fafBSA lub PVP. Do analiz immunoflurescencyjnych wrzecion oocytów używano mysich
przeciwciał monoklonalnych przeciw β-tubulinie (przeciwciała pierwszorzędowe, Monoclonal Anti β-tubulin) oraz,
jako drugorzędowe, przeciwciała sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (Goat anti-Mouse IgG-FITC). Chromatynę
barwiono przy użyciu DAPI. Ocena preparatów polegała na określeniu stadium podziału mejotycznego oocytu oraz
analizie struktury wrzeciona podziałowego. Jako nieprawidłowe uznawano wrzeciona podziałowe z więcej niż dwoma
biegunami, wrzeciona z widocznymi w ich obrębie opóźnionymi chromosomami, a także komórki z diploidalną liczbą
chromosomów w stadium MII.
145
Genetyka zwierząt
Ogółem przeanalizowano strukturę wrzecion podziałowych w 542 oocytach, które znajdowały się w stadiach MI,
AI, TI oraz MII (wśród ostatnich także MII z diploidalną liczbą chromosomów). Stwierdzono tylko 7 komórek,
w których zaobserwowano nieprawidłowości w obszarze wrzeciona podziałowego, co stanowi 1.29% (7/542). Wśród
nieprawidłowości stwierdzono 2 oocyty z wrzecionem trójbiegunowym (obie w grupie oocytów dojrzewających
w pożywce z dodatkiem PVP) oraz 5 komórek z opóźnionymi chromosomami w obrębie wrzecion. Najwięcej
nieprawidłowości obserwowano w grupie 190 oocytów dojrzewających w pożywce uzupełnionej PVP –4 komórki
(2.1%, 4/190). Wśród 185 oocytów hodowanych w pożywce z dodatkiem FCS stwierdzono 2 komórki (1.1%, 2/185),
a wśród 167 dojrzewających w obecności BSA, 1 komórkę (0.6%, 1/167). Pośród 357 oocytów w stadium MII, 4.5% (16/
357) było z diploidalną liczbą chromosomów. Poziom diploidii wśród oocytów dojrzałych w pożywce z dodatkiem PVP
wyniósł 11.1% (8/72), z dodatkiem FCS 3,1% (5/159) a w pożywce z faf BSA 2,4% (3/126).
Praca naukowa finansowana ze środków KBN w latach 2003-2005 jako projekt badawczy zamawiany nr PZB/KBN-084/
P06/2002
Mutacje, diagnostyka genetyczna, terapia
Komunikaty ustne:
W82.
Ekspresja genu Ssty1 u samców myszy z delecją w chromosomie Y.
Paweł Grzmil, Agnieszka Dziuba, Józefa Styrna
Zakład Genetyki i Ewolucjonizmu, Instytut Zoologii Uniwersytetu Jagiellońskiego, Ingardena 6, 30-060 Kraków
Obserwowane przez lekarzy pogorszenie się jakości męskiego nasienia skłania naukowców do intensywnego
poszukiwania genów kontrolujących prawidłowy przebieg spermatogenezy u ssaków. W tego typu badaniach niezwykle
użyteczne są zwierzęce modele z zaburzeniami płodności. Jednym z genów wpływających na prawidłowy przebieg
spermatogenezy u myszy jest występujący w licznych kopiach w długim ramieniu chromosomu Y gen Ssty1. Ostatnio
wykryto obecność produktu białkowego tego genu w kanalikach nasiennych. W obecnej pracy wykazaliśmy znaczący
ubytek liczby kopii tego genu u samców mutantów B10. BR-Ydel z delecją dwu trzecich długiego ramienia chromosomu
Y. Samce te mają znacznie podniesiony w stosunku do kontroli (B10. BR) procent morfologicznie nienormalnych
plemników, co dowodzi, że redukcja znacznej liczby kopii genu Ssty1 nie zatrzymuje spermatogenezy, ale wpływa na
przebieg spermiogenezy. Ponadto udało się nam również wykazać, że ekspresja tego genu występuje nie tylko w gonadzie
męskiej, jak podawano dotychczas w literaturze, ale także w mózgu u samców myszy.
Praca finansowana z grantu KBN 3 P04C 033 23
W83.
Zmiany cytogenetyczne w komórkach krwi obwodowej i szpiku kostnego myszy po
działaniu promieniowania X i nonylfenolu.
Urszula Mikulska, Małgorzata Dobrzyńska
Zakład Ochrony Radiologicznej i Radiobiologii, Państwowy Zakład Higieny, ul. Chocimska 24, 00-791 Warszawa
Nonylfenol i promieniowanie X powszechnie występują w środowisku człowieka.
Nonylfenol (NL) należy do grupy związków wykazujących aktywność hormonalną. Występuje w produktach
powszechnego użytku, jak wyroby z pcv, farby, folie, pestycydy, detergenty, zabawki.
Celem przeprowadzonych badań było określenie wpływu nonylfenolu, promieniowania X oraz skojarzonego działania
małych dawek obu czynników na indukcję mikrojąder w retikulocytach oraz w erytrocytach polichromatycznych.
Materiał doświadczalny stanowiły niewsobne myszy Pzh: SFIS. Samce napromieniano na całe ciało lub/i podawano im
dootrzewnowo nonylfenol rozprowadzony w oleju słonecznikowym, 5 razy w tygodniu przez 2 tygodnie. Każdorazowo
dawki wynosiły 0,10 Gy lub 0,20 Gy promieniowania X, 25 mg/kg mc, 50 mg/kg mc lub 100 mg/kg mc nonylfenolu,
a w przypadku skojarzonego działania 0,10 Gy + 50 mg/kg mc NL. Krew obwodową pobierano po upływie 1 tygodnia
od rozpoczęcia doświadczenia oraz 24h po jego zakończeniu, a szpik kostny po zakończeniu ekspozycji.
Stosunek erytrocytów polichromatycznych do normochromatycznych we wszystkich grupach doświadczalnych
146
Genetyka zwierząt
oraz kontrolnych wynosił 1:1. Nie stwierdzono zatem efektu cytotoksycznego. Ilość mikrojąder w erytrocytach
polichromatycznych wzrosła około dwukrotnie w przypadku dawek 50 mg/kg mc NL i 100 mg/kg mc NL w stosunku
do kontroli. Dawki 0,10 Gy i 0,20 Gy promieniowania X zwiększyły ilość mikrojąder odpowiednio o 38% i 180%
w odniesieniu do osobników kontrolnych. Natomiast skojarzone działanie promieniowania X i nonylfenolu
spowodowało wzrost częstości występowania mikrojąder w erytrocytach polichromatycznych aż o 203%.
Napromienianie myszy indukowało powstawanie mikrojąder w retikulocytach szpiku kostnego oraz krwi obwodowej.
Po zastosowaniu dawki 0,20 Gy stwierdzono dwukrotnie wyższą ich obecność w stosunku do dawki 0,10 Gy, zaś powyżej
ośmiokrotnie wyższą w porównaniu do kontroli. Zwiększoną obecność mikrojąder stwierdzono także w krwi myszy
poddanych ekspozycji na 50 mg/kg NL i 100 mg/kg NL. Nie wykazano natomiast istotnych różnic między obiema
dawkami. W przypadku skojarzonego działania promieniowania X i nonylfenolu, częstość występowania mikrojąder
w retikulocytach szpiku kostnego nie różniła się istotnie od kontroli, w krwi obwodowej wzrosła 2-3-krotnie w stosunku
do kontroli, natomiast zmniejszyła się w porównaniu z działaniem samego promieniowania.
W84.
Antyangiogenna terapia genowa skojarzona z chemioterapią w hamowaniu wzrostu
guzów pierwotnych u myszy.
Iwona Mitrus, Natalia Wróbel, Klaudia Delić, Ewa Missol-Kolka, Stanisław Szala
Zakład Biologii Molekularnej, Centrum Onkologii, Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie, ul. Wybrzeże Armii Krajowej 15, 44-101
Gliwice
W leczeniu chorób nowotworowych próbuje się kojarzyć różne metody terapeutyczne. Zastosowanie odmiennych
sposobów niszczenia komórek nowotworowych powinno przynieść poprawę efektów leczenia.
Eksperymenty terapii skojarzonej przeprowadzano na guzach pierwotnych mysiego czerniaka B16(F10). W czasie
badań kojarzono dwie metody: terapię genową z zastosowaniem genu kodującego IL-12 (białko to hamuje angiogenezę
i indukuje INF-gamma) oraz chemioterapię przy użyciu cyklofosfamidu. Wykazano, że podawanie genu IL-12
bezpośrednio do guza wywołuje jedynie niewielki efekt terapeutyczny – czas przeżycia myszy leczonych poprzez
podawanie tego genu niewiele różni się od czasu przeżycia myszy grup kontrolnych. Znacznie lepsze wyniki daje
zastosowanie terapii samym cyklofosfamidem. Czynnik ten podawano dootrzewnowo, według dwóch różnych
schematów czasowych i w różnych dawkach, przy czym uzyskane wyniki terapeutyczne były zbliżone. Najlepsze wyniki
uzyskano stosując terapię skojarzoną z udziałem genu IL-12 oraz cyklofosfamidu. Leczenie takie powoduje wydłużenie
czasu przeżycia zwierząt w porównaniu z myszami leczonymi samą IL-12. Efekt terapii skojarzonej jest wyraźnie
widoczny podczas podawania obu leków i jest dużo lepszy od każdego leku z osobna. Ponadto efekt terapeutyczny
zależy w dużym stopniu od chwili rozpoczęcia terapii – wczesne rozpoczęcie leczenia podnosi wyniki terapeutyczne.
W85.
Skojarzona antyangiogenna terapia w hamowaniu przerzutów B16(F10) w płucach
myszy.
Tomasz Cichoń, Ryszard Smolarczyk, Stanisław Szala
Zakład Biologii Molekularnej, Centrum Onkologii, Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie, ul. Wybrzeże Armii Krajowej 15,
44-101 Gliwice
Terapia antyangiogenna jest pośrednią metodą niszczenia komórek nowotworowych. W terapii tej zahamowanie wzrostu
naczyń okołonowotworowych pociąga za sobą zahamowanie wzrostu guzów pierwotnych oraz przerzutów. W terapii
antyangiogennej przerzutów mysiego czerniaka B16(F10) skojarzono dwa rozwiązania terapeutyczne: antyangiogenną
terapię genową oraz antyangiogenną chemioterapię.
Terapię genową prowadzono na dwa sposoby. Pierwszy polegał na wprowadzeniu genu terapeutycznego do mięśnia
podudzia obu łap myszy (elektroporacja) gdzie ulegał on stałej ekspresji wytwarzając białko terapeutyczne wprost do
ustroju (terapia systemowa). Drugi opierał się na wprowadzeniu genu terapeutycznego bezpośrednio do płuc za pomocą
polietylenoiminy 750 kDa (terapia lokalna). W terapii systemowej stosowano gen sFlt-1 (rozpuszczalny receptor dla
VEGF), natomiast w terapii lokalnej geny IL-12 oraz sFlt-1.
W obu przypadkach terapię genową rozpoczynano w trzecim dniu po zaszczepieniu myszy komórkami nowotworowymi.
W terapii systemowej elektroporację przeprowadzono dwa razy w odstępie sześciu dni, natomiast w terapii lokalnej gen
wprowadzano co siedem dni przez okres pięciu tygodni.
Chemioterapię rozpoczynano w szóstym dniu po zaszczepieniu myszy komórkami i prowadzono co sześć dni.
Chemioterapeutyk (cyklofosfamid) podawano dootrzewnowo w ilości 170mg/kg masy ciała.
147
Genetyka zwierząt
W wyniku skojarzenia antyangiogennej terapii genowej z antyangiogenną chemioterapią zaobserwowano wydłużenie
czasu przeżycia myszy poddanych terapii skojarzonej w porównaniu do czasu przeżycia myszy w grupach kontrolnych
Komunikaty plakatowe:
P183.
Polimorfizm regionów kodujących i regulatorowych genów MYF6 i MYOG oraz nowa
sekwencja genu MYF6 u świni.
Joanna Wyszyńska-Koko, Jolanta Kurył, Krzysztof Flisikowski
Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN w Jastrzębcu, Jastrzębiec, ul. Postępu 1, 05-552 Wólka Kosowska
Procesy miogenezy warunkowane są wieloma czynnikami, z których bardzo ważną rolę odgrywają cztery czynniki
transkrypcyjne kodowane przez rodzinę genów MyoD. Do rodziny tej należą geny MYOG i MYF6, które pełnią
funkcję odpowiedzialną za proces różnicowania i dojrzewania włókien mięśniowych. MYOG z racji swojej kluczowej
roli w miogenezie jest obiektem wielu badań, natomiast MYF6 jest najpóźniej odkrytym i najsłabiej poznanym genem
z czterech genów z rodziny MyoD. Do tej pory jego sekwencja u świni nie była znana. W badaniach wykorzystano
sekwencje tego genu u myszy i człowieka do zaprojektowania (starterów), których produkty amplifikacji odpowiadają
regionowi promotorowemu oraz sekwencji kodującej wraz z występującymi w niej intronami, z wyłączeniem 3’UTR.
Otrzymane produkty PCR zsekwencjonowano, a sekwencje po złożeniu zostały zdeponowane w genetycznej bazie
danych NCBI pod numerami akcesyjnymi AY238474 i AY327443. Fragmenty obejmujące promotor i wszystkie trzy
eksony zostały poddane analizom PCR-SSCP, PCR-RF-MSSCP i HD, w wyniku których wykryto dwie sprzężone
transwersje (C do G i A do C) w obrębie pierwszego eksonu oraz tranzycję T do C w rejonie promotorowym. Wykonano
analizę frekwencji poszczególnych alleli u różnych ras świń oraz analizę homologii w porównaniu do sekwencji
dostępnych bazie danych NCBI. W przypadku genu MYOG znane są tylko mutacje w rejonach niekodujących. Sekwencje
kodujące i regulatorowe tego genu również poddano analizom PCR-MSSCP i PCR-RF-MSSCP i wykryto tranzycję C do
T występującą w pierwszym eksonie. Przeprowadzono analizę frekwencji poszczególnych alleli u różnych ras świń.
P184.
Polimorfizm w regionie 5’ genu receptora estrogenu ER bydła.
Tomasz Szreder, Lech Zwierzchowski
Zakład Biologii Molekularnej, Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt, Polska Akademia Nauk, ul. Postępu 1
Jastrzębiec, 05-552 Wólka Kosowska
Receptor estrogenowy należy do nadrodziny receptorów jądrowych i do rodziny receptorów steroidowych. Receptory
jądrowe uczestniczą w wielu procesach zachodzących w komórce i w całym organizmie, między innymi reprodukcji,
różnicowaniu, rozwoju, homeostazie oraz onkogenezie (Eng i wsp., 1997).
Receptor estrogenowy ER, jest białkowym czynnikiem transkrypcyjnym, który indukowany jest przez wiązanie
z ligandem. Po utworzeniu kompleksu z ligandem receptor jest zdolny do oddziaływania z DNA i regulowania
transkrypcji docelowych genów. U zwierząt i człowieka istnieją dwie izoformy receptora estrogenowego – ERa i ERb.
Naturalnymi ligandami dla obu receptorów są 17b estradiol, estron i estriol (piśmiennictwo – patrz: Tkaczyk i Kalita,
2001). W naszych badaniach, na podstawie dostępnych w bazie GenBank sekwencji ER człowieka, owcy i świni,
zaprojektowaliśmy startery do PCR, poddaliśmy amplifikacji siedem zachodzących na siebie fragmentów genu ERa
bydła, przeprowadziliśmy sekwencjonowanie produktów PCR, a następnie z tych odcinków złożyliśmy sekwencję 2853
pz regionu 5’ flankującego bydła, dotychczas nieznanego. Sekwencja została zdeponowana w bazie GenBank pod nr
AY340597. Posługując się uzyskaną przez nas sekwencją stwierdziliśmy także występowanie polimorfizmu w regionie 5’
receptora estrogenu α; prawdopodobnie jest to region promotora leżącego w obrębie eksonu C genu ER bydła. Znaleziony
przez nas polimorfizm jest tranzycją – substytucją nukleotydów A/G, rozpoznawaną przez trawienie enzymem BglI.
Stwierdziliśmy również występowanie tranzycji A/C, rozpoznawanej przez trawienie enzymem Mnl I. Ten polimorfizm
występuje w regionie promotora dla eksonu B. Wstępnie stwierdzono także występowania polimorfizmu w kodującym
eksonie 1 genu ERa bydła. Ekson ten jest odpowiedzialny za kodowanie domeny transaktywującej.
148
Genetyka zwierząt
P185.
Wpływ plazmidowego DNA wprowadzanego za pomocą PEI 750kDa/ albumina na
indukcję cytokin prozapalnych u myszy.
Ryszard Smolarczyk, Tomasz Cichoń, Aleksander Sochanik, Stanisław Szala
Zakład Biologii Molekularnej, Centrum Onkologii, Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie, ul. Wybrzeże Armii Krajowej 15, 44-101
Gliwice
Polietylenoimina o masie cząsteczkowej 750kDa z dodatkiem albuminy (PEI 750kDa/albumina) jest wykorzystywana
do transferu genów in vivo. Celem pracy było zbadanie i ocena poziomu stanu zapalnego indukowanego przez DNA
wprowadzonego in vivo przez ten nośnik.
Optymalna dla tego nośnika ilość plazmidowego DNA (1µg) wprowadzana do organizmu nie wywołuje odpowiedzi
układu odpornościowego. Ilość cytokin prozapalnych: TNF-alfa, IFN-gamma, IL-12 oznaczonych przy pomocy
Quantikine Kit firmy R&D jest na prawie zerowym poziomie.
Stwierdziliśmy także, że podanie PEI 750kDa/albumina z plazmidowym DNA co 3 dni umożliwia utrzymanie stale
wysokiego poziomu ekspresji genu, co może zapewnić ciągłą obecność białka terapeutycznego w ustroju przez dłuższy
okres czasu.
Dalsze zwiększenie ilości białka terapeutycznego można osiągnąć podając polipleks w obecności deksametazonu.
Naszym zdaniem, PEI 750kDa/albumina dzięki swojej wysokiej efektywności w transferze genów i stosunkowo niskiej
indukcji stanu zapalnego może być wykorzystana do transferu genów do płuc, np. do leczenia chorób genetycznych typu
mukowiscydozy.
P186.
Badania wpływu estrów kwasu ftalowego
[ftalan dibutylu i ftalan di(2-etyloheksylu)] na gonady samców myszy
laboratoryjnych testem kometowym oraz testem anomalii plemnikowych.
Ewa Tyrkiel, Małgorzata Dobrzyńska, Urszula Mikulska
Państwowy Zakład Higieny – Instytut Naukowo-Badawczy
Polskie Towarzystwo Genetyczne
Estry kwasu ftalowego należą do grupy związków chemicznych, które ze względu na szerokie zastosowanie i powszechne
występowanie w środowisku człowieka, cieszą się szczególnym zainteresowaniem.
Znajdują one przede wszystkim zastosowanie jako plastyfikatory przy produkcji polichlorku winylu.Tworzywa sztuczne,
które mogą zawierać do 50% wagowych ftalanów, stosowane są w praktyce biomedycznej, stomatologii,farmacji,
używane są do produkcji zabawek dla dzieci oraz opakowań do żywnosci. Ftalany znajdują też zastosowanie jako
rozpuszczalniki.
Przedmiotem niniejszych badań były: ftalan di(2-etyloheksylu /DEHP/ i ftalan dibutylu /DBP/). Związki te
charakteryzują się stosunkowo niską toksycznością dla zwierząt: DEHP ( myszy– 33,5 g/kg m.c., szczury –
30,6 g/kg m.c.), DBP (szczury – 8-20 g/kg m.c., myszy – 5-16 g/kg m.c.). Obydwa ftalany wykazują działanie teratogenne
i embrioletalne. DEHP, jak wykazano w dotychczas wykonanych badaniach, nie wywiera bezpośredniego działania
na DNA. Niemniej jednak stwierdzono, że przy wysokich dawkach związek ten indukuje dominujące mutacje letalne
w komórkach rozrodczych u samców myszy, oraz prowadzi do aneuploidalności w komórkach chomika chińskiego
(badania na hodowlach komórkowych). Brak natomiast jednoznacznych danych dotyczących oddziaływania DBP na
materiał genetyczny zwierząt.
W prezentowanych badaniach oceniano oddziaływanie DEHP i DBP na gonady i komórki rozrodcze samców myszy
laboratoryjnych stosując test kometowy oraz test anomalii plemnikowych.
Test kometowy używany jest do oceny uszkodzeń DNA, może też być przydatny przy ocenie procesów apoptozy.
Test anomalii plemnikowych jest testem niespecyficznym określającym zmiany w morfologii plemników. Zmiany te
mogą być spowodowane zarówno uszkodzeniami w materiale genetycznym, zaburzeniami w procesach podziałowych
komórek, jak i zakłóceniami procesów dojrzewania spermatyd.
Badane związki podawano przez 8 tygodni per os sondą dożołądkowo w dawkach stanowiących wartosci ułamkowe
wyznaczonej doustnej toksyczności ostrej LD50 .
Otrzymane wyniki wskazują na nieznaczny wzrost częstości komet przy najwyższej dawce DEHP (8000 mg/kg m.c.),
oraz odsetka plemników o zmienionej morfologii Stwierdzono też obniżenie ciężaru gonad zarówno przy podawaniu
zwierzętom DEHP jak i DBP.
149
Genetyka zwierząt
P187.
Polimorfizm genu białka szoku termicznego hsp 70-1 bydła.
Emilia Pers, Tatiana Adamowicz, Dorota Lechniak
Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza w Poznaniu, ul. Wołyńska 33, 60-637 Poznań
Białko szoku termicznego jest białkiem opiekuńczym powstającym w warunkach stresu termicznego. Zapobiega ono
denaturacji białek komórkowych pod wpływem czynników stresowych. Do tej pory opisano zaledwie jedno miejsce
polimorficzne typu SNP (single nucleotide polymorphism) w pozycji 238 sekwencji regulatorowej 3’UTR bydlęcego
genu hsp 70-1. Celem badań było ustalenie frekwencji poszczególnych form genotypowych pod względem opisanej
wcześniej mutacji A → G w pozycji 238 oraz poszukiwanie nowych mutacji we wspomnianym fragmencie tego genu.
Badaniami objęto 200 osobników kilku ras bydła (ncbxhf, limousine, białogrzbiete, zebu, hereford, charolaise, angus).
Poszczególne genotypy (AA, AG, GG) identyfikowano za pomocą enzymu AluI, a ich frekwencja była następująca: AA
– 0.97, AG – 0.025 i GG – 0.005.
Fragment sekwencji regulatorowej poddano również analizie SSCP przy użyciu automatycznego sekwenatora
AlfExpress. Zidentyfikowano nowe miejsce polimorficzne w analizowanym fragmencie (pozycje nukleotydów od 8 pz
do 161 pz) polegające na transwersji G → T oraz opracowano test RFLP umożliwiający identyfikację nowej mutacji.
Analiza restrykcyjna dała możliwość rozróżnienia dwóch alleli: G oraz T, a tym samym trzech genotypów GG, GT
oraz TT. W badanej populacji obejmującej po 10 zwierząt ras ncbxhf, białogrzbiete, limousin oraz 8 osobników zebu
stwierdzono następujące frekwencje genotypów: GG – 0.71, GT – 0.26 i TT – 0.03.
Niska frekwencja zmutowanych alleli w przypadku obu analizowanych mutacji odcinka 3`UTR genu hsp 70-1 świadczy
o wysokim konserwatyzmie genetycznym badanej sekwencji.
P188.
Przypadek polimelii u cielęcia.
Krzysztof Urbaniak (2), Paweł Antosik (2), Jędrzej M. Jaśkowski (2), Hieronim Frąckowiak (3),
Joanna Nowacka (1), Marek Świtoński (1)
(1) Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza Poznań, ul. Wołyńska 33, 60-637 Poznań
(2) Katedra Weterynarii Rolniczej, Akademia Rolnicza Poznań, ul. Wojska Polskiego 52, 60-625 Poznań
(3) Katedra Anatomii Zwierząt AR w Poznaniu, ul. Wojska Polskiego 28, 60-637 Poznań
Cielę płci żeńskiej, z czterema prawidłowymi kończynami i jedną dodatkową umiejscowioną między łopatkami
urodziło się w lipcu 2003 roku. Poród przebiegł prawidłowo, mimo iż ciąża trwała tylko 310 dni. Urodzeniowa masa
ciała była w normie. Dodatkowa kończyna była mniejsza, zgięta w stawie garstkowym, zakończona parzystymi racicami
i zwieszona na prawym boku zwierzęcia. Jej obecność nie upośledzała ruchu, a badanie palpacyjne wykazało, że jest
ona na trwałe umocowana do łopatki. Kończynę usunięto chirurgicznie i przekazano do badań anatomicznych. Analiza
cytogenetyczna zwierzęcia wykazała obecność prawidłowego kariotypu – 60,XX. Jednakże w 28% metafaz (28/100)
zaobserwowano liczne pęknięcia różnych chromosomów (od 1 do 3 w metafazie). Analiza rodowodu nie wykazała
zinbredowania. Polimelia jest rzadko obserwowaną wrodzoną wadą rozwojową bydła. W minionych trzech latach
opisano na świecie dwa takie przypadki – jeden w Szwajcarii u jałówki rasy holsztyńsko-fryzyjskiej oraz drugi w Japonii
u buhajka koreańskiej rasy rodzimej.
P189. Zaburzenia koniugacji chromosomów płci w spermatocytach samców myszy.
Jarosław Sosnowski (1) Magdalena Obarzanek-Fojt (1), Zbigniew Polański (2)
(1) Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza w Poznaniu, ul. Wołyńska 33, 60-637 Poznań,
e-mail: [email protected]
(2) Max-Planck Institute of Immunobiology in Freiburg, Department of Developmental Biology, Stübeweg 51, 79108
Freiburg, Niemcy
Występowanie uniwalentów w trakcie przebiegu gametogenezy opisywano u wielu gatunków ssaków. U samców myszy
występowanie uniwalentów dotyczy głównie chromosomów płci i może osiągać zróżnicowany poziom w różnych
szczepach. Jak dotąd nie jest jasne czy przyczyną tej anomalii jest brak koniugacji chromosomów X i Y czy też ich
przedwczesna dysocjacja przed zainicjowaniem anafazy I mejozy (AI). Celem niniejszych badań było porównanie
częstości występowania uniwalentów chromosomów płci w spermatocytach samców trzech szczepów wsobnych myszy:
CBA, C57/BL oraz SV 129. Z jąder samców (4-5 osobników/szczep) wykonano preparaty uwidaczniające kompleksy
synaptonemalne (SC) w stadium pachytenu profazy mejotycznej, oraz uwidaczniające chromosomy w stadium
metafazy I (MI). Wykazano, że poziom występowania uniwalentów chromosomów płci w spermatocytach w stadium
150
Genetyka zwierząt
MI różni się znacznie pomiędzy szczepami i wynosi odpowiednio: C57/BL – 8.4%, CBA – 17.9% oraz SV129 – 24.9%.
Analiza preparatów w mikroskopie świetlnym, uwidaczniających kompleksy synaptonemalne wykazała, że częstość
występowania zjawiska braku koniugacji chromosomów płci wynosi odpowiednio: C57/BL – 2.8%, CBA – 9,7% oraz
SV129 – 4.2%.
W świetle powyższego można wnioskować, że występowanie uniwalentów w MI jest skutkiem ich przedwczesnego
rozłączenia, a nie brakiem koniugacji w zygotenie.
*J. Sosnowski prowadził badania w ramach stypendium dla młodych doktorów przyznanego w 2001 roku przez Fundację
na Rzecz Nauki Polskiej (FNP)
Wyklad plenarny:
W86.
Gene expression in embryos
Jaana Peippo
MTT Agrifood Research Finland, Animal Production Research, Animal Breeding, FI-31600 Jokioinen, FINLAND
Developmental kinetics is an important tool for evaluating embryo viability. Zygotes that cleave early for the first time
are the ones most likely to reach the blastocyst stage. Blastulation is necessary to establish the first two differentiated
cell lines within an embryo, the inner cell mass and the trophectoderm, which contribute to the embryo and the
extraembryonic membranes, respectively. These events are controlled by precise expression of different genes during
preimplantation development.
After fertilisation, the first cleavages of a zygote are supported by maternally inherited RNA and protein reservoirs
established during oocyte maturation. The timing of transition from the maternal to the embryonic control of the
development is species– specific. In cattle, a minor activation of the embryonic genome occurs at the one to two-cell
stage, followed by the major activation at the eight to 16-cell stage.
In terms of viability, the in vivo produced embryos are superior to their in vitro produced counterparts, which, however,
are not a homogenous group either as, for example, the in vitro production protocol itself affects the embryo quality.
Embryos adjust their gene expression to the culture environment, which may also be used as a tool to improve embryo
production protocols.
When comparing the gene expression patterns of the in vivo and the in vitro produced embryos, differences can be
recognised and analysed. Techniques like Suppressive subtractive hybridisation and Micro array offer efficient tools to
carry out such comparisons as thousands of genes can be analysed at the same time.
Dziedziczenie wielogenowe
Komunikaty ustne:
W87.
Wpływ mutacji K232A w genie acylotransferazy diacyloglicerolowej 1 (DGAT1)
na wartość hodowlaną buhajów dla cech mleczności.
Jolanta Komisarek (1), Joanna Szyda (2), Zbigniew Dorynek (1)
(1) Katedra Hodowli Bydła, Akademia Rolnicza im. A. Cieszkowskiego w Poznaniu, ul. Wojska Polskiego 71A, 60-625 Poznań
(2) Katedra Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza we Wrocławiu, ul. Kożuchowska 7, 51-631 Wrocław
Trójglicerydy (triacyloglicerole) stanowią główną frakcję (ponad 98 %) związków tłuszczowych mleka. Szlak ich
syntezy rozpoczyna się najczęściej od 3-fosfoglicerolu, którego acylacja prowadzi do powstania kwasu fosfatydowego.
W wyniku przekształceń kwasu fosfatydowego powstają diacyloglicerole, a następnie trójglicerydy. Acylotransferaza
diacyloglicerolowa 1 (DGAT1) jest jednym z dwóch znanych enzymów katalizujących ostatni etap syntezy
151
Genetyka zwierząt
triacylogliceroli. U bydła, locus DGAT1 zlokalizowany jest na chromosomie 14. Jedna z jego mutacji, określana jako K232A,
polega na dwunukleotydowym podstawieniu AA –> GC w obrębie eksonu 8. Skutkiem tego, w pozycji 232 białkowego
produktu genu, w miejsce lizyny pojawia się alanina. Celem pracy było określenie wpływu polimorfizmu K232A na
wartość hodowlaną buhajów reprodukcyjnych dla wydajności mleka, białka i tłuszczu oraz procentowej zawartości białka
i tłuszczu w mleku. Badaniami objęto 147 osobników rasy holsztyno-fryzyjskiej. Genotypy identyfikowano metodą
PCR-RFLP. Zastosowany model statystyczny zawiera stały efekt DGAT1 oraz losowy efekt addytywnie poligeniczny.
Wpływ analizowanego polimorfizmu oszacowano stosując metodę najwyższej wiarogodności, w oparciu o model
statystyczny zawierający: (i) stałe efekty reprezentujące sezon-rok oceny oraz DGAT1, (ii) losowy efekt addytywnie
poligeniczny buhaja z macierzą (ko)wariancji reprezentowana przez macierz spokrewnień addytywnie poligenicznych
i komponent wariancji addytywnie poligenicznej oraz (iii) losowy efekt błędu z macierzą (ko)wariancji reprezentowaną
przez diagonalną macierz zawierająca odwrotności liczby córek wykorzystanych do oceny buhaja i komponent wariancji
błędu. Wartości obu komponentów przyjęto odpowiednio jako 30% i 70% całkowitej wariancji. W analizowanej populacji
frekwencja allelu K kodującego lizynę oraz A kodującego alaninę wynosiła odpowiednio 0.66 i 0.34.
Badania finansowane przez KBN (grant 2 P06D 017 26).
W88.
Identyfikacja loci chromosomowych kontrolujących parametry ruchu plemników
w oparciu o analizę wsobnych szczepów rekombinacyjnych u myszy.
Aniela Gołas, Paweł Grzmil, Józefa Styrna
Zakład Genetyki i Ewolucjonizmu, Instytut Zoologii Uniwersytetu Jagiellońskiego, ul. Ingardena 6, 30-060 Kraków
Rekombinacyjne szczepy wsobne myszy zyskują coraz większe uznanie w analizie genów wpływających na cechy
ilościowe. Zakład Genetyki i Ewolucjonizmu prowadzi od lat hodowlę takich szczepów wyprowadzonych ze
szczepów wsobnych KE i CBA/Kw znacznie różniących się parametrami płodności. Szczepy te są wykorzystywane
m.in. do lokalizacji genów zaangażowanych w kontrolę jakości gamet. Dzięki zastosowaniu metody komputerowo
wspomaganego systemu analizy jakości plemników (CASA) scharakteryzowano parametry ruchliwości plemników dla
samców z poszczególnych rekombinacyjnych szczepów wsobnych (RI EXCB i RI CBXE). W celu zlokalizowania genów
kontrolujących ruch plemników dla 11 chromosomów ustalono SDP czyli wzór rozkładu markerów mikrosatelitarnych,
którymi różnią się między sobą szczepy wyjściowe. Znaleziono 86 loci różnicujących rekombinacyjne szczepy wsobne
a średnia odległość między markerami na chromosomie wynosi 7 cM. Wykazano, że BCF (liczba przemieszczeń
główki plemnika z trajektorią średniego śladu) jest kontrolowany przez region 7q11, VSL (droga przebyta przez
plemnik ruchem prostoliniowym w jednostce czasu) jest kontrolowany przez 15q22 oraz 12q48 i VAP („wygładzona”
droga przebyta przez plemnik w jednostce czasu) jest kontrolowany przez 12q48 (p<0,001 dla wszystkich uzyskanych
korelacji). Analiza tych regionów pozwoliła na wytypowanie potencjalnych genów – kandydatów na geny kontrolujące
parametry ruchliwości plemników.
Praca finansowana z grantu BW/IZ/17a/2003
W89.
Dziedziczenie cech behawioralnych w teście otwartego pola w liniach myszy
wyprowadzonych z F2 (samica C x samiec L).
Elżbieta Wirth-Dzięciołowska, Marta Gajewska, Anna Łuczyszyn
Katedra Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierząt, Wydział Nauk o Zwierzętach, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, ul.
Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa
W wyniku prowadzonej przez 113 pokoleń selekcji ukierunkowanej na zmianę masy ciała uzyskano dwie linie myszy,
które zróżnicowały się również pod względem cech behavioralnych. Myszy ciężkie (C) są bardziej aktywne w teście
otwartego pola, popełniają mniej błędów w teście labiryntu i wymagają mniej czasu na jego pokonanie niż myszy lekkie
(L). Różnice te są statystycznie wysoko istotne.
W celu określenia dziedziczenia cech behavioralnych przeprowadzono kojarzenie do F2. Wszystkie zwierzęta
przetestowano w teście otwartego pola (OF).Następnie z pokolenia drugiego wybrano dwie grupy zwierząt; 15 samic
i samców charakteryzujących się wysoką aktywnością oraz podobną liczbę zwierząt o niskiej aktywności. Różnice
między oboma grupami były statystycznie wysoko istotne. Potomstwo uzyskane w grupie zwierząt aktywnych (A)
i nieaktywnych (B) różni się między sobą istotnie wzorem zachowań w teście OF. Myszy z grupy A są prawie dwa razy
aktywniejsze niż myszy z grupy B. W obu grupach zwierząt stwierdzono wyraźne różnice w aktywności osobników obu
płci. Samce są aktywniejsze niż samice zarówno pod względem zachowań eksploracyjnych w OF jak i liczby stójek.
Stwierdzono pozytywne koleracje między masą ciała i aktywnością zwierząt.
152
Genetyka zwierząt
W90.
Analiza efektów matczynych na długość życia wybranych gatunków zwierząt
utrzymywanych w ogrodach zoologicznych.
Anna Wolc, Anna Feder, Anna Waśniewska, Tomasz Sternicki, Tomasz Szwaczkowski
Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu, ul. Wołyńska
33, 60-637 Poznań
Długość życia jest cechą podstawową dla istnienia gatunku, co jest szczególnie ważne w odniesieniu do hodowli
i restytucji gatunków zagrożonych wyginięciem. Jest ona uwarunkowana zarówno przez czynniki genetyczne jak
i środowiskowe. Badania prowadzone na niektórych gatunkach zwierząt gospodarskich wskazują, że przeżywalność
osobnika, zwłaszcza w pierwszych dniach może być w znacznym stopniu uwarunkowana przez matkę. Celem pracy
była ocena wpływów matczynych genetycznych na długość życia trzech gatunków zwierząt utrzymywanych w ogrodach
zoologicznych (oryksa arabskiego, konia Przewalskiego i jelenia Dawida), które w swej historii przeszły przez
załamanie liczebności. Analiza objęto 1829 oryksów arabskich, 2083 konie Przewalskiego oraz 422 jelenia Dawida.
Dane pochodzą z Międzynarodowego Systemu Informacji o Gatunkach (ISIS). Parametry genetyczne szacowano na
podstawie modelu zwierzęcia uwzględniając efekty stałe: płci, roku, miejsca urodzenia oraz efekty losowe: genetyczny
addytywny, genetyczny matczyny, kowariancję między efektem genetycznym bezpośrednim i matczynym. Do analizy
użyto pakietu DFREML. Niskie estymatory odziedziczalności bezpośredniej (<0.06) uzyskane dla populacji konia
Przewalskiego i oryksa arabskiego sugerują znaczny wpływ czynników środowiskowych na kształtowanie analizowanej
cechy (współczynnik ten dla jelenia Dawida wyniósł 0.35). Jednak pewne niedoszacowanie parametrów może także
wynikać z rozkładu długości życia odbiegającego od normalnego (bardzo wysoka śmiertelność w pierwszych dniach)
oraz ograniczonych liczebności badanych populacji. Natomiast powtarzalne wartości oszacowania wariancji genetycznej
matczynej na poziomie kilku procent ogólnej zmienności fenotypowej potwierdzają istnienie wpływu matki na długość
życia potomstwa. Uzyskano ujemne zależności między efektami genetycznymi bezpośrednimi i matczynymi dla konia
Przewalskiego i jelenia Dawida. Natomiast dla oryksa arabskiego zależności (chociaż dodatnie) te były bardzo bliskie
zeru. Mimo podobnej historii wszystkich trzech gatunków (odbudowanie obecnej populacji od niewielkiej liczby
założycieli), przeprowadzone badania wskazały na ich znaczne genetyczne zróżnicowanie.
W91.
DNA fingerprinting linii królików selekcjonowanych na aktywność w otwartym polu.
Mariusz Sacharczuk, Kazimierz Jaszczak, Tadeusz Jezierski, Rafał Parada, Aleksandra Górecka
Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN w Jastrzębcu
DNA fingerprinting wykrywa wiele fragmentów DNA, które są dziedziczone wzorem Mendla. Te wysoko polimorficzne
fragmenty DNA wywodzą się z minisatelitarnych loci, które są rozproszone na większości chromosomów. Dlatego
DNA fingerprinting jest wysoce skuteczną metodą w identyfikacji osobników oraz w określaniu struktury genetycznej
populacji i podobieństwa między populacjami. Przy pomocy tej techniki przeprowadzono badania na liniach królików
selekcjonowanych rozbieżnie przez 8 pokoleń w kierunku wysokiej (H) i niskiej (L) aktywności w otwartym polu.
Analizę zmienności pomiędzy liniami wykonano na mix-ach otrzymanych z wymieszania równej ilości DNA 10-ciu
osobników, natomiast stopień zmienności wewnątrz linii określono na podstawie wzorów prążkowych 4 osobników
indywidualnych każdej z linii. Zastosowano enzym restrykcyjny HinfI i sondę molekularną 33.6. Stopień zmienności
wewnątrzliniowej nie różnił się statystycznie pomiędzy liniami i wynosił odpowiednio 0,7701 i 0,7478 u linii H i L. Na
podstawie analizy reprezentacyjnego DNA (10 osobników w każdej linii) stwierdzono obecność prążka ( o m.cz. ok. 15
tys. pz), charakterystycznego tylko dla linii L. Największa zmienność charakteryzowała minisatelity o długości 17-20
tys. pz. Wskaźnik zmienności genetycznej między obiema liniami wynosił 0,7143, natomiast dystansu genetycznego
0,3262. Wystąpienie różnic w obrazie DNA fingerprinting świadczy o powstaniu zróżnicowania genetycznego
między selekcjonowanymi liniami królików, a obecność prążka markerowego w linii L o możliwości sprzężenia loci
minisatelitarnych z genem (-ami), które determinują selekcjonowaną cechę aktywności w otwartym polu.
153
Genetyka zwierząt
Komunikaty plakatowe:
P190.
Badania nad parametrami genetycznymi cech pokroju u wybranych odmian
barwnych norek (Mustela vison Sch.).
Dorota Kołodziejczyk, Stanisław Socha
Zakład Metod Hodowlanych i Hodowli Zwierząt Futerkowych, Akademia Podlaska, ul. B. Prusa 12, 08-110 Siedlce
W okresie 3 lat badaniami objęto fermę hodowlaną norek znajdującą się w Południowo-Wschodniej Polsce. W fermie
były następujące odmiany barwne norek: standardowa, pastelowa, biała Hedlunda, szafirowa. Celem pracy było
szacowanie wskaźników odziedziczalności oraz korelacji genetycznych, fenotypowych i środowiskowych cech pokroju
norek – cech ocenianych podczas jesiennych licencji, w okresie pełnej dojrzałości okrywy włosowej. Wartości wskaźników
odziedziczalności cech kształtowała się na zróżnicowanym poziomie, najwyższą wartość uzyskała jakość okrywy (w tym
długość i gęstość włosów) 0,613. Odziedziczalność pozostałych cech kształtowała się następująco: wielkość zwierząt
(wyrażona w gramach) 0,205, wielkość norek wyrażona w punktach 0,279, czystość barwy 0,419 i łączna suma punktów
0,384. Istniejąca zmienność genetyczna w stadzie norek jest jednym z warunków uzyskania postępu hodowlanego
i poprawę wartości użytkowej zwierząt. Korelacje genetyczne wahały się od –0,200 do 0,668. Wysokie korelacje wystąpiły
pomiędzy łączną sumą punktów a poszczególnymi cechami: wielkością zwierząt (wyrażoną w punktach) 0,609, czystością
barwy 0,668, i jakością okrywy włosowej 0,355. Ujemne korelacje genetyczne stwierdzono: pomiędzy wielkością
norek a jakością okrywy (-0,200), oraz pomiędzy czystością barwy a jakością okrywy (-0,198). Korelacje fenotypowe
w porównaniu z genetycznym były w węższym przedziale: od –0,071 (pomiędzy wielkością a jakością okrywy) do 0,640
(pomiędzy wielkością a łączną sumą punktów). Wysoka i istotna zależność pomiędzy wielkością norek a łączną sumą
punktów świadczy o znaczącym wpływie tej cechy na ocenę łączną. Korelacje środowiskowe w stadzie norek wahały się
od –0,199 (wielkością zwierząt a czystością okrywy) do 0,661 (wielkością norek a łączną sumą punktów).
P191.
Porównanie wzorów zachowań myszy selekcjonowanych na zmianę masy ciała
i ich potomstwa z pokolenia F1 i F2.
Elżbieta Wirth-Dzięciołowska, Marta Rybicka
Katedra Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierząt, Wydział Nauk o Zwierzętach, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, ul.
Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa
W wyniku prowadzonej przez 113 pokoleń selekcji w kierunku zmiany masy ciała myszy uzyskano dwie linie; lekką (L)
o średniej masie ciała 20g i ciężką (C) o średniej masie ciała 40g. Myszy te zróżnicowały się pod względem wielu cech
fizjologicznych a także pod względem cech behavioralnych. Myszy L są mniej aktywne w teście otwartego pola (OF),
popełniają więcej błędów w teście labiryntu i wymagają więcej czasu na jego pokonanie niż myszy ciężkie. Różnice te
są statystycznie wysoko istotne. W celu określenia dziedziczenia cech behavioralnych przeprowadzono kojarzenie do
F2 między samicami linii C i samcami linii L. Zwierzęta pokolenia rodzicielskiego, F1 i F2 przetestowano testem OF.
Analizowano aktywność zwierząt określaną liczbą pokonanych pól w jednostce czasu, liczbą stójek a także oceniano
zachowania świadczące o reakcji stresowej takie jak; grooming, defekacja i urynacja. Myszy L miały inny wzór
eksploatacji OF i aktywności niż myszy C. Miały również większą liczbę groomingów, defekacji i urynacji. Stwierdzono
nieco inny wzór zachowań samców i samic w obu liniach rodzicielskich. W pokoleniach F1 i F2 również występowały
istotne różnice we wzorach zachowań samców i samic. Stwierdzono, że większość analizowanych cech ma charakter
cech ilościowych. W przypadku aktywności liczonej liczbą pokonanych pól wystapil wyraźny efekt heterozji.
P192.
Parametry genetyczne plenności w populacji koni pełnej krwi angielskiej.
Anna Bresińska, Anna Wolc, Laura Wachowska, Tomasz Szwaczkowski
Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt, Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu, ul. Wołyńska
33, 60-637 Poznań
Ciąże mnogie stanowią poważny problem ekonomiczny w hodowli koni pełnej krwi angielskiej, gdyż występują tam ze
zwiększoną częstością. Przyczyniają się do strat wynikających z poronień i niższej wartości użytkowej źrebiąt. Celem
154
Genetyka zwierząt
pracy było oszacowanie odziedziczalności i powtarzalności oraz trendów genetycznych i środowiskowych plenności
koni pełnej krwi angielskiej. Badaniami objęto wyniki rozpłodowe 2033 klaczy urodzonych w latach 1929-1993
w jedenastu stadninach. Plenność definiowano jako liczbę urodzonych w sezonie źrebiąt włączając jałowość (plenność
I) oraz pomijając ją (plenność II). Parametry genetyczne szacowano na podstawie modelu zwierzęcia uwzględniając
efekty stałe: stadniny i roku urodzenia klaczy oraz efekty losowe: genetyczny addytywny i środowiskowy trwały.
Analizę danych przeprowadzono stosując algorytm AI-REML. Ciąże bliźniacze wystąpiły u 368 klaczy, natomiast
trojacze u 2, co łącznie stanowi 2.7% badanej populacji. Estymatory współczynników odziedziczalności kształtowały się
następująco: 0.019 (plenność I) oraz 0.016 (plenność II). Natomiast powtarzalność wynosiła 0.026 (plenność I) i 0.031
(plenność II). Generalnie, oszacowania obu parametrów były bliskie zeru. Koresponduje to z wcześniejszymi badaniami
przeprowadzonymi przez autorów w odniesieniu do populacji koni pełnej krwi angielskiej, jak również z wynikami
uzyskanymi dla plenności bydła. Uzyskane niskie estymatory odziedziczalności mogą być zarówno wynikiem
znacznego wpływu czynników środowiskowych na kształtowanie analizowanej cechy, jak i jej rozkładu odbiegającego
od normalnego. Trendy genetyczne i fenotypowe są nieujemne, występują jednak duże fluktuacje. Może to wiązać się
z wprowadzeniem do rozrodu określonych osobników męskich, co z kolei sugeruje segregację pojedynczego genu
determinującego tę cechę.
P193.
Poziom inbredu w populacji Panthera uncia.
Tomasz Sternicki, Tomasz Szwaczkowski
Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt Akademii Rolniczej im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu, ul. Wołyńska 33,
60-637 Poznań
Głównym celem badań było określenie poziomu zinbredowania i jego zmian w populacji pantery śnieżnej (Panthera
uncia), utrzymywanej w ogrodach zoologicznych oraz innych populacjach zamkniętych. Spośród wielu przedstawicieli
dzikich kotów, Panthera uncia jako jedna z nielicznych należy do gatunku, którego hodowla prowadzona jest
według ścisłych programów restytucyjnych. Placówki hodowlane, mając do dyspozycji ograniczone liczebnie grupy,
z konieczności kojarzą osobniki w bliskim pokrewieństwie, co w konsekwencji prowadzi do wzrostu poziomu
zinbredowania. To z kolei zubaża pulę genową populacji, przyczyniając się do ujawnienia się depresji inbredowej,
szczególnie w odniesieniu do tzw. cech przystosowawczych. Analizą objęto dane rodowodowe (pochodzące
z Międzynarodowego Systemu Informacji o Gatunkach – ISIS) dotyczące 2080 osobników urodzonych w latach
1915-2003. Po dokonaniu selekcji danych, z obliczeń wyeliminowano informacje o osobnikach z niekompletnymi
rodowodami. Tak więc, bazując na macierzy spokrewnień addytywnych, współczynniki inbredu oszacowano dla 1709
osobników. Generalnie, średni poziom wzrostu homozygotyczności w badanej populacji był niski (1.22%). Wykazywał
jednak stosunkowo duże zróżnicowanie. Największe wartości współczynników inbredu odnotowano dla grupy 29
osobników urodzonych w latach 1971-79. Poziom inbredu tej grupy osobników osiągnął 25%. W kolejnych latach
odnotowano tendencję spadkową.
P194.
Parametry genetyczne udziału jaj pękniętych w kolejnych okresach nieśności.
Anna Wolc (1), Małgorzata Twardowska (1), Tomasz Szwaczkowski (2)
(1) Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt Akademii Rolniczej w Poznaniu
(2) Centrum Hodowli Zarodowej MESSA w Mieni
Występowanie jaj pękniętych i uszkodzonych stanowi poważny problem ekonomiczny w produkcji drobiarskiej.
Pęknięcie jaja jest wypadkową wielu czynników (grubość i struktura skorupy, masa jaja) mających zarówno podłoże
genetyczne jak i środowiskowe. Celem pracy było oszacowanie współczynnika odziedziczalności procentu jaj
pękniętych w miesięcznych okresach nieśności. Analizowano dane 932 kur rasy Rhode Island ze stadek selekcyjnych
utrzymywanych w Centrum Hodowli Zarodowej MESSA w Mieni. Średni udział jaj pękniętych wynosił 1% (wahając
się od 0.26-2.77%). Parametry genetyczne szacowano na podstawie wielocechowego modelu zwierzęcia. Obliczenia
wykonano stosując pakiet DFREML. Dla całego badanego okresu uzyskano niski estymator odziedziczalności h2
=0.1. W poszczególnych miesiącach współczynnik ten przyjmował wartości od 0.01 do 0.08. Od 9 miesiąca nieśności
zaznaczyła się dla odziedziczalności tendencja rosnąca. Korelacje genetyczne z nieśnością w poszczególnych
okresach były ujemne (zawierając się w przedziale od –0.88 do –0.19) z wyjątkiem miesiąca czwartego (0.29).
Sugeruje to możliwość obniżania udziału jaj uszkodzonych z jednoczesnym zwiększaniem ich produkcji.
155
Genetyka zwierząt
P195.
Aktywność LDH, AspAT i AlAT w surowicy krwi osobników rodzicielskich i pokolenia
F1 wybranych ras owiec.
Jolanta Rysińska (1), Hanna Stępkowska (1), Tadeusz Rychlik (2)
(1) Zakład Genetyki, Instytut Biologii, Akademia Świętokrzyska, Kielce
(2) Zakład Immunologii i Cytogenetyki, Instytut Zootechniki w Balicach k/Krakowa
Do doskonalenia populacji przydatne są te zależności między cechami, które mają istotne znaczenie ekonomiczne i te,
które powodują, że selekcja na jedną z tych cech wpływa pozytywnie na inną.
Celem eksperymentu było zbadanie, w jaki sposób zachodzi dziedziczenie aktywności LDH, AspAT i AlAT w surowicy
krwi wybranych ras owiec. Materiał do badań stanowiła surowica krwi 153 osobników rodzicielskich i pokolenia F1
owiec ras czarnogłówka, leine, merynos polski, charollais i mieszańców międzyrasowych.
Analiza statystyczna wyników wskazuje, że różnice w aktywności LDH, AspAT i AlAT dla matek i ojców były
istotne statystycznie. Podobny wynik uzyskano porównując aktywność enzymów ojców i dzieci. Natomiast różnice
w aktywności analizowanych enzymów dla matek i dzieci okazały się nieistotne statystycznie.
Przedstawione wyniki doświadczenia mogą wskazywać na większy wpływ genetyczny matki niż ojca na obserwowaną
u ich potomstwa aktywność LDH, AspAT i AlAT w surowicy krwi.
P196.
Model wielocechowy w ocenie parametrów genetycznych nieśności miesięcznych
i kumulowanych kur.
Anna Wolc (1), M. Lisowski (2), T. Szwaczkowski (1)
(1) Katedra Genetyki i Podstaw Zwierząt, Akademii Rolniczej im. A. Cieszkowskiego w Poznaniu
(2) Oddział Badawczy Drobiarstwa Instytutu Zootechniki w Zakrzewie
Selekcja kur nieśnych w stadach zarodowych w Polsce ukierunkowana jest głównie na zwiększenie liczby jaj. Efektywność
pracy hodowlanej determinowana jest w dużym stopniu wczesnością dokonywanej selekcji. Z tego względu ważnym
jest określenie odziedziczalności oraz korelacji genetycznych i fenotypowych cząstkowych okresów nieśności. Stanowiło
to przedmiot badań niniejszej pracy. Analizie poddano dane użytkowości nieśnej 6646 kur rodu A22 ( Rhode Island
White) utrzymywanych w Oddziale Badawczym Drobiarstwa Instytutu Zootechniki w Zakrzewie w latach 1995-1997.
Analizowano pierwszych sześć miesięcy nieśności. Parametry genetyczne nieśności miesięcznych i kumulowanych
oszacowano metodą AI-REML na podstawie wielocechowego modelu zwierzęcia. Średnie badanej cechy zawierały
się w przedziale od 7.9 w miesiącu pierwszym (okres wchodzenia w nieśność) do 27.1 w miesiącu trzecim (szczyt
nieśności). Największym współczynnikiem zmienności charakteryzował się pierwszy miesiąc (94.1%). Dla tego okresu
oszacowano także najwyższy udział wariancji genetycznej w wariancji fenotypowej h2 = 0.43. Na podstawie nieśności
kumulowanych można zaobserwować, że w miarę wydłużania okresu oceny współczynnik odziedziczalności obniżał się,
co wynika z niższego niż w przypadku wariancji fenotypowej wzrostu wariancji genetycznej addytywnej.
P197.
Parametry genetyczne cech reprodukcyjnych zwierząt futerkowych.
Stanisław Socha, Dorota Kołodziejczyk, Aldona Gontarz
Zakład Metod Hodowlanych i Hodowli Zwierząt Futerkowych, Akademia Podlaska, ul. B. Prusa 12, 08-110 Siedlce
W pracy oszacowano wskaźniki powtarzalności podstawowych cech reprodukcyjnych: liczby urodzonych i odchowanych
młodych oraz korelacie pomiędzy tymi cechami a cechami jakości okrywy włosowej. Badaniami objęto populację norek,
lisów polarnych i pospolitych oraz szynszyli. Najwyższą plennością charakteryzowały się samice w 2 i 3 roku użytkowania.
Do zdecydowanego natomiast zmniejszenia plenności doszło po 4 roku użytkowania samic. Wskaźnik powtarzalności
liczby urodzonych młodych w stadzie norek wynosił 0,150, u lisów polarnych 0,187, pospolitych 0,190 i szynszyli 0,157.
Wskaźniki powtarzalności odchowanych młodych były natomiast następujące: norek 0,12, lisów pospolitych 0,228, lisów
polarnych 0,167 oraz szynszyli 0,180. Uzyskane wartości wskazują, że cechy związane z rozrodem zwierząt – w tym
z rozrodem zwierząt futerkowych – są w decydującej stopniu zależne od czynników środowiskowych. Tym
niemniej długotrwała selekcja prowadzona w stadach tych zwierząt daje pożądane efekty. Z kolei oszacowane korelacje
zarówno fenotypowe, jak również genetyczne pomiędzy cechami reprodukcyjnymi a cechami okrywy włosowej były
ujemne. Niskie były korelacje pomiędzy plennością samic a liczebnością miotu, z którego pochodziły. Zmienność cech
mierzona wielkością współczynników zmienności wahała się – w zależności od gatunku zwierząt i roku użytkowania
samic –od około 20 do 50%. Istniejąca zmienność fenotypowa cech ma swoje uwarunkowanie w założeniach
156
Genetyka zwierząt
genetycznych zwierząt, umożliwiających osiąganie postępu hodowlanego w zakresie cech reprodukcyjnych. Pomimo
prowadzonej długotrwałej selekcji zmienność cech reprodukcyjnych pozostaje w dalszym ciągu na wysokim poziomie.
157
Notatki
158
Genetyka roślin
W92.
Splicing intronów typu U12 (AT-AC) u roślin
Artur Jarmołowski
Zakład Ekspresji Genów, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu
Splicing pre-mRNA, czyli proces wycinania intronów i precyzyjnego łączenia ze sobą sekwencji kodujących zwanych
egzonami, jest jednym z kluczowych etapów ekspresji genów u wyższych eukariontów; ekspresja wielu genów
kodujących białka może być kontrolowana na tym właśnie etapie. Regulacji może podlegać wybór miejsc splicingowych,
a także sama wydajność procesu. Prowadzi to do powstania wielu różnych wariantów białek pochodzących z jednego
genu, co znacznie zwiększa pojemność genetyczną genomów ekariotycznych.
Geny kodujące białka zawierają dwie klasy intronów. Pierwsza z nich, to tak zwane introny typu U2 (inaczej introny
zależne od snRNP U2), powszechnie występujące w eukariotycznych genomach jądrowych. Stanowią one zwykle
ponad 99,5 % wszystkich zidentyfikowanych sekwencji interweniujących. Druga klasa, to introny typu U12 (inaczej
zależne od snRNP U12, dawniej nazywane również intronami ATAC); występują one w pre-mRNA sporadycznie a ich
liczba nie przekracza zwykle 0,5 % wszystkich intronów. Obie klasy intronów wycinane są z pre-mRNA przez dwa
różne, skomplikowane kompleksy rybonukleoproteinowe zwane spliceosomami U2 i U12. W przypadku usuwania
z prekursorów mRNA intronów typu U2, w procesie uczestniczą: U1, U2, U4, U5 i U6 snRNP. W tworzeniu spliceosomu
U12 biorą udział: U11, U12, U4atac, U5 i U6atac snRNP. Jedyną wspólną cząstką snRNP w obu spliceosomach jest U5.
Pomimo wyraźnych różnic w budowie spliceosomu U2 i U12, wydaje się, że sama reakcja wycinania intronów obu klas
przebiega bardzo podobnie. Pierwszy scharakteryzowany intron U12 wyróżniał się od intronów klasycznych nukleotydami
występującymi na jego końcach 5’ i 3’: zamiast klasycznego GT-AG, zaczynał i kończył się dwunukleotydami AT-AC.
Dalsze badania wykazały, że nie jest to cecha charakterystyczna intronów tej klasy. O przynależności do intronów U12
świadczy natomiast: zachowawcza sekwencja w miejscu splicingowym 5’ (egzon: G/ATATCCTY), charakterystyczna
sekwencja w miejscu rozgałęzienia (TCCTTRAY; miejsce rozgałęzienia podkreślono) oraz znacznie mniej zachowawcza
sekwencja w miejscu splicingowym 3’ (YAC/G: egzon).
W genomie Arabidopsis thaliana zidentyfikowano do tej pory 165 intronów U12, co stanowi około 0,15% wszystkich
intronów występujących u tej rośliny. Do badań wybraliśmy trzy genu rzodkiewnika posiadające, oprócz licznych
intronów U2, pojedyncze introny U12. Były to geny: CBP20, GSH2 i LD. Eksperymentalnie przeanalizowaliśmy
czynniki wpływające na wydajność splicingu intronów U12 w badanych genach. Wykazaliśmy, że na wydajność splicingu
intronów U12 u roślin wpływają: wysoka zawartość AT w sekwencji interweniującej, wydajny splicing sąsiadujących
z intronem U12 intronów klasycznych typu U2, oraz swoiste sekwencje wzmacniające splicing występujące w egzonach
otaczających intron U12 (ESE, ang. exonic splicing enhancer). Co więcej, wykazaliśmy, że RBP45, białko należące do
rodziny polipeptydów wiążących się do RNA o wysokiej zawartości AT, bierze udział w selekcji miejsc splicingowych
w roślinnych intronach U12.
159
Genetyka roślin
Genetyka molekularna
Komunikaty ustne:
W93.
Mosaic cucumber line MSC16 carries mitochondrial genome rearrangement and
shows increased alternative oxidase (AOX) expression.
Grzegorz Bartoszewski (1), S. Malepszy (1), M. J. Havey (2)
(1) Department of Plant Genetics, Breeding and Biotechnology Warsaw Agricultural University Nowoursynowska 166,
02-787 Warsaw Poland
(2) Vegetable Crops Unit, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Dep. of Horticulture, 1575 Linden
Drive, University of Wisconsin, Madison, WI 53706, USA
The mosaic cucumber line MSC16 phenotype shows slower growth and mosaic type of leaf spots (Malepszy et al 1996)
and is associated with complex mitochondrial rearrangements causing DNA deletions and duplications (Bartoszewski
et al 2004). Alternative oxidase (AOX), a nuclear-encoded component of the plant respiratory chain, functions to
prevent the oxygen free radicals formation. AOX is differentially expressed during normal plant development and in
response to stresses. AOX expression is influenced by mitochondrial genome rearrangements (Karpowa et al 2002).
Using degenerated primers, we cloned and sequenced conserved regions of the cucumber Aox gene. Southern-blot
hybridization revealed a single band suggesting that there is one copy or small Aox multigene family in the cucumber
genome. Aox transcript level was increased in leaves and male flowers of MSC16 cucumber as compared with control
inbred line B. Immunoblotting of total or mitochondrial proteins with anti-AOX monoclonal antibody showed clearly
that AOX is present in leaves and flowers of MSC16 and is almost not delectable in control line B. Our experiments
indicate that AOX expression is increased in MSC16 cucumber suggesting that this line is experiencing continuous
oxidative stress and AOX expression is probably post-translationally regulated.
Bartoszewski G, Malepszy S, Havey MJ 2004 Mosaic (MSC) cucumbers regenerated from independent cell cultures
possess different mitochondrial rearrangements Curr Genet 45; 45-53
Karpova OV, Kuzmin EV, Elthon TE, Newton, KJ 2002 Differential expression of alternative oxidase genes in maize
mitochondrial mutants. Plant Cell 14; 3271-3284
Malepszy S, Burza W, Smiech M 1996 Characterization of a cucumber (Cucumis sativus L.) somaclonal variant with
paternal inheritance. J Appl Genet 37; 65-78
W94.
Identyfikacja rodzaju cytoplazmy obecnej w polskich populacjach żyta uprawnego
z użyciem krzyżowań testowych i markerów SCAR.
Stefan Stojałowski (1), Miłosława Jaciubek (2), Marek Szklarczyk (3)
(1) Katedra Genetyki i Hodowli Roślin, Akademia Rolnicza w Szczecinie, Słowackiego 17, 71-434 Szczecin
(2) Instytut Fizjologii Roślin im. Franciszka Górskiego, Polska Akademia Nauk, Niezapominajek 21, 30-239 Kraków
(3) Katedra Genetyki, Hodowli i Nasiennictwa, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie, 29 listopada 54,
31-425 Kraków
Cytoplazmy wywołujące męską sterylność (cms) są powszechnie obecne w populacjach żyta uprawnego. W dotychczas
przeprowadzonych badaniach stwierdzano, że zarówno w polskich jak i innych europejskich populacjach żyta z dużą
częstotliwością występuje sterylizująca cytoplazma typu cms-V. Dlatego istnieje potrzeba opracowania łatwego
i szybkiego sposobu identyfikowania typu cytoplazmy występującej w materiałach hodowlanych. Dotychczas stosowana
do tego celu metoda bazuje na ocenie płodności potomstw uzyskiwanych z odpowiednio zaprojektowanej serii
krzyżowań i jest określana mianem testu plazmotypu z genotypem. Jej podstawową wadą jest czasochłonność, gdyż
do pełnej identyfikacji typu cytoplazmy konieczne jest uzyskanie przynajmniej trzech pokoleń mieszańców. Znacznie
160
Genetyka roślin
szybsze i mniej pracochłonne jest zastosowanie techniki markerów molekularnych wykorzystujących PCR. W pracy
określono typ cytoplazmy 55 roślin pochodzących z siedmiu aktualnie uprawianych w Polsce odmian populacyjnych
żyta. Poza klasycznym testem plazotypu z genotypem w badaniach wykorzystano markery SCAR opracowane ostatnio
w ramach współpracy pomiędzy Akademiami Rolniczymi w Krakowie i Szczecinie. Uzyskane przy użyciu obu metod
rezultaty identyfikacji cytoplazm były w pełni zgodne. Większość z badanych roślin posiadała cytoplazmę sterylizującą
z grupy cms-V. Cytoplazma normalna była obecna tylko u 6 roślin wywodzących się z czterech odmian: Amilo, Hegro,
Kier i Walet. W badanej grupie roślin nie stwierdzono obecności cytoplazmy cms Pampa. Uzyskane wyniki, pomimo
niewielkiej liczebności analizowanych obiektów, świadczą o wiarygodności rezultatów uzyskiwanych przy zastosowaniu
nowo opracowanych markerów molekularnych.
W95.
Występowanie, organizacja i ekspresja sekwencji chimerycznej z mitochondrialnego
DNA form męskosterylnych cebuli.
Marek Szklarczyk (1), Katarzyna Sala (1), Katarzyna Walinowicz (1), Beata Rogowska (1), Magdalena Simlat (1),
Grażyna Ba (2) i Barbara Michalik (1)
(1) Katedra Genetyki, Hodowli i Nasiennictwa, Akademia Rolnicza w Krakowie, Al. 29-go Listopada 54, 31-425 Kraków
(2) Instytut Ekspertyz Sądowych, ul. Westerplatte 9, 31-033 Kraków
Nasiona mieszańcowe cebuli produkuje się przy użyciu linii cytoplazmatycznie męskosterylnych (CMS). W hodowli
tego gatunku, oprócz normalnej męskopłodnej cytoplazmy N, wykorzystywane są trzy cytoplazmy sterylizujące: S,
C i T. Zastosowaliśmy technikę vectorette PCR do poszukiwania sekwencji mitochondrialnego DNA różnicujących
poszczególne typy cytoplazm hodowlanych cebuli. W wyniku tych badań udało się zidentyfikować region genomu
mitochondrialnego występujący wyłącznie w cytoplazmach sterylizujących. Analiza sekwencji nukleotydowej ujawniła
chimeryczny charakter tego regionu. Zawiera on fragmenty standardowych genów mitochondrialnych jak również
odcinek o nieznanym pochodzeniu. Ustalono także, że sekwencje znajdujące się powyżej locus chimerycznego
różnicują cytoplazmy S/C i T. Natomiast sekwencje położone bezpośrednio poniżej tego regionu są prawie identyczne,
niezależnie od tego, z jakiego źródła sterylności pochodzą. Dzięki znajomości otoczenia genomowego locus
chimerycznego zaprojektowano marker typu SCAR do identyfikacji genotypów cytoplazmatycznych cebuli. Marker
ten jest obecnie wykorzystywany do testowania materiałów kilku polskich firm prowadzących hodowlę heterozyjną tej
rośliny. Zidentyfikowana sekwencja chimeryczna cebuli ulega ekspresji na poziomie RNA. Odpowiednie transkrypty
wykryto zarówno techniką RT-PCR jak i Northern blotting. Zaobserwowano zróżnicowaną obróbkę tego mRNA
u roślin męskosterylnych i męskopłodnych z cytoplazmą T. Dane te wskazują, że znaleziona u form CMS sekwencja
chimeryczna może brać udział w ekspresji cechy męskiej sterylności.
W96.
Construction of differential expression profiles by cDNA – DSC method in cucumber
floral buds (Cucumis sativus L.).
Magdalena Ewa Kowalczyk, Zbigniew Przybecki
Department of Plant Genetics, Breeding and Biotechnology, Warsaw Agricultural University, Nowoursynowska 166, 02-787
Warsaw, Poland
The aim of this study was a construction of differential expression libraries of genes products from cucumber floral
buds. Two pairs of cucumber near isogenic lines of different sexes were used (Cucumis sativus L.): monoecious line
B10 (ff/MM/GyGy) and gynoecious line 2gg (ff/MM/gygy), gynoecious line Gy3 (FF/MM/GyGy) and hermaphrodite
line HGy3 (FF/mm/GyGy). Cucumber floral buds at the stage of 1 – 2 mm are bisexual without any morphological
differences between sexes. We applied cDNA – DSC (Luo et al., Nucleic Acid Research, 1999, 27:24e) method to
construct differential expression profiles. Expression analysis of products expressed differentially between buds of
different sexes could facilitate understanding of sex determination and flower differentiation in cucumber plant.
The cDNA – DSC method is one of the methods of subtractive hybridization. As a result four differential subtraction
libraries were obtained, which consist: 44 tags for cDNA-DSC B102gg, 23 for cDNA – DSC 2ggB10, 41 for cDNA-DSC
Gy3Hgy3 and 14 for cDNA-DSC Hgy3Gy3.
The verification of obtained results was performed by dot blot hybridization with previously obtained differential cDNA
DH (Przybecki et al., Cell Mol Biol Lett. 2003, 8 (2): 421-38) libraries (obtained by differential hybridization method).
Firstly we confirm the presence of homologous sequences coming from DH and cDNA-DSC methods. Secondly, the
application of these two methods increases the range of gene products, which are differentially expressed among buds of
different sexes. The expression specificity was confirmed by hybridization of libraries with sscDNA.
161
Genetyka roślin
W97.
Kostytutywna i organo-specyficzna ekspresja antygenu M-HBsAg w tytoniu.
Tomasz Pniewski (1), Anna Kostrzak (1), Józef Kapusta (2), Andrzej Płucienniczak (3)
(1) Instytut Genetyki Roślin PAN, Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań
(2) w trakcie zmiany miejsca pracy
(3) Instytut Biotechnologii i Antybiotyków, Starościńska 5, Warszawa
Wirusowe zapalenie wątroby typu B (wzwB) jest chorobą dotykającą ponad 350 mln ludzi na całym świecie. Liczba
ta powiększa się mimo coraz lepszej dostępności szczepionki pochodzenia drożdżowego, opartej na małym antygenie
powierzchniowym S-HBsAg wirusa Hepatitis B (HBV). Koszty produkcji i dystrybucji tej szczepionki pozostają
barierą ekonomiczną dla krajów rozwijających się, a ponadto nie jest ona całkowicie skuteczna. Podejmowane są próby
wytworzenia nowej generacji szczepionki przeciwko wzwB, zawierającej poza S-HBsAg pozostałe antygeny wirusa lub
ich epitopy. Rośliny transgeniczne mogą być tanim źródłem tych białek.
Jednym z komponentów nowej szczepionki przeciwko wzwB jest średni antygen powierzchniowy M-HBsAg, który
poza domeną S identyczną jak w S-HBsAg, zawiera wysoce immunogenny N-końcowy 55-aminokwasowy fragment
preS2, uczestniczący w transporcie białek otoczki wirionu do ER w trakcie cyklu życiowego wirusa. Sekwencja
kodująca M-HBs została umieszczona pod kontrolą promotora konstytutywnego 35S lub nasieniowo-specyficznego
legA i wklonowana do wektora pGPTV-BAR. Otrzymane wektory binarne wykorzystano do transformacji tytoniu.
Transgeniczne rośliny zregenerowano z użyciem systemu selekcji na fosfinotricynę, substancję aktywną niektórych
herbicydów. Obecność transgenu M-HBs w DNA genomowym roślin pokolenia T0 i T1 potwierdzono za pomocą PCR
i hybrydyzacji Southern. Poziom ekspresji antygenu M-HBs oszacowano za pomocą testu immunoenzymatycznego
ELISA z użyciem zestawu firmy Abbott. Poziom M-HBsAg w liściach roślin zawierających transgen pod kontrolą
promotora 35S osiągał ponad 5 µg /g świeżej masy. Zawartość antygenu w nasionach roślin z transgenem pod kontrolą
promotora legA dochodził do około 2 µg /g. Ekspresja M-HBsAg na stosunkowo wysokim poziomie oznacza możliwość
wytwarzania tego białka konstytutywnie lub w nasionach roślin jadalnych, które mogą być następnie komponentem
przyszłej szczepionki doustnej.
W98.
Analiza ekspresji genów kodujących cyklofilinę, białko transportujące tłuszcze
i enzym kondensujący długie łańcuchy kwasów tłuszczowych u S. sogarandi.
Agnieszka Kiełbowicz-Matuk, Karolina Hofman, Tadeusz Rorat
Instytut Genetyki Roślin, Polska Akademia Nauk, 60-479 Poznań, ul. Strzeszyńska 34
Stres niskiej temperatury „chłód” jest istotnym czynnikiem ograniczającym prawidłowy wzrost i rozwój roślin.
Rośliny zamieszkujące umiarkowaną i polarną strefę klimatyczną posiadają naturalną zdolność przystosowania się
warunków chłodu i przeżywania okresu zimowego. Proces adaptacji, w wyniku którego następuje wzrost tolerancji
roślin na zamarzanie podczas traktowania chłodem jest określany jako aklimatyzacja. Podczas aklimatyzacji zachodzą
w komórkach liczne zmiany metaboliczne i fizjologiczne oraz zmiany w ekspresji genów, w wyniku których następuje
wzrost odporności roślin na stres.
W badaniach nad mrozoodpornością ziemniaka wyizolowano z dzikiego gatunku Solanum sogarandinum kilka
genów, których poziom ekspresji (mierzony poziomem transkryptów) wzrastał w ciągu kilku minut od zadziałania
stresu. Wyizolowane geny wykazywały wysoką homologię do genów kodujących następujące białka: cytoplazmatyczną
cyklofilinę (gen SsCyP), białko transportujące tłuszcze (gen SsLTP) i enzym kondensujący długie łańcuchy kwasów
tłuszczowych (gen SsCE).
Wstępna analiza poziomu ekspresji genów SsCyP, SsLTP i SsCE w odpowiedzi na chłód u dzikiego gatunku S.
sogarandinum i odmiany uprawnej S. tuberosum przeprowadzona metodą Northern blot wykazała, że wzrost poziomu
akumulacji transkryptów pod wpływem chłodu następował u obu gatunków Solanum, przy czym u gatunku odpornego
poziom akumulacji był znacznie wyższy. W przypadku genu SsCyP wzrost poziomu transkryptu obserwowano już
po obniżeniu temperatury do 4°C, dla genu SsLTP po 10 min, a dla genu SsCE po 2h od zadziałania stresu. Tak
szybka indukcja ekspresji genów Ss pod wpływem chłodu sugeruje, że ich białkowe produkty mogą być związane
z uruchamianiem procesów prowadzących do zwiększenia tolerancji Solanum na zamarzanie.
162
Genetyka roślin
Komunikaty plakatowe:
P198.
Charakterystyka molekularna patogena wywołującego kanciastą plamistość
ogórka.
Helena Olczak-Woltman (1), Aleksander Masny (2), Andrzej Płucienniczak (2), Katarzyna Niemirowicz-Szczytt (1)
(1) Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, Wydział Ogrodnictwa i Architektury Krajobrazu, Katedra Genetyki,
Hodowli i Biotechnologii Roślin, ul. Nowoursynowska 166, 02-787 Warszawa
(2) Instytut Biotechnologii i Antybiotyków, ul. Starościńska 5, 02-516 Warszawa
Bakteryjna kanciasta plamistość (wywoływana przez Pseudomonas syringae pv. lachrymans) jest chorobą powszechnie
występującą w uprawach ogórka (Cucumis sativus L.) w Polsce, powodującą straty w jakości i ilości plonu. Inokulując
rośliny ogórka kilkoma szczepami patogena oraz kilkunastoma izolatami, uzyskanymi z liści ogórka z objawami
chorobowymi, zebranymi w różnych częściach Polski (zakwalifikowanymi jako Pseudomonas syringae na podstawie
testów LOPAD), stwierdzono duże zróżnicowanie w nasileniu objawów chorobowych. Podjęto więc próbę molekularnej
oceny stopnia zróżnicowania pomiędzy szczepami bakterii P. syringae pv. lachrymans oraz P. syringae pv. syringae,
otrzymanymi z banków patogenów, a także zebranymi izolatami. Przeprowadzono reakcję PCR z parą starterów
D21/D22 (amplifikacja konserwatywnego regionu pomiędzy 16S i 23S rRNA) oraz B1/B2 (amplifikacja fragmentu
związanego z syntezą toksyny bakteryjnej) na DNA genomowym wszystkich zebranych w kolekcji szczepów i izolatów.
Wyniki reakcji pozwoliły na wyróżnienie obu patowarów wśród zebranych izolatów. W celu szczegółowej analizy stopnia
zróżnicowania zastosowano metodę powielania w PCR fragmentów DNA otaczających rzadkie miejsca restrykcyjne
(ADSRRS) i metodę powielania w PCR w fragmentów o niskiej stabilności termicznej (PCR melting profiles). Metody
te wykazały duże zróżnicowanie zebranych szczepów i izolatów bakterii. Wyniki badań molekularnych pokrywają się
jednocześnie z wynikami inokulacji na ogórku, wskazując, że objawy chorobowe na ogórku powodowane są zarówno
przez P. syringae pv. lachrymans, jak i P. syringae pv. syringae.
P199.
Poszukiwanie markerów odporności na porastanie u pszenżyta.
Arleta Drozd (1), Piotr Masojć (1), Wojciech Sodkiewicz (2)
(1) Katedra Genetyki i Hodowli Roślin, Akademia Rolnicza, ul. Słowackiego 17, 71-374 Szczecin
(2) Pracownia Mieszańców Oddalonych, Instytut Genetyki Roślin PAN, ul.Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań
Poszukiwano markerów molekularnych wykazujących związek z podwyższoną odpornością na porastanie ziarna
pszenżyta, przy użyciu analizy zbiorczych grup segregantów (BSA).
Analizą objęto populację F2 (F408), otrzymaną przez krzyżowanie dwóch sublinii odpornych na porastanie z wrażliwymi
formami odmianowymi Kitaro.
W wyniku przeprowadzonej selekcji, spośród 1000 starterów RAPD, wykryto 4 potwierdzające zdolność do rozróżnienia
poszczególnych grup skrajnych segergantów, wyselekcjonowanych w obrębie pokolenia F2 (F408). Otrzymano zestaw
5 markerów molekularnych, na podstawie których, można odróżnić rośliny odporne od wrażliwych na porastanie.
W dalszym etapie prac, zestaw markerów testowany będzie w obrębie pokolenia F3 badanej populacji.
Metoda RAPD jest metodą skuteczną, szybką i stosunkowo tanią, i stąd przydatność do poszukiwania markerów
ważnych cech użytkowych. W dalszych badaniach konieczne jednak będzie przekształcenie wykrytych markerów
RAPD na specyficzne markery SCAR lub PCR-RFLP.
P200.
Zróżnicowanie genetyczne gatunków w obrębie rodzaju Avena.
Maria Chrząstek, Edyta Paczos-Grzęda, Danuta Miazga
Akademia Rolnicza w Lublinie, Instytut Genetyki i Hodowli Roślin
Przedmiotem badań były gatunki owsa o różnym stopniu ploidalności: diploidalne (2n=14) – A. nuda i A. strigosa,
tetraploidalne (2n=28) – A. barbata, A. murphyi i A. maroccana oraz heksaploidalne (2n=42) – A. sterilis i A.
sativa. W celu określenia stabilności cytogenetycznej i oceny podobieństwa genetycznego poszczególnych gatunków
przeprowadzono analizy cytologiczne i molekularne.
163
Genetyka roślin
Obserwując konfiguracje chromosomów w metafazie I stwierdzono, że we wszystkich gatunkach chromosomy tworzyły
głównie biwalenty, sporadycznie występowały uniwalenty. Nie obserwowano połączeń multiwalentnych. Biwalenty
miały najczęściej postać pierścieni. Najwięcej biwalentów otwartych (prętów) notowano u A. barbata (14.11%), najmniej
u A. sativa (6.77%). Liczba uniwalentów przypadających na jedną komórkę wahała się od 0.01 (A. nuda, A. strigosa)
do 0.08 (A. barbata). W anafazie I we wszystkich gatunkach obserwowano nieliczne chromosomy opóźnione i mosty
chromatydowe. Najwięcej tych zaburzeń stwierdzono u A. fatua. Analizowane gatunki różniły się pod względem
liczby mikrojąder w tetradach. U A. sativa obserwowano je sporadycznie (0,004/KMP), a najczęściej u A. barbata
(0,073/KMP). Średnia żywotność pyłku gatunków diploidalnych wynosiła 92.31%, a przeciętne ziarno pyłku miało
wymiary 47.45 x 46.95 mm. Spośród gatunków tetraploidalnych najwięcej żywotnego pyłku wytwarzał A. maroccana
(97.23%). Jednocześnie gatunek ten wyróżniał się najmniejszymi wymiarami pyłku (45.46 x 44.60 mm). Pyłek gatunków
heksaploidalnych charakteryzował się najlepszą żywotnością i największymi wymiarami.
Do oceny podobieństwa genetycznego analizowanych gatunków wykorzystano metodę RAPD. Reakcję przeprowadzono
dla 20 dziesięcionukleotydowych starterów o losowych sekwencjach. Matrycę podobieństwa genetycznego Dicea otrzymaną na podstawie 50 polimorficznych fragmentów DNA wykorzystano do konstrukcji dendrogramu metodą
UPGMA. Największe podobieństwo genetyczne stwierdzono w obrębie diploidów oraz heksaploidów
P201.
Transgenic cucumber plants with thaumatin II cDNA under the control of tomato
fruit polygalacturonase gene-flanking regions.
Maria Szwacka (1), Agnieszka Jankowska (2), Wojciech Burza (1), Anna Pożarowska (1), Maciej Ładyżyński (3),
Stefan Malepszy (1)
(1) Department of Plant Genetics, Breeding and Biotechnology, Warsaw Agricultural University, Nowoursynowska 166,
Warszawa
(2) Department of Genetics, Institute of Biochemistry and Biophysics PAS, Pawińskiego 5A, Warszawa
(3) Botanical Garden – Centre for Biological Diversity Conservation PAS, Prawdziwka 2, Warszawa
After Agrobacterium-mediated genetic transformation of leaf microexplants of highly inbred cucumber (Cucumis
sativus L.) line B with the binary plasmid pRDT12, aimed at improvement of quality of fruits, we obtained three
independent transformants (ca. 1.5% of transformation efficiency). Vector plasmid pRDT12, derivative of pRD12
(16600 bp, C. Bird, ZENECA), contains thaumatin II cDNA (gene for extremely sweet-tasting protein, 1100 bp) under
the control of tomato fruit poligalacturonase gene-flanking regions and nos-nptII-nos construct. Genomic DNA PCR
analysis confirmed that the selected transformants contained the thaumatin II gene. For two out of three T0 transgenic
plants (T1004 and T1005) T2 generations were obtained and segregation of kanamycin-resistance was investigated. In
the progenies of plant T1004, the segregation ratio was consistent with monogenic Mendelian trait (50%) or it did not
fit the expected 3:1 ratio. In the progenies of plant T1005 the segregation ratio of 3:1 was observed. The morphology of
some T2 plants varied as compared to line B.
P202.
Sources of enhanced Pseudoperonospora cubensis tolerance in transgenic
cucumber lines harboring 35S-thaumatin II chimeric gene.
Maria Szwacka (1), Teresa Tykarska (2), Łukasz Wiśniewski (1), Arkadiusz Przybysz (1),
Monika Rakoczy-Trojanowska (1), Stefan Malepszy (1)
(1) Department of Plant Genetics, Breeding and Biotechnology, Warsaw Agricultural University, Nowoursynowska 166,
Warszawa
(2) Department of Plant Morphogenesis, University of Warsaw, Miecznikowa 1, Warszawa
Some transgenic cucumber lines that express thaumatin II gene from Thaumatococcus daniellii Benth show increased
tolerance to downy mildew (Pseudoperonospora cubensis). The aim of the work was explanation of this property.
Structure of leaf was compared by SEM (electron scanning microscopy) technique, and presence of thaumatin protein
in different layers of leaf was determined (immunocytochemical localization with use of mouse monoclonal antibodies
raised against thaumatin). No differences were found in shape, position and number of stomata on the leaf surface of
tolerant lines and the parental line, which is susceptible to downy mildew. Data from SEM suggest importance of other
pre-existing structures in defense, such as amount and morphology of cuticular waxes and morphology of trichomes.
164
Genetyka roślin
P203.
Charakterystyka podjednostki gluteninowej Bx za pomocą markerów
molekularnych w polskich odmianach i rodach hodowlanych pszenicy
heksaploidalnej (Tr).
Marcin Moczulski, Bolesław P. Salmanowicz
Instytut Genetyki Roślin PAN, ul. Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań
Wysokocząsteczkowe podjednostki gluteninowe (HMW-GS) ze względu na obecność, kompozycje i stosunek ilościowy
względem białek gliadynowych wpływają na jakość mąki pszennej, a tym samym na właściwości elastomeryczne
uzyskiwanego z niej ciasta w procesie wypieku chleba. Rozróżnianie i opisywanie poszczególnych alleli tych podjednostek
za pomocą biochemicznych i molekularnych markerów odgrywa istotna rolę w programach hodowlanych pszenicy.
Największy polimorfizm podjednostkowy HMW-GS wśród alleli stwierdzono dla genu Glu-1Bx. Klasyczne metody
wykorzystujące rozdział zdysocjowanych białek w żelach poliakrylamidowych w obecności siarczanu dodecylowego
(SDS-PAGE) pozwalają na rozróżnienie większości z nich. Szczególną uwagę warto zwrócić na podjednostkę Bx7, której
ekspresja w niektórych odmianach ulega zwiększeniu, dzięki obecności 43 nukleotydowej tzw. „wstawki” w sekwencji
promotorowej genu Glu-1Bx7. Rozróżnienie tych dwóch alleli podjednostki Bx7 i tzw. Bx7OE (nadekspresyjnego)
za pomocą SDS-PAGE jest niemożliwe. Bardzo pomocne okazują się markery molekularne wychwytujące różnice
wielkości sekwencji promotorowej.
W niniejszej pracy przedstawiono szereg dostępnych markerów molekularnych dla alleli Glu-1Bx w celu określenia ich
przydatności w programach hodowlanych na przykładzie 80 odmian polskich pszenic jarych i ozimych.
P204.
Wykorzystanie markerów SSR, ISSR oraz RAPD do fingerprintingu oraz oceny
zróżnicowania genetycznego linii wsobnych żyta.
Beata Myśków, Paweł Milczarski, Marta Twardowska, Piotr Masojć
Katedra Genetyki i Hodowli Roślin, Akademia Rolnicza w Szczecinie
[email protected]
Głównym zadaniem hodowli mieszańcowej jest gromadzenie i testowanie linii wsobnych pod kątem doboru materiałów
jako komponentów rodzicielskich. Do tego celu doskonale nadają się dane o genetycznym podobieństwie uzyskane
przy użyciu markerów molekularnych, które są dużo bardziej miarodajne niż informacje o pochodzeniu. Każda z wielu
dostępnych obecnie technik molekularnych ma swoje zalety i wady. Korzystne wydaje się zatem zastosowanie do
fingerprintingu i oceny zróżnicowania genetycznego kilku metod równocześnie. Umożliwi to wykrycie polimorfizmu
w wielu loci pochodzących z różnych obszarów genomu. Wykorzystując 3 techniki markerowe bazujące na metodzie
PCR – SSR, ISSR, RAPD – przeprowadzono analizy zróżnicowania genetycznego 48 linii wsobnych żyta. Przy użyciu
każdej z metod dokonano fingerprintingu badanych materiałów, oceny ich podobieństwa genetycznego oraz utworzono
dla nich dendrogramy. Do badań użyto trzynastu par starterów SSR, pozwalających na wykrycie 34 alleli, ośmiu
starterów ISSR, wykrywających polimorfizm w 29 loci oraz dziewiętnastu starterów RAPD generujących amplifikację
48 polimorficznych fragmentów DNA. Każdy z zestawów markerów okazał się wystarczający do odróżnienia wszystkich
48 linii wsobnych żyta. Spośród wszystkich markerów wybrano zestaw najlepszych pod względem łatwości oceny,
który pozwolił na dokonanie fingerprintingu przy użyciu możliwie najmniejszej liczby starterów. Na ich podstawie
sporządzono dendrogram, który stanowił podstawę dokonania porównania stopnia podobieństwa genetycznego
z pokrewieństwem wynikającym z rodowodów. Połączenie kilku metod markerów molekularnych stanowi korzystny
sposób uzyskiwania fingerprintingu i analizy podobieństwa genetycznego badanych linii wsobnych żyta i może być
z powodzeniem zastosowane do analizy innych materiałów w ramach gatunku.
P205.
Typy mitochondriów i chloroplastów w liniach diploidalnych ziemniaka
i ich mieszańcach somatycznych.
Jarosław Przetakiewicz, Dominik Kuć, Wacław Orczyk
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Radzików, 05-870 Błonie
Analizowano typy mitochondriów i chloroplastów u mieszańców somatycznych ziemniaka i ich linii wyjściowych.
Komponenty fuzji tj. diploidalne linie ziemniaka dobrano tak, aby uzyskać tetraploidalne mieszańce o określonej
charakterystyce cech użytkowych. Jednocześnie pochodzenie tych linii, będących potomstwem krzyżowań z wieloma
dzikimi gatunkami Solanum, wskazywało na ich potencjalne duże zróżnicowanie cytoplazmatyczne. Uzyskane
165
Genetyka roślin
mieszańce somatyczne stanowią unikatowy materiał pozwalający badać czynniki dziedziczenia cytoplazmatycznego
oraz ich ewentualny udział w dziedziczeniu wybranych cech fenotypowych.
Analiza RFLP z użyciem całkowitego DNA ciętego odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i hybrydyzowanego
z sondami (m79, m80, m93 i m112) homologicznymi do określonych genów mitochondrialnych pozwoliła
zidentyfikować trzy typy mitochondriów. Typ α występował u linii DG 88-596; typ β u linii DW 84-1920, DG 82258, DG 88-89, DG 92-4294, DG 94-90 i DG 94-503 oraz typ ε u linii DG 82-199. Wszystkie testowane mieszańce
somatyczne zawierały mitochondria typu β.
Identyfikację różnych rodzajów chloroplastowego DNA wykonano przy wykorzystaniu reakcji PCR, całkowitego DNA
komponentów fuzji i ich mieszańców, oraz starterów specyficznych do cpDNA. �
Na plakacie zostaną przedstawione wyniki pełnej analizy tych czynników oraz będzie przedyskutowana segregacja
organelli obserwowana u mieszańców somatycznych i będąca wynikiem połączenia dwóch różnych cytoplazm.
P206.
Wykorzystanie sprzężonych markerów STS, AFLP i SSR do identyfikacji locus Pm1
w różnych genotypach pszenicy heksaploidalnej.
Łukasz Stępień (1), Jerzy Chełkowski (1), Gerhard Wenzel (2), Volker Mohler (2)
(1) Instytut Genetyki Roślin PAN, ul. Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań,
(2) Chair of Agronomy and Plant Breeding, Center for Food and Life Sciences Weihenstephan, Technical University Munich,
85350 Freising, Germany
Analizowano 98 odmian/linii pszenicy zwyczajnej za pomocą markerów STS (Xsts638-7A), AFLP (XE39M58-777A) oraz SSR (Xgwm344-7A), sprzężonych z locus Pm1. Dzięki wynikom segregacji otrzymanymi dla populacji
Chinese Spring x Virest (Pm1e), zmapowano Xgwm344-7A i XE39M58-77-7A dystalnie w stosunku do Pm1e
w odległościach 0.9 cM i 4.8 cM, natomiast Xsts638-7A segregował zawsze z locus Pm1e. Wyniki analiz z użyciem
markerów Xsts638-7A i XE39M58-77-7A potwierdziły obserwacje fenotypowe, z wyjątkiem odmian Omega, Remus
i Weihenstephan Stamm M1N. Markerem SSR Xgwm344 wykryto 15 różnych fragmentów, o długości od 102 pz
do 147 pz, jak również 15 prób, które prezentowały allel null położony zarówno na chromosomie 7A, jak i 7B (linie
posiadające jeden z alleli genu odporności Pm1). Z uwagi na ich dużą zmienność, wykorzystanie multi-allelicznych
markerów SSR do identyfikacji genotypów może być skomplikowane, jednakże łączne wykorzystywanie różnych typów
sprzężonych ze sobą markerów jest wielce pomocną metodą w badaniach szerokiego wachlarza materiałów roślinnych.
P207.
DSC method for genomic subtracted libraries construction in cucumber (Cucumis
sativus L.).
Ewa Siedlecka, Magdalena Ewa Kowalczyk, Zbigniew Przybecki
Department of Plant Genetics, Breeding and Biotechnology, Warsaw Agricultural University, Nowoursynowska 166,
02-787 Warsaw, Poland
Differential Subtraction Chain (DSC) seems to be an effective technique for isolating the differences between two highly
similar genomes. We have performed widly modified technique elaborated by Luo et al. (Nucl.AcidsRes. 27: 24e, 1999),
which occurred to be valuable in our analyses of cucumber lines (NILs) differing in sex. The DSC tags from the genomic
DNA of Gy3 line (FF/MM/GyGy, female line) versus HGy3 line (FF/mm/GyGy, hermaphrodite line) and B10 line (ff/
MM/GyGy, monoecious line) versus 2gg line (ff/MM/gygy, female line) were cloned into plasmids vectors (Siedlecka
et al., II Krajowy Kongres Biotechnologii, Łódź, 2003). The difference products have restrictions sites for Bam HI, Hind
III or Bgl II. We obtained the 27 tags for DSC Gy3 (tester)HGy3(driver)B (B-Bam HI), 26 tags for DSC Gy3HGy3H
(H-Hind III), 30 tags for DSC Gy3HGy3BL (BL– Bgl II), 19 tags for DSC HGy3Gy3B, 11 tags for DSC HGy3Gy3H, 29
DSC tags for HGy3Gy3BL, 25 DSC tags for B102ggB, 11 tags for DSC B102ggH, 28 tags for DSC B102ggBL, 24 tags for
DSC 2ggB10B, 9 tags for DSC 2ggB10H, 24 tags for DSC 2ggB10BL. For each genomic DSC library we picked six probes
derived from flowers cDNA-DSC and DH (Differential Hybridization) libraries for dot blot hybridization analysis. Due
to hybridization we found that obtained many of genomic DSC tags were homologous to that in transcriptomes. It
means that differences between genomes and transcriptomes showed conformity. We observed the strongest signals on
a blot of BglII-digested difference DNAs from genomic DSC.
166
Genetyka roślin
P208.
Analiza ekspresji genu SsZF kodującego czynnik transkrypcyjny, typu palca
cynkowego pod wpływem chłodu u Solanum sogarandinum.
Karolina Hofman, Agnieszka Kiełbowicz-Matuk, Tadeusz Rorat
Instytut Genetyki Roślin, Polska Akademia Nauk, 60-479 Poznań, ul. Strzeszyńska 34
Przedmiotem badań jest izolacja i identyfikacja genów, których ekspresja jest sprzężona z uruchamianiem procesów
prowadzących do wzrostu tolerancji roślin na zamarzanie podczas traktowania roślin chłodem (temp. 3-4°C).
Obiektem badań są dwa gatunki Solanum, odporny na zamarzanie dziki gatunek Solanum sogarandinum i nieodporny
gatunek uprawny Solanum tuberosum, odm. Aster.
Na wstępie przygotowano kolekcję klonów cDNA na matrycy mRNA wyizolowanego z pędów S. sogarandinum,
traktowanych chłodem (4°C). Na podstawie selekcji klonów metodą „differential screening” wyodrębniono 93
różne geny, które wykazały wyższy poziom akumulacji odpowiadających im transkryptów u S. sogarandinum. Jeden
z wyselekcjonowanych klonów cDNA SsZF wykazywał wysoką homologię do genów kodujących białka posiadające
domeny palca cynkowego typu B-box.
W kolejnym etapie badań określono poziom akumulacji transkryptu genu SsZF pod wpływem niskiej temperatury.
Analizę ekspresji przeprowadzono metodą Northern blot. Dla uchwycenia czasu indukcji ekspresji genu SsZF pod
wpływem chłodu (4°C) materiał roślinny zbierano po 5, 10, 20 min. oraz po 1, 2, 4, 8 godzinach od zadziałania stresu.
Badania wykazały, że maksimum akumulacji transkryptu genu SsZF obserwowano u S. sogarandinum już po jednej
godzinie od zadziałania chłodu (4°C). Nie obserwowano obecności transkryptu w roślinach nie poddanych działaniu
stresu. U S. tuberosum wzrost poziom transkryptu SsZF pod wpływem chłodu był nieznaczny.
Szybka indukcja ekspresji genu SsZF pod wpływem chłodu może sugerować, iż kodowane białko jest zaangażowane
w procesy uruchamiania wzrostu tolerancji S. sogarandinum na zamarzanie.
P209.
Analiza ekspresji genów kodujących proteazę cysteinową oraz acetylotransferazę
serynową u Solanum sogarandinum w odpowiedzi na chłód.
Alina Liczbańska, Agnieszka Kiełbowicz-Matuk, Karolina Hofman, Tadeusz Rorat
Instytut Genetyki Roślin, Polska Akademia Nauk, 60-479 Poznań, ul. Strzeszyńska 34
Celem badań była analiza ekspresji genów kodujących proteazę cysteinową (SsCysp) oraz acetylotransferazę serynową
(SsSat) w odpowiedzi na chłód. Materiałem badawczym były dwa gatunki Solanum, odporny na zamarzanie, dziki
gatunek Solanum sogarandinum oraz nieodporny gatunek uprawny Solanum tuberosum, odm. Aster.
W badaniach nad mrozoodpornością ziemniaka wyizolowano z dzikiego gatunku Solanum sogarandinum kilka genów,
których poziom ekspresji mierzony metodą Northern blot wzrastał w ciągu kilku minut od zadziałania czynnika
stresowego. Wyizolowane geny SsCysp oraz SsSat wykazywały wysoką homologię do genów kodujących proteazę
cysteinową oraz acetylotransferazę serynową. Bliższa analiza poziomu ekspresji genów SsCysp i SsSat w odpowiedzi na
chłód (4°C) u dwóch gatunków Solanum wykazała, że poziom akumulacj transkryptów obu genów był znacznie wyższy
u gatunku dzikiego w porównaniu do gatunku uprawnego Solanum tuberosum. W przypadku genu SsSat poziom
transkryptu wzrastał już po 5 minutach od zadziałania czynnika stresowego, a w przypadku genu SsCysp po 1 godzinie
od obniżenia temperatury do 4°C.
Ponieważ ekspresja obu genów ulega szybkiej indukcji pod wpływem chłodu, białka kodowane przez SsCysp i ScSat
mogą mieć istotne znaczenie w uruchamianiu odpowiedzi S. sogarandinum na stres niskiej temperatury.
P210.
Ekspresja genu kodującego białko dehydrynowe 10 kDa (DHN10) pod kontrolą
promotora genu glukozylotransferazy (GT) w transgenicznych roślinach dwóch
gatunków Solanum.
Izabela Pawłowicz, Tadeusz Rorat
Instytut Genetyki Roślin, Polska Akademia Nauk, 60-479 Poznań, ul. Strzeszyńska 34
Ekspresję natywnego genu Dhn10 kodującego białko dehydrynowe DHN10 oraz transgenu GT-Dhn10 analizowano
u dwóch gatunkach Solanum, dzikim mrozoodpornym S. sogarandinum oraz uprawnym S. tuberosum w odpowiedzi
na stres chłodu. Transgen GT-Dhn10 został złożony z regionu promotorowego genu glukozylotransferazy (GT) oraz
sekwencji kodującej dehydrynę genu Dhn10 pochodzącego z S. sogarandinum. Sekwencja kodująca genu Dhn10
została wstawiona do transgenu w orientacji sensowej w celu zwiększenia poziomu białka DHN10 w komórkach
167
Genetyka roślin
oraz w orientacji antysensowej dla obniżenia poziomu DHN10. Otrzymanymi transgenami w układzie sensowym
i antysensowym transformowano odmianę uprawną S. tuberosum Irga.
W otrzymanych roślinach transgenicznych rosnących w warunkach kontrolnych oraz w chłodzie (4°C) analizowano
ekspresję genu natywnego Dhn10 oraz transgenu GT-Dhn10 na poziomie transkrypcyjnym metodą RT-PCR przy
zastosowaniu specyficznych straterów oraz metodą Western blot przy zastosowaniu przeciwciała anty-DHN10. Jak
wykazano, na poziomie transkrypcyjnym obydwa geny działały w sposób niezależny od siebie.W transformantach był
obecny był zarówno transkrypt pochodzący od genu natywnego jak i transgenu. Analiza Western blot nie wykazała
jednak obecności dodatkowego prążka w ekstraktach białkowych pochodzących z roślin transgenicznych, który mógłby
być produktem mRNA transgenu GT-Dhn10. Natomiast poziom białka DHN10 pochodzącego od genu natywnego
Dhn10 był podobny jak u roślin kontrolnych nietransgenicznych. Histochemiczna analiza aktywności promotora GT
za pomocą genu reporterowego uidA kodującego bakteryjne białko β-glukuronidazę wykazała, że ulega on tkankowospecyficznej ekspresji w dolnej epidermie liścia oraz w miękiszu gąbczastym. Brak białkowego produktu transgenu GTDhn10 wskazuje, że poziom białka transgenicznego DHN10 w komórkach jest bardzo niski lub też białko dehydrynowe
nie jest syntetyzowane w tkankach okrywających liścia. Chłód nie wywierał wpływu na zmianę poziomu DHN10
w roślinach transgenicznych.
P211.
Konstrukcja wysokowydajnej roślinnej kasety ekspresyjnej genu stafylokinazy
Katarzyna Hnatuszko, Aneta Wiktorek-Smagur, Piotr Łuchniak, Andrzej K. Kononowicz*
Zakład Cytogenetyki i Biologii Molekularnej Roślin, Uniwersytet Łódź, ul. S. Banacha 12/16, 90-237 Łódź,
*[email protected]
W ostatnich latach optymalizacja roślinnych kaset ekspresyjnych pod kątem stabilnej i ekonomicznie opłacalnej
ekspresji genów kodujących heterologiczne białka stała się przedmiotem intensywnych badań. Wśród opracowanych
konstrukcji na szczególną uwagę zasługują kasety opracowane przez De Jaegera i wsp. (Nature Biotechnol. 20: 1265
– 1268, 2002) z Ghent University. Opracowali oni grupę wektorów zapewniających niezwykle wysoki poziom produkcji
rekombinowanych białek w roślinach. Do niedawna możliwy do uzyskania poziom produkcji rekombinowanych
białek w roślinach wynosił ok. 1% TSP (Total Soluble Protein), co stanowiło niewątpliwą wadę tego rodzaju systemów
produkcyjnych. Przy wykorzystaniu wektora pbetaphas De Jaeger i wsp. (2002) uzyskali akumulację heterologicznego
białka (scFV-G4) w roślinach Arabidopsis thaliana sięgającą 36,5% TSP. Tak silna ekspresja transgenów skonstruowanych
na bazie opracowanych wektorów jest wynikiem zastosowania kombinacji różnych elementów regulatorowych: silnego
promotora (beta-fazeoliny lub sekwencje regulatorowe genu kodującego białko arcelinę 5I), optymalnego 5-UTR
oraz sekwencji flankującej arc5I-3-. Uzyskane kasety ekspresyjne pozwoliły także na skierowanie i retencję badanego
białka w kanałach siateczki śródplazmatycznej (peptyd sygnałowy ss oraz sekwencja KDEL). Ponadto, na uwagę
zasługuje możliwość uzyskania równie wysokiego poziomu ekspresji omówionych transgenów u innych, odległych
taksonomicznie gatunków roślin.
W niniejszym komunikacie przedstawiono wyniki badań mających na celu skonstruowanie na bazie wektora
wahadłowego pATAG5, wysokowydajnej roślinnej kasety ekspresyjnej do produkcji rekombinowanych białek
o właściwościach terapeutycznych. Przykładem takiego białka jest stafylokinaza, bakteryjny czynnik o właściwościach
fibrynolitycznych, wykazujący aktywność aktywatora plazminogenu.�
Praca wykonana w ramach grantu KBN 6 PO4B 003 18 i badań własnych UŁ 505/040424
P212.
Ocena podatności na transformację przy pomocy Agrobacterium tumefaciens
różnych genotypów kapusty głowiastej białej (Brassica oleracea L.).
Karol Gładysz, Małgorzata Madej, Maria Klein
Katedra Genetyki, Hodowli i Nasiennictwa, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja, Al.29 Listopada 54, 31-425 Kraków,
e-mail: [email protected]
Do oceny wybrano 10 późnych odmian kapusty oraz 4 linie DH. Transformację hypokotyli 2-tygodniowych siewek
przeprowadzono wg zmodyfikowanej metody Metza. Do transformacji użyto dwóch superwirulentnych szczepów
Agrobacterium tumefiaciens: LBA 4404 i AGLO zawierających geny: npt II i gus pod promotorem 35S CMV. Zastosowano
2-dniową prekulturę oraz 1-dniową kokultywację hypokotyli z Agrobacterium tumefaciens na pożywce płynnej. Do
eliminacji bakterii użyto karbenicylinę i cefataxime. Ocenę regeneracji transgenicznych pędów przeprowadzono po 2,
4 i 6 tygodniach od wyłożenia eksplantatów na pożywkę regeneracyjno-selekcyjną zawierającą kanamycynę. Początek
168
Genetyka roślin
regeneracji pędów obserwowano po około 14 dniach od transformacji. Zachodziła ona bezpośrednio lub z udziałem
kalusa. Stwierdzono duże różnice odmianowe w zdolności do transformacji. W zależności od odmiany kalus wytwarzało
od 15 do 100% hypokotyli, pędy pojawiały się z częstotliwością od 0 do 50%. Analiza molekularna uzyskanych pędów
wykazała obecność transgenów w niektórych odmianach. Duże zróżnicowanie zdolności regeneracyjnych pomiędzy
odmianami pozwoli wybrać genotypy posiadające cechy predysponujące je do dalszych prac nad transformacją kapusty,
których celem będzie wprowadzenie genów użytkowych.
P213.
Mapowanie fizyczne genomu Lupinus.
Barbara Naganowska, Anna Kaczmarek, Bogdan Wolko
Instytut Genetyki Roślin PAN, ul. Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań
Struktura genomu łubinów (rodzaj Lupinus, Fabaceae), grupy obejmującej liczne gatunki dzikie i uprawne Starego
i Nowego Świata, jest słabo poznana. W ostatnich latach dostosowano do jej analiz metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji
in situ (FISH). U gatunków Starego Świata zostały zlokalizowane loci 18S-25S rDNA i 5S rDNA. Zaobserwowano
jeden locus 5S rDNA oraz 1-3 loci 18S-25S rDNA, wśród których wyróżniała się para silnych, dużych sygnałów na
chromosomie satelitarnym, wykazująca specyficzne zachowanie w trakcie cyklu komórkowego. Zaobserwowane loci
rDNA mogą służyć jako markery 2-4 par chromosomów łubinów, zależnie od gatunku. Badano również występowanie
sekwencji telomerowych i kilku syntetycznych oligonukleotydów, jednak nie stanowiły one dobrych markerów do
identyfikacji chromosomów.
Dalsze etapy analiz cytogenetycznych metodą FISH dotyczyły łubinu wąskolistnego (Lupinus angustifolius cv. Sonet,
2n=40) z grupy gładkonasiennych (Malacospermae), gatunku uprawnego o dużym potencjale wykorzystania w rolnictwie
ekologicznym i jako źródło białka. W celu uzyskania preparatów cytologicznych o wysokiej liczbie komórek w stadium
metafazy zastosowano metodę synchronizacji podziałów komórkowych poprzez użycie hydroksymocznika jako związku
hamującego replikację DNA, rozpuszczonego w płynnej pożywce Hoaglanda, w warunkach napowietrzania.
Dla poszerzenia liczby markerów poszczególnych par chromosomów w mapowaniu fizycznym genomu łubinu
wąskolistnego wykorzystano klony BAC jako sondy molekularne do fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Pochodziły
one z genomowej biblioteki BAC L. angustifolius cv. Sonet skonstruowanej w ramach projektu KBN Nr 3 P06A 009 24.
Klony zostały wyselekcjonowane na podstawie przeglądu biblioteki znakowanymi radioaktywnie sondami zawierającymi
kodujące sekwencje genów. Wyselekcjonowane klony BAC zweryfikowane metodą PCR zostały wyizolowane
i wyznakowane metodą nick translacji. Planowana jest kontynuacja badań z wykorzystaniem kolejnych klonów BAC.
P214.
Optymalizacja warunków transformacji Arabidopsis thaliana in planta metodą
histochemicznej analizy ekspresji genu reporterowego gusA
Aneta Wiktorek-Smagur, Katarzyna Hnatuszko, Andrzej K. Kononowicz*
Zakład Cytogenetyki i Biologii Molekularnej Roślin, Uniwersytet Łódź, ul. S. Banacha 12/16, 90-237 Łódź
*[email protected]
Rzodkiewnik pospolity (Arabidopsis thaliana) od blisko 20 lat znajduje się w centrum zainteresowań genetyków, biologów
molekularnych i fizjologów roślin. Wśród cech, które z Arabidopsis uczyniły super-model badawczy wymienia się nie
tylko łatwość hodowli, o której decydują rozmiary roślin (wysokość 15 – 20 cm), krótki cykl życiowy (6 tygodni od
kiełkowania do produkcji dojrzałych nasion), samopłodność i wysoka produkcja nasion (5 000 nasion z jednej rośliny)
umożliwiające otrzymywanie kolekcji homozygot, ale także niewielkie rozmiary genomu (125 Mb = 115 409 949 pz),
małą liczbę chromosomów (5), bogactwo genów (25 494, należących do 11 000 rodzin genów) a wreszcie unikalną
wśród roślin podatność na transformację i inne manipulacje genetyczne (Arabidopsis pozostaje jednym z niewielu
gatunków roślin poddających się transformacji ex vitro – metodą in planta). Niniejsza praca stanowi jeden z ważnych
elementów programu badań realizowanego w Zakładzie Cytogenetyki i Biologii Molekularnej Roślin Uniwersytetu
Łódzkiego mającego na celu konstrukcję transgenicznych roślin do produkcji rekombinowanych białek diagnostycznych
i farmaceutyków. Histochemiczna i molekularna analiza ekspresji gernu reporterowego gusA w transgenicznych
roślinach Arabidopsis, otrzymanych w wyniku transformacji metodą in planta (Clough i Bent, 1998), pozwoliła na
precyzyjną identyfikację najodpowiedniejszych dla transformacji stadiów rozwojowych kwiatów i optymalizację
warunków agroinfekcji, a w konsekwencji na opracowanie efektywnego i powtarzalnego systemu transformacji.
Praca wykonana w ramach grantu KBN 6 PO4B 003 18 i badań własnych UŁ 505/040424.
169
Genetyka roślin
P215.
Ocena chemicznych i molekularnych podstaw odporności marchwi
[Daucus carota L.] na połyśnicę marchwiankę [Psila rosae (Fabr.)]
Magdalena Simlat (1), Łukasz Marczak (2), Barbara Michalik (1)
(1) Katedra Genetyki, Hodowli i Nasiennictwa, Wydział Ogrodniczy, Akademia Rolnicza, Kraków
(2) Pracownia Fitochemii, Instytut Chemii Bioorganicznej PAN, Poznań.
Przeprowadzone badania dotyczyły poszukiwania zależności między wrażliwością marchwi na żerowanie larw
połyśnicy, a zawartością fenolowych metabolitów wtórnych i poziomem akumulacji mRNA genów PAL uczestniczących
w ich biosyntezie.
Do badań wytypowano cztery obiekty marchwi, różniące się wyraźnie podatnością na żerowanie larw szkodnika, co
oszacowano na podstawie wcześniejszych doświadczeń polowych [Michalik i Wiech 2000, Simlat 2002]. Odmiany
populacyjne Dolanka (POLAN – Snowidza) i Karotan (Rijk Zwaan) stanowiły obiekty wrażliwe natomiast linie 7262A
(USDA) i DC 96367 (HRI Wellesbourne) stanowiły genotypy odporne.
W okresie penetracji plantacji przez dorosłe muchówki połyśnicy przeprowadzono ocenę względnej zawartości
glikozydów flawonoidów w częściach nadziemnych roślin. W liściach starszych obie wrażliwe odmiany wykazywały
w porównaniu do odpornych linii wyższy poziom akumulacji 7-O-glukozydu metyloluteoliny i 3-O-glukozydu
kempferolu. Z kolei stosunek zawartości obu glikozydów do siebie (7-O-glukozyd metyloluteoliny/3-O-glukozyd
kempferolu) wykazywał zależność odwrotną – niższa wartość charakteryzowała obiekty wrażliwe.
Analiza poziomu akumulacji transkryptów genów pal1 i pal3 marchwi, metodą hybrydyzacji typu Northern również
pozwoliła wykazać różnice między badanymi grupami obiektów. Najwyższy poziom mRNA obu genów charakteryzował
odporną linię DC 96367, sygnały hybrydyzacyjne obserwowane u linii 7262A były nieco słabsze, natomiast u obu
wrażliwych odmian sygnały te nie zostały zarejestrowane.
Zaobserwowane prawidłowości będą wymagały potwierdzenia w kolejnych sezonach wegetacji roślin.
Mapowanie genetyczne
Komunikaty ustne:
W99.
Opracowanie dwóch map genomu żyta w oparciu o markery RAPD.
Piotr Masojć, Aneta Banek-Tabor, Beata Myśków, Paweł Milczarski, Karolina Lebiecka
Katedra Genetyki i Hodowli Roślin, Akademia Rolnicza, Szczecin
Budowanie mapy genetycznej określonego organizmu stanowi duże wyzwanie naukowe. O sukcesie przedsięwzięcia
decyduje wybór systemu markerowego, który byłby zarówno polimorficzny jak i zapewniający pokrycie segregującymi
loci całej długości genomu. W przypadku konstrukcji mapy żyta, pierwotnie najlepsze efekty osiągnięto dzięki
zastosowaniu techniki RFLP. W ten sposób opracowano mapę na bazie pokolenia F2 mieszańca DS2 x RXL10. Mapę
markerów RFLP zagęszczono markerami RAPD, których zaletą było losowe, dość równomierne rozmieszczenie wzdłuż
chromosomów. Korzystając z tego doświadczenia, markery RAPD wykorzystano do konstrukcji od podstaw drugiej
mapy żyta, bazującej na mieszańcu międzyliniowym 541 x Ot1-3. Również w tym przypadku markery RAPD okazały
się skutecznym narzędziem. Z puli ok. 1200 starterów otrzymano 165 segregacji jednogenowych, z czego grupy sprzężeń
odpowiadające chromosomom żyta utworzyło 98 loci RAPD. Dwie otrzymane mapy nie mają, poza kilkoma wyjątkami
wspólnych loci markerowych, stąd trudno je ze sobą powiązać. Poszukiwania innych rodzajów markerów mogących
efektywnie zagęszczać i rozbudowywać mapę nie przyniosły dobrych efektów. Markery AFLP, chociaż polimorficzne,
wykazały silne zblokowania wielu loci w kilku regionach na chromosomie. Natomiast markery SSR dawały małą liczbę
loci na chromosom. Zdobyte doświadczenie w mapowaniu genomu żyta sugeruje następującą strategię konstruowania
mapy przy użyciu markerów bazujących na reakcji PCR: (1) zastosowanie analizy RAPD dla osiągnięcia krytycznej
liczby segregacji jednogenowych (ok. 200), (2) wzbogacenie mapy o kilka do kilkunastu na chromosom loci typu SSR,
STS, PCR-RFLP. Otrzymany układ mapy pozwala na prowadzenie analizy QTL dla wielu ważnych cech użytkowych
roślin.
170
Genetyka roślin
W100. Ocena efektywności MAS na podstawie analizy QTL warunkujących odporność żyta
na porastanie.
Marta Twardowska, Piotr Masojć, Paweł Milczarski, Aneta Banek-Tabor
Katedra Genetyki i Hodowli Roślin, Akademia Rolnicza, Szczecin
Porastanie ziarna żyta stwarza stałe zagrożenie ponoszenia znacznych strat materialnych w rolnictwie krajowym.
Wyniki badań genetycznych, w tym szczególnie mapowanie interwałowe potwierdziły złożoność genetycznego podłoża
tej cechy, która jest dodatkowo silnie uzależniona od warunków atmosferycznych panujących w okresie dojrzewania
ziarna.
W drodze analizy QTL na mapie markerów molekularnych żyta wytypowano 4 loci markerowe mogące stanowić
podstawę selekcji genotypów odpornych na porastanie. Efektywność markerów w selekcji sprawdzano na populacji
360 rodów żyta wyprowadzonych z populacji mapującej 541 x Ot1-3. Selekcja prowadzona z użyciem każdego markera
z osobna nie wykazała znaczącej skuteczności. Silny efekt osiągnięto przez równoczesną selekcję wszystkimi czterema
markerami. Metoda ta doprowadziła do wyselekcjonowania subpopulacji odznaczającej się wysoką odpornością na
porastanie. Zastosowanie podobnej procedury w stosunku do trzech markerów sprzężonych z QTL warunkujących
aktywność alfa-amylazy doprowadziło do otrzymania grupy roślin o bardzo niskim poziomie enzymu odpowiedzialnego
za rozkład skrobi ziarniaka, a tym samym za niską liczbę opadania. Przeprowadzone badania wykazały, że właściwą drogą
zabezpieczenia żyta przed porastaniem jest piramidyzacja korzystnie działających alleli z kilku loci przy wykorzystaniu
sprzężonych z nimi markerów molekularnych.
W101. Markery molekularne sprzężone z genami kontrolującymi męską sterylność u żyta
z cytoplazmą C.
Stefan Stojałowski (1), Mirosław Łapiński (1), Miłosława Jaciubek (2), Piotr Masojć (1)
(1) Katedra Genetyki i Hodowli Roślin, Akademia Rolnicza w Szczecinie, Słowackiego 17, 71-434 Szczecin
(2) Instytut Fizjologii Roślin im. Franciszka Górskiego, Polska Akademia Nauk, Niezapominajek 21, 30-239 Kraków
Cytoplazmatyczna męska sterylność (cms) jest powszechnie stosowana w hodowli roślin do otrzymywania nasion odmian
mieszańcowych. U żyta prawie wszystkie zarejestrowane odmiany mieszańcowe posiadają cytoplazmę sterylizującą typu
Pampa. Źródło sterylizującej pręcikowie cytoplazmy określane symbolem cms-C zostało wytworzone na początku lat
70-tych XX wieku i stanowi alternatywny wobec Pampy system cms, który można wykorzystać do produkcji nasion
mieszańców żyta. Identyfikacja markerów molekularnych silnie sprzężonych z genami Rfc kontrolującymi męską
jałowość w systemie cms-C może w znaczącym stopniu przyspieszyć prace hodowlane nad wytworzeniem nowych
odmian mieszańcowych żyta posiadających to źródło cytoplazmy. Wyniki analiz RAPD przeprowadzone na mieszańcach
międzyliniowych żyta z cytoplazmą cms-C, pozwoliły na zlokalizowanie na długim ramieniu chromosomu 4R silnego
genu kontrolującego płodność pręcikowia. Gen ten oznaczono symbolem Rfc1. Pozostałe geny warunkujące płodność
roślin żyta z cytoplazmą C nie zostały dotąd precyzyjnie zmapowane. Wśród aktualnie wyprowadzanych w oparciu
o mieszańca między liniami 544 i L1 rekombinacyjnych linii wsobnych (RIL) znajdują się genotypy dopełniające męską
sterylność. Przeprowadzone na tym materiale analizy RAPD potwierdzają bliskie sprzężenie wykrytych markerów ze
zlokalizowanym na chromosomie 4RL genem Rfc1 oraz wskazują, że po transformacji w markery typu SCAR mogą one
znaleźć praktyczne zastosowanie w pracach selekcyjnych.
W102. Estymacja efektu addytywnego działania genów metodą genetyki ilościowej
i metodą genetyki molekularnej.
Jan Bocianowski, Paweł Krajewski
Instytut Genetyki Roślin PAN w Poznaniu, ul. Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań
W pracy przedstawiono metody estymacji efektu addytywnego działania genów: metodę genetyki ilościowej – bazującą na
obserwacjach jedynie fenotypowych i metodę genetyki molekularnej – uwzględniającą również obserwacje markerowe.
Porównanie analityczne obu metod umożliwia podanie warunków, których spełnienie przybliża oceny dokonywane
wymienionym wyżej metodami. Porównania numeryczne przeprowadzono na trzech zbiorach danych: dwa dotyczyły
linii podwojonych haploidów jęczmienia, jeden – linii wsobnych kukurydzy. W celu sprawdzenia dobroci metod
estymacji przeprowadzono badania symulacyjne odpowiadające 108 sytuacjom eksperymentalnym. Uzyskane wyniki
wskazują na dużą niezmienniczość obu prezentowanych w pracy metod estymacji efektu addytywnego działania genów.
171
Genetyka roślin
Można je stosować do różnych gatunków roślin, o czym świadczy brak wpływu liczby chromosomów na oceny efektów
addytywnego działania genów dokonane obiema metodami oraz na wnioski dotyczące porównania zaproponowanych
metod estymacji, a także dla różnych map genetycznych, o czym świadczy zaobserwowanie braku wpływu odległości
między markerami na oceny badanego parametru.
W większości analizowanych sytuacji (w przypadku badań symulacyjnych – we wszystkich) ocena parametru związanego
z efektem addytywnego działania genów dokonana na podstawie obserwacji fenotypowych była większa niż ocena
metodą wykorzystującą obserwacje markerowe.
W103. Identyfikacja i chromosomowa organizacja homeologów wybranych genów szlaku
biosyntezy i transdukcji sygnału etylenowego w genomie Brassica oleracea.
Danuta Babula, M. Jakubowicz, M. Kaczmarek, W. Nowak, L. Misztal, J. Sadowski
Instytut Genetyki Roślin, Polska Akademia Nauk, ul. Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań
Zakład Biotechnologii, Instytu Biologii Molekularnej i Biotechnologii, Uniwersytet im. A. Mickiewicza, ul. Międzychodzka 5,
60-379 Poznań
Celem prowadzonych badań jest poznanie chromosomowej lokalizacji wybranych genów uczestniczących w syntezie
i przekazywaniu sygnału etylenowego u Brassica oleracea L. (rośliny kapustne). Struktura genomów gatunków z rodzaju
Brassica charakteryzuje się dużym stopniem zduplikowania segmentalnego, będącego konsekwencją ich poliploidalnego
pochodzenia. W związku z tym pochodzeniem geny są z reguły reprezentowane przez kilka kopii (= homeologów
genowych). Dlatego też, ważnym etapem badań nad poznaniem funkcji genów w rodzinie Brassicaceae, do której należy
także Arabidopsis thaliana, jest identyfikacja ich specyficznych homeologów indukowanych w zróżnicowany sposób np.
pod wpływem stresów środowiskowych. Prezentowane badania dotyczyły identyfikacji homeologów wybranych genów
biosyntezy etylenu ( SAM, ACS, ACO) oraz kluczowych etapów przekazywania sygnału etylenowego (ETR1, CTR1,
MKK4, MKK5, EIN2, EIN3, EREBP, ERF5 i ERF7) w genomie B. oleracea. Homologi w/w genów były identyfikowane
w oparciu o hybrydyzację wg Southerna i analizę RFLP z wykorzystaniem sond typu EST z A. thaliana. Równocześnie,
pojedyncze homologi niektórych genów były wykrywane w oparciu o specyficzne dla nich startery (projektowane
na podstawie sekwencji i specyficznej funkcji danego homeologa z A. thaliana) w reakcji PCR. Wybrane klony EST
reprezentowały unikalne sekwencje w genomie A. thaliana, rozproszone na wszystkich 5 chromosomach. Natomiast
w genomie B. oleracea wiekszość z zastosowanych sond genowych pozwalała na wykrycie 3-4 homeologów. Porównanie
organizacji badanych genów w genomach B. oleracea i A. thaliana wskazuje, ze wiele z analizowanych loci występuje
w konserwatywnych regionach chromosomowych. Pozwala to na wstępną identyfikację ortologicznych kopii niektórych
z genów. Zidentyfikowane homeologi analizowanych genów będą weryfikowane eksperymentalnie podczas planowanych
ekperymentów z zastosowaniem stresu ozonowego i suszy u B. oleracea.
W104. Identyfikacja chromosomów z pojedynczymi segmentami chromatyny Festuca
arundinacea i F. pratensis w liniach introgresywnych Lolium multiflorum przy użyciu
FISH.
Arkadiusz Kosmala (1) Agnieszka Leśniewska-Bocianowska (1), Michał Łuczak (1), Elżbieta Zwierzykowska (1),
Zbigniew Zwierzykowski (1), Mike W. Humphreys (2),
(1) Instytut Genetyki Roślin, Polskiej Akademii Nauk, Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań;
(2) Institute of Grassland and Environmental Research, Aberystwyth, Plas Gogerddan, SY23 3EB, UK.
Wykorzystanie oddalonych mieszańców traw – F. arundinacea (6x) x L. multiflorum (4x) i L. multiflorum (2x) x F.
pratensis (4x) w krzyżowaniach wstecznych z diploidalnymi odmianami L. multiflorum (2n=2x=14) umożliwia transfer
genów odporności na suszę i /lub zamarzanie z gatunków Festuca do L. multiflorum. Selekcja roślin w kolejnych
pokoleniach wstecznych prowadzi do uzyskania już w pokoleniu BC2 odpornych roślin introgresywnych, u których
w garniturze chromosomowym L. multiflorum występują tylko pojedyncze segmenty chromatyny Festuca z genami
odporności na stresy. Segmenty te można identyfikować przy zastosowaniu genomowej hybrydyzacji in situ (GISH).
Fizyczne zmapowanie obcej chromatyny w genomie L. multiflorum możliwe jest po zastosowaniu fluorescencyjnej
hybrydyzacji in situ (FISH), opartej na sondach 5S i 45S rDNA, co w konsekwencji umożliwia identyfikację niektórych
chromosomów Lolium. W prezentowanym komunikacie przedstawiono wyniki analiz cytogenetycznych, które
obejmowały identyfikację chromatyny F. pratensis i F. arundinacea oraz jej chromosomową lokalizację w liniach
inrogresywnych L. multiflorum odpornych na zamarzanie i/lub suszę. Wykazano, że w badanych liniach introgresywnych
chromatyna F. pratensis, zarówno z genami odporności na zamarzanie jak i na suszę zlokalizowana była terminalnie na
172
Genetyka roślin
krótkim ramieniu chromosomu 2 Lolium, bądź też obejmowała centromer i oba rejony przycentromerowe chromosomu
4. Natomiast chromatyna F. arundinacea z genami odporności na zamarzanie obejmowała terminalny rejon krótkiego
ramienia chromosomu 2 Lolium. W dalszym etapie badań do pojedynczych segmentów chromosomowych Festuca
zostaną przypisane markery STS (miejsce znaczone sekwencyjnie; ang. sequence tagged site). Pozwoli to zidentyfikować
markery sprzężone z genami odporności i zapewni szybki sposób selekcji odpornych genotypów w hodowli traw.
Komunikaty plakatowe:
P216.
Identyfikacja QTLi reakcji w kulturze in vitro niedojrzałych zarodków żyta ozimego
(Secale cereale L.).
Maja Boczkowska (1), Hanna Bolobok (1), Monika Rakoczy-Trojanowska (1), Paweł Milczarski (2),
Piotr Masojć (2)
(1) SGGW, Katedra Genetyki, Hodowli i Biotechnologii Roślin, ul. Nowoursynowska 166, 02-787 Warszawa
(2) Katedra Genetyki i Hodowli Roślin, AR, ul. Słowackiego 17, 71-434 Szczecin
Poszukiwanie na mapach genetycznych loci cech ilościowych (QTL) związanych z reakcją roślin w kulturze in vitro jest
w ostatnich latach jednym z najbardziej intensywnych kierunków badań w tym obszarze.
W niniejszej pracy po raz pierwszy zidentyfikowano QTLe reakcji w kulturze in vitro niedojrzałych zarodków żyta
ozimego. Materiał roślinny stanowiła populacja mapująca Ot x 541 (otrzymana w AR w Szczecinie) składająca się z 89
rekombinacyjnych linii wsobnych (RIL). Komponenty rodzicielskie tej populacji wykazywały zróżnicowaną reakcję
na zmodyfikowanej pożywce MS uzupełnionej 3 mg/dm3 2,4-D, 100 mg/dm3 hydrolizatu kazeiny i 30 g/dm3 maltozy.
Po 12 tygodniach od inicjacji kultury niedojrzałych zarodków RIL wykonano pasaż tkanek kalusowych na pożywkę
MS bez hormonów, z sacharozą i edaminą, a po kolejnych 2 tygodniach obliczono udział kalusów embriogenicznych
i nieembriogenicznych dla każdej RIL. Rozkład obu cech w całej populacji był zbliżony do normalnego. Wykorzystując
program Mapmaker zlokalizowano na utworzonej wcześnie mapie markerów molekularnych (głównie RAPD) populacji
mapującej 11 QTLi zdolności do embriogenezy i 3 QTLe braku zdolności do embriogenezy. Cztery QTle zdolności do
embriogenezy – ESS1.3, ESS2.5, ESS2.7 (V grupa sprzężeń) i ESS2.8 (VII grupa sprzężeń), o wartości LOD większej niż
3.0, położone w odległości mniejszej niż 5 cM od jednego z markerów ograniczających przedział mapowy i wyjaśniające
ponad 60% zmienności cechy mogą w przyszłości znaleźć praktyczne zastosowanie w biotechnologii.
P217.
Markery RAPD w ocenie zmienności genetycznej wybranych genotypów Salix
viminalis L.
Jerzy Andrzej Przyborowski, Stefan Szczukowski, Józef Tworkowski
Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie, Katedra Hodowli Roślin i Nasiennictwa
Wierzba wiciowa (Salix viminalis L.) należy do rodziny Salicaceae, jest rośliną wieloletnią i szybko rosnącą. Uprawa
szybko rosnących wierzb krzewiastych z przeznaczeniem na cele energetyczne cieszy się wzrastającym wciąż
zainteresowaniem, zarówno w kraju jak i zagranicą. Lignino-celulozowa świeża biomasa Salix spp. w nowoczesnej
technologii chemicznego przetwarzania może być zmieniona na wtórne nośniki energii: energię cieplną (proces
gazyfikacji) i paliwa płynne (metanol). W związku z wzrastającym zainteresowaniem istnieje potrzeba hodowli
wydajnych form wierzb krzewiastych. Wybór odpowiednich komponentów krzyżowania w hodowli rekombinacyjnej
wymaga poznania zakresu zmienności genetycznej materiałów wyjściowych. Z wykorzystaniem markerów RAPD
oceniono zakres zmienności między 16 genotypami S. viminalis, znajdującymi się w naszej kolekcji. Przetestowano 60
starterów, z których w badaniach wykorzystano 38 dających prążki polimorficzne. Uzyskano ogółem 217 produktów
amplifikacji, a stopień zróżnicowania określono biorąc pod uwagę całkowitą zgodność oraz różnice w liczbie prążków
u badanych form. Całkowita zgodność w liczbie i lokalizacji prążków wahała się od 5,6 do 60%, zaś różnice w liczbie
prążków wahały się od 10,1 do 41,7%.
173
Genetyka roślin
P218.
Wykorzystanie markerów SSR z Medicago truncatula do mapowania genomu Pisum
sativum i Lupinus angustifolius.
Tomasz Pniewski (1), Thierry Huguet (2), Bogdan Wolko (1)
(1) Instytut Genetyki Roślin PAN, Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań
(2) Laboratoire des Interactions Plantes Micro-organismes CNRS/INRA, Chemin de Borde Rouge – BP 27 31326 Castanet
Tolosan, Francja
Tworzenie map genetycznych jest etapem wstępnym w badaniach nad genomiką i genetyką molekularną roślin.
Zmapowane markery molekularne, sprzężone z określonymi cechami fizjologicznymi i morfologicznymi, stanowią
dogodny punkt wyjścia do wyszukiwania genów determinujących różne właściwości roślin oraz do ukierunkowanej
hodowli nowych odmian roślin uprawnych. Mapowanie genetyczne umożliwia również porównawcze badanie struktury
genomów i ich ewolucji.
Zastosowanie markerów określających położenie mikrosatelitów – SSR (Simple sequence repeats), opracowanych
uprzednio dla Medicago truncatula L., miało na celu wzbogacenie o ten typ markerów mapy genetycznej grochu
(Pisum sativum L.) oraz łubinu (Lupinus angustifolius L.), a także rozpoczęcie badań nad mapowaniem porównawczym
genomów wymienionych gatunków.
Markery typu SSR wykazują stosunkowo szeroki polimorfizm, a zatem są dogodne do mapowania. Ponadto są proste
w zastosowaniu, ponieważ do wygenerowania wymagają rozdziału produktów PCR na żelach agarozowych lub
akrylamidowych.
Spośród analizowanych 360 par starterów opracowanych dla markerów M. truncatula, 138 generowało specyficzne
produkty PCR w genomowym DNA grochu trzech linii rodzicielskich dwóch populacji mapujących. Spośród 138
markerów, 36 wykazało polimorfizm, a wśród nich było 22 o charakterze dominacyjnym oraz 14 kodominacyjnym. �
W przypadku łubinu wąskolistnego analizowano polimorfizm tych samych 360 markerów dla 4 roślin rodzicielskich
dwóch populacji mapujących. Spośród 67 specyficznych markerów, 18 wykazało polimorfizm, w tym 5 o charakterze
dominacyjnym i 13 kodominacyjnym. Tylko 2 markery były polimorficzne zarówno dla grochu jak i łubinu.�
Przeprowadzone badania polimorfizmu markerów SSR umożliwiają ich zastosowanie do porównawczego mapowania
M. truncatula, Pisum oraz Lupinus.
P219.
Wykorzystanie linii DH kapusty głowiastej białej do konstrukcji mapy genetycznej
w oparciu o markery AFLP i RAPD.
Michał Combik, Dariusz Grzebelus, Adela Adamus, Barbara Michalik
Katedra Genetyki Hodowli i Nasiennictwa, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja, Al. 29 Listopada 54, 31-425 Kraków
Celem badań jest opracowanie mapy genetycznej kapusty głowiastej białej (Brassica oleracea L. var capitata subvar.
alba) w oparciu o populację roślin DH. Materiał roślinny, który posłużył do otrzymania populacji mapującej uzyskano
ze skrzyżowania 2 linii wsobnych kapusty różniących się składem chemicznym oraz wczesnością. Mikrospory pobrane
z roślin pokolenia F1 tej krzyżówki indukowano w kulturach in vitro w celu otrzymania podwojonych haploidów.
Otrzymano 67 roślin DH, z których wyizolowane DNA analizowano przy użyciu markerów AFLP i RAPD. Do chwili
obecnej uzyskano kilkadziesiąt segregujących markerów, które posłużyły do sporządzenia wstępnej mapy genetycznej
przy wykorzystaniu programu Map Maker. Potomstwo uzyskane przez zapylenie wsobne roślin podwojonych haploidów
i ocenione pod względem składu chemicznego pozwoli w przyszłości na zmapowanie loci cech ilościowych.
174
Genetyka roślin
Wykład plenarny:
W105. W poszukiwaniu genów morfogenezy włośników u Hordeum vulgare poprzez
analizę mutacyjną do sekwencji DNA.
Iwona Szarejko, Mirosław Kwaśniewski, Agnieszka Janiak, Beata Chmielewska, Małgorzata Nawrot,
Jagna Karcz i Mirosław Małuszyński
Katedra Genetyki, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, ul. Jagiellońaska 28, 40-032 Katowice
Uważa się, że włośniki korzeniowe pełnią podstawową rolę w zaopatrywaniu roślin w wodę i sole mineralne,
w zakotwiczaniu roślin w ziemi i w oddziaływaniu z mikroorganizmami glebowymi. Choć ich fizjologiczna funkcja
jest dobrze udokumentowana, jedyne informacje na temat genetycznych i molekularnych podstaw rozwoju tych
wyspecjalizowanych komórek epidermy korzenia pochodzą z badań na Arabidopsis thaliana. U Arabidopsis, podstawową
rolę w różnicowaniu komórek włośnikowych odgrywa pozycja, jaką komórki epidermy zajmują w stosunku do komórek
kory pierwotnej korzenia. W przeciwieństwie do tego modelu, u wielu gatunków z rodziny Poaceae, w tym u jęczmienia,
każda komórka epidermy, niezależnie od jej położenia, może stać się komórką włośnikową (trichoblastem), a potencjalne
trichoblasty są morfologicznie nierozróżnialne od komórek nie formujących włośników (atrichoblastów). Jak dotąd,
brak jest informacji o molekularnych podstawach morfogenezy komórek włośnikowych u roślin jednoliściennych.
Unikalne mutanty włośnikowe jęczmienia (Hordeum vulgare L.), wyprowadzone w Katedrze Genetyki UŚ po działaniu
chemicznych związków mutagenicznych, stanowią idealny materiał do rozpoczęcia analizy mutacyjnej różnicowania
i rozwoju włośników u tej grupy roślin. W toku dotychczasowych doświadczeń wyselekcjonowano 13 mutantów ze
zmianami w różnych stadiach rozwoju włośników, a 6 z nich poddano pełnej analizie genetycznej. Przebadano wzory
rozwoju epidermy w mikroskopie skanningowym i konfokalnym, i określono poziom polimorfizmu AFLP między
mutantami i odmianami wyjściowymi. Ustalono, że u analizowanych mutantów zmiany w morfologii strefy chłonnej
są cechami recesywnymi, warunkowanymi monogenicznie. Obecnie prowadzone są prace nad lokalizacją genów
odpowiedzialnych za zmiany w rozwoju włośników na mapach markerów DNA. Wykorzystując bezwłośnikowego
mutanta, podjęto próbę identyfikacji genu odpowiedzialnego za etap inicjacji włośników przy pomocy techniki cDNA
RDA, bazującej na subtraktywnej hybrydyzacji fragmentów cDNA amplifikowanych w PCR. Posługujac się tą strategią,
a także techniką klonowania RACE i Genome Walking oraz analizą bioinformatyczną, wyizolowano genomową
sekwencję o długości 1490 bp i zidentyfikowano ją jako pierwszy opisany gen dla β-ekspansyny jęczmienia (GenBank
Acc. AY351785). Wykazano, że ekspresja tego genu (oznaczonego HvEXPB1) jest korzeniowo-specyficzna i kosegreguje z włośnikiowym fenotypem rośliny w potomstwie F2 krzyżówki między bezwłośnikowym mutantem a jego
odmiana wyjściową. Ekspansyny stanowią dużą rodzinę białek, których działanie związane jest z rozluźnianiem ściany
komórkowej w procesach związanych ze wzrostem i rozwojem roślin. Znaleziono je w wielu rosnących komórkach,
z włośnikami włącznie.
175
Genetyka roślin
Genetyka rozwoju
Komunikaty ustne:
W106. The developmental regulation of cucumber SCARECROW gene expression during
somatic embryogenesis.
Anita Wiśniewska, Sabina Zuzga, Marcin Filipecki, Stefan Malepszy
Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego,Katedra Genetyki, Hodowli i Biotechnologii Roślin, ul. Nowoursynowska 166,
02-787 Warszawa
Somatic embryogenesis in cell suspension cultures is a convenient, chemically inducible model to study differential
gene expression. In our research we concentrate on genes encoding specific transcription factors (TFs) upregulated in
the first steps of cucumber somatic embryogenesis. One of TFs analysed is the CsSCR gene, which shows high sequence
similarity to SCARECROW gene from Arabidopsis thaliana (AtSCR1), which is a member of GRAS family of TFs and
is essential for the asymmetric division of the cortex/endodermis progenitor cells in the root. The genomic sequence of
CsSCR was cloned and analyzed. It contains one intron located in similar position like in AtSCR1. When compared with
AtSCR the predicted protein sequence of CsSCR shows 57% identical residues overall and reaches 86% identity within
the region where high conserved domains are located. The expression analysis showed clear upregulation in somatic
embryos when compared to other tissues. The in situ hybridization and the analyses of transgenics containing the
promoter CsSCR::GUS fusion, showed specific signal localization in developing roots and root-like structures in tissue
culture. The possible factors influencing CsSCR expression are discussed.
W107. Wpływ pożywki i źródła pyłku na efektywność partenogenezy u marchwi
Agnieszka Kiełkowska, Adela Adamus, Barbara Michalik
Katedra Genetyki, Hodowli i Nasiennictwa, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja, Al.29 Listopada 54, 31-425 Kraków,
e-mail: [email protected]
Celem badań było opracowanie wydajnej metody indukcji haploidów u marchwi. Dotychczasowe prace dotyczące tego
zagadnienia przy zastosowaniu metody kultur pylników prowadzone w IWARZ w Skierniewicach i KGHiN w Krakowie
okazały się mało efektywne, co skłoniło do poszukania innej drogi otrzymania linii DH.
Do indukcji partenogenezy w latach 2002-2003 używane były wyłącznie rośliny heterozygotyczne pod względem
allelu Pgi (izomeraza 6-glukozo-fosforanowa). Kwiaty roślin donorowych zapylano pyłkiem trzech innych gatunków:
pietruszka, pasternak, kapusta, a następnie z powiększonych zalążni izolowano zalążki i umieszczano na czterech
pożywkach o różnym składzie, przygotowanych na bazie MS lub B5. W kulturach zalążków obserwowano niewielką
liczbę (do 2%) eksplantatów tworzących zarodki, a dominującą formą rozwoju okazał się kalus, który tworzył się
z częstotliwością od 0-3,87%. Pietruszka okazała się lepszym źródłem pyłku, gdyż w większym stopniu stymulowała
rozwój eksplantatów. Stwierdzono również wyraźny wpływ pożywki na rozwój zalążków. Pożywka H była najlepsza
do indukcji zarodków (1.46%), natomiast pożywka A12 indukowała w większym stopniu rozwój kalusa (3.41%).
Analiza ploidalności otrzymanych regenerantów wykazała, że 98% z nich to diploidy, natomiast nie otrzymano roślin
haploidalnych. Spośród ocenionych roślin diploidalnych 52% było homozygotami pod względem allelu Pgi, co wskazuje
na ich gametyczne pochodzenie.
176
Genetyka roślin
Komunikaty plakatowe:
P220.
Kultury in vitro pylników pszenicy w płynnych pożywkach
Aleksandra Ponitka, Aurelia Ślusarkiewicz-Jarzina, Jolanta Woźna
Instytut Genetyki Roślin PAN, ul. Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań
Badano efektywność uzyskiwania haploidów pszenicy otrzymywanych metodą kultur pylnikowych w płynnych
pożywkach. Pylniki pobierano z 10 form pszenicy ozimej pochodzących z pięciu Stacji Hodowli Roślin i wykładano
na szalki o średnicy 6 cm zawierające 5 ml pożywki. Przy użyciu mikroskopu z odwróconym światłem obserwowano
rozwój mikrospor, które wypłynęły z pękających pylników. Zastosowano dwie pożywki indukcyjne i uzyskano od 0,7
do 105,1 androgenicznych zarodków /100 pylników. Po 3 tygodniach kultury, androgeniczne zarodki, przenoszono
na pożywkę regeneracyjną i otrzymano od 0,1 do 21,4 zielonych roślin /100 pylników. Częstotliwość uzyskiwania
zarodków i roślin zależała zarówno od stosowanej pożywki indukcyjnej, jak i od genotypu. Porównano wyniki z kultur
pylnikowych prowadzonych w pożywkach płynnych i na pożywkach agarowych. Stwierdzono wyższą efektywność
androgenezy stosując kultury płynne
P221.
Amfiploidy Aegilops kotschyi x Secale cereale.
Barbara Wojciechowska, Hanna Pudelska
Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk, ul. Strzeszyńska 34, 60-479-Poznań
Amfiploidy Aegilops kotschyi x Secale cereale (linie samozgodne) otrzymano poprzez kolchicynowanie i propagację
in vitro niepłodnych mieszańców F1 (2n=3x=21). Rośliny amfiploidalne (2n=6x=42) charakteryzowały się częściową
płodnością, silnym wigorem wegetatywnym oraz zwiększonymi wymiarami w porównaniu z mieszańcami F1.
W pierwszym pokoleniu, szczególnie u kolchiamfiploidów odsetek wybarwionych ziaren pyłku i średnia liczba
osadzonych ziarniaków w kłosie były niższe niż w dalszych pokoleniach, w których następowała stabilizacja
cytogenetyczna. Ziarniaki uzyskano w wyniku samozapylenia, większość z nich była dobrze wykształcona i żywotna.
Nie udało się pokonać silnych barier izolacji generatywnej pomiędzy amfiploidem a formą wyjściową żyta. Z krzyżowań
wstecznych otrzymano nieliczne zarodki, bardzo słabo wykształcone i niezdolne do dalszego rozwoju w warunkach
kultur in vitro.
Wykład plenarny:
W108. Patterning of the maize embyo.
Prof. W. Werr
Departament of Development of Biology, University of Cologne, Grmany
Streszczenie w suplemencie
177
Genetyka roślin
Genetyka populacji
Komunikaty ustne:
W109. Dziedziczenie odporności na rdzę brunatną ( Puccinia recondita f.sp. tritici) odmian
Fidelio
Helena Grzesik, Anna Strzembicka
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Zakład Oceny Jakości i Metod Hodowli Zbóż, ul. Zawiła 4, 30-423 Kraków
W niniejszej pracy badano dziedziczenie odporności na rdzę brunatną w stadium siewki dwóch odmian pszenżyta
ozimego Fidelio i Lamberto. W tym celu wykonano dwie kombinacje krzyżowań typu odporne x wrażliwe: Fidelio
x Marko i Lamberto x Marko. Odmiany Fidelio i Lamberto były odporne na rdzę brunatną zarówno w stadium siewki
w warunkach polowych jak i w stadium rośliny dorosłej w warunkach polowych natomiast odmiana Marko była podatna
(Grzesik i in. 2002).Formy rodzicielskie oraz mieszańce pokolenia F1 i F2 inokulowano w szklarni w stadium siewki
izolatami 4c, 40b, 83c i 95b rdzy brunatnej (Puccinia recondita f.sp. tritici).Wymienione patotypy występują w ostatnich
latach z dużą częstotliwością w krajowej populacji patogena (Strzembicka i Gruszecka 1997). Charakteryzują się one
określoną kombinacją wirulencji/awirulencji w stosunku do 15 linii izogenicznych NIL z genami odporności Lr :
patotyp wirulencja/ awirulencja
4c Lr2c,Lr3,Lr11,Lr15,Lr17,Lr21,Lr26,Lr28 / Lr1,Lr2a,Lr2b,Lr9,Lr19, Lr 23,Lr24.
40b Lr3,Lr11,Lr15,Lr17,Lr21,Lr26, / Lr1,Lr2a,Lr2b,Lr2c,Lr9,Lr19,Lr23, Lr24,Lr28.
83c Lr3,Lr11,Lr15,Lr17,Lr21,Lr26,Lr28 / Lr1,Lr2a,Lr2b,Lr2c,Lr9,Lr19, Lr23,Lr 24.
95b Lr2b,Lr2c,Lr3,Lr11,Lr15,Lr17,Lr21,Lr26/Lr1,Lr2a,Lr9,Lr19,Lr23, Lr24,Lr28
(Strzembicka i in.2001).
Infekcję w szklarni oceniano po 14 dniach w skali 5.stopniowej: 0; – odporne, 4 – podatne. Wyniki analizowano stosując
test X2
Badania prowadzono w latach 2001 – 2003. Wyniki inokulacji rodziców oraz pokolenia F1 i F2 wyraźnie wskazują,
że pokolenie F1 było odporne w typie odporności rodziców. Stosunek rozszczepień roślin odpornych do podatnych
w pokoleniu F2 w przypadku mieszańca Fidelio x Marko wynosił 3:1, co oznacza, że odporność odmiany Fidelio
warunkowana jest jednym genem dominującym. W kombinacji krzyżowania Lamberto x Marko stosunek roślin
odpornych do podatnych wynosił 13:3, co wskazuje, że odporność odmiany Lamberto zależy od działania dwóch genów
– jednego dominującego i jednego recesywnego.
W110. Efektywność hybrydyzacji introgresywnej T.aestivum.
Józef Pilch
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Zbóż, Zakład Oceny Jakości i Metod Hodowli Zbóż, 30-423 Kraków, ul. Zawiła 4
Hybrydyzacja introgresywna T. aestivum L. z T. durum Desf. umożliwia introgresje loci Glu-A1, Glu-A3 glutenin i GliA1, Gli-A2 gliadyn genomu A, oraz loci Glu-B1, Glu-B3 glutenin i Gli-B1, Gli-B2 gliadyn genomu B kodujące białka
zapasowe endospermu oraz geny amylolityczne alfa – Amy 1 z chromosomów 6A, 6B, geny alfa – Amy 2 z chromosomów
7A, 7B oraz geny alfa – Amy 3 z chromosomów 5A, 5B oraz geny kodujące wysoką zawartość białka prawie wszystkich
chromosomów tego gatunku. W efekcie krzyżowania mono-5BChinese Spring, mono-5B Favorit T. aestivum L.
z odmianami Mirable, Khapli i Fuensemiduro T. durum Desf. uzyskano 64 introgresywne linie heksaploidalne T.
aestivum L./ T. durum Desf o wysokich wskaźnikach technologicznych ziarna klasy E znacznie przewyższającymi
komponenty rodzicielskie T. aestivum L., jak i odmianę jakościową Begra: 30 linii miało zawartość białka 14,5 % – 16,0
%, 14 linii miało wskaźnik sedymentacji Zelenyego 52,3 ml – 62,0 ml, 62 linie miały liczbę opadania 232,0 s – 398,0 s,
12 linii miało wartość wypiekową w klasie E. Wykonana elektroforeza SDS-PAGE wysokocząsteczkowych glutenin
potwierdziła udział obcych, niezidentyfikowanych podjednostek loci Glu-A1 i Glu-B1 oraz zmiany w locus Glu-D1 pod
wpływem chromosomów genomów A, B T. durum Desf u 5 linii oraz powstania nowej niewystępującej u T. aestivum L.
178
Genetyka roślin
pary podjednostek 5+12 w locus Glu-D1. Wyniki wykazały, że hybrydyzacja introgresywna T. aestivum L. z gatunkiem
tetraploidalnym (AA BB) T. durum Desf może prowadzić do uzyskania w odmianach pszenicy heksaploidalnej
wyraźnych i korzystnych zmian technologicznych ziarna uwarunkowanych genetycznie.
W111. Zróżnicowanie populacji sudeckich buka (Fagus sylvatica L.).
Maria Krzakowa (1), Jan Matras (2)
(1) Uniwersytet im.Adama Mickiewicza w Poznaniu, Zakład Genetyki, ul. Międzychodzka 5, 60-371 Poznań
(2) Instytut Badawczy Leśnictwa, Zakład Genetyki Drzew Leśnych, Sękocin, 05-090 Raszyn
Buk (Fagus sylvatica L.) był obok jodły i świerka podstawowym gatunkiem lasotwórczym regla dolnego. Obecnie, jego
rola jest bardzo ograniczona wskutek wzmożonej uprawy świerka. Szczególnie drastyczny ubytek lasów bukowych
w Sudetach zmusza leśników do stosowania metod zachowawczych. Poznanie struktury genetycznej ułatwi wybór
różnych rodzajów selekcji: populacyjnej, rodowej lub indywidualnej dla zachowania ich puli genowej.
Przebadano 5 populacji pod względem szczególnie wybranych dwóch układów enzymatycznych (Px i MDH)
wykazujących w innych pracach zmienność geograficzną. Badania enzymatyczne prowadzone są w różnych krajach
Europy, co pozwoli porównać skalę zmienności naszych rodzimych populacji. Wszystkie populacje okazały się
polimorficzne i różnią się częstością genotypów. Niektóre genotypy okazały się charakterystyczne dla populacji.�
W112. Coevolutionary hotspots in man-made habitats: from ecological to molecular
evidences.
Marlena Lembicz (1), Paweł Olejniczak (2), Artur Jarmolowski (3), Ziemowit Olszanowski (4)
(1) Department of Plant Taxonomy, A. Mickiewicz University, Niepodległości 14, 61-713 Poznań, Poland.
(2) Institute of Nature Conservation, Polish Academy of Science, Mickiewicza 33, 31-120 Kraków, Poland.
(3) Department of Gene Expression, A. Mickiewicz University, Miedzychodzka 5, 61-701 Poznań, Poland.
(4) Department of Animal Taxonomy and Ecology, A. Mickiewicz University, Szamarzewskiego 91A, 60-569 Poznań, Poland.
The origin and effects of an evolutionary game between species from three different kingdoms, plants, fungi and
animals are reported. We present ecological and molecular evidences that the interaction discovered in the man-made
habitats leads to early stage of coevolution. The grass Puccinellia distans was observed to rapidly spread in new manmade habitats, while at the same time it is colonised by the fungus Epichloë typhina. Invasion of infected grasses is
accompanied by alterations in life histories of both species. P. distans developed features promoting long-distance
spreading, E. typhina changed its life cycle by forming sexual structures a second time later in the season. This enables
the fungus to make use of the late shoots of the grass for sexual reproduction, even though it cannot be completed, since
the vector of spermatia necessary for fertilisation, female Botanophila flies, is not present at the time. This indicates that
uncoordinated evolutionary processes have taken place before interactions between organisms become so specialised
that it is difficult to imagine they were the result of natural selection. Moreover, the processes could have been initiated
in man-made habitats – becoming in particular circumstances – coevolutionary hotspots.
W113. Genetyczno-środowiskowe uwarunkowania tolerancji sosny zwyczajnej
(Pinus sylvestris L.) na zanieczyszczenia przemysłowe.
Wiesław Prus-Głowacki (1), Ewa Chudzińska (1), Aleksandra Wojnicka-Półtorak (1), Leon Kozacki (2),
Katarzyna Fagiewicz (2)
(1) Zakład Genetyki UAM Poznań
(2) Instytut Geografii Fizycznej i Kształtowania Środowiska Przyrodniczego UAM Poznań�
Celem badań było określenie poziomu zmienności genetycznej i zbadanie struktury genetycznej populacji Pinus
sylvestris pod wpływem silnego zanieczyszczenia środowiska wynikającego z działalności Huty Cynku w Miasteczku
Śląskim. Analizowana populacja sosny pochodziła z naturalnego odnowienia i w jej składzie obserwowano drzewa
wykazujące niekorzystne objawy wpływu wielostronnego stresu przemysłowego (S– sensitive) i drzewa, które takich
objawów nie wykazują (T– tolerant). Zebrano materiał, którym były paki zimowe i 2-letnie igły oraz szyszki z 40
osobników wykazujących wyraźne symptomy uszkodzeń takie jak nekrozy i chlorozy igieł, nietypowy pokrój i słaby
wzrost, oraz z 40 drzew nie wykazujących uszkodzeń. Zawartość metali ciężkich (Cd, Cr, Cu, Ni, Pb, i Zn) w glebie
badano pobierając próby glebowe po pięć wzdłuż 4 transektów, w odstępach co 50 metrów. Analizy wykonano metodą
179
Genetyka roślin
absorpcyjnej spektrometrii atomowej.
W celu określenia struktury genetycznej drzew tolerancyjnych i wrażliwych na skażenie posłużono się metodą badania
zmienności izoenzymów dla 18 loci genowych w ramach 11 systemów enzymatycznych. W badanych grupach drzew
określano częstości alleli i genotypów, średnią liczbę alleli (A/L) i genotypów (G/L) na locus, heterozygotyczność
obserwowaną (Ho) i spodziewaną (He), indeks polimorfizmu genotypów (Pg) oraz współczynnik Wright-a (F). Badania
cytogenetyczne wykonywano metoda zgniatania stożków wzrostu korzeni kiełkujących nasion pobranych z drzew
uszkodzonych i nie wykazujących uszkodzeń. Preparaty rozgniatano w 45% kwasie octowym i barwiono techniką
Giemsy.
W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że struktura genetyczna w obu grupach drzew różni się znacząco.
W grupie T zaobserwowano niższą liczbę alleli i genotypów na locus, wyższy poziom heterozygotyczności oraz niższą
liczbę aberracji chromosomowych niż w grupie S, co wskazuje na bezpośredni wpływ zanieczyszczeń na materiał
genetyczny drzew.
Praca wykonana w ramach projektu interdyscyplinarnego UAM: Genetyczno-środowiskowe uwarunkowania tolerancji
drzew leśnych na zanieczyszczenie przemysłowe – PI-II/12003.
Komunikaty plakatowe:
P222.
Ocena interakcji genotypowo-środowiskowej linii DH jęczmienia pod względem
cech morfologicznych i fizycznych źdźbła determinujących odporność.
Stanisław Jeżowski, Maria Surma, Tadeusz Adamski, Paweł Krajewski, Katarzyna Głowacka
Instytut Genetyki Roślin, PAN, 60-479 Poznań, ul. Strzeszyńska 34
Praca przedstawia wyniki badań dotyczące wpływu warunków środowiska na kształtowanie się cech morfologicznych
i fizycznych źdźbła oraz stopnia wylegania u wybranych form jęczmienia jarego. Materiał do badań stanowiły linie
podwojonych haploidów (DH) uzyskane z mieszańców F1 między oplewioną formą RK63/1 i nagoziarnistą 1N86.
Linie DH, formy wyjściowe oraz mieszańce F1 F2 badano w trzyletnim doświadczeniu polowym założonym w układzie
bloków losowanych w trzech powtórzeniach. Analizowano długość, średnicę i grubość źdźbła, wskaźnik elastyczności
źdźbła (moduł Younga) oraz stopień wylegania, który oceniano na polu w skali bonitacyjnej 1-9, gdzie 1 oznaczał
brak wylegania a 9 najwyższe wyleganie. W badaniach stwierdzono istotny wpływ lat, genotypów oraz interakcji lata
x genotypy na zmienność analizowanych cech. Ocena i testowanie porównań między oplewionymi a nagoziarnistymi
liniami jęczmienia wykazała, że formy oplewione charakteryzowały się istotnie grubszymi i dłuższymi źdźbłami,
większa ich elastycznością oraz mniejszym stopniem wylegania. Natomiast wielkość i kierunek różnic miedzy liniami
oplewionymi a nagoziarnistymi pod względem analizowanych cech zależny był od warunków środowiskowych.
P223.
Analiza wpływu biotypów i herbicydów na wybrane cechy ilościowe pszenżyta
heksaploidalnego.
Czesław Stankiewicz
Zakład Genetyki i Fizjologii Roślin, Instytut Biologii, Akademia Podlaska w Siedlcach
Pod względem areału uprawy pszenżyto w Polsce zajmuje piąte miejsce. Uprawiane w kraju heksaploidalne odmiany
pszenżyta łączą korzystne właściwości żywieniowe pszenicy z małymi wymaganiami glebowymi i dobrą mrozoodpornością
żyta. Pod względem ewolucyjnym pszenżyto jest jeszcze młodą rośliną uprawną, co uzasadnia dalsze prowadzenie
badań hodowlanych w kierunku plonu ziarna oraz jego cech ilościowych (białko, skrobia, aminokwasy egzogenne,
CS, EAAI). Materiał badawczy stanowiło ziarno, które pochodziło z doświadczeń poletkowych prowadzonych w Stacji
Doświadczalnej Zawady. Eksperyment polowy wykonano w latach 1999-2001 na glebach klasy bonitacyjnej IVb, na
kompleksie rolniczym żytnim dobrym (5). Doświadczenie założono metodą split-plot w czterech powtórzeniach. Zbioru
ziarna dokonano w fazie pełnej dojrzałości. Analizy chemiczne wykonano w trzech powtórzeniach. W doświadczeniu
analizowano wpływ biotypów (pszenżyto ozime-odmiana Tornado oraz pszenżyto jare-odmiana Wanad) i herbicydów
(Arelon 75 WP, Puma Super 069 EW) na zawartość skrobi (metoda spektrofotometryczna) białka ogółem (metoda
Kjeldahla), aminokwasy egzogenne oraz biologiczną wartość białka (CS-Mitchella i Blocka, EAAI-Oser). W celu
stwierdzenia istotności różnic w wartościach badanych cech ilościowych, wyniki opracowano przy pomocy analizy
wariancji w układzie całkowicie losowym oraz testu Tukey-a przy poziomie istotności p=0,05. Dodatkowo stwierdzono
istotny wpływ lat na skład chemiczny ziarna pszenżyta.
180
Genetyka roślin
P224.
Obrazy mikroskopowe parametrów strukturalnych nasion oraz genetyczna
zmienność cech u mutantów lędźwianu siewnego (Lathyrus sativus L.).
Wojciech Rybiński (1), Wioletta Błaszczak (2), Józef Fornal (2)
(1) Instytut Genetyki Roślin PAN, Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań
(2) Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności PAN, Tuwima 10, 10-747 Olsztyn
Z uwagi na wysoką zawartość białka w nasionach (do 32%), znaczną tolerancję na rodzaj gleb oraz wybitną odporność
na suszę, lędźwian siewny może być cennym uzupełnieniem palety roślin strączkowych uprawianych w Polsce.
Warunkiem szerszego wprowadzenia tej rośliny do krajowego rolnictwa jest konieczność genetycznego poprawienia
szeregu niekorzystnych cech użytkowych.
W wyniku zastosowania chemomutagenów uzyskano mutanty lędźwianu siewnego w odniesieniu do cech
morfologicznych, terminu dojrzewania oraz parametrów struktury plonu. Szczególnie wartościowe są mutanty
o obniżonej wysokości roślin, wyższym osadzeniu najniższego strąka oraz ograniczeniu wielkości biomasy poprzez
redukcję liczby rozgałęzień bocznych. Genotypy te charakteryzują się poprawieniem odporności na wyleganie oraz
skróconym okresem dojrzewania, co ma podstawowe znaczenie w warunkach klimatycznych Polski. Część mutantów
w porównaniu z ich odmianami wyjściowymi – Derek i Krab wyróżniają wyższe parametry struktury plonu jak liczba
strąków z rośliny, długość i szerokość strąka, liczba i masa nasion z pojedynczego strąka oraz rośliny.
Dla wybranych mutantów i ich form wyjściowych wykonano analizę cech masowych i geometrycznych oraz
mikrostruktury w mikroskopie JEOL 5200. Analizowano wymiary nasion, grubość i budowę łupiny nasiennej, wymiary
i budowę znaczka i jego szczeliny a także wielkość i budowę komórek liścieni. W odniesieniu do wymienionych cech
wykazano zróżnicowanie mutantów w porównaniu z ich formami wyjściowymi. Stwierdzono między innymi, że
powierzchnia nasion może być podstawą do identyfikacji badanych obiektów.
P225.
Struktura interakcji genotypowo-środowiskowej linii podwojonych haploidów
jęczmienia pod względem cech technologicznych.
Michał Rebarz, K. Krystkowiak, A. Kuczyńska, T. Adamski, Z. Kaczmarek, M. Surma, S. Jeżowski
Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk, ul.Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań , e-mail: [email protected]
Przedmiotem badań była interakcja genotypowo-środowiskowa linii podwojonych haploidów (DH) jęczmienia dla cech
związanych z wartością browarną ziarna. Materiał do badań stanowiło 28 linii DH, w tym 13 dwu– i 15 sześciorzędowych
otrzymanych z mieszańców pokolenia F1 browarnej odmiany Maresi (dwurzędowa) z pastewną odmianą Pomo
(sześciorzędowa). Podwojone haploidy zostały wytworzone metodą „bulbosową”. Doświadczenia przeprowadzono
w sześciu różnych środowiskach. W każdym środowisku eksperyment zakładano w układzie bloków losowanych
kompletnych z trzema powtórzeniami. Badano następujące cechy browarne ziarna jęczmienia: zawartość białka, liczba
Kolbacha oraz ekstrakt z mąki. Słodowanie próbek ziarna zostało przeprowadzone w mikrosłodowni typu AMS (firmy
Phoenix Biosystems). Analizy słodu zostały wykonane zgodnie z zaleceniami EBC (European Brewery Convention).
Do oceny interakcji genotypowo-środowiskowej wykorzystano program SERGEN©. Testowano efekty główne dla
poszczególnych linii oraz ich interakcję ze środowiskiem. Na podstawie wartości statystyki F dla interakcji genotypowośrodowiskowej linie podzielono na stabilne (interakcja nieistotna statystycznie) oraz niestabilne (interakcja istotna).
Linie niestabilne zostały sklasyfikowane jako ekstensywne przypadku, kiedy współczynnik regresji był statystycznie
istotny i ujemny oraz intensywne przy dodatnim i istotnym współczynniku regresji. Nie znaleziono różnic w reakcji na
warunki środowiska linii dwu– i sześciorzędowych: liczba linii stabilnych i niestabilnych była zbliżona w obu grupach
linii DH. Wyselekcjonowano dwie linie (S10 i D2), które wykazywały nieistotny efekt główny dla zawartości białka
i liczby Kolbacha, natomiast w przypadku ekstraktu z mąki oceny efektów głównych były dodatnie i stabilne.
P226.
Analiza białek gliadynowych przy użyciu wolnostrefowej elektroforezy kapilarnej
do określenia podobieństwa genetycznego odmian pszenicy jarej.
Marcin Moczulski, Jan Bocianowski, Bolesław P. Salmanowicz
Instytut Genetyki Roślin PAN, ul. Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań
W pracy przedstawiono wyniki oszacowania przydatności wolnostrefowej elektroforezy kapilarnej w celu określenia
podobieństwa genetycznego dwudziestu czterech odmian pszenicy jarej na podstawie składu białek gliadynowych.
Zastosowana technika zapewnia szybkie, powtarzalne i o wysokiej rozdzielczości rozdziały elektroforetyczne białek,
181
Genetyka roślin
również występujących w bardzo małych ilościach w analizowanych próbach.
Analizy przeprowadzono na aparacie do wysokosprawnej elektroforezy kapilarnej firmy Beckman (USA) typu PACE
System 2100 z użyciem nieusieciowanej kapilary o średnicy wewnętrznej 0,05 mm i długości 270 mm.
Porównano czasy migracji poszczególnych białek gliadynowych, którym odpowiadały piki na elektroforegramach. Na ich
podstawie wyznaczono współczynniki podobieństwa genetycznego, które posłużyły do hierarchicznego pogrupowania
odmian metodą najkrótszych średnich połączeń. Wyniki grupowania przedstawiono w postaci dendrogramu.
P227.
Substytucje A/Am i ich ekspresja we wtórnych formach pszenżyta tetraploidalnego
z kompletnym genomem A.
Wojciech Sodkiewicz, Barbara Apolinarska, Teresa Sodkiewicz
Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk, ul. Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań
Badania mają na celu rozróżnienie chromosomów należących do genomu A pszenżyta heksaploidalnego i chromosomów
pochodzących z genomu Am pszenicy diploidalnej (Triticum monococcum) we wtórnych formach pszenżyta, a także
sprawdzenie skuteczności tego zabiegu na przykładzie analizy populacji wtórnych form tetraploidalnego pszenżyta
z substytucjami A/Am. Genotypy substytucyjne wytworzone zostały poprzez krzyżowanie pszenżyta heksaploidalnego
z syntetycznym allotetraploidem T. monococcum/ S. cereale (Am/Am). Porównawcze barwienie chromosomów metodą
C-prążkową wykazało, że chromosomy T. monococcum wybarwiają się trudniej w rejonach heterochromatynowych niż
chromosomy genomu A z pszenżyta heksaploidalnego. Wykorzystując tę różnicę zaklasyfikowano wstępnie występujące
substytucje i określono ich sprzężenie z wyznaczonymi jako markerowe cechami fenotypowymi. Na podstawie
obliczonych sprzężeń uściślono pierwotne analizy cytologiczne. Wyznaczono częstość substytucji poszczególnych
chromosomów z genomu A do pierwotnego amfitetraploida (AmAmRR).
P228.
Wewnątrzgatunkowa zmienność Solidago virgaurea w wybranych cechach
morfologii w uprawie doświadczalnej.
Ewa Maria Pawlaczyk, Maria Anna Bobowicz, Mirosława Szymańska, Ewa Maria Pawlaczyk
Zakład Genetyki, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu, ul. Międzychodzka 5, 60-371 Poznań
Celem badań było przeanalizowanie genetycznej zmienności cech morfologicznych w warunkach uprawy wybranych
polskich populacji dwóch form z rodzaju Solidago – nawłoć: Solidago virgaurea ssp.virgaurea – formy niżowej i Solidago
virgaurea ssp. alpestris – formy alpejskiej. Powodem, który przyczynił się do podjęcia tego tematu był dyskusyjny status
taksonomiczny Solidago virgaurea L. ssp. alpestris. Niektórzy badacze reprezentowali pogląd, że jest on subalpejskim
ekotypem Solidago virgaurea L., lub subalpejską odmianą Solidago virgaurea L. spotykaną w górach Środkowej Europy.
Według innego poglądu Solidago virgaurea L. ssp. alpestris był uznawany za podgatunek, lub za odrębny gatunek.
Referowane badania przeprowadzono na: 9 cechach liści rozetkowych, 7 cechach pokroju rośliny i 9 cechach kwiatowych.
W sumie zbadano 220 roślin z uprawy doświadczalnej założonej na poletku doświadczalnym Zakładu Genetyki UAM
na terenie Ogrodu Botanicznego w Poznaniu. Dane z badań biometrycznych zostały następnie opracowane za pomocą
wielozmiennych analiz statystycznych. Obliczono: charakterystyki zastosowanych cech, współczynniki korelacji między
cechami, wielozmienną analizę wariancji, rozkład i test t-Studenta, analizę zmiennych dyskryminacyjnych i odległości
Mahalanobiosa wraz z najkrótszym dendrytem oraz wykonano grupowanie metodą najbliższego sąsiedztwa na
podstawie odległości Euklidesa. Analizie poddano dane w 2 wariantach: I wariant – trzy populacje alpejskie, II wariant
– dwie populacje niżowe. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono występowanie statystycznie istotnego
genetycznego zróżnicowania między formą alpejską a niżową w następujących cechach: długości zewnętrznego kwiatka
języczkowego; długości pylników; największej szerokości liścia rozetkowego; długości łodygi; długości kwiatostanu;
liczby koszyczków w kwiatostanie. Stwierdzono również, że zmienność między formami jest większa, niż zmienność
w obrębie form. Potwierdza to hipotezę o wysokiej randze tych taksonów. W świetle wyników uzyskanych ze wszystkich
analiz, można wnioskować, że mamy do czynienia z dwoma dobrze wyróżnionymi formami.
182
Genetyka roślin
P229.
Wykorzystanie systemu DH-MAS w hodowli syntetycznych odmina rzepaku ozimego
(Brassica napus L.).
Laurencja Szała, Teresa Cegielska-Taras, Wiesława Popławska, Alina Lierch, Iwona Bartkowiak-Broda
Instytut Hodowli i Aklimatyzcji Roślin, Zakład Genetyki Roślin Oleistych, Pracownia Kultur Tkankowych, 60-479 Poznań,
ul. Strzeszyńska 36
U rzepaku występuje wysoki efekt heterozji w plonie nasion, który może być wykorzystany w odmianach mieszańcowych
i syntetycznych. W przypadku odmian syntetycznych efekt heterozji zależy od stopnia wzajemnego przepylenia
linii składowych oraz ich zróżnicowania genetycznego. Podjęto badania nad tworzeniem tego typu odmian z linii
podwojonych haploidów (DH). Pierwszy etap badań ma na celu ocenę możliwości selekcji linii DH o wysokim stopniu
obcoprzepylenia przy pomocy markerów izoenzymatycznych. Do doświadczenia wybrano 13 linii DH rzepaku ozimego
różniących się dwoma układami izoenzymatycznymi-PGI (izomeraza glukofosfora-nowa pH7,0 – EC-Nr 5.3.1.9. oraz
LAP (aminopeptydaza leucynowa – pH7,0 – EC Nr 3.4.11.1.). Następnie wykonano badania polimorfizmu tych systemów
w pokolenia F1 uzyskanego w wyniku przepylenia tych linii w warunkach kontrolowanych i swobodnego pylenia.
P230.
Ocena mieszańców międzygatunkowych Lupinus albus (sensu lato) x Lupinus
mutabilis pod względem cech morfologicznych.
Ewa Sawicka-Sienkiewicz, Renata Galek, Jolanta Augiewicz, Kamila Nowosad
Akademia Rolnicza we Wrocławiu, Katedra Hodowli Roślin i Nasiennictwa, ul. Cybulskiego 34, 50-205 Wrocław
Południowo amerykański uprawny gatunek Lupinus mutabilis Sweet został uznany jako perspektywiczna roślina dla
warunków klimatu umiarkowanego. Wysoka zawartość białka (>40%) i tłuszczu (do 20%) w nasionach była przyczyną
określenia go jako andyjskiej soi. Ze względu na długi okres wegetacji poszukuje się form wcześniej dojrzewających.
W celu zwiększenia zmienności genetycznej wykonano szereg krzyżowań z gatunkiem Lupinus albus i jego dzikimi
odmianami botanicznymi (L. termis, L. vavilovi i L. graecus), który jest dobrze zaadoptowanym gatunkiem do
europejskich warunków klimatycznych. Pomimo wytworzonych barier cytogenetycznych udało się uzyskać osiem
mieszańców analizowanych aż do pokoleniu F7 i F 8. U międzygatunkowych mieszańców różnice wysokości między
wysokością pędu głównego i bocznych rozgałęzień są wyraźnie mniejsze niż u form rodzicielskich. Analizowano liczbę
bocznych rozgałęzień, długość kwiatostanu i liczbę okółków kwiatowych pędu głównego i bocznych rozgałęzień oraz
liczbę strąków i masę 1000 nasion. Zarówno mieszańce jak formy rodzicielskie odznaczały się istotnym zróżnicowaniem
analizowanych cech morfologicznych a wartości współczynników zmienności wahały się od 6% do 49%. Sześć
mieszańców pod względem większości cech było podobnych do form matecznych a dwa (L. albus „Wat” x L. mutabilis
– Mut-136) i (L. termis x L. mutabilis XM.5) do form ojcowskich. Cztery mieszańce odznaczały się szybkim wzrostem
i osiągały pełną dojrzałość na początku września. Żywotność pyłku ośmiu mieszańców i form rodzicielskich była
wysoka.
P231.
Poszukiwanie zmienności genetycznej uzyskanej na drodze mutagenezy mikrospor
rzepaku ozimego (Brassica napus L.).
Laurencja Szała (1), Teresa Cegielska-Taras (1), Elżbieta Adamska (2), Krystyna Krótka (1)
(1) Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Zakład Genetyki Roślin Oleistych, Pracownia Kultur Tkankowych, 60-479 Poznań,
ul. Strzeszyńska 36
(2) Instytut Genetyki Roślin PAN, 60-479 Poznań, ul. Strzeszyńska 36
Zastosowanie mutagenezy w połączeniu z systemem podwojonych haploidów (DH) może przyspieszyć programy
hodowlane mające na celu tworzenie zmienności, selekcję, dochodzenie do homozygotyczności oraz szybkie
namnażanie pożądanych genotypów. Wynikiem prowadzonych badań nad mutagenezą rzepaku ozimego było
uzyskanie 400 linii DH. Linie DH otrzymano z mikrospor naświetlanych promieniami UV lub traktowanych MNU.
Wyniki analizy wariancji wykazały istotne różnice pomiędzy liniami DH a formą wyjściową we wszystkich badanych
cechach. Posługując się metodą obliczonych kontrastów wyselekcjonowano linie o wartościach istotnie mniejszych
lub większych od formy wyjściowej w cechach morfologicznych i biochemicznych. Ponieważ mutowane mikrospory
pochodziły z homozygotycznej linii można przypuszczać, że każda zmiana występująca w homozygotycznej linii będzie
zmianą mutacyjną.
183
Genetyka roślin
P232.
Morfologiczne i anatomiczne zróżnicowanie populacji kosodrzewiny (Pinus mugo
Turra) z Tatr wyrażone w cechach igieł.
Ewa Maria Pawlaczyk, Alina Bączkiewicz
Zakład Genetyki, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza, ul. Międzychodzka 5, 60-371 Poznań
Z 90 osobników kosodrzewiny (Pinus mugo Turra) pochodzących z 3 populacji tego gatunku występujących w Tatrach
zebrano dwuletnie igły, które opracowano pod względem 13 morfologicznych i anatomicznych cech. Uzyskane dane
poddano kompleksowej analizie z zastosowaniem wielozmiennych metod statystycznych, za pomocą których starano się
wykryć zmienność między populacjami. Wykonano analizę zmiennych dyskryminacyjnych, obliczono charakterystyki
zastosowanych cech i współczynniki korelacji między nimi. Wyznaczono odległości Mahalanobisa między każdymi
dwoma drzewami i oceniono ich istotność za pomocą statystyki F. Przeprowadzono także grupowanie aglomeratywne
metodą najbliższego sąsiedztwa na bazie odległości Euklidesa. Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że
populacje kosodrzewiny różnią się między sobą wysoce statystycznie istotnie na podstawie zastosowanego zestawu cech
igieł. Zaobserwowano, że populacje z Wielkiej Świstówki i Kotła Dziurawe są do siebie bardziej podobne, a populacja
z Kotliny Jarząbczej różni się od pozostałych. Cechami, które najbardziej różnią badane populacje są wysokość i szerokość
komórki epidermy. Ze względu na te dwie cechy populacje z Wielkiej Świstówki i Kotła Dziurawe tworzą jedną grupę,
a populacja z Kotliny Jarząbczej jest wyraźnie różna od nich.
P233.
Zmienność i odziedziczalność cech mieszańców żyta ozimego.
Irena Kolasińska
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Radzików
Badano zmienność i odziedziczalność kilkunastu cech mieszańców prostych żyta pochodzących z krzyżowania linii
męskosterylnych z restorerami płodności oraz mieszańców trójkomponentowych uzyskanych poprzez krzyżowanie
męskosterylnych mieszańców prostych z restorerami. Doświadczenia polowe przeprowadzono w latach 1999-2002 (1-3
miejscowości, 3 powtórzenia, wielkość poletka 5m2).
W latach 1999 i 2002 stwierdzono niską zmienność badanych cech zarówno u mieszańców prostych jak
i trójkomponentowych. Najwyższe współczynniki zmienności stwierdzono dla wylegania (8.0%), porażenia mączniakiem
(6.1%) i rdzą brunatną (6.6%). W 2000 roku obserwowano większą zmienność mieszańców prostych. Największe
współczynniki zmienności stwierdzono dla cech: plon ziarna (13.3%), masa ziarna z kłosa (8.9%), termin kłoszenia
(11.0%), porażenie rdzą brunatną (15.1%), wyleganie (13.0%), liczba opadania (13.1%).
Badania wykazały wysoką odziedziczalność większości cech mieszańców prostych w latach 1999 i 2002. W obu latach
stwierdzono wysokie współczynniki odziedziczalności w szerokim sensie – h2(s) ponad 0.7 dla cech: plon ziarna, masa
ziarna ziaren kłosa, liczba ziaren w kłosie, masa 1000 ziaren, długość kłosa, pylenie, wysokość. W 1999 roku dodatkowo
wysokim h2(s) wyróżniły się cechy: liczba kłosków w kłosie, masa hektolitra, wysokość roślin, termin kłoszenia,
porażenie mączniakiem, wyleganie, liczba opadania, zawartość białka i zawartość lizyny. W 1999 roku współczynniki
odziedziczalności w wąskim sensie – h2(w) ponad 0.6 stwierdzono dla wszystkich cech z wyjątkiem wylegania
i zawartości włókna w ziarnie. Mieszańce tego typu wykazały wyższe współczynniki h2(s) większości cech niż mieszańce
trójkomponentowe. U obu typów mieszańców wysoką odziedziczalność w szerokim sensie wykazały cechy: masa ziarna
z kłosa, masa 1000 ziaren, długość kłosa. Spośród analizowanych cech najwyższe współczynniki h2(w) stwierdzono dla
liczby ziaren w kłosie (0.54), liczby kłosków w kłosie (0.58) i terminu kłoszenia (0.45).
P234.
Wykorzystanie markerów genetycznych do identyfikacji szczepów w plantacjach
nasiennych sosny zwyczajnej.
Ireneusz J. Odrzykoski (1), Wojciech Wesoły (2), Wiesław Prus-Głowacki (1)
(1) Zakład Genetyki, Instytut Biologii Eksperymentalnej, Uniwersytet im. A. Mickiewicza, Poznań
(2) Zakład Selekcji, Nasiennictwa i Szkółkarstwa Leśnego, Katedra Hodowli Lasu, Akademia Rolnicza w Poznaniu
Opracowano prostą metodę badania jednorodności genetycznej szczepów sosny zwyczajnej, opartą na markerach
izoenzymatycznych. Wykorzystano polimorfizm produktów 17 loci o średniej heterozygotyczności He = 0.27.
W odróżnieniu od metod stosowanych do tej pory, ekstrakty uzyskiwane są z diploidalnych pąków zimowych (zamiast
haploidalnych endospermow), co pozwala na obniżenie kosztów genotypowania i przyspieszenie analiz. Metodę tę
wykorzystano do weryfikacji mapy rozmieszczenia szczepów w plantacji nasiennej PN-34, w nadleśnictwie Zdrojowa
184
Genetyka roślin
Góra (RDLP Piła). Na powierzchni 9,6 ha rośnie tu około 3000 szczepów z 71 drzew doborowych. Stwierdzono, że
spośród 500 zbadanych szczepów rosnących w pięciu sektorach tej plantacji, 13% ma genotyp niezgodny z genotypem
drzew doborowych wykorzystywanych do szczepień. Omówione będą możliwe przyczyny tej niezgodności.
P235.
Wstępna ocena mutantów odmiany Emir pod względem grubości ścian strąka
i okrywy nasiennej na tle wybranych rodów i odmian (Lupinus angustifolius).
Honorata Kalińska (1), Ewa Sawicka-Sienkiewicz (1), Renata Galek (1), Stawiński Stanisław (2)
(1) Akademia Rolnicza, Katedra Hodowli Roslin i Nasiennictwa, ul. Cybulskiego 34 50-205 Wrocław
(2) Hodowla Roślin Smolice Sp. z.o.o, Oddział Przebędowo 62-095 Murowana Goślina
Postęp w hodowli łubinu wąskolistnego dotyczy głównie otrzymania form samokończących wegetację
(o zdeterminowanym typie wzrostu), termoneutrealnych, odpornych na pękanie strąków i osypywanie nasion, dających
wyższy plon, odpornych na choroby oraz otrzymania form o niskiej zawartości alkaloidów. Prace hodowlane powinny
iść również w kierunku podwyższenia zawartości białka i tłuszczu w nasionach łubinu wąskolistnego (31 – 34% białka
i 6,5 % tłuszczu).
Według Clementsa i in. (2002) grubość ścian strąka oraz okrywy nasiennej ma istotny wpływ na zawartość związków
odżywczych w nasionach oraz plon nasion. Selekcja genotypów w kierunku niższej proporcji ścian strąka i okrywy
nasiennej mogłaby doprowadzić do zwiększenia koncentracji białka i tłuszczu w nasionach.
W australijskich badaniach procentowy udział ścian strąka i okrywy nasiennej w całym strąku u 125 genotypów
łubinu wąskolistnego wynosił od 21,8% do 26,2%, a ścian strąka od 32 do 35%. Dla porównania nasiona soi i grochu
charakteryzują się kolejno 7% i 9% udziałem okrywy nasiennej w całym nasieniu, oraz 13% udziałem ścian strąka
u grochu.
W naszych pracach określono procentowy udział ścian strąka oraz okrywy nasiennej w stosunku do całego strąka dla 244
linii mutacyjnych z odmiany „Emir” oraz 16 rodów i odmian Lupinus angustifolius. Analizę przeprowadzono według
metodyki Clementsa i in. (2002). Wstępnie wyselekcjonowano 18 linii mutacyjnych charakteryzujących się najniższymi
wartościami powyższych cech w stosunku do kontroli. Procentowy udział okrywy nasiennej dla linii mutacyjnych wynosił
od 14,91 % do 19, 55%, a dla kontroli (odmiana Emir) od 19,77% do 22,02%. Procentowy udział ścian strąka wynosił od
24,39% do 62,56% dla linii mutacyjnych, a dla kontroli od 34,56% do 42,63%. Linie mutacyjne pod względem grubości
ścian strąka i okrywy nasiennej porównano z kolekcją rodów i odmian łubinu wąskolistnego. Dla kolekcji procentowy
udział okrywy nasiennej wynosił 18,88% – 22,98%, a udział ścian strąka w całym strąku 30,32% – 38,62%.
P236.
Wstępne badania nad przyczynami obniżonej płodności u wybranych form L.
angustifolius.
Renata Galek (1), Ewa Sawicka-Sienkiewicz (1), Stanisław Stawiński (2), Patrycja Maniukiewicz (1)
(1) Akademia Rolnicza, Katedra Hodowli Roslin i Nasiennictwa, ul. Cybulskiego 34 50-205 Wrocław
(2) Hodowla Roślin Smolice Sp. z.o.o, Oddział Przebędowo 62-095 Murowana Goślina
Materiał do badań nad płodnością stanowiło sześć wybranych odmian i rodów Lupinus angustifolius
zróżnicowanych pod względem typu wzrostu (samokończenia) – dwa rody samokończące oraz trzy odmiany (ELF,
EMIR, GRAF) i jeden ród o tradycyjnym typie wzrostu. Materiał pochodził ze Stacji Hodowli Roślin w Przebędowie.
Badano następujące cechy na pędzie głównym: długość kwiatostanu [cm], liczbę kwiatków, oraz zawiązanych
i zebranych strąków. Określono indeks płodności [%] u badanych obiektów. W trakcie maksymalnego pylenia roślin
pobrano słupki ze środkowej i górnej części kwiatostanu głównego. Po wykonaniu preparatów obserwowano przebieg
kiełkowania pyłku na znamieniu, przerastanie łagiewki pyłkowej oraz liczbę zalążków w zalążni w świetle mikroskopu
fluorescencyjnego.
Najwyższy indeks płodności stwierdzono u samokończących rodów (41,2% i 32,4%). U form o tradycyjnym wzroście
indeks płodności wahał się od 26 (ród hodowalny oraz Emir) do 32,7% (Elf). Odmiana Graf miała indeks płodności
na poziomie 29,2%. Stwierdzono obecność pyłku na znamieniu w 77% w części środkowej kwiatostanu, natomiast
w górnej części kwiatostanu pyłek osadzał się tylko w 45%. W części środkowej kwiatostanu pyłek kiełkował u 70 %
analizowanych znamion słupków, a w górnej u 43%. Obiekty o dobrym indeksie płodności tworzyły mniej niż cztery
zalążki w zalążni w środkowej części kwiatostanu, a w górnej zaobserwowano mniejszą ich liczbę, szczególnie u jednego
z rodów samokończących (1,7). U odmiany Elf, o tradycyjnym wzroście wystąpiła wyraźna zależność między wyższą
płodnością a zmniejszoną liczbą zalążków w górnej części kwiatostanu (2,7). U pozostałych obiektów liczba zalążków
w środkowej i górnej części kwiatostanu wynosiła cztery. W górnej części kwiatostanu stwierdzono średnio o jeden
185
Genetyka roślin
zalążek mniej. Należy nadmienić, iż badane epigonalne formy charakteryzowały się dwa razy dłuższymi kwiatostanami
od form o tradycyjnym wzroście. Powyższe wyniki wskazują, iż przyczyną obniżonej płodności łubinu w górnej
i środkowej części kwiatostanu może być brak substancji pokarmowych lub fitohormonalnych, o czym świadczy
niemożność osadzenia się pyłku na znamieniu, brak przerastania łagiewki pyłkowej przez szyjkę słupka, a w efekcie
opadanie niezapłodnionych słupków oraz niedojrzałych zarodków.
P237.
Ocena podobieństwa genetycznego form żyta jarego na podstawie wybranych cech
ilościowych.
Henryk Bujak, Renata Galek
Akademia Rolnicza we Wrocławiu, Katedra Hodowli Roślin i Nasiennictwa
Przeprowadzone badania miały określić wzajemne podobieństwo genotypów żyta jarego pochodzących z różnych stref
klimatycznych oraz określić ich przydatność do wznowionej hodowli tego gatunku. Materiałem badawczym było 20
kolekcyjnych form żyta jarego. Doświadczenia polowe założono metodą losowanych bloków w dwóch miejscowościach.
Analizowano 9 cech struktury plonu oraz 3 cechy jakościowe ziarna. Średnie wartości cech pogrupowano na rozłączne
grupy jednorodne testem Haufe-Geidel (1984). Do oceny zróżnicowania badanych genotypów i ich podziału na grupy
wykorzystano metodę skupień Warda. Wykonano dendrogram metodą najdalszego sąsiedztwa i określono podobieństwo
między obiektowe badanych genotypów za pomocą statystyki Fα (Mądry 1993). Dendrogram przecięto linią prosta na
poziomie Fα otrzymując skupienia zawieszone na odpowiednich gałęziach. Skupienia te stanowią grupy jednorodne
genotypów pod względem analizowanych cech. Analiza wariancji wykazała istotny wpływ środowisk na ekspresję
badanych cech. Stwierdzono również istotne zróżnicowanie badanych genotypów dla większości cech z wyjątkiem
krzewistości, zbitości kłosa i zawartości włókna w ziarnie. Dla liczby pięterek w kłosie, zbitości kłosa, masy 1000
ziaren, masy hektolitra, zawartości białka ogólnego i lizyny w ziarnie wystąpiła również istotna interakcja genotypowośrodowiskowa. Wykreślony dendrogram według metody najdalszego sąsiedztwa Warda pozwolił na podział badanych
genotypów na grupy jednorodne i określenie odległości między nimi. Najbardziej podobne pod względem badanych
cech okazały się genotypy leżące w blisko siebie na dendrogramie. Większość badanych genotypów stanowi samodzielne
grupy jednorodne pod względem kompleksowej oceny wszystkich cech.
P238.
Możliwości poprawienia jakości nasion rzepaku ozimego (Brassica napus L.) przy
udziale mutagenezy.
Jan Olejniczak (1), Małgorzata Adamczak (1), Christian Moellers (2)
(1) Instytut Genetyki Roślin PAN, Poznań 60-479 ul. Strzeszyńska 34
(2) Instytut Hodowli Roślin i Agronomii, Uniwersytet George-August Getynga D-37-075, ul. Von Siebold 8, Niemcy
Od kilku lat zwiększa się wykorzystanie oleju rzepakowego do celów spożywczych i przemysłowych (biopaliwa, olej
hydrauliczny). Wartość pokarmowa i przemysłowa oleju rzepakowego zależy głównie od zawartości oleju, białka,
glukozynolanów oraz spektrum kwasów tłuszczowych. Na drodze mutagenezy można skutecznie zwiększać zakres
zmienności cech decydujących o jakości oleju (RÖBBELEN 1990, OLEJNICZAK i in. 2000, 2003).
Selekcję mutantów przeprowadzono w pokoleniu M3/M6 linii DH-0120 potraktowanej różnymi dawkami azydku
sodu (SA) oraz N-nitrozo-N-metylomocznika (MNUA). Wyselekcjonowano 1576 linii mutantów, które następnie
analizowano metodą spektrometrii odbiciowej w bliskiej podczerwieni (NIRS).
Zawartość składników chemicznych w badanych liniach mutantów wahała się odpowiednio: olej 39.4 – 51.7%, białko
17.2 – 31.1%, glukozynolany 4.3 – 31.1 µM, kwas oleinowy 50.4 – 69.7%, kwas linolowy 6.1 – 14.4%, kwas linolenowy
6.1 – 14.4% i kwas erukowy 0.1 – 28.0%.
Analizowane linie wykazały wyraźnie zwiększoną zmienność badanych cech w porównaniu do linii wyjściowej DH0120. Spośród badanej populacji linii mutantów dodatkowo analizowano metodą chromatografii gazowej (GLC)
spektrum kwasów tłuszczowych dziewięciu form o wyraźnie zwiększonej zawartości kwasu oleinowego oznaczonego
wstępnie metodą NIRS. Stwierdzono nieznaczne różnice dotyczące zawartości kwasu oleinowego oznaczonej metodą
NIRS i GLC. Powyższy wynik wskazuje, iż metoda NIRS jest metodą efektywną, skuteczną i tanią, co ma istotne
znaczenie w hodowli rzepaku.
186
Genetyka roślin
P239.
Zróżnicowanie wątrobowca Aneura pinguis (L.) Dumort. w Polsce na podstawie
analiz cpDNA.
Witold Wachowiak (1), Alina Bączkiewicz (2), Katarzyna Buczkowska (2, 3), Ewa Chudzińska (2)
(1) Polska Akademia Nauk, Instytut Dendrologii, ul. Parkowa 5, 62– 035 Kórnik.
(2) Uniwersytet im. A. Mickiewicza, Zakład Genetyki, Instytut Biologii Eksperymentalnej, 60-371 Poznań,
ul. Międzychodzka 5, [email protected] (AB).
(3) Uniwersytet im. A. Mickiewicza, Instytut Biologii Eksperymentalnej Pracownia i Zielnik Wątrobowców, ul.
Szamarzewskiego 89/91, 60-568 Poznań.
Aneura pinguis jest gatunkiem kosmopolitycznym, występującym od Arktyki poprzez strefę umiarkowaną do tropikalnej
i spotykana jest w bardzo różnych siedliskach (Schuster, 1992). Tak szerokie rozprzestrzenienie nasuwa przypuszczenie,
że gatunek ten może być geograficznie zróżnicowany na genetycznie odmienne warianty. Ze względu na brak wykrytych
różnic w budowie morfologiczno – anatomicznej, w tym brak różnic w budowie sporofitów (bardzo istotnej cechy
w klasycznej taksonomii mszaków), dotychczas nie znaleziono podstaw do wydzielenia podgatunków w obrębie A.
pinguis (Schuster 1992). Badania izoenzymatyczne wskazują jednak na zróżnicowanie genetyczne w obrębie tego
gatunku, a nawet istnienie gatunków kryptycznych (Szweykowski i Odrzykoski 1990).
Celem pracy było zweryfikowanie powyższej hipotezy poprzez analizę wybranych rejonów DNA. W prezentowanej pracy
przeprowadzono analizę sekwencyjną intronu genu tRNALeu cpDNA u osobników pochodzących z różnych regionów
Polski: z Wielkopolski, Bieszczadów, Tatr i Białowieży. U osobników pochodzących z Wielkopolski w sekwencji
badanego rejonu stwierdzono istnienie kilku substytucji nukleotydowych różniących je od osobników pochodzących
z Bieszczadów i Tatr. U osobników z Białowieży wykryto sekwencje charakterystyczne dla osobników z pozostałych
regionów geograficznych. Wynik ten wspiera hipotezę o istnieniu co najmniej dwóch gatunków kryptycznych. Uzyskane
dane sekwencyjne posłużą do opracowania markerów PCR-RFLP pozwalających na analizę osobników z różnych części
zasięgu gatunku a także analizę materiału zielnikowego.
Badania przeprowadzone w ramach grantu KBN 0216/PO4/2002/22.
Literatura:
1. Schuster, R.M. (1992): The Hepaticae and Anthocerotae of North America, Chicago:Field Museum of Nat. Hist.
p. 937.
Szweykowski, J. i Odrzykoski, I.J. (1990): Chemical differentiation of Aneura pinguis (L.) Dum. (Hepaticae, Aneuraceae)
in Poland and some comments on application of enzymatic markers in bryology. In: Bryophytes Their Chemistry and
Chemical Taxonomy, edited by Zinsmeister, H.D. and Mues, R.Oxford:Clarendon Press. p. 437-448.
P240.
Genetyczna zmienność wątrobowca Aneura pinguis (L.) Dumort.
Alina Bączkiewicz, Katarzyna Buczkowska, Ewa Chudzińska
Zakład Genetyki, Instytut Biologii Eksperymentalnej, Uniwersytet im. A. Mickiewicza, 60-371 Poznań, ul. Międzychodzka 5,
[email protected] (AB).
Aneura pinguis (L.) Dumort. jest taksonem o szerokim holarktycznym zasiegu. W Polsce występuje zarówno na niżu
jak i w górach. Nie jest jednak gatunkiem częstym ze względu na wąską skalę wymagań ekologicznych – rośnie tylko
na nieeutroficznych siedliskach o zasadowym podłożu. Głównym celem pracy była ocena poziomu izoenzymatycznej
zmienności tego gatunku.
Przeanalizowano w sumie 91 populacji, w tym 52 z niżu (Białowieski Park Narodowy, Wielkopolska, Pomorze) oraz 39
z gór (Bieszczady, Tatry). Zbadano 8 układów enzymatycznych, w tym 9 loci: GOT, GDH, DIA, SDH, MDH-1, MDH2, IDH, PGM, PGI. Na podstawie otrzymanych wyników obliczono szereg parametrów genetycznych m. in. częstości
alleli i genotypów, średnią liczbę alleli (A) i genotypów na locus (A/G), całkowite zróżnicowanie genetyczne HT,
genetyczną zmienność w obrębie populacji HS, genetyczną zmienność pomiędzy populacjami DST oraz współczynnik
genetycznego zróżnicowania GST.
Uzyskane wyniki wskazują na duże zróżnicowanie genetyczne badanych populacji. Stwierdzono polimorfizm 96.9 %
loci, średnia liczba alleli na locus wynosiła 3.6 (4.2 na locus polimorficzny). Wewnętrzne zróżnicowanie genetyczne HS
było równe 0.35. Współczynnik zróżnicowania genetycznego GST okazał się wysoki dla 3 loci: GOT, MDH-2 i SDH
osiągając średnią wartość równą 0.262.
Zróżnicowanie geograficzne znalazło odbicie w strukturze genetycznej populacji. Na podstawie odległości genetycznych
187
Genetyka roślin
i innych wyników można powiedzieć, że badane populacje niżowe różnią się od populacji górskich, ważną rolę
w powyższym podziale odegrał genotyp GOT.
Badania przeprowadzone w ramach grantu KBN 0216/PO4/2002/22.
P241.
Ocena zdolności kombinacyjnej form rodzicielskich pszenicy twardej ozimej
(Triticum durum Desf.) na podstawie oceny cech ilościowych mieszańców F4.
Dariusz Zalewski (1), Jaroslaw Bojarcyuk (2)
(1) Katedra Hodowli Roślin i Nasiennictwa, Akademia Rolnicza we Wrocławiu, ul. Cybulskiego 34, 50-205 Wrocław
(2) Hodowla Roślin Smolice sp. z o.o.
Zmiany zachodzące w ostatnich latach w rolnictwie spowodowały wzrost zainteresowania uprawą Triticum durum
w Polsce. Zwiększenia się spożycia makaronu a także wysokie ceny semoliny w połączeniu z problemami zbytu ziarna
pszenicy zwyczajnej zachęcają do zajęcia się hodowlą tego gatunku zwłaszcza, że do Polski corocznie sprowadza się
od 50 do 150 tys. ton ziarna pszenicy twardej. Dla prowadzenia hodowli tego gatunku istotne znaczenie ma poznanie
zdolności kombinacyjnej przeznaczonych do krzyżowania odmian i linii, co w znacznej mierze może ułatwić
uzyskanie korzystnych rekombinacji. Dlatego celem niniejszej pracy było oszacowanie ogólnej i swoistej zdolności
kombinacyjnej użytych do krzyżowań form matecznych i ojcowskich linii pszenicy twardej ozimej (Triticum durum
Desf.). Doświadczenie z uzyskanymi mieszańcami pszenicy twardej założono metodą wzorcową w Hodowli Roślin
Smolice w sezonie wegetacyjnym 2002/2003. Analizę statystyczno-genetyczną przeprowadzono w oparciu o wyniki
oceny sześciu cech: wysokości roślin, masy tysiąca ziaren, zawartości białka ogólnego, szklistości ziarna, liczby opadania
oraz przezimowania w 208 mieszańcach F4 pszenicy twardej ozimej. Mieszańce te uzyskano w wyniku krzyżowania
25 linii z 11 testerami w układzie niekompletnym. W wyniku przeprowadzonej analizy wariancji stwierdzono istotne
zróżnicowanie dla testerów i dla form matecznych dla wszystkich ocenianych cech. Dla użytych w krzyżowaniu linii
i testerów obliczono efekty ogólnej i swoistej zdolności kombinacyjnej. Przeprowadzona analiza pozwoliła wskazać
wartościowe genotypy o dobrej zdolności przekazywania cech. Wyodrębniono też grupę kombinacji krzyżowań dla
wyboru korzystnych genotypów. Uzyskane wyniki wskazują na możliwość uzyskania wartościowych odmian krajowych.
Pewnym problemem może być uzyskanie form dobrze zimujących, jednak stwierdzona znaczna zmienność pod względem
tej cechy oraz wykazane liczne kombinacje o wysokiej zimotrwałości pozwalają oczekiwać postępu również dla tej cechy.
188
Genetyka Mikroorganizmów
Wykład plenarny:
W114. Komórki bakterii jako model w badaniach niestabilności ludzkich sekwencji
mikrosatelitarnych.
Adam Jaworski
Zakład Genetyki Drobnoustrojów Uniwersytetu Łódzkiego, Łódź, Banacha 12/16, tel: (42)-635-44-66
e-mail: [email protected]
Genom człowieka jest bogaty w różne sekwencje powtarzające się, które stanowią około 30 % jego DNA. Badania ostatnich
10 lat dostarczają coraz wiecej dowodów, że niestabilność genetyczna różnego typu sekwencji mikrosatelitarnych jest
przyczyną wielu chorób genetycznych człowieka.
W badaniach molekularnych mechanizmów leżących u podłoża niestabilności trójnukleotydowych sekwencji (TRS–
trinucleotide repeat sequences), a także innych sekwencji powtarzających się zdolnych do tworzenia różnorodnych
struktur przestrzennych, niezwykle przydatnymi modelami są bardzo dobrze zdefiniowane mutanty Escherichia coli
oraz różnorodne wektory plazmidowe i fagowe. W czasie wykładu przedstawi się wyniki prac doświadczalnych
z wykorzystaniem różnych mutantów E. coli oraz wektorów i systemów plazmidowych, które wskazują na rolę
replikacji, transkrypcji, rekombinacji oraz systemów naprawy DNA w generowaniu w obrębie badanych sekwencji
mikrosatelitarnych mutacji dynamicznych, w tym różnorodnych delecji oraz ekspansji. Wyniki omawianych prac
dowodzą, że u podłoża niestabilności badanych ludzkich sekwencji leży ich zdolność do tworzenia w żywej komórce
różnorodnych struktur przestrzennych, które z jednej strony stanowią zawadę dla procesów replikacji i transkrypcji
DNA, z drugiej zaś jako nowego typu „uszkodzenia DNA” są rozpoznawane przez białka i systemy naprawcze. Ponadto,
w miarę wydłużania się tego typu sekwencji w komórce stają się one tarczą dla procesów homologicznej rekombinacji.
Modele molekularnych mechanizmów odpowiedzialnych za niestabilność ludzkich sekwencji mikrosatelitarnych,
zbudowane w opraciu o wyniki prac doświadczalnych z wykorzystaniem komórek bakterii, w wielu przypadkach
zostały już potwierdzone w badaniach z wykorzystaniem komórek drożdzy oraz linii komórkowych.
Mutacje, rekombinacja, replikacja
Komunikaty ustne:
W115. Reguły wyznaczania regionu inicjacji replikacji w genomach bakteryjnych.
Paweł Mackiewicz (1), Jolanta Zakrzewska-Czerwińska (2), Anna Zawilak (2), Mirosław R. Dudek (3),
Stanisław Cebrat (1)
(1) Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wrocławski, ul. Przybyszewskiego 63/77, 51-148 Wrocław
(2) Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej, Polska Akademia Nauk, ul. Weigla 12, 53-114 Wrocław
(3) Instytut Fizyki, Uniwersytet Zielono-Górski, ul. Szafrana 4A, 65-516 Zielona Góra
Region inicjacji replikacji (oriC) jest miejscem, od którego rozpoczyna się replikacja chromosomu bakteryjnego.
Replikacja podlega regulacji na poziomie inicjacji. Do identyfikacji potencjalnego regionu oriC zastosowano trzy
niezależne metody komputerowej analizy sekwencji: badanie asymetrii w składzie nukleotydowym między różnie
replikowanymi nićmi, wyznaczenie rozkładu boksów wiążących inicjatorowe białko DnaA oraz określenie położenia
189
Genetyka mikroorganizmów
genu dnaA, kodującego białko DnaA. Analizy przeprowadzono na 120 zsekwencjonowanych genomach bakteryjnych.
Określono skuteczność zastosowanych metod w identyfikowaniu regionu oriC, a chromosomy poklasyfikowano ze
względu na zgodność tych metod. Analiza asymetrii DNA okazała się najbardziej uniwersalną metodą, jednak większą
skuteczność przewidywania uzyskuje się uwzględniając wyniki wszystkich trzech metod. Trzy zastosowane metody
zgodnie identyfikowały ten sam region jako oriC u wszystkich analizowanych mikroorganizmów należących do Bacilli
i Clostridia, oraz większości przedstawicieli Actinobacteria i g-Proteobacteria. Sygnały związane z regionem inicjacji
replikacji zostały natomiast utracone u bakterii, które prowadzą wewnątrzkomórkowy pasożytniczy lub symbiotyczny
tryb życia, a ich genomy uległy znacznej redukcji. W większości chromosomów stwierdzono, że boksy DnaA pojawiają
się częściej niż wynikałoby to z ich losowego występowania na chromosomie. Ponadto w wielu chromosomach
zaobserwowano obecność więcej niż jednego zgrupowania boksów DnaA w okolicy regionu oriC. Zgrupowania te mogą
uczestniczyć w regulacji procesu replikacji przez miareczkowanie stężenia aktywnego białka DnaA.
W116. Wykorzystanie systemu rekombinacji miejscowo-specyficznej gd do badania roli
białka FIS w organizacji superhelikalnych domen chromosomu bakteryjnego.
Joanna Połeć, Paweł Stączek
Zakład Genetyki Drobnoustrojów, Uniwersytet Łódzki, ul. Banacha 12/16, 93-208 Łódź, e-mail: [email protected]
Obowiązujący obecnie model organizacji chromosomu bakterii z rodziny Enterobacteriaceae zakłada występowanie
wielu (~50) niezależnych pętli, domen superhelikalnych, co powoduje, że zmiany poziomu superskręcenia w jednej
z domen nie zmieniają tej wartości w pozostałych regionach chromosomu.
Spośród grupy białek wewnątrzkomórkowych mogących potencjalnie odgrywać istotną rolę w organizacji przestrzennej
chromosomu bakteryjnego, w literaturze naukowej zwraca się ostatnio uwagę na histonopodobne białko FIS. Dzięki
swoim zdolnościom do wiązania się ze specyficznymi sekwencjami, wprowadzania zakrzywień w obrębie DNA oraz
stabilizacji rozgałęzionych struktur superhelikalnych (badania in vitro), białko to może prawdopodobnie prowadzić
zmiany w architekturze genomu, a tworzenie lokalnych stabilnych struktur DNA mogłoby stanowić barierę dla
swobodnego przemieszczania się fali superskrętów.
Postanowiono zbadać in vivo wpływ białka FIS na organizację domen chromosomu bakteryjnego. Do tego celu
wykorzystano system rekombinacji miejscowo-specyficznej gd (gamma-delta) oraz zastosowano warunki wzrostu,
w których białko FIS występuje w komórkach w podwyższonym stężeniu.
Warunkiem koniecznym dla efektywnego procesu rekombinacji miejscowo-specyficznej gd jest brak barier
ograniczających swobodną dyfuzję fali superskręcenia niezbędną do prawidłowego kontaktu dwóch oddziałujących
ze sobą sekwencji. Badając częstość rekomobinacji w warunkach indukcji białka FIS można obserwować proces
powstawania takich barier definiujących rozmiar domeny superhelikalnej.�
Przy użyciu metody RT-PCR wykazano, iż w zastosowanych warunkach eksperymentalnych, gen fis ulega wzmożonej
ekspresji. Ponadto, wzrost stężenia FIS w komórkach został potwierdzony techniką Western-blot.
Wykazano, że w okresie czasu, w którym dochodzi do wzmożonej ekspresji fis, ma miejsce spadek częstości rekombinacji
miejscowo-specyficznej gd. Może to świadczyć o potencjalnej zdolności białka FIS do zwiększania liczby barier
organizujących domeny chromosomalne.
W117. Wpływ białka CgtA z E. coli na ekspresję genów dnaA, seqA oraz recA.
Celina Kanka, Aleksandra Sikora, Grzegorz Wegrzyn
Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk
Białka podrodziny Obg/GTP1 występują u wszystkich badanych pod tym kątem organizmów od bakterii do człowieka
włącznie. Mimo ich powszechnego występowania, specyficzna rola, jaką odgrywają w procesach zachodzących
w komórce pozostaje w dużej mierze niewyjaśniona. Szczególnie wyraźnie widać to na przykładzie regulacji replikacji
DNA i innych procesów związanych z funkcjami chromosomu bakteryjnego. Dotychczasowe wyniki wskazują,
że CgtA może brać udział w kontroli procesu replikacji chromosomalnego DNA B. subtilis (Kok et al., 1994) oraz
pozachromosomalnych replikonów u E. coli (Ulanowska et al., 2003). Zaburzenia metabolizmu chromosomalnego DNA
obserwowano również podczas nadprodukcji białka CgtAE w komórkach E. coli (Dutkiewicz et al., 2002). Sugerowano
również niezależny od replikacji DNA udział tego białka w rozdziale chromosomu i podziale komórki (Kobayashi
et al., 2001). Wykazano natomiast wpływ mutacji w genie cgtA na wydajność naprawy DNA (Zielke et al., 2003).
Niemniej jednak, nawet w przypadku, gdy dane procesy związane z funkcjami chromosomów bakteryjnych są wyraźnie
zaburzone w warunkach dysfunkcji lub nadekspresji genu cgtA, bardzo niewiele wiadomo jest o mechanizmie regulacji
190
Genetyka mikroorganizmów
tych procesów przez białko CgtA. Teoretycznie może to być regulacja bezpośrednia lub pośrednia, na przykład poprzez
kontrolę translacji mRNA genów, których produkty są zaangażowane w metabolizm DNA. Taką możliwość sugeruje
fakt, że CgtA oddziałuje bezpośrednio z podjednostkami rybosomów. Faktycznie sugerowano, a w dwóch przypadkach
wykazano eksperymentalnie, że białko CgtA może uczestniczyć w regulacji ekspresji różnych genów (Maddock et al.,
1997; Ulanowska et al., 2003; Zielke et al., 2003).
Przy użyciu metody ,,dot-blot RNA”określiliśmy poziom transkryptów genów dnaA, seqA oraz recA w warunkach
inaktywacji genu cgtA. Nie zaobserwowaliśmy zmian w poziomie mRNA genu seqA, natomiast ekspresja genów dnaA
oraz recA była obniżona. W celu sprawdzenia czy produkt genu cgtAE wpływa na ekspresję genów kodujących białka
DnaA (takie sugestie już się pojawiły), SeqA oraz RecA skonstruowaliśmy fuzje transkrypcyjne promotorów tych genów
z genem reporterowym lacZ.
W118. Kofeina i jej pochodne zapobiegają mutagennemu działaniu MPTP (1-metylo-4fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyny).
Katarzyna Ulanowska (1), Jacek Piosik (2), Anna Gwizdek-Wiśniewska (3), Agata Czyż (4), Grzegorz Węgrzyn (1)
(1) Katedra Biologii Molekularnej UG, Kładki 24, 80-822 Gdańsk
(2) Katedra Biologii Molekularnej i Komórkowej; Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii Uniwersytetu Gdańskiego
i Akademii Medycznej w Gdańsku
(3) Katedra Technologii lLeków i Biochemii Politechniki Gdańskiej, Narutowicza 11, 80-952 Gdańsk
(4) Pracownia Biologii Molekularnej afiliowana przy UG, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN
MPTP (1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyna) jest substancją neurotoksyczną, wywołującą u zwierząt
laboratoryjnych objawy charakterystyczne dla choroby Parkinsona. Opublikowane w ostatnich latach badania
wykazały, że kofeina może chronić przed wystąpieniem objawów parkinsonizmu bądź zmniejszyć progresję choroby.
W tym celu przeprowadzono badania na zwierzętach, u których sztucznie wywoływano objawy chorobowe za pomocą
MPTP oraz podawano kofeinę. Badania te wykazały, że kofeina podana wraz z MPTP przeciwdziała między innymi
ubytkowi dopaminy wywoływanego przez tą neurotoksynę. Nie wysunięto jednak jednoznacznej hipotezy wyjaśniającej
mechanizm takiego ochronnego wpływu kofeiny.
Inną właściwością MPTP jest jego mutagenne działanie wobec komórek bakteryjnych. Wykorzystując test mutagenności
na komórkach Vibrio harveyi wykazaliśmy, że kofeina jak i jej pochodne tzn.: pentoksyfilina i teofilina, przeciwdziałają
mutagennemu działaniu MPTP.
Kofeina oraz wiele neurotoksyn (w tym MPTP) są heterocyklicznymi związkami aromatycznymi. Jedną z właściwości
kofeiny jest to, że może tworzyć mieszane kompleksy stakingowe z innymi związkami aromatycznymi, co zostało
opisane chociażby na przykładach bezpośredniego oddziaływania mutagenów akrydynowych (ICR191 i ICR170 )
z kofeiną i innymi metyloksantynami. Dlatego też wysoce prawdopodobnym wydaje się fakt, że jednym z mechanizmów
ochronnego działania kofeiny wobec neurotoksyn jest bezpośrednie oddziaływanie między tymi związkami poprzez
tworzenie hydrofobowych kompleksów stakingowych. Wyniki badań mikrokalorymetrycznych wykazały egzotermiczny
efekt cieplny występujący podczas miareczkowania roztworu wodnego MPTP kofeiną i pentoksyfiliną. Efekt ten może
świadczyć o bezpośredniej interakcji pomiędzy badanymi substancjami
Komunikaty plakatowe:
P242.
Interakcja genu CSM1 kodującego białko, które wpływa na segregację
chromosomów w mejozie I, z elementami kompleksu replikacji DNA w drożdżach.
Monika Wysocka, Joanna Rytka, Anna Kurlandzka
Zakład Genetyki, IBB PAN, Pawińskiego 5A, Warszawa, 02 –106
Rola białka Csm1 została częściowo poznana i postuluje się, że jest ono elementem monopoliny, kompleksu, który wiąże
się z centromerami i odpowiada za orientację kinetochorów. Jego brak powoduje poważne zaburzenia w mejozie.
Delecja genu Csm1 powoduje zwiększoną wrażliwość szczepu haploidalnego na benomyl oraz chlorek manganu oraz
zaburzenia w segregacji chromosomów w czasie mejozy. Wydajność sporulacji diploida csm1delta/csm1delta jest niska
i powstają nietypowe worki.
Analiza interakcji białka Csm1 w systemie dwuhybrydowym wykazała, że większość białek łączących się z Csm1p jest
zaangażowanych w replikację DNA. Poprzez koimmunoprecypitację wykazano, że Csm1p oddziałuje z trzema białkami
191
Genetyka mikroorganizmów
rodziny Mcm2-7 (Mcm3, Mcm5, Mcm7) tworzącymi kompleks prereplikacyjny DNA.
Nasze badania pozwoliły na wysunięcie przypuszczenia, że Csm1 stanowi element kompleksu odpowiedzialnego za
przedmejotyczną rundę replikacji DNA..
P243.
Mutageneza transpozonowa Mycobacterium smegmatis mc2 jako próba
identyfikacji i charakterystyki genów zaangażowanych w biosyntezę ściany
komórkowej.
Arkadiusz Rainczuk (1), Piotr Bielecki (1), Anna Rumijowska-Galewicz (2), Jarosław Dziadek (2)
(1) Zakład Genetyki Drobnoustrojów, Uniwersytet Łódzki
(2) Centrum Biologii Medycznej PAN, Łódź
Jednym z najważniejszych czynników patogenezy Mycobacterium tuberculosis (czynnik etiologiczny gruźlicy) jest
unikatowa ściana komórkowa będąca istotną barierą przepuszczalności zarówno dla związków hydrofobowych jak
i hydrofilowych. Ściana komórkowa prątków warunkuje również ich oporność na szereg potencjalnych leków oraz
uczestniczy w reakcjach pomiędzy drobnoustrojem i systemem immunologicznym gospodarza. Ponadto jednymi
z najskuteczniejszych tuberkulostatyków są inhibitory biosyntezy poszczególnych składników budujących ścianę
komórkową prątków.
Ze względu na powolny wzrost M. tuberculosis i związane z tym trudności metodyczne, najczęściej stosowanym
modelem do badań mykobakterii są saprofityczne prątki M. smegmatis. �
W niniejszej pracy zastosowano system genetyczny oparty o sztuczny transpozon skonstruowany na bazie sekwencji
insercyjnej IS1096 pozwalający na skuteczną i wydajną mutagenezę szczepu M. smegmatis mc2 155. Przy zastosowaniu
metody hybrydyzacji typu Southern wykazano, że element ten wbudowuje się w przypadkowe miejsca (random)
w obrębie chromosomalnego DNA szczepu biorcy. Opracowano również metodę selekcji rekombinowanych prątków
o zwiększonej przenikalności osłon komórkowych. Obecnie prowadzone są prace zmierzające do szczegółowej analizy
genetycznej i fizjologicznej otrzymanych mutantów.
P244.
Izolacja trzech nowych genów drożdży piekarniczych Saccharomyces cerevisiae
komplementujących mutację aci+.
Ewa Boniewska (1), B. Machnicka (2), R. Grochowalska (2), T. M. Lachowicz (2)
(1) Katedra Biologii Molekularnej i Eksperymentalnej, Uniwersytet Opolski
(2) Instytut Biotechnologii, Uniwersytet w Zielonej Górze
Działając na haploidalny szczep S. cerevisiae D273-10B/A1 EMS-em wyizolowano 32 mutanty (aci+), reprezentujące 17
grup komplementacyjnych, zakwaszające podłoże pełne z purpurą bromokrezolową. Analizie molekularnej poddano
mutanta ER 24 reprezentującego III grupę komplementacyjną. Wykonano transformację drożdżowym bankiem
genów zlokalizowanym na wielokopijnym plazmidzie pFL44L, izolowano plazmidy przywracające fenotyp dziki
i sekwencjonowano ich wstawki pochodzące z genomowego DNA drożdży. Wyniki badań wykazały, że trzy, nieznane
dotąd geny, komplementują cechę aci+ u badanego mutanta.
Wyizolowanymi genami, umieszczonymi na plazmidzie wielokopijnym, transformowano przedstawicieli pozostałych
grup komplementacyjnych. Okazało się, że w przypadku niektórych grup komplementacyjnych, po transformacji,
dochodzi do przywrócenia fenotypu dzikiego u badanych mutantów.
P245.
Replikacja plazmidu pochodzącego od profaga Gifsy-1 z Salmonella enterica
serotyp Typhimurium.
Bartosz Słomiński (1), Borys Wróbel (2), Piotr Golec (1), Grzegorz Węgrzyn (1, 2)
(1) Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk
(2) Instytut Oceanologii, Polska Akademia Nauk, ul. Św. Wojciecha 5, 81-347 Gdynia
Profag Gifsy-1 jest jednym z profagów obecnych w większości szczepów Salmonella enterica serotyp Typhimurium.
Jest on jednym z fagów determinujących wirulencję szczepów S. enterica – niesie gen gipA, nizbędny w efektywnej
kolonizacji jelita człowieka przez bakterie. Usunięcie profaga Gifsy-1 (jak również innego profaga obecnego w genomie
S. enterica serotyp Typhimurium, Gifsy-2) prowadzi do istotnego obniżenia wirulencji bakterii. Co więcej, wydaje się,
że przenoszenie cech wirulencji przez bakteriofagi na szczepy, które wcześniej nie były patogenne dla człowieka jest
192
Genetyka mikroorganizmów
podstawowym mechanizmem prowadzącym do ewolucji patogenności wśród bakterii z rodzaju Salmonella. Poznanie
budowy i funkcjonowania tych bakteriofagów ma niewątpliwie ogromne znaczenie w walce z patogennymi szczepami
S. enterica. Bakteriofag Gifsy-1 należy do rodziny fagów lambdoidalnych ze względu na podobieństwo strukturalne
budowy wirionów jak i organizacji i sekwencji materiału genetycznego. Rejon replikacyjny faga Gifsy-1 zawiera
otwarte ramki odczytu, które odpowiadają genom obecnym w rejonie replikacyjnym bakteriofaga λ: cro, cII, O i P.
Po amplifikacji tego rejonu metodą PCR i ligacji z genem determinującym oporność na antybiotyk powstał plazmid
pGifsy-1, który funkcjonuje jako niezależny replikon w komórkach Escherichia coli. W pracy tej dokonano podstawowej
charakterystyki plazmidu pGifsy-1 jak np. określenie liczby kopii plazmidu w komórkach E. coli. Zbadano też zależność
replikacji plazmidu od funkcji białek szoku termicznego z rodziny Hsp 70, zdolność replikacji plazmidu w szczepach
z mutacjami w genach dnaA oraz dnaA i seqA, zmapowano prawdopodobne miejsce origin replikacji. Udowodniono, że
do replikacji plazmidu Gifsy-1 nie jest bezwzględnie wymagana obecność odpowiednika białka P faga λ oraz wykazano
jego toksyczność w komórkach E. coli. Zbadano wpływ aktywacji transkrypcyjnej origin na amplifikację plazmidu
pGifsy-1 oraz wskazano na możliwość istnienia zjawiska dziedziczenia kompleksu replikacyjnego.
P246.
Optymalizacja biologicznego testu wykrywania substancji mutagennych
w środowisku morskim.
Beata Podgórska (1), Ewa Chęć (1), Grzegorz Węgrzyn (1,2)
(1) Instytut Oceanologii PAN, Sopot ul Powstańców Warszawy 55
(2) Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk
Morza i oceany spełniają rolę ostatecznego odbiornika odpadów działalności człowieka. Niektóre z tych substancji
wykazują szczególnie groźne działanie mutagenne. Związki mutagenne są często kancerogenne i powodują powstawanie
nowotworów zarówno u zwierząt jak i człowieka. W środowisku morskim mutageny występują w bardzo niskich
stężeniach i stanowią jedynie frakcję pośród wszystkich związków zanieczyszczających. Stanowi to poważną trudność
w ich wykrywaniu i identyfikacji metodami chemicznymi. Z tego względu szczególnie użyteczne są testy biologiczne.
Najczęściej stosowany jest test Ames’a, w którym do określenia mutagenności badanego materiału wykorzystuje się kilka
szczepów bakterii Salmonella enterica serotyp Typhimurium, ale z uwagi na słabą ich przeżywalność w wodzie morskiej
test ten jest tylko sporadycznie wykorzystywany w badaniach środowiska morskiego. Dlatego do badań tego środowiska
stworzyliśmy nowy biologiczny test mutagenności na bazie genetycznie zmodyfikowanych szczepów bakterii Vibrio
harveyi (mikroorganizm, który naturalnie występuje w morzu). Celem badań jest optymalizacja i adaptacja stworzonego
przez nas biologicznego testu do wykrywania mutagenów w środowisku morskim. Sprawdzamy czy na wynik testu mają
wpływ następujące czynniki: czas inkubacji z mutagenem, skład podłoża, w którym szczepy poddawane są działaniu
substancji mutagennych oraz faza wzrostu bakterii.
Ekspresja genów
Komunikaty ustne:
W119. Promotor p54 genu rpoH jest czynnym promotorem.
Anna Janaszak, Wiktor Majczak, Beata Nadratowska, Grażyna Konopa, Jacek Jasiecki, Alina Taylor
Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański
Odpowiedź szoku termicznego u Escherichia coli kontrolowana jest przez dwa znane regulony: zależny od σ32 i zależny
od σ24. Są jednak geny indukowane przez szok termiczny, kontrolowane przez σ54, produkt genu rpoN. Należy do nich
operon pspA-E oraz gen kodujący małe białko szoku termicznego ibpB. W 1999 roku zauważono obecność sekwencji
consensus promotora pσ54 przed genem rpoH kodującym σ32. Nasze analizy rejonu promotorowego genu rpoH
pozwoliły stwierdzić występowanie potencjalnych sekwencji wiążących aktywatory PspF i NtrC oraz białko zginające
DNA, IHF.
Inicjacja transkrypcji z promotorów pσ54 jest ściśle kontrolowana na etapie topnienia DNA w obrębie sekwencji
193
Genetyka mikroorganizmów
promotora. RNAPσ54 wiąże się z sekwencją promotora tworząc stabilny kompleks zamknięty. Izomeryzacja do
kompleksu otwartego zależna jest od ATP i wymaga oddziaływania polimerazy z aktywatorem związanym do
enhancera. Sekwencje enhancerów położone są w odległości 100 nt lub więcej od promotora, dlatego oddziaływanie to
wymaga wypętlenia DNA ułatwianego przez IHF.
Oczyszczono białka σ54, PspF, ∆HTH PspF i NtrC. W teście opóźniania migracji w żelu wykazano, iż holoenzym
RNAPσ54 rzeczywiście wiąże się w rejonie regulatorowym genu rpoH. Doświadczenia z użyciem mikroskopii
elektronowej potwierdziły ten wynik i wykazały, że holoenzym RNAPσ54 wiąże się w miejscu odpowiadającym
sekwencji consensus promotora pσ54 genu rpoH. W testach opóźniania migracji w żelu wykazano również, że znany
aktywator operonu pspA-E, białko PspF wiąże się w rejonie regulatorowym genu rpoH, podobnie jak NtrC, aktywator
genów związanych m.in. z metabolizmem azotu. Doświadczenie „primer extension” wykazuje, że promotor pσ54 genu
rpoH jest czynnym promotorem, jakkolwiek poziom transkrypcji z tego promotora jest znacznie niższy niż ze znanych
promotorów genu rpoH: P1, P3, P4 i P5. W komórkach ∆rpoN nie stwierdzono transkrypcji z pσ54, a komplementacja
tej mutacji przywraca transkrypcję. Doświadczenia transkrypcji in vitro wskazują, że białko PspF jest aktywatorem tego
promotora. Operon psp aktywowany jest w odpowiedzi na warunki uszkadzające błonę komórkową. Być może więc
w takich warunkach byłaby aktywowana transkrypcja z pσ54 genu rpoH, zapewniając dodatkowy poziom ekspresji tego
genu.
W120. Specyficzność substratowa IbpA i IbpB, małych białek szoku termicznego E. coli.
Joanna Kwiatkowska, Dorota Kuczyńska-Wiśnik, Magdalena Kulma, Ewa Laskowska
Katedra Biochemii UG, ul Kładki 24, 80-822 Gdańsk
Białka IbpA i IbpB E. coli należą do grupy białek szoku termicznego. Oba białka są składnikami agregatów białkowych
powstających w warunkach stresu termicznego w komórkach E. coli. Małe białka szoku termicznego IbpA i IbpB wiążą
zdenaturowane termicznie lub chemicznie polipeptydy, dzięki czemu zapobiegają powstawaniu trwałych agregatów
białkowych. Agregaty te ulegają następnie dysocjacji przy udziale innych białek opiekuńczych.
Dotychczasowe doświadczenia wykazały, że w komórkach, w których białko IbpA jest nieobecne, tylko niewielka część
IbpB (~ 2%) wiąże się ze zagregowanymi polipeptydami, podczas gdy większość IbpB znajduje się we frakcji białek
rozpuszczalnych. Większość IbpA, zarówno w obecności jak i przy braku IbpB, związana jest z agregatami. Ponadto,
w komórkach, w których nadprodukowano IbpA, zaobserwowano agregację prekursora β-laktamazy, kodowanego przez
gen znajdujący się na plazmidzie niosącym gen ibpA. Podobnego efektu nie zaobserwowano w komórkach, w których
nadprodukowano samo IbpB. Wyniki te sugerują, że białka IbpA i IbpB mogą rozpoznawać różne substraty. Możliwe
jest także, że IbpA i IbpB rozpoznają te same polipeptydy, ale w różnym stadium denaturacji: IbpB – rozfałdowane,
ale jeszcze niezagregowane białka, natomiast IbpA –polipeptydy w formie agregatów. W celu identyfikacji naturalnych
substratów wiązanych przez białka IbpA i IbpB w warunkach szoku termicznego zastosowałyśmy dwie metody:
chromatografię powinowactwową i koimmunoprecypitację. Skonstruowano plazmidy nadprodukujące białka fuzyjne:
His-IbpA, His-IbpB oraz IbpA-His, IbpB-His. Obecność znacznika (His)6 na końcu aminowym lub karboksylowym
białek fuzyjnych umożliwiła wiązanie kompleksów IbpA i IbpB z potencjalnymi substratami na kolumnie afinitywnej
z jonami niklu (Ni-TED).
Wstępne wyniki wykazały, że każde z białek, IbpA i IbpB, wiąże przynajmniej kilka różnych substratów. Białka te
zostaną zidentyfikowane metodą spektroskopii masowej. �
W121. Gen regulatorowy rosR w Rhizobium leguminosarum bv. trifolii: identyfikacja
i funkcja w syntezie egzopolisacharydu.
Monika Janczarek, Anna Skorupska
Zakład Mikrobiologii Ogólnej, Uniwersytet im. M. Curie-Skłodowskiej, ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin
Bakterie Rhizobium leguminosarum bv. trifolii syntetyzują znaczne ilości kwaśnego zewnątrzkomórkowego
polisacharydu (EPS), który odgrywa istotną rolę w symbiotycznych oddziaływaniach z gospodarzem roślinnym
–koniczyną. Rizobia produkujące EPS wykazują przewagę konkurencyjną w ryzosferze i zasiedlaniu brodawek
gospodarza. Mutanty R. leg. bv. trifolii niezdolne do syntezy EPS indukują brodawki defektywne w redukcji azotu
atmosferycznego.
Gen rosR wyizolowano z genomowego DNA R. leg. bv. trifolii w reakcji PCR ze starterami homologicznymi do
regionów flankujących gen rosR pokrewnego gatunku Rhizobium etli. Produkt reakcji PCR o wielkości 1,3 kpz.
zawierał otwartą ramkę odczytu kodującą białko o masie 15,7 kDa, które było w 80% identyczne z białkiem RosR R.
194
Genetyka mikroorganizmów
etli, Ros Agrobacterium tumefaciens, RosR Agrobacterium radiobacter i MucR Sinorhizobium meliloti. Wszystkie
wymienione białka należą do rodziny transkrypcyjnych represorów, zawierających w swej sekwencji domeny wiążące
DNA o strukturze palców cynkowych (C2H2). Białko represorowe Ros wiąże się do sekwencji Ros – box o długości
40 pz. zlokalizowanej powyżej promotora, zawierającej 9-nukleotydowe odwrócone powtórzenia. Pomimo wysokiego
podobieństwa sekwencji aminokwasowej, białka Ros poszczególnych gatunków Rhizobium wykazują ogromne różnice
funkcjonalne. Wszystkie te białka wpływają na produkcję egzopolisacharydu, ale mutanty w genie ros R. etli, A.
tumefaciens i A. radiobacter nie tworzą EPS, podczas gdy mutant w homologicznym genie mucR S. meliloti syntetyzuje
alternatywny EPS II. Funkcja białka RosR w R. leg. bv. trifolii jest badana.
Praca finansowana z grantu KBN nr 2 PO4 A 034 26
W122. Genetyczne i molekularne aspekty transportu siarczanu u grzyba Aspergillus
nidulans.
Sebastian Piłsyk, Renata Natorff, Marzena Sieńko, Andrzej Paszewski �
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Pawińskiego 5A, 02-106 Warszawa�
U grzyba nitkowatego Aspergillus nidulans pobieranie siarczanu odbywa się przez permeazę siarczanową, kodowaną
przez gen sB, zlokalizowany na chromosomie VI. Dotychczas otrzymane mutacje w tym genie dają fenotyp braku wzrostu
na siarczanie, jako jedynym źródle siarki. Jednakże brak szczelnego fenotypu uniemożliwiał użycie tych szczepów jako
biorców do klonowania genu sB przez komplementację.
Ostatnio w naszym laboratorium został otrzymany szczelny mutant metS1, posiadający defekt w samym pobieraniu
siarczanu. Szczegółowa analiza molekularna wykazała, że mutacja metS1 dotyczy wyłącznie rearanżacji obszaru
promotora permeazy siarczanowej. Mutant ten stanowił punkt wyjściowy do klonowania genu sB. Sklonowano trzy
różne supresory mutacji metS1, jednak żaden z nich nie koduje genu permeazy siarczanowej.
Pierwszy ze sklonowanych genów okazał się być nieznanym dotąd genem kodującym białko o charakterze transportera
(alternative sulphate transporter – astA), należącego do rodziny permeaz alantoinianowych. Gen astA komplementuje
mutację metS1 zastępując funkcję genu sB. Gen astA podlega regulacji na poziomie transkrypcji przez dostępne źródła
siarki.
Drugim supresorem jest dobrze znany gen metR, kodujący czynnik transkrypcyjny genów metabolizmu siarkowego
(Natorff i in. 2003). Mechanizm supresji mutacji metS1 polega na nadekspresji białka METR, a w konsekwencji,
derepresji nieaktywnego genu sB z pozostałego fragmentu promotora.
Trzeci supresor mutacji metS1 (roboczo nazwany neo), koduje białko transmembranowe, o nieznanej dotychczas funkcji,
specyficzne wyłącznie dla grzybów nitkowatych. Białko NEO posiada słabe motywy receptorów zwiazanych z białkami
G, oraz motywy wiązania ściany komórkowej. Mechanizm supresji przez ten gen nie jest dotychczas poznany.
W123. Nadekspresja genu BDF1 znosi efekty delecji genu YAF9, kodujacego podjednostkę
kompleksu NuA4 w drożdżach S. cerevisiae.
Anna Chełstowska (1), Michele Bianchi (2), Antonella Cavalli (2), Giovanna Constanzo (2),
Dorota Grabowska (1), Eugenia Piccini (2), Laura Frontali (2), Rodolfo Negri (2), Piotr Słonimski (1),
Joanna Rytka (1)
(1) Zakład Genetyki, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawa
(2) Department of Cell and Developmental Biology, University of Rome, Italy
Gen YAF9 koduje podjednostkę konserwowanego ewolucyjnie kompleksu acetylo-transferazy histonu H4 (NuA4).
Mutanty niosące delecję genu YAF9 charakteryzują się plejotropowym fenotypem: między innymi nie rosną na
pożywkach zawierających benomyl, CsCl, MMS, HU i DMSO. Zidentyfikowano wielokopijne supresory znoszące
nadwrażliwość mutantów yaf9-delta na CsCl i DMSO, wśród nich gen BDF1, kodujący białko, które oddziałuje
z acetylowanymi lizynami w N-terminalnych fragmentach histonu H4. Wykazano genetyczną interakcję pomiędzy
genami BDF1 i YAF9, prowadzącą do nieżywotności szczepu niosącego podwójną delecję yaf9-delta bdf1-delta. Poprzez
porównawczą analizę transkryptomu szczepu typu dzikiego, szczepu mutanta yaf9-delta oraz szczepu yaf9-delta
nadeksprymującego gen BDF1, wykazano wpływ genów YAF9 i BDF1 na poziom ekspresji kilku grup genów.
195
Genetyka mikroorganizmów
W124. Apoptotyczna funkcja białka Ydr533p z drożdży Saccharomyces cerevisiae,
homologa białka DJ-1, którego mutacja powoduje chorobę Parkinsona.
Arkadiusz Miciałkiewicz, Adrianna Skoneczna, Marek Skoneczny
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN
Stosując analizę transkryptomu (mikromacierze DNA) poszukiwano genów o podobnych profilach ekspresji
w warunkach indukcji proliferacji peroksysomów (hodowla w obecności kwasu olejowego oraz w niekompetencji
oddechowej). Spośród wyodrębnionej grupy genów zwrócono uwagę na ramkę odczytu YDR533c kodującą białko
o nieznanej funkcji. W wyniku analizy bioinformatycznej stwierdzono, że większość łańcucha polipeptydowego
białka Ydr533p stanowi domena ThiJ/PhpI występująca w kilku rodzinach białek pochodzących z różnych grup
systematycznych, między innymi w prokariotycznych regulatorach transkrypcji typu AraC, proteinazach cysteinowych,
bakteryjnych białkach opiekuńczych oraz w ludzkim białku DJ-1. Mutacja w genie kodującym DJ-1 powoduje
powstanie wczesnej, dziedzicznej formy choroby Parkinsona. W genomie S. cerevisiae występują jeszcze trzy inne geny
charakteryzujące się wysokim stopniem homologii do YDR533c: YPL280w,YOR391c oraz YMR322c. Skonstruowano
kolekcję szczepów drożdżowych z delecjami w obrębie tych genów. Zarówno pojedyncze delecje, jak i delecja
wszystkich czterech ramek odczytu nie przejawia się w żaden łatwo rozpoznawalny sposób. Wykonano szereg testów
w poszukiwaniu fenotypu delecji. Analiza wyników tych testów wskazuje na udział tych białek w odpowiedzi na stres
wysokotemperaturowy. Wydaje się również, że białka te uczestniczą w reakcji komórki na stres oksydacyjny. Ponadto
otrzymane wyniki sugerują udział badanych białek w procesach prowadzących do apoptotycznej śmierci komórki.
Powyższe dane mogą przyczynić się do poznania funkcji ludzkiego homologa Ydr533p –DJ-1 i jego udziału w etiologii
choroby Parkinsona.
Komunikaty plakatowe:
P247.
Geny kodujące reduktazy metylenotetrahydrofolianu u Aspergillus nidulans.
Marzena Sieńko, Natorff R., Hejduk A., Paszewski A.
Zakład Genetyki, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, ul. Pawińskiego 5A, 02-106 Warszawa�
Biosynteza metioniny u Aspergillus nidulans łączy ze sobą dwa szlaki metaboliczne – szlak metabolizmu folianów, który
dostarcza grupy metylowe pochodzące z 5-metylotetrahydrofolianu – CH3-THF i szlak metabolizmu aminokwasów
siarkowych, w którym zachodzi synteza akceptora grup metylowych – homocysteiny. Synchronizacja wydajności
obu tych szlaków jest bardzo istotna i odbywa się za pomocą CH3-THF, który jest aktywatorem gamma-syntazy
cystationinowej (enzymu biorącego udział w biosyntezie homocysteiny). 5-metylotetrahydrofolian powstaje w wyniku
redukcji 5,10-metylenotetrahydrofolianu (CH2-THF) w reakcji katalizowanej przez reduktazę metylenotetrahydrofolia
nu (MTHFR). Z tego powodu enzym ten jest bardzo istotny w utrzymaniu niskiego poziomu homocysteiny w komórce.
U A. nidulans, podobnie jak u Saccharomyces cerevisiae i Schizosaccharomyces pombe wystepują dwa geny kodujące
reduktazę metylenotetrahydrofolianu – metA i metF. Mutanty w genie metA są auksotrofami metioninowymi i ulegają
supresji przez mutacje w genach cysA i cysB (w drodze głównej biosyntezy cysteiny) oraz przez mutacje w genach scon
– negatywnych regulatorach szlaku metabolizmu aminokwasów siarkowych. Efektem fizjologicznym tych mutacji
jest podwyższony poziom homocysteiny w komórce. Gen metF został zidentyfikowany niedawno, po udostępnieniu
genomu A. nidulans przez Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research. Skonstruowano szczep z delecją
w genie metF, który okazał się również auksotrofem metioninowym, wymagającym do wzrostu 4-krotnie większego
stężenia metioniny niż szczep metA. Delecja metF nie ulega supresji przez mutacje w genach cys ani scon. Regulacja
ekspresji obu genów kodujących reduktazy MTHF przebiega podobnie, homocysteina jest aktywatorem transkrypcji
zarówno genu metA jak i metF.
P248.
Charakterystyka aktywatora transkrypcji METR (Aspergillus nidulans).
Renata Natorff, Jerzy Brzywczy , Andrzej Paszewski
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, 02-106 Warszawa, ul. Pawińskiego 5A�
Gen metR Aspergillus nidulans koduje czynnik transkrypcyjny specyficzny dla metabolizmu siarkowego. Białko METR
posiada motyw bZIP odpowiedzialny za wiązanie się z DNA i dimeryzację. W odpowiedzi na podwyższony poziom
196
Genetyka mikroorganizmów
aminokwasów siarkowych (warunki represji) METR jest przypuszczalnie kierowany do degradacji przez kompleks
ligazy ubikwitynowo-białkowej (typu SCF), w skład którego wchodzą białka SCON.
Mutacje w genie metR prowadzące do utraty funkcji są recesywne i epistatyczne wobec mutacji w negatywnie
działających genach scon. Brak aktywnego białka METR powoduje auksotrofię metioninową.�
Obecnie przedstawiamy nowego typu mutanty w genie metR, które zostały wyizolowane jako dominujące supresory
mutacji w genie metB. Okazało się, że trzy niezależne mutacje prowadzą do zamiany aminokwasu fenyloalaniny
w pozycji 48 białka METR na serynę lub leucynę. Mutacje te identyfikują istotne miejsce w strukturze białka, które
może mieć wpływ na jego stabilność.
Mutacja sG8, prowadząca do derepresji szlaku asymilacji siarczanu, została ostatnio zlokalizowana w genie metR.
Mutacja ta prowadzi do zmiany C-końcowej części białka METR na skutek zmiany fazy odczytu od pozycji 239. Mutacja
jest recesywna, a mutanty sG8 nie są supresorami mutacji w genie metB.
W celu zbadania regulacji poziomu białka METR w mutantach A. nidulans postanowiono oczyścić je do homogenności.
Gen metR (kopia cDNA) został umieszczony w bakteryjnym wektorze ekspresyjnym pET30a(+) (Novagen), pod
promotorem polimerazy RNA faga T7. Gen ulega silnej ekspresji w Escherichia coli BL21 (DE3) pLysE (Novagen),
produkując zrekombinowane białko zawierające 6xHisTag na N-końcu. Białko to ulega wydajnemu oczyszczaniu przez
IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography) na złożu TalonBD (Clontech) zawierającym związane jony
kobaltu (Co2+).
P249.
Klonowanie, sekwencjonowanie i ekspresja genu nadA kodującego syntetazę
chinolinową z Pseudomonas fluorescens szczepu 267.
Monika Marek-Kozaczuk (1), Anna Skorupska (1), Jerzy Rogalski (2)
(1) Zakład Mikrobiologii Ogólnej, UMCS, ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin
(2) Zakład Mikrobiologii Ogólnej i Zakład Biochemii, UMCS, ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin
Pseudomonas fluorescens 267 (P. f. 267), należący do grupy bakterii PGPR (plant growth promoting rhizobacteria),
stymuluje wzrost koniczyny w układzie symbiotycznym z Rhizobium leguminosarum bv. trifolii 24.1. Ten promujący
efekt szczepu 267 należy łączyć m.in. ze zdolnością bakterii do efektywnej kolonizacji korzeni roślin oraz syntezą
rozpuszczalnych w wodzie witamin z grupy B, w tym niacyny (B3). Witamina B3 synetyzowana jest w płynnym podłożu
minimalnym M1 w ilości 92 µg/ (Marek-Kozaczuk, Skorupska, Biol. Fertil. Soils, 2001, 33: 146-151).
Dla wykazania roli niacyny w działaniu promującym szczepu 267 na wzrost roślin, przeprowadzono mutagenezę
z użyciem transpozonu Tn5, w której uzyskano mutanta P. fluorescens 1106 auksotroficznego dla witaminy B3.
Zastosowanie technik klonowania oraz sekwencjonowania umożliwiło identyfikację mutacji w szczepie P.f. 1106 w genie
nadA dla syntetazy kwasu chinolinowego oraz sklonowanie genu nadA z dzikiego szczepu P. f. 267.
U wielu mikroorganizmów produkt genu nadA wraz z genami nadB (oksydaza L-asparaginy) i nadC (pirofosforylaza
mononukletodu nikotynowego) uczestniczą w biosyntezie de novo dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD)
oraz NADP, które należą do kluczowych kofaktorów reakcji oksydacji i redukcji w komórce.
Do szczepu dzikiego Pseudomonas fluorescens 267 wprowadzono dodatkowe kopie genu nadA oraz przeprowadzono
test komplementacji w szczepie 1106. Efekt wprowadzenia dodatkowych kopii genu nadA do bakterii zbadano w testach
roślinnych oraz chromatograficznie oznaczono syntezę kwasu chinolinowego, prekursora witaminy B3. �
P250.
Rola białka Faf1 w procesie biogenezy rybosomów w Saccharomyces cerevisiae.
Bożenna Rempoła, Iwona Karkusiewicz, Robert Gromadka, Marcin Grynberg, Joanna Rytka
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN
Nowo odkryty gen Saccharomyces cerevisiae, FAF1, koduje białko niezbędne do życia komórki drożdżowej.
Wykazaliśmy, że białko to zlokalizowane jest w jąderku. Analiza rRNA w szczepie niosącym mutację w genie FAF1
wykazała zmniejszenie ilości 18S rRNA względem szczepu dzikiego. Wynika ono, jak wykazano analizując poziom
prekursorowych form rRNA, z defektu w procesowaniu pre-rRNA na etapie trawień w miejscach A0, A1 i A2.
Trawienia te są niezbędne dla syntezy 18S rRNA i biogenezy podjednostek 40S. Analiza profilu polisomów w szczepie
mutanta potwierdziła obniżenie poziomu podjednostek 40S. Uzyskane wyniki wskazują na zaangażowanie białka Faf1
w biogenezę rybosomów.
197
Genetyka mikroorganizmów
P251.
Rola małych białek szoku termicznego IbpA i IbpB w powstawaniu i przetwarzaniu
ciał inkluzyjnych.
Dorota Kuczyńska-Wiśnik, Ewa Laskowska
Katedra Biochemii, Uniwersytet Gdański, Kładki 24, 80-822 Gdańsk
Najczęściej stosowanym sposobem uzyskiwania białek w celach badawczych i przemysłowych jest ich nadprodukcja
w komórkach Escherichia coli i oczyszczanie powstających ciał inkluzyjnych (IB). Izolowane z lizatów bakteryjnych IB
zawierają głównie nadprodukowane białko, które odzyskuje się w aktywnej formie po rozpuszczeniu ciał inkluzyjnych
i refałdowaniu. Na wydajność tych procesów decydujący wpływ mają obecne w IB zanieczyszczenia –współagregujące
endogenne białka E. coli. Białkami, które stanowić mogą nawet do 10% zanieczyszczeń IB są małe białka szoku
termicznego, IbpA i IbpB.
Celem naszej pracy było sprawdzenie, jak brak cytoplazmatycznych białek IbpAB (szczep deltaibpAB) wpływa na
powstawanie i właściwości ciał inkluzyjnych. W doświadczeniach użyliśmy ciała inkluzyjne tworzone przez: białko
fuzyjne cro-beta –galaktozydazę, białko fuzyjne OmpA-beta-laktamazę, beta-laktamazę pozbawioną sekwencji
sygnałowej, niezmutowane białko beta-laktamazę oraz rHtrA1 –szczurzy homolog bakteryjnej proteazy HtrA.
Stosując standardowe metody oczyszczania IB wykazaliśmy, że formowanie wszystkich typów ciał inkluzyjnych jest tak
samo wydajne w komórkach mutanta deltaibpAB jak i w szczepie dzikim. W warunkach przedłużającego się stresu przy
braku IbpAB IB są bardziej stabilne.
W komórkach pozbawionych IbpAB zaobserwowaliśmy podwyższony poziom białek szoku termicznego DnaK i DnaJ
w warunkach powstawania ciał inkluzyjnych, w odniesieniu do szczepu niezmutowanego.
Cytoplazmatyczne IB pozbawione białek IbpAB charakteryzowały się wyższą rozpuszczalnością w najczęściej
stosowanych denaturantach: chlorowodorku guanidyny i moczniku, co może świadczyć o ich rozluźnionej strukturze.
Brak białek IbpA i IbpB nie wpływał natomiast na rozpuszczalność periplazmatycznych IB.
Przy braku białek IbpAB w IB znajdowało się mniej aktywnych białek. Potwierdza to teorię, wg. której sHsps wiążą
nienatywne białka i zapobiegają ich nieodwracalnej agregacji.
P252.
Odporność odmian i linii pszenic jarych na fuzariozę kłosa i mączniaka
prawdziwego.
Halina Wiśniewska (1), Krzysztof Kowalczyk (2)
(1) Instytut Genetyki Roślin PAN, ul. Strzeszyńska 34, POZNAŃ
(2) Instytut Genetyki i Hodowli Roślin, Akademia Rolnicza, ul. Akademicka 15, LUBLIN
W latach 1998-2002 badano odporność na fuzariozę kłosa i mączniaka prawdziwego w liniach i odmianach pszenicy
jarej. Analizowano18 linii pochodzących ze szkółki odpornościowej w CIMMYT– Meksyk i 12 odmian polskich:
Alkora, Banti, Eta, Hera, Henika, Igna, Ismena, Jasna, Olimpia, Omega, Santa i Sigma. Wszystkie linie i odmiany
inokulowano punktowo silnie patogenicznym izolatem Fusarium culmorum KF 846. Odmianami kontrolnymi były
odporne odmiany Frontana i Sumai 3. Porażenie linii i odmian pszenicy przez mączniaka prawdziwego określono
w doświadczeniu polowym w warunkach naturalnej infekcji. Ocenę porażenia przeprowadzono w skali 9-stopniowej.
W celu określenia genów odporności na mączniaka prawdziwego (Pm) w odmianach polskich wykorzystano test
inokulacyjny. Zastosowano 11 różnicujących izolatów Blumeria graminis f. sp. tritici otrzymanych od dr S.L.K. Hsama
z Uniwersytetu w Monachium. Identyfikację genów Pm wykonano przez porównanie reakcji badanych odmian z reakcją
linii izogenicznych zawierających określone geny Pm.
W pięcioletnich badaniach stwierdzono, że procent ziarniaków z wyraźnymi objawami fuzariozy (FDK) w liniach
pszenicy jarej otrzymanych z CIMMYT wynosił 16.7% (wartość średnia z pięciu lat badań) i był niższy niż w polskich
odmianach 28.31%. U odmian kontrolnych wynosił odpowiednio 20% (odmiana Frontana ) i 12% odmiana Sumai 3.
W trzech iniach IPG-SW-14, IPG-SW-16 i IPG-SW-30 stwierdzono niską podatność na fuzariozę kłosa – podobną do
odmiany Sumai 3.
Porażenie przez mączniaka prawdziwego badanych linii i odmian wahało się na przestrzeni 5 lat od 0-5. Na podstawie
przeprowadzonych badań wykazano, że odmiany polskie były mniej porażone niż linie meksykańskie. Spośród odmian
polskich najmniej były porażone Eta, Henika, Ismena, Jasna i Olimpia, zaś najbardziej Alkora, Igna i Omega. Spośród
wszystkich badanych form linia IPG-SW-14 charakteryzowała się najmniejszą podatnością fusariozę kłosa i mączniaka
prawdziwego podczas 5-letnich badań.
Za pomocą testu inokulacyjnego wykazano, że odmiana Alkora zawiera gen Pm3d, a Henika gen Pm5. Obecność genu
Pm3d stwierdzono również w odmianie Jasna, a w kombinacji z nieznanym genem lub genami odporności w odmianie
198
Genetyka mikroorganizmów
Eta. W odmianach Santa i Torka postulowano obecność genu Pm5 w kombinacji z innym lub innymi genami odporności
na mączniaka prawdziwego. Cztery odmiany Banti, Ismena, Olimpia i Sigma były odporne na 11 różnicujących izolatów
Blumeria graminis f. sp. tritici.
P253.
Białka zaangażowane w terminację translacji mitochondrialnej u drożdży
Saccharomyces cerevisiae.
Jan Kutner, Magda Boguta
Zakład Genetyki, Instytut Biofizyki i Biochemii PAN
Gen MRF1 koduje czynnik terminacji translacji mitochondrialnej u drożdży S. cerevisiae. W naszej pracowni
scharakteryzowano szereg mutacji mrf1 typu zmiany sensu, które powodowały zwiększony poziom błędności translacji
mitochondrialnej. Najsilniejszy efekt fenotypowy obserwowano dla mutacji mrf1-13 i mrf1-780, które powodowały
znaczne zahamowanie translacji, obniżenie ekspresji białek mitochondrialnych, w rezultacie, niekompetencję
oddechową (gly-). Natomiast całkowita delecja chromosomalnego genu MRF1 prowadzi do nieodwracalnej degradacji
mt DNA.
Celem obecnych badań było sprawdzenie czy zmiana poziomu ekspresji genu MRF1 wpływa na wzrost komórki
w obecności niefermentowalnych źródeł węgla oraz znalezienie innych białek lub procesów komórkowych, które
wpływają na funkcję białka mRF1.
Poziom ekspresji MRF1 regulowano przy użyciu systemu tetracyklinowego (E. Gari i in., (1997) Yeast vol. 13: 837-848)
i kontrolowano przy użyciu specyficznych przeciwciał anty-mRF1. Stwierdzono, że podwyższona ekspresja MRF1,
obserwowana w nieobecności tetracykliny osłabia wzrost komórek w pożywce zawierającej niefermentowalne źródła
węgla. W obecności tetracykliny, wbrew przewidywaniom, nie dochodziło do obniżenia ekspresji MRF1 poniżej
poziomu obserwowanego w szczepie dzikim. Zaobserwowano jednak, że drożdże z podwyższona ekspresją rosły słabiej
na niefermentowalnym źródle węgla.
Szczep z mutacją mrf1-780 transformowano wielokopijnym bankiem genów S. cerevisiae i znaleziono transformanta
gly+, który zawierał we wstawce gen RSM10. Fenotyp był słaby i niepowtarzalny. Białko Rsm10 jest homologiem
bakteryjnego rybosomalnego białka Rps10 i wykazuje podobieństwo w strukturze do domeny mRF1 odpowiedzialnej
za rozpoznawanie kodonu stop. Wprowadzenie wielokopijnego banku drożdżowego do szczepu z mutacja mrf1-780
zawierajacego plazmid niosący na wstawce gen RSM10 pozwoli na znalezienie genu odpowiedzialnego za wzmocnienie
fenotypu oraz na potwierdzenie hipotezy o roli Rsm10 w mitochondrialnej terminacji translacji.
P254.
Klonowanie supresorów delecji genu MAF1 u drożdży Saccharomyces cerevisiae.
Małgorzata Cieśla, Magdalena Boguta
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Zakład Genetyki, ul. Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa�
Maf1 jest negatywnym regulatorem RNA polimerazy III (pol III) u drożdży S. cerevisiae. Komórki mutantów maf1
akumulują tRNA; jest to wynik wzrostu aktywności transkrypcji pol III. Wykazano, że Maf1 oddziałuje z elementami
pol III.
Poszukiwano mutacji, które kompensują brak białka Maf1 w komórce. Wyizolowano ok. 300 spontanicznych
supresorów, które odwracają termowrażliwy (ts) fenotyp delecji genu MAF1. Skoncentrowano się na identyfikacji genu
supresorowego reprezentowanego przez mutację R119. Jest to pojedyncza mutacja chromosomalna i wykazuje własny
fenotyp zimnowrażliwy (cs). Szczep R119 transformowano bankiem genów drożdżowych i poszukiwano fragmentów,
które komplementują fenotyp cs. Wyizolowano genomowy fragment zawierający gen RPB10 (jeden raz) oraz fragment
zawierający gen RBS1 (cztery razy). Gen RPB10 koduje wspólną podjednostkę dla trzech polimeraz RNA zaś RBS1
koduje białko o bliżej nieokreślonej funkcji, wiążące się do RNA.
Analiza molekularna mutanta R119 ujawniła obniżony poziom tRNA w porównaniu do kontroli. Odtworzenie
kontrolnej ilości tRNA obserwowano w obecności plazmidu centromerycznego z genem RPB10, ale również
w obecności wielokopijnego plazmidu z genem RBS1. Obniżony poziom tRNA wskazuje na istotną rolę mutacji R119
w procesie transkrypcji RNA z udziałem pol III.
Mutacja R119 mapuje się w rejonie RPB10 i ma prawdopodobnie charakter regulatorowy. Analiza Northern blot
wykazała obniżony poziom mRNA RPB10 w mutancie R119. Obecność plazmidu z genem RBS1 w komórkach R119
powodowała zwiększenie poziomu mRNA RPB10.
Przedstawione wyniki wskazują na mechanizm kompensacji braku represora Maf1 poprzez mutację regulatorową R119
prowadzącą prawdopodobnie do obniżenia aktywności pol III. Istotną rolę w tym mechanizmie odgrywa produkt genu
RBS1.
199
Genetyka mikroorganizmów
P255.
Białko GFP jako bioindykator komórkowej reakcji na fenol.
Marzena Matejczyk (1), Stanisław Józef Rosochacki (1, 2)
(1) Katedra Biologii Sanitarnej i Biotechnologii, Politechnika Białostocka, ul. Wiejska 45 E
(2) Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt, PAN, Jastrzębiec k/Warszawy
Fenol jest popularnym związkiem chemicznym wykorzystywanym w różnych gałęziach przemysłu, ponadto to produkt
naturalnych procesów zachodzących w ekosystemach, takich jak rozkład szczątków roślinnych i zwierzęcych. Ze
względu na notowany w ostatnich latach wzrost zanieczyszczenia rzek fenolem istnieje ogromna potrzeba opracowania
tanich, szybkich metod wykrywania tego rodzaju związków w wodach.
Ogromne możliwości w tej dziedzinie stwarza technologia genów reporterowych, szczególnie genów, których
produktem ekspresji jest światło, do których należy pochodzący z meduzy Aequorea victoria gen gfp (green fluorescent
protein), którego produktem ekspresji jest świecące w świetle UV białko GFP. Okazuje się, że dynamika emitowanej
przez zmodyfikowane genetycznie bakterie fluorescencji jest bardzo użytecznym narzędziem w analizie ekspresji genów
u Procaryota po ekspozycji na określone związki chemiczne, w tym i fenol. Stąd w badaniach własnych postanowiono
przeanalizować w oparciu o dynamikę emitowanej fluorescencji reakcję szczepu E. coli MM294 z genem gfp po
ekspozycji na fenol.
Zmodyfikowane genetycznie komórki E. coli MM294 z genem gfp poddano godzinnej ekspozycji na fenol w stężeniu
0,01 g/l, w buforze PBS. Następnie przy użyciu spektrofluorymetru fluorescencyjnego (Hitachi, Japan, F-2500) mierzono
dynamikę emitowanej przez bakterie fluorescencji, wartość intensywności fluorescencji wyrażano jako wielkość SFI=
IF(395, 509)/OD(600), gdzie SFI-specyficzna intensywność fluorescencji, IF intensywność fluorescencji odczytana ze
spektrofluorymetru, OD– optyczna gęstość hodowli bakteryjnej. �
Ekspozycja E. coli MM294 z genem gfp na fenol w stężeniu 0,01 g/l wywołała pojawienie się istotnych statystycznie
(P?0,05) różnic w emisji fluorescencji między 0 a 30 minutą analizy. Po godzinnym potraktowaniu hodowli bakteryjnej
fenolem w tym stężeniu zarejestrowano początkowo w czasie 0 oraz 30 minucie stymulację ekspresji genu gfp w stosunku
do kontroli, odpowiednio o 1,3 i 0,43 %, po czym od 60 minuty zauważono inhibicję ekspresji genu o 2,2 % w 60 minucie
do 5, 20 % w 150 minucie i 1,10 % w 240 minucie analizy.
Wydaje się, że w przedstawionych warunkach analizy na poziom ekspresji genu gfp w E. coli MM294 mają wpływ
jednocześnie dwa mechanizmy: ograniczenie podaży substancji odżywczych oraz dodatkowe oddziaływanie fenolu,
co wskazuje na fakt, że dynamika fluorescencji białka GFP w E. coli MM294 jest użytecznym narzędziem w analizie
ekspresji genów.
P256.
Ligaza ubikwitynowo-białkowa Rsp5 S. cerevisiae posiada funkcjonalną sekwencję
NLS kierującą ją do jądra.
Piotr Chołbiński, Małgorzata Lewandowska, Marta Kwapisz, Teresa Żołądek
Zakład Genetyki, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa�
Ligaza ubikwitynowo-białkowa Rsp5 reguluje szereg procesów komórkowych. Mutanty rsp5 wykazują między innymi
zaburzenia eksportu tRNA z jądra do cytoplazmy (Neumann i wsp., EMBO Rep. 2003, 4, 1156). W celu bliższego
poznania funkcji Rsp5p zbadano interakcje genetyczne pomiędzy genem RSP5 a genami, LOS1, CCA1 i TEF2,
kodującymi białka zaangażowane w eksport tRNA. LOS1 koduje eksportynę tRNA, CCA1 koduje nukleotydylotransferazę tRNA, a TEF2 koduje czynnik elongacji translacji eEF-1A. Stwierdzono syntetyczny defekt wzrostu
mutantów podwójnych rsp5-13 tef2∆; i rsp5-13 cca1-1 w porównaniu ze wzrostem mutantów pojedynczych. Ponadto
TEF2 okazał się wielokopijnym supresorem fenotypu termowrażliwości mutanta rsp5-13. Nie zaobserwowano jednakże
interakcji pomiędzy genami RSP5 i LOS1. W toku badań nad Rsp5p zidentyfikowano również potencjalną sekwencję
NLS (ang.: nuclear localization sequence) 477-PEDLKKRL-454 i metodą immunofluorescencji wykazano, że jest ona
zdolna do kierowania białka reporterowego, β-galaktozydazy, do jądra. Dotychczas nie wykazano jednakże jądrowej
lokalizacji białka Rsp5. Zatem nie jest jasne czy Rsp5p oddziałuje na transport tRNA z cytoplazmy jako element kaskady
sygnałowej, czy też krąży pomiędzy jądrem a cytoplazmą i bezpośrednio reguluje eksport tRNA. Metodą mutagenezy
PCR wprowadzono do genu RSP5 mutacje powodujące podstawienie asparaginy w miejsce aminokwasów zasadowych
sekwencji NLS, co w konsekwencji doprowadziło do unieczynnienia tego regionu. Dalsze badania będą kontynuowane
w kierunku poznania konsekwencji tych mutacji dla funkcjonowania i lokalizacji Rsp5p, a uzyskane wyniki zostaną
zaprezentowane.
200
Genetyka mikroorganizmów
P257.
Udział terminacji translacji i prionu [PSI+] w regulacji ekspresji genu COX5b
u drożdży Saccharomyces cerevisiae.
Agnieszka Jankowska, Joanna Towpik, Magdalena Boguta
Instytut Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk, ul. Pawińskiego 5A, 02-106 Warszawa�
U Saccharomyces cerevisiae geny COX5a i COX5b kodują dwie alternatywne wersje podjednostki kompleksu oksydazy
cytochromowej. Ekspresja genu COX5b jest negatywnie regulowana przez tlen i hem za pośrednictwem czynnika
transkrypcyjnego Ord1. Gen ORD1 posiada dodatkową ramkę odczytu bezpośrednio za kodonem stop. Błędne
odczytanie kodonu stop jako kodon sensowny prowadziłoby do syntezy przedłużonej formy białka Ord1.
Celem doświadczeń jest zbadanie ewentualnej zależności ekspresji genu COX5b od obecności prionu [PSI+], który
wpływa na terminację translacji. W układzie in vitro wykazano, że w ekstraktach pochodzących ze szczepów [PSI+]
i [psi-] wydajność odczytu kodonu stop w genie ORD1 wynosi odpowiednio 11% i 0,9%. Wykazanie różnicy w ekspresji
genu COX5b w tych szczepach świadczyłoby o jej regulacji przez prion [PSI+] za pośrednictwem Ord1.
Wykonano analizę Nothern blot RNA wyizolowanego z płynnych kultur szczepów [PSI+] i [psi-]. Nie stwierdzono
różnicy w poziomie ekspresji genu COX5b w obu szczepach. Analizowano także wpływ [PSI+] na fenotyp wzrostu
mutantów deltacox5a. Wiadomo, że zmutowany szczep deltacox5a z pojedynczą kopią genu COX5b wykazuje słaby
wzrost na pożywkach zawierających niefermentowalne źródła węgla. Wprowadzenie genu COX5b na wysokokopijnym
plazmidzie zwiększa poziom oddychania od 12% do 69% w porównaniu do szczepu dzikiego. Gen COX5b namnożono
PCR z genomowego DNA, sklonowano na wysokokopijnym plazmidzie i wtransformowano do skonstruowanych
uprzednio szczepów deltacox5a [PSI+] i deltacox5a [psi-]. Wyselekcjonowane transformanty analizowano na pożywkach
z niefermentowalnymi źródłami węgla.
P258.
Identyfikacja promotorów genów hemolizyn clyA i clyC Campylobacter jejuni.
Marta Jaśkowska, Agnieszka Sałamaszyńska, Danuta Klimuszko
Zakład Bakteriologii i Biologii Molekularnej, Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej
SGGW w Warszawie
Celem pracy jest identyfikacja promotorów genów kodujących białka o charakterze hemolizyn Campylobacter jejuni
oraz określenie ich aktywności. Campylobacter jejuni jest czołowym przedstawicielem grupy patogenów wywołujących
infekcje przewodu pokarmowego. Uważany jest za główna przyczynę ostrego, bakteryjnego zapalenia jelit i żołądka
u ludzi na całym świecie powodowanego przez żywność zakażoną C.jejuni. W krajach rozwiniętych przyczynił się do
większej liczby nieżytów układu pokarmowego niż np. Salmonella. Toksyny z grupy hemolizyn, obok rzęsek, adhezyn
oraz toksyn CDT należą do istotnych czynników wirulencji tych bakterii. Wiadomo, że sekwencja promotorowa
Campylobacter jejuni ma niespotykany do tej pory układ. Region 10 podobny jest do regionu rozpoznawanego przez
czynnik 70 E. coli, ale region –16 przypomina już region typowy dla bakterii grammdodatnich, a region –35 jest
zupełnie różny od dotychczas poznanych. Sklonowano dwa geny C.jejuni clyC i clyA (Cj0183 i Cj0588) kodujące białka
posiadające domeny hemolityczne. Fragmenty położone powyżej genu strukturalnego, zawierające prawdopodobne
miejsca promotorowe, przeklonowano do wektorów wahadłowych pMW10 i pWM1001 posiadających geny
reporterowe bez promotorów, odpowiednio lacZ i gfp. Uzyskane konstrukty wprowadzono do szczepu E.coli DH5a
metodą transformacji i do dzikich szczepów Campylobacter jejuni za pomocą elektroporacji. Przeprowadzono test na
aktywność �-galaktozydazy pozwalający stwierdzić obecność i określić siłę promotora. W przeklonowanym fragmencie
genu clyA znajduje się promotor. Wykazano także różnice w aktywności tego promotora w E.coli i C.jejuni. Oznaczenie
aktywności promotora genu clyC stanowi kolejny etap naszych badań.
P259.
DraD mutants for determination of the functional regions.
Katarzyna Bury, Beata Zalewska, Rafał Piątek, Józef Kur
Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Mikrobiologii, ul. Narutowicza 11/12 80-952 Gdańsk
Pathogenic Escherichia coli strains cause a wide variety of infectious diseases by colonizing and infecting different
tissues. Regardless of the infection place, the establishment of the bacterium in the host requires the production of
bacterial adhesins and invasins that prevent clearance from eukaryotic host by mediating a strong interaction between
the bacteria and epithelial cells. The DraD invasin is encoded by a dra operon of uropathogenic E. coli strains causing
urinary tract infections. The dra gene cluster was shown to contain six open reading frames (ORF): draA, draB, draC,
201
Genetyka mikroorganizmów
draD, draP i draE. Very little is known about the DraD invasin, which is 100% identical to the AfaD invasin that was
proposed to support the uptake of adherent bacteria into HeLa cells. The aim of the presented study was a determination
of the functional region of the DraD protein responsible for adhesion and invasion process. Several DraD mutants
were prepared by changing the sequence of draD gene using PCR based site-directed mutagenesis (selected amino
acid residues were replaced for alanine residue: E2A; R25A; C28A; R29A; H36A; N40A; Q90A; D94A; D98A; Q101A;
E107A; C116A). pInvDsyg-C-His plasmid (pET30LIC plasmid with a cloned draD gene) was used as a template in PCR
reaction. The resulted draD mutants were sequenced. The obtained plasmids were used for expression of the proteins
with polihistidine domain at the C-terminus in E. coli BL21(DE3) strain. After expression the proteins were isolated
from a periplasm and purified by metal-affinity chromatography on a Ni2+ – IDA – Sepharose column. A detection of
the proteins in E. coli lysates, periplasm and elution fraction after purification was made by Western blotting analysis
with policlonal antibodies against the DraD invasin and monoclonal antibodies against the polihistidine domain.
P260.
Analiza genetyczna i funkcjonalna regionu genomu Listeria monocytogenes EGD,
determinującego aktywność autilizyny.
Magdalena Popowska
Uniwersytet Warszawski, Instytut Mikrobiologii, Zakład Fizjologii Bakterii, 02-096 Warszawa, ul.Miecznikowa 1
Gramdodatnia pałeczka Listeria monocytogenes jest fakultatywnym, wewnątrzkomórkowym patogenem ludzi
i zwierząt. Zakażenie jest przeważnie związane ze spożyciem żywności zanieczyszczonej tymi bakteriami, dlatego
też listeriozę zaliczono do grupy chorób przenoszonych drogą pokarmową. Najczęstszymi postaciami tej choroby są:
zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i mózgu, bakteriemia oraz zakażenia okołoporodowe.
Patogenność L. monocytogenes jest uwarunkowana głównie przez następujące czynniki wirulencji: listeriolizynę O,
internaliny A i B, białko CwhA, białko ActA, dwie fosfolipazy C oraz metaloproteazę. Na uwagę zasługuje fakt, że L.
monocytogenes koduje 133 białka powierzchniowe, w tym aż 41 białek z motywem LPXTG –związanych kowalencyjnie
z peptydoglikanem, co wyróżnia ją spośród innych bakterii gramdodatnich. Wśród tej klasy białek znajdują zarówno
czynniki wirulencji jak i hydrolazy peptydoglikanu. Do tej pory, u tej bakterii scharakteryzowano pięć białek
o właściwościach autolizyn: CwhA, P45, Ami, MurA i Auto. Analiza genomu L. monocytogenes wykazała obecność 11
genów, kodujących białka z charakterystycznymi domenami dla tej grupy enzymów.
W prezentowanej pracy otrzymano oraz scharakteryzowano 3 mutanty insercyjne, odpowiednio w genach lmo0325,
lmo0326 i lmo0327. Analiza genetyczna badanych genów oraz charakterystyka fizjologiczna mutantów, pozwoliły
zidentyfikować nowe białko powierzchniowe o właściwościach hydrolazy peptydoglikanu – Lmo0327, posiadające
charakterystyczną domenę dla internalin: LRR oraz motyw LPXTG. Wyniki przeprowadzonych badań wskazują na
udział tego białka w takich procesach jak: wzrost i/lub podział komórki a zwłaszcza etap oddzielania się komórek
potomnych po podziale, autoliza i obrót metaboliczny mureiny. Zidentyfikowano także dwa regulatory transkrypcji
Lmo0325 i Lmo0326 pozytywnie wpływające na ekspresję bądź aktywność białka Lmo0327, którego gen położony jest
poniżej genów lmo0325 i lmo0326.
P261.
Regulacja ekspresji genów metabolizmu folianów u Aspergillus nidulans.
Irmina Lewandowska (1), Zbigniew Zieliński (2), Andrzej Paszewski (1)
(1) Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Zakład Genetyki, Pawińskiego 5A, 02-106 Warszawa�
(2) Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN, Zakład Biochemii Komórki, Pasteura 3, 02-093 Warszawa
Metabolizmy: folianów i aminokwasów siarkowych łączą sie ze sobą poprzez dostarczanie przez te pierwsze grupy
metylowej, wykorzystywanej w syntezie metioniny. Istotne są zatem powiązania systemów regulujących ekspresję
genów, odpowiedzialnych za te dwie domeny metaboliczne. Ustaliliśmy, że gen metH, kodujacy syntazę metioninową,
jest silnie indukowany przez homocysteinę i reprymowany przez cholinę (Biochem J. 2003, 376(Pt2); 517-24). Obecnie
przedstawiamy dane, pokazujące regulację ekspresji, na poziomie transkrypcji, trzech innych genów kodujących enzymy
folianowe. Zależnie od warunków hodowli, gen SHMT (hydroksymetylotransferaza serynowa) ulega 3-4-krotnej
indukcji przez serynę, FPGS (syntetaza folilopoli-gamma-glutaminianów) 2-krotnej indukcji przez homocysteinę, co
wskazuje na bezpośrednią regulację jego ekspresji przez poziom aminokwasów siarkowych. Trzeci badany gen C1-THFS
(syntaza grup C1 tetrahydrofolianu) nie ulega regulacji w badanych warunkach. Otrzymane wyniki pokazują, że systemy
regulujące metabolizmy: folianowy i siarkowy mogą mieć wspólne elementy, lecz nie całkowicie pokrywają się.
202
Genetyka mikroorganizmów
P262.
Zdolność do odpowiedzi na stres środowiskowy i energetyczny jest niezbędna do
rozwoju biofilmu Bacillus subtilis.
Krzysztofa Nagórska (1), Arletta Nowodworska (2), Daria Julkowska (1), Michał Obuchowski (2)
(1)Uniwersytet Gdański, Katedra Biologii Molekularnej, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk
(2) Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii UG-AMG, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk
Bakterie Bacillus subtilis zamieszkujące naturalnie powierzchniowe warstwy gleby są narażone na wiele różnych
czynników stresowych takich jak brak lub nadmiar wody, wahania temperatury, pH czy zawartości tlenu. W wyniku
adaptacji do tak różnorodnego środowiska bakterie wykształciły bardzo skomplikowany mechanizm regulacji
odpowiedzi na stres, która to umożliwia czasowe dostosowanie swojego metabolizmu do aktualnie panujących
warunków. Aktywacja odpowiedzi na stres może zachodzić dwoma drogami: w odpowiedzi na stres środowiskowy
lub w odpowiedzi na stres energetyczny. Podczas wzrostu w warunkach laboratoryjnych regulon odpowiedzi na stres
wydaje się być zbędny, gdyż bakterie jego pozbawione nie wykazują żadnych efektów fenotypowych w klasycznej
hodowli płynnej. Inaczej jednak jest w momencie, gdy bakterie rozpoczynają tworzenie biofilmu –złożonej struktury
spotykanej powszechnie w środowisku naturalnym.
Prezentowane wyniki wskazują, iż zdolność do odpowiedzi na stres jest niezbędna do utworzenia prawidłowego
biofilmu. Co więcej, potrzebne są obie drogi aktywacji odpowiedzi na stres muszą być sprawne komórka bakteryjna była
w stanie wziąć udział w tworzeniu kolonii nazywanej biofilmem. �
P263.
Lokalizacja i funkcja białkowej fosfatazy PrpE w komórkach Bacillus subtilis.
Krzysztof Hinc (1), Elżbieta Ratajczak (2), Adam Iwanicki (1), Michał Obuchowski (1)
(1) Uniwersytet Gdański, Katedra Biologii Molekularnej, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk
(2) Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii UG-AMG, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk
W ostatnich dwóch dekadach fosforylacja białek została określona jako jeden z najważniejszych sposobów regulacji
aktywności enzymów w organizmach eukariotycznych.
Przeprowadzona w naszym laboratorium analiza biochemiczna wykazała, że produkt genu prpE wykazuje trzy
aktywności: fosfatazy białkowej, hydrolazy Ap4A i ATPazy. Wszystkie wyżej wymienione aktywności są zależne od
dwuwartościowych jonów niklu. Dokładniejsze badania pozwoliły stwierdzić, iż badane białko jest w stanie usuwać
grupy fosforanowe z reszt fosfotyrozyny, ale nie z fosfoseryny i fosfotreoniny. Było to pewnym zaskoczeniem, ponieważ
dane literaturowe mówią, że co prawda, głównymi substratami dla fosfataz z rodziny PPP jest fosfoseryna i fosfotreonina,
ale niektóre enzymy są również zdolne defosforylować reszty fosfotyrozyny. Badane białko jest pierwszym enzymem
z tej grupy, który in vitro wykazuje aktywność tylko w stosunku do fosfotyrozyny. Kolejną niespodzianką był fakt,
że cząsteczka Ap4A jest hydrolizowana niesymetrycznie do cząsteczki AMP i ATP. Najlepiej znany enzym tego typu,
ApaH, pochodzący z E.coli i wykazujący znaczną homologię z badanym białkiem (25% identyczności) jest symetryczną
hydrolazą Ap4A. Natura odmiennego sposobu degradacji Ap4A pozostaje w dalszym ciągu niewyjaśniona. Ostatnia
z wykrytych aktywności enzymatycznych, ATPazy nie stanowi zaskoczenia, ponieważ może ona towarzyszyć
hydrolazom Ap4A.
W niniejszej pracy przedstawiono wyniki badań in-vivo, dotyczące lokalizacji fosfatazy PrpE w komórkach Bacillus
subtilis. W tym celu zastosowano fuzję translacyjną PrpE z białkiem GFP. Otrzymane wyniki wskazują, że fosfataza
ta lokalizuje się w sporach (komórkach przetrwalnikowych Bacillus subtilis). Dalsze wyniki z użyciem szczepów
delecyjnych i nadprodukujących PrpE sugerują, że białko to prawdopodobnie uczestniczy w germinacji spor.
P264.
Wpływ aktywności genów operonu pL położonych między genami exo i xis na
przebieg infekcji bakteriofagiem λ.
Joanna Woźniak (1), Marcin Łoś (1), Grzegorz Węgrzyn (1, 2)
(1) Uniwersytet Gdański, Katedra Biologii Molekularnej, Kładki 24, 80-822 Gdańsk
(2) Instytut Oceanologii PAN, Św. Wojciecha 5, 81-347 Gdynia
Funkcja większości genów bakteriofaga λ została już stosunkowo dobrze poznana. Istnieją jednak pewne wyjątki, które
w dużej części dotyczą genów zbędnych fagowi do rozwoju w warunkach laboratoryjnych. Jedna z grup takich genów
znajduje się w operonie pL pomiędzy genami exo i xis. Znajdują się w niej geny wczesne ea22 i ea8.5 oraz otwarte ramki
odczytu orf60a, orf61 i orf63. Geny te zostały umieszczone na plazmidzie pGAW3775. Zauważono, że ich obecność
203
Genetyka mikroorganizmów
powoduje zmianę morfologii łysinek tworzonych przez faga λ.
W niniejszej pracy wykazano, że za obserwowany fenotyp łysinek odpowiada gen ea8.5. Wykazano też, że zwiększona
mętność łysinek może być spowodowana przez zwiększoną przeżywalność komórek bakteryjnych posiadających plazmid
pGAW3775. Za obserwowany fenotyp nie odpowiada zwiększona wydajność lizogenizacji, której częstość jest niższa dla
szczepów eksprymujących badane geny w porównaniu ze szczepami kontrolnymi, ani różnica w zdolności adsorpcji
cząstek fagowych na powierzchni komórek bakteryjnych, która wydaje się być podobna dla szczepu posiadającego
plazmid pGAW3775 jak i dla szczepu kontrolnego. Również nie wynika ona z obniżonego plonu fagowego, ponieważ
jest on podobny dla obu szczepów.
Dzięki użyciu odpowiednich fuzji promotorowych z genem lacZ zaobserwowano, że aktywność badanych genów
może powodować nieznaczne obniżenie aktywności promotora pL. Ponadto ekspresja genu ea8.5 powoduje obniżenie
aktywności promotorów pI oraz paQ, a ekspresja genów ea22 i/lub orf60a, orf61, orf63 hamuje aktywność promotora
pE.
Wykazano również, że ekspresja badanych genów powoduje zwiększenie częstości indukcji spontanicznej jak
i wymuszonej profaga λ.
P265.
Oddziaływanie pomiędzy kinazą białkową PrkC i fosfatazą białkową PrpC.
Michał Obuchowski, Adam Iwanicki
Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk
Białka PrpC i PrkC stanowią parę enzymów zaangażowaną w fosforylację białek w komórkach Bacillus subtilis.
Kinaza PrkC jest białkiem zakotwiczonym w błonie komórkowej, posiadającą zewnątrzkomórkową domenę działającą
prawdopodobnie jako sensor. Fosfataza jest białkiem cytoplazmatycznym. PrpC wydajnie usuwa grupy fosforanowe
z autofosforylowanej cząsteczki kinazy PrkC. Cząsteczka kinazy jest fosforylowana w trzech rejonach: pętli aktywacyjnej
(4 fosforylowane reszty treoniny), płacie katalitycznym (1 fosforylowana reszta seryny) oraz rejonie przymembranowym
(3 fosforylowane reszty treoniny).
Fosfataza PrpC nie traktuje wszystkich fosforylowanych rejonów jednakowo wykazując preferencje do w pełni
fosforylowanej pętli katalitycznej i rejony przymembranowego. Ponadto uzyskane wyniki pozwoliły stwierdzić, iż
defosforylacja każdej reszty aminokwasowej bez względu na jej otoczenie jest oddzielnym zdarzeniem.
Oba białka są zaangażowane w regulację wytwarzania przetrwalników (spor) oraz powstawanie biofilmu. �
P266.
Influence of Escherichia coli DnaK AND DnaJ chaperones on stability of UmuC, GreA,
GreB AND CysB proteins.
Anna M. Grudniak, Monika Maciąg , Krystyna I. Wolska
Uniwersytet Warszawski, Wydział Biologii, Instytut Mikrobiologii, Zakład Genetyki Bakterii, ul. Miecznikowa 1,
02-096 Warszawa
Escherichia coli proteins DnaK and DnaJ are the members of the DnaK-DnaJ-GrpE chaperone team and are classified
as stress proteins because they are induced under stress conditions. By virtue of being molecular chaperones DnaK and
DnaJ proteins are able to promote proper protein folding and to influence protein conformation, transport, oligomeric
structure and stability.
DnaK and DnaJ chaperones are involved in a variety of important cellular processes executed by protein complexes. We
decided to studied three of such a processes: – error prone repair, – transcription of cysPTWA operon, a member of cys
regulon and –expression of tnaA gene coding for tryptophanase. As the effect of DnaK and DnaJ chaperones on all three
activities are documented their influence on the stability of UmuC, CysB and GreA/GreB proteins which are respectively
the main activators of these processes were also determined.
Transcription of tnaA, cysPTWA and reversion frequency executed by UmuC (error prone repair) was studied in null
dnaJ and dnaKdnaJ mutants at permissive temperature, 30oC, and after 1h exposure to 42oC. The stability of UmuC,
CysB and GreA/GreB was determined by densitometric (analysis of autoradiograms). Proteins were synthesized from
genes cloned under T7 promoter; the bulk of cellular proteins production was knock-out by rifampicin.
The simultaneous deprivation of DnaK and DnaJ influences the stability of UmuC, CysB, GreA/GreB, the deprivation of
DnaJ protein only does not have any effect. This result points to the involvement of DnaK (or DnaK, DnaJ tandem) on
the stability of proteins studied.
204
Genetyka mikroorganizmów
Wykład plenarny
W125. Molecular Mechanism Of Bacterial Virulence From Global Genome Analysis To
Structure-Function And Prevention Of Chronic Infection.
B. Nowicki, S. Nowicki, Y. Fofanov, A. Hart-Van Tassell, P. Urvil, P. Goluszko,
OB /Gyn. and Microbiology at University of Texas Medical Branch, Galveston, TX and University of Houston, Houston, TX
Infectious diseases remain the major cause of human morbidity and mortality. Infectious diseases result from interaction
between the pathogenic bacteria and the human host. Some microbes develop acute infection and some avoid human
defenses and cause chronic or sub-clinical infection. Microbial virulence is encoded by clusters of genes contained
in pathogenic islands which have been acquired by horizontal transfer. Understanding microbial virulence strategies
become essential in prevention of chronic infections and require novel genetic approaches to enhance our chances to
develop cures. The availability of complete genomic sequences of several pathogens allows now the global analysis of
genome organization and better understanding of evolution of microbial virulence. We have used recently developed
algorithm, similarity-plot (S-plot) which identifies DNA sequences of unusual statistical properties and visualize 2D genome organization of related bacteria. Using the S-plot we compared genomes of two E. coli, strain K12 and
uropathogenic E. coli CFT073. The S-plot identified several regions of unusual DNA properties and visualized them
as blue lines. The blue lines contained the genetic and pathogenic islands unique to uropathogenic E. coli with several
virulence factors of which some may be recognized as family of Dr and/or afimbrial adhesins associated with chronic
infections. We consider that chronic infection process may require retention of these GI’s which allow colonization
(attachment) and invasion of epithelial cells but not necessarily powerful toxins. Using the genetic approaches we
constructed recombinant systems in which we investigate attachment and invasion of Dr E. coli associated with chronic
infection of the kidney (pyelonephritis). Using site directed mutagenesis we identified unique domains of E. coli fimbrial
Dr adhesin and epithelial receptor DAF (CD55) that signal invasion process. Computer modeling of receptor mutants
allowed us to propose a novel hypothesis that distribution of a negative charge in the receptor binding pocket may
be involved in the invasion process. In vivo experimental model of chronic kidney infection showed that the chronic
infection is dependent on E. coli Dr fimbriae since the isogenic fimbriae negative mutant was eliminated by the host.
A recombinant vaccine of Dr fimbriae was used to prevent pyelonephritis. While vaccine protected mice from mortality
it did not protect mice from the kidney infection. This further emphasizes a need for understanding of global genomic
organization of pathogens and the human host and designing alternative genetic strategies to protect humans from
chronic debilitating infections.
Genomika i ewolucja molekularna
Komunikaty ustne:
W126. Zależność stabilności genów od ich długości.
Paweł Mackiewicz (1), Natalia Polak (1), Paweł Mackiewicz (1), Joanna Banaszak (1), Małgorzata Dudkiewicz (1),
Maria Kowalczuk (1), Dorota Mackiewicz (1), Kamila Smolarczyk (1), Mirosław R. Dudek (2), Stanisław Cebrat (1)
(1) Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wrocławski, ul. Przybyszewskiego 63/77, 51-148 Wrocław
(2) Instytut Fizyki, Uniwersytet Zielono-Górski, ul. Szafrana 4A, 65-516 Zielona Góra
Długość genu jest wynikiem kompromisu między presją mutacyjną i selekcyjną. Presja mutacyjna najczęściej powoduje
skracanie genów z powodu generowania kodonów stop wewnątrz ramek odczytu. Natomiast presja selekcyjna stara się
utrzymać długość genu optymalną ze względu na funkcję kodowanego białka. Przy pomocy symulacji komputerowych
zbadano związek między stabilnością genów a ich długością. W symulacjach sekwencje genów pochodzące z genomu
205
Genetyka mikroorganizmów
Borrelia burgdorferi poddano presji mutacyjnej opisanej macierzą 12 przejść nukleotydowych i określonej w wyniku
analiz porównawczych genów i pseudogenów w tym genomie. Zastosowano dwa rodzaje presji selekcyjnej. W kolejnych
krokach symulacji, po wprowadzeniu losowych mutacji, sprawdzano dla każdego genu jak zmienił się ogólny składu
aminokwasowy kodowanego przez niego białka w stosunku do białka kodowanego przez jego niezmutowaną formę.
W przypadku, gdy ta zmiana przekraczała wartość tolerancji gen był eliminowany. W drugim rodzaju selekcji gen był
eliminowany, jeśli mutacji uległ jego kodon start lub stop lub jeśli pojawił się kodon stop wewnątrz genu. Stwierdzono,
że przy selekcji na skład aminokwasowy efekt eliminowania genu jest większy dla genów krótkich niż dla długich, co
można tłumaczyć większym prawdopodobieństwem supresji wenątrzgenowych w genach długich. Geny długie były
z kolei częściej eliminowane z powodu pojawiania się kodonów stop wewnątrz ich sekwencji. Liczba eliminowanych
genów nie zależała natomiast od długości, jeśli geny były eliminowane tylko z powodu zmiany kodonu startu lub stopu.
Wstępne analizy porównawcze genomów zdają się świadczyć o tym, że tempo dywergencji genów nie zależy od ich
długości. Wyniki symulacji pozwolą więc na określenie relacji ilościowych między mutacjami zmieniającymi sekwencję
aminokwasową a mutacjami generującymi kodony stop.
W127. Ewolucja genów w asymetrycznych genomach bakteryjnych.
Kamila Smolarczyk (1), Paweł Mackiewicz (1), Natalia Polak (1), Joanna Banaszak (1), Małgorzata Dudkiewicz (1),
Maria Kowalczuk (1), Dorota Mackiewicz (1), Mirosław R. Dudek (2), Stanisław Cebrat (1)
(1) Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wrocławski, ul. Przybyszewskiego 63/77, 51-148 Wrocław
(2) Instytut Fizyki, Uniwersytet Zielono-Górski, ul. Szafrana 4A, 65-516 Zielona Góra
Większość chromosomów bakteryjnych wykazuje wyraźną asymetrię w składzie nukleotydowym między różnie
replikowanymi nićmi (wiodącą i opóźniającą) wynikającą z różnych presji mutacyjnych związanych z syntezą tych
nici. Asymetryczną naturę posiadają również geny, u których jedna z nici jest kodująca (sensowna), a na drugiej nici
(antysensownej) odbywa się proces transkrypcji. Ta asymetria wynika z presji selekcyjnej na skład aminokwasowy
kodowanych białek. W związku z istnieniem tych dwóch mechanizmów generujących asymetrię, stabilność genu zależy
od jego położenia na chromosomie. Stosując symulacje komputerowe zbadano wpływ asymetrycznej presji mutacyjnej
na ,,przeżywalność” genów. Sekwencje nukleotydowe genów należące do genomu Borrelia burgdorferi poddawano
presji mutacyjnej opisanej macierzą 12 przejść nukleotydowych. Po każdym kroku symulacji, po wprowadzeniu mutacji,
sprawdzano jak bardzo zmienił się ogólny skład aminokwasowy kodowanego przez dany gen białka w stosunku do białka
kodowanego przez ten gen przed mutacją. Gdy ta zmiana przekraczała przyjętą wartość tolerancji –gen był eliminowany
i zastępowany przez jego allel z innego genomu. Zastosowano stałą presję mutacyjną (przez całą symulację gen był
poddany jednej presji) i zmienną (gen był poddawany presjom mutacyjnym na przemian z nici wiodącej i opóźniającej).
Stwierdzono, że prawdopodobieństwo eliminacji genów było większe, jeśli geny były poddawane presji pochodzącej
z nici przeciwnej. Natomiast efekt zabijania zmniejszał się, jeśli geny były poddawane zmiennej presji mutacyjnej.
Poszczególne geny wykazywały różną stabilność w zależności od częstości zmiany presji i czasu pozostawania pod
wpływem danej presji. Wyniki tłumaczą dane uzyskane z analiz porównawczych genomów wskazujących, że geny
relatywnie często zmieniają położenie względem różnie replikowanych nici i wobec tego poddawane są zmiennym
presjom mutacyjnym.
W128. Punkt izoelektryczny białek – analizy proteomów i symulacje komputerowe.
Joanna Banaszak (1), Paweł Mackiewicz (1), Natalia Polak (1), Maria Kowalczuk (1), Dorota Mackiewicz (1),
Kamila Smolarczyk (1), Małgorzata Dudkiewicz (1), Mirosław R. Dudek (2), Stanisław Cebrat (1)
(1) Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wrocławski, ul. Przybyszewskiego 63/77, 51-148 Wrocław
(2) Instytut Fizyki, Uniwersytet Zielono-Górski, ul. Szafrana 4A, 65-516 Zielona Góra
Wartości punktów izoelektrycznych białek wszystkich analizowanych proteomów mają rozkład bimodalny. Zbiory
białek kwaśnych i białek zasadowych są rozdzielone wyraźną strefą wokół pI = 7,5, w której białka nie występują.
Przyczyna tego wydaje się trywialna, ponieważ rozpuszczalność białek w pH bliskim ich punktowi izoelektrycznemu
jest najniższa. Okazuje się jednak, że stabilność genów poddanych presji mutacyjnej charakterystycznej dla danego
genomu jest najmniejsza dla genów kodujących białka o pI = 7,5. Ponadto stwierdzono pozytywną korelację między
długością genów a punktem izoelektrycznym kodowanych przez nie białek kwaśnych i negatywną korelację między
długością genów a punktem izoelektrycznym kodowanych przez nie białek zasadowych. Obserwowane korelacje
wynikają z możliwości buforowania zmian pI wprowadzanych przez substytucje aminokwasowe w większych
cząsteczkach białkowych. Wykazano również, że presja mutacyjna, dzięki strukturze uniwersalnego kodu genetycznego
również generuje bimodalny rozkład produktów genów, jeżeli presja selekcyjna utrzymuje jedynie rozkład długości
206
Genetyka mikroorganizmów
genów charakterystyczny dla danego genomu. Tak więc bimodalny rozkład wartości pI białek jest ewolucyjnie bardzo
starą cechą organizmów żywych, być może ,,pamiętającą” czasy ewolucji uniwersalnego kodu genetycznego.
W129. Poszukiwanie sekwencji kodujących wśród krótkich ORFów w genomie drożdży
Saccharomyces cerevisiae.
Krystian Bączkowski (1), Paweł Mackiewicz (1), Maria Kowalczuk (1), Mirosław R. Dudek (2), Stanisław Cebrat (1)
(1) Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wrocławski, ul. Przybyszewskiego 63/77, 51-148 Wrocław
(2) Instytut Fizyki, Uniwersytet Zielono-Górski, ul. Szafrana 4A, 65-516 Zielona Góra
W projekcie sekwencjonowania genomu drożdży Saccharomyces cerevisiae, systematycznie analizowano otwarte
ramki odczytu (ORFs –ang. Open Reading Frames) dłuższe niż 100 kodonów. Granica 100 kodonów została arbitralnie
przyjęta, aby nie przeoczyć stosunkowo długich ORFów najprawdopodobniej kodujących oraz, aby uniknąć dużej liczby
przypadkowych ORFów niekodujących wśród ramek krótkich. Poszukiwanie sekwencji kodujących wśród ORFów
krótkich (smORFs –ang. small ORFs) jest utrudnione ze względu na dużą liczbę fałszywych ramek niekodujących.
Zidentyfikowanie krótkich ORFów jest jednak istotne, ponieważ wiele z nich może kodować białka pełniące istotne
funkcje regulatorowe. W celu znalezienia potencjalnych genów w obrębie smORFów do analiz wybrano 34 583 ORFów
dłuższych niż 20 kodonów nieadnotowanych w bazie MIPS w czasie jej pobierania, które nie zachodziły na ORFy
o przypisanej już funkcji lub na ORFy wykazujące istotną homologię ze znanymi sekwencjami kodującymi. ORFom
przypisano prawdopodobieństwo kodowania w oparciu o parametry asymetrii w składzie nukleotydowym między nicią
sensowną (kodującą) i antysensowną (niekodująca). Wcześniejsze analizy wykazały, że zastosowane parametry właściwie
identyfikują znane sekwencje kodujące białka nie tylko w genomie drożdży. Dla wybranych ORFów przeszukano
dostępne bazy danych w celu znalezienia sekwencji homologicznych do ich produktów białkowych (BLASTP) oraz
znanych motywów, domen i regionów konserwatywnych (RPS BLAST, INTERPROSCAN). Parametry programów
zoptymalizowano ze względu na krótkie sekwencje. Dla ponad 3000 ORFów poszukiwania dały statystycznie istotne
wyniki (E-value < 0.001). Przypisane prawdopodobieństwa kodowania wykazały wysoką korelację z parametrami
istotności statystycznej (E-value) uzyskanych poszukiwań, co umożliwia wybranie z rankingu do dalszych analiz
eksperymentalnych ORFy o dużym potencjale kodowania.
W130. Genotypic characterization of Cyanobacteria based on PCR-RFLP analysis of rpoC1
gene.
K. Waleron, J. Głowacka, M. Waleron, M. Całusińska, M. Szefel, A. J. Podhajska
Department of Biotechnology, Faculty of Biotechnology University of Gdańsk and Medical University of Gdańsk. Kładki 24,
80-822 Gdańsk, Poland.
Cyanobacteria are the most numerous and the most spread photosynthetic prokaryotes, which taxonomy is still discussed.
Molecular methods are very useful tools in improving the identification, classification and genotypic characterization of
Cyanobacteria. We have tested a technique, based on analysis of rpoC1 gene polymorphism, to determine its usefulness
for molecular taxonomy of Cyanobacteria. The DNA –dependent RNA polymerase of Cyanobacteria and Algae contains
a unique core component γ, encoded by rpoC1 gene. This gene was used for molecular characterization of different species
of Cyanobacteria, for example: Synechococcus (Toledo and Palenik 1997); Cylindrospermopsis raciborskii (Wilson et al.
2000). We try to design universal primers that allow amplification of rpoC1 gene isolated from Cyanobacteria belonging
to all of five sections. Our genotypic characterization was performed on 88 strains of Cyanobacteria belonging to 28
genera. The 700bp fragments of rpoC1 gene were amplified with DNA of all tested strains. The PCR products were
digested with three endonucleases TasI, TruI, TaqI. All enzymes gave characteristic RFLP profiles: TasI gave 53 RFLP
patterns; Tru1I and TaqI allowed to describe 43 and 52 RFLP patterns respectively. The results of the rpoC1-RFLP
analysis of PCR products revealed the presence of 69 different rpoC1 restriction groups. Our results indicated that
PCR-RFLP analysis of the rpoC1 gene fragment is a useful tool for identification of cyanobacterial species, as well as for
strains differentiation. Obtained RFLP profiles will serve to create a Molecular Key for Cyanobacteria. On this basis we
conduct further identification of cyanobacterial species isolated from different biotops of Northern Poland.
Acknowledgements:
Supported by grant KBN 0365/PO4/2003/24.
207
Genetyka mikroorganizmów
W131. Development of universal primers for amplification recA gene of Cyanobacteria.
K. Waleron, M. Szefel, M. Waleron, J. Głowacka, M. Całusińska, A. J. Podhajska
Department of Biotechnology, Faculty of Biotechnology University of Gdańsk and Medical University of Gdańsk. Kładki 24,
80-822 Gdańsk, Poland.
At present, classification system of Cyanobacteria is based on their morphological characters and data derived from
16S rDNA sequence comparisons. The molecular systematic of Cyanobacteria based on 16S rDNA is still discussed
due to horizontal transfer of rrn operons among microorganisms. Polyphasic analysis of highly conserved genes
seems to be a useful molecular approach to construct the taxonomic system of these bacteria. Therefore, we studied
possibility of using house-keeping genes, which are universally present in cells and show a high degree of sequence
conservation. In this project we analyzed the recA gene polymorphism. We tried to design universal primers to amplify
recA gene fragment for all cyanobacterial species. The set of six primers were designed on the basis of published recA
gene sequences of few species of Cyanobacteria. The primers recA4/5 appeared to be most universal. The product of
amplification was observed for 59 of 77 tested cyanobacterial strains, belonging to 21 different genera. The other primers
were selective for particular groups of cyanobacteria, eg. primers recava1/2 were more specific for filamentous species.
On the basis of obtained results we decide to sequence amplified recA gene fragments to have more data, which could
be used to design more universal degenerate primers. The RFLP analysis of recA PCR products will be performed. The
RFLP patterns obtained from tested species of Cyanobacteria will be applied in construction a molecular key for their
identification.
Acknowledgements:
Supported by grant KBN 0365/PO4/2003/24.
W132. Testowanie hipotez filogenetycznych z użyciem ważonych najmniejszych
kwadratów.
Borys Wróbel (1, 2), Rafael Sanjuan (1)
(1) Institut Cavanilles de Biodiversitat i Biología Evolutiva, Universitat de Valencia
(2) Instytut Oceanologii Polskiej Akademii Nauk
Najbardziej wydajne obliczeniowo metody rekonstrukcji filogenetycznej to szeroko stosowane metody oparte na
odległościach, do których należy algorytm najbliższego sąsiada oraz algorytm Fitch-Margoliash. Na ich wydajność
obliczeniowa pozwala zastąpienie matrycy danych (matrycy cech morfologicznych czy zestawienia sekwencji) matryca
odległości miedzy jednostkami taksonomicznymi. Możliwe jest tez zastosowanie metod odległościowych w przypadku,
gdy same odległości są danymi pierwotnymi czy kiedy konieczne jest uśrednienie odległości otrzymanych w różnych
pomiarach. Większość metod testowania hipotez filogenetycznych (zarówno dotyczących gałęzi, jak i porównywania
drzew) wymaga otrzymania pseudopowtórzen matrycy danych na drodze wybierania z podstawianiem (bootstrapping).
Jest to kosztowne obliczeniowo i niemożliwe, gdy danymi pierwotnymi są odległości. Tych wad nie maja metody
analityczne, jednak zaproponowane do tej pory metody wymagają oszacowania wariancji i kowariancji odległości.
Szczególnie konieczność oszacowanie kowariancji może być problematyczne. Metoda ważonych najmniejszych
kwadratów, którą prezentujemy, nie ma tej wady. Opracowany test względnej wiarygodności można zastosować zarówno
dla oceny wiarygodności gałęzi, gdy dana jest topologia, jak i do porównania kilku topologii. Przedstawione zostaną
wyniki symulacji, oraz analiza realnych danych. Wyniki wskazują, ze test gałęzi oparty na ważonych najmniejszych
kwadratach prowadzi do zbliżonych wniosków, co testy oparte na psuedopróbkowaniu (test Felsensteina czy Dopazo).
Szczegolnie interesujące są wyniki porównania z testem Felsensteina; mimo ze test ten ma chwiejne podłoże teoretyczne,
jest on najszerzej stosowany w pracach filogenetycznych. Nasze symulacje wskazują, ze tradycyjnie przyjmowany próg
akceptacji kladow (obecność w 70% topologii otrzymanych z użyciem pseudozestawień) jest arbitralny. Zaprezentowane
zostanie zastosowanie nowej metody w przypadku, gdy nie jest możliwe pseudopróbkowanie (w analizie zależności
miedzy sekwencjami wirusa nabytego braku odporności otrzymywanymi z różnych organów różnych pacjentów).
Planujemy użyć nowa metodę w przypadku, gdy nie można użyć innych ze względu na trudności obliczeniowe wynikające
z dużej ilości analizowanych sekwencji oraz wysokiego podobieństwa miedzy nimi. Implementacja metody (program
WeightLESS) jest dostępna na stronie http://www.iopan.gda.pl/~wrobel.
208
Genetyka mikroorganizmów
Komunikaty plakatowe:
P267.
Zróżnicowanie genotypowe izolatów Phytophthora citricola otrzymanych z roślin
szkółkarskich z objawami fytoftorozy.
Teresa Orlikowska, Katarzyna Wiejacha, Aleksandra Trzewik
Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa, 96-100 Skierniewice, ul. Pomologiczna 18
W wyniku inspekcji prowadzonych w szkółkach drzew i krzewów ozdobnych w latach 1995-2004, otrzymano z roślin
wykazujących objawy fytoftorozy 193 izolaty Phytophthora. Kwalifikacji do rodzaju dokonano na podstawie cech
morfologicznych strzępek i zarodni na pożywce PDA i wyciągu glebowym a kwalifikacji do gatunku dokonano przy
użyciu techniki PCR ze specyficznymi starterami. Spośród 119 oznaczonych tą techniką, 77 izolatów należało do gatunku
P. citricola. Były one patogenami następujących gospodarzy: Chamaecyparis lawsoniana, Thuja occidentalis, Thuja
plicata (Cupressaceae), Taxus bacctaca L. (Taxaceae), Picea omorica and Abies concolor (Pinaceae), Azalea sp., Calluna
vulgaris, Rhododendron, Vaccinium vitis-ideae (Ericaceae sp.), Fagus sylvatica L. (Fagaceae), Fraxinus sp. (Oleaceae).
Przy tak dużej liczbie gospodarzy zachodzi pytanie o specjalizację izolatów do porażania różnych gatunków roślin.
Z tego powodu analizowano stopień polimorfizmu DNA. Profile otrzymywano za pomocą techniki PCR, ze starterami
ISSR i RAPD. Analiza polimorfizmu pozwoliła na stworzenie macierzy 0/1, na podstawie której określono współczynnik
zróżnicowania genetycznego i wykreślono dendrogramy, grupujące izolaty o podobnym stopniu zróżnicowania.
W pierwszym etapie przeanalizowano polimorfizm 24 izolatów. Zróżnicowanie genotypowe pomiędzy izolatami
wahało się od 10 do 60%. Stwierdzono większe różnice pomiędzy izolatami otrzymanymi z roślin należących do różnych
rodzin botanicznych.
P268.
Selekcja naturalna w ewolucji molekularnej wirusów czarnej pierścieniowej
plamistości pomidora (TBRV) i pierścieniowej plamistości buraka (BRSV).
Magdalena Jończyk, Natasza Borodynko, Henryk Pospieszny
Instytut Ochrony Roślin w Poznaniu
Stosunek częstości mutacji niesynonimicznych (dN) do synonimicznych (dS) jest ważnym wskaźnikiem presji
selekcyjnej działającej na sekwencję kodującą (w=dN/dS). Jeśli w<1 sekwencja jest pod działaniem selekcji negatywnej,
gdy w=1 można przypuszczać, że gen był pod wpływem dryfu genetycznego, natomiast przy w>1 na sekwencję
oddziałuje ewolucja adaptacyjna (różnicująca). Zwykle uśredniona w dla wszystkich miejsc aminokwasowych
rzadko przekracza 1. Wiąże się to z faktem, że większość aminokwasów jest pod silną presją selekcyjną warunkującą
funkcjonalność i poprawną strukturę białka. Pod wpływem ewolucji różnicującej znajduje się zwykle kilka-kilkanaście
miejsc (kodonów) lub tylko kilka linii ewolucyjnych.
Zróżnicowanie presji selekcyjnej pomiędzy poszczególnymi klasami miejsc w sekwencji C-końca polimerazy TBRV
i BRSV badano programem codeml z pakietu PAML. W tym celu zastosowano kilka z dostępnych modeli substytucji
w odniesieniu do kodonu jako miejsca oddziaływania presji selekcyjnej (modele: M0. M1, M2 i M3).
Badana populacja izolatów TBRV i BRSV wykazała przewagę selekcji negatywnej w ewolucji obu gatunków. Udało się
jednak wskazać gałęzie, w których prawdopodobnie mogła wystąpić selekcja adaptacyjna. Wyróżniono także te miejsca,
w których silna selekcja negatywna może sugerować istnienie nie tylko ograniczeń związanych ze strukturą i funkcją
białka, ale również ze strukturą RNA wirusa.
P269.
Genomotypowanie mikrosymbiontów Genista tinctoria metodą AFLP.
Michał Kalita, Wanda Małek, Marta Dmochowska, Łukasz Motyczka, Urszula Słupna
Zakład Mikrobiologii Ogólnej, Instytut Mikrobiologii i Biotechnologii UMCS, ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin
Analizę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (AFLP) wykorzystano do badania stopnia zróżnicowania
genomowego i genomotypowania mikrosymbiontów Genista tinctoria pochodzących z Anglii, Polski i Ukrainy.
W metodzie tej wykorzystano jeden enzym restrykcyjny PstI, jeden adaptor i dwa selekcyjne startery: Pst-G i PstGC odpowiednio, z G i G+C na końcach 3’. W reakcji PCR z bardziej selekcyjnym starterem Pst-GC powstało 57%
209
Genetyka mikroorganizmów
polimorficznych amplikonów, które pozwoliły odróżnić badane izolaty i szczepy referencyjne reprezentujące różne
gatunki rodzaju Bradyrhizobium. Wielkość produktów amplifikacji wynosiła od 0.28 do 2.15 kb. Wśród nich, trzy
bandy DNA z amplifikacji ze starterem Pst-G i cztery z reakcji PCR ze starterem Pst-GC były monomorficzne niemal
dla wszystkich mikrosymbiontów G. tinctoria niezależnie od ich geograficznego pochodzenia. Stopień podobieństwa
genomowego rizobiów specyficznych dla G. tinctoria określono stosując macierz prostokątną opartą na profilach
AFLP. Wynosił on, dla poszczególnych izolatów, od 0.32 do 1.00 i wskazywał na ich dużą heterogenność genomową.
Współczynniki podobieństwa DNA mikrosymbiontów G. tinctoria, włączając także referencyjne bradyrizobia,
przedstawiono na dendrogramie skonstruowanym w oparciu o metodę grupowania UPGMA. Badane izolaty zostały
umieszczone w trzech podgrupach, zgodnie z ich geograficznym pochodeniem podobnie jak na fenogramie. Wynik ten
wskazuje na duże znaczenie analizy AFLP w badaniach taksonomicznych tj. w klasyfikacji i identyfikacji rizobiów.
Wykłady plenarne:
W133. Genetyczne podstawy patogenezy prątka gruźlicy. Metabolizm steroidów.
Jarosław Dziadek
Centrum Biologii Medycznej, PAN, Lodowa 106, Łódź.
Mycobacterium tuberculosis, zidentyfikowany w 1882 roku jako czynnik etiologiczny gruźlicy jest wciąż najgroźniejszym
bakteryjnym patogenem człowieka odpowiedzialnym rocznie za 3 mln przypadków śmiertelnych.
Zakażenie M. tuberculosis może nastąpić poprzez inhalację nawet kilku prątków i ich kontakt z tkanką płucną.
W 90-95% przypadków u zdrowych, dorosłych osób prątki są szybko inaktywowane przez makrofagi płucne oraz
swoistą odpowiedź immunologiczną, co zabezpiecza przed uszkodzeniem tkanki i rozwojem infekcji. W niektórych
przypadkach jednakże ani odpowiedź wrodzona, ani swoista odpowiedź immunologiczna nie są w stanie kontrolować
przebiegu zakażenia. Makrofagi płucne uwalniają wiele różnych czynników chemotaktycznych indukujących napływ
neutrofili i limfocytów oraz nieaktywnych monocytów krwi, a następnie wytworzenie ziarniniaków (granuloma)
zbudowanych z makrofagów i komórek epitelialnych. Ziarniniaki mogą ulegać zwapnieniom, bądź zanikają przez
upłynnienie. W późniejszej fazie zakażenia prątki rozprzestrzeniają się przez oskrzeliki płucne lub naczynia krwionośne
i limfatyczne tworząc kolejne zmiany ziarniniakowe. Wnikanie M. tuberculosis do makrofagów, ich zdolność do
wewnątrzkomórkowego przeżywania, a także długotrwałe przeżywanie prątków gruźlicy w organizmie człowieka,
pomimo stosowanej terapii antybiotykowej, związane jest z właściwościami samych bakterii i ich zdolnością do
przystosowywania się do zmian środowiska. Niespotykana u innych organizmów liczba genów M. tuberculosis, których
produkty zaangażowane są w przemiany steroidów sugerowałyby znaczenie tych elementów dla patogenezy prątków.
Należą do nich komponenty biosyntezy ściany komórkowej takie jak lipidy, glikolipidy, lipoglikolipidy czy poliketydy.
Genom M. tuberculosis wyposażony jest również w geny kodujące enzymy cyklu b-oksydacji czy alternatywnych
szlaków oksydacji lipidów. Prace ostatnich lat wskazują na rolę cholesterolu we wnikaniu mykobakterii do makrofagów
a także w wytwarzaniu białka ochronnego (TACO) odpowiedzialnego za zahamowanie fuzji fago i lizosomów. Postuluje
się również, że degradacja kwasów tłuszczowych jest głównym źródłem energii w czasie zakażenia, a bogate w tłuszcze
osłony komórkowe prątków ulegają przeorganizowaniu, co wiąże się z degradacją lub resyntezą różnorodnych lipidów
ściany komórkowej.
Przedmiotem wykładu będzie aktualny stan wiedzy dotyczący wybranych zagadnień metabolizmu steroidów prątków
gruźlicy i ich znaczenie dla procesu patogenezy.
W134. Evolution of Neisseria species virulence: what else can be deleted?
Stella Nowicki (1) Sergei Chumakov (2), Audrey Hart-van Tassell (1), Bogdan Nowicki (1), Catherine Putonti (2),
Petri Urvil (1), Meizhuo Zhang (2), Yuriy Fofanov (2)
(1) Department of Obstetrics and Gynecology, and Department of Microbiology and Immunology, University of Texas
Medical Branch, Galveston, TX.
(2) Department of Computer Science University of Houston, Houston, TX
Infectious diseases remain the major cause of human morbidity/mortality. Microbial virulence factors are carried on
pathogenecity (PAI) and/or genomic islands (GI) acquired by the horizontal gene transfer. These virulence factors have
unique statistical properties of DNA (G/C ratio) and have been the major targets for diagnosis, treatment and vaccine
development. To investigate global organization of virulence and to analyze (retrospectively) evolution of bacterial
210
Genetyka mikroorganizmów
virulence, a novel algorithm Similarity Plot was used. The S-plot visualized 2-D organization of genomes against each
other and identified genomic regions of unusual statistical properties. Here we show that S-plot identified several new
GI visualized as blue lines of which majority contained virulence like-genes such as toxins, hemagglutinin/hemolysin
not characterized yet. These genes were clustered with t-RNA, bacteriophage or transposase. Based on sequence
alignment majority of GI’s had similar genomic location in all pathogenic Neisseria spp, suggesting that these GI’s were
acquired before ancestral parent strain Chromobacterium violaceum separated into neuro– and genital– pathogens (N.
meningitidis and N. gonorrhoeae). In comparison to N. memingitidis, gonococci lacked eight common GI’s or deleted
segments of GI in less virulent strains, suggesting that evolution of N. gonorrhoeae progressed primarily by deletion of
GI’s and virulence determinants.
Diagnostyka, terapia,
inżynieria genetyczna, biotechnologia
Komunikaty ustne:
W135. Konstrukcja i charakterystyka fuzji genu cjaA Campylobacter z genem extB E. coli
kodującym podjednostkę B toksyny LT, białko o charakterze adjuwantu.
Agnieszka Wyszyńska, Joanna Lampkowska, Elżbieta. K. Jagusztyn-Krynicka
Zakład Genetyki Bakterii, Instytut Mikrobiologii, Uniwersytet Warszawski, 02-096 Warszawa, ul. Miecznikowa 1, Polska
Bakterie rodzaju Campylobacter są aktualnie najczęściej izolowanymi ludzkimi enteropatogenami. Jak dotąd, nie
opracowano skutecznej szczepionki anty-Campylobacter ani dla ludzi z grup podwyższonego ryzyka ani dla kurcząt
będących głównym źródłem ludzkich infekcji. Celem prezentowanych badań było skonstruowanie i scharakteryzowanie
fuzji genu cjaA (cj0982c) Campylobacter kodującego 30 kDa protekcyjny antygen z genem extB E. coli kodującym
podjednostkę B toksyny LT E. coli, białko wykazujące właściwości adjuwantowe. Przygotowano rekombinacyjne
plazmidy zawierające oba geny wyrażane z własnych promotorów, fuzje translacyjną extB-cjaA oraz fuzję kodująca
białko hybrydowe CjaAxLT-A2xLT-B. Prawidłowość konstrukcji potwierdzono analizą restrykcyjną oraz na drodze
sekwencjonowania. Konstrukty genetyczne zostały wprowadzone do komórek E. coli oraz po przeklonowaniu do
plazmidu pYA3341 (Asd+) do komórek awirulentnej Salmonella enterica sv. Typhimurium χ3987 stosowanej jako nośnik
heterologicznych antygenów w badaniach szczepionkowych. Hybrydowe białka przebadano pod kątem ich lokalizacji
w komórce (analiza obecności białka w izolowanych frakcjach komórkowych), reakcji ze specyficznymi przeciwciałami
(Western blot) oraz zdolności do rozpoznawania GM1 receptorów (test ELISA). Awirulentna Salmonella eksprymująca
hybrydowe białka zostanie użyta do immunizacji dwu gatunków zwierzat –myszy i kurcząt. Ten cykl eksperymentów
pozwoli na ocenę adjuwantowego efektu LT-B na dwu modelach zwierzęcych.
W136. Analiza funkcjonalna produktu genu cjaA (cj0982) Campylobacter na drodze
ukierunkowanej mutagenezy.
Agnieszka Wyszyńska (1), Joanna Życka (1), Nadzieja Drela, Renata Godlewska (1), E. K. Jagusztyn-Krynicka (1)
(1) Zakład Genetyki Bakterii, Instytut Mikrobiologii Uniwersytetu Warszawskiego, 02-096 Warszawa, ul. Miecznikowa 1,
Polska
(2) Zakład Immunologii, Instytut Zoologii Uniwersytetu Warszawskiego, 02-096 Warszawa, ul. Miecznikowa 1, Polska
Immunodominujące białko CjaA (Cj0982) Campylobacter zostało zidentyfikowane w bibliotece genomowego DNA
przy użyciu króliczej surowicy anty-Campylobacter. Jak wykazano stosując izogeniczne mutanty cjaA– antygen ten
jest dwufunkcyjną lipoproteiną. Celem prezentowanych badań było potwierdzenie roli białka w procesie transportu
glutaminy oraz interakcji z komórkami eukaryotycznymi jak i jego lokalizacji w komórce na drodze ukierunkowanej
mutagenezy. Określono motywy/aminokwasy białka zaangażowane w omawiane procesy. Mutagenezie poddano pięć
kodonów genu cjaA: 1– dwa zlokalizowane w kieszeni wiążącej substrat (K115G, H195G), 2 – dwa wchodzące w skład
211
Genetyka mikroorganizmów
motywu RGD potencjalnie odpowiedzialnego za rozpoznawanie integrynowych receptorów (R189G, D191A) oraz
3 – kodon dla cysteiny sekwencji sygnalnej (C20A). Prawidłowość wprowadzonych zmian w sekwencjach kodujących
potwierdzono poprzez określenie sekwencji nukleotydowych odpowiednich fragmentów DNA. Przeprowadzone testy
fizjologiczne udokumentowały rolę Lis 115 i His 195 w wiązaniu glutaminy oraz wpływ powierzchniowo zlokalizowanego
motywu RGD na proces adhezji do komórek Hela. Dodatkowo wykazano, że Cys 20 sekwencji sygnałowej warunkuje
błonową lokalizację CjaA potwierdzając, że zgodnie z przewidywaniami białko to jest lipoproteiną procesowana przez
sygnałową peptydazę II.
W137. Rekombinantowe antygeny Toxoplasma gondii – oszacowanie przydatności
w immunodiagnostyce.
Lucyna Holec, Elżbieta Hiszczyńska-Sawicka, Artur Gąsior, Józef Kur
Katedra Mikrobiologii, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska, ul. G. Narutowicza 11/12, 80-952 Gdańsk
Toksoplazmoza jest chorobą rozpowszechnioną na całym świecie. Szacuje się, iż liczba osób seropozytywnych w Polsce
wynosi 60%. Szczególnie istotny problem stanowi toksoplazmoza wrodzona, która jest przyczyną aborcji lub wad
wrodzonych u dzieci. Obecnie w Polsce nie prowadzi się badań przesiewowych u kobiet ciężarnych i noworodków
w kierunku zarażenia Toxoplasma gondii. Systematyczne badania prenatalne odgrywałyby bardzo istotną rolę we
wczesnej identyfikacji zarażeń pasożytem oraz leczeniu. Wprowadzenie do diagnostyki toksoplazmozy metody, która
byłaby czuła, szybka i tania, pozwoliłoby na wykonywanie badań przesiewowych. Ponadto bardzo ważne jest, aby
metoda diagnostyczna pozwoliła odróżnić fazę ostrą od fazy przewlekłej toksoplazmozy. Obecnie w stosowanych testach
diagnostycznych wykorzystuje się głównie antygeny natywne (spreparowane całe tachyzoity, antygeny powierzchniowe
bądź somatyczne). Rekombinantowe białka antygenowe mogą być alternatywnym źródłem antygenów stosowanych
w diagnostyce. Bardzo duża liczba białek antygenowych T. gonidii, powoduje, że konieczne jest przebadanie ich pod
kątem przydatności do immunodiagnostyki.
Wykorzystując metody Westen blotting, dot blot, oraz test ELISA zbadano zdolność do oddziaływania kilkunastu
rekombinantowych białek antygenowych T. gondii (GRA1, GRA2, GRA6, GRA7, SAG1, SAG4, p22, p35, ROP1, ROP9,
MAG1, LDH1 i LDH2) z przeciwciałami pochodzącymi z surowicy ludzkiej. Zastosowano pulę surowic pochodzącą
od pacjentów seropozytywnych oraz seronegatywnych. Wyniki przeprowadzonych badań pozwoliły podzielić
antygeny na te, które reagują z surowicą pochodzącą od pacjentów z ostrą (GRA7, p35) lub przewlekłą (SAG4, MAG1)
toksoplazmozą, a tym samym umożliwiają różnicowanie jej faz.
W138. Chimeryczne fimbrie typu Dr-SAG1 – potencjalna szczepionka przeciwko
toksoplazmozie.
Artur Gąsior, Elżbieta Hiszczyńska-Sawicka, Lucyna Holec, Józef Kur
Katedra Mikrobiologii, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska, ul. G. Narutowicza 11/12, 80-952 Gdańsk
Toksoplazmoza jest chorobą wywoływaną przez pierwotniaka Toxoplasma gondii. U zwierząt zarażonych T. gondii
występują niespecyficzne objawy kliniczne (utrata apetytu, biegunka, znaczny spadek masy ciała i ogólne osłabienie),
a także w bardzo dużej ilości przypadków poronienia. Z tego powodu zarażenie pasożytem jest bardzo poważnym
problemem powodującym duże straty w hodowli zwierząt. Leczenie toksoplazmozy jest bardzo długotrwałe
i skomplikowane, dlatego najlepszym sposobem walki z tą chorobą byłyby szczepienia. Ciągły rozwój immunologii,
biologii molekularnej, prowadzi do nowych strategii w konstruowaniu ,,idealnej” szczepionki. Eksponowanie
określonych sekwencji białkowych (epitopów) na powierzchni bakterii w postaci fimbrii zbudowanych z chimerycznych
podjednostek DraE otwiera nową drogę do biotechnologicznej produkcji szczepionek anty-T. gondii. Długie,
zbudowane z kilkuset takich samych rekombinantowych podjednostek DraE, fimbrie chimeryczne mogą zawierać
bardzo wiele kopii wybranego przez nas epitopu. Biorąc pod uwagę fakt, że są to organella powierzchniowe oraz że
ich liczba na powierzchni pojedynczej komórki wynosi około 500, można przypuszczać, że będą one bardzo dobrymi
immunogenami. Przypuszczenia te potwierdzają liczne badania nad wykorzystaniem fimbrii natywnych, bądź
chimerycznych, w szczepieniu zwierząt.
Skonstruowano system ekspresji chimerycznych fimbrii typu Dr-SAG1 zbudowanych z podjednostek białkowych
adhezyny DraE z determinantą antygenowa pochodzącą z antygenu SAG1 T. gondii. Antygen SAG1, będący białkiem
powierzchniowym pasożyta, został wybrany w oparciu o wyniki badań, w których wykazano jego silną indukcję
odpowiedzi immunologicznej zarówno u zwierząt jak i ludzi. Ekspresja białka adhezyny DraE zawierającej sekwencję
antygenową została potwierdzona metodą Western blotting z użyciem przeciwciał anty-DraE. Natomiast obecność
212
Genetyka mikroorganizmów
chimerycznych fimbrii typu Dr-SAG1 na powierzchni komórek bakteryjnych Escherichia coli BL21(DE3) potwierdzono
wykorzystując metodę mikroskopii immunofluorescencyjnej. �
W139. Wykrywanie oporności na pyrazynamid wśród szczepów Mycobacterium
tuberculosis complex metodą SSCP-PCR.
Albert Jaworski, Ewa Augustynowicz-Kopeć, Krzysztofa Janus, Anna Zabost, Zofia Zwolska
Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, Zakład Mikrobiologii, 01-138 Warszawa, ul. Płocka 26
Pyrazynamid (PZA), wraz z izoniazydem, ryfampicyną i etambutolem należy do zestawu podstawowych leków
stosowanych w leczeniu gruźlicy. Wykonanie dla danego szczepu testu lekowrażliwości na PZA jest trudne i możliwe tylko
za pomocą systemu hodowlanego Bactec. Od niedawna wiadomo, że za oporność na PZA odpowiedzialne są mutacje
punktowe w ok. 600 nukleotydowym fragmencie genu PncA. Celem pracy było stworzenie prostego testu określającego
wrażliwość szczepu Mycobacterium tuberculosis na PZA opartego na metodach biologii molekularnej. Materiały
i metody: Z wyhodowanych na podłożu L-J 26 szczepów M. tuberculosis complex wyizolowano DNA i poddano reakcji
amplifikacji z dwoma starterami PncA1 i PncA2. Otrzymany produkt wielkości 623 pz zsekwencjonowano metodą
ABI Prism-BigDye-Terminator Cycle Sequencing Kit. Sekwencje genu PncA dla szczepów klinicznych porównywano
z sekwencjami tego genu otrzymanymi dla szczepów wzorcowych: M.tuberculosis H37Rv (PZA-wrażliwy) i M.bovis
BCG (PZA-oporny), w celu znalezienia mutacji punktowych odpowiedzialnych za oporność na lek. Równocześnie
otrzymane produkty PCR cięto enzymami restrykcyjnymi, podzielonymi na dwie grupy: a) (BstEII, Tsp45I) i b) (BsaHI,
AflIII). Następnie uzyskane fragmenty analizowano metodą SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) na
renaturującym żelu poliakrylamidowym. Początkową analizę przeprowadzono dla szczepu H37Rv oraz M.bovis BCG
w celu wystandaryzowania metody, a następnie analizowano fragmenty DNA otrzymane dla poszczególnych 26 szczepów
klinicznych. Wyniki: 1. Analiza SSCP pokazała, że lepiej dobranymi fragmentami do wykrywania mutacji w genie PncA
są enzymy z grupy b. 2.Jakość rozdziału na żelu poliakrylamidowym zależała od miejsca mutacji w sekwencji genu
PncA. 3. Metoda ta pozwala na wykryć 80% mutacji w genie PncA odpowiedzialnych za oporność na PZA.
W140. Wykrywanie genetycznych podtypów Mycobacterium kansasii metodą hsp65 RFLP
wśród szczepów izolowanych w IGiChP w Warszawie.
Krzysztofa Janus (1), E. Augustynowicz-Kopeć (1), A. Jaworski (1), M. Klatt (1), A. Zabost (1), B. Roszkowska (2),
D. Górska (3), Z. Zwolska (1)
(1) Zakład Mikrobiologii, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, 01-138 Warszawa, ul. Płocka 26
(2) III Klinika Chorób Płuc, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, 01-138 Warszawa, ul. Płocka 26
(3) II Klinika Chorób Płuc i Gruźlicy, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, 01-138 Warszawa, ul. Płocka 26
Mycobacterium kansasii jest jednym z głównych gatunków prątków atypowych (MOTT), wywołujących mykobakteriozę
u ludzi. Równocześnie jest gatunkiem środowiskowym, dla którego naturalnym rezerwuarem jest woda wodociągowa.
Rzadko występuje w glebie, w wodach jezior i rzek i sporadycznie izoluje się go od zwierząt. Najważniejszym jednak
spostrzeżeniem jest fakt, że wyhodowanie szczepu M. kansasii od chorego nie stanowi dowodu mykobakteriozy
Molekularna analiza szczepów M. kansasii na podstawie genu hsp65 (heat shock protein) pozwala podzielić je na
pięć podtypów, z których tylko jeden (podtyp I), jest uważany za typowy patogen dla człowieka, pozostałe zaś są
szczepami środowiskowymi. Celem pracy było przeprowadzenie analizy pokrewieństw genetycznych metodami
biologii molekularnej szczepów Mycobacterium kansasii wyizolowanych z materiałów klinicznych pacjentów IGiChP
i porównanie ich z gatunkami wyhodowanymi z wody. Materiały i metody: Wyizolowano i zidentyfikowano 39 szczepów
M. kansasii z materiałów klinicznych i 11 – z wymazów z ujęć wody z dwóch oddziałów. Następnie przeprowadzono
analizę restrykcyjną genu hsp65. Gen zamplifikowano przy użyciu specyficznych primerów. Otrzymany produkt pocięto
enzymami restrykcyjnymi HaeIII i BstEII i rozdzielano na 4% żelu agarozowym. Wszystkie szczepy zostały również
poddane analizie RFLP z markerem TR2. Otrzymane wzory RFLP były analizowane i porównywane. Wyniki i Wnioski:
1.Wśród analizowanych szczepów dominował podtyp IV i III ( 90 %). 2. Wśród szczepów należących do podtypu IV
72 % miało identyczne wzory RFLP. 3. Z dwóch próbek wody wyizolowano podtyp II 4. Podsumowując sugerujemy,
aby w każdym przypadku wyizolowania od chorego szczepu M. kansasii określić jego podtyp przed podjęciem decyzji
o leczeniu.
213
Genetyka mikroorganizmów
W141. Identyfikacja genów wirulencji i systemu globalnej regulacji ekspresji egzobiałek
agr w nosicielskich i patogennych szczepach Staphylococcus aureus.
Kinga Wójcik (1), Magdalena Kowalska (1), Anna Kędzierska (2)
(1) Zakład Mikrobiologii, Wydział Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie
(2) Katedra Immunologii Klinicznej i Patologii, Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii CM UJ
Szczepy Staphylococcus aureus produkują różnorodne czynniki wirulencji w tym adhezyny, białka maskujące
powierzchnię komórki oraz egzobiałka degradujące tkanki gospodarza i inaktywujące składniki odpowiedzi obronnej
makroorganizmu. Większość genów czynników wirulencji S. aureus należy do regulonu, w którym ekspresja białek
kontrolowana jest przez system globalnej regulacji agr, który koduje elementy dwuskładnikowego systemu transdukcji
sygnału, ulegającego aktywacji poprzez zwiększenie gęstości komórek bakterii. Na podstawie różnic w sekwencji genów
loci agr podzielono populacje szczepów S. aureus na cztery grupy agr. Celem niniejszej pracy było określenie potencjału
wirulencji patogennych i oportunistycznych szczepów S. aureus. W kolekcji szczepów S. aureus pochodzących
od chorych i od nosicieli określono występowanie genów kodujących czynniki wirulencji: adhezyny, egzotoksyny
i egzoenzymy metodą amplifikacji fragmentów poszukiwanych genów z zastosowaniem PCR oraz oznaczono grupy
agr. We wszystkich badanych szczepach zaobserwowano obecność licznych genów czynników wirulencji. Połowa
testowanej kolekcji szczepów S. aureus pochodzących od bezobjawowych nosicieli zawierała agr grupy trzeciej, podczas
gdy w szczepach wyizolowanych od chorych przeważała pierwsza grupa agr, a trzecia – nie przekraczała 30 % szczepów.
Otrzymane wyniki sugerują możliwość znaczącego wpływu przynależności do danej grupy systemu globalnej regulacji
ekspresji genów agr na wirulencję testowanych szczepów S. aureus.
Praca finansowana przez KBN nr projektu 3P05A 092 22
Komunikaty plakatowe:
P270.
Sekwencje minisatelitarne jako markery patogeniczności owadobójczego grzyba
Conidiobolus coronatus wobec larw Galleria mellonella.
Wioletta Wieloch (1), Mariusz Sacharczuk (2), Mieczysława I. Boguś (1), Kazimierz Jaszczak (2)
(1) Instytut Parazytologii PAN. Ul. Twarda 51/55. 00-818 Warszawa
(2) Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN. Jastrzębiec, ul. Postępu 1. 05-552 Wólka Kosowska
Conidiobolus coronatus (Entomophthoraceae) jest grzybem entomopatogennym szybko zabijającym żywicieli za
pomocą toksycznych metabolitów i może posłużyć jako potencjalne źródło insektycydów. Celem pracy było zbadanie
czy zróżnicowana wirulencja poszczególnych kolonii C. coronatus ma podłoże genetyczne. Sto czterdzieści jeden
kolonii grzybowych wyprowadzonych z pojedynczych zarodników hodowano na podłożu Sabouroud wzbogaconym
homogenatem z mola woskowego (G. mellonella). Patogeniczność kolonii testowano na larwach siódmego stadium
G. mellonella. Testy wykazały zróżnicowaną śmiertelność larw (10% – 100%) po 20-to godzinnej ekspozycji na
zarodnikujące kolonie. DNA wybranych kolonii o różnej patogeniczności zostało przebadane przy użyciu techniki DNA
fingerprinting z użyciem enzymów MspI/HaeIII oraz sondy Jeffreys’a 33.6, którą użyto po raz pierwszy do badania
genomu grzybowego. Analizowano fragmenty w zakresie najlepszego rozdziału elektroforetycznego tj. od 2-20 tys. par
zasad. Liczba prążków dla poszczególnych kolonii wynosiła od 14 do 20. Indeks podobieństwa pomiędzy koloniami o tej
samej patogeniczności mieścił się w przedziale od 0,97 do 0,80. Dystans genetyczny, oszacowany na podstawie indeksów
podobieństwa wewnątrz i między koloniami o różnej patogeniczności, wynosił od 0,03 do 0,28. Wyróżnionych zostało
kilka specyficznych prążków różnicujących kolonie o niskiej (10%) i wysokiej (100%) patogeniczności wobec larw. Analiza
statystyczna wskazuje na korelację pomiędzy patogenicznością a genetycznym podobieństwem analizowanych kolonii.
Można przypuszczać, że te specyficzne prążki, przez kolokację w genomie, są związane z genami odpowiedzialnymi za
proces porażania owadów. Hybrydyzacja ludzkich sekwencji minisatelitarnych z genomem grzybowym wskazuje, że są
to sekwencje szeroko rozpowszechnione wśród Eucaryota, zachowywane w procesie ewolucji.
214
Genetyka mikroorganizmów
P271.
Zastosowanie sond DNA i wyznaczników molekularnych dla zróżnicowania
dermatofitów z rodzaju Trichophyton i Microsporum.
Anita Dobrowolska (1), Łukasz Bojarski(1)*, Aleksandra Kaszuba (2), Paweł Stączek (1)
(1) Zakład Genetyki Drobnoustrojów, Uniwersytet Łódzki, ul. Banacha 12/16, 90-237 Łódź , e-mail: [email protected]
*(obecny adres) Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej, ul. Ks. Trojdena 4, 02-109 Warszawa
(2) II Katedra Dermatologii i Wenerologii, Klinika Dermatologii i Dermatologii Dziecięcej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi,
ul. Kniaziewicza 1/5, 91-347 Łódź
Tradycyjne metody diagnostyki mikologicznej oparte są na analizie cech morfologicznych i biochemicznych grzybów
chorobotwórczych. Ocena cech fenotypowych jest trudna, czasochłonna i dość często prowadzi do postawienia błędnej
diagnozy.
W prezentowanej pracy podjęto próbę opracowania techniki identyfikacji gatunków dermatofitów, opartej na
hybrydyzacji kwasów nukleinowych metodą dot-blot i Sothern-blot.
Opracowano metodę izolacji genomowego DNA z komórek grzybów chorobotwórczych o szerokim spektrum
przynależności systematycznej. Uzyskane preparaty DNA wykorzystano jako matryce w reakcji PCR-RAPD. Analiza
uzyskanych profili RAPD, wykazała obecność produktów, które z dużym prawdopodobieństwem mogą zawierać
specyficzne rodzajowo i gatunkowo sekwencje nukleotydowe. Wyselekcjonowano produkty reakcji PCR-RAPD
zsekwencjonowano, a uzyskane wyniki poddano analizie komputerowej, obejmującej m.in. poszukiwanie homologii
z sekwencjami zgromadzonymi w światowym banku genów GeneBank.
Spośród analizowanych produktów PCR wybrano dwa, z których udało się uzyskać trzy sondy molekularne, które mogą
być specyficzne dla grzybów z gatunków Trichophyton rubrum i Microsporum canis oraz z rodzaju Trichophyton.
Specyficzność sond potwierdza się obecnie poprzez hybrydyzację kwasów nukleinowych metodą dot-blot i Southernblot.
Ponadto, przedstawi się wyniki wskazujące, że technika PCR, skojarzona z analizą restrykcyjną produktów amplifikacji
określonych regionów rDNA, może zostać zastosowana z powodzeniem w naszych laboratoriach diagnostyki
chorobotwórczych dermatofitów.
P272.
Studies of methylation activity of MmeI restriction endonuclease and
methyltransferase.
Joanna Nakonieczna, Sylwia Firasiewicz, Anna Podhajska
Intercollegiate Faculty of Biotechnology University of Gdańsk and Medical University of Gdańsk, Kładki 24, 80-822 Gdańsk
Restriction endonuclease MmeI (R.MmeI) and methyltransferase MmeI (M.MmeI) are isolated from methylotrophic
bacteria Methylophilus methylotrophus. Both components of MmeI restriction-modification system recognize partially
degenerated sequence: 5’-TCCRAC-3’/3’-AGGYTG-5’, where R= G or A, Y=T or C. R.MmeI cuts DNA molecule after
20th and 18th nucleotide away from recognition sequence on top and bottom strand respectively. We also notice that
R.MmeI exerts methyltransferase activity modifying only one strand of recognition sequence, namely adenine in 5’TCCRAC-3’ sequence. Stimulation of restriction activity by SAM (S-adenosyl-L-methionine; methyl donor) and SIN
(Sinefungin; non-hydrolizable SAM analogue) together with hemimethylation ability (methylation of one strand) decide
of uniqueness of this enzyme. Hemimethylation does not protect host DNA from MmeI cleavage. Methyltransferase
MmeI methylates both adenines in recognition sequence making it resistant to MmeI restriction. On the basis of these
facts we proposed hypotesis of functional cooperation between both R-M.MmeI enzymes. In 2004 R.MmeI gene was
isolated and cloned in Escherichia coli (R.Morgan, NEB-INC.). Plasmid containing R.MmeI gene is hosted in E. coli
cells and is resistant to MmeI cleavage. In such circumstances we carried out series of experiments in order to verify our
previous observation. In present study we used several different DNA molecules (dsDNA oligonucleotides, long DNA
fragments) as substrates for methylation activity tests. All experiments included in this study were based on in vitro
tests and need to be confirmed by in vivo analysis. On the basis of obtained data we are able to conclude that R.MmeI
is sufficient to protect DNA from autorestriction. M.MmeI may be an independently acting methyltransferase or it
recognizes sequence that overlaps R.MmeI recognition site. Given thesis is based on observation that methylation of
both adenine residues in 5’-TCCRAC-3’/3’-AGGYTG-5’ sequence prevents M.MmeI methylation of the above DNA
sequence. Our observation led to conclusion that specificity of M.MmeI should be thoroughly verified.
Acknowledgements
Supported by BW B051-5-0113-4
215
Genetyka mikroorganizmów
P273.
Transmisja prątków gruźlicy pomiędzy blisko spokrewionymi osobami.
Albert Jaworski (1), Ewa Augustynowicz-Kopeć (1), Krzysztofa Janus (1), Dorota Krawiecka (2),
Maria Błezowska (3), Lidia Maciak (4), Krystyna Podolak (5), Zofia Zwolska (1)
(1) Zakład Mikrobiologi, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, 01-138 Warszawa , ul. Płocka 26
(2) Kujawsko-Pomorskie Centrum Pulmonologii w Bydgoszczy
(3) Dolnośląskie Centrum Chorób Płuc we Wrocławiu
(4) Wojewódzki Szpital Zakaźny w Gdańsku
(5) Specjalistyczny Szpital Gruźlicy i Chorób Płuc w Rzeszowie
Śledzenie dróg transmisji Mycobacterium tuberculosis w środowisku człowieka stanowi jeden z najważniejszych
elementów w programach walki z gruźlicą. Przez wiele lat z powodu braku odpowiednich metod badawczych wiedza
o transmisji choroby była bardzo ograniczona. Obecnie, zastosowanie techniki RFLP opartej na analizie polimorfizmu
występowania i liczbie sekwencji IS6110 w genomie szczepów prątków umożliwia takie badania. Celem pracy było
stwierdzenie czy miała miejsce aktywna transmisja w obrębie czterech rodzin, których członkowie chorowali na
gruźlicę. Materiał stanowiły szczepy M. tuberculosis wyhodowane w czterech województwach Polski od chorych na
gruźlicę dorosłych i ich dzieci. 1. –szczepy wyhodowane z płynu m-rdzeniowego od kobiety, która zmarła w połogu oraz
od jej dziecka– noworodka z popłuczyn żołądkowych, 2.szczepy wyhodowane z plwocin pobranych od ojca i dziecka,
3. szczepy wyizolowane plwociny od matki i córki, 4. szczepy wyhodowane z plwocin od matki i córki. Wszystkie
szczepy miały wykonaną identyfikację gatunkową oraz oznaczony test lekoowrażliwości. Metody: DNA wyizolowany
z hodowli prątków na pożywce płynnej trawiono endonukleazą PvuII, fragmenty rozdzielano na 1 % żelu agarozowym,
przenoszono na membranę nylonową i poddawano hybrydyzacji ze znakowanymi barwnie sondami będącymi
fragmentami IS 6110. Otrzymane wzory RFLP ze szczepów „rodzinnych” były porównywane pomiędzy sobą.
Wyniki i wnioski: 1. We wszystkich badanych przypadkach 4 rodzin otrzymano identyczne wzory RFLP u szczepów
izolowanych od dzieci i ich rodziców. 2. Zastosowanie metod biologii molekularnej umożliwiło potwierdzenie
aktywnej transmisji gruźlicy w ramach osób blisko spokrewnionych. 3. Według naszej wiedzy, w Polsce po raz pierwszy
udowodniono powyższą transmisję.
P274.
Fizjologiczno-morfologiczna charakterystyka drożdży Saccharomyces cerevisiae
opornych na jony kobaltu.
Małgorzata Grządka (1), Ryszard Adamski (2), Bogdan Barwiński (3), Zbigniew Kotylak (1)
(1) Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Rzeszowski ul. Rejtana 16C 35-959 Rzeszów
(2) Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wrocławski
(3) Instytut Fizyki Doświadczalnej, Uniwersytet Wrocławski
Tolerancja na metale ciężkie może być wynikiem modyfikacji w obrębie zewnętrznych osłon komórkowych,
chelatowania metali, precypitacji, wewnątrzkomórkowej separacji, np. w wakuolach, zwiększonej produkcji melaniny
lub niskocząsteczkowych substancji organicznych. Do badań wybrano auksotroficzne szczepy Saccharomyces cerevisiae,
które wykazywały oporność na wysokie stężenia jonów kobaltu (2mM) oraz szczep wrażliwy na koncentrację 0.6mM.
Przebadano wpływ różnych stężeń metalu na kinetykę wzrostu tych szczepów w zależności od: składu podłoża
hodowlanego (pełne i minimalne z glukozą, etanolem, glicerolem), temperatury (30oC, 35oC) i pH podłoża (pH3,
pH8). Istotnym problemem było ustalenie ilości kobaltu akumulowanego w komórkach drożdży w zależności od jego
koncentracji w podłożu i warunków hodowli. Analizę tę przeprowadzono metodą absorpcyjnej spektrometrii atomowej
(ASA). Okazało się, że istnieją wyraźne różnice w akumulacji między szczepami opornymi do 2mM. Aby stwierdzić
czy badane szczepy S. cerevisiae akumulują kobalt wewnątrz komórki, czy też ulega on sorpcji w obrębie zewnętrznych
osłon komórkowych dokonano analizy w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM). Uzyskane wyniki korelują
z danymi dotyczącymi stopnia akumulacji tego pierwiastka. Wartość akumulacji kobaltu ustala się na stałym poziomie
przy koncentracji 1mM, jest on wówczas wiązany w obrębie ściany komórkowej. Natomiast w przypadku 2mM stężenia
ilość akumulowanego metalu nie zmienia się. Prawdopodobnie jest on częściowo transportowany do wnętrza komórki
i separowany w wakuoli. Wykonano również badania za pomocą mikroskopu atomowego (AFM) metodą kontaktową.
Wykazały one, że powierzchnia komórki drożdży ulega zmianie w zależności od stężenia kobaltu, a w przypadku
wysokich koncentracji obserwowano wytrącanie się charakterystycznych krystalicznych złogów. Może to być jeden
z systemów obronnych komórki przed toksycznością tego metalu.
216
Genetyka mikroorganizmów
P275.
Wykorzystanie metody PCR do wykrywania inwazji Babesia canis u psów z okolic
Warszawy.
Agnieszka Sobczyk (1), Grzegorz Kotomski (2), Halina Wędrychowicz (2)
(1) Zakład Biologii Ogólnej i Parazytologii Akademii Medycznej, Chałubińskiego 5, 02-004 Warszawa
(2) Zakład Parazytologii Wydziału Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa
Celem pracy było opracowanie testu diagnostycznego opartego o metodę PCR do wykrywania inwazji Babesia canis,
pierwotniaka powodującego babeszjozę, ciężką, nierzadko śmiertelną chorobę psów.
Krew pobrano od 62 psów z okolic Warszawy z podejrzeniem o zarażenie Babesia canis. DNA izolowano przy pomocy
zestawu Blood DNA Prep Plus. Zaprojektowano startery komplementarne do sekwencji regionu konserwowanego,
kodującego podjednostkę 18S rybosomu Babesia canis. W celu zwiększenia specyficzności zastosowano metodę touchdown PCR. Program obejmował następujące etapy: pierwsza denaturacja w temp. 94oC przez 2 min., przyłączanie
starterów w 60oC przez 30 s, elongacja w 72oC przez 30 s. W kolejnych 2 cyklach obniżano temp. przyłączania starterów
o 2oC; następnie 15 cykli zostało przeprowadzonych z przyłączaniem starterów w temp. 54oC (etapy denaturacji
i wydłużania starterów były prowadzone w wyżej opisanych warunkach); w kolejnych 15 cyklach temp. przyłączania
starterów wynosiła 52oC.
Amplifikowane fragmenty trzech reakcji PCR zostały sklonowane w plazmidzie pBluescriptSK+. Zsekwencjonowane
fragmenty miały długość 509 pz i wykazywały duży stopień homologii. Sekwencje umieszczono w Banku Genów pod
numerem akcesyjnym (AY 321119). Analizę porównawczą wykonano przy pomocy programu BLAST. Wykazała ona
przynależność izolatów do podgatunku Babesia canis canis.
Wynik pozytywny uzyskano w 34 przypadkach (częstość zarażenia 54,8%). Czułość metody została określona na
0,00015%. Oznaczono ją poprzez wykonanie PCR z DNA wyizolowanego z kolejnych rozcieńczeń krwi. Wysoka
czułość metody PCR w diagnozowaniu Babesia canis jest niezbędna, gdyż w przypadku nosicielstwa liczba zarażonych
krwinek jest bardzo niska. Utrudnia to wykrywanie inwazji przy pomocy innych metod, w tym powszechnie stosowanej
obserwacji mikroskopowej rozmazów krwi barwionych Giemsą.
P276.
Identification of trichomonadid protozoa from the oral cavity of humans
by PCR-RFLP.
Monika Turkowicz
Akademia Medyczna, Zakład Biologii Ogólnej i Parazytologii, ul. Chałubińskiego 5, 02-004 Warszawa
Objectives. Accurate identification of trichomonads based on conventional techniques is time-consuming and poorly
reliable. Routine diagnostic tests usually depend on microscopic observation of motile flagellates in wet-mount
preparations. Although rapid and inexpensive, the wet mount is not sensitive. The most reliable method of diagnosis is
culture though requires frequent microscopic observation for up to 7 days. None of these methods are sufficient for the
species differentiation. In comparison molecular techniques are highly sensitive and specific, therefore PCR-RFLP was
performed for identification of oral trichomonads in humans.
Materials and methods. 226 humans (144 females and 82 males at the age of 6-76) were examined. Saliva samples were
collected. A pair of primers was designed to amplify ITS regions and 5.8S rRNA gene. The PCR products were digested
with the restriction enzyme DdeI.
Results. 10.2% of humans were positive for oral trichomonads. All PCR products were 368 bp long. The digestion
resulted in 4 restriction fragments: 116, 125, 50 and 77 bp that are characteristic for Trichomonas tenax –the most
frequent trichomonadid protozoa in the oral cavity of humans.
Conclusions. The PCR and RFLP analysis is a rapid, sensitive and reliable method for specific identification of
trichomonads isolated from the human oral cavity. The primers, designed to amplify a fragment characteristic for
Trichomonadidae family, can be used for the detection of different species occuring in humans and animals. The
restriction analysis requires a selection of an appropriate enzyme that would distinguish the trichomonad species.
217
Genetyka mikroorganizmów
P277.
Analiza mutantów drożdży Saccharomyces cerevisiae opornych na podwyższoną
temperaturę.
Zbigniew Kotylak, Małgorzata Kus-Liśkiewicz, Anna Żaczek
Uniwersytet Rzeszowski, Instytut Biotechnologii, Zakład Genetyki i Mikrobiologii, ul. Rejtana 16C, 35-959 Rzeszów
Badania prowadzone są nad szczepami drożdży Saccharomyces cerevisiae izolowanymi z naturalnego środowiska.
Wszystkie szczepy sprawdzano pod względem zdolności do wzrostu w temperaturze wyższej niż optymalna (40
stopni), po czym wybrano tylko te, które wykazywały oporność na podwyższoną temperaturę. Dalsza analiza szczepów
wykazała, że są one prototrofami i poliploidami. Wyizolowano formy haploidalne poprzez kilkukrotną izolację spor.
Po mutagenezie, przeprowadzonej za pomocą promieniowania UV, otrzymano mutanty auksotroficzne, u których
sprawdzono, czy nadal utrzymuje się cecha termooporności. Stwierdzono, że wyizolowane mutanty auksotroficzne
zachowują cechę termooporności, w związku z tym poddano je analizie genetycznej w celu stwierdzenia charakterystyki
determinanty genetycznej. W tym celu krzyżowano je ze szczepem wrażliwym na podwyższoną temperaturę. Analiza
tetrad takiej krzyżówki wykazała, że cecha termooporności segreguje 2:2, ale nie jest cechą stabilną –nie utrzymuje
się przy dalszym pasażowaniu. Wśród tetrad segregujących mendlowsko, pojawiły się takie, które segregowały
w kierunku termowrażliwości. W związku z tym wydaje się, że cecha termooporności jest pod kontrolą wielu genów.
W celu sprawdzenia czy cecha termooporności zależna jest od funkcjonalnego oddychania tlenowego, wyizolowano
ze szczepów termoopornych mutanty rho– i sprawdzono, czy szczepy nadal zachowują tą cechę. Mutanty rho–
otrzymane w wyniku działania bromkiem etydyny nie utraciły termooporności. Wykonano również testy wzrostowe
na podłożu z różnymi źródłami węgla przeprowadzane w temperaturze optymalnej i podwyższonej. Sprawdzono też
termotolerancję badanych mutantów oraz zawartość trehalozy, która jest uważana jako czynnik znoszący negatywne
działanie podwyższonej temperatury.
Doniesienia różne:
Komunikaty plakatowe:
P278.
Interakcje genu CCZ1 kodującego białko wymagane w procesie transportu
wakuolarnego w komórkach drożdży Saccharomyces cerevisiae.
Róża Kucharczyk, Marta Hoffman, Aleksandra Jaszcza, Joanna Rytka
Zakład Genetyki IBB PAN, ul. Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa
Białko Ccz1 jest niezbędne w procesie fuzji pęcherzyków transportowych z wakuolą.
Delecja genu CCZ1 powoduje fragmentację wakuoli, zaburzenia w homeostazie wapniowej, niezdolność do sporulacji
homozygoty ccz1delta/ccz1delta. Poszukiwano supresorów znoszących nadwrażliwość mutantów ccz1delta na
podwyższoną zawartość jonów Ca2+ w podłożu, przywracających sporulację homozygoty, mutacji nieżywotnych
w połączeniu z ccz1delta oraz białek współdziałających z Ccz1p w systemie dwuhybrydowym.
Wykazano genetyczne interakcje CCZ1 z genami PMC1 i PMR1, kodującymi Ca2+ATP-azy, GTP-azami rodziny ras:
YPT7, RHO2, YPT1, ARL1, oraz genami YKT6 i VPS39 kodującymi białka zaangażowane w proces fuzji pęcherzyków
z wakuolą.
218
Genetyka mikroorganizmów
P279.
Aminoestry jako inhibitory H+-ATPazy błony komórkowej drożdży Saccharomyces
cerevisiae.
Ewa Obłąk (1), Tadeusz M. Lachowicz (1), Jacek Łuczyński (2), Stanisław Witek (2)
(1) Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wrocławski, ul. Przybyszewskiego 65/73, 51-148 Wrocław
(2) Instytut Technologii Organicznej i Tworzyw Sztucznych, Politechnika Wrocławska, 51-148 Wrocław
Badaniami objęto grupę estrów alkilowych kwasów a-dimetyloamino tłuszczowych (MEM-n, n-MEM-8s) oraz
N,N-dimetyloalaninian dodecylowy (DMAL-12s) w postaci szczawianów. Testowane związki różniły się długością
hydrofobowego podstawnika alkilowego oraz jego pozycją w cząsteczce estru. Porównywano aktywność biologiczną
w stosunku do komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae w zależności od struktury chemicznej związku. Najbardziej
aktywnymi okazały się związki z podstawnikiem decylowym (MEM-10s) i dodecylowym (DMAL-12s). Związki te
hamują aktywność H+-ATPazy błony komórkowej drożdży, nie działają zaś na ATPazę mitochondrialną, hamują
także pobieranie aminokwasów przez komórki drożdży. Aktywność biologiczna aminoestrów zależy również od pH
środowiska (pH 8 bardziej uwrażliwia drożdże na te aminoestry niż pH 6) i od kompetencji oddechowych (formy rhoo
są bardziej wrażliwe niż rho+).
219
Notatki
220
Notatki
221
Notatki
222
Notatki
223
Notatki
224
Notatki
225
Notatki
226
Notatki
227
Notatki
228
Notatki
229
Notatki
230
Suplement
Integrating DORNRÖSCHEN into Arabidopsis shoot meristem function
Wolfgang Werr
Departament of Developmental Biology, University of Cologne, Germany
The dominant DORNRÖSCHEN(drn-1d) mutant was identified in an activation tagging approach and is due to the
ectopic expression of an AP2/ERF-type transcription factor. Overexpression of DRN causes a complete reorganisation of
the shoot apical meristem (SAM), which ultimately leads to meristem arrest. Genetically, manifestation of the dominant
drn-1d phenotype is independent of the SHOOT MERISTEMLESS (STM), WUSCHEL (WUS) or CLAVATA (CLV)
pathways. In wildtype the DRN expression domain is confined to the L1 layer at the apical tip of the SAM, and detected
in primordia anlagen. However, in the mutant drn-1d SAM DRN,WUS and CLV3 are coexpressed in a large central
domain of the enlarged meristem, whereas STM is mutually excluded from this central domain. Different experimental
approaches to integrate DRN into SAM function will be discussed, which include the loss of function phenotype, protein
interaction partners and a potential connection to auxin signalling.
Geny cech ilościowych (QTLs) u zwierząt gospodarskich
Jolanta Kurył
Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN, Jastrzębiec
Wartość cechy ilościowej jest wynikiem oddziaływania wielu genów (QTLs - quantitative trait loci) oraz wpływu
środowiska. Aktualnie istnieją dwie strategie identyfikacji QTLs. Pierwsza, to mapowanie genów potencjalnie
kształtujących daną cechę, z wykorzystaniem odpowiednio skonstruowanych, kilkupokoleniowych rodzin referencyjnych
lub populacji zwierząt. Druga, to selekcja genów kandydujących (candidate genes) , które z racji ich udziału w przebiegu
odpowiednich szlaków metabolicznych lub procesów fizjologicznych związanych z daną cechą, są uznane za potencjalnie
ją kształtujące. Obydwie strategie oparte są na statystycznej ocenie istotności zależności (sprzężenia) między wartością
cechy ilościowej a określonym wariantem analizowanego genu. W odniesieniu do zwierząt gospodarskich, badania
koncentrują się głównie na poszukiwaniu genów kształtujących tempo wzrostu, rozwój tkanki mięśniowej, odkładanie
tkanki tłuszczowej w tuszy, wydajność w produkcji mleka i jego skład, efektywność reprodukcji, zdrowotność. Programy
mapowania genomu zwierząt gospodarskich i poszukiwania QTLs uruchomiono z początkiem lat 90-tych. Umożliwiły
one konstrukcję map genomu świni, bydła, owcy, konia, kury oraz pozwoliły zlokalizować rejony genomów potencjalnie
zawierające QTLs kształtujące szereg cech ilościowych. Analiza porównawcza tych map z mapą genomu człowieka czy
myszy umożliwiła identyfikację szeregu genów warunkujących cechy istotne dla zdrowia zwierząt i ich produkcyjności.
Między innymi zidentyfikowano mutacje genowe warunkujące: hipertrofię mięśni u bydła (gen miostatyny), podwyższony
poziom glikogenu w mięśniach szkieletowych świń (gen podjednostki gamma kinazy białkowej AMP-zależnej), oporność
prosiąt na biegunki wywołane infekcją Escherichia coli [gen α (1,2)fukozyltransferazy] oraz kształtujące zawartość białka
i tłuszczu w mleku (gen acyl-CoA:diacylglicerol acyltransferazy 1), czy fizyko-chemiczne parametry jakości mięsa
wieprzowego (gen receptora ryanodiny, gen kalpastatyny). Badania te umożliwiają nie tylkpoznanie genetycznych
uwarunkowań wielu cech istotnych dla hodowli zwierząt, ale mogą również służyć jako modelowe dla rozpoznania
uwarunkowań niektórych schorzeń metabolicznych człowieka.
Suplement
Diagnostyka genetyczna Toxoplasma gondii.
Adam Master (1), Karolina Świtaj (2), Magdalena Skrzypczak (1),, Piotr Zaborowski (2),
Andrzej Płucienniczak (1)
(1) Instytut Badań DNA,
(2) Klinika Chorób Odzwierzęcych i Tropikalnych Instytutu Chorób Zakaźnych i Pasożytniczych Akademii Medycznej
w Warszawie
Toksoplazmoza jest chorobą wywoływaną przez pierwotniaka Toxoplasma gondii, bezwzględnego pasożyta
wewnątrzkomórkowego powszechnie zarażającego wiele ssaków w tym ludzi. W Polsce zarażeni stanowią ponad
59% populacji, a każdego roku odnotowuje się 200-400 przypadków toksoplazmozy wrodzonej. Ustalenie właściwego
rozpoznania choroby utrudnia jej skąpo- lub bezobjawowy przebieg i wymaga wykonania wielu badań diagnostycznych,
które mają znaczące ograniczenia. Jak dotąd nie ma wystandaryzowanej procedury szybkiego i pewnego wykrywania
zarażeń Toxoplasma gondii. Autorzy niniejszego doniesienia prezentują metodę genetycznej diagnostyki zarażeń poprzez
wykrywanie i analizę DNA pasożyta izolowanego bezpośrednio z krwi pacjenta. W badaniach zastosowano techniką PCR
w połączeniu z elektroforezą kapilarną i laserową detekcją fluorescencji. Identyfikacja pasożyta oparta jest na wykrywaniu
sekwencji wielokopijnych genów B1 (35 kopii/genom) oraz 529 bp (200-300 kopii/genom), wysoce specyficznych dla
Toxoplasma gondii. Szczegółowa charakterystyka pasożyta bazuje na analizie genetycznej fragmentów genu GRA6,
HSP70 oraz wybranych sekwencji STR, wykazujących polimorfizm determinujący przynależność do określonego
szczepu. Metodę przetestowano na próbkach kontrolnych: zawiesiny płynu otrzewnowego pobranego od myszy
zarażonych szczepem RH Toxoplasma gondii (kontrola pozytywna) oraz wymazu z jamy ustnej niemowlęcia, u którego
matki nie stwierdzono obecności przeciwciał przeciwko pasożytowi (kontrola negatywna). W kontroli pozytywnej
wykryto produkty specyficzne dla sekwencji B1 oraz 529 bp o oczekiwanej długości, natomiast analiza produktów
PCR ze starterami specyficznymi dla GRA6 i HSP70 wykazała obecność fragmentów o długości charakterystycznej dla
szczepu RH. W próbce kontroli negatywnej nie wykryto żadnych produktów PCR. Wstępne badania próbek pełnej krwi
obwodowej pacjentów, u których toksoplazmozę podejrzewano lub stwierdzono w oparciu o testy immunologiczne
wykazały obecność DNA pasożyta. Uzyskane wyniki świadczą o przydatności metody do wczesnej, szybkiej, swoistej,
czułej i jednoznacznej diagnostyki zarażeń wywoływanych przez Toxoplasma gondii i jej potencjalnym szerokim
zastosowaniu w medycynie i weterynarii nie tylko w zwalczaniu, ale i badaniach przesiewowych.
Uszkodzenie genu BCL11B w wyniku INV(14)(q11.2q32.31) prowadzi do ekspresji
transkryptu fuzyjnego BCL11B-TCRD i jest związane z brakiem prawidłowego
transkryptu genu BCL11B.
Grzegorz K. Przybylski (1, 2), Willem A. Dik (3), Jens Wanzeck (2), Piotr Grabarczyk (2), Stine Majunke (2),
Jose I. Martin-Subero (4), Reiner Siebert (4), Gottfried Dölken (2), Wolf-Dieter Ludwig (5), Brenda Verhaaf ‡,
Jacques J. M van Dongen (3), Christian A. Schmidt (2) and Anton W. Langerak (3)
(1) Instytut Genetyki Człowieka, PAN, Poznan
(2) Klinik für Innere Medizin C, Universität Greifswald, Greifswald, Niemcy
(3) Department of Immunology, Erasmus MC, University Medical Center, Rotterdam, Holandia
(4) Institute of Human Genetics, University Hospital Schleswig-Holstein, Campus Kiel, Niemcy
(5) Robert-Rössle-Clinic, HELIOS Clinic Berlin-Buch, Charité, Niemcy
Ostra białaczka limfatyczna z limfocytów T (T-ALL) jest związana z występowaniem aberracji chromosomalnych
charakteryzujących się przyłączeniem proto-onkogenów do genów receptora limfocytów T (TCR), prowadzących do
zaburzenia transkrypcji zaangażowanych proto-onkogenów. W tej pracy przedstawiamy molekularną charakteryzację
nowej aberracji chromosomalnej, inv(14)(q11.2q32.31), w T-ALL, z udziałem opisanego ostatnio genu BCL11B
i genu TCRD. W wyniku inwersji doszło do połączenia części 5’ BCL11B, zawierającej egzony 1-3, z segmentem
TRDD3, oraz segmentu TRDV1 z czwartym egzonem BCL11B. Region połączenia segmentów TRDV1-BCL11B,
o długości 1344 pz, zawierał fragmenty z chromosomów 20q11.22, 3p21.33 i 11p12, wskazując na złożony charakter
aberracji. Zaobserwowano silną ekspresję, zgodnego z ramką odczytu transkryptu fuzyjnego części 5’ genu BCL11B
i stałego regionu genu TCRD (TRDC). W odróżnieniu od prawidłowych limfocytów T i innych przypadków T-ALL,
w opisywanej próbce nie wykryto ekspresji dzikiego genu BCL11B. Ponieważ gen BCL11B wydaje się odgrywać
ważną rolę w różnicowaniu komórek T, uszkodzenie BCL11B i jego zaburzona ekspresja mogą mieć udział w rozwoju
nowotworów z komórek T u ludzi.
232
Suplement
Ekspresja genu Dhn24 kodującego białko dehydrynowe 24 kDa u Solanum
sogarandinum jest specyficznie indukowana pod wpływem chłodu
Tadeusz Rorat, Bartosz Szabała, Zhimin Yin
Instytut Genetyki Roślin PAN, Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań
Z dzikiego nieuprawnego gatunku Solanum (S. sogarandinum), odpornego na mróz wyizolowaliśmy trzy geny, Dhn10,
Dhn15 i Dhn24 kodujące różne białka dehydrynowe. Poziom ich ekspresji wzrastał w odpowiedzi na chłód zarówno
na poziomie transkryptów jak i kodowanych białek. W warunkach niestresowych poziom ekspresji genu Dhn10,
kodującego dehydrynę DHN10 był zależny od organu rośliny. U dwu-tygodniowych pędów najwyższy poziom białka
obserwowano w części apikalnej pędu i w łodydze, a najniższy w liściach. U roślin poddanych działaniu chłodu wzrost
poziomu DHN10 obserwowano tylko w dojrzałych, nie obserwowano natomiast wzrostu poziomu białka DHN10
pod wpływem stresu w części apikalnej pędu, w liściach starszych oraz w korzeniach. Zwiększenie poziomu białka
DHN10 w dojrzałych liściach następowało także pod wpływem suszy (Rorat 2004). Drugi gen, Dhn24, kodujący białko
dehydrynowe DHN24 ulegał ekspresji w warunkach niestresowych we wszystkich organach pędów ziemniaka; przy
czym najwyższy poziom białka obserwowano w części apikalnej pędów, korzeniach i łodydze. Analiza aktywności
transkrypcyjnej promotora genu Dhn24 z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazała, że jego ekspresja zachodzi
w sitach wiązek przewodzących organów ziemniaka. Pod wpływem chłodu następuje zwiększenie poziomu ekspresji
genu Dhn24 we wszystkich organach pędów, ale najwyższy wzrost poziomu białka DHN24 obserwuje się w łodygach
i części apikalnej pędów. Pod wpływem suszy, za wyjątkiem części apikalnej pędów następuje obniżenie poziomu
ekspresji genu Dhn24 we wszystkich organach. Ponadto, ekspresja genu Dhn24 nie ulega zmianom pod wpływem
stresów osmotycznych (Rorat 2004, dane niepublikowane). W przeciwieństwie do genów Dhn10 i Dhn24, zwiększona
ekspresja genu Dhn15 następowała tylko pod wpływem ABA i stresów osmotycznych.
Wyniki te wyraźnie wskazują, że w warunkach stresowych zwiększona ekspresja genu Dhn24 ma miejsce tylko
w odpowiedzi na chłód. W związku z tym, gen Dhn24 może być zaangażowany w procesy prowadzące do zwiększenia
tolerancji ziemniaka na niskie temperatury.
Badanie przyczyn różnej ekspresji wrodzonej łamliwości kości typu I w rodzinie
Anna Galicka, Andrzej Gindzieński
Zakład Chemii Medycznej, Akademia Medyczna, Białystok
Wrodzona łamliwość kości (osteogenesis imperfecta, OI) jest autosomalną dominującą chorobą tkanki łącznej. Na
podstawie klinicznych, genetycznych i radiograficznych cech wyodrębniono 7 typów choroby (I-VII). W większości
przypadków choroba spowodowana jest mutacją w genach kodujących kolagen typu I. Mutacje mogą prowadzić
do zmniejszonej ilości syntezowanego kolagenu i/lub syntezy kolagenu o nieprawidłowej strukturze, co w efekcie
dramatycznie zaburza strukturę kostną. Charakterystyczną cechą OI jest różnorodna ekspresja choroby u osób z tym
samym defektem genetycznym. Celem naszych badań były próby znalezienia czynników, które mogłyby być przynajmniej
częściowo odpowiedzialne za przyczynę tego zjawiska u 10-letniej dziewczynki i jej
45-letniego ojca z najłagodniejszym typem I choroby. U ojca wystąpiły 2 złamania kompresyjne kręgów lędźwiowych
i prowadzi on aktywny tryb życia, natomiast dziewczynka była wielokrotnie hospitalizowana z powodu złamań kości
udowych. Fibroblasty skórne w hodowli komórkowej syntetyzowały prawidłowy kolagen w zredukowanej ilości, z tym
że ilość kolagenu w fibroblastach dziewczynki była zredukowana o 25% więcej niż w fibroblastach ojca. Wiadomo, iż
ważną rolę w regulacji biosyntezy kolagenu odgrywa prolidaza (EC 3.4.13.9) odpowiedzialna za resyntezę kolagenu
z produktów degradacji białek, zawierających L-prolinę. W regulacji enzymu, jak również metabolizmu kolagenu biorą
udział integryny i receptory wiążące IGF-I (IGFR).
W fibroblastach dziewczynki o cięższym przebiegu choroby stwierdzono znacznie większe obniżenie aktywności
prolidazy i ekspresji receptorów (ß-1 integryny i IGFR) niż w fibroblastach ojca i fibroblastach kontrolnych. Na
podstawie uzyskanych wyników można sądzić, iż oprócz poznanych czynników genetycznych, u chorych z OI mogą
wystąpić zaburzenia aktywności i ekspresji czynników biorących udział w regulacji metabolizmu kolagenu, co może
przyczynić się do różnego przebiegu choroby u osób z tym samym defektem genetycznym.
233
Suplement
Genotyping of candidate SNPs by APEX microarray technology
Kamiński S.(1), Ahman A. (2), Ruść A. (1), Wójcik E. (1), Malewski T. (3), Brym P. (1)
(1) University of Warmia and Mazury, Olsztyn, Poland
(2) AsperBiotech Ltd, Tartu, Estonia
(3) Institute of Genetics and Animal Breeding, Jastrzębiec, Poland
Many reports suggust that milk protein content is a polygenic trait determined by milk protein genes and other putative
loci dispersed in the cattle genome. Identification of those loci is a subject of whole genome scanning by microsatellite
genotyping and positional cloning. Alternative appoach is SNP genotyping in candidate genes. Among more than
300 preselected bovine SNPs (database “SNPs for MILKPROT”, http://matman.uwm.edu. pl/~snp), 81 bovine SNPs
within 43 loci were selected representing most of known genes directly or potentially associated with milk protein
biosynthesis. 77 SNPs were suceessully optimised in 34 singleplex and 13 multiplex PCRs. PCR products were then
genotyped in microarray platform based on APEX method (Arrayed Primer Extention). 12 Polish Holstein bulls,
1 Polish Red bull, 1 bison (Bos bonasus), 11 Jersey cows, 25 Polish Holstein were screened to validate 77 SNPs. 30 SNPs
were found with no variation, 13 SNP showed two genotypes, and remaing 34 - three genotypes for entire population
under study. Finally, 14 most promising SNPs were chosen to genotype 5 sib-families of heterozygous Polish Holstein
bulls. Statistical analysis is underway. We expect to found SNPs or the combination of SNPs associated with the milk
performance traits. The results may be used in Marker Assisted Selection in dairy cattle.
234
Notatki
235
Notatki
236
Skorowidz nazwisk
Skorowidz nazwisk
A
Adamczak Małgorzata 186
Adamowicz Tatiana 139, 150
Adamowicz-Salach Anna 119
Adamska Elżbieta 183
Adamski Ryszard 216
Adamski Tadeusz 181 180
Adamus Adela 174, 176
Agnieszka Pollak 39
Ahman A. 234
Aigare Diana 117
Al-Amawi T. 103
Alina Warenik-Szymankiewicz Alina 84
Ałaszewski Wojciech 55, 75
Antosik Paweł 150
Apolinarska Barbara 182
Arabski Michał 89
Augiewicz Jolanta 183
Augustynowicz-Kopeć E. 213
Augustynowicz-Kopeć Ewa 213, 216
Auguściak Aleksandra 94
B
Ba Grażyna 161
Babicz Mariusz 51, 118
Babula Danuta 172
Badura Magdalena 25, 41, 60
Bal J. 32, 52
Bal Jerzy 16, 22,23, 23, 65, 99
Balcerska A. 47
Balcerzak A. 116
Balcerzyk Anna 80, 86
Balwierz W. 47
Banaszak Joanna 205, 206
Banaszkiewicz A. 103
Banecka-Majkutewicz Zyta 56
Banecki Bogdan 56
Banek-Tabor Aneta 170, 171
Barcikowska Maria 19, 20
Barciszewska Anna-Maria 24
Barciszewska Mirosława Z. 24
Barciszewski Jan 24
Barczyk A. 36
Bartkowiak-Broda Iwona 183
Bartnik Ewa 46, 60
Bartoszewski Grzegorz 160
Bartsch Detlef K. 108
Bartusiak K. 35
Barwiński Bogdan 216
Bąbol Katarzyna 39
Bączkiewicz Alina 184, 187
Bączkowski Krystian 207
Bąk Daniel 18, 40
Bednarczyk Marek 143
Bednarek Jarosław 125
Benedycka Aleksandra 135
Berbeć Henryk 114
Bernaczyk Andrzej 104
Bębenek M. 93
Białecka Magdalena 67
Bianchi Michele 195
Bidzińska Bożena 85
Biedziak Barbara 83, 119
Bieganowska K. 79
Biegański Tadeusz 73
Bielecka-Grzela S. 105
Bielecki Piotr 192
Bielicka-Cymermann Jolanta 69
Bien-Willner Gabriel 33
Bierła Joanna 82
Bierwagen M. 96
Bierzyńska-Macyszyn Grażyna 104
Bik-Multanowski Mirosław 87
Binka-Kowalska Aleksandra 96, 109, 120
Bitina Marianna 117
Blin Maria Nikolaus 100
Blin Nikolaus 99
Blitek Aleksander 46
Błasiak Janusz 39, 48, 89, 90
Błaszczak Wioletta 181
Błaszczyk Alina 89
Błaszkowska Joanna 91
Błezowska Maria 216
Bobowicz Maria Anna 182
Bocian Ewa 32, 34, 59
Bocianowski Jan 171, 181
Boczkowska Maja 173
Bodalski J. 47
Boehm-Steuer Barbara 104
Boespflug-Tanguy Odile 29
Bogdanowicz J. 33
Bogdanowicz Joanna 50
Boguś Mieczysława I. 214
Boguta Magdalena 199, 201
Bojarcyuk Jaroslaw 188
Bojarojć-Nosowicz Barbara 131
Bojarski Łukasz 215
Bojczuk Barbara 130
Bolobok Hanna 173
Bongarc Emilia 131
Boniewska Ewa 192
237
Skorowidz nazwisk
Borg A. 115
Borg K. 34
Borkowska Edyta 30, 96, 109, 120
Borkowski Krzysztof 114
Borodynko Natasza 209
Borosenko Viktors 117
Borowicz K. 129
Borowski Dariusz 55
Borowski J. 54
Borucka-Mankiewicz M. 3, 15, 38, 47, 79
Boruszewska Kinga 145
Bratkowska Wanda 48, 91
Bresińska Anna 155
Bręborowicz Andrzej 120
Brożek I. 37, 115, 116
Brożek Izabela 76
Brycz-Witkowska Joanna 70
Brym P. 234
Brzosko M. 103
Brzywczy Jerzy 196
Bubała H. 47
Buczkowska Katarzyna 187
Budny Bartłomiej 25
Budny Marta 137
Bujak Henryk 186
Bury Katarzyna 201
Burza Wojciech 164
Burzyńsk Artur 127
Burzyńska Beata 119
Burzyński Artur 128, 140
Busza H. 35
Busza Halina 67
Byrski Tomasz 93, 106, 107
C
Całusińska M. 207, 208
Cassiman Jean-Jacques 76
Cavalli Antonella 195
Cebrat Stanisław 189, 205, 206, 207
Cegielska-Taras Teresa 183
Centkowski Piotr 119
Cettler Sylwia 75
Chelly Jamel 16
Chełkowski Jerzy 166
Chełstowska Anna 195
Chen W. 25
Chęć Ewa 193
Chilarska Tatiana 62, 64, 72,73
Chlubek Dariusz 19
Chmara Magdalena 31, 37
Chmielewska Beata 175
Chmielnicka Ewa 131
Chmurzyńska Agata 127, 138
Choim Marcin 123
Chojnacki Jan 89
Chołbiński Piotr 200
Chosia Maria 105, 115
Chrzanowska Krystyna 9, 15, 16, 47, 74
238
Chrzanowska Krystyna H. 47
Chrząstek Maria 163
Chudzińska Ewa 179, 187
Chumakov Sergei 210
Chybicka A. 47
Ciara Elżbieta 8,15, 38, 47, 79
Cichoń Tomasz 147, 149
Cieśla Małgorzata 199
Cieśliński Andrzej 79
Cisowski Jarosław 143
Combik Michał 174
Constantinou Maria 70, 96, 109, 120
Constanzo Giovanna 195
Creveaux Isabelle 29
Cutting Garry 18, 36
Cybulski Cezary 32, 93, 102, 104, 105, 106, 107
Czajka R. 107
Czartoryska Barbara 8
Czemarmazowicz Halina 35, 67
Czerska Kamila 40, 52
Czerski Piotr 81, 83
Czerwiecka M. 74
Czerwionka-Szaflarska M. 41
Czuczwar S. 129
Czudowska D. 93
Czyż Agata 191
Czyżewska J. 33, 50
D
Dansonka-Mieszkowska Agnieszka 94, 108
Dawidowska Małgorzata 113
Dawydzik B. 32
Dąbrowski Andrzej 114
Delić Klaudia 147
Demissie Marek 85
Demkow Tomasz 101
Dettlaff-Pokora Agnieszka 97
Dębiec-Rychter Maria 115
Dębniak B. 105
Dębniak J. 116
Dębniak Tadeusz 93, 102, 103, 104, 105, 106, 107
Dębski R. 33
Dębski Robert 111
Diehl S. R. 55
Dik Willem A. 232
Dinkler Katarzyna
Dinkler Katarzyna 91, 92
Dmitrzak-Węglarz Monika 81, 83
Dmochowska Marta 209
Dmoszyńska-Graniczka Magdalena 114
Dmowski Rafał 51, 117
Dobosz Tadeusz 85
Dobrowolska Anita 215
Dobrzyńska Małgorzata 146, 149
Dolf G. 138
Dölken Gottfried 232
Dołowy Krzysztof 36
Domagała Alina 121
Skorowidz nazwisk
Domagała Wenancjusz 102
Domińska Kamila 92
Dongen Jacques J. M van 232
Dorynek Zbigniew 130, 151
Drac Hanna 17, 22, 28
Drela Nadzieja 211
Drozd Arleta 163
Druszczyńska M. 45
Druszczyńska Magdalena 44
Drzewoski Józef 39, 48, 89
Dubrawska Martyna 94
Dudarewicz Lech 44, 54
Dudek Mirosław R. 189, 205, 206, 207
Dudkiewicz Małgorzata 205, 206
Dulak Józef 11, 143
Duszenko Ewa 43, 74, 75, 111, 114
Dworniak Daniela 48
Dyrek Isabelle Alice 66
Dziadek Jarosław 192, 210
Dziedziejko Violetta 19
Dziedzina Sylwia 80
Dziuba Agnieszka 146
E
Emerich J. 115
Empel Joanna 17
F
Fagiewicz Katarzyna 179
Feder Anna 153
Ferenc Tomasz 48, 91
Fidziańska Elżbieta 25
Figarski Adam 109
Filipecki Marcin 176
Filipek Sławomir 20
Filipowicz Monika 140
Filipowska Anita 30
Firasiewicz Sylwia 215
Fiszer Dorota 121
Fiszer-Maliszewska Ł. 93
Flicinski J. 103
Flisikowski Krzysztof 135, 139, 148
Florczak Jolanta 24
Fofanov Yuriy 205, 210
Fornal Józef 181
Frąckowiak Hieronim 150
Frontali Laura 195
G
Gabriel Marcin 84
Gacia Magda 19
Gadomski A. 47
Gajdulewicz M. 9, 15, 47, 74
Gajewska E. 41
Gajewska M. 123
Gajewska Marta 152
Galek Renata 183, 185, 186
Galicka Anna 233
Gardovskis Andris 117
Gardovskis Janis 116
Garwoliński J. 33
Gawłowicz J. 129
Gaworczyk Anna 47, 51, 118
Gawrońska Iwona 24
Gawrońska-Szklarz Barbara 88
Gąsior Artur 212
Geremek Maciej 54, 55
Gielicz Anna 80
Gieruszczak-Bialek Dorota 61, 62, 69, 70
Gil Justyna 66
Gindzieński Andrzej 233
Giżewska Maria 63
Glazar Renata 25, 32, 61
Glaze Daniel 31
Gliniewicz B.
Gliniewicz B. 106, 107
Gloser C. 47
Gładkowska-Dura M. 47
Gładysz Karol 168
Głażewska K. 113
Głowacka J. 207, 208
Głowacka Katarzyna 180
Głuszek Jerzy 87
Głuszkiewicz E. 59
Gmur A. 138
Godlewska Renata 211
Golan Maciej 20
Golec Piotr 192
Golusiński Paweł 112
Goluszko P. 205
Gołas Aniela 152
Gołąbek Bożena 60
Gołka Dariusz 94
Gontarz Aldona 156
Gorski B. 107
Gorski Bohdan 117
Goryluk-Kozakiewicz Bożenna 71, 74
Gos Monika 101, 102
Górecka Aleksandra 153
Górniak Magdalena 89
Górnicka-Michalska Ewa 136
Górska D. 213
Górski Bohdan 93, 104, 105, 106, 107
Góżdź S. 93
Grabarczyk Piotr 232
Grabek-Gawłowicz Małgorzata 129
Grabowska Dorota 195
Grabowska Ewa 102, 104
Gremida M. 51
Grochowalska R. 192
Gromadka Robert 197
Gronwald Jacek 93, 104, 107
Grudniak Anna M. 204
Grygalewicz Beata 95
Grygielska Beata 121
Grynberg Marcin 197
Grynkiewicz Grzegorz 30
239
Skorowidz nazwisk
Grządka Małgorzata 216
Grzebelus Dariusz 174
Grzesik Helena 178
Grzmil Paweł 146, 152
Grzybowska E. 93
Grzybowski Grzegorz 130
Grzybowski Tomasz 125, 136
Gutkowska Anna 62, 67, 71, 74
Gwizdek-Wiśniewska Anna 191
H
Hahn Stephan A. 108
Hansmann I. 47
Hart-Van Tassell Audrey 205, 210
Haus Olga 42, 43, 68, 75, 93, 111, 112, 114
Hauser Joanna
Hauser Joanna 81, 83
Hausmanowa-Petrusewicz Irena 17, 21, 22
Havey M. J. 160
Hawuła Wanda 55, 62, 64, 72, 75
Hejduk A.196
Helias-Rodzewicz Z. 59
Helszer Zofia 27, 30, 36
Hertmanowska Hanna 27
Heubner Angela 46
Hilczer Maciej 64
Hinc Krzysztof 203
Hiszczyńska-Sawicka Elżbieta 212
Hnatuszko Katarzyna 63, 168, 169
Hoeltzenbein M. 16, 25
Hoffman Marta 218
Hoffman-Zacharska Dorota 17, 19
Hofman Karolina 162, 167
Holec Lucyna 212
Holweg Marta 118
Hoon K. 32
Horbańczuk Jarosław O. 145
Horz M. 31
Hubert E. 68
Huguet Thierry 174
Humphreys Mike W. 172
Huzarski Tomasz 93, 106, 107
I
Iliszko M. 63
Iliszko Mariola 115
Ilnicka A. 33, 50
Inoue Ken 41
Irmejs Arvids 117
Iwanicki Adam 203, 204
Iwańczak Franciszek 46
Iwona Płowaś 30
J
Jabłońska-Skwiecińska Ewa 119
Jaciubek Miłosława 160, 171
Jaczyńska Renata 65
Jagodziński Paweł P. 120
Jagusztyn-Krynicka Elżbieta K. 211
Jakóbczyk Małgorzata 101
240
Jakóbkiewicz-Banecka Joanna 30, 56
Jakubiuk-Tomaszuk Anna 68
Jakubowicz M. 172
Jakubowska Anna 93, 102, 103, 104, 106, 107
Jakubowski Lucjusz 44, 55, 63, 64, 72, 73, 75
Jalal Syed M. 33
James A. 32
Jamrich M. 26
Jamroz Ewa 29
Janaszak Anna 193
Janczarek Monika 194
Janiak Agnieszka 175
Janiak Katarzyna 55
Janiec-Jankowska A. 94
Janik P. 102
Janik Przemysław 101
Janiszewska Hanna 93, 112
Jankowska Agnieszka 164, 201
Januchowski Radosław 120
Janus Krzysztofa 213, 216
Januszkiewicz-Lewandowska Danuta 27, 53, 95, 110
Jaowiec I. 32
Jarmołowski Artur 159, 179
Jarocki P. 96
Jaruzelska Jadwiga 82
Jasiecki Jacek 193
Jaszcza Aleksandra 218
Jaszczak Kazimierz 125, 153, 214
Jaśkowska Marta 201
Jaśkowski Jędrzej M. 150
Jauch Anna 104
Jawien A. 103
Jaworski Adam 189, 213
Jaworski Albert 213, 216
Jazowiecka Joanna 128
Jelska Anna 42, 75
Jezela-Stanek Aleksandra 9, 59
Jezierski Tadeusz 153
Jeziorowska Anna 64
Jeżowski Stanisław 180, 181
Jędrzejczak Piotr 82, 120
Jędrzejowska Maria 22
Jończyk Magdalena 209
Jółkowska J. 113
Józkowicz Alicja 143
Julkowska Daria 203
Juraszek Anetta 75
Jurkiewicz D. 15, 38, 79
Jurkiewicz Dorota 47
Jurkowska Monika 99
Juszczuk-Kubiak E. 129
K
Kabzińska Dagmara 17, 20, 21, 22, 28
Kaczanowski Radosław 108
Kaczmarczyk Ewa 131
Kaczmarek Anna 169
Kaczmarek M. 172
Skorowidz nazwisk
Kaczmarek Z. 181
Kaczor Marcin 40
Kadziński Leszek 56
Kajor Maciej 28, 94
Kalinowska Urszula 91, 92
Kalińska Honorata 185
Kalita Michał 209
Kalscheuer V. M. 16, 25
Kałużewski Bogdan 27, 30, 36, 70, 96, 109, 120
Kamerys Juliusz 48
Kamińska Anna 69
Kamiński S. 234
Kanka Celina 190
Kapellerova A. 5
Kapelski Paweł 81
Kapusta Józef 162
Karcz Jagna 175
Karczmarewicz Elżbieta 28
Karhukorpi J. 44, 45
Karkusiewicz Iwona 197
Karttunen R. 44, 45
Kasprzak H. 96
Kasprzak Maria 89
Kasznicki Jacek 39, 48
Kaszuba Aleksandra 215
Kawalec W. 74
Kawka Magdalena 145
Kawulak Marta 21
Kayademir Tuncay 100
Kazanowska B. 47
Kaźmierczak Paweł 89
Kądziołka Bartosz 23
Kempisty Bartosz 84, 137
Kennerson Marina 21
Kędzierska Anna 214
Khoshnevisan M. 55
Kielkowska Agnieszka 176
Kiełbasiewicz-Binikowska Jolanta 62
Kiełbowicz-Matuk Agnieszka 162, 167
Kijewska Agnieszka 128
Kijewski Tomasz 141
Kilar E. 93
Klapecki Jakub 65
Klatt M. 213
Klein Maria 168
Klimek Beata 6
Klimiuk M. 113
Klimuszko Danuta 201
Kloska Anna 56
Klukowska A. 44
Klukowska J. 138
Klupińska Grażyna 89
Kładny Józef 102, 103, 105
Kłoczko J. 113
Kmieć Marek 124, 132, 133, 134, 135, 140
Kobiela Jarosław 109
Kobryś Małgorzata 19
Kobus Kazimierz 35, 119
Koc J. 93
Kochański Andrzej 17, 20, 21, 22, 28
Kolasa Iwona 94
Kolasińska Irena 184
Kołodziej Łukasz 72
Kołodziejczyk Dorota 154, 156
Kołowska Jolanta 16, 61
Komarnicki M. 116
Komisarek Jolanta 130, 151
Konarska Zofia 70
Kononowicz Andrzej K. 168, 169
Konopa Grażyna 193
Konopka B. 94
Kontek Renata 91, 92
Kopen Gene C. 94
Kopiński P. 96
Kopyta Ilona 29
Korcz Aleksandra 84
Korczak Małgorzata 125
Kordek Radzisaw 104
Korniszewski Lech 39, 49, 51, 61, 62, 68, 69, 70
Korzon M. 47
Kosmala Arkadiusz 172
Kostrzak Anna 162
Kostyk Ewa 32, 59
Kostyrko Andrzej 26
Kościelak Jerzy 44, 97, 119
Kotecki Maciej 82
Kotlarz Agnieszka 82
Kotomski Grzegorz 217
Kotylak Zbigniew 216, 218
Kowalczuk Maria 205, 206, 207
Kowalczyk J. 47
Kowalczyk Jerzy R. 51, 93, 118
Kowalczyk Krzysztof 198
Kowalczyk Magdalena Ewa 161, 166
Kowalewska Inga 132, 133, 134, 135
Kowalska Anna 18, 24
Kowalska E. 93, 107
Kowalska Elżbieta 102
Kowalska Magdalena 214
Kowalski Andrzej 136
Kowalski P. 15, 38, 47, 79
Kozacki Leon 179
Kozakiewicz-Goryluk B. 9
Kozak-Klonowska B. 68
Kozarzewski Marek 75
Kozera Adrianna 137
Koziarski A. 103
Kozlowski M. 103
Kozłowska Anna 120
Kozłowska J. 35
Kozłowska Magdalena 55
Kozłowska Magdalena 75
Kozłowski Wojciech 104
Kozubski Wojciech 18, 24
241
Skorowidz nazwisk
Krajewska-Walasek Małgorzata 8, 15, 38, 47, 59, 62, 67,
71, 74, 79
Krajewski Paweł 171, 180
Krauze Jolanta 80, 86
Krauze Jolanta 86
Krawczuk-Rybak M. 47
Krawczyński Maciej 25, 41
Krawczyński Maciej R. 37
Krawiecka Dorota 216
Kroll Renata 116
Krótka Krystyna 183
Kruczek A. 32, 34
Krull Kevin 31
Krysa Wioletta 19
Krystkowiak K. 181
Krzakowa Maria 179
Krzewski Konrad 82
Krzymińska Anna 64
Krzyśko Krystiana 20
Kubalska J. 31, 33, 37
Kuber Krzysztof 131
Kucharczyk Krzysztof 108
Kucharczyk Róża 218
Kucinskas V. 68
Kuczyńska A. 181
Kuczyńska-Wiśnik Dorota 194, 198
Kuć Dominik 165
Kujawa Alicja 64
Kulczycki Jerzy 20
Kulecka Alicja 13
Kulig Hanna 132, 133, 135
Kulma Magdalena 194
Kupryjańczyk Jolanta 94, 108
Kur Józef 201, 212
Kurlandzka Anna 191
Kurpisz Maciej 121
Kurylak Danuta 74
Kurył Jolanta 124, 148, 231
Kurzawski Grzegorz 102, 103, 105, 106, 107, 117
Kus-Liśkiewicz Małgorzata 218
Kusz Kamila 82
Kutkowska-Kaźmierczak Anna 34, 59, 65
Kutner Jan 199
Kuźmicz M. 47
Kuźnicki Jacek 20
Kwapisz Marta 200
Kwaśniewski Mirosław 175
Kwiatkowska Joanna 194
L
Lach Joanna 30
Lachowicz Tadeusz M. 192, 219
Lampkowska Joanna 211
Lange Agata 71, 73
Langer S. 49
Langerak Anton W. 232
Laskowska Ewa 194, 198
Lassota Maria 32, 42
242
Latos-Bieleńska Anna 16, 25, 32, 41, 42, 60, 68, 82
Lauda-Świeciak Anna 43, 74
Lawniczak M. 107
Lebiecka Karolina 170
Lechniak Dorota 139, 144, 145, 150
Lejman Monika 51, 118
Lembicz Marlena 179
Lemka Małgorzata 63
Lenner Marcin 104
Lenzner S. 25
Lepczyński Adam 132
Lescher J. 32
Lesiak Marta 94
Leszczyńska-Rodziewicz Anna 81
Leśniewicz R. 49
Leśniewska-Bocianowska Agnieszka 172
Lewandowska Irmina 202
Lewandowska Małgorzata 200
Lewandowski Krzysztof 27, 95
Liczbańska Alina 167
Lierch Alina 183
Limon Janusz 31, 37, 41, 42, 76, 115, 116
Lipczyńska-Ojkowska Wanda 20
Lipińska Barbara 82, 109
Lipiński Daniel 144
Lipiński T. 33
Lipska Elżbieta 69
Lisiecka Krystyna 72
Lisik Małgorzata 45
Lisowski M. 156
Liwem Izabela 27
Lockhart Lillian H. 33
Lubiński Jan 93, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108
Lubiński Wojciech 63
Lubka M. 42
Lukamowicz Jolanta 44
Lumme Jaakko 126
Lupski James R. 14, 21, 26, 28, 31, 33, 34, 41
Luszawska-Kutrzeba T. 47
Ł
Łaciński Mariusz 84
Łaczmańska Izabela 35, 66, 67
Ładyżyński Maciej 164
Łaniewski-Wołłk Mikołaj 65, 103
Łapiński Mirosław 171
Łopaczyńska Dobrosława 48, 91
Łosowska-Kaniewska Danuta 73
Łoś Marcin 203
Łuchniak Piotr 168
Łuczak Michał 172
Łuczyński Jacek 219
Łuczyszyn Anna 152
Łuczywek Elżbieta 20
Łusakowska A. 28
M
Machnicka B. 192
Maciak Lidia 216
Skorowidz nazwisk
Maciąg Monika 119, 204
Maciejka-Kapuścińska L. 47
Mackiewicz A. 93
Mackiewicz Dorota 205, 206
Mackiewicz Paweł 189, 205, 206, 207
Maćkowski Mariusz 142
Madej Małgorzata 168
Madeja Zofia 139
Maj Piotr 110
Majczak Wiktor 193
Majewska Marta 131
Majsterek Ireneusz 39, 48, 90
Majunke Stine 232
Makowska Izabela 111
Makowska Izabela 114
Makowski P. 95
Malepszy Stefan 160, 164, 176
Maleszka R. 105
Malewski T. 234
Malinowska Iwona 99
Małdyk J. 47
Małek Wanda 209
Małolepszy Joanna 131
Małunowicz E. M. 8
Małuszyński Mirosław 175
Maniukiewicz Patrycja 185
Mańkowska Barbara 63
Marczak A. 71
Marczak Łukasz 170
Marek-Kozaczuk Monika 197
Mariańska B. 97
Markowska-Wojciechowska Alicja 104
Marszał Elżbieta 28, 29, 66
Marszałek Bożena 35
Martin-Subero Jose I. 232
Maruszak Aleksandra 19
Maryniak Renata 98
Marzec B. 129
Masny Aleksander 163
Masojć B. 93, 106, 107
Masojć Piotr 163, 165, 170, 171, 173
Mastalerz Lucyna 90
Master Adam
Master Adam 50, 232
Matejczyk Marzena 200
Materna-Kiryluk Anna 25, 41, 60
Matławska Ksenia 91, 92
Matras Jan 179
Matulewicz Kamila 144
Matuszewski Marcin 96, 97, 98
Matych Józef 96, 109, 120
Matyja Ewa 104
Matyjasik Joanna 104, 106,107
Matysiak M. 47
Matysiak Michał 99
Mayer Magdalena 16
Mazurczak Tadeusz 16, 22, 23, 32, 34, 59, 60, 65
Mcintyre Alan 95
Mejnartowicz J. P. 41
Mel Katarzyna 84, 137
Menkiszak J. 93, 107
Mędrek K. 93, 105
Miazga Danuta 163
Michalak Arkadiusz 130
Michalak Ewa 144
Michalik Barbara 161, 170, 174, 176
Miciałkiewicz Arkadiusz 196
Midro Alina Teresa 32, 42, 49, 52, 68, 75
Mielcarek-Kuchta Daniela 112
Mierzejewski Marek 93, 102, 106, 107
Mierzewska H. 31
Mikulska Urszula 146, 149
Milczarski Paweł 165, 170, 171, 173
Milewicz Andrzej 85
Milewski Michał 18, 22, 36
Missol-Kolka Ewa 147
Misztal L. 172
Mitrus Iwona 147
Miturski R. 93
Moczulski Marcin 165, 181
Modestowicz Renata 24
Modliński J. A. 143
Modrzyńska K. 54
Moellers Christian 186
Mohler Volker 166
Moll Jadwiga 62
Mordalska Anna 48
Möslein G. 103
Mosor Maria 53, 110
Mostowska Adrianna 83, 119
Mościcki R. 58
Motyczka Łukasz 209
Mucha Barbara 43, 111, 114
Mueller-Malesińska Małgorzata 39, 49
Myrhřj T. 103
Myśków Beata 165, 170
N
Nadratowska Beata 193
Naganowska Barbara 169
Nagórska Krzysztofa 203
Nakonieczna Joanna 215
Nalewajek Hanna 64
Napierała Filip 134
Narod S. 93, 107
Narod S. A. 106, 107
Natorff Renata 195, 196
Nawara Magdalena 16
Nawrocka Agnieszka 96, 109, 120
Nawrot Małgorzata 175
Negri Rodolfo 195
Nej Katarzyna 108
Nicholson Garth 21
Niemiec Paweł 80, 86
Niemirowicz-Szczytt Katarzyna 163
243
Skorowidz nazwisk
Niepsuj S. 93
Nogowska Anna 144
Norek Aleksandra 40
Northup Jill K. 33
Nowacka Joanna 150
Nowacki Przemysaw 104
Nowak Jerzy 27, 53, 54, 95, 110
Nowak Stanisław 24
Nowak W. 172
Nowakowska B. 34
Nowakowski Adam 17, 20, 21
Nowicka Karina 27, 95
Nowicki Bogdan 205, 210
Nowicki Grzegorz 55, 75
Nowicki Stella
Nowicki Stella 205, 210
Nowodworska Arletta 203
Nowopolska Karolina 137
Nowosad Kamila 183
Nowosławska Emilia 73
Nyka Walenty 56
O
Obarzanek-Fojt Magdalena 150
Obersztyn Ewa 32, 34, 59, 60, 65
Obłąk Ewa 219
Obuchowski Michał 203, 204
Ochman Karolina 76, 116
Ochocki Justyn 91, 92
Odrzykoski Ireneusz J. 184
Olbryt Magdalena 128
Olczak-Woltman Helena 163
Olejniczak Jan 186
Olejniczak Paweł 179
Olszanowski Ziemowit 179
Ołdak Monika 61, 69, 70
Oracz Grzegorz 40
Oralewska Beata 40
Orczyk Wacław 165
Orlikowska Teresa 209
Osiecka Regina 91, 92
Ostrowska Katarzyna 62, 72
Oszkinis Grzegorz 84
P
Paczos-Grzęda Edyta 163
Palmieri G. 115
Palomba G. 115
Pałyga Jan 136
Panasiewicz Grzegorz 131
Panasiuk Barbara 42, 49, 52, 68, 113
Paprocka J. 59
Parada Rafał 145, 153
Pareek Chandra Shekhar 130, 139
Pasińska Magdalena 43
Paszewski A. 196
Paszewski Andrzej 195, 196, 202
Pawelczyk Leszek 82, 120
Pawlaczyk Ewa Maria 182, 184
244
Pawlak Andrzej L. 87
Pawlak Mikołaj 87
Pawlik J. 55
Pawlukowiec Tomasz 121
Pawłowicz Izabela 167
Pawłowska B. 33, 50
Peippo Jaana 151
Pepłońska Beata 20
Perek D. 47
Perkowska Magdalena 115
Pernak Monika 27, 95
Pernak Monika.
Pers Emilia 150
Petriczko Elżbieta 72
Petriczko W. 103
Piasecka-Wengi A. 138
Piątek Rafał 201
Piccini Eugenia 195
Piechota Janusz 46
Piekutowska-Abramczuk Dorota 15, 38, 47, 79
Pieńkowska-Grela Barbara 95, 98
Pieńkowska-Schelling Aldona 126
Pietrzak Marek 26
Pietrzyk Jacek J.
Pietrzyk Jacek J. 77, 87
Pietrzyk Witold 132, 133
Pignatti Pier Franco 57
Pijacka Wioletta 145
Pilch Jacek 15, 28, 29, 32, 42, 54
Pilch Józef 178
Piłsyk Sebastian 195
Pinkier Iwona 64, 75
Piosik Jacek 191
Piotrowicz Małgorzata 62, 68, 71, 72, 73
Piotrowska Ewa 30
Pisano M. 115
Plewa R. 35
Plisiecka-Hałasa J. 94
Płoski Rafał 39, 49, 51
Płowaś Iwona 27, 36, 70
Płucienniczak Andrzej 50, 162, 163, 232
Płużańska M. 93
Pniewski Tomasz 162, 174
Pobłocka Lucyna 137
Poćwierz-Kotus Anita 140
Podgórska Beata 193
Podhajska Anna 215
Podhajska Anna J. 208, 207
Podolak Krystyna 216
Poirier Karine 16
Polak Natalia
Polak Natalia 205, 206
Polański Zbigniew 150
Pollak Agnieszka 49
Połeć Joanna 190
Ponitka Aleksandra 177
Popławska Wiesława 183
Skorowidz nazwisk
Popowska Ewa 8, 15, 38, 47, 79
Popowska Magdalena 202
Posmyk M.
Posmyk M. 93, 107
Posmyk Renata 68
Pospieszny Henryk 209
Potaczek Daniel 90
Potocki Lorraine 31
Potrzebowska Agnieszka 64, 72
Pożarowska Anna 164
Prątnicka M. 116
Presler Małgorzata 96
Pronicka Ewa 10, 28, 31, 37, 38, 51
Pronicki M. 38
Pruchnik-Wolińska Danuta 24
Prudlak Edmund 104
Prusak Beata 125, 130, 136
Prus-Głowacki Wiesław 179, 184
Przetakiewicz Jarosław 165
Przybecki Zbigniew 161, 166
Przyborowski Jerzy Andrzej 173
Przybylski Grzegorz K. 232
Przybyłowska Karolina 39, 48
Przybysz Arkadiusz 164
Przygocka Jarosława 71
Przywecka Magdalena 126
Pudelska Hanna 177
Pulka Grażyna 80
Purzycka J. 50
Putonti Catherine 210
Pyrkosz A. 59
Pyrkosz Antoni 66
Pytel Dariusz 90
R
Rainczuk Arkadiusz 192
Rajewski Andrzej 83
Rakoczy-Trojanowska Monika 164, 173
Ramsey David 100
Ratajczak Bogumiła 26
Ratajczak Elżbieta 203
Ratajska Dorota 46
Ravazzolo Roberto 60
Rebarz Michał 181
Religa Dorota 19
Rembowska Jolanta 27, 95
Rempoła Bożenna 197
Respondek-Liberska Maria 55, 75
Rieder Harald 108
Roa B. B. 32
Rodney J. Scott 102
Rogalski Jerzy 197
Rogowska Beata 161
Rokicka Anna 29
Rokicka-Milewska R. 47
Ropers H. H. 16, 25
Rorat Tadeusz 162, 167, 233
Rosińska Zdzisława 63
Rosochacki Stanisław Józef 129, 200
Rossa Grzegorz 24
Roszkiewicz Andrzej 104
Roszkowska B. 213
Roszkowski T. 33
Rowińska E. 51
Rowińska-Marcińska Katarzyna 17, 21
Rozmiarek A. 93
Rozwadowska Natalia 121
Różycka Agata 26
Rudnicka W. 44, 45
Rumijowska-Galewicz Anna 192
Ruść A. 234
Rutkiewicz E. 54, 55
Rutkowski Andrzej Jacek 139
Rybakowski Filip 83
Rybicka Marta 154
Rybiński Wojciech 181
Rychlik Tadeusz 130, 156
Rychter P. 103
Rydzanicz Małgorzata 112
Rymkiewicz Grzegorz 98, 102
Ryniewicz Barbara 17, 21, 22, 25, 28
Rysińska Jolanta 156
Ryś Janusz 115
Rytka Joanna 191, 195, 197, 218
Rzymowska Jolanta 110
S
Sacharczuk Mariusz 145, 153, 214
Sadowska Małgorzata 101
Sadowski J. 172
Safian Anna 87
Safranow Krzysztof 19
Saifi Gulam Mustafa 21, 28
Sakowski T. 129
Sala Katarzyna 161
Salamanczuk Zoriana 101
Salmanowicz Bolesław P. 165, 181
Sałamaszyńska Agnieszka 201
Sanak Marek 40, 80, 90
Sanjuan Rafael 208
Sarecka Beata 80, 86
Sawecka Jadwiga 44, 97
Sawicka A. 52
Sawicka-Sienkiewicz Ewa 183, 185
Sawicki Rafał 114
Sawiniec Jarosław 114
Sawuła Wojciech 56
Sąsiadek Małgorzata 35, 66, 100
Sąsiadek Maria 99
Schelling Claude 126, 138
Schlichtholz Beata 96, 97, 98
Schmidt Christian A. 232
Schoell Brigitte 104
Schwanitz Gesa 42
Scott Rodney 104, 105, 107
Sell Jerzy 135, 137
245
Skorowidz nazwisk
Senkus E. 115
Setkowicz Małgorzata 90
Shaw Christine J. 31, 41
Shipley Janet 95
Siebert Reiner 232
Siedlecka Ewa 166
Sielska Danuta 22
Sieńko Marzena 196, 195
Sieroń Aleksander L. 66, 94
Sikora Agnieszka 48
Sikora Aleksandra 190
Sikorski A. 106, 107
Simlat Magdalena 161, 170
Sina-Frey Mercedes 107
Sitarz Mirosława 99
Skarżyński Henryk 39, 49
Skibińska Maria 81
Skolimowski Janusz 89
Skoneczna Adrianna 196
Skoneczny Marek 196
Skonieczka Katarzyna 43, 111, 114
Skorupa Ewa 30
Skorupska Anna 194, 197
Skorupski Włodzimierz 79
Skotnicki Aleksander B. 101
Skórka Agata 39, 49, 61, 62, 69, 70
Skrzypczak Magdalena 50, 232
Skrzypczak U. 54
Skulimowska J. 44, 97
Słomiński Bartosz 192
Słomski Ryszard 84, 144
Słonimski Piotr 195
Słopień Agnieszka 81, 83
Słupna Urszula 209
Smigiel Robert 100
Smolarczyk Kamila 205, 206
Smolarczyk Ryszard 147, 149
Sobczyk Agnieszka 217
Sobczyńska-Tomaszewska Agnieszka 40, 52
Sobek Zbigniew 132
Sobiczewska J. 50
Socha Jerzy 40
Socha Stanisław 154, 156
Sochanik Aleksander 128, 149
Sodkiewicz Teresa 182
Sodkiewicz Wojciech 163, 182
Sokołowska Joanna 79, 84
Sołtysińska Ewa 21
Sońta-Jakimczyk D. 47
Soroka Marianna 104
Sorokin D. 93
Sosnowski Jarosław 145, 150
Soszyńska Krystyna 74, 75, 111, 114
Sośnierz-Chmielińska E. 74
Speicher M. 49
Speina Elżbieta 100
Spik Anna 82
246
Spodar K. 9, 15, 47, 67, 71, 74
Spółczyńska A. 52
Spychalska Justyna 119
Stankiewicz Czesław 180
Stankiewicz Paweł 33, 34, 41
Stańczak Halina 70
Stańczyk J. 104
Starostecka Ewa 71
Starzynska T. 107
Starzyński Rafał Radosław 135, 139
Stawerska Renata 73
Stawicka M. 93
Stawiński Stanisław 185
Stączek Paweł 190, 215
Stefaniak Tomasz 109
Stefańska Agnieszka 96
Stefańska K. 47
Steinborn Barbara 26
Stembalska Agnieszka 35, 66, 99, 100
Stepnowska Magdalena 56
Sternicki Tomasz 153, 155
Stępień Łukasz 166
Stępkowska Hanna 156
Stojałowski Stefan 160, 171
Stolarska M. 47
Stolarski B. 51
Strapagiel Dominik 45, 44
Strauss Ewa 87
Stróżyńska Jolanta 48
Stróżyński Henryk 48, 91
Strzałka Joanna 132
Strzembicka Anna 178
Stukan M. 115
Styczyńska Maria 20
Styczyński Jan 112
Styrna Józefa 146, 152
Sucharski Piotr 65
Suchenek Kamila 34, 59
Suchy Janina 102, 117
Sułek Anna 17, 19
Summersgill Brenda 95
Sun C. 55
Surma M. 181
Surma Maria 180
Swoboda Paweł 102
Syczewska M. 47
Sykut-Cegielska J. 38
Sywula Tadeusz 137
Szabała Bartosz 233
Szafrańska Bożena 131
Szala Stanisław 147, 149
Szała Laurencja 183
Szarejko Iwona 175
Szczałuba Krzysztof 16, 23, 60
Szczech Józef 24
Szczecina R. 33
Szczeklik Andrzej 40, 80, 90
Skorowidz nazwisk
Szczeklik Wojciech 80
Szczepankiewicz Aleksandra 81
Szczepański T. 47
Szczerbal I. 138
Szczukowski Stefan 173
Szefel M. 207, 208
Szigeti Kinga 28
Szirkowiec W. 33
Szklarczyk Marek 160 161
Sznurkowska K. 47
Szołna Adam 23
Szpechciński A. 96
Szpecht-Potocka Agnieszka 32, 65, 103
Szreder Tomasz 148
Szwacka Maria 164
Szwaczkowski Tomasz 153, 155, 156
Szwiec M. 93, 107
Szych Zbigniew 102
Szyda Joanna 151
Szydłowski Maciej 127
Szyfter Krzysztof 112
Szylberg Tadeusz 104
Szyma Janusz 104
Szymańczak Robert 135
Szymańska Mirosława 182
Ś
Ślęzak Ryszard 35, 67, 85
Śliwiński Tomasz 90
Ślusarkiewicz-Jarzina Aurelia 177
Śmietanka Beata 140
Śmigiel Robert 35, 46
Świątkowska Ewa 44
Świtaj Karolina 50, 232
Świtoński Marek 127, 138, 139, 142, 150
T
Taraszewska Anna 104
Taylor Alina 193
Teisseyre Mikołaj 40
Terman Arkadiusz 124, 134, 135
Tołoczko-Grabarek A. 93
Tomankiewicz-Zawadzka A. 33, 50
Tomczyk Hubert 109, 120
Tońska K. 10
Tońska Katarzyna 46, 60
Towpik Joanna 201
Treadwell-Deering Diane 31
Trojan J.96
Trojanowski Tomasz 104
Trusz-Gluza Maria 80, 85, 86
Trzeciak Wiesław H. 26, 35, 64, 79, 83, 84, 119, 137
Trzewik Aleksandra 209
Tudek Barbara 100
Turkowicz Monika 217
Turyn Jacek 98
Twardowska Małgorzata 155
Twardowska Marta 165, 171
Tworkowski Józef 173
Tworowska Urszula 85
Tykarska Teresa 164
Tylki-Szymańska Anna 7, 15, 30
Tyrkiel Ewa 149
Tzschach A. 25
U
Ulanowska Katarzyna 191
Ulańska Anna 62, 64, 72, 73
Urbanek Ksymena 94
Urbaniak Krzysztof 150
Urbańsk Paweł 124
Urbański K. 93
Urvil Petri 205, 210
Velagaleti Gopalrao V.N. 33
Verhaaf Brenda 232
W
Wachowiak J. 47, 113
Wachowiak Witold 187
Wachowska Laura 155
Wakulińska A. 47
Walczak Mieczysław 41, 63, 72
Waleron K. 207, 208
Waleron M. 207, 208
Walewski J. 102
Waligora Jarosław 39, 49, 61, 62, 69, 70
Walinowicz Katarzyna 161
Waliszewski Krzysztof 84
Walizada Gina 21
Wang S. 55
Wanzeck Jens 232
Wardęcka Barbara 125
Warzych Ewelina 144
Wasilewska Ewa 113
Waśko B. 93
Waśniewska Anna 153
Wegrzyn Grzegorz 190
Wender Mieczysław 18, 24, 27
Wender-Ożegowska E. 53
Wenne Roman 127, 128, 140, 141
Wenzel Gerhard 166
Werr Wolfgang 177, 231
Wesoły Wojciech 184
Wędrychowicz Halina 217
Węgiel Barbara 143
Węgrzyn Alicja 30, 56
Węgrzyn Grzegorz 30, 56, 191, 193, 203
Wieczorek M. 47
Wieczorek-Cichecka Nina 62
Wiejacha Katarzyna 209
Wieloch Wioletta 214
Wierzba Jolanta 63, 76
Wierzba-Bobrowicz Teresa 104
Wierzbicka A. 31, 37
Wierzbicki Heliodor 132, 133, 140
Więckiewicz K. 54
Wiktorek-Smagur Aneta 168, 169
Wiland Ewa 121, 121
247
Skorowidz nazwisk
Winnicka Dorota 118
Wirth-Dzięciołowska E. 123
Wirth-Dzięciołowska Elżbieta 99, 152, 154
Wisniewska Marzena. 25
Wiszniewska Joanna 32
Wiszniewski Wojciech 22, 26, 28
Wiśniewska Anita 176
Wiśniewska Barbara 73
Wiśniewska Halina 198
Wiśniewska K. 41
Wiśniewska Marzena 16, 61
Wiśniewska-Jarosińska Maria 89
Wiśniewska-Wojtasik Barbara 128
Wiśniewski Łukasz 164
Witek Stanisław 219
Withers Marjorie 41
Witt Michał 42, 54, 55, 113
Wojaczyńska-Stanek Katarzyna 28, 29
Wojciechowska Barbara 177
Wojcierowski J. 129
Wojda Alina 42
Wojdak-Maksymiec Katarzyna 124, 135
Wojnicka-Półtorak Aleksandra 179
Wojtkiewicz A. 103
Wolc Anna 153, 155, 156
Wolf-Dieter Ludwig 232
Wolko Bogdan 169, 174
Wolnik-Brzozowska 68
Wolska Krystyna I. 204
Woroniecka Renata 98
Woźna Jolanta 177
Woźniak Joanna 203
Woźniak Michał 109
Woźniczko Izabela 145
Woźniewicz Bogdan 104
Wójcicki Piotr 35, 119
Wójcik E. 234
Wójcik Kinga 214
Wraith J. E. 7, 58
Wróbel Borys 192, 208
Wróbel Natalia 147
Wyrobek E. 47
Wysocka Anna 137
Wysocka Monika 191
Wysocki Mariusz 111, 112
Wyszynski D. F. 55
Wyszyńska Agnieszka 211
Wyszyńska-Koko Joanna 148
Y
Yin Zhimin 233
Z
Zaborowski Piotr 50, 232
Zabost A. 213
Zabost Anna 213
Zadurska M. 64
Zagulski Marek 40
Zając Ewa 96
248
Zając Magdalena 121
Zajączek Stanisław 63, 72, 93
Zakrzewska-Czerwińska Jolanta 189
Zalewska Beata 201
Zalewski Dariusz 188
Zalewski Kazimierz 131
Zapalski Stanisław 84
Zapolska B. 47
Zaremba B. 50
Zaremba C. M. 26
Zaremba Jacek 19, 22, 25, 33
Zaremba L. 93
Zawada M. 95
Zawada Mariola 27, 126
Zawiejska A. 53
Zawilak Anna 189
Zbawicka Małgorzata 127
Zborek Anna 94
Zdebska Ewa 119
Zdzienicka Elżbieta 25, 33
Zekanowski Cezary 19
Zhang Meizhuo 210
Zhang Y. J. 55
Zieba Grzegorz 125
Zielińska Maja 100
Zieliński Krzysztof 104
Zieliński Zbigniew 202
Ziętar Marek S. 126
Ziętkiewicz E. 42, 54, 55
Zimnoch Lech 104
Zimowski Janusz 11, 22, 25
Ziółkowska Iwona 53, 110
Ziółkowska L. 74
Złobecka Ewa 92
Złowocka Elżbieta 105, 106, 107
Zuzga Sabina 176
Zwierzchowski Lech 135, 139, 148
Zwierzykowska Elżbieta 172
Zwierzykowski Zbigniew 172
Zwolska Z. 213
Zwolska Zofia 213, 216
Zych Sławomir 140
Ż
Żaczek Anna 218
Żak Iwona 80, 86
Żekanowski Cezary 20
Żołądek Teresa 200
Żukiel Ryszard 24
Żurawa-Janicka Dorota 109
Żurawek Magdalena 53
Żurkowski Maciej 139
Życka Joanna 211