(11) PL/EP 1692102 PL/EP 1692102 T3

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO
(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
19.10.2004 04795907.7
(19) PL
(11) PL/EP
(13)
(51)
1692102
T3
Int.Cl.
G01N 33/566 (2006.01)
G01N 33/567 (2006.01)
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej
Polskiej
(54)
(97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono:
21.11.2012 Europejski Biuletyn Patentowy 2012/47
EP 1692102 B1
A61K 45/00 (2006.01)
Tytuł wynalazku:
Kompozycje i sposoby do wykrywania i leczenia chorób i stanów związanych z receptorami chemokiny
(30)
(43)
Pierwszeństwo:
30.10.2003 US 698541
04.08.2004 US 912638
Zgłoszenie ogłoszono:
23.08.2006 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2006/34
(45)
O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:
31.05.2013 Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/05
(73)
Uprawniony z patentu:
Chemocentryx, Inc., San Carlos, US
PL/EP 1692102 T3
(72)
Twórca(y) wynalazku:
JENNIFER M. BURNS, San Mateo, US
BRETTON SUMMERS, Redwood City, US
MAUREEN C. HOWARD, Los Altos, US
THOMAS J. SCHALL, Palo Alto, US
ZHENHUA MIAO, San Jose, US
(74)
Pełnomocnik:
rzecz. pat. Janina Kossowska
PATPOL
KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O.
ul. Nowoursynowska 162 J
02-776 Warszawa
Uwaga:
W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący
udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za
sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
EP 1 692 102 B1
Opis
TŁO WYNALAZKU
5
[0001] Chemokiny stanowią rodzinę małych cytokin wytwarzanych podczas zapalenia i regulujących rekrutację, aktywację i proliferację leukocytów (Baggiolini, M. i inni, Adv. Immunol. 55: 97-179 (1994); Springer, T.
A., Annu. Rev. Physiol. 57: 827-872 (1995); oraz Schall, T. J. i K. B. Bacon, Curr. Opin. Immunol. 6: 865-873
(1994)). Chemokiny są zdolne do wybiórczego wywołania chemotaksji utworzonych składników krwi (innych
niż czerwone ciałka krwi), włącznie z leukocytami, takimi jak neutrofile, monocyty, makrofagi, eozynofile,
10
bazofile, komórki tuczne i limfocyty, w tym komórki T i komórki B. Dodatkowo oprócz stymulowania chemotaksji chemokiny mogą wybiórczo wywoływać inne zmiany w reagujących komórkach obejmujące zmiany w
kształcie komórki, przejściowy wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wolnych jonów wapnia (Ca2+), egzocytozę granul, zwiększenie ekspresji integryn, wytwarzanie bioaktywnych lipidów (np. leukotrienów) oraz
wybuch oddechowy (ang. respiratory burst), związany z aktywacją leukocytów. Zatem chemokiny są wcze-
15
snymi wyzwalaczami odpowiedzi zapalnej, powodującymi uwalnianie mediatorów odpowiedzi zapalnej,
chemotaksję i wynaczynienie do miejsc zakażenia lub zapalenia.
[0002] Dwie podrodziny chemokin, nazwane chemokinami CXC i CC, rozróżnia się przez ustawienie pierwszych dwóch z czterech konserwowanych reszt cystein, które są rozdzielone jednym aminokwasem (tak jak
w chemokinach CXC SDF-1, IL-8, IP-10, MIG, PF4, ENA-78, GCP-2, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2, NAP-4,
20
I-TAC) lub przylegają do siebie (tak jak w chemokinach CC MIP-1α, MIP-1β, RANTES, MCP-1, MCP-2,
MCP-3, I-309). Większość chemokin CXC przyciąga leukocyty, takie jak neutrofile. Na przykład, chemokiny
CXC, interleukina 8 (IL-8), czynnik płytkowy 4 (PF4) i peptyd aktywujący neutrofile 2 (NAP-2), są silnymi
chemoatraktantami i aktywatorami neutrofili. Chemokiny CXC nazwane MIG (monokina indukowana przez
interferon gamma) i IP-10 (białko o masie 10 kDa indukowane przez interferon-γ) są szczególnie aktywne w
25
wywoływaniu chemotaksji aktywowanych limfocytów krwi obwodowej. Chemokiny CC są ogólnie mniej wybiórcze i mogą przyciągać wiele typów leukocytów, włącznie z monocytami, eozynofilami, bazofilami, limfocytami T i komórkami naturalnymi zabójcami NK. Chemokiny CC, takie jak ludzkie białka chemotaktyczne
dla monocytów 1-3 (MCP-1, MCP-2 i MCP-3), RANTES (regulowane przez aktywację, wyrażane i wydzielane przez prawidłowe limfocyty T; ang. Regulated on Activation, Normal T Expressed and Secreted) i białka
30
zapalne makrofagów 1α i 1β (MIP-1α i MIP-1β) scharakteryzowano jako chemoatraktanty i aktywatory monocytów lub limfocytów, ale nie wydają się one być chemoatraktantami dla neutrofili.
[0003] Chemokiny CC i CXC działają przez receptory należące do nadrodziny receptorów siedmiotransbłonowych sprzężonych z białkami G (Murphy, P. M., Pharmacol Rev. 52:145-176 (2000)). Ta rodzina receptorów sprzężonych z białkami G zawiera dużą grupę integralnych białek błonowych zawierających siedem
35
regionów transbłonowych. Receptory te są sprzężone z białkami G, które są heterotrimerycznymi białkami
regulatorowymi zdolnymi do wiązania GTP i uczestniczącymi w przekazywaniu sygnału ze sprzężonych
receptorów, na przykład, przez wytwarzanie wewnątrzkomórkowych mediatorów.
[0004] Ogólnie ujmując, oddziaływania chemokiny i receptora chemokiny mają tendencję do tego, aby były
typu mieszanego pod tym względem, że jedna chemokina może wiązać wiele receptorów chemokin oraz na
40
odwrót, jeden receptor chemokinowy może oddziaływać z kilkoma chemokinami. Istnieje kilka wyjątków od
tej zasady; jednym z takich wyjątków jest oddziaływanie między SDF-1 i CXCR4 (Bleul i inni, JExp Med,
184(3): 1101-9 (1996); Oberlin i inni, Nature, 382(6594): 833-5 (1996)). SDF-1, początkowo zidentyfikowany
1
EP 1 692 102 B1
jako czynnik stymulujący wzrost komórki pre-B (Nagasawa i inni, Proc Natl Acad Sci USA, 91(6): 2305-9
(1994)), jest jedynym opisanym ludzkim ligandem dla CXCR4. Gen SDF-1 koduje, przez alternatywne składanie, dwa białka nazwane SDF-1α i SDF-1β. Te dwa białka są identyczne za wyjątkiem czterech reszt aminokwasowych, które są obecne na C-końcu SDF-1β i nieobecne w SDF-1α.
5
[0005] Istnieje wiele dotychczas nie zrozumianych aspektów przekazywania sygnału przez receptor chemokinowy i jego selektywności względem ligandów. Na przykład istnieje pewna ilość sierocych receptorów,
których funkcja nie została wcześniej wyznaczona. RDC1, na przykład, pomimo, że wcześniej był uważany
za receptor dla wazoaktywnego peptydu jelitowego (VIP), obecnie jest uważany za receptor sierocy, ponieważ jego endogenny ligand nie został zidentyfikowany. Patrz, przykładowo, Cook i inni, FEBS Letts.
10
300(2):149-152 (1992).
[0006] Niniejszy wynalazek rozwiązuje te i inne problemy.
SKRÓCONY OPIS WYNALAZKU
15
[0007] Niniejszy wynalazek dostarcza sposobów identyfikacji środka wiążącego CCX-CKR2 na komórce. W
niektórych wykonaniach sposób obejmuje skontaktowanie wielu środków z polipeptydem CCX-CKR2 zawierającym zewnątrzkomórkową domenę identyczną przynajmniej w 95% z domeną zewnątrzkomórkową o SEK
ID NR:2 lub jej fragmentem wiążącym SDF1 lub I-TAC; i wybranie środka, który współzawodniczy z I-TAC
lub SDF1 o wiązanie z polipeptydem CCX-CKR2 lub jego fragmentem, przez co identyfikuje się środek, który
20
wiąże się z CCX-CKR2 na komórce.
[0008] W niektórych wykonaniach komórką jest komórka nowotworowa. W niektórych wykonaniach, sposób
dalej obejmuje zbadanie wybranego środka pod względem zdolności wiązania z komórką lub hamowania
wzrostu komórki. W niektórych wykonaniach komórką jest komórka nowotworowa.
[0009] W niektórych wykonaniach, sposób dalej obejmuje zbadanie wybranego środka pod względem zdol-
25
ności do zmiany adhezji komórkowej do komórek śródbłonka.
[0010] W niektórych wykonaniach, środek jest mniejszy niż 1500 Daltonów. W niektórych wykonaniach,
środkiem jest przeciwciało. W niektórych wykonaniach, środkiem tym jest polipeptyd. W niektórych wykonaniach, polipeptyd CCX-CKR2 zawiera sekwencję przedstawioną w SEK ID NR:2.
[0011] Niniejszy wynalazek dostarcza również sposobów określania obecności lub nieobecności komórki
30
nowotworowej. W niektórych wykonaniach, sposoby te obejmują skontaktowanie próbki zawierającej komórkę ze środkiem, który specyficznie wiąże się z SEK ID NR:2; i wykrycie wiązania środka z polipeptydem w
próbce, przy czym wiązanie środka z próbką wskazuje na obecność komórki nowotworowej.
[0012] W niektórych wykonaniach, środek jest przeciwciałem. W niektórych postaciach, środek jest mniejszy
niż 1500 Daltonów. W niektórych wykonaniach, środkiem jest polipeptyd. W niektórych wykonaniach, wykry-
35
wanym polipeptydem jest SEK ID NR:2. W niektórych wykonaniach, próbka pochodzi od człowieka. W niektórych wykonaniach, sposób jest stosowany do diagnozowania nowotworu u człowieka. W niektórych wykonaniach, sposób jest stosowany do przewidywania wystąpienia nowotworu u człowieka. W niektórych
wykonaniach, nowotwór jest wybrany z grupy obejmującej raka szyjki macicy, raka sutka, chłoniaka, glejaki,
raka gruczołu krokowego i białaczkę. W niektórych wykonaniach, nowotworem nie jest mięsak Kaposiego,
40
wieloogniskowa choroba Castlemana lub związany z AIDS pierwotny chłoniak wysiękowy. W niektórych
wykonaniach, przeciwciało współzawodniczy z SDF1 i I-TAC o wiązanie z SEK ID NR:2.
2
EP 1 692 102 B1
[0013] Niniejszy wynalazek także dostarcza sposobów dostarczenia diagnozy lub rokowania u pacjenta mającego nowotwór. W niektórych wykonaniach, sposoby te obejmują wykrywanie obecności lub braku ekspresji polinukleotydu kodującego polipeptyd CCX-CKR2 w komórce pacjenta, przy czym polipeptyd CCX-CKR2
wiąże I-TAC i/lub SDF1 i polipeptyd CCX-CKR2 jest w przynajmniej w 95% identyczny z SEK ID NR:2, przez
5
co diagnozuje się nowotwór u pacjenta.
[0014] W niektórych wykonaniach polipeptyd CCX-CKR2 przedstawiono w SEK ID NR:2. W niektórych wykonaniach, nowotwór jest wybrany z grupy obejmującej raka szyjki macicy, raka sutka, chłoniaka, glejaki,
raka gruczołu krokowego i białaczkę. W niektórych wykonaniach, nowotwór nie jest mięsakiem Kaposiego,
wieloogniskową chorobą Castlemana lub związanym z AIDS pierwotnym chłoniakiem wysiękowym.
10
[0015] Niniejszy wynalazek dostarcza także przeciwciał specyficznie współzawodniczących z SDF-1 i I-TAC
o wiązanie SEK ID NR:2. W niektórych wykonaniach, przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym. W
niektórych wykonaniach, przeciwciało jest przeciwciałem humanizowanym.
[0016] Niniejszy wynalazek dostarcza także sposobów obejmujących skontaktowanie komórki ze środkiem,
który specyficznie wiąże SEK ID NR:2, przy czym środek współzawodniczy z SDF-1 i I-TAC o wiązanie poli-
15
peptydu CCX-CKR2 i przy czym komórka wyraża polipeptyd CCX-CKR2 zawierający zewnątrzkomórkową
domenę identyczną przynajmniej w 95% z domeną zewnątrzkomórkową SEK ID NR:2, tym samym wiążąc
środek z polipeptydem CCX-CKR2 na komórce.
[0017] W niektórych wykonaniach, środek jest mniejszy niż 1500 Daltonów. W niektórych wykonaniach środek jest przeciwciałem. W niektórych wykonaniach środek jest polipeptydem. W niektórych wykonaniach
20
polipeptyd CCX-CKR2 jest taki jak przedstawiono w SEK ID NR:2. W niektórych wykonaniach środek identyfikuje się sposobem obejmującym kontaktowanie wielu środków z polipeptydem CCX-CKR2 zawierającym
zewnątrzkomórkową domenę identyczną przynajmniej w 95% z domeną zewnątrzkomórkową SEK ID NR:2
lub jej fragmentem wiążącym SDF1 lub I-TAC i wybranie środka, który współzawodniczy z I-TAC lub SDF1 o
wiązanie z polipeptydem CCX-CKR2 lub jego fragmentem, przez co identyfikuje się środek wiążący komórkę
25
nowotworową.
[0018] Opisano tutaj sposoby leczenia nowotworu u pacjenta. W niektórych przypadkach sposoby obejmują
podawanie pacjentowi terapeutycznie skutecznej ilości polinukleotydu, który hamuje ekspresję polinukleotydu CCX-CKR2. W niektórych wykonaniach, polinukleotyd CCX-CKR2 koduje SEK ID NR:2. W niektórych
wykonaniach, polinukleotyd CCX-CKR2 zawiera SEK ID NR:1. W niektórych wykonaniach, podawany po-
30
linukleotyd hamuje ekspresję przez siRNA.
[0019] Opisano tutaj sposoby leczenia nowotworu u pacjenta. W niektórych przypadkach sposoby te obejmują podawanie pacjentowi terapeutycznie skutecznej ilości środka, który współzawodniczy z SDF1 i I-TAC
o wiązanie z SEK ID NR:2. W niektórych wykonaniach, środek jest mniejszy niż 1500 Daltonów. W niektórych wykonaniach, środkiem jest przeciwciało. W niektórych wykonaniach środkiem jest polipeptyd. W nie-
35
których wykonaniach środek identyfikuje się sposobem obejmującym skontaktowanie wielu środków z polipeptydem CCX-CKR2 zawierającym zewnątrzkomórkową domenę przynajmniej w 95% identyczną z domeną zewnątrzkomórkową SEK ID NR:2 lub jej fragmentem wiążącym SDF1 lub I-TAC; i wybór środka, który
współzawodniczy z I-TAC lub SDF1 o wiązanie z polipeptydem CCX-CKR2 lub jego fragmentem, przez co
identyfikuje się środek wiążący komórkę nowotworową. W niektórych wykonaniach nowotwór jest wybrany z
40
grupy obejmującej raka szyjki macicy, raka sutka, chłoniaka, glejaki, raka gruczołu krokowego i białaczkę. W
niektórych wykonaniach, nowotwór nie jest mięsakiem Kaposiego, wieloogniskową chorobą Castlemana lub
związanym z AIDS pierwotnym chłoniakiem wysiękowym.
3
EP 1 692 102 B1
KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW
[0020] Figury 1A-I ilustrują dane wiązania przedstawiające wyraźnie inny "odcisk" wypierania wiązania SDF1 na różnych typach komórek. Profil współzawodnictwa o wiązanie z zastosowaniem
5
125
I SDF-1α jako sondy
znakowanego radioizotopem liganda na (a) CEM-NKr (Figury 1A-C) i (b) MCF-7 (Figury 1D-F), jak również
125
II-TAC (Figury 1G-I) stosowanego jako sonda znakowanego radioizotopem liganda zastosowana na (c)
MCF-7, w doświadczeniu z wypieraniem wiązania z kompleksową macierzą >90 osobnych wirusowych,
ludzkich i mysich chemokin i wariantów chemokin jako niewyznakowanych środków współzawodniczych.
Procent hamowania wiązania wyznakowanego radioizotopem liganda przedstawiono jako wykres słupkowy i
10
ujawnia on, że SDF-la i I-TAC są krzyżowo wypierane z komórek MCF-7, ale nie z komórek CEM-NKr. Białe
słupki, potencjalnie wysokie powinowactwo (>80% hamowania); szare słupki, powinowactwo potencjalnie
średnie do niskiego (hamowanie między 60-79%); czarne słupki brak powinowactwa lub niskie powinowactwo (hamowanie <60%). Wyniki są średnimi z trzech oznaczeń. Pominięto słupki błędów dla uzyskania lepszego obrazu.
15
[0021] Figura 2 przedstawia porównanie powinowactwa wiązania liganda i specyficzność na CEM-NKr i
MCF-7. Wyselekcjonowane ligandy o potencjalnie wysokim powinowactwie zidentyfikowane na Figurze 2
zostały wybrane do współzawodnictwa odpowiedzi na dawkę na CEN-NKr (puste kwadraty) i MCF-7 (pełne
kwadraty). W każdym teście współzawodnictwa
125
I SDF-1α współzawodniczy z nie znakowaną hemokiną,
jak wskazana.
20
[0022] Figura 3 przedstawia, że wiązanie
ływania przez wiązanie CXCR3. Zdolność
125
II-TAC na komórkach MCF-7 nie wynika z klasycznego oddzia-
125
I-TAC do współzawodnictwa ze wskazanymi chemokinami ba-
dano jedynie w obecności buforu (pełne kwadraty), nadmiaru MIG (aby zahamować wiązanie za pośrednictwem CXCR3; puste trójkąty) lub nadmiaru SDF-1α (gwiazdki).
[0023] Figura 4 przedstawia, że opisany tutaj fenotyp wiązania można podsumować w linii komórkowej, któ25
ra nie wyraża endogennie tego receptora. Stabilnie transformowana CCX-CKR2 linia komórek nowotworu
sutka MDA MB 435s wykazuje wiązanie
125
I SDF-1α. Wiązanie to można usunąć przez powinowactwo z
niewyznakowanym SDF-1α i I-TAC. W porównaniu z tym komórki typu dzikiego (nietransfekowane) nie dają
wydajnego sygnału wiązania
125
I SDF-1α.
[0024] Figura 5 przedstawia dane wiązania kompetycyjnego. Dwa związki niskocząsteczkowe, CCX0803
30
(pełne kółka) i CCX7923 (puste kółka), współzawodniczą specyficznie z
125
I SDF-1α, na odrębnych typach
komórek; nie wykryto współzawodnictwa krzyżowego. Włączono także SDF-1α (gwiazdki) jako nie znakowany środek współzawodniczący z
125
I SDF-1α o wiązanie na zarówno na MCF-7 jak i CEM-NKr. Struktury
chemiczne CCX0803 i CCX7923 przedstawiono we wstawce. Przewidywane wartości IC50 dla antagonistycznego współzawodnictwa z SDF-1α i CXCR4 zamieszczono w dołączonej Tabeli.
35
[0025] Figura 6 przedstawia wpływ traktowania komórek raka sutka, które wyrażają CCX-CKR2, niskocząsteczkowym antagonistą CCX-CKR2 w porównaniu z komórkami nietraktowanymi tym antagonistą.
[0026] Figura 7 przedstawia, że antagonista CCX-CKR2 3451 (patrz, Tabela 1, Związek nr 49) hamuje adhezję komórek wyrażających CCX-CKR2 do pojedynczej warstwy śródbłonka naczyń.
[0027] Figura 8 przedstawia, że antagonizm CCX-CKR2 na komórkach raka sutka zmniejsza objętość nowo-
40
tworu.
4
EP 1 692 102 B1
DEFINICJE
[0028] "Chemokina" lub "ligand chemokinowy" dotyczą małego białka złożonego z około 50 do 110 aminokwasów oraz wykazującego homologię sekwencji z innymi znanymi chemokinami (patrz, np., Murphy, P. M.,
5
Pharmacol Rev. 52:145-176 (2000)). Chemokiny klasyfikuje się zgodnie z odpowiednimi pozycjami pierwszej
pary cystein (Cs) znajdujących się w pierwszorzędowej sekwencji aminokwasowej. W chemokinach CXCL
pierwsza para cystein jest rozdzielona przez jakikolwiek pojedynczy aminokwas. Chemokiny CCL zawierają
przylegające cysteiny. W chemokinach CX3CL, pierwsza para cystein jest rozdzielona przez 3 aminokwasy.
Chemokiny CL zawierają tylko pojedynczą cysteinę w homologicznej pozycji. Chemokiny mogą wywoływać
10
funkcję biologiczną przez wiązanie i aktywację receptorów chemokinowych.
[0029] Termin "receptor chemokinowy" dotyczy polipeptydu, który specyficznie oddziałuje z cząsteczką
chemokiny. Receptor chemokinowy jest zazwyczaj receptorem sprzężonym z białkiem G z siedmioma domenami transbłonowymi. Receptory chemokinowe mogą posiadać kilka wspólnych cech strukturalnych, w
tym,wysoce kwaśną domenę N-końcową; sekwencję aminokwasową DRYLAIVHA (lub niewielką odmianę tej
15
sekwencji) znajdywaną w drugiej pętli zewnątrzkomórkowej wielu receptorów chemokinowych; krótką trzecią
pętlę wewnątrzkomórkową o ogólnie zasadowym ładunku; resztę cysteiny w każdej z czterech domen zewnątrzkomórkowych. Zazwyczaj, receptory chemokinowe mają ogólną wielkość około 340-370 reszt aminokwasowych. Patrz, np., praca przeglądowa Murphy, P.M. Chemokine Receptors; Overview, Academic Press
2000; oraz Loetscher P. i Clark-Lewis I. J. Leukocyte Biol. 69:881 (2001). Przykładowe receptory chemoki-
20
nowe obejmują, np., receptory chemokin CC ( w tym CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7,
CCR8, CCR9 i CCR10), receptory chemokin CXC (w tym CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5,
CXCR6 i CCX-CKR2 (np. SEK ID NR:2)), CX3CR1, CXR1, CCXCKR (CCR11), receptory chemokinowe
kodowane przez wirusy, US28, ECRF3, GPCR wirusa opryszczki związanego z mięsakiem Kaposiego
(ORF74), związane z błonami receptory sprzężone z białkami G wirusa ospy; D6 i DARC.
25
[0030] Określone odpowiedzi, które mogą być stymulowane przez receptory chemokinowe obejmują
transbłonowe przekazywanie sygnału, aktywacje cytoplazmatycznych kaskad sygnałowych, przebudowę
cytoszkieletu, adhezję, chemotaksję, inwazję, przerzutowanie, wytwarzanie cytokin, indukcję genu, represję
genu, indukcję ekspresji białka lub modulację wzrostu i różnicowania komórki, włącznie z rozwojem nowotworu.
30
[0031] "RDC1" oznaczony tutaj jako "CCX-CKR2" dotyczy siedmiotransbłonowego receptora przypuszczalnie sprzężonego z białkiem G - (GPCR). Psi ortolog CCX-CKR2 początkowo zidentyfikowano w 1991. Patrz,
Libert i inni Science 244:569-572 (1989). Psią sekwencję opisano w Libert i inni, Nuc. Acids Res. 18(7):1917
(1990). Mysią sekwencje opisano w, np., Heesen i inni, Immunogenetics 47:364-370 (1998). Ludzką sekwencję opisano w, np., Sreedharan i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4986-4990 (1991), która pomyłko-
35
wo opisuje białko jako receptor wazoaktywnego peptydu jelitowego. "CCX-CKR2" obejmuje sekwencje, które
są zasadniczo podobne do lub są konserwatywnie zmodyfikowanymi wariantami SEK ID NR:1, SEK ID
NR:2, SEK ID NR:3, SEK ID NR:4, SEK ID NR:5, SEK ID NR:6, SEK ID NR:7, SEK ID NR:8, SEK ID NR:9
lub SEK ID NR:10.
[0032] Terminy "peptydomimetyk" i "mimetyk" dotyczą syntetycznego związku chemicznego, który ma za-
40
sadniczo takie same cechy strukturalne i funkcjonalne antagonistów lub agonistów receptora chemokinowego. Analogi peptydów są powszechnie stosowane w przemyśle farmaceutycznym jako leki nie-peptydowe o
właściwościach analogicznych do matrycowego peptydu. Te typy związku nie-peptydowego są nazywane
5
EP 1 692 102 B1
"mimetykami peptydów" lub "peptydomimetykami" (Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber i Freidinger TINS str. 392 (1985); oraz Evans i inni J. Med. Chem. 30:1229 (1987) ). Mimetyki peptydów, które są
strukturalnie podobne do peptydów przydatnych terapeutycznie można stosować do wytworzenia równoważnego lub zwiększonego efektu terapeutycznego lub profilaktycznego. Ogólnie, peptydomimetyki są struk5
turalnie podobne do paradygmatycznego polipeptydu (tj., polipeptydu, który wykazuje aktywność biologiczną
lub farmakologiczną), ale zawierają jedno lub większą liczbę wiązań peptydowych ewentualnie zastąpionych
wiązaniem wybranym z grupy obejmującej, np., - CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis i trans), COCH2-, -CH(OH)CH2- oraz- CH2SO-. Mimetyk może być albo całkowicie złożony z syntetycznych, nienaturalnych analogów aminokwasów albo jest cząsteczką chimeryczną częściowo naturalnych aminokwasów
10
peptydowych i częściowo nienaturalnych analogów aminokwasów. Mimetyk może także zawierać jakąkolwiek liczbę konserwatywnych podstawień naturalnych aminokwasów tak długo jak takie podstawienia także
nie zmieniają zasadniczo struktury i/lub aktywności mimetyku. Mimetyk może, na przykład, naśladować wiązanie SDF-1 lub I-TAC z CCX-CKR2. Na przykład, kompozycja mimetyku jest w zakresie wynalazku jeżeli
jest w stanie hamować lub zwiększać aktywność lub działanie CCX-CKR2.
15
[0033] "Przeciwciało" dotyczy polipeptydu zasadniczo kodowanego przez gen immunoglobulinowy lub geny
immunoglobulinowe, lub ich fragmenty, który specyficznie wiąże i rozpoznaje analit (antygen). Poznane geny
immunoglobulinowe obejmują geny regionu stałego kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon i mu, a także
ogromną liczbę genów regionu zmiennego immunoglobulin. Łańcuchy lekkie klasyfikuje się jako kappa lub
lambda. Łańcuchy ciężkie klasyfikuje się jako gamma, mu, alfa, delta lub epsilon, co z kolei określa klasy
20
immunoglobulin, odpowiednio IgG, IgM, IgA, IgD i IgE.
[0034] Przykładowa jednostka strukturalna immunoglobuliny (przeciwciała) zawiera tetramer. Każdy tetramer
jest złożony z dwóch identycznych par łańcuchów polipeptydowych, przy czym każda para ma jeden łańcuch
"lekki" (około 25 kD) i jeden "ciężki" (około 50-70 kD). N-koniec każdego łańcucha określa region zmienny
wielkości około 100 do 110 lub większej liczby aminokwasów odpowiedzialnych głównie za rozpoznanie
25
antygenu. Terminy region zmienny łańcucha lekkiego (VL) i region zmienny łańcucha ciężkiego (VH) dotyczą
odpowiednio tych łańcuchów lekkiego i ciężkiego.
[0035] Przeciwciała występują, np. jako nienaruszone immunoglobuliny lub jako kilka ich dobrze scharakteryzowanych fragmentów wytworzonych przez trawienie różnymi peptydazami. Zatem, na przykład, pepsyna
trawi przeciwciało poniżej wiązań disiarczkowych w regionie zawiasowym z wytworzeniem F(ab)'2 - dimeru
30
Fab, który sam z siebie jest łańcuchem lekkim połączonym z VH-CH1 przez wiązanie disiarczkowe. F(ab)'2
może zostać zredukowany w łagodnych warunkach w celu przerwania wiązania disiarczkowego w regionie
zawiasowym, co tym samym przekształca dimer F(ab)'2 w monomer Fab'. Monomer Fab' jest zasadniczo
Fab z częścią regionu zawiasowego (patrz, Paul (red.) Fundamental Immunology, wydanie trzecie, Raven
Press, NY (1993)). Podczas gdy różne fragmenty przeciwciała określa się pod względem trawienia nienaru-
35
szonego przeciwciała specjalista doceni, że takie fragmenty można syntetyzować de novo chemicznie lub z
zastosowaniem metod rekombinacji DNA. Zatem, termin "przeciwciało", w zastosowanym tutaj znaczeniu,
obejmuje również fragmenty przeciwciała albo wytworzone przez modyfikację całego przeciwciała albo tych
zsyntetyzowanych de novo z wykorzystaniem metod rekombinacji DNA (np., jednołańcuchowe Fv).
[0036] Termin "humanizowane" przeciwciała dotyczy cząsteczki mającej miejsce wiążące antygen, które
40
zasadniczo pochodzi z immunoglobuliny od gatunku innego niż człowiek a pozostała struktura immunoglobulinowa cząsteczki oparta jest na strukturze i/lub sekwencji ludzkiej immunoglobuliny. Miejsce wiążące antygen może zawierać pełne domeny zmienne zfuzowane do domen stałych lub tylko regiony determinujące
6
EP 1 692 102 B1
dopasowanie (CDR) przeszczepione w odpowiednie regiony zrębowe domen zmiennych. Miejsca wiążące
antygen mogą być typu dzikiego lub zmodyfikowane przez jedno lub większą liczbę podstawień aminokwasowych, np. zmodyfikowane tak aby bliżej przypominały ludzką immunoglobulinę. Pewne postaci humanizowanych przeciwciał zachowują wszystkie sekwencje CDR (na przykład, humanizowane mysie przeciwciało
5
zawierające wszystkie sześć CDR z mysich przeciwciał). Inne postaci humanizowanych przeciwciał zawierają jeden lub większą liczbę CDR (jeden, dwa, trzy, cztery, pięć, sześć), które są zmienione w odniesieniu do
wyjściowego przeciwciała.
[0037] Wyrażenie "specyficznie (lub wybiórczo) wiąże przeciwciało" lub "specyficznie (lub wybiórczo) immunoreaktywne z", w odniesieniu do białka lub peptydu, dotyczy reakcji wiązania, która wyznacza obecność
10
białka w obecności heterogennej populacji białek lub innych cząsteczek biologicznych. Zatem, we wskazanych warunkach testu immunologicznego wyszczególnione przeciwciała wiążą konkretne białko i nie wiążą
w istotnej ilości innych białek obecnych w próbce. Specyficzne wiązanie się z przeciwciałem w tych warunkach może wymagać przeciwciała wybranego ze względu na jego specyficzności dla konkretnego białka. Na
przykład, przeciwciała wytworzone przeciw białku mającemu sekwencję aminokwasową kodowaną przez
15
jakiekolwiek polinukleotydy według wynalazku mogą zostać wybrane do uzyskania przeciwciał specyficznie
immunoreaktywnych z tym białkiem, ale nie z innymi białkami, za wyjątkiem polimorficznych wariantów, np.,
białek identycznych w przynajmniej 80%, 85%, 90%, 95% lub 99% z SEK ID NR:2. Do wybrania przeciwciał
specyficznie immunoreaktywnych z konkretnym białkiem można wybrać wiele formatów testów immunologicznych. Na przykład, testy immunologiczne ELISA w fazie stałej, analizy Western blot lub metody immuno-
20
histochemiczne stosuje się rutynowo do wybrania przeciwciał monoklonalnych specyficznie immunoreaktywnych z białkiem. Patrz w Harlow i Lane Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications,
NY (1988) w celu znalezienia opisu formatów i warunków testów immunologicznych, które można zastosować do określenia specyficznej immunoreaktywności. Zazwyczaj, specyficzna lub wybiórcza reakcja będzie
stanowić co najmniej dwukrotność sygnału tła lub szumu, a bardziej typowo więcej niż 10- do 100-krotność
25
tła.
[0038] Termin "ligand" dotyczy środka, np. polipeptydu lub innej cząsteczki zdolnej do wiązania receptora
chemokinowego.
[0039] W zastosowanym tutaj znaczeniu wyrażenie "środek wiążący receptor chemokinowy" dotyczy środka
wiążącego receptor chemokinowy z wysokim powinowactwem. Termin "wysokie powinowactwo" dotyczy
30
powinowactwa wystarczającego do wywołania odpowiedzi istotnej farmakologicznie, np. zdolności do istotnego współzawodniczenia z naturalnym ligandem chemokinowym o wiązanie z receptorem chemokinowym
w stężeniach odpowiednich farmakologicznie (np., w stężeniach niższych niż około 10-5 M). Patrz, np. Przykład 1 i Figura 5. Pewne przykładowe środki o wysokim powinowactwie będą wiązać receptor chemokinowy
-6
-7
-8
z powinowactwem wyższym niż 10 M oraz czasami wyższym niż 10 M lub 10 M. Środek, który nie jest w
35
stanie współzawodniczyć o wiązanie z naturalnym ligandem receptora gdy środek ten jest w stężeniach niższych niż 10-4 M dla celów wynalazku będzie on uznawany jako "niewiążący".
[0040] Termin "kwas nukleinowy" lub "polinukleotyd" dotyczy deoksyrybonukleotydów lub rybonukleotydów i
ich polimerów w postaci jedno- lub dwuniciowej. Do czasu gdy nie zostanie wprowadzone specyficzne ograniczenie termin ten obejmuje kwasy nukleinowe zawierające znane analogi naturalnych nukleotydów, które
40
wykazują podobne właściwości wiązania jak kwas nukleinowy odniesienia i są metabolizowane w sposób
podobny do nukleotydów występujących naturalnie. Do czasu gdy nie wskazano inaczej konkretna sekwencja kwasu nukleinowego będzie domyślnie obejmować ich konserwatywnie zmodyfikowane warianty (np.
7
EP 1 692 102 B1
podstawienia wynikające ze zdegenerowanych kodonów) oraz sekwencje komplementarne, a także sekwencję wyraźnie wskazaną. Specyficznie, podstawienia wynikające ze zdegenerowanych kodonów można
uzyskać przez wytworzenie sekwencji, w których trzecia pozycja jednego lub większej liczby wybranych (lub
wszystkich) kodonów jest podstawiona resztami mieszanej zasady i/lub deoksyinozyny (Batzer i inni, Nucleic
5
Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka i inni, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); oraz Cassol i inni (1992);
Rossolini i inni, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). Termin kwas nukleinowy jest stosowany zamiennie z terminem gen, cDNA i mRNA kodowany przez gen.
[0041] Terminy "polipeptyd", "peptyd" i "białko" stosuje się tutaj zamiennie i dotyczą one polimeru reszt aminokwasowych. Terminy te mają zastosowanie do polimerów aminokwasów, w których jedna lub większa
10
liczba reszt aminokwasowych jest sztucznym chemicznym mimetykiem odpowiedniego aminokwasu występującego naturalnie, a także naturalnie występujących polimerów aminokwasów i nie występujących naturalnie polimerów aminokwasów. W zastosowanym tutaj znaczeniu terminy te obejmują łańcuchy aminokwasów
o dowolnej długości, włącznie z białkami pełnej długości (tj., antygenami), przy czym reszty aminokwasów są
połączone przez kowalencyjne wiązania peptydowe.
15
[0042] Termin "aminokwas" dotyczy aminokwasów występujących naturalnie lub syntetycznych, a także
analogów aminokwasów i mimetyków aminokwasów, które działają w sposób podobny do aminokwasów
występujących naturalnie. Aminokwasami występującymi naturalnie są te kodowane przez kod genetyczny,
a także aminokwasy, które są później modyfikowane, np. hydroksyprolina, γ-karboksyglutaminian i Ofosfoseryna. Termin analogi aminokwasów dotyczy związków, które mają taką samą podstawową strukturę
20
chemiczną jak aminokwasy występujące naturalnie, tj. węgiel α związany z wodorem, grupę karboksylową,
grupę aminową oraz grupę R, np. homoseryna, norleucyna, sulfotlenek metioniny, sól metylosulfonowa metioniny. Takie analogi mają zmodyfikowane grupy R (np. norleucyna) lub zmodyfikowane szkielety peptydowe, ale zachowują podstawową strukturę chemiczną taką samą jak aminokwas występujący naturalnie.
Termin "mimetyki aminokwasów" dotyczy związków chemicznych, które maja strukturę inną od ogólnej struk-
25
tury chemicznej aminokwasu, ale działają w sposób podobny do aminokwasu występującego naturalnie.
[0043] Aminokwasy mogą być tutaj określane albo ich powszechnie znanymi trójliterowymi symbolami albo
jednoliterowymi symbolami rekomendowanymi przez Komisję IUPAC-IUB ds. Nomenklatury Biochemicznej.
Podobnie nukleotydy mogą być określane ich powszechnie akceptowanymi kodami jednoliterowymi.
[0044] Termin "warianty zmodyfikowane konserwatywnie" ma zastosowanie zarówno do sekwencji amino-
30
kwasowych, jak i kwasów nukleinowych. W odniesieniu do konkretnych sekwencji kwasu nukleinowego termin "warianty zmodyfikowane konserwatywnie" dotyczy tych kwasów nukleinowych, które kodują identyczne
lub zasadniczo identyczne sekwencje aminokwasowe lub, gdy kwas nukleinowy nie koduje sekwencji aminokwasowej, sekwencji zasadniczo identycznych. Ze względu na zdegenerowanie kodu genetycznego jakiekolwiek dane białko będzie kodowane przez wiele sekwencji kwasu nukleinowego. Na przykład, kodony
35
GCA, GCC, GCG i GCU wszystkie kodują aminokwas alaninę. Zatem, w każdej pozycji w której alanina jest
wyszczególniona przez kodon, kodon ten może zostać zmieniony do któregokolwiek z odpowiednich opisanych kodonów bez zmiany kodowanego polipeptydu. Takie zmiany kwasu nukleinowego są "cichymi zmianami", które są jednym z rodzajów zmian zmodyfikowanych konserwatywnie. Każda opisana tutaj sekwencja
kwasu nukleinowego, która koduje polipeptyd także opisuje każdą możliwą cichą zmianę kwasu nukleinowe-
40
go. Specjalista stwierdzi, że każdy kodon w kwasie nukleinowym (za wyjątkiem AUG, który zwykle jest jedynym kodonem dla metioniny i TGG, który zwykle jest jedynym kodonem dla tryptofanu) można zmodyfikować
8
EP 1 692 102 B1
z wytworzeniem cząsteczki identycznej funkcjonalnie. Zgodnie z tym, każda cicha zmiana kwasu nukleinowego, która koduje polipeptyd jest zawarta w każdej opisanej sekwencji.
[0045] Odnośnie sekwencji aminokwasowych specjalista stwierdzi, że poszczególne podstawienia, delecje
lub addycje do sekwencji kwasu nukleinowego, peptydu, polipeptydu lub białka, które zmieniają, dodają lub
5
usuwają pojedynczy aminokwas lub niewielki procent aminokwasów z kodowanej sekwencji są "wariantami
zmodyfikowanymi konserwatywnie", w których zmiana powoduje podstawienie aminokwasu aminokwasem
podobnym chemicznie. W dziedzinie wynalazku dobrze znane są tabele podstawień konserwatywnych dostarczające aminokwasy podobne funkcjonalnie. Takie warianty zmodyfikowane konserwatywnie są dodatkowe i nie wykluczają wariantów polimorficznych, homologów międzygatunkowych i alleli według wynalazku.
10
[0046] Poniższych osiem grup zawiera aminokwasy, które są względem siebie konserwatywnymi podstawieniami:
1) Alanina (A), Glicyna (G);
2) Kwas asparaginowy (D), Kwas glutaminowy (E);
3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
15
4) Arginina (R), Lizyna (K);
5) Izoleucyna (I), Leucyna (L), Metionina (M), Walina (V);
6) Fenyloalanina (F), Tyrozyna (Y), Tryptopfan (W);
7) Seryna (S), Treonina (T); oraz
8) Cysteina (C), Metionina (M)
20
(patrz, np. Creighton, Proteins (1984)).
[0047] "Procent identyczności sekwencji" określa się przez porównanie dwóch optymalnie dopasowanych
sekwencji w oknie porównywania, przy czym w celu wytworzenia optymalnego dopasowanie dwóch sekwencji część sekwencji polinukleotydowej w oknie porównywania może zawierać addycje lub delecje (tj., przerwy) w porównaniu z sekwencją odniesienia (która nie zawiera addycji lub delecji). Procent ten oblicza się
25
przez wyznaczenie liczby pozycji w których identyczna zasada kwasu nukleinowego lub reszta aminokwasowa występuje w obydwu sekwencjach z uzyskaniem liczby dopasowanych pozycji, podzieleniem liczby
dopasowanych pozycji przez całkowitą liczbę pozycji w oknie porównywania i pomnożenie wyniku przez 100
w celu uzyskania procentu identyczności sekwencji.
[0048] Terminy "identyczny" lub procent "identyczności" w kontekście dwóch lub więcej sekwencji kwasu
30
nukleinowego lub polipeptydowych dotyczą dwóch lub większej liczby sekwencji lub subsekwencji, które są
takie same lub zawierają wyszczególniony procent reszt aminokwasowych lub nukleotydów, które są takie
same (tj., 60% identyczności, ewentualnie 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% lub 95% identyczności w wyszczególnionym regionie, np. w całych sekwencjach polipeptydowych według wynalazku lub domenach zewnątrzkomórkowych polipeptydów według wynalazku), przy porównywaniu i dopasowaniu w celu uzyskania
35
maksymalnej zgodności w oknie porównywania lub wyznaczonym regionie, co mierzy się z zastosowaniem
jednego z poniższych algorytmów porównywania sekwencji lub przez manualne dopasowanie sekwencji i ich
kontrolę wizualną. Takie sekwencje są wtedy opisywane jako "zasadniczo identyczne". Określenie to dotyczy
także sekwencji komplementarnej do sekwencji badanej. Ewentualnie identyczność występuje w regionie
długości przynajmniej około 50 nukleotydów lub korzystniej w regionie, który ma długość 100 do 500 lub
40
1000 lub więcej nukleotydów.
[0049] Termin "podobieństwo" lub procent "podobieństwa" w kontekście dwóch lub więcej sekwencji polipeptydowych dotyczy dwóch lub więcej sekwencji lub subsekwencji, które mają wyszczególniony procent reszt
9
EP 1 692 102 B1
aminokwasowych, które są takie same lub podobne, jak określone w 8 zdefiniowanych powyżej konserwatywnych podstawieniach aminokwasów (tj., 60%, ewentualnie 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% lub 95%
podobieństwa w wyszczególnionym regionie lub w całej sekwencji polinukleotydu, np. całych sekwencjach
polipeptydowych według wynalazku, takich jak CCX-CKR2 (np. SEK ID NR:2) lub domenach zewnątrzko5
mórkowych polipeptydów według wynalazku), przy porównywaniu i dopasowaniu w celu uzyskania maksymalnej zgodności w oknie porównywania lub określonym regionie, co mierzy się z zastosowaniem jednego z
następujących algorytmów porównywania sekwencji lub przez manualne dopasowanie sekwencji i ich kontrolę wizualną. Zatem takie sekwencje są opisywane jako "zasadniczo podobne. Ewentualnie identyczność
ta występuje w regionie o długości przynajmniej około 50 aminokwasów lub korzystniej w regionie, który ma
10
długość co najmniej około 100 do 500 lub 1000 lub więcej aminokwasów.
[0050] Do porównywania sekwencji zazwyczaj jedna sekwencja działa jako sekwencja odniesienia, z którą
porównywana jest badana sekwencja. Przy zastosowaniu algorytmu porównywania sekwencji sekwencje
badaną i odniesienia wprowadza się do komputera, wyznacza się współrzędne subsekwencji, gdy jest to
konieczne, oraz projektuje się parametry programu z algorytmem do porównywania sekwencji. Można zasto-
15
sować domyślne parametry programu lub alternatywnie można zaprojektować inne parametry. Następnie, w
oparciu o parametry programu, algorytm porównywania sekwencji oblicza procent identyczności sekwencji
dla badanych sekwencji względem sekwencji odniesienia.
[0051] W zastosowanym tutaj znaczeniu termin "okno porównywania" obejmuje odniesienie do segmentu
jakiejkolwiek liczby ciągłych pozycji wybranej z grupy obejmującej, np., sekwencję pełnej długości lub od 20
20
do 600, około 50 do około 200 lub około 100 do około 150 aminokwasów lub nukleotydów, w którym sekwencję można porównać z sekwencją odniesienia o tej samej liczbie ciągłych pozycji po optymalnym dopasowaniu tych dwóch sekwencji. Sposoby dopasowywania sekwencji w celu ich porównania są dobrze znane
w dziedzinie wynalazku. Optymalne dopasowanie sekwencji do porównania można przeprowadzić, np.,
przez algorytm miejscowej homologii Smitha i Watermana (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, przez algorytm
25
dopasowania homologii Needlemana i Wunscha (1970) J. Mol. Biol. 48:443, przez poszukiwanie podobieństwa metodą Pearsona i Lipmana (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, przez skomputeryzowane
wdrożenia tych algorytmów (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA w pakiecie Wisconsin Genetics Software
Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) lub przez manualne dopasowanie i
kontrolę wizualną (patrz, np. Ausubel i inni, Current Protocols in Molecular Biology (1995, suplement)).
30
[0052] Przykładem algorytmów, które są odpowiednie do określania procentu identyczności sekwencji i podobieństwa sekwencji są algorytmy BLAST i BLAST 2.0, które opisano odpowiednio w Altschul i inni (1977)
Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 oraz w Altschul i inni (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Oprogramowanie do
przeprowadzenia analiz BLAST jest dostępne publicznie przez National Center for Biotechnology Information
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Algorytm ten obejmuje najpierw identyfikację par sekwencji o wysokiej punk-
35
tacji (HSP) przez identyfikację w sekwencji zapytania krótkich słów o długości W, które jakkolwiek są dopasowane lub spełniają pewną wartość progową punktacji T o wartości dodatniej przy dopasowaniu ze słowem
o tej samej długości w sekwencji z bazy danych. T określa się jako wartość progową punktacji dla słowa
sąsiedniego (Altschul i inni, jak wyżej). Te początkowe dopasowania słowa sąsiedniego działają jako zalążki
do rozpoczęcia poszukiwań w celu znalezienia zawierających je dłuższych HSP. Dopasowane słowa są
40
wydłużane w obu kierunkach wzdłuż każdej sekwencji tak długo jak rośnie skumulowana punktacja dopasowania. Skumulowane punktacje oblicza się z zastosowaniem, dla sekwencji nukleotydowych, parametrów M
(punktacja nagrody dla pary pasujących reszt; zawsze > 0) i N (punktacja kary za nie pasujące reszty; zaw10
EP 1 692 102 B1
sze < 0). Dla sekwencji aminokwasowych do obliczenia zbiorczej punktacji stosuje się macierz punktującą.
Wydłużanie dopasowanych słów w obu kierunkach jest zatrzymywane gdy: skumulowana punktacja dopasowania spadnie o wartość X od swojej maksymalnej uzyskanej wartości; skumulowana punktacja spadnie
do zera lub poniżej, ze względu na nagromadzenie się jednego lub więcej dopasowań reszt z ujemną punk5
tacją; lub po osiągnięciu końca którejkolwiek z sekwencji. Parametry W, T i X algorytmu BLAST określają
czułość i szybkość dopasowania. Program BLASTN (dla sekwencji nukleotydowych) wykorzystuje domyślnie
długość słowa (W) 11, oczekiwanie (E) lub 10, M=5, N=-4 i porównywanie obydwu nici. Dla sekwencji aminokwasowych program BLASTP wykorzystuje domyślnie długość słowa 3 i oczekiwanie (E) 10 i dopasowywanie (B) macierzy punktującej BLOSUM62 (patrz Henikoff i Henikoff (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
10
89:10915) wynoszące 50, oczekiwanie (E) 10, M=5, N=-4 i porównywanie obu nici.
[0053] Algorytm BLAST także przeprowadza analizę statystyczną podobieństwa między dwoma sekwencjami (patrz, np., Karlin i Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Jedną z miar podobieństwa
dostarczaną przez algorytm BLAST jest prawdopodobieństwo najmniejszej sumy (P(N)), które dostarcza
wskazówki, z jakim prawdopodobieństwem dopasowanie między dwiema sekwencjami nukleotydowymi lub
15
aminokwasowymi wystąpi przypadkowo. Na przykład, kwas nukleinowy jest uznawany za podobny do sekwencji odniesienia, jeżeli prawdopodobieństwo najmniejszej sumy w porównaniu badanego kwasu nukleinowego z kwasem nukleinowym odniesienia jest niższe niż około 0,2, korzystniej niższe niż około 0,01, a
najkorzystniej niższe niż około 0,001.
[0054] Wskazaniem, że dwie sekwencje kwasu nukleinowego lub polipeptydy są zasadniczo identyczne jest
20
to, że polipeptyd kodowany przez pierwszy kwas nukleinowy jest immunologicznie reaktywny krzyżowo z
przeciwciałami wzbudzonymi przeciw polipeptydowi kodowanemu przez drugi kwas nukleinowy, jak opisano
poniżej. Zatem, polipeptyd jest zazwyczaj zasadniczo identyczny z drugim polipeptydem gdy, na przykład,
gdy te dwa polipeptydy różnią się tylko podstawieniami konserwatywnymi. Innym wskazaniem, że dwie sekwencje kwasu nukleinowego są zasadniczo identyczne jest to, że te dwie cząsteczki, lub cząsteczki do nich
25
komplementarne, hybrydyzują ze sobą w ostrych warunkach, jak opisano poniżej. Jeszcze innym wskazaniem, że dwie sekwencje kwasu nukleinowego są zasadniczo identyczne jest to, że do amplifikacji sekwencji
można zastosować te same startery.
[0055] Termin "modulatory" aktywności CCX-CKR2 stosuje się w odniesieniu do cząsteczek, które bezpośrednio lub pośrednio zwiększają lub obniżają aktywność CCX-CKR2 i obejmuje on te cząsteczki zidentyfi-
30
kowane z zastosowaniem testów dla CCX-CKR2 wiązania lub przekazywania sygnału in vitro i in vivo. Aktywność CCX-CKR2 można zwiększyć, np. przez skontaktowanie polipeptydu CCX-CKR2 z agonistą i/lub, w
niektórych przypadkach, przez ekspresję CCX-CKR2 w komórce. Termin agoniści dotyczy cząsteczek, które
zwiększają aktywność CCX-CKR2. Agoniści są środkami, które, np. wiążą się z, stymulują, zwiększają,
otwierają, aktywują, ułatwiają, wzmacniają aktywację, uwrażliwiają lub podwyższają aktywność CCX-CKR2.
35
Modulatory mogą współzawodniczyć o wiązanie z CCX-CKR2 ze znanymi ligandami CCX-CKR2, takimi jak
SDF-1 i I-TAC i małymi cząsteczkami jak tu opisane.
[0056] Termin antagoniści dotyczy cząsteczek, które hamują aktywność CCX-CKR2, np. przez blokowanie
wiązania agonistów, takich jak I-TAC lub SDF-1. Antagoniści są środkami, które, np. wiążą, częściowo lub
całkowicie blokują stymulację, obniżają przeciwdziałają, opóźniają aktywację, inaktywują, zmniejszają wraż-
40
liwość lub obniżają aktywność CCX-CKR2.
[0057] Modulatory obejmują środki, które, np., zmieniają oddziaływanie CCX-CKR2 z: białkami wiążącymi
aktywatory lub inhibitory, receptorami, włącznie z receptorami sprzężonymi z białkami G (GPCR), kinazami
11
EP 1 692 102 B1
itd. Modulatory obejmują genetycznie zmodyfikowane wersje naturalnie występujących ligandów receptorów
chemokinowych, np. o zmienionej aktywności, a także naturalnie występujące i syntetyczne ligandy, antagonistów, agonistów, małe cząsteczki chemiczne, siRNA itp. Testy dla inhibitorów i aktywatorów obejmują, np.
zastosowanie przypuszczalnych związków modulatorowych na komórce wyrażającej CCX-CKR2, a następ5
nie określenie funkcjonalnych wpływów na przekazywanie sygnału przez CCX-CKR2, np. fosforylacji ERK1
i/lub ERK2 lub aktywacji członków szlaku przekazywania sygnału przez ERK1 lub ERK2 i/lub innych opisanych tutaj wpływów. Próbki lub testy zawierające CCX-CKR2, które potraktowano potencjalnym aktywatorem, inhibitorem lub modulatorem porównuje się z próbkami kontrolnymi bez inhibitora, aktywatora lub modulatora, aby zbadać stopień zahamowania. Próbkom kontrolnym (nietraktowanym inhibitorami) przypisuje
10
się względną wartość aktywności receptora chemokinowego równą 100%. Hamowanie CCX-CKR2 uzyskuje
się gdy wartość aktywności lub ekspresji CCX-CKR2 względem kontroli jest niższa niż około 95%, ewentualnie około 90%, ewentualnie około 80%, ewentualnie około 50% lub około 25-0%. Aktywację CCX-CKR2
uzyskuje się gdy wartość aktywności lub ekspresji CCX-CKR2 względem kontroli wynosi przynajmniej około
105%, około 110%, ewentualnie przynajmniej około 105%, około 150%, ewentualnie przynajmniej około
15
105%, około 200-500% lub przynajmniej około 105%, około 1000-3000% lub więcej.
[0058] Termin "siRNA" dotyczy małych interferujących RNA, które są zdolne do wywołania interferencji z
ekspresją genu i mogą spowodować posttranskrypcyjne wyciszenie specyficznych genów w komórkach, na
przykład, komórkach ssaczych (w tym komórkach ludzkich) oraz w organizmie, na przykład, organizmie ssaka (w tym człowieka). Fenomen interferencji RNA opisano i omówiono w Bass, Nature 411: 428-29 (2001);
20
Elbahir i inni, Nature 411: 494-98 (2001); oraz Fire i inni, Nature 391: 806-11 (1998); oraz WO 01/75164,
gdzie omówiono także sposoby wytwarzają interferujących RNA. siRNA oparte na sekwencjach i kwasach
nukleinowych kodujących ujawnione tutaj produkty genów zazwyczaj zawierają mniej niż 100 par zasad i
mogą mieć długość, np. około 30 pz lub krótszą i można je wytwarzać z zastosowaniem podejśćznanych w
dziedzinie obejmujących zastosowanie komplementarnych nici DNA lub podejść syntetycznych. siRNA są
25
zdolne do wywoływania interferencji i mogą wywołać posttranskrypcyjne wyciszenie konkretnych genów w
komórkach, na przykład, komórkach ssaczych (w tym komórkach ludzkich) i w organizmie, na przykład, organizmach ssaczych (w tym człowieka). Przykładowe siRNA według wynalazku mogą mieć długość do 29
pz, 25 pz, 22 pz, 21 pz, 20 pz, 15 pz, 10 pz, 5 pz lub dowolnej wartości liczby całkowitej zbliżonej do tych
wartości lub znajdującej się pomiędzy tymi wartościami. Narzędzia do zaprojektowania hamujących siRNA
30
obejmują te dostępne z DNAengine Inc. (Seattle, WA) i Ambion, Inc. (Austin, TX).
[0059] W jednej z technik RNAi stosuje się konstrukty genetyczne, w których sekwencję sensowną i antysensowną umieszcza się w regionach flankujących sekwencję intronu w prawidłowej orientacji do składania
z miejscami donorowym i akceptorowym do składania. Alternatywnie, aby rozdzielić w konstrukcie regiony
sekwencji komplementarne względem siebie można zastosować sekwencje odstępnikowe o różnych długo-
35
ściach. Podczas obróbki transkryptu konstruktu genowego sekwencje intronów są wycinane, umożliwiając
sekwencji sensownej i antysensownej, a także sekwencji łącznikowych do składania, związanie z wytworzeniem dwuniciowego RNA. Następnie wybrane rybonukleazy wiążą się i rozszczepiają dwuniciowy RNA, co
zapoczątkowuje kaskadę zdarzeń prowadzącą do degradacji specyficznych sekwencji mRNA oraz wyciszenie specyficznych genów.
40
[0060] Określenie "związek" dotyczy konkretnej cząsteczki i obejmuje jej enencjomery, diastereoizomery,
odmiany polimorficzne i sole.
[0061] Określenie "heteroatom" dotyczy związanego atomu azotu, tlenu lub siarki.
12
EP 1 692 102 B1
[0062] Określenie "podstawiona" dotyczy grupy, która jest związana z cząsteczką lub grupą macierzystą.
Zatem, pierścień benzenowy mający podstawnik metylowy oznacza benzen podstawiony metylem. Podobnie, pierścień benzenowy zawierający 5 podstawników wodorowych będzie niepodstawioną grupą fenylową,
gdy jest związany z cząsteczką macierzystą.
5
[0063] Określenie "podstawiony heteroatom" dotyczy grupy, w której heteroatom jest podstawiony. Heteroatom może być podstawiony grupą lub atomem, w tym, ale nie wyłącznie, atomem wodoru, fluorowca, grupą
alkilową, alkilenową, alkenylową, alkinylową, arylową, arylenową, cykloalkilową, cykloalkilenową, heteroarylową, heteroarylenową, heterocyklilową, karbocyklilową, hydroksylową, alkoksylową, aryloksylową i sulfonylową. Reprezentatywne podstawione heteroatomy obejmują, dla przykładu, grupę cyklopropyloaminową,
10
izopropyloaminową, benzyloaminową i fenoksylową.
[0064] Określenie "alkil" dotyczy jednowartościowej, nasyconej grupy węglowodorowej, która może być liniowa lub rozgałęziona. O ile nie określono inaczej, takie grupy alkilowe zazwyczaj zawierają od 1 do 10
atomów węgla. Reprezentatywne grupy alkilowe obejmują, dla przykładu, metyl, etyl, n-propyl, izopropyl, nbutyl, sec-butyl, izobutyl, tert-butyl, n-pentyl, n-heksyl, n-heptyl, n-oktyl, n-nonyl, n-decyl itp.
15
[0065] Określenie "alkilen" dotyczy dwuwartościowej, nasyconej grupy węglowodorowej, która może być
liniowa lub rozgałęziona. O ile nie określono inaczej, takie grupy alkilenowe zazwyczaj zawierają od 1 do 10
atomów węgla. Reprezentatywne grupy alkilenowe obejmują, dla przykładu, metylen, etano-1,2-diyl ("etylen"), propano-1,2-diyl, propano-1,3-diyl, butano-1,4-diyl, pentano-1,5-diyl itp.
[0066] Określenie "alkenyl" dotyczy jednowartościowej, nienasyconej grupy węglowodorowej, która może
20
być liniowa lub rozgałęziona, i która ma przynajmniej jedno, a zazwyczaj 1, 2 lub 3 wiązania podwójne węgiel-węgiel. O ile nie określono inaczej, takie grupy alkenylowe zazwyczaj zawierają od 2 do 10 atomów węgla. Reprezentatywne grupy alkenylowe obejmują, dla przykładu, etenyl, n-propenyl, izopropenyl, n-but-2enyl, n-heks-3-enyl itp.
[0067] Określenie "alkinyl" dotyczy jednowartościowej, nienasyconej grupy węglowodorowej, która może być
25
liniowa lub rozgałęziona, i która ma przynajmniej jedno, a zazwyczaj 1, 2 lub 3 wiązania potrójne węgielwęgiel. O ile nie określono inaczej, takie grupy alkinylowe zazwyczaj zawierają od 2 do 10 atomów węgla.
Reprezentatywne grupy alkinylowe obejmują, dla przykładu, etynyl, n-propynyl, n-but-2-ynyl, n-heks-3-ynyl
itp.
[0068] Określenie "aryl" dotyczy jednowartościowej, aromatycznej grupy węglowodorowej mającej pojedyn-
30
czy pierścień (czyli fenyl) lub pierścienie skondensowane (np. naftalen). O ile nie określono inaczej, takie
grupy arylowe zazwyczaj zawierają od 6 do 10 atomów węgla tworzących pierścień. Reprezentatywne grupy
arylowe obejmują, dla przykładu, fenyl i naftalen-1-yl, naftalen-2-yl itp.
[0069] Określenie "grupa arylenowa" dotyczy dwuwartościowej, aromatycznej grupy węglowodorowej mającej pojedynczy pierścień (np. fenylen) lub pierścienie skondensowane (np. naftalenodiyl). O ile nie określono
35
inaczej, takie grupy arylenowe zazwyczaj zawierają od 6 do 10 atomów węgla tworzących pierścień. Reprezentatywne grupy arylenowe obejmują, dla przykładu, 1,2-fenylen, 1,3-fenyl, 1,4-fenylen, naftaleno-1,5-diyl,
naftaleno-2,7-diyl itp.
[0070] Określenie "aralkil" dotyczy grupy alkilowej podstawionej arylem. Reprezentatywne grupy aralkilowe
obejmują benzyl.
40
[0071] Określenie "cykloalkil" dotyczy jednowartościowej, nasyconej karbocyklicznej grupy węglowodorowej
mającej pojedynczy pierścień lub pierścienie skondensowane. O ile nie określono inaczej, takie grupy cyklo-
13
EP 1 692 102 B1
alkilowe zazwyczaj zawierają od 3 do 10 atomów węgla. Reprezentatywne grupy cykloalkilowe obejmują,
drogą przykładu, cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cykloheksyl itp.
[0072] Określenie "cykloalkilen" dotyczy dwuwartościowej, nasyconej karbocyklicznej grupy węglowodorowej
mającej pojedynczy pierścień lub pierścienie skondensowane. O ile nie określono inaczej, takie grupy cyklo5
alkilenowe zazwyczaj zawierają od 3 do 10 atomów węgla. Reprezentatywne grupy cykloalkilenowe obejmują, dla przykładu, cyklopropano-1,2-diyl, cyklobutylo-1,2-diyl, cyklobutylo-1,3-diyl, cyklopentylo-1,2-diyl, cykclopentylo-1,3-diyl, cykloheksylo-1,2-diyl, cykloheksylo-1,3-diyl, cykloheksylo-1,4-diyl itp.
[0073] Określenie "heteroaryl" dotyczy podstawionej lub niepodstawionej jednowartościowej grupy aromatycznej mającej pojedynczy pierścień lub pierścienie skondensowane i zawierającej w pierścieniu przynajm-
10
niej jeden heteroatom (zazwyczaj 1 do 3 heteroatomów) wybrany spośród atomu azotu, tlenu i siarki. O ile
nie określono inaczej, takie grupy heteroarylowe zazwyczaj zawierają w łącznie od 5 do 10 atomów tworzących pierścień. Reprezentatywne grupy heteroarylowe obejmują, dla przykładu, jednowartościowe reszty
pirolu, imidazolu, tiazolu, oksazolu, furanu, tiofenu, triazolu, pirazolu, izoksazolu, izotiazolu, pirydyny, pirazyny, pirydazyny, pirymidyny, triazyny, indolu, benzofuranu, benzotiofenu, benzimidazolu, benzotiazolu, chino-
15
liny, izochinoliny, chinazoliny, chinoksaliny itp., przy czym punkt przyłączenia znajduje się przy którymkolwiek dostępnym atomie węgla lub azotu pierścienia.
[0074] Określenie "heteroarylen" dotyczy dwuwartościowej grupy aromatycznej mającej pojedynczy pierścień lub pierścienie skondensowane i zawierającej w pierścieniu przynajmniej jeden heteroatom (zazwyczaj
1 do 3 heteroatomów) wybrany spośród azotu, tlenu i siarki. O ile nie określono inaczej, takie grupy hetero-
20
arylenowe zazwyczaj zawierają łącznie do 5 do 10 atomów tworzących pierścień. Reprezentatywne grupy
heteroarylenowe obejmują, dla przykładu, dwuwartościowe reszty pirolu, imidazolu, tiazolu, oksazolu, furanu,
tiofenu, triazolu, pirazolu, izoksazolu, izotiazolu, pirydyny, pirazyny, pirydazyny, pirymidyny, triazyny, indolu,
benzofuranu, benzotiofenu, benzoimidazolu, benzotiazolu, chinoliny, izochinoliny, chinazoliny, chinoksaliny
itp., przy czym punkt przyłączenia znajduje się na którymkolwiek dostępnym atomie węgla lub azotu pier-
25
ścienia.
[0075] Określenie "heterocyklil" lub "grupa heterocykliczna" dotyczy grupy podstawionej lub niepodstawionej,
jednowartościowej, nasyconej lub nienasyconej (niearomatycznej), mającej pojedynczy pierścień lub wiele
skondensowanych pierścieni i zawierającej w pierścieniu przynajmniej jeden heteroatom (zazwyczaj 1 do 3
heteroatomów) wybrany spośród azotu, tlenu i siarki. O ile nie określono inaczej, takie grupy heterocykliczne
30
zazwyczaj zawierają w całości 2 do 9 atomów tworzących pierścień. Reprezentatywne grupy heterocykliczne
obejmują, dla przykładu, jednowartościowe reszty pirolidyny, morfoliny, imidazolidyny, pirazolidyny, piperydyny, 1,4-dioksanu, tiomorfoliny, piperazyny, 3-piroliny itp., gdzie punkt przyłączenia znajduje się na którymkolwiek dostępnym atomie węgla lub azotu pierścienia.
[0076] Określenie " karbocykl" dotyczy pierścienia aromatycznego lub niearomatycznego, w którym każdym
35
atomem w pierścieniu jest atom węgla. Reprezentatywne karbocykle obejmują cykloheksan, cykloheksen i
benzen.
[0077] Określenia "halo" lub "halogen" dotyczy grupy fluorowej- (-F), chlorowej- (-Cl), bromowej- (-Br) i jodowej- (-I).
[0078] Określenie "hydroksyl" lub "grupa hydroksylowa" dotyczy grupy -OH.
40
[0079] Określenie "alkoksyl" dotyczy grupy -OR, w której R może być podstawionym lub niepodstawionym
alkilem, alkilenem, cykloalkieml lub cykloalkilenem. Odpowiednie podstawniki obejmują grupę halo, cyjano-
14
EP 1 692 102 B1
wą, alkilową, aminową, hydroksylową, alkoksylową i amidową. Reprezentatywne grupy alkoksylowe obejmują, dla przykładu, metoksyl, etoksyl, izopropyloksyl i trifluorometoksyl.
[0080] Określenie "aryloksyl" dotyczy grupy -OR, gdzie R może być podstawioną lub nie podstawioną grupą
arylową lub heteroarylową. Reprezentatywne grupy aryloksylowe obejmują fenoksyl.
5
[0081] Określenie "sulfonyl" dotyczy grupy -S(O)2- lub -S(O)2R, gdzie R może być grupą alkilową, alkilenową, alkenylową, alkinylową, arylową, cykloalkilową, cykloalkilenową, heteroarylową, heteroarylenową, heterocykliczną lub halogenową. Reprezentatywne grupy sulfonylowe obejmują, dla przykładu sulfonian, sulfonoamid, halogenki sulfonylu i dipropyloamidosulfonian.
[0082] Określenie "kondensacja" dotyczy reakcji, w której dwie lub więcej cząsteczek łączy się kowalencyj-
10
nie ze sobą. Podobnie, produktami kondensacji są produkty utworzone w reakcji kondensacji.
SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU
I. Wstęp
15
[0083] Niniejszy wynalazek dostarcza odkrycia, że sierocy receptor RDC1, nazywany tutaj CCX-CKR2, wiąże ligandy chemokinowe SDF1 i I-TAC. Ponadto, niniejszy wynalazek dostarcza zaskakującego odkrycia
uwikłania CCX-CKR2 w nowotwór. Zatem, wynalazek dostarcza sposobów diagnozowania nowotworu przez
wykrywanie CCX-CKR2. Wynalazek także dostarcza sposobów hamowania nowotworu przez podawanie
modulatora CCX-CKR2 pacjentowi z nowotworem.
20
II. Polipeptydy i polinukleotydy CCX-CKR2
[0084] W wielu wykonaniach niniejszego wynalazku, kwasu nukleinowe kodujące polipeptydy CCX-CKR2
będące przedmiotem zainteresowania będą izolowane i klonowane z zastosowaniem metod rekombinacji.
Takie postaci stosuje się, przykładowo, do izolacji polinukleotydów CCX-CKR2 (np., SEK ID NR:1, SEK ID
NR:3, SEK ID NR:5, SEK ID NR:7 i SEK ID NR:9) do ekspresji białka lub podczas wytwarzania wariantów,
25
pochodnych, kaset ekspresyjnych lub innych sekwencji pochodzących z polipeptydu CCX-CKR2 (np., SEK
ID NR:2, SEK ID NR:4, SEK ID NR:6, SEK ID NR:8 i SEK ID NR:10), do monitorowania ekspresji genu CCXCKR2, do izolacji i wykrywania sekwencji CCX-CKR2 w różnych gatunkach, do celów diagnostycznych u
pacjenta, np., do wykrycia mutacji w CCX-CKR2 lub wykrycia ekspresji kwasów nukleinowych CCX-CKR2
lub polipeptydów CCX-CKR2. W niektórych wykonaniach sekwencje kodujące CCX-CKR2 sprzęga się funk-
30
cjonalnie z heterologicznym promotorem. W niektórych wykonaniach, kwasy nukleinowe według wynalazku
pochodzą od dowolnego ssaka, w tym, w szczególności, np., człowieka, myszy szczura, psa itd.
[0085] W niektórych przypadkach, polipeptydy CCX-CKR2 według wynalazku zawierają zewnątrzkomórkowe
aminokwasy ludzkiej sekwencji CCX-CKR2 (np. SEK ID NR:2, SEK ID NR:4, SEK ID NR:6, SEK ID NR:8 i
SEK ID NR:10)), podczas gdy inne reszty są zmienione lub nieobecne. W innych wykonaniach polipeptydy
35
CCX-CKR2 zawierają wiążące ligand fragmenty CCX-CKR2. Na przykład, w niektórych przypadkach, fragmenty te wiążą I-TAC i/lub SDF1. Struktura receptorów siedmiotransbłonowych (z których jednym jest CCXCKR2) jest dobrze znana specjalistom w dziedzinie, a zatem można łatwo wyznaczyć domeny transbłonowe.
Na przykład, łatwo dostępne algorytmy hydrofobowości można znaleźć w bazie danych G Protein-Coupled
Receptor Data Base (GPCRDB), np., http://www.gpcr.org/7tm/seq/DR/RDC1_HUMAN.TABDR.html lub
40
http://www.gpcr.org/7tm/seq/vis/swac/P25106.html.
[0086] Wynalazek dotyczy rutynowych technik w dziedzinie genetyki rekombinacyjnej. Podstawowe teksty
ujawniające ogólne metody znajdujące zastosowanie w wynalazku obejmują Sambrook i inni, Molecular
15
EP 1 692 102 B1
Cloning, A Laboratory Manual (wydanie 3 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); oraz Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel i inni, red., 1994)).
[0087] Odpowiednie startery i sondy do identyfikacji genów kodujących CCX-CKR2 z tkanek ssaczych mogą
pochodzić z dostarczonych tutaj sekwencji (np. SEK ID NR:1). Ogólny opis PCR, patrz, Innis i inni PCR Pro5
tocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego (1990).
III. Opracowanie specyficznych terapeutyków
[0088] Cząsteczki wiążące CCX-CKR2, włącznie z modulatorami funkcji CCX-CKR2, tj. agonistami lub antagonistami lub środkami o aktywności CCX-CKR2, są przydatne w leczeniu wielu chorób ssaków, w tym nowotworu.
10
[0089] Choroby lub stany ludzi lub innych gatunków, które można leczyć antagonistami receptora chemokinowego lub innymi inhibitorami funkcji receptora chemokinowego obejmują, ale nie wyłącznie, np., raki, glejaki, międzybłoniaki, czerniaki, chłoniaki, białaczki, gruczolakoraki, raka sutka, raka jajnika, raka szyjki macicy, glejaka, białaczkę, chłoniaka, raka gruczołu krokowego oraz chłoniaka Burkitta, raka głowy i szyi, raka
okrężnicy, raka jelita grubego i odbytu, niedrobnokomórkowego raka płuc, drobnokomórkowego raka płuc,
15
raka przełyku, raka żołądka, raka trzustki, raka układu wątrobowo-żółciowego, raka pęcherzyka żółciowego,
raka jelita cienkiego, raka odbytnicy, raka nerek, raka pęcherza moczowego, raka gruczołu krokowego, raka
penisa, raka cewki moczowej, raka jądra, raka szyjki macicy, raka pochwy, raka macicy, raka jajnika, raka
tarczycy, raka przytarczyc, raka nadnerczy, nowotwór z komórek wewnątrzwydzielniczych trzustki, rakowiaka, raka kości, raka skóry, siatkówczaka złośliwego, chłoniaka Hodgkina, chłoniaka nieziarniczego (dodat-
20
kowe nowotwory, patrz CANCER:PRINCIPLES AND PRACTICE (DeVita, VT i inni, red. 1997)); a także zaburzenia czynności mózgu i neuronalne, takie jak choroba Alzheimera i stwardnienie rozsiane; niewydolność
nerek; reumatoidalne zapalenie stawów; odrzucenie przeszczepu serca; miażdżycę; astmę; kłębuszkowe
zapalenie nerek; kontaktowe zapalenie skóry; zapalenie jelit; zapalenie okrężnicy; łuszczycę; uszkodzenie
reperfuzyjne; jak również inne opisane tutaj choroby i zaburzenia.
25
[0090] Alternatywnie, agonistę CCX-CKR2 można stosować do leczenia choroby, np. w dysfunkcji nerek,
mózgu lub neuronalnej w przypadkach gdy środkiem leczniczym jest mobilizacja komórek macierzystych.
A. Sposoby identyfikacji modulatorów receptorów chemokinowych
[0091] Kilka różnych protokołów przeszukiwania można zastosować do identyfikacji środków, które modulują
poziom aktywności lub działanie CCX-CKR2 w komórkach, w szczególności, w komórkach ssaczych, a
30
zwłaszcza w komórkach ludzkich. Ogólnie, sposoby przeszukiwania obejmują przeszukiwanie wielu środków
w celu identyfikacji środka, który oddziałuje z CCX-CKR2 (lub jego domeną zewnątrzkomórkową), na przykład, przez wiązanie CCX-CKR2, przeciwdziałanie wiązaniu liganda (np. I-TAC i/lub SDF1) z CCX-CKR2 lub
aktywacji CCX-CKR2. W niektórych postaciach, środek wiąże CCX-CKR2 z przynajmniej około 1,5-, 2-, 3-,
4-, 5-, 10-, 20-, 50-, 100-, 300-, 500- lub 1000-krotnie wyższym powinowactwem względem innego białka.
35
1. Testy wiązania receptora chemokinowego
[0092] W niektórych wykonaniach, modulatory CCX-CKR2 identyfikuje się przez poszukanie cząsteczek,
które współzawodniczą z ligandem CCX-CKR2, takim jak SDF1 lub I-TAC. Specjaliści w dziedzinie wynalazku docenią, że istnieje wiele sposobów przeprowadzenia analiz współzawodnictwa. W niektórych wykonaniach, próbki z CCX-CKR2 pre-inkubuje się ze znakowanym ligandem CCX-CKR2, a następnie kontaktuje z
40
cząsteczką potencjalnie współzawodniczącą. Zmiana (np., zmniejszenie) ilości liganda związanego z CCXCKR2 oznacza, że cząsteczka ta jest potencjalnym modulatorem CCX-CKR2.
16
EP 1 692 102 B1
[0093] Początkowe badania można przeprowadzić przez przeszukiwanie w celu znalezienia środków zdolnych do wiązania się z CCX-CKR2, ponieważ przynajmniej niektóre ze środków tak zidentyfikowanych są
prawdopodobnie modulatorami receptora chemokinowego. Testy wiążące zazwyczaj obejmują skontaktowanie CCX-CKR2 z jednym lub większą liczbą badanych środków i pozostawienie ich na wystarczający
5
czas, aby białko i badane środki wytworzyły związany kompleks. Jakikolwiek związany kompleks można
wykryć z zastosowaniem dowolnej liczby ustalonych technik analitycznych. Testy wiązania białka obejmują,
ale nie wyłącznie, immunohistochemiczne testy wiązania, cytometrię przepływową, wiązanie liganda znakowanego radioaktywnie, wiązanie liganda znakowanego europem, wiązanie liganda znakowanego biotyną lub
inne testy, które zachowują konformację CCX-CKR2. Receptor chemokinowy wykorzystywany w takich te-
10
stach może być naturalnie wyrażany, klonowany lub syntetyzowany. Na przykład, przez skontaktowanie
CCX-CKR2 z potencjalnym agonista i pomiar aktywności CCX-CKR2 możliwe jest zidentyfikowanie tych
cząsteczek, które stymulują aktywność CCX-CKR2.
2. Komórki i odczynniki
[0094] Sposoby przeszukiwania według wynalazku można przeprowadzić jako testy in vitro lub testy oparte
15
na komórkach. Testy in vitro przeprowadza się, na przykład, z zastosowaniem frakcji błonowych lub całych
komórek zawierających CCX-CKR2. Testy oparte na komórkach można przeprowadzić w dowolnych komórkach, w których wyrażany jest CCX-CKR2.
[0095] Testy oparte na komórkach obejmują całe komórki lub frakcje komórek zawierające CCX-CKR2 do
poszukania środka wiążącego lub modulacji aktywności CCX-CKR2 przez ten środek. Przykładowe typy
20
komórek, które mogą być stosowane zgodnie ze sposobami według wynalazku obejmują, np., dowolne komórki ssacze, w tym, leukocyty, takie jak neutrofile, monocyty, makrofagi, eozynofile, bazofile, komórki tuczne i limfocyty, takie jak komórki T i komórki B, komórki białaczki, chłoniaka Burkitta, komórki nowotworowe,
komórki śródbłonka, fibroblasty, komórki mięśnia sercowego, komórki mięśniowe, komórki raka sutka, raków
jajnika, raków szyjki macicy, glejaków, komórki wątroby, komórki nerki i komórki nerwowe, a także komórki
25
grzybów, w tym drożdży. Komórki mogą być komórkami pierwotnymi lub nowotworowymi lub innymi typami
nieśmiertelnych linii komórkowych. Oczywiście, CCX-CKR2 może być wyrażany w komórkach, które nie
wyrażają endogennej wersji CCX-CKR2.
[0096] W pewnych przypadkach do przeszukiwania można zastosować fragmenty CCX-CKR2, a także fuzje
białkowe. Gdy pożądane są cząsteczki, które współzawodniczą o wiązanie z ligandami CCX-CKR2, stoso-
30
wanymi fragmentami CCX-CKR2 są fragmenty zdolne do wiązania ligandów (np., zdolne do wiązania I-TAC
lub SDF1). Inaczej, jakikolwiek fragment CCX-CKR2 można zastosować jako cel do identyfikacji cząsteczek
wiążących CCX-CKR2. CCX-Fragmenty CKR2 mogą obejmować jakikolwiek fragment długości, np. przynajmniej 20, 30, 40, 50 aminokwasów aż do białka zawierającego wszystkie, za wyjątkiem jednego, aminokwasy CCX-CKR2. Zazwyczaj, fragmenty wiążące ligand będą zawierały regiony transbłonowe i/lub więk-
35
szość lub wszystkie domeny zewnątrzkomórkowe CCX-CKR2.
3. Aktywność przekazywania sygnału
[0097] W niektórych wykonaniach, przekazywanie sygnału wywołane przez aktywację CCX-CKR2 stosuje
się do identyfikacji modulatorów CCX-CKR2. Aktywność przekazywania sygnału przez receptory chemokinowe można wyznaczyć na wiele sposobów. Na przykład, przekazywanie sygnału można określić przez
40
przyleganie komórek, w którym uczestniczy receptor chemokinowy. Oddziaływanie pomiędzy chemokinami i
receptorami chemokinowymi mogą doprowadzić do szybkiego przylegania przez modyfikację powinowactwa
i zachłanności integryn. Patrz, np., Laudanna, Immunological Reviews 186:37-46 (2002).
17
EP 1 692 102 B1
[0098] Przekazywanie sygnału można także zmierzyć przez określenie, jakościowo i ilościowo, wtórnych
przekaźników, takich jak cykliczny AMP lub fosforany inozytolu, a także można monitorować przypadki fosforylacji lub defosforylacji. Patrz, np. Premack, i inni Nature Medicine 2: 1174-1178 (1996) oraz Bokoch, Blood
86:1649-1660 (1995).
5
[0099] Przykłady dostarczają wyników wykazujących, że aktywność CCX-CKR2 odbywa się za pośrednictwem szlaku MAPK, zwłaszcza, że CCX-CKR2 promuje defosforylację białek MAPK ERK1 i ERK2. Przykładowa natywna sekwencja ERK1 jest dostarczona pod nr dostępu GenBank p27361; Przykładowa natywna
sekwencja ERK2 jest dostarczona pod nr dostępu GenBank p28482. Zatem, pewne testy zaprojektowano w
celu wykrycia sygnału w szlaku MAPK. Termin "sygnał" stosowany w odniesieniu do szlaku MAPK dotyczy
10
składnika, który stanowi część tego szlaku i/lub pewnej aktywności lub objawu związanego z tym szlakiem.
Składnikiem tym może być jakakolwiek cząsteczka (np. białko) uczestnicząca (np. wytwarzana, wykorzystywana lub modyfikowana) w szlaku przekazywania sygnału MAPK. Sygnałem w pewnych przypadkach jest
wykrycie fosforylacji białka MAPK, takiego jak ERK1 lub ERK2. Inne sygnały, które można wykryć obejmują
składniki, które są tworzone i/lub wykorzystywane poniżej od fosforylacji ERK1 lub ERK2, jak również aktyw-
15
ności związane z tworzeniem i wykorzystywaniem tych składników. Niektóre testy można przeprowadzać w
celu wykrycia składników, które są tworzone i/lub wykorzystywane powyżej od fosforylacji ERK1 lub ERK2, a
także aktywności związanych z wytwarzaniem lub wykorzystywaniem takich składników powyżej od fosforylacji ERK1 lub ERK2. Jak wskazano powyżej, w przypadku ERK1 lub ERK2, składniki leżące powyżej obejmują, na przykład, Ras, MKKK (np. c-Raf1, B-Raf i A-Raf) i MKK (np. MKK1 i MKK2). Składniki leżące poni-
20
żej obejmują, na przykład, białko p90RSK, c-JUN, c-FOS, CREB i STAT. Zatem, każdy z tych składników
i/lub ich modyfikację (np. fosforylację) można wykrywać w pewnych testach. Ponadto, można także przeprowadzić analizę profilu ekspresji genów i wydzielania białka.
[0100] Niektóre dostarczone testy stosowane do przeszukiwania obejmują wykrycie fosforylacji ERK1 i/lub
ERK2. Fosforylacja tych białek zależy od liganda (np. SDF1, ITAC). Zatem testy w pewnych sposobach
25
przeszukiwania przeprowadza się w obecności ITAC lub SDF1, aby wywołać fosforylację ERK1 i ERK2. Gdy
testy te przeprowadza się z ITAC i SDF1, test można uprościć przez zastosowanie komórek, które nie wyrażają CXCR3 lub CXCR4, ze względów, które opisano powyżej.
[0101] Określenie czy ERK1 lub ERK2 zostało ufosforylowane można przeprowadzić z zastosowaniem różnych podejść. Jednym rozwiązaniem jest zlizowanie komórek po ich inkubacji z ligandem CCX-CKR2 i ba-
30
danym związkiem. Powstały lizat można następnie analizować z zastosowaniem techniki Western blot przez
przeprowadzenie elektroforezy lizatu w celu rozdzielenia białek w żelu, a następnie inkubacji z przeciwciałami, które specyficznie wiążą ufosforylowaną postać ERK1 lub ERK2. Takie przeciwciała są dostępne z Cell
Signaling Technologies of Beverly, MA. Ewentualnie można wyznaczyć ilość obecnego ERK1 lub ERK2 z
zastosowaniem przeciwciał, które specyficznie wiążą zarówno ufosforylowane i nie fosforylowane postaci
35
ERK1 i ERK2. Dalsze szczegóły dotyczące tego podejścia przedstawiono w Przykładach. Inną opcją, która
jest dostosowana do przeszukiwania z wysoką wydajnością jest zastosowanie metody ELISA z wykorzystaniem przeciwciał, które specyficznie wiążą ufosforylowane postaci ERK1 i ERK2. Zestawy do przeprowadzania takich testów w formatach z wysoką wydajnością są także dostępne z Cell Signaling Technologies of
Beverly, MA (Patrz, np. PathScan™ Phospho-p44/42 MAPK (T202/Y204) Sandwich ELISA Kit).
40
[0102] Podobnie techniki Western blotting i ELISA można zastosować do wykrycia obecności białek, które
są składnikami szlaku MAPK poniżej od fosforylacji ERK1 i ERK2 z zastosowaniem przeciwciał, które specyficznie rozpoznają składniki uczestniczące w tym szlaku. Na przykład, fosforylację p90RSK można badać z
18
EP 1 692 102 B1
zastosowaniem dostępnych w handlu fosfo-specyficznych przeciwciał analogicznie do detekcji fosforylowanego ERK2 lub ERK2 techniką Western blot.
[0103] Ponadto w celu określenia aktywności przekazywania sygnału można także monitorować inne zdarzenia poniżej aktywacji CCX-CKR2. Zdarzenia leżące powyżej CCX-CKR2 obejmują te aktywności lub ob5
jawy, które wynikają ze stymulacji receptora chemokinowego. Przykładowe zdarzenia leżące poniżej aktywacji CCX-CKR2 obejmują, np. zmieniony stan komórki (np. od komórki prawidłowej do komórki nowotworowej lub od komórki nowotworowej do komórki nie-nowotworowej). Odpowiedzi komórek obejmują przyleganie komórek (np. do komórek śródbłonkowych). Efekty wywoływane przez modulatory CCX-CKR2 można
także monitorować w ustalonych kaskadach sygnalizacyjnych uczestniczących w angiogenezie (np. przeka-
10
zywanie sygnału przez VEGF). Na przykład testy błony kosmówkowo-owodniowej (CAM) można zastosować
do zbadania wpływu na angiogenezę lub, np. test Milesa można zastosować do badania wpływu na przepuszczalność naczyń.
[0104] W innym przykładzie w zastępstwie aktywności CCX-CKR2 można zmierzyć przeżycie komórek. Jak
opisano bardziej szczegółowo w przykładach, ekspresja CCX-CR2 wywołuje przedłużone przeżycie komórek
15
wyrażających CCX-CR2 hodowanych w warunkach niskiego stężenia surowicy w porównaniu z komórkami
niewyrażającymi CCX-CR2 hodowanymi w tych samych warunkach. Zatem, oczekuje się, że antagonizm
CCX-CR2 zmniejszy przeżycie komórek, podczas gdy oczekuje się, że aktywacja (np. przez agonistów)
zwiększy przeżycie komórek. W konsekwencji, przeżycie komórek i apoptoza mogą służyć do odczytania
aktywności CCX-CR2.
20
[0105] Wiele testów śmierci komórkowej i apoptozy można włączyć do metod przeszukiwania w celu zidentyfikowania modulatorów CCX-CR2. Ogólnie, testy tego typu zazwyczaj obejmują poddanie populacji komórek działaniu warunków, które indukują śmierć komórkową lub apoptozę, zazwyczaj zarówno w obecności,
jak i przy braku badanego związku, który jest potencjalnym modulatorem śmierci komórkowej lub apoptozy.
Test jest następnie przeprowadzany z komórkami, lub ich ekstraktem, w celu oceny wpływu badanego środ-
25
ka na śmierć komórkową lub apoptozę, przez porównanie stopnia śmierci komórkowej lub apoptozy w obecności i przy braku badanego środka. Zamiast badania na śmierć komórek lub apoptozę można przeprowadzić odwrotny typ testu, a mianowicie, można zbadać przeżycie komórek, a także związane z nim aktywności, takie jak wzrost komórek i proliferacja komórek. Bez względu na konkretny typ testu niektóre testy przeprowadza się w obecności liganda, który aktywuje CCX-CR2, takiego jak I-TAC lub SDF-1.
30
[0106] W niniejszych sposobach przeszukiwania można badać wiele różnych parametrów charakterystycznych dla śmierci komórkowej i apoptozy. Przykłady takich parametrów obejmują, ale nie wyłącznie, monitorowanie aktywacji szlaków komórkowych, w celu wykrycia odpowiedzi toksykologicznych przez analizę ekspresji genu lub białka, fragmentacji DNA, zmian w składzie błon komórkowych, przepuszczalności błon, aktywacji składników receptorów śmierci lub dalszych szlaków przekazywania sygnału (np. kaspaz), ogólnych
35
odpowiedzi na stres, aktywacji NF-kappa B oraz odpowiedzi na mitogeny.
[0107] Przy uwzględnieniu roli, którą CCX-CKR2 odgrywa w zmniejszaniu apoptozy inne podejście ma na
celu zbadanie efektów przeciwnych do apoptozy i śmierci komórek, a mianowicie przeprowadzenie badań, w
których wykrywa się przeżycie komórek lub proliferację komórek. Przeżycie komórek można wykrywać, na
przykład, przez monitorowanie długości czasu, w którym komórki pozostają żywe, długości czasu, w którym
40
pewien procent wyjściowych komórek pozostaje żywych lub wzrostu liczby komórek. Parametry te można
monitorować wizualnie z zastosowaniem ustalonych technik.
19
EP 1 692 102 B1
[0108] Inny test do oceny apoptozy obejmuje wyznakowanie komórek Aneksyną V (sprzężoną z barwnikiem
Alexa Fluor(r) 488) i jodkiem propidyny (PI) (Molecular Probes, Eugene Oregon). PI, wiążący kwas nukleinowye barwnik emitujący czerwoną fluorescencję, jest nieprzepuszczalny zarówno dla komórek żywych, jak
i apoptotycznych. PI znakuje tylko komórki nekrotyczne przez ścisłe związanie kwasów nukleinowych w ko5
mórce. Aneksyna V wykorzystuje fakt, że komórki apoptotyczne przemieszczają fosfatydyloserynę (PS) do
zewnętrznej powierzchni komórki. Aneksyna V jest ludzkim antykoagulantem o wysokim powinowactwie
względem (PS). Komórki apoptotyczne, ale nie komórki żywe, wyrażają PS na swojej powierzchni zewnętrznej. Aneksyna V (znakowana barwnikiem Alexa Fluor(r) 488) znakuje te komórki zieloną fluorescencją. Komórki można następnie analizować z zastosowaniem aktywowanego przez fluorescencję sortera komórek
10
(FACS) w celu oceny fluorescencji w kanałach czerwonym i zielonym: komórki apoptotyczne (pozytywne
względem Aneksyny, negatywne względem PI) emitują fluorescencję jedynie w zielonym kanale; żywe komórki (negatywne względem Aneksyny, negatywne względem PI) wykazują niską fluorescencję zarówno w
kanale czerwonym, jak i zielonym; a komórki nekrotyczne lub nieżywe (pozytywne względem Aneksyny,
pozytywne względem PI) są silnie pozytywne zarówno w kanale czerwonym, jak i zielonym.
15
[0109] Inne sposoby przeszukiwania są oparte na obserwacji, że ekspresja pewnych białek regulatorowych
jest indukowana przez obecność lub aktywację CCX-CR2. Zatem wykrywanie takich białek można zastosować do pośredniego określania aktywności CCX-CR2. Jak opisano bardziej szczegółowo w poniższych
Przykładach przeprowadzono kilka badań ELISA w celu porównania względnych stężeń różnych białek wydzielanych do podłóż do hodowli komórkowych dla komórek transfekowanych CCX-CR2 lub nietransfeko-
20
wanych. Przez te badania określono, że CCX-CR2 indukuje wytwarzanie wielu różnych białek regulatorowych, włącznie z czynnikami wzrostu, chemokinami, metaloproteinazami i inhibitorami metaloproteinaz. Zatem pewne dostarczone sposoby przeszukiwania obejmują określenie czy badany środek moduluje wytwarzanie pewnych czynników wzrostu, chemokin, metaloproteinaz i inhibitorów metaloproteinaz przez CCXCR2. W pewnych przypadkach testy te można przeprowadzić z komórkami (lub ich ekstraktami), które ho-
25
dowano w warunkach ograniczonego stężenia surowicy, gdyż stwierdzono, że zwiększa to wytwarzanie białek indukowanych przez CCX-CR2 (patrz, Przykłady).
[0110] Następujące białka są przykładami różnych klas białek, które wykryto, a także specyficznymi białkami
w każdej z tych klas: (1) czynniki wzrostu (np. GM-CSF); (2) chemokiny (np. RANTES, MCP-1); (3) metaloproteinazy (np. MMP3); oraz (4) inhibitory metaloproteinaz (np. TIMP-1). Oczekuje się, że można w tych
30
różnych klasach wykryć również inne białka.
[0111] Te konkretne białka można wykrywać z zastosowaniem znanych w dziedzinie standardowych immunologicznych metod detekcji. Jednym podejściem, które jest odpowiednie do zastosowania w formacie z
wysoką wydajnością są, na przykład, testy ELISA przeprowadzane w płytkach wielostudzienkowych. Zestaw
ELISA do wykrywania TIMP-1 jest dostępny z DakoCytomation (kod produktu nr EL513). Dalsze przykłady
35
dostawców przeciwciał, które specyficznie wiążą białka wymienione powyżej dostarczono w poniższych
Przykładach. Białka takie jak metaloproteinazy, które są enzymami, można także wykrywać znanymi testami
enzymatycznymi.
[0112] W innych wykonaniach, potencjalne modulatory CCX-CK2 bada się na ich zdolność do modulowania
adhezji komórek. Adhezję komórek nowotworowych do monowarstw komórek śródbłonka badano w modelu
40
inwazyjnego przerzutowania (patrz, np., Blood i Zetter, Biovhem. Biophys. Acta, 1032, 89-119 (1990). Te
monowarstwy komórek śródbłonka naśladują układ naczyń limfatycznych i mogą być stymulowane różnymi
cytokinami i czynnikami wzrostu (np., TNFalfa i IL-1beta). Komórki wyrażające CCX-CKR2 można oceniać
20
EP 1 692 102 B1
pod względem zdolności do adhezji do tej monowarstwy zarówno w statycznych testach adhezji, jak i w testach, w których komórki są poddawane warunkom przepływu, co pozwala naśladować siłę w układzie naczyń w naczyniach in vivo. Ponadto, testy oceniające adhezję można przeprowadzić in vivo (patrz, np. von
Andrian, U.H. Microcirculation. 3(3):287-300 (1996)).
5
4. Walidacja
[0113] Środki początkowo zidentyfikowane dowolnym z powyższych sposobów przeszukiwania można badać dalej w celu walidowania pozornej aktywności. Korzystnie, takie badania przeprowadza się z odpowiednimi modelami zwierzęcymi. Podstawowy format takich sposobów obejmuje podawanie związku przewodniego (ang. lead compound) zidentyfikowanego podczas początkowego przeszukiwania zwierzęciu, które
10
służy za model choroby u ludzi, a następnie określenie czy choroba (np. nowotwór) jest w istocie modulowana i/lub czy występuje poprawa choroby lub stanu. Modele zwierzęce wykorzystywane w badaniach walidacyjnych na ogół są ssakami dowolnego rodzaju. Konkretne przykłady odpowiednich zwierząt obejmują, ale
nie wyłącznie, naczelne, myszy, szczury i Danio pręgowane.
B. Środki oddziałujące z CCX-CKR2
15
[0114] Modulatory CCX-CKR2 (np., antagoniści lub agoniści) mogą obejmować, np. przeciwciała (w tym
przeciwciała monoklonalne, humanizowane lub inne znane w dziedzinie typy białek wiążących), niskocząsteczkowe związki organiczne, siRNA, polipeptydy CCX-CKR2 lub ich warianty, chemokiny (w tym, ale nie
wyłącznie, SDF-1 i/lub I-TAC), mimetyki chemokin, polipeptydy chemokinowe itd.
[0115] Środki badane jako modulatory CCX-CKR2 mogą być jakimikolwiek małymi związkami chemicznymi
20
lub cząsteczkami biologicznymi, takimi jak polipeptyd, cukier, kwas nukleinowy lub lipid. Alternatywnie, modulatory mogą być zmienionymi genetycznie wersjami lub wersjami peptydomimetycznymi chemokiny lub
innego liganda. Zazwyczaj badane związki będą małymi związkami chemicznymi lub peptydami. Zasadniczo
jakikolwiek związek chemiczny można zastosować, w testach według wynalazku, jako potencjalny modulator
lub ligand, chociaż najczęściej stosuje się związki, które można rozpuszczać w roztworach wodnych lub
25
organicznych (w szczególności opartych na DMSO). Testy projektuje się, aby przeszukiwać duże biblioteki
związków chemicznych przez zautomatyzowanie etapów testu i dostarczenie związków z jakiegokolwiek
dogodnego źródła do testów, które zazwyczaj analizuje się równolegle (np. w formatach do mikromiareczkowania na płytkach do mikromiareczkowania w testach z zastosowaniem robotów). Należy docenić, że istnieje
wielu dostawców związków chemicznych, w tym Sigma (St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO), Sigma-
30
Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Szwajcaria) itp.
[0116] W niektórych wykonaniach, środki mają masę cząsteczkową niższą niż 1500 Daltonów, a w niektórych przypadkach niższą niż 1000, 800, 600, 500 lub 400 Daltonów. Względnie mała wielkość środków może
być pożądana, ponieważ mniejsze związki z większym prawdopodobieństwem będą wykazywać właściwości
fizykochemiczne zgodne z dobrymi cechami farmakokinetycznymi, włącznie z wchłanianiem po podaniu
35
doustnym, niż związki o większej masie cząsteczkowej. Na przykład, środkami, które z mniejszym prawdopodobieństwem mogą być skuteczne jako leki, w oparciu o przepuszczalność i rozpuszczalność, opisanymi
przez Lipinski i inni, są następujące: niosące więcej niż 5 donorów wiązania H (wyrażonych jako suma -OH i
-NH); mające masę cząsteczkową ponad 500; wykazujące LogP ponad 5 (lub MLogP ponad 4.15); i/lub mające więcej niż 10 akceptorów wiązania H (wyrażonych jako suma N i O). Patrz, np. Lipinski i inni Adv Drug
40
Delivery Res 23:3-25 (1997). Klasy związków, które są substratami transporterów biologicznych są zazwyczaj wyjątkami od tej reguły.
21
EP 1 692 102 B1
[0117] W jednym wykonaniu sposoby prowadzenia przeszukiwania z wysoką wydajnością obejmują dostarczenie kombinatorycznej biblioteki związków chemicznych lub peptydów zawierającej dużą liczbę potencjalnych związków terapeutycznych (potencjalnych związków modulatorowych lub ligandów). Następnie takie
"kombinatoryczne biblioteki związków chemicznych" lub "biblioteki ligandów" przeszukuje się w jednym lub
5
więcej testów, jak tutaj opisano, w celu zidentyfikowania tych członków biblioteki (konkretnych związków
chemicznych lub ich podklas), które wykazują żądaną charakterystyczną aktywność. Tak zidentyfikowane
związki mogą służyć jako konwencjonalne "związki przewodnie" lub mogą być same z siebie stosowane jako
potencjalne lub aktualne terapeutyki.
[0118] Kombinatoryczna biblioteka chemiczna jest zbiorem różnych związków chemicznych wytworzonych z
10
przez syntezę chemiczną lub syntezę biologiczną, przez połączenie wielu chemicznych "bloków budulcowych". Na Przykład, liniowa kombinatoryczna biblioteka chemiczna, taka jak biblioteka polipeptydów, jest
utworzona przez połączenie zestawów chemicznych bloków budulcowych (aminokwasów) w każdy możliwy
sposób dla danej długości związku (tj., liczby aminokwasów w związku polipeptydowym). Przez takie kombinatoryczne mieszanie chemicznych bloków budulcowych można zsyntetyzować miliony związków chemicz-
15
nych.
[0119] Wytwarzanie i przeszukiwanie kombinatorycznych bibliotek związków chemicznych jest dobrze znane
specjalistom w dziedzinie. Takie kombinatoryczne biblioteki związków chemicznych obejmują, ale nie wyłącznie, biblioteki peptydów (patrz, np., opis patentowy USA nr 5010175, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res.
37:487-493 (1991) i Houghton i inni, Nature 354:84-88 (1991)). Można także zastosować inne reakcje che-
20
miczne do wytworzenia zróżnicowanych bibliotek związków chemicznych. Takie związki chemiczne obejmują, ale nie wyłącznie: peptoidy (np., publikacja PCT nr WO 91/19735), kodowane peptydy (np., publikacja
PCT nr WO 93/20242), losowe bio-oligomery (np., publikacja PCT nr WO 92/00091), benzodiazepiny (np.,
opis patentowy USA nr 5288514), dywersomery, takie jak hydantoiny, benzodiazepiny i dipeptydy (Hobbs i
inni, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)), polipeptydy winylogowe (Hagihara i inni, J. Amer.
25
Chem. Soc. 114:6568 (1992)), niepeptydowe peptydomimetyki ze szkieletem z glukozy (Hirschmann i inni, J.
Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)), analogiczne syntezy organiczne bibliotek małych związków
(Chen i inni, J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)), oligokarbaminiany (Cho i inni, Science 261:1303
(1993)) i/lub peptydylofosfoniany (Campbell i inni, J. Org. Chem. 59:658 (1994)), biblioteki kwasów nukleinowych (patrz, Ausubel, Berger i Sambrook, jak wyżej), biblioteki peptydowych kwasów nukleinowych
30
(patrz, np., opis patentowy USA nr 5539083), biblioteki przeciwciał (patrz, np., Vaughn i inni, Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996) i PCT/US96/10287), biblioteki węglowodanów (patrz, np., Liang i inni,
Science, 274:1520-1522 (1996) i opis patentowy USA nr 5593853), biblioteki małych związków organicznych
(patrz, np. benzodiazepiny, Baum C&EN, 18 styczeń, str. 33 (1993); izoprenoidy, opis patentowy USA nr
5569588; tiazolidynony i metatiazanony, opis patentowy USA nr 5,549,974; pirolidyny, opisy patentowe USA
35
nr 5525735 i 5519134; związki morfolinowe, opis patentowy USA nr 5506337; benzodiazepiny, opis patentowy USA nr 5288514 itp.).
[0120] Urządzenia do wytwarzania bibliotek kombinatorycznych są dostępne w handlu (patrz, np. 357 MPS,
390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems,
Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA). Ponadto, wiele bibliotek kombinatorycznych jest dostęp-
40
nych w handlu (patrz, np. ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD itd.).
22
EP 1 692 102 B1
[0121] CCX7923 (patrz, Figura 4) jest dostępny w handlu i może być zsyntetyzowany przez kondensację N[3-(dimetyloamino)propylo]-N,N-dimetylo-1,3-propanodiaminy z bromometylobicyklo(2,2,1)hept-2-enem sposobami znanymi w dziedzinie. CCX0803 (patrz, Figura 4) jest dostępny w handlu i może być zsyntetyzowany
przez kondensację 3-(2-bromoetylo)-5-fenylometoksyindolu i 2,4,6-trifenylopirydyny sposobami znanymi w
5
dziedzinie . Patrz, np. Organic Function Group Preparations, wydanie 2, tom 1, (S.R. Sander i W. Karo
1983); Handbook of Heterocyclic Chemistry (A.R. Katritzky, 1985); Encyclopedia of Chemical Technology,
wydanie 4 (J.L. Kroschwitz, 1996).
[0122] W jednym wykonaniu, związki aktywne (tj., modulatory CCX-CKR2) według niniejszego wynalazku
mają ogólną strukturę (I):
10
w której
m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 5, a każdy Y podstawiający pierścień benzylowy jest niezależnie wybrany z grupy obejmującej atom wodoru, alkil, fluorowco-podstawiony alkil, alkilen, alkenyl, alkinyl, cykloalkil,
cykloalkilen, halogen, grupę heterocykliczną, aryl, arylen, heteroaryl, heteroarylen, hydroksyl, alkoksyl oraz
15
aryloksyl;
n oznacza 0, 1, 2 lub 3;
Z oznacza -CH- lub -N-;
każda z R1 i R2 niezależnie oznacza alkil lub atom wodoru, albo Z w połączeniu z R1 i R2 tworzy 5- lub 6członowy pierścień zawierający przynajmniej jeden atom azotu oraz ewentualnie zawierający jeden lub wię-
20
cej dodatkowych heteroatomów, przy czym wspomniany 5-6-członowy pierścień jest ewentualnie i niezależnie podstawiony jedną lub więcej reszt wybraną z grupy obejmującej alkil, alkenyl, fenyl, benzyl, sulfonyl i
podstawiony heteroatom;
każda z R3, R4 i R5 niezależnie jest wybrana z grupy obejmującej atom wodoru, alkil, fluorowco-podstawiony
alkil, alkilen, alkenyl, alkinyl, cykloalkil, cykloalkilen, heterocyklil, aryl, arylen, heteroaryl, heteroarylen, hy-
25
droksyl, alkoksyl i aryloksyl; oraz
6
1
2
R oznacza alkil lub atom wodoru; pod warunkiem, że jeżeli Z oznacza atom azotu i R i R razem z Z tworzą
grupę morfolinylową,
3
4
5
wtedy n oznacza 3 i przynajmniej jedna spośród R , R i R oznacza hydroksyl, alkoksyl lub aryloksyl; lub
pod warunkiem, że gdy n=1, Z oznacza atom węgla i
30
R1 i R2 są połączeniem, które nie oznacza -CH2CH2NCH2CH2-; lub
pod warunkiem, że gdy R1 razem R2 oznaczają -CH(CH3)(CH2)4-, wtedy Z oznacza -CH-; lub
pod warunkiem, że gdy R5 oznacza t-butyl, to R3 oznacza atom wodoru; lub
4
5
pod warunkiem, że gdy R i R razem tworzą 5-członowy pierścień, wtedy przynajmniej jeden z atomów
związanych z pierścieniem fenylowym jest atomem węgla. Patrz, tymczasowe zgłoszenie patentowe USA nr
35
60/434912, złożone 20 grudnia, 2002 oraz tymczasowe zgłoszenie patentowe USA nr 60/516151 złożone 20
grudnia 2003.
23
EP 1 692 102 B1
[0123] Faliste wiązanie łączące grupę olefinową z podstawionym pierścieniem fenylowym oznacza, że pier6
ścień ten może być w konfiguracji cis lub trans względem R . W korzystnym wykonaniu, n oznacza 1, 2 lub
3. W innym korzystnym wykonaniu n oznacza 2 lub 3. W kolejnym korzystnym wykonaniu n oznacza 3.
[0124] W innym wykonaniu, korzystne związki mają ogólną strukturę (I), w której R6 oznacza atom wodoru.
5
W dalszym wykonaniu korzystne związki mają ogólną strukturę (I), w której R6 oznacza metyl.
[0125] W innym wykonaniu, korzystne związki mają ogólną strukturę (I), w której każda z R3, R4 i R5 niezależnie oznacza atom wodoru, hydroksyl, alkil, alkoksyl, aryloksyl oraz fluorowco-podstawiony alkil. Korzystniej, R3, R4 i R5 niezależnie oznaczają alkoksyl lub atom wodoru. W innym wykonaniu, korzystne związki
mają ogólną strukturę (I), w której R4 oznacza atom wodoru, a R3 i R5 oznaczają alkoksylowe (-OR), włącz-
10
3
nie z trifluoroalkoksylami, takimi jak trifluorometoksyl i (-OCH2CF3). W dalszym wykonaniu R oznacza atom
4
5
wodoru, a R i R oznaczają alkoksyl. W każdymj z tych wykonań grupą alkoksylową może być metoksyl (OCH3) lub etoksyl (-OCHaCH3).
4
5
[0126] W innym wykonaniu, korzystne związki mają ogólną strukturę (1), w której R i R razem tworzą pierścień heterocykliczny, arylowy lub heteroarylowy. W innym korzystnym wykonaniu, R3 oznacza atom wodo15
ru, a R4 i R5 razem oznaczają -O(CH2)3O-, - (CH)4- lub -N(CH)2N-.
[0127] W innym wykonaniu, korzystne związki mają ogólną strukturę (I), w której Z oznacza atom azotu, a Z
w połączeniu z R1 i R2 tworzy grupę heteroarylową lub heterocykliczną. W korzystnym wykonaniu, związki
mają ogólną strukturę (I), w której Z oznacza CH, a Z w połączeniu z R1 i R2 tworzą grupę heteroarylową lub
heterocykliczną. Korzystniejsze związki mają ogólną strukturę (I), w której Z oznacza CH, a Z w połączeniu z
20
R1 i R2 tworzy grupę heterocykliczną zawierającą atom azotu. W dalszym wykonaniu, Z w połączeniu z R1 i
R2 tworzy podstawioną lub niepodstawioną grupę morfolinową, pirolidynylową, piperydynylową lub piperazynylową.
[0128] Korzystne podstawniki dla grupy heteroarylowej lub heterocyklicznej obejmują alkil, alkenyl, alkinyl,
cykloalkil, aryl, aralkil, heteroaryl, alkoksyl, hydroksyl, heteroatomy oraz atomy fluorowców. W szczególnie
25
korzystnym wykonaniu grupa heteroarylowa lub heterocykliczna jest podstawiona benzylem, fenylem, metylem, etylem, cykloheksylem, metoksymetylem (-CH2OCH3) lub cykloheksylometylem (-CH2(C6H11)).
[0129] W jednym wykonaniu korzystny związek ma ogólną strukturę (I), w której Z w połączeniu z R1 i R2
oznacza grupę pirolidynylową podstawioną alkilem lub metoksymetylem; grupę piperydynylową podstawioną
benzylem, fenylem, metylem, etylem lub podstawionym heteroatomem; lub grupę piperazynylową podsta-
30
wioną benzylem, fenylem lub sulfonylem. Szczególnie korzystne podstawione grupy heteroatomowe obejmują alkoksyl, grupę aminową, cykloalkiloaminową, alkiloaminową, cyklopropyloaminową, izopropyloaminową,
benzyloaminową i fenoksyl. Korzystnie, podstawiony heteroatom jest w pozycji 3 pierścienia piperydynylowego.
1
2
[0130] W innym aspekcie korzystne związki mają ogólną strukturę (I), gdzie Z w połączeniu z R i R ozna35
cza
24
EP 1 692 102 B1
5
1
2
[0131] Korzystne związki mające ogólną strukturę (I) mogą także zawierać jako Z atom azotu, mają R i R ,
każdą jako grupę alkilową lub metylową lub maja R1 i R2 razem tworzące -C(C(O)N(CH3)2)(CH2)3-.
[0132] W innym wykonaniu, Z w połączeniu z R1 i R2 tworzą 5-członowy pierścień zawierający azot i ewentualnie zawierający jeden lub więcej dodatkowych heteroatomów. W tym wykonaniu n korzystnie oznacza 1,
a Z korzystnie oznacza -CH-. W szczególnie korzystnym wykonaniu tego typu Z w połączeniu z R1 i R2
10
oznacza
[0133] gdzie R7 korzystnie oznacza wodór, alkil, aryl lub aralkil.
[0134] W innym korzystnym wykonaniu R7 może oznaczać fluorowcowaną grupę benzylową lub fenylową. W
15
dalszej wykonaniu, R7 korzystnie oznacza wodór, metyl, etyl, benzyl lub para-fluorofenyl.
[0135] W innych wykonaniach związki aktywne według niniejszego wynalazku mają ogólną strukturę (II):
w której
m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 5;
20
każdy Y podstawiający pierścień benzylowy jest niezależnie wybrany z grupy obejmującej wodór, alkil, fluorowco-podstawiony alkil, alkilen, alkenyl, alkinyl, cykloalkil, cykloalkilen, atom fluorowca, heterocyklil, aryl,
arylen, heteroaryl, heteroarylen, hydroksyl oraz alkoksyl;
n oznacza 0, 1, 2 lub 3;
3
4
5
każda z R , R i R jest niezależnie wybrana z grupy obejmującej wodór, alkil, fluorowco-podstawiony alkil,
25
alkilen, alkenyl, alkinyl, cykloalkil, cykloalkilen, heterocyklil, aryl, arylen, heteroaryl, heteroarylen, hydroksyl,
alkoksyl i aryloksyl.
25
EP 1 692 102 B1
[0136] Tak jak w powyższej strukturze (I), faliste wiązanie łączące grupę olefinową z podstawionym pierścieniem fenylowym oznacza, że pierścień może być w konfiguracji cis lub trans.
[0137] W innym wykonaniu, korzystne związki mogą mieć ogólną strukturę (II), w której n oznacza 3. W innym wykonaniu, korzystne związki mogą mieć ogólną strukturę (II), w której R3, R4 i R5 są podstawione jak
5
opisano powyżej dla struktury (I). Obecnie, szczególnie korzystne związki mają ogólną strukturę (II), w której
R3, R4 i R5 oznaczają alkoksyl lub metoksyl.
[0138] Choć wiele szlaków syntezy znanych specjalistom w dziedzinie można zastosować do zsyntetyzowania związków aktywnych według niniejszego wynalazku, ogólny sposób syntezy jest podany poniżej na
Schemacie I.
10
Schemat I
[0139] Na Schemacie I, aldehyd (2) poddaje się reakcji kondensacji z pierwszorzędową aminą (3) na drodze
redukcyjnego aminowania. Odpowiednie pierwszorzędowe aminy są dostępne w handlu na przykład z Ald15
rich, Milwaukee, WI, lub mogą być zsyntetyzowane drogami chemicznymi znanymi specjalistom w dziedzinie.
[0140] Reakcję aminowania można przeprowadzić ze środkiem redukującym w dowolnym odpowiednim
rozpuszczalniku, obejmującym, ale nie wyłącznie, tetrahydrofuran (THF), dichlorometan lub metanol, z wytworzeniem związku pośredniego (4). Odpowiednie środki redukujące do reakcji kondensacji obejmują, ale
20
nie wyłacznie, cyjanoborowodorek sodu (jak opisano w Mattson, i inni, J. Org. Chem. 1990, 55, 2552 oraz
Barney, i inni, Tetrahedron Lett. 1990, 31, 5547); triacetoksyborowodorek sodu (jak opisano w Abdel-Magid,
i inni, Tetrahedron Lett. 31:5595 (1990)); borowodorek sodu (jak opisano w Dribble; Nutaitis Synthesis. 709
(1987)); pentakarbonylek żelaza i alkoholowy roztwór KOH (jak opisano w Watabane, i inni, Tetrahedron
Lett.1879 (1974)); i BH3-pirydynę (jak opisano w Pelter, i inni, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1:717 (1984)).
25
[0141] Przekształcenie produktu przejściowego (4) w związek (5) można przeprowadzić w dowolnym odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak tetrahydrofuran lub dichlorometan, z odpowiednio podstawionym chlorkiem acylu w obecności zasady. Korzystne są zasady w postaci amin trzeciorzędowych. Szczególnie korzystne zasady obejmują trietyloaminę i zasadę Hunningsa.
[0142] Alternatywnie, przekształcenie produktu przejściowego (4) w związek (5) można także osiągnąć z
30
odpowiednim odczynnikiem sprzęgającym, takim jak 1-etylo-3-(3-dimetylobutylopropylo)karbodiimid lub dicykloheksylokarbodimid (jak opisano w B. Neises i W. Steglich, Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 17:522 (1978)), w
obecności katalizatora, takiego jak 4-N,N-dimetyloaminopirydyna lub w obecności hydroksybenzotriazolu (jak
opisano w K. Horiki, Synth. Commun. 7:251).
26
EP 1 692 102 B1
[0143] Aby wykazać, że opisane powyżej związki są przydatnymi antagonistami chemokin SDF-1 i I-TAC,
związki te przeszukuje się in vitro w celu określenia ich zdolności do wyparcia SDF-1 i I-TAC z receptora
CCX-CKR2 w wielu stężeniach. Związki te połączono z komórkami gruczołu sutkowego wyrażającymi miejsca receptorowe CCX-CKR2 w obecności chemokiny SDF-1 i/lub I-TAC znakowanej
5
125
I. Zdolność tych
związków do wyparcia znakowanego SDF-1 lub I-TAC z miejsc receptora CCX-CKR2 w wielu stężeniach
wyznaczono z zastosowaniem procedury przeszukiwania.
[0144] Związki, które uznano za skutecznych antagonistów SDF-1 i I-TAC były w stanie wyprzeć przynajmniej 50% chemokiny SDF-1 i/lub I-TAC z receptora CCX-CKR2 w stężeniach wynoszących lub niższych niż
1,1 mikromolarne (µM), a korzystniej w stężeniach wynoszących lub niższych niż 300 nanomolarne (nM). W
10
niektórych przypadkach pożądane było aby związki potrafiły wyprzeć przynajmniej 50% SDF-1 i/lub I-TAC z
receptora CCX-CKR2 w stężeniach wynoszących lub niższych niż 200 nM. Przykładowe związki, które spełniają te kryteria przedstawiono poniżej w Tabeli I.
TABELA I
Nr
Związek
Nr
1
27
2
28
3
29
4
30
27
Związek
EP 1 692 102 B1
Nr
Związek
Nr
5
31
6
32
7
33
8
34
9
35
10
36
28
Związek
EP 1 692 102 B1
Nr
Związek
Nr
11
37
12
38
13
39
14
40
15
41
16
42
17
43
29
Związek
EP 1 692 102 B1
Nr
Związek
Nr
18
44
19
45
20
46
21
47
22
48
23
49
30
Związek
EP 1 692 102 B1
Nr
Związek
Nr
24
50
25
51
26
52
Związek
C. Wysokowydajne testy w fazie stałej i rozpuszczalnej
[0145] W wysokowydajnych testach według wynalazku możliwe jest zbadanie przesiewowe do kilku tysięcy
5
różnych modulatorów lub ligandów podczas jednego dnia. W szczególności, każda studzienka płytki do mikromiareczania można zastosować do przeprowadzenia osobnego testu względem wybranego potencjalnego modulatora lub, gdy obserwuje się wpływ stężenia lub czasu inkubacji, pojedynczy modulator można
zbadać w 5-10 studzienkach. Zatem, w pojedynczej standardowej płytce do mikromiareczkowania można
zbadać około 100 (np. 96) modulatorów. Gdy stosuje się płytki 1536-studzienkowe, wtedy na pojedynczej
10
płytce można łatwo zbadać od około 100 do około 1500 różnych związków. Możliwe jest przeszukanie kilku
różnych płytek na dzień; z zastosowaniem zintegrowanych układów według wynalazku możliwe jest przeprowadzenie przeszukiwania testowego do około 6000-20000 różnych związków. Niedawno opracowano
podejścia mikrofluidalne do manipulacji odczynnikami.
[0146] Wynalazek dostarcza testów in vitro do identyfikacji, w formacie wysokowydajnym związków, które
15
mogą modulować funkcje lub aktywność CCX-CKR2. Można ewentualnie przeprowadzić reakcje kontrolne
mierzące aktywność CCX-CKR2 komórki w reakcji, która nie zawiera potencjalnego modulatora, ponieważ
testy te są wysoce jednorodne. Jednakże takie ewentualne reakcje kontrolne zwiększają wiarygodność testu.
[0147] W niektórych testach byłoby pożądane wprowadzenie kontroli pozytywnych, aby upewnić się, że
20
składniki testów pracują prawidłowo. Odpowiednie są przynajmniej dwie kontrole pozytywne. Po pierwsze,
znany aktywator lub ligand CCX-CKR2 można inkubować z jedną próbką w teście i wykrywać powstałe
31
EP 1 692 102 B1
zwiększenie sygnału wynikające ze zwiększonej aktywności CCX-CKR2 (np., jak określono zgodnie z zamieszczonymi tu sposobami). Po drugie, można dodać inhibitor lub antagonistę CCX-CKR2 i podobnie wykrywać powstały spadek sygnału dla aktywności receptora chemokinowego. Należy zwrócić uwagę, że modulatory można łączyć z aktywatorami lub inhibitorami w celu znalezienia modulatorów, które hamują wzrost
5
lub spadek, który jest w przeciwnym przypadku wywoływany obecnością znanego modulatora CCX-CKR2.
IV. Ekspresja CCX-CKR2 u osobnika
[0148] CCX-CKR2 jest wyrażany u osobnika, co tym samym zwiększa ekspresję CCX-CKR2. Alternatywnie
polinukleotydy inhibitorowe obejmujące na przykład siRNA lub sekwencjami antysensownymi, można wyrażać in vitro lub iv vivo w celu zahamowania ekspresji CCX-CKR2. W niektórych przypadkach, polinukleotyd
10
kodujący CCX-CKR2 wprowadza się do komórki in vitro i komórkę tą następnie wprowadza się do organizmu
osobnika. W niektórych z tych przypadków komórki najpierw izoluje się z organizmu osobnika, a następnie,
po wprowadzeniu polinukleotydu, ponownie wprowadza się do organizmu osobnika. W innych przypadkach,
polinukleotydy kodujące CCX-CKR2 wprowadza się bezpośrednio in vivo do komórek w organizmie osobnika.
15
[0149] W niektórych przypadkach polipeptydy kodujące CCX-CKR2 wprowadza się do komórek z: (i) tkanki
będącej przedmiotem zainteresowania, (ii) egzogennych komórek wprowadzonych do tej tkanki lub (iii) sąsiadujących komórek nie znajdujących się w tej tkance. W niektórych wykonaniach, polinukleotydy według
wynalazku wprowadza się do komórek śródbłonka. Tkanka, z którą związane są komórki śródbłonka jest
dowolną tkanką, przy czym pożądane jest, aby zwiększała ona migrację i ekspansję śródbłonka.
20
[0150] Do wprowadzenia kwasów nukleinowych kodujących zaprojektowane polipeptydy według wynalazku
do komórek ssaczych lub docelowych tkanek można zastosować standardowe sposoby przenoszenia genów oparte lub też nie oparte na wirusach. Sposoby takie można zastosować do podania kwasów nukleinowych kodujących polipeptydy według wynalazku (np., CCX-CKR2) do komórek in vitro. W niektórych przypadkach kwasy nukleinowe kodujące polipeptydy według wynalazku podaje się do zastosowań in vivo lub ex
25
vivo terapii genowej. Nie-wirusowe wektorowe układy dostarczania obejmują plazmidy DNA, nagi kwas nukleinowy i kwas nukleinowy skompleksowany z nośnikiem dostarczającym, takim jak liposom. Wirusowe
wektorowe układy dostarczające obejmują wirusy DNA i RNA, które po dostarczeniu do komórki mają genomy episomalne lub wintegorwane. W celu przeglądu procedur terapii genowej, patrz Anderson, Science
256:808-813 (1992); Nabel i Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani i Caskey, TIBTECH 11:162-166
30
(1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology
6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer i Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada i inni, w Current Topics in Microbiology and
Immunology Doerfler i Böhm (red.) (1995); oraz Yu i inni, Gene Therapy 1:13-26 (1994).
[0151] Sposoby nie wirusowego dostarczania kwasów nukleinowych kodujących opisane tutaj zaprojekto-
35
wane polipeptydy obejmują lipofekcję, mikroinjekcję, techniki mikrowstrzeliwania, wirosomy, liposomy, immunoliposomy, koniugaty polikationowe lub lipid:kwas nukleinowy, nagi DNA, sztuczne wiriony i pobieranie
DNA wspomagane środkami. Lipofekcję opisano np. w opisach patentowych USA nr 5049386, 4946787;
oraz 4897355), a odczynniki do lipofekcji są sprzedawane komercyjnie (np., Transfectam™ i Lipofectin™).
Kationowe i obojętne lipidy, które są odpowiednie do skutecznej lipofekcji polinukleotydów z rozpoznaniem
40
receptora obejmują te według Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024. Podawanie można prowadzić do komórek (podawanie ex vivo) lub tkanek docelowych (podawanie in vivo).
32
EP 1 692 102 B1
[0152] Wytwarzanie kompleksów lipid:kwas nukleinowy, obejmujących ukierunkowane liposomy, takie jak
kompleksy immunolipidowe, jest dobrze znane specjaliście w dziedzinie (patrz, np., Crystal, Science
270:404-410 (1995); Blaese i inni, Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr i inni, Bioconjugate Chem.
5:382-389 (1994); Remy i inni, Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao i inni, Gene Therapy 2:710-722
5
(1995); Ahmad i inni, Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); opisy patentowe USA nr 4186183, 4217344,
4235871, 4261975, 4485054, 4501728, 4774085, 4837028 i 4946787).
[0153] Zastosowanie układów opartych na wirusach RNA lub DNA do dostarczania kwasów nukleinowych
kodujących opisane tutaj zaprojektowane polipeptydy wykorzystuje wysoce rozwinięte procesy dostarczania
wirusa do specyficznych komórek w organizmie i przenoszenia ładunku wirusa do jądra. Wektory wirusowe
10
można bezpośrednio podawać pacjentom (in vivo) lub można jest stosować do traktowania komórek in vitro i
zmodyfikowane komórki podawać pacjentom (ex vivo). Standardowe oparte na wirusach układy dostarczania opisanych tutaj polipeptydów mogą obejmować wektory retrowirusowe, lentiwirusowe, adenowirusowe,
wirusa adenosatelitarnego i wirusa opryszczki do przenoszenia genów. Obecnie wektory wirusowe są najbardziej wydajnym i wszechstronnym sposobem przenoszenia genów do docelowych komórek i tkanek.
15
Włączenie do genomu gospodarza jest możliwe metodami przenoszenia genów opartych na retrowirusie,
lentiwirusie i wirusie adenosatelitarnym, często powodując długookresową ekspresję wstawionego transgenu. Ponadto, wysokie wydajności transdukcji zaobserwowano w wielu różnych typach komórek i tkankach
docelowych.
[0154] Tropizm retrowirusa można zmienić przez włączenie obcych białek do otoczki, co rozszerza poten-
20
cjalną docelową populację komórek docelowych. Wektory lentiwirusowe są wektorami retrowirusowymi, które są w stanie transdukować lub zakażać nie dzielące się komórki i zazwyczaj wytwarzają wysokie miana
wirusa. Zatem wybór retrowirusowego układu do przenoszenia genów będzie zależeć od docelowej tkanki.
Wektory retrowirusowe są złożone z cis-działających długich powtórzeń końcowych z pojemnością pakowania do 6-10 kb obcej sekwencji. Minimalne LTR działające w cis są wystarczające do replikacji i pakowania
25
wektorów, które są następnie stosowane do włączenia terapeutycznego genu do komórki docelowej, aby
zapewnić stałą ekspresję transgenu. Szeroko stosowane wektory retrowirusowe obejmują te oparte na wirusie białaczki mysiej (MuLV), wirusie białaczki gibonów (GaLV), małpim wirusie niedoboru odporności (SIV),
ludzkim wirusie niedoboru odporności (HIV) oraz ich kombinacjach (patrz, np., Buchscher i inni, J. Virol.
66:2731-2739 (1992); Johann i inni, J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt i inni, Virol. 176:58-59 (1990);
30
Wilson i inni, J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller i inni, J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).
[0155] W zastosowaniach, w których korzystna jest przejściowa ekspresja opisanych tutaj polipeptydów
zazwyczaj stosuje się układy oparte na adenowirusach. Wektory oparte na adenowirusach są zdolne do
bardzo wysokiej wydajności transdukcji w wielu typach komórek i nie wymagają podziału komórki. Dla takich
wektorów uzyskano wysokie miano i poziom ekspresji. Wektor ten może być wytwarzany w dużych ilościach
35
we względnie prostym układzie. Wektory oparte na wirusie towarzyszącym adenowirusom ("AAV") są także
stosowane do transdukcji komórek docelowymi kwasami nukleinowymi, np., w wytwarzaniu kwasów nukleinowych i peptydów in vitro i w procedurach terapii genowej in vivo i ex vivo (patrz, np., West i inni, Virology
160:38-47 (1987); opis patentowy USA nr 4797368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801
(1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)). Konstruowanie rekombinowanych wektorów AAV opisa-
40
no w wielu publikacjach, w tym opisie patentowym USA nr 5173414; Tratschin i inni, Mol. Cell. Biol. 5:32513260 (1985); Tratschin, i inni, Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat i Muzyczka, PNAS 81:64666470 (1984) i Samulski i inni, J. Virol. 63:03822-3828 (1989).
33
EP 1 692 102 B1
[0156] pLASN i MFG-S są przykładami wektorów retrowirusowych, które zastosowano w próbach klinicznych (Dunbar i inni, Blood 85:3048-305 (1995); Kohn i inni, Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech i inni,
PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN był pierwszym wektorem terapeutycznym zastosowanym
w próbie terapii genowej. (Blaese i inni, Science 270:475-480 (1995)). Dla zapakowanych wektorów MFG-S
5
zaobserwowano wydajności transdukcji wynoszące 50% lub więcej. (Ellem i inni, Immunol Immunother.
44(1):10-20 (1997); Dranoff i inni, Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997).
[0157] Rekombinowane wektory z wirusów towarzyszących adenowirusom (rAAV) są obiecującymi alternatywnymi układami dostarczania genów opartymi na defektywnym i niepatogennym parwowirusem typu 2
towarzyszącym adenowirusom. Wszystkie wektory pochodzą z plazmidu, który zachowuje jedynie odwróco-
10
ne powtórzenia końcowe AAV wielkości 145 pz flankujące kasetę ekspresyjną transgenu. Kluczowymi cechami tego układu wektorowego są wydajne przeniesienie genów i stabilne dostarczenie transgenu przez
włączenie do genomów transdukowanych komórek. (Wagner i inni, Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns i
inni, Gene Ther. 9:748-55 (1996)).
[0158] Rekombinowane wektory adenowirusowe (Ad) z defektem replikacji można modyfikować tak, że
15
transgen zastępuje geny E1a, E1b i E3 Ad; następnie wektor z defektem replikacji namnaża się w ludzkich
komórkach 293, które dostarczają funkcję wydeletowanego genu w trans. Wektory Ad mogą transdukować
wiele typów tkanek in vivo, włącznie z niedzielącymi się, zróżnicowanymi komórkami, takimi jak te znajdujące się w tkankach wątroby, nerki i układu mięśniowego. Konwencjonalne wektory Ad mają wysoką pojemność przenoszenia. Przykład zastosowania wektora Ad w próbie klinicznej obejmował terapię polinukleoty-
20
dem do immunizacji przeciwnowotworowej z iniekcją domięśniową (Sterman i inni, Hum. Gene Ther. 7:10839 (1998)). Dodatkowe przykłady zastosowania wektorów adenowirusowych do przenoszenia genów w próbach klinicznych obejmują Rosenecker i inni, Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman i inni, Hum. Gene Ther.
9:7 1083-1089'(1998); Welsh i inni, Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez i inni, Hum. Gene Ther.
5:597-613 (1997); Topf i inni, Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman i inni, Hum. Gene Ther. 7:1083-1089
25
(1998).
[0159] Komórki pakujące stosuje się do tworzenia cząstek wirusa, które są zdolne do zakażania komórki
gospodarza. Takie komórki obejmują komórki 293, które pakują adenowirusy oraz komórki ψ2 lub komórki
PA317, które pakują retrowirusy. Wektory wirusowe stosowane w terapii genowej zazwyczaj są wytwarzane
przez linię komórkową producenta, która pakuje wektor kwasu nukleinowego do cząstki wirusa. Wektory te
30
zazwyczaj zawierają minimalne sekwencje wirusowe wymagane do pakowania i następnie włączenia do
gospodarza, przy czym inne sekwencje wirusowe są zastępowane przez kasetę ekspresyjna kodującą białko, które ma być wyrażane. Brakujące funkcje wirusowe są dostarczane w trans przez pakującą linię komórkową. Na przykład, wektory AAV stosowane w terapii genowej zazwyczaj posiadają tylko sekwencje ITR z
genomu AAV, które są wymagane do pakowania i włączenia do genomu gospodarza. Wirusowy DNA jest
35
pakowany w linii komórkowej, która zawiera plazmid pomocniczy kodujący inne geny AAV, mianowicie rep i
cap, ale brak jest w niej sekwencji ITR. Linię komórkową zakaża się także adenowirusem jako wirusem pomocniczym. Wirus pomocniczy promuje replikację wektora AAV i ekspresję genów AAV z plazmidu pomocniczego. Plazmid pomocniczy nie jest pakowany w znaczących ilościach ze względu na brak sekwencji ITR.
Zanieczyszczenie adenowirusem można zmniejszyć przez np. obróbkę termiczną, na którą adenowirus jest
40
bardziej wrażliwy niż AAV.
[0160] W wielu zastosowaniach terapii genowej pożądane jest, aby wektor do terapii genowej był dostarczany z wysokim stopniem specyficzności do konkretnego typu tkanki. Wektor wirusowy jest zazwyczaj zmody34
EP 1 692 102 B1
fikowany, aby wykazywał specyficzność dla danego typu komórek przez ekspresję liganda jako białka fuzyjnego z białkiem płaszcza wirusa na powierzchni zewnętrznej wirusa. Ligand wybiera się tak aby wykazywał
powinowactwo do receptora, o którym wiadomo, że jest obecny na typie komórek będących przedmiotem
zainteresowania. Na przykład, Han i inni, PNAS 92:9747-9751 (1995) donieśli, że wirus mysiej białaczki
5
Moloneya można zmodyfikować tak aby wyrażał ludzką heregulinę zfuzowaną z gp70, a rekombinowany
wirus zakaża pewne ludzkie komórki raka sutka wyrażając ludzki receptor naskórkowego czynnika wzrostu.
Zasadę tą można rozszerzyć na inne pary wirusa wyrażającego białko fuzyjne liganda i komórki docelowej
wyrażającej receptor. Na przykład, fag nitkowaty może zostać zmodyfikowany, aby prezentował fragmenty
przeciwciała (np., FAB lub Fv) wykazujące specyficzne powinowactwo wiązania dla praktycznie dowolnego
10
wybranego receptora komórkowego. Chociaż powyższy opis ma zastosowanie głównie do wektorów wirusowych, te same zasady można zastosować do wektorów niewirusowych. Takie wektory można zaprojektować, aby zawierały specyficzne sekwencje pobierania, które, jak się uważa, faworyzują pobieranie przez
specyficzne komórki docelowe.
[0161] Wektory do terapii genowej można dostarczać in vivo przez podanie indywidualnemu pacjentowi,
15
zazwyczaj w podaniu ogólnoustrojowym (np. we wlewie dożylnym, śródotrzewnowym, domięśniowym, podskórnym lub doczaszkowym) lub nałożenie miejscowe, jak opisano poniżej. Alternatywnie, wektory można
dostarczać ex vivo do komórek, takich jak komórki eksplantowane od indywidualnego pacjenta (np. limfocyty, aspiraty szpiku kostnego, biopsje tkanki) lub uniwersalnego dawcy hematopoetycznych komórek macierzystych, po czym przeprowadza się ponowne wszczepienie tych komórek do organizmu pacjenta, zazwy-
20
czaj po selekcji na komórki, które mają wbudowany wektor.
[0162] Transfekcja komórek ex vivo do celów diagnostycznych, badawczych lub do terapii genowej (np.
przez ponowny wlew transfekowanych komórek do organizmu gospodarza) jest dobrze znana specjalistom
w dziedzinie. Opisano tutaj, że komórki izoluje się z organizmu pacjenta, transfekuje kwasem nukleinowym
(genem lub cDNA) kodującym polipeptydy według wynalazku i ponownie dokonuje wlewu z powrotem do
25
organizmu osobnika (np. pacjenta). Różne typy komórek odpowiednie do transfekcji ex vivo są dobrze znane
specjalistom w dziedzinie (dyskusja odnośnie izolacji i hodowli komórek pacjentów, patrz, np. cytowane tu
referencje np. Freshney i inni, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (wydanie 3 1994)).
[0163] Opisano tutaj, że komórki macierzyste stosuje się w procedurach ex vivo do transfekcji komórek i
terapii genowej. Zaletą stosowania komórek macierzystych jest to, że mogą one różnicować się do innych
30
typów komórek in vitro lub można je wprowadzić do organizmu ssaka (takiego jak dawca tych komórek),
gdzie wszczepią się one w szpiku kostnym. Dobrze znane są sposoby różnicowania komórek CD34+ in vitro
do klinicznie istotnych typów komórek immunologicznych z zastosowaniem cytokin, takich jak GM-CSF, IFNγ i TNF-α (patrz, Inaba i inni, J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)).
[0164] Komórki macierzyste izoluje się do transdukcji i różnicowania stosując znane sposoby. Na przykład,
35
komórki macierzyste izoluje się z komórek szpiku kostnego przez immunoadsorbcję (ang. panning) komórek
szpiku kostnego przeciwciałami, które wiążą niechciane komórki, takie jak CD4+ i CD8+ (komórki T), CD45+
(komórki panB), GR-1 (granulocyty) i Iad (zróżnicowane komórki prezentujące antygen) (patrz, Inaba i inni, J.
Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)).
[0165] Wektory (np. retrowirusy, adenowirusy, liposomy itd.) zawierające terapeutyczne kwasy nukleinowe
40
można także podawać bezpośrednio do organizmu do transdukcji komórek in vivo. Alternatywnie, można
podawać nagi DNA. Podaje się dowolną z dróg normalnie stosowanych do wprowadzenia cząsteczki do
ostatecznego kontaktu z komórkami krwi lub tkanki. Odpowiednie sposoby podawania takich kwasów nukle35
EP 1 692 102 B1
inowych są dostępne i dobrze znane specjalistom w dziedzinie i chociaż do podawania konkretnej kompozycji można zastosować więcej niż jedną z dróg to konkretna droga może często dostarczać bardziej natychmiastową i bardziej skuteczną reakcję niż inna droga.
[0166] Nośniki dopuszczalne farmaceutycznie są określane częściowo przez konkretną podawaną kompo5
zycję, a także przez konkretny sposób stosowany do podawania kompozycji. Zgodnie z tym, istnieje szeroki
wachlarz odpowiednich preparatów kompozycji farmaceutycznych według niniejszego wynalazku, jak opisano poniżej (patrz, np. Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 17, 1989).
V. Diagnoza i przewidywanie wystąpienia
[0167] Niniejszy wynalazek dostarcza sposobów wykrywania komórki nowotworowej obejmujących sposoby
10
dostarczenia przewidywania wystąpienia lub diagnozowania nowotworu. Jak tutaj wykazano, CCX-CKR2
jest wyrażany w prawie każdej dotychczas zbadanej komórce nowotworowej, podczas gdy normalna (nienowotworowa) ekspresja CCX-CKR2 wydaje się być ograniczona do nerki i niektórych komórek mózgu, a
także pewnych stadiów rozwojowych wątroby płodu. Zatem ekspresja CCX-CKR2 w komórce, a w szczególności w nie-płodowej komórce i/lub komórce innej niż komórka nerki lub mózgu, wskazuje prawdopodobień-
15
stwo obecności komórki nowotworowej. W niektórych przypadkach w próbkach zawierających komórki wyrażające CCX-CKR2 potwierdza się obecność komórek nowotworowych stosując inne sposoby znane w dziedzinie.
[0168] Zgodnie z jeszcze innym aspektem wynalazku, dostarczone są sposoby wyboru przebiegu leczenia
pacjenta mającego lub u którego podejrzewa się występowanie nowotworu. Sposoby te obejmują uzyskanie
20
od pacjenta próbki biologicznej, skontaktowanie tej próbki z przeciwciałami lub ich fragmentami wiążącymi
antygen, które swoiście wiążą się z CCX-CKR2, wykrywanie obecności lub nieobecności wiązania przeciwciała i wybieranie przebiegu leczenia odpowiedniego dla nowotworu występującego u pacjenta. W niektórych
przypadkach leczeniem jest podawanie pacjentowi antagonistów CCX-CKR2.
[0169] Sposoby detekcji z zastosowaniem środków wiążących białko są dobrze znane i obejmują, np. różne
25
testy immunologiczne, cytometrię przepływową itd. Stosując cytometrię przepływową można zidentyfikować
komórki wyrażające specyficzny antygen będący przedmiotem zainteresowania w mieszanej populacji komórek. W skrócie, komórkom pozwala się przereagować z przeciwciałem swoistym dla białka będącego przedmiotem zainteresowania (np. CCX-CKR2). Przeciwciało może być znakowane albo fluorescencyjnie (bezpośrednia metoda wybarwiania) albo gdy nie jest znakowane, drugie przeciwciało, które reaguje swoiście z
30
pierwszym, może być znakowane fluorescencyjnie (pośrednia metoda wybarwiania). Następnie komórki
przepuszcza się przez instrument, który może wykryć sygnał fluorescencyjny. Komórki aspiruje się i doprowadza do zawiesiny zawierającej pojedyncze komórki. Tą zawiesinę komórek przepuszcza się przez urządzenie z laserem, który wzbudza znakowane fluorochromem przeciwciało, związane obecnie z komórkami,
oraz zbiera się te dane. Komórki, dla których wykryto jasną fluorescencję (tj. reagują z przeciwciałem zna-
35
kowanym fluorescencyjnie) wyrażają interesujące białko; komórki nie wykazujące fluorescencji (tj. nie reagujące z przeciwciałem znakowanym fluorescencyjnie) nie wyrażają białka będącego przedmiotem zainteresowania.
[0170] Niniejszy wynalazek dostarcza sposobów diagnozowania ludzkich chorób obejmujących, ale nie wyłącznie, nowotwór, np. raki, glejaki, międzybłoniaki, czerniaki, chłoniaki, białaczki, gruczolakoraki, raka sutka,
40
raka jajnika, raka szyjki macicy, glejaka, białaczkę, chłoniaka, raka gruczołu krokowego i chłoniaka Burkitta,
raka głowy i szyi, raka okrężnicy, raka jelita grubego i odbytu, niedrobnokomórkowego raka płuc, drobnokomórkowego raka płuc, raka przełyku, raka żołądka, raka trzustki, raka układu wątrobowo-żółciowego, raka
36
EP 1 692 102 B1
pęcherzyka żółciowego, raka jelita cienkiego, raka odbytnicy, raka nerek, raka pęcherza moczowego, raka
gruczołu krokowego, raka penisa, raka cewki moczowej, raka jądra, raka szyjki macicy, raka pochwy, raka
macicy, raka jajnika, raka tarczycy, raka przytarczyc, raka nadnerczy, nowotwór z komórek wewnątrzwydzielniczych trzustki, rakowiaka, raka kości, raka skóry, siatkówczaka złośliwego, chłoniaka Hodgkina, chło5
niaka nieziarniczego (dodatkowe nowotwory, patrz CANCER:PRINCIPLES AND PRACTICE (DeVita, VT i
inni, red. 1997)); a także zaburzenia czynności mózgu i neuronalne, takie jak choroba Alzheimera i stwardnienie rozsiane; niewydolność nerek; reumatoidalne zapalenie stawów; odrzucenie przeszczepu serca;
miażdżycę; astmę; kłębuszkowe zapalenie nerek; kontaktowe zapalenie skóry; zapalenie jelit; zapalenie
okrężnicy; łuszczycę; uszkodzenie reperfuzyjne; jak również inne opisane tutaj choroby i zaburzenia. W nie-
10
których wykonaniach, pacjent nie cierpi na mięsaka Kaposiego, wieloogniskową chorobę Castlemana lub
związanego z AIDS pierwotnego chłoniaka wysiękowego. Jak tutaj przedstawiono, w tym w przykładach,
komórki i tkanki prawidłowe i chore można rozróżnić w oparciu o reaktywność z przeciwciałem monoklonalnym przeciw-CCX-CKR2 lub SDF-1 i I-TAC. Na przykład, komórki nowotworowe wykrywa się przez wykrycie
na komórce receptora chemokinowego, o którego wiązanie współzawodniczą SDF-1α i I-TAC.
15
[0171] Ponadto można wykryć różnice w wiązaniu liganda między receptorami chemokinowymi i takie różnice można zastosować do wykrycia komórek wyrażających CCX-CKR2. Na przykład, żaden receptor chemokinowy nie wykazuje specyficzności względem zarówno SDF1, jak i I-TAC jako ligandów. Wiązanie chemokin można określić stosując próbki tkanki (np. biopsji) lub można monitorować bezpośrednio w tkance in situ
(np. z zastosowaniem obrazowania chemokiny znakowanej radioaktywnie).
20
[0172] Można także zastosować testy immunologiczne do jakościowego lub ilościowego analizowania CCXCKR2. Ogólny przegląd technologii mających tu zastosowanie można znaleźć w Harlow i Lane, Antibodies:
A Laboratory Manual (1988). Alternatywnie, do wykrycia receptora można także zastosować nie będące
przeciwciałami cząsteczki o powinowactwie względem CCX-CKR2.
[0173] Sposoby wytwarzania przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych, które reagują specyficznie z biał-
25
kiem będącym przedmiotem zainteresowania są znane specjalistom w dziedzinie (patrz, np. Coligan, Current
Protocols in Immunology (1991); Harlow i Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (wydanie 2 1986); i Kohler i Milstein Nature, 256:495-497 (1975)).
Techniki takie obejmują wytwarzanie przeciwciała przez selekcję przeciwciał z bibliotek rekombinowanych
przeciwciał w fagu lub podobnych wektorach. Na przykład, w celu wytworzenia surowicy odpornościowej do
30
zastosowania w teście immunologicznym izoluje się białko będące przedmiotem zainteresowania lub jego
fragment antygenowy, jak tutaj opisano. Na przykład, rekombinowane białko jest wytwarzane w transformowanej linii komórkowej. Wsobny szczep myszy, szczurów, świnek morskich lub królików immunizuje się białkiem z zastosowaniem standardowego adiuwanta, takiego jak adiuwant Freunda i standardowego protokołu
immunizacji. Alternatywnie, jako immunogen można stosować syntetyczny peptyd pochodzący od ujawnio-
35
nych tutaj sekwencji i sprzężony z białkiem nośnikowym. Dalszą opcją jest stosowanie jako antygenu komórki wyrażającej białko lub frakcję błonową lub liposom zawierający CCX-CKR2 lub jego fragment. Przeciwciała wzbudzone przeciw komórce, frakcji błonowej lub liposomowi można następnie selekcjonować na ich
zdolność do wiązania białka.
[0174] Surowice poliklonalne zbiera się i miareczkuje wobec immunogenu w teście immunologicznym, na
40
przykład w teście immunologicznym w fazie stałej z immunogenem unieruchomionym na stałym nośniku.
4
Wybiera się poliklonalne surowice odpornościowe o mianie 10 lub wyższym i bada je pod względem ich
reaktywności krzyżowej wobec innych, a czasami homologicznych, białek z zastosowaniem testu immunolo37
EP 1 692 102 B1
gicznego wiązania kompetycyjnego. Specyficzne przeciwciała monoklonalne i poliklonalne oraz surowice
zazwyczaj będą się wiązać z CCX-CKR2 z KD przynajmniej około 0,1 mM, częściej przynajmniej około 1 µM,
korzystnie przynajmniej około 0,1 µM lub wyższą oraz najkorzystniej 0,01 µM lub wyższą.
[0175] Do wytwarzania przeciwciał, np. przeciwciał rekombinowanych, monoklonalnych lub poliklonalnych,
5
można zastosować wiele technik znanych w dziedzinie (patrz, np. Kohler i Milstein, Nature 256:495-497
(1975); Kozbor i inni, Immunology Today 4: 72 (1983); Cole i inni, str. 77-96 w Monoclonal Antibodies and
Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow i Lane,
Antibodies, A Laboratory Manual (1988); oraz Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (wydanie 2 1986)). Geny kodujące łańcuchy ciężki i lekki przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania
10
można sklonować z komórki, np. genu kodujące przeciwciało monoklonalne można sklonować z hybrydoma
i stosować do wytworzenia rekombinowanego przeciwciała monoklonalnego. Z hybrydoma lub komórek plazmatycznych można także wytworzyć biblioteki genów kodujące łańcuchy ciężki i lekki przeciwciał monoklonalnych. Losowe połączenia produktów genów łańcucha ciężkiego i lekkiego wytwarzają dużą pulę przeciwciał o różnej specyficzności antygenowej (patrz, np. Kuby, Immunology (wydanie 3 1997)). Techniki wytwa-
15
rzania przeciwciał jednołańcuchowych lub przeciwciał rekombinowanych (opis patentowy USA nr 4946778,
opis patentowy USA nr 4816567) można dostosować do wytwarzania przeciwciał przeciw opisanym tutaj
polipeptydom. Ponadto do ekspresji humanizowanych lub ludzkich przeciwciał można wykorzystać myszy
transgeniczne lub inne organizmy, takie jak ssaki (patrz, np., opisy patentowe USA nr 5545807; 5545806;
5569825; 5625126; 5633425; 5661016, Marks i inni, Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg i inni, Na-
20
ture 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild i inni, Nature Biotechnology 14:84551 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); oraz Lonberg i Huszar, Intern. Rev. Immunol.
13:65-93 (1995)). Alternatywnie, do identyfikacji przeciwciał i heteromerycznych fragmentów Fab, które specyficznie wiążą wybrane antygeny, można stosować techniki prezentacji na fagu (patrz, np. McCafferty i inni,
Nature 348:552-554 (1990); Marks i inni, Biotechnology 10:779-783 (1992)). Można także wytworzyć prze-
25
ciwciała bispecyficzne, tj. zdolne do rozpoznawania dwóch różnych antygenów (patrz, np. WO 93/08829,
Traunecker i inni, EMBO J. 10:3655-3659 (1991); i Suresh i inni, Methods in Enzymology 121:210 (1986)).
Przeciwciała mogą być także heterokoniugatami, np. dwa połączone kowalencyjnie przeciwciała lub immunotoksyny (patrz, np. opis patentowy USA nr 4676980, WO 91/00360; WO 92/200373; oraz EP 03089).
[0176] Sposoby humanizowania lub prymatyzowania przeciwciał nie będących ludzkimi są dobrze znane w
30
dziedzinie. Takie przeciwciała są przydatne zarówno do detekcji, jak i zastosowań terapeutycznych. Na ogół,
humanizowane przeciwciało zawiera jedną lub więcej reszt aminokwasowych wprowadzonych do niego ze
źródła, które nie pochodzi od człowieka. Te reszty aminokwasowe nie będące ludzkimi są często nazywane
importowanymi resztami, które zazwyczaj są pobierane z importowanej domeny zmiennej. Humanizację
można zasadniczo przeprowadzić według metody opisanej przez Wintera i współpracowników (patrz, np.
35
Jones i inni, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann i inni, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen i inni,
Science 239:1534-1536 (1988) oraz Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)), lub przez podstawienie CDR gryzoni lub sekwencji CDR w miejsce odpowiadających im sekwencji ludzkiego przeciwciała. Zgodnie z tym, takie humanizowane przeciwciała są przeciwciałami chimerycznymi (opis patentowy USA nr
4816567), w których zasadniczo mniej niż nienaruszona ludzka domena zmienna została podstawiona od-
40
powiadającą jej sekwencją pochodzącą od gatunku nie będącego człowiekiem. W praktyce, humanizowane
przeciwciała są zazwyczaj ludzkimi przeciwciałami, w których pewne reszty CDR i prawdopodobnie pewne
reszty FR podstawiono resztami z analogicznych miejsc w przeciwciałach gryzoni.
38
EP 1 692 102 B1
VI. Sposoby leczenia, podawania i kompozycje farmaceutyczne
[0177] Modulatory CCX-CKR2 (np., antagoniści lub agoniści) mogą być podawane bezpośrednio osobnikowi
będącemu ssakiem do modulacji przekazywania sygnału przez receptor chemokinowy in vivo. W niektórych
wykonaniach modulatory współzawodniczą z SDF1 i/lub I-TAC o wiązanie z CCX-CKR2. Modulacja CCX5
CKR2 może obejmować, np. przeciwciała (w tym przeciwciała monoklonalne, humanizowane lub inne typy
białek wiążących znanych w dziedzinie, małe związki organiczne, siRNA itd.
[0178] Opisano tutaj, że modulatory CCX-CKR2 podaje się pacjentowi mającemu nowotworu. W niektórych
przypadkach modulatory CCX-CKR2 podaje się w celu leczenia nowotworu, np., raków, glejaków, międzybłoniaków, czerniaków, chłoniaków, białaczek, gruczolakoraków, raka sutka, raka jajnika, raka szyjki macicy,
10
glejaka, białaczki, chłoniaka, raka gruczołu krokowego oraz chłoniaka Burkitta, raka głowy i szyi, raka okrężnicy, raka jelita grubego i odbytu, niedrobnokomórkowego raka płuc, drobnokomórkowego raka płuc, raka
przełyku, raka żołądka, raka trzustki, raka układu wątrobowo-żółciowego, raka pęcherzyka żółciowego, raka
jelita cienkiego, raka odbytnicy, raka nerek, raka pęcherza moczowego, raka gruczołu krokowego, raka penisa, raka cewki moczowej, raka jądra, raka szyjki macicy, raka pochwy, raka macicy, raka jajnika, raka tar-
15
czycy, raka przytarczyc, raka nadnerczy, nowotworu z komórek wewnątrzwydzielniczych trzustki, rakowiaka,
raka kości, raka skóry, siatkówczaka złośliwego, chłoniaka Hodgkina, chłoniaka nieziarniczego (dodatkowe
nowotwory, patrz CANCER:PRINCIPLES AND PRACTICE (DeVita, VT i inni, red. 1997)); a także zaburzeń
czynności mózgu i neuronalnych, takich jak choroba Alzheimera i stwardnienie rozsiane; niewydolności nerek; reumatoidalnego zapalenia stawów; odrzucenia przeszczepu serca; miażdżycy; astmy; kłębuszkowego
20
zapalenia nerek; kontaktowego zapalenia skóry; zapalenia jelit; zapalenia okrężnicy; łuszczycy; uszkodzenia
reperfuzyjnego; jak również innych opisanych tutaj chorób i zaburzeń. W niektórych postaciach, pacjent nie
cierpi na mięsaka Kaposiego, wieloogniskową chorobę Castlemana lub związanego z AIDS pierwotnego
chłoniaka wysiękowego. Ponieważ CCX-CKR2 jest często wyrażany w komórkach nowotworowych, ale nie
w komórkach nienowotworowych, zazwyczaj konieczne jest podawanie antagonistów CCX-CKR2 do lecze-
25
nia pacjentów mających nowotwór. W niektórych przypadkach modulatory maja masę cząsteczkową niższą
niż 1500 Daltonów, a w niektórych przypadkach mniejszą niż 1000, 800, 600, 500 lub 400 Daltonów.
[0179] Podawanie modulatorów można prowadzić dowolną z dróg normalnie stosowanych do wprowadzenia
związku modulatora do ostatecznego kontaktu z leczoną tkanką i jest dobrze znane dla specjalistom w dziedzinie. Chociaż do podawania konkretnej kompozycji można stosować więcej niż jedną drogę, konkretna
30
droga może często dostarczyć bardziej bezpośredniej i skuteczniejszej reakcji niż inna droga.
[0180] Opisane tutaj kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki są określone częściowo przez konkretną podawaną kompozycję, a
także przez konkretny sposób stosowany do podawania kompozycji. Zatem, istnieje wiele różnych opisanych
tutaj odpowiednich preparatów kompozycji farmaceutycznych (patrz, np. Remington's Pharmaceutical Scien-
35
ces, wydanie 17, 1985)).
[0181] Modulatory (np. agoniści lub antagoniści) ekspresji lub aktywności CCX-CKR2, samodzielnie lub w
połączeniu z innymi odpowiednimi składnikami, można doprowadzić do preparatów aerozolowych (tj. można
je "nebulizować") tak by były podawane przez inhalację. Formulacje aerozolowe można umieszczać pod
ciśnieniem w dopuszczalnych propelentach, takich jak dichlorodifluorometan, propan, azot itp.
40
[0182] Formulacje odpowiednie do podawania obejmują roztwory wodne i bezwodne, izotoniczne jałowe
roztwory, które mogą zawierać przeciwutleniacze, bufory, środki bakteriostatyczne i substancje rozpuszczone, które sprawiają, że formulacja jest izotoniczna i wodne i bezwodne jałowe zawiesiny, które mogą zawie39
EP 1 692 102 B1
rać środki zawieszające, środki solubilizujące, środki zagęszczające, stabilizatory i środki konserwujące. W
praktyce u niniejszego wynalazku kompozycje można podawać, na przykład, doustnie, donosowo, miejscowo, dożylnie, śródotrzewnowo lub dooponowo. Formulacje związków mogą być obecne w jednodawkowych
lub wielodawkowych uszczelnionych pojemnikach, takich jak ampułki lub fiolki. Roztwory lub zawiesiny moż5
na wytwarzać z jałowych proszków, granulek i tabletek typu, który poprzednio opisano. Modulatory można
także podawać jako część przygotowanego pokarmu lub leku.
[0183] W niektórych postaciach, modulatory CCX-CKR2 według niniejszego wynalazku można podawać w
kombinacji z innymi odpowiednimi środkami terapeutycznymi obejmującymi, np. środki chemioterapeutyczne, radioaktywne itd. Wyboru odpowiednich środków do stosowania w terapii skojarzonej może dokonać
10
specjalista w dziedzinie, zgodnie ze standardowymi zasadami farmaceutycznymi. Kombinacja środków terapeutycznych może działać synergistycznie wpływając na leczenie lub profilaktykę różnych zaburzeń, takich
jak np. nowotwór, niewydolność nerek, upośledzenie czynności umysłowych lub upośledzenie czynności
neuronalnych. Z zastosowaniem tego podejścia możliwe jest uzyskanie skuteczności terapeutycznej przy
niższych dawkach każdego ze środków, co tym samym zmniejsza możliwość wystąpienia szkodliwych skut-
15
ków ubocznych.
[0184] Dawka podawana pacjentowi, w kontekście niniejszego wynalazku, powinna być wystarczająca do
wywołania korzystnej odpowiedzi u pacjenta w czasie (np. do zmniejszenia wielkości nowotworu lub obciążenia nowotworem). Optymalny poziom dawki dla jakiegokolwiek pacjenta będzie zależeć od wielu czynników obejmujących skuteczność specyficznego zastosowanego modulatora, wieku, masy ciała, aktywności
20
fizycznej i diety pacjenta, od możliwego połączenia z innymi lekami i od zaawansowania konkretnej choroby.
Wielkość dawki będzie także określona przez występowanie, naturę i rozmiar jakichkolwiek szkodliwych
skutków ubocznych, które towarzyszą podawaniu konkretnego związku lub wektora konkretnemu pacjentowi.
[0185] Przy określaniu skutecznej ilości modulatora, który ma być podany lekarz może ocenić poziomy mo-
25
dulatora krążące w osoczu, toksyczność modulatora i wytwarzanie przeciwciał przeciw-modulatorowi. Ogólnie, równoważnik dawki modulatora wynosi od około 1 ng/kg do 10 mg/kg dla typowego pacjenta.
[0186] Przy podawaniu, modulatory receptora chemokinowego według niniejszego wynalazku można podawać z szybkością określoną przez LD-50 modulatora i skutki uboczne modulatora w różnych stężeniach, w
odniesieniu do całkowitej masy i ogólnego stanu zdrowia pacjenta. Podawanie można prowadzić w pojedyn-
30
czych lub podzielonych dawkach.
VII. KOMPOZYCJE, ZESTAWY, ZINTEGROWANE UKŁADYI ZASTOSOWANIA PROTEOMICZNE
[0187] Opisano tutaj kompozycje, zestawy oraz zintegrowane układy do przeprowadzania opisanych tutaj
testów z zastosowaniem przeciwciał przeciw-CCX-CKR2 lub innych środków, które swoiście wykrywają
CCX-CKR2.
35
[0188] Opisano tutaj także kompozycje testowe do zastosowania w testach w fazie stałej; takie kompozycje
mogą zawierać, na przykład polipeptyd CCX-CKR2 (w tym, np. jako część komórki, frakcje błonowe lub liposomy (patrz, np., Babcok i inni, J. Biol. Chem. 276(42):38433-40 (2001); Mirzabekov i inni, Nat. Biotechnol.
18(6):649-54 (2000))) unieruchomiony na stałym nośniku oraz odczynnik znakujący. W każdym przypadku
kompozycje testowe mogą także zawierać dodatkowe odczynniki, które są konieczne do hybrydyzacji. Na
40
przykład, nośnikiem stałym może być, np. szalka Petriego, płytka wielostudzienkowa lub mikromacierz. Ponadto, mikromacierze bibliotek peptydów można stosować do identyfikacji sekwencji peptydowych, które
swoiście wiążą CCX-CKR2.
40
EP 1 692 102 B1
[0189] Do kompozycji testowych można także włączyć środki, które swoiście wiążą CCX-CKR2. Na przykład, przeciwciało, które swoiście wiąże CCX-CKR2 można unieruchomić na stałym nośniku. W niektórych z
tych postaci stosuje się środek do wykrycia obecności lub braku CCX-CKR2 lub komórek wyrażających
CCX-CKR2. Na przykład, nośnikiem stałym może być, np. szalka Petriego, płytka wielostudzienkowa lub
5
mikromacierz.
[0190] Opisano tutaj zestawy do przeprowadzania testów według wynalazku. Zestawy te zazwyczaj zawierają środek (np. przeciwciało lub inną małą cząsteczkę), który swoiście wiąże się z CCX-CKR2 i znacznik do
wykrywana obecności tego środka. Zestawy te mogą zawierać jeden lub więcej polipeptydów innego receptora chemokinowego. Zestawy mogą zawierać dowolne kompozycje wymienione powyżej i ewentualnie po-
10
nadto zawierać dodatkowe składniki, takie jak instrukcje przeprowadzania wysokowydajnych testów do zbadania wpływu na aktywność lub działanie receptorów chemokinowych, jeden lub więcej pojemników lub komór (np. do utrzymywania sondy, znaczników itd.), kontrolny modulator działania lub aktywności receptorów
chemokinowych, aparaturę robotyczną do mieszania składników zestawu itp.
[0191] W niektórych przypadkach zestawy zawierają SDF1 i/lub I-TAC. W niektórych przypadkach zestawy
15
zawierają znakowany lub etykietowany SDF-1 i nieznakowany współzawodniczy I-TAC lub inaczej, znakowany lub etykietowany I-TAC oraz nieznakowany współzawodniczy SDF-1. Znakowana lub zaetykietowana
chemokina może być znakowana lub etykietowana w jakikolwiek sposób znanych specjaliście w dziedzinie.
W niektórych przypadkach, znakowana chemokina jest znakowana izotopowo lub etykietowana biotyną lub
znacznikiem fluorescencyjnym. Inaczej, lub dodatkowo, zestaw może zawierać środek wiążący przeciw-I-
20
TAC (np. przeciwciało) do wykrywania I-TAC. Zestawy mogą także zawierać odpowiednie sole buforujące
oraz inne odczynniki do przeprowadzenia testu wiązania kompetycyjnego, np. nienaruszone komórki lub
błony komórkowe. Takie odczynniki opisano np. w poniższych Przykładach. W niektórych aspektach zestawy
zawierają także stały nośnik lub naczynie do zmierzenia wiązania liganda z CCX-CKR2 (np. w formacie płytek do reakcji kompatybilnych z licznikami scyntylacyjnymi lub zautomatyzowanymi czytnikami płytek). W
25
niektórych przypadkach, zestawy zawierają instrukcje do stosowania tych zestawów, np. w sposobach według wynalazku.
[0192] Opisano tutaj także zintegrowane układy do wysokowydajnego przeszukiwania potencjalnych modulatorów pod względem wpływu na aktywność lub działanie potencjalnych modulatorów CCX-CKR2. Układy te
zazwyczaj obejmują aparaturę robotyczną, która przenosi płyn ze źródła do miejsca przeznaczenia, kontroler
30
kontrolujący aparaturę robotyczną, detektor znacznika, jednostkę do przechowywania danych, która rejestruje detekcję znacznika oraz składnik testu, taki jak płytka do mikromiareczkowania zawierająca studzienkę z
mieszaniną reakcyjną lub substrat zawierający utrwalony kwas nukleinowy lub resztę unieruchamiającą.
[0193] Obrazowanie optyczne obserwowane (i ewentualnie, rejestrowane) przez kamerę lub inne urządzenie
rejestrujące (np. fotodiodę i urządzenie do przechowywania danych) są ewentualnie poddawane dalszej
35
obróbce, jak tutaj opisano, np., przez digitalizację obrazu i przechowywanie i analizę obrazu na komputerze.
Wiele różnych dostępnych w handlu urządzeń peryferyjnych i oprogramowania jest dostępnych do digitalizacji, przechowywania i analizy zdygitalizowanego nagrania wideo i zdygitalizowanego obrazowania optycznego.
40
41
EP 1 692 102 B1
PRZYKŁADY
Przykład 1:
[0194] Przykład ten pokazuje, że SDF-1 i I-TAC współzawodniczą o wiązanie z nowym receptorem chemo5
kinowym.
Materiały i Metody.
[0195] Odczynniki i komórki. Ludzkie, wirusowe i mysie rekombinowane chemokiny uzyskano z R&D Systems (Minneapolis, MN) i PeproTech (Rocky Hill, NJ) gdzie to wskazano.
z PerkinElmer Life Sciences, Inc. (Boston, MA), a
10
125
I-znakowaną SDF-1a zakupiono
125
I-znakowaną I-TAC uzyskano z Amersham Pharmacia
Biotech (Buckinghamshire,UK). Przeciwciała monoklonalne stosowane w cytometrii przepływowej oraz do
kompetycyjnego wiązania liganda były z R&D Systems (Minneapolis, MN): klony 12G5, 44708.111 (171),
44716.111 (172), 44717.111 (173), nmIgG2a i nmIgG2b przeciw-CXCR4. Drugorzędowe przeciwciało, kozie
anty-mysie IgG sprzężone z PE (Coulter Immunotech, Miami, FL) zastosowano do wykrycia wiązania przeciwciała przez cytometrię przepływową. Poniższe komórki uzyskano z American Type Culture Collection
15
(Manassas, VA): MCF-7 (gruczolakorak; gruczoł sutkowy), MDA MB-231 (gruczolakoraki; gruczoł sutkowy),
MDA MB-435s (rak przewodowy; gruczoł sutkowy), DU 4475 (gruczoł sutkowy), ZR 75-1 (rak przewodowy;
gruczoł sutkowy), HEK 293 (ludzkie komórki zarodkowe nerki), HUV-EC-C (ludzkie komórki żyły pępowinowej; śródbłonek naczyń; prawidłowe). Komórki CEM-NKr (ostra białaczka limfoblastyczna; krew obwodowa;
limfoblasty T) uzyskano z NIH AIDS Research and Reference Reagent Program. Linie komórkowe hodowa-
20
no w DMEM (Mediatech, Herndon, VA) uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (HyClone Logan, UT) w 37°C w nawilżanym inkubatorze w mieszaninie 5% CO2/powietrze. Ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) uzyskano z kożuszków leukocytarno-płytkowych zdrowych dawców (Stanford
Blood Center, Palo Alto, CA) przez wirowanie na gradientach gęstości Ficoll-Hypaque. Izolowane PBMC
aktywowano 2,5 µg/ml fitohemaglutniny (PHA) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) i 10 ng/ml rekom-
25
binowanej ludzkiej IL-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN) przez 3 dni w RPMI-1640 (Mediatech, Hemdon,
VA) uzupełnionym 10% FBS w 37°C w nawilżanym inkubatorze w mieszaninie 5% CO2/powietrze. Po aktywacji komórki przemyto i hodowano w RPMI uzupełnionym 10% FBS i 10 ng/ml IL-2, którą uzupełniano co 34 dni do dnia wykorzystania komórek.
[0196] Analiza wiązania. Do zbadania globalnego profilu oddziaływania liganda chemokinowego z recepto-
30
rem SDF-1 na komórkach MCF-7 i CEM-NKr zastosowaliśmy technikę, "DisplaceMax™". Technologia ta
wykorzystuje rozszerzone, zmaksymalizowane pod względem wydajności wiązanie liganda znakowanego
izotopowo z wykorzystaniem protokołów filtracji, ja wcześniej opisano (Dairaghi i inni, J Biol Chem
274:21569-74 (1999); Gosling, J. i inni J Immunol 164:2851-6 (2000)). W tych testach, w DisplaceMax™
zastosowano równoczesne badanie komórek MCF-7 lub CEM-NKr, jak wskazano, przez >110 różnych
35
oczyszczonych chemokin pod względem zdolności do wyparcia znakowanej izotopowo
125
I SDF-1α lub I-
TAC, jak wskazano, z zastosowaniem opisanego protokołu (Dairaghi,i inni J Biol Chem 274:21569-74
(1999); Gosling, J. i inni J Immunol 164:2851-6 (2000)). W skrócie, elementy chemokinowe inkubowano z
komórkami po dodaniu chemokiny znakowanej izotopowo (125I SDF-1a lub
125
I h I-TAC) przez 3 godz. w 4°C
w poniższym podłożu do wiązania (25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2 i 0,2% bydlęca
40
albumina surowicza, doprowadzone do pH 7,1). W niektórych testach małe cząsteczki włączono tam, gdzie
to wskazano. W testach tych związek dodawano do płytki we wskazanym stężeniu, a następnie dodawano
chemokinę znakowaną izotopowo. Następnie wszystkie testy inkubowano przez 3 godz. w 4°C z delikatnym
42
EP 1 692 102 B1
wytrząsaniem. Po inkubacji we wszystkich testach wiązania mieszaninę reakcyjną zaaspirowano na potraktowane PEI szklane filtry GF/B (Packard) z zastosowaniem urządzenia cell harvester (Packard) i dwukrotnie
przemyto (25 mM HEPES, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, doprowadzony do pH 7,1). Do studzienek dodano roztwór scyntylacyjny (MicroScint 10, Packard) i (komórki na filtrach?) filtry zliczono w liczniku
5
scyntylacyjnym Packard Topcount. Dane analizowano i wykreślono z zastosowaniem Prism (GraphPad
Prism wersja 3.0a dla Macintosh, oprogramowanie GraphPad).
[0197] Oznaczenie wiązania
125
I SDF-1α z receptorem. Stosując opisany powyżej test oparty na na filtracji
komórki preinkubowano z albo 1) samym buforem, 2) nadmiarem SDF-1β (końcowe stężenie 90 nM) albo 3)
MIG (końcowe stężenie 175 nM), jak wskazano, przez 30 min. w 4°C. Po tej inkubacji do mieszaniny reak10
cyjnej wiązania dodano wskazaną nie znakowaną współzawodniczą chemokinę we wskazanych stężeniach
oraz
125
I I-TAC. Następnie wszystkie testy inkubowano, zbierano i analizowano jak opisano powyżej.
[0198] RT PCR. mRNA wyizolowano z komórek z zastosowaniem standardowych technik. Komplementarny
DNA analizowano pod względem ekspresji CXCR3 i CXCR4 z zastosowaniem PCR. Specyficzne startery
uzyskano z Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Specyficzne produkty PCR mierzono za pomocą
15
Hybaid Omn-E (E&K Scientific Products, Inc., Saratoga, CA) podczas 35 cykli. GAPDH zmierzono jako kontrolę.
[0199] Test adhezji. Komórki HUVEC hodowano przez noc na traktowanych szkiełkach do hodowli tkankowej w obecności TNFα (25 ng/ml) i IFNγ (50 ng/ml). Następnego dnia komórki NSO transfekowane CCXCKR2, a także kontrole typu dzikiego wyznakowano kalceiną-AM. Następnie komórki wyznakowane kalceiną
20
wysiano na monowarstwę komórek śródbłonka w obecności i przy braku antagonisty CCX-CKR2
(CCX3451). Szkiełka inkubowano w 37°C przez 40 minut, a następnie przemyto PBS w celu usunięcia nieprzylegających komórek. Przylegające komórki NSO uwidoczniono z zastosowaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki traktowane związkiem lub podłożem policzono wzrokowo z trzech obszarów widzenia (fov) i
wyniki wykreślono.
25
Wyniki
[0200] Niedawno opublikowane doniesienia zidentyfikowały ekspresję CXCR4 na kilku typach komórek nowotworowych (Sehgal, i inni, J Surg Oncol 69:99-104 (1998); Sehgal, A., i inni J Surg Oncol 69:239-48
(1998); Burger, i inni Blood 94:3658-67 (1999); Rempel, i inni Clin Cancer Res 6:102-11 (2000); Koshiba, T. i
inni Clin Cancer Res 6:3530-5 (2000); Muller, A. i inni Nature 410:50-6 (2001); Robledo, i inni J Biol Chem
30
276:45098-45105 (2001)) iw jednym przykładzie połączono tę ekspresję z przerzutami komórek nowotworu
sutka (Muller, A. i inni Nature 410:50-6 (2001)). W celu dalszego zbadania roli receptorów chemokinowych
na komórkach nowotworowych podjęto próbę oceny ekspresji CXCR4 na kilku liniach ludzkich komórek raka
sutka. Początkowo, wzór ekspresji CXCR4 oceniono przez cytometrię przepływową. Pierwotne limfocyty T
hodowane z IL-2 i dwie linie komórek T, CEM-NKr i Jurkat, zbadano w celu oznaczenia fenotypu komórek T
35
pod względem barwienia przeciw-CXCR4. Zbadano także trzy linie komórek raka sutka, MCF-7, MDA MB231 i MDA MB-435s. Wszystkie cztery klony przeciw-CXCR4 wybarwiły komórki T. Nieoczekiwanie, podczas
gdy opisano, że komórki raka sutka wyrażają CXCR4, szeroko stosowany klon 12G5 nie wykrył jakiegokolwiek CXCR4 na komórkach raka sutka. Słabą i zmienną reaktywność wykryto dla trzech innych klonów zbadanych na komórkach raka sutka. W teście tym zbadano także linie komórkowe raka sutka DU 4475 i ZR 75-
40
1 (dane nie prezentowane) i stwierdzono, że wykazują one podobne profile wybarwienia przeciwciałami jak
inne zbadane komórki raka sutka. Zatem wzory wybarwienia panelem mAb dla CXCR4 wydają się sugerować dwa różne typy reaktywności: "leukocytarny" fenotyp CXCR4 (którego przykładem jest wybarwienie
43
EP 1 692 102 B1
CEM-NKr, Jurkat i limfocytów hodowanych z IL-2) i fenotyp komórek raka sutka (którego przykładem jest
słabe wybarwienie na liniach komórek raka sutka MCF-7 i MDA MB-231).
[0201] Konsekwentny brak reaktywność przy zastosowaniu najczęściej stosowanego mAb przeciw-CXCR4,
klonu 12G5, na komórkach raka sutka doprowadziło autorów do zbadania ekspresji CXCR4 w tych komór5
kach przez RT PCR. mRNA wyizolowano z trzech linii komórek sutka zbadanych w cytometrii przepływowej,
a także limfocytów hodowanych z IL-2 i linii komórek T, CEM-NKr i Jurkat, jako kontroli pozytywnych dla
ekspresji CXCR4. Pomimo braku reaktywności z 12G5 i zmiennej reaktywności z innymi zbadanymi klonami
przeciwciał przeciw-CXCR4, linie komórek raka sutka, MCF-7 i MDA MB-231, wyrażały mRNA CXCR4; jednakże stwierdzono, że MDA MB-435s jest negatywna względem ekspresji CXCR4. We wszystkich przypad-
10
kach jako kontrolę zmierzono GAPDH. W celu zbadania czy różnice w reaktywności mAb mogą wynikać z
różnic w sekwencji w ten sposób powodujących zmiany epitopów CXCR4 na różnych liniach komórkowych
zsekwencjonowano następnie produkty PCR wytworzone z MCF-7, jako reprezentatywnych komórek raka
sutka CXCR4+ i CEM-NKr, jako reprezentatywnych komórek T. Sekwencje z tych dwóch linii komórkowych
są identyczne z opublikowanymi sekwencjami CXCR4, sugerując, że pomimo różnic w profilach przeciwciał
15
przeciw-CXCR4, struktura genetyczna, a zatem polipeptydowa CXCR4 w obu typach komórek była identyczna.
[0202] Opisano wcześniej zestaw technik, w których jednocześnie można oceniać wiązanie z receptorem
obszernego zbioru ligandów chemokinowych (Dairaghi, i inni J Biol Chem 274:21569-74 (1999); Gosling, J. i
inni J Immunol 164:2851-6 (2000)). W sposób ten zbadaliśmy profil wiązania CXCR4 na CEM-NKr w porów-
20
naniu z komórkami MCF-7. Ponad 90 elementów chemokinowych zbadano pod względem zdolności do wyparcia sygnaturowej chemokiny, 125I SDF-1α, w wiązaniu komórek CEM-NKr (Figura 1) lub MCF-7 (Figura 1).
Jak oczekiwano, potencjalne chemokiny współzawodniczące z
125
I SDF-1α z wysokim powinowactwem na
CEM-NKr obejmują hSDF-1β i mSDF-1, podczas gdy hSDF-1α i HHV8 vMIP-II wykazują współzawodnictwo
o średnim powinowactwie. Jest to zgodne ze wszystkimi wcześniej opisanymi wynikami dla SDF-1 jako jedy25
nym niewirusowym ligandem CXCR4. Jednak, ogólny wzór współzawodnictwa na komórkach MCF-7 był
wyraźnie inny. W tym typie komórek hI-TAC i mI-TAC wykazywały współzawodnictwo o wysokim powinowactwie do tego samego liganda sygnaturowego SDF-1. W celu dalszego zbadania tego nietypowego wyniku
125
I I-TAC zastosowano jako ligand sygnaturowy na komórkach MCF-7 (Figura 1). Profil wyparcia o wyso-
kim powinowactwie z zastosowaniem
30
125
II-TAC na MCF-7 był identyczny z profilem uzyskanym dla
125
I SDF-
1α. Zatem, na komórkach MCF-7 I-TAC i SDF-1 zachowują się w sposób nie dający się rozróżnić i współzawodniczą o to samo miejsce receptorowe.
[0203] W celu dalszego scharakteryzowania wiązania I-TAC i SDF-1 uzyskano krzywe odpowiedzi na dawkę
w doświadczeniach kompetycyjnego wiązania z wybranymi ligandami o potencjalnie wysokim powinowactwie na CEM-NKr i MCF-7. Jak zasugerowały dane DisplaceMax™, I-TAC współzawodniczy z
35
wiązanie z MCF-7, ale nie z CEM-NKr (Figura 2). Homologiczne współzawodnictwo
125
I SDF-1α o
125
I SDF-1α z którąkol-
wiek z izoform SDF-1, SDF-1α lub SDF-1β, spowodowało całkowite współzawodnictwo na CEM-NKr i MCF7 (Figura 2). W szczególności, powinowactwo SDF-1 względem receptora wyrażanego na MCF-7 jest wyższe niż na CEM-NKr. Zatem, podczas gdy sekwencja CXCR4 w obydwu typach komórek jest identyczna
specyficzność wiązania liganda i powinowactwo różnią się dla komórek T vs komórki raka sutka.
40
[0204] Następnie zbadano czy w wiązaniu I-TAC wykrytym na komórkach MCF-7 może uczestniczyć
CXCR3, ponieważ CXCR3 jest od dawna ustalonym głównym receptorem dla I-TAC (Cole, K. E. i inni J Exp
Med 187:2009-21. (1998)). W tym celu, zbadano wiązanie 125II-TAC w warunkach, które zahamowałyby "kla44
EP 1 692 102 B1
syczne" wiązanie za pośrednictwem CXCR3 (tj. wiązanie znanych ligandów CXCR3 MIG, I-TAC i IP-10 z
CXCR3)umożliwiając w ten sposób "klasyczne" wiązanie za pośrednictwem CXCR4 (tj. wiązanie opisanego
liganda CXCR4 SDF-1 z CXCR4), jak również w odwrotnej sytuacji. Komórki MCF-7 wstępnie inkubowano
albo z samym podłożem, podłożem zawierającym nadmiar (~175 nM; w celu zahamowania wiązania za po5
średnictwem CXCR3) lub podłożem zawierającym nadmiar SDF-1β (~90 nM; w celu zahamowania wiązania
za pośrednictwem CXCR4). I-TAC współzawodniczyła z
125
I I-TAC o wiązanie z komórkami MCF-7 z IC50 1
nM (Figura 3), co potwierdza, że jest to ligand o wysokim powinowactwie do tego receptora na tych komórkach. Podobnie, komórki najpierw wstępnie inkubowane z nadmiarem MIG były nadal w stanie wytworzyć
taką samą homologiczną krzywą wiązania I-TAC/125I I-TAC ponownie z IC50 1 nM (Figura 3). Jednak, gdy
10
komórki najpierw wstępnie inkubowano z nadmiarem SDF-1β zahamowano całe wiązanie
3), co sugeruje, że w obserwowanym wiązaniu
125
II-TAC (Figura
125
II-TAC na komórkach raka sutka uczestniczy receptor
SDF1 wyrażany na tych komórkach. Podobnie, wiązanie
125
II-TAC z komórkami MCF-7 nie było hamowane
gdy IP-10 zbadano jako nie znakowaną współzawodniczą chemokinę. Ponownie, wstępna inkubacja z nadmiarem MIG nie wpłynęła na profil wiązania; jednak wstępna inkubacja komórek z SDF-1β całkowicie zaha15
mowała wiązanie
125
I I-TAC. Gdy ligand CXCR3 MIG zbadano jako nie znakowaną chemokinę współzawod-
niczącą to wiązanie
125
II-TAC z komórkami nie było zahamowane (Figura 3). Jak oczekiwano z danych Di-
splaceMax™ przedstawionych na Figurze 1, SDF-1β współzawodniczyła z
125
I I-TAC o wiązanie z tymi ko-
mórkami z wysokim powinowactwem (IC50 1 nM). Preinkubacja komórek z nadmiarem MIG nie wpływała na
współzawodnictwo SDF-1β/125I I-TAC, ponownie sugerując, że w wykrytym wiązaniu nie uczestniczy
20
CXCR3.
[0205] Hipotezę tę zbadano dalej z zastosowaniem PCR. Wcześniej zastosowany wyizolowany mRNA (opisany powyżej) zastosowano do udowodnienia obecności transkryptów CXCR3. Podczas gdy limfocyty hodowane z IL-2 wyrażały CXCR3; żaden inny zbadany typ komórek nie wyrażał CXCR3. Brak ekspresji
CXCR3 wykrywalnej przez RT PCR potwierdza dane z Figury 3, co ponowie sugeruje, że w wiązaniu I-TAC
25
na MCF-7 nie pośredniczy CXCR3.
[0206] Zmieniona reaktywność przeciwciała przeciw-CXCR4, a także zmieniona specyficzność i powinowactwo wiązania z ligandem doprowadziły nas do wzięcia pod uwagę, że receptor ten nie jest klasycznym
CXCR4. Istnieje kilka "sierocych" receptorów chemokinowych, które zostały zidentyfikowane, ale dla których
nie zidentyfikowano liganda chemokinowego. Rozważaliśmy kilka receptorów sierocych. Jeden taki receptor
30
jest nazywany RDC1 (tutaj określany CCX-CKR2). Gdy sekwencję białkowa RDC1 transfekuje się do MDA
MB 435s (linii komórkowej, która endogennie nie wyraża CXCR4, CXCR3 lub CCX-CKR2) analizowana jest
cecha fenotypu wiązania liganda znakowanego izotopowo (Figura 4). CCX-CKR2 wyrażany w komórkach
MDA MB 435s wiąże SDF-1 znakowaną izotopowo. Z wiązaniem tym współzawodniczą nie znakowane
chemokiny współzawodnicze SDF-1 i I-TAC.
35
[0207] W próbie ukierunkowania na ten receptor terapeutyków będących małymi cząsteczkami organicznymi
(SMC) przeszukano małe cząsteczki (prawie 135000) z zastosowaniem dwóch przesiewowych testów wysokowydajnych: jednego zaprojektowanego do oceny fenotypu wiązania SDF-1 za pośrednictwem CXCR4 na
leukocytach i jednego badającego fenotyp wiązania SDF-1 za pośrednictwem CCX-CKR2 na komórkach
raka sutka. Wyniki tych badań przesiewowych wykazały, że możliwe było wyraźne farmakologiczne rozróż-
40
nienie tych dwóch fenotypów wiązania (Figura 5). Na przykład, mała cząsteczka oznaczona CCX0803
współzawodniczy z
125
I SDF-1α o wiązanie z MCF-7 z IC50 46 nM (Figura 5), jednak, ta mała cząsteczka w
ogóle nie hamuje wiązania
125
I SDF-1α na CEM-NKr (Figura 5). W odróżnieniu od tego, inny antagonista
45
EP 1 692 102 B1
małocząsteczkowy, CCX7923, hamuje wiązanie
hamuje wiązania
125
I SDF-1α do CEM-NKr z IC50 106 nM (Figura 5), ale nie
125
I SDF-1α na komórkach MCF-7 (Figura 5). Te dwa związki ujawniają wyraźny i jedno-
znaczny wzór nie-wzajemnego hamowania wiązania ligandów z tymi dwoma receptorami (linie raka sutka vs
leukocyty).
5
[0208] Po początkowym określeniu, że komórki raka sutka wykazują powinowactwo wiązania do SDF-1,
które różni się od tego obserwowanego na innej tkance nienowotworowej lub nierakowej, podjęto dalsze
badania. Te badania fenotypowania (z zastosowaniem reaktywności przeciwciała, profilu wiązania liganda i
rozróżnienia farmakologicznego, patrz, wyszczególnione tutaj metody) wyraźnie pokazały, że wiele typów
komórek rakowych (lub nowotworowych) także wykazuje powinowactwo wiązania (np., reaktywność z prze-
10
ciwciałem, wiązanie ligandów i rozróżnienie farmakologiczne) początkowo skorelowane z komórkami raka
sutka, a zatem z ekspresją CCX-CKR2. Zbadano następujące komórki nowotworowe i wykazują one powinowactwo wiązania skorelowane z nowotworem: ludzkie komórki raka jajnika, ludzkie komórki gruczolakoraka szyjki macicy, ludzkie komórki chłoniaka Burkitta, ludzkie komórki gruczolakoraka sutka, ludzkie komórki
raka przewodowego, ludzkie komórki glejaka oraz mysie komórki nowotworu sutka.
15
[0209] Nowotwory i inne raki są trudne do leczenia częściowo z powodu ich szybkiego tempa wzrostu komórek. W tym zakresie wiadomo, że nowotwory dzielą takie same charakterystyki wzrostu jak szybko dzielące
się wczesne tkanki zarodkowe. Jedna szkoła myślenia sugeruje, że nowotwory u osób dorosłych stanowią
"rewertanty' do zarodkowego fenotypu wzrostu. Myszy z nokautem genetycznym zarówno SDF-1, jak i
CXCR4, są letalne na etapie zarodka, co sugeruje, że ta para liganda i receptora jest krytycznym składni-
20
kiem wzrostu i rozwoju. Około 50% homozygotycznych zarodków z mutacją SDF-1 umiera okołoporodowo w
dniu 18,5; pozostałe homozygotyczne osobniki z miotu zdychają w przeciągu 1 godziny po urodzeniu (Kishimoto, i inni Nature 382: 635-638 (1996)). Podobnie, ~1/3 homozygotycznych myszy z nokautem CXCR4
umiera okołoporodowo w dniu E18,5 (Ma i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9448-9453 (1998)). Zarówno
w nokautach receptora i liganda obserwowano defekty limfopoezy i mielopoezy. Wątroba zarodka jest głów-
25
nym miejscem hematopoezy u myszy w dniu 11 i utrzymuje tą funkcję do czasu pierwszego tygodnia po
porodzie. Z tego powodu postanowiliśmy zbadać ekspresję CCX-CKR2 w tym kompartymencie. Zbadaliśmy
ekspresję CCX-CKR2 na mysich zarodkach typu dzikiego w E17 (punkt w rozwoju, który jest bliski do punktu
czasowego, w którym umierają zwierzęta z nokautem) i E13 ( punkt w rozwoju, który jest daleki do punktu
czasowego, w którym umierają zwierzęta z nokautem, ale po rozpoczęciu hematopoezy).
30
[0210] W testach wiązania SDF-1 znakowana izotopowo ludzka SDF-1 wiąże się z komórkami wątroby płodowej E13 i zarówno SDF, jak i I-TAC (białka mysie i ludzkie) są w stanie współzawodniczyć o wiązanie z
cząsteczką znakowaną izotopowo. Ta zmieniona specyficzność wobec liganda, czego przykładem jest wiązanie I-TAC z receptorem SDF-1, jest cechą fenotypu wiązania, którą najpierw skorelowaliśmy z komórkami
nowotworowymi, co do której wykazano teraz, że jest to CCX-CKR2. Ponadto, antagoniści CCX-CKR2 są w
35
stanie współzawodniczyć o wiązanie z SDF-1 na wątrobie zarodka E13; natomiast antagoniści CXCR4 nie
są do tego zdolni.
[0211] Później w rozwoju, komórki wątroby zarodka w dniu E17 wyrażają CXCR4 i komórki te odpowiadają
na SDF-1 przez mobilizację wewnątrzkomórkowego wapnia. Antagoniści CXCR4 hamują tę mobilizację komórkowego wapnia, w której pośredniczy SDF-1, jednak antagoniści CCX-CKR2 nie wywierają takiego dzia-
40
łania. Zatem dane te sugerują, że komórki wątroby zarodka typu dzikiego w zarówno w dniach E13 jak i E17
wyrażają CXCR4, natomiast CCX-CKR2 jest wyrażany we wczesnych (E11), ale nie w późniejszych punktach czasowych (E15).
46
EP 1 692 102 B1
[0212] Pomimo, że badania wiązania w modelach zarodków myszy dobrze korelują z danymi z badań u
ludzi, wstępne doświadczenia przeprowadzone z wykorzystaniem myszy z ukierunkowanym przerwaniem
genu CXCR4 sugerują, że profile wiązania SDF-1 i I-TAC obserwowane w 13 dniu zarodkowym (E13) w
komórkach wątroby zarodka nie są zmienione. Dostarcza to dalszego dowodu, że genem kodującym poli5
peptyd o związanym z nowotworami powinowactwie wiązania SDF-1 nie jest CXCR4.
[0213] Doświadczenia wykazują także, że receptor CCX-CKR2 może dostarczyć sygnału stymulującego
rosnącym komórkom nowotworowym. W odpowiedzi na stymulację SDF-1 komórki nowotworowe mogą
zwiększyć ekspresję pewnych genów uczestniczących w cyklu komórkowym lub transkrypcji. Co istotniejsze,
jeżeli komórki nowotworowe są głodzone bez surowicy w całonocnej hodowli, zaczynają wchodzić w apopto-
10
zę (śmierć komórkową). Gdy dodaje się SDF-1 w celu uzupełnienia tych hodowli, komórki są w stanie wyjść
z głodzenia w porównaniu z nie traktowanymi kontrolami. Zatem SDF-1 służy jako sygnał przeciwapoptotyczny. Komórki nowotworowe często charakteryzuje się jako komórki, które utraciły zdolność do
przechodzenia apoptozy.
Przykład 2:
15
[0214] Przykład ten wykazuje, że w związanym z nowotworem fenotypie omówionym w Przykładzie 1 pośredniczy CCX-CKR2 (poprzednio znany jako sierocy receptor RDC1).
[0215] Ogólnie CCX-CKR2 jest preferencyjnie wyrażany na komórkach transformowanych. Jak przedstawiono w Tabeli 1 (lewa kolumna), wiele różnych komórek nowotworowych okazało się być pozytywnymi w testach na ekspresję CCX-CKR2. Przeciwnie, większość prawidłowych (nienowotworowych) komórek nie wy-
20
rażała CCX-CKR2. Patrz, Tabela 1 (prawa kolumna).
Tabela 1
CCX-CKR2 pozytywne
CCX-CKR2 negatywne
ludzki rak sutka (MCF-7, MDA MB 361)
prawidłowe ludzkie PBMC
ludzkie białaczki komórek T (MOLT4, Jurkat, CEM-
ludzkie glejak (T98G)
NKr)
ludzkie rak gruczołu krokowego (LN Cap)
niestymulowane komórki śródbłonka
ludzkie białaczki z komórek B (Raji, IM9)
mysia grasica
ludzki rak jajnika (HeLa)
mysie płuco
ludzki rak płuc (A549)
mysia śledziona
mysi rak sutka (4T1)
mysie serce
mysie komórki śródbłonka trzustki, transformowane
SV40 (SVR)
mysie PBL
mysie białaczki komórek B (BCL1)
mysia wątroba
mysie prawidłowe nerki*
Całkowity szpik kostny od mysich osobników doro-
47
EP 1 692 102 B1
CCX-CKR2 pozytywne
CCX-CKR2 negatywne
słych
Szpik kostny od osobników dorosłych negatywnej
mysi prawidłowy mózg*
linii mysiej
mysia wątroba zarodkowa (E11 do E13)
mysia wątroba zarodkowa (E15 do narodzin)
aktywowane komórki śródbłonka
* ekspresja na tych narządach jest słaba, co określono przez sygnał wiązania liganda znakowanego izotopowo
[0216] Pomimo tego, wydaje się, że CCX-CKR2 odgrywa rolę w niektórych komórkach prawidłowych. Receptor CCX-CKR2 jest wyrażany przez pewien czas podczas rozwoju zarodka. CCX-CKR2 jest wyrażany na
wątrobie zarodka myszy do dnia 11 embriogenezy (E11), ale w dniu E15 nie jest dłużej wykrywany (jak
oznaczono przez wiązanie SDF1 znakowanego izotopowo i wyparcie 1-TAC, a także transkryptów CCX5
CKR2 wykrytych w analizie Northern). U dorosłych myszy jest on wyrażany w prawidłowej nerce. W porównaniu z ekspresją w nerce, zaobserwowano niższą ekspresję w prawidłowym mózgu. Ponieważ badanie to
przeprowadzono na homogenatach całego mózgu ten niski sygnał w testach wiązania liganda znakowanego
izotopowo jest zgodny z mała populacją komórek wyrażających CCX-CKR2 w mózgu.
[0217] W celu dalszego poparcia dowodu na rolę CCX-CKR2 w nowotworach wykazaliśmy, że wzrost komó-
10
rek nowotworowych można zahamowanć przez antagonizowanie CCX-CKR2 w komórkach nowotworowych.
Antagonizm CCX-CKR2 wyrażony na komórkach raka sutka przez antagonistę CCX-CKR2 zahamował proliferacje komórek in vitro. Komórki traktowane in vitro wykazywały zmniejszony wzrost komórkowy w czasie w
porównaniu z nie traktowanymi kontrolami. Patrz, Figura 6.
[0218] CCX-CKR2 uczestniczy także w adhezji. Migracja leukocytów obejmuje kilka etapów, w tym, adhezję
15
komórek, a następnie ich przemieszczenie do danej tkanki. Statyczne testy adhezji in vitro modelują ten
przypadek. Monowarstwy komórek śródbłonka naczyń są hodowane na powierzchni. Następnie komórki
wyrażające CCX-CKR2 znakuje się barwnikiem fluorescencyjnym w celu wizualizacji. Gdy komórki CCXCKR2 pozostawia się do adhezji do powierzchni śródbłonka znacznie więcej komórek wyrażających CCXCKR2 niż kontrolnych komórek CCX-CKR2- przyczepia się do warstwy śródbłonka. Ponadto, dodanie anta-
20
gonisty CCX-CKR2 hamuje adhezję w porównaniu z kontrolą traktowaną podłożem. Patrz, Figura 7.
[0219] Dowód in vivo dalej potwierdza rolę CCX-CKR2 we wzroście nowotworu. Guzy tworzą się gdy ludzkie
komórki chłoniaka z komórek B, które wyrażają CCX-CKR2, wstrzyknie się myszom z niedoborem odporności. Traktowanie tych myszy antagonistami CCX-CKR2 zahamowało wytworzenie unaczynionego guza. W
jednym z takich badań, u 1 z 17 myszy traktowanych antagonistą CCX-CKR2 rozwinął się otorbiony, una-
25
czyniony guz, podczas gdy u 11 z 17 myszy w grupie traktowanej podłożem rozwinęły się otorbione, unaczynione guzy. Dane te sugerują, że CCX-CKR2 może być związany ze zdolnością nowotworu do różnicowania się i wytworzenia łożyska naczyniowego oraz dostarczają dowodu, że antagonizowanie CCX-CKR2
jest przydatną terapią przeciwnowotworową.
[0220] Wpływ antagonizowania CCX-CKR2 zbadano także w modelu raka sutka. W modelu wzrostu guza
30
sutka myszom z niedoborem odporności wstrzyknięto ludzkie komórki raka sutka. Pomiary guza wykonywa48
EP 1 692 102 B1
no 3 razy na tydzień i wykreślono objętości. Myszy traktowane antagonistą CCX-CKR2 wykazywały zmniejszoną objętość guza w porównaniu z grupą kontrolną z podłożem, wykazując, że CCX-CKR2 odgrywa rolę
we wzroście nowotworu. Patrz, Figura 8.
Przykład 3
5
[0221] Przykład ten wykazuje, że CCX-CKR2 promuje przeżycie komórek przez zmniejszanie apoptozy.
[0222] Oddziaływanie między chemokinami a receptorami chemokinowymi zazwyczaj bada się przez zmierzenie mobilizacji wewnątrzkomórkowego wapnia i chemotaksji. Jednak, CCX-CKR2 nie wytwarza przejściowej mobilizacji wapnia, ani też nie powoduje migracji komórek w odpowiedzi na swoje ligandy CXCL12
lub CXCL11. Jednak komórki wyrażające CCX-CKR2 wykazują zwiększoną adhezję do monowarstw akty-
10
wowanych komórek śródbłonka. Ponadto, w warunkach niskiej suplementacji surowicy w podłożu hodowlanym (tj. 1% zamiast typowych 10%) odzyskiwanie żywych, przylegających komórek po trzech dniach było
znacznie wyższe dla transfektantów MDA MB 435s - CCX-CKR2 (oznaczonych CCX-CKR2 435s) versus
nietransfekowane komórki typu dzikiego WT (WT 435s). Zgodnie z tą obserwacją częstotliwość martwych
komórek odzyskanych w supernatancie zebranym z tych hodowli była znacznie wyższa dla komórek WT
15
versus transfektanty CCX-CKR2. Efekt ten można wizualizować fluorescencyjnie z zastosowaniem barwnika
interkalującego do DNA 7AAD (7 aminoaktynomycyny D). Transfektanty CCX-CKR2-435s lub komórki 435s
typu dzikiego hodowano w różnych stężeniach surowicy, następnie zbierano i inkubowano z 7AAD (1 µg/ml
w DMSO) przez 15-30 minut w temperaturze pokojowej. Analiza FACS ujawniła znacznie więcej martwych/apoptotycznych komórek (tj. 7AAD pozytywnych) w komórkach 435s typu dzikiego versus transfektan-
20
ty CCX-CKR2-435s.
[0223] Obecnie rozszerzono te odkrycia w serii doświadczeń, w których transfektanty CCX-CKR2 lub nietransfekowane komórki typu dzikiego współ-wybarwiono aneksyną, która wykrywa tylko komórki apoptotyczne, oraz jodkiem propidyny (PI), który wykrywa komórki martwe, ale nie apoptotyczne. Podejście to łatwo
identyfikuje stosunek komórek apoptotycznych w populacji komórkowej, co wykazano z zastosowaniem
25
środków, co do których wiadomo, że wywołują apoptozę komórek, np. kamptotecyny (CMP) lub TNFalfa plus
cykloheksymid (CHX), i które dostarczają doskonałych kontroli w tych testach.
[0224] Stosując ten test zmierzyliśmy powstawanie komórek apoptotycznych w czasie dla transfektantów
CCX-CKR2-435s lub komórek 435s typu dzikiego hodowanych w optymalnymi (10%) lub ograniczającym
(1%) stężeniu surowicy. Obydwa typy komórek hodowane w 10% surowicy wykazały doskonałą żywotność
30
przez cały 4-dniowy okres hodowli. W odróżnieniu od tego, komórki WT hodowane w 1% surowicy wykazywały znaczne obniżenie liczby żywych komórek po 3 i 4 dniach hodowli. Współ-wybarwienie aneksyną i PI
ujawniło, że to odzwierciedlało pojawianie się zarówno apoptotycznych, jak i martwych komórek. Co ciekawe, komórki CCX-CKR2-435s hodowane w 1% surowicy wykazywały doskonałą żywotność przez ten sam 4dniowy okres hodowli, co sugeruje, że wprowadzenie CCX-CKR2 do 435s chroniło te komórki przed szybką
35
apoptozą komórkową występującą w warunkach sub-optymalnej suplementacji surowicy.
[0225] Identyczne wyniki uzyskano w drugim doświadczeniu z zastosowaniem tego samego transfektanta
CCX-CKR2-435s i dodatkowo osobnej nie-klonalnej populacji komórek 435s transfekowanych CCX-CKR2.
Dalsze wyniki wskazały, że właściwość ochrony przed apoptozą początkowego klonalnego transfektanta
wynikały raczej z ekspresji CCX-CKR2 niż z konkretnej aberracji tego jednego klonu transfektanta.
40
Przykład 4
[0226] Przykład ten wykazuje na fosforylację p44/42 MAPK (ERK1 i ERK2) za pośrednictwem CCX-CKR2.
49
EP 1 692 102 B1
[0227] CCX-CR2 jest nietypowym receptorem pod tym względem, że wiązanie liganda (np., ITAC lub SDF1)
nie powoduje mobilizacji wapnia, która jest typowa dla wielu receptorów chemokinowych. Skłoniło to do zbadania innych potencjalnych szlaków przekazywania sygnału, włącznie ze zbadaniem czy aktywność CCXCR2 jest przekazywana przez fosforylację ERK. Doświadczenia przeprowadzone z lizatami linii komórkowej
5
MCF7 wyrażającej CCX-CR2, którą stymulowano ITAC lub SDF1, wykazały występowanie zależnej od liganda fosforylacji ERK1 i ERK2 (czasami także nazywanych w literaturze p44/42 MAPK). Fosforylowane
ERK1 i ERK2 wykryto z zastosowaniem analizy Western blot z lizatami z linii komórkowej MCF7 początkowo
poddanej elektroforezie w celu rozdzielenia białek lizatu. Fosforylowane ERK1 i ERK2 na żelu po elektroforezie wykryto przez reakcję z przeciwciałami specyficznymi względem fosforylowanej postaci tych białek.
10
Przeciwciała te są dostępne z Cell Signaling Technologies of Beverly, MA.
[0228] Podobne doświadczenia przeprowadzono z komórkami Hela wyrażającymi CCX-CR2. Te same wyniki uzyskano, gdy komórki te stymulowano ITAC lub SDF1.
[0229] Ponieważ ITAC i SDF1 wiążą inne receptory chemokinowe, np., CXCR3 w przypadku ITAC, a
CXCR4 w przypadku SDF1, istotne było rozważenie potencjalnego wpływu tych receptorów na fosforylację
15
ERK wywołana przez te ligandy w komórkach MCF7. Analiza FACS komórek MCF7 z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych względem CXCR3 lub CXCR4 ujawniła całkowity brak tych receptorów na komórkach
MCF7. Kontrole pozytywne z zastosowaniem linii komórkowych wyrażających CXCR3 lub CXCR4 potwierdziły, że przeciwciała zastosowane w tych doświadczeniach nie mogą wiązać tych receptorów. Zatem dane
te wskazują, że wiązanie ligandów, takich jak ITAC lub SDF1 z CCX-CR2 powoduje przekazywanie sygnału
20
wewnątrzkomórkowego przez fosforylację ERK, co prawdopodobnie powoduje aktywację dodatkowych dalszych składników. Odkrycie, że CCX-CR2 pośredniczy w fosforylacji ERK1 i ERK2 wskazuje, że CCX-CR2
jest związany z wieloma procesami biologicznymi, ponieważ wykazano, że fosforylacja ERK pośredniczy w
regulacji wzrostu komórek i różnicowania.
Przykład 5
25
[0230] Przykład ten wykazuje, że komórkowa ekspresja CCX-CKR2 powoduje indukcję wielu białek regulatorowych.
[0231] W alternatywnym podejściu do badania przekazywania sygnału przez CCX-CKR2 supernatanty zebrane z komórek MDA MB 435s transfekowanych CCX-CKR2 porównano z supernatantami zebranymi z
komórek MDA MB 435s (435s) typu dzikiego, co wykonano z zastosowaniem specyficznych testów ELISA
30
wykrywających obecność dużej rodziny wydzielanych białek. Komórki 435s wyrażające CCX-CKR2 wytwarzały istotnie wyższe ilości GM-CSF, RANTES, MCP-1, TIMP-1 i MMP3 niż komórki 435s typu dzikiego,
zwłaszcza, gdy były hodowane w warunkach ograniczonego stężenia surowicy. Co ciekawe, opisano, że
wszystkie te czynniki są zaangażowane we wzrost, przebudowę naczyń i chemotaksję związane z nowotworzeniem. Mogą być one także zaangażowane w opisanym powyżej fenotypie ochrony przed apoptozą CCX-
35
CKR2.
Przykład 6
[0232] Przykład ten wykazuje oparte na siRNA hamowanie CCX-CKR2.
[0233] Uzyskano SMARTpool™ siRNA (Dharmacon) specyficzne dlaCXCR4 lub CCX-CKR2. SMARTpool™
siRNA jest pulą czterech różnych sekwencji siRNA, z których każda jest skierowana do innego regionu wy-
40
szczególnionego mRNA. Te pule siRNA zbadano w komórkach HeLa. Ekspresję CXCR4 zbadano przez
wybarwienie Mab 12G5 lub 173 i analizę FACS, podczas gdy ekspresję CCX-CKR2 zbadano w teście wiązania z wykorzystaniem
125
I-SDF1. CXCR4 jest wyrażany na komórkach HeLa w konformacji, która nie wy50
EP 1 692 102 B1
kazuje wykrywalnego wiązania
CKR2 SMARTpool
™
125
I-SDF1, co tym samym pozwala na wykrycie ekspresji CCX-CKR2. CCX-
siRNA (25-100 nM) wywołało istotne (≥50%) zahamowanie wiązania
125
I-SDF1, pod-
™
czas gdy dla CXCR4 SMARTpool siRNA nie uzyskano tego efektu. Podobne wyniki uzyskano dla transfektantów 293- CCX-CKR2.
5
[0234] Ponadto, stwierdzono, że każda z nastepujących 3 sekwencji siRNA zmniejsza wiązanie SDF-1 po
wprowadzeniu do komórek w stężeniu tak niskim jak 4 nM:
siRNA #1: GCCGTTCCCTTCTCCATTATT
siRNA #2: GAGCTCACGTGCAAAGTCATT
siRNA #3: GACATCAGCTGGCCATGCATT
10
Przykład 7
[0235] Przykład ten wykazuje ekspresję CCX-CKR2 w mózgu.
[0236] CCX-CKR2 jest wyrażany na dużej liczbie linii komórek nowotworowych, ale w niewielkiej liczbie tkanek prawidłowych. Jeden z wyjątków od tego ostatniego wzoru dostarczono przez wykazanie w testach wiązania, że komórki mózgu od normalnych dorosłych myszy wyrażały CCX-CKR2. Aby rozszerzyć te obserwa-
15
cje przeprowadzono badania hybrydyzacji in situ z zastosowaniem sondy specyficznej względem CCXCKR2 w celu zlokalizowania regionu ekspresji CCX-CKR2 w mózgu. Próbki tkanek zebrano od normalnych,
dorosłych myszy i utrwalono 4% PFA w PBS przez noc w 4°C, a następnie inkubowano w 30 % sacharozie
w PBS przez noc w 4°C. Następnie tkanki zatopiono w OCT, pocięto na 20-µm skrawki, a następnie zebrano
na szkiełkach superfrost plus. Do badań hybrydyzacji in situ sondy kwasu rybonukleinowego antysensowną i
20
sensowną przygotowano przez transkrypcję in vitro odpowiednio z polimerazą RNA T7 i SP6 stosując zestaw do znakowania DIG cRNA (Roche) po linearyzacji. 20-µm krioprzekroje utrwalono w świeżym 4% PFA,
a następnie poddano traktowaniu proteinazą K (2 µg/ml przez 20 min. w 37°C). Szkiełka poddano prehybrydyzacji w 55°C przez 1 godz., a następnie hybrydyzacji w 55°C przez noc w szczelnie zamkniętych
pojemnikach. Następnie szkiełka przemyto 50% formamidem, 5x SSC pH 4,5 i 1% SDS w 65°C, następnie
25
blokowano 5% kozią surowicą przez 1 godz. i inkubowano z rozcieńczonym 1:1000 przeciwciałem przeciwDig w 1% koziej surowicy przez noc w 4°C. Szkiełka przemyto TBST i wywoływano NBT/BCIP.
[0237] Wyniki wyraźnie pokazują silną ekspresję CCX-CKR2 przez neurony w móżdżku, hipokampie i korze.
Stwierdzono niewielką lub niewykrywalną ekspresję w obszarach zawierających komórki glejowe, takich jak
obszary istoty białej móżdżku i ciele modzelowatym. Komórki Purkinjego wykazywały jednorodnie silny pozy-
30
tywny sygnał oraz pozytywny sygnał wykazywał podzbiór komórek ziarnistych w wewnętrznej warstwie komórek ziarnistych. Ponadto, kora jest ogólnie całkiem dodatnia oraz pojedyncze neurony w korze wykazywały wyraźne pozytywne wybarwienie. Hipokamp wykazywał silny sygnał CCX-CKR2 w neuronach zakrętu
zębatego i CA1-3. Ponadto, kora pokrywająca była także pozytywna.
[0238] Dane te dostarczają pewien wgląd odnośnie potencjalnego znaczenia CCX-CKR2 dla nowotworów
35
mózgu. CCX-CKR2 nie jest wyrażany w komórkach obszaru komorowego mózgu lub w komórkach glejowych, skąd uważa się, że pochodzą gwiaździaki. W odróżnieniu od tego stwierdzono pewną ekspresję w
komórkach, które wydają się być podzbiorem komórek ziarnistych móżdżku, typu komórek, z którego pochodzą rdzeniaki. Profil ekspresji CCX-CKR2 bardzo różni się od tego obserwowanego dla innego receptora
SDF-1, CXCR4, który opisali inni autorzy.
40
Przykład 8
[0239] Przykład ten wykazuje skuteczność współzawodniczego liganda CCX-CKR2 w mysim modelu ksenoprzeszczepu raka płuca.
51
EP 1 692 102 B1
[0240] Rak płuc jest wiodącą przyczyna śmierci wywołanych nowotworami w Stanach Zjednoczonych. CCXCKR2 jest wyrażany na komórkach raka płuca, jak i na aktywowanym śródbłonku. Oceniono wpływ podawania współzawodniczego liganda CCX-CKR2, związku z serii 700, w modelu ksenoprzeszczepu raka płuca.
[0241] W badaniu ksenoprzeszczepu raka płuc fragmenty nowotworu A549 (30-40 mg) wszczepiono do
5
przestrzeni podskórnej nagiej myszy. Guzom pozwolono rosnąć do czasu gdy osiągnęły one w przybliżeniu
wielkość 150 mg (pomiędzy 100 a 200 mg), w którym to punkcie czasowym myszy włączono do badania i
rozpoczęto leczenie. Myszy leczono współzawodniczym ligandem CCX-CKR2 (25 mpk; podawanie podskórne, co jeden dzień (ang. Q1D)) lub kontrolą z podłożem. Melfalan włączono jako kontrolę pozytywną (9
mpk/dawkę, podawanie śródotrzewnowe, trzy dawki co 4 dni (ang. Q4Dx3)). Guzy mierzono w dwóch wy-
10
miarach dwa razy na tydzień z zastosowaniem suwmiarki i przekształcano do masy guza z zastosowaniem
2
wzoru na wydłużoną elipsoidę (a x b /2), gdzie a oznacza dłuższy wymiar oraz b oznacza krótszy wymiar
oraz przy przyjęciu jednostki gęstości (1 mm3 = 1 mg). Masy ciała także mierzono dwa razy na tydzień aby
wyznaczyć jakiekolwiek skutki uboczne dawkowania związku. Aktywność przeciwnowotworową wyznaczono
przez opóźnienie wzrostu guza w grupie leczonej w porównaniu z grupą traktowaną podłożem.
15
[0242] Myszy otrzymujące związek współzawodniczy wykazywały zmniejszone obciążenie nowotworem w
porównaniu z grupą traktowana podłożem. Ta różnica w objętości guza była istotna statystycznie pomiędzy
tymi grupami i przedstawia 32% obniżenie średniej objętości guza. Melfalan także obniżył objętość guza z
60% obniżeniem średniej objętości guza. Ponadto, codzienne leczenie związkiem współzawodniczym jest
dobrze tolerowane w tym badaniu, co wyznaczono przez przybieranie na wadze u zwierząt leczonych związ-
20
kiem zgodnie z tym obserwowanym u myszy traktowanych podłożem.
[0243] Masy guzów oceniono w końcowym dniu leczenia związkiem (dzień 49). Myszy leczone związkiem
współzawodniczym CCX-CKR2 niosły guzy statystycznie mniejsze niż te w grupie traktowanej podłożem.
Podobnie, myszy otrzymujące Melfalan także niosły guzy istotniej mniejsze niż te w grupie traktowanej podłożem.
25
[0244] Jakkolwiek powyższy wynalazek został opisany szczegółowo poprzez jego ilustrowanie oraz w przykładach dla jasności zrozumienia, dla fachowców dziedzinie wynalazku w świetle opisu niniejszego wynalazku oczywiste będzie, że można do niego wprowadzić pewne zmiany i modyfikacje bez odchodzenia od zakresu wynalazku zdefiniowanego w zastrzeżeniach.
30
35
40
52
Lista sekwencji
EP 1 692 102 B1
sekwencja kodująca
sekwencja aminokwasowa
sekwencja kodująca
53
EP 1 692 102 B1
sekwencja aminokwasowa
sekwencja kodująca
sekwencja aminokwasowa
sekwencja kodująca
54
EP 1 692 102 B1
sekwencja aminokwasowa
sekwencja kodująca
sekwencja aminokwasowa
55
EP 1 692 102 B1
Zastrzeżenia patentowe
1. Sposób badania przesiewowego w kierunku środka, który wiąże CCX-CKR2 na komórce, obejmujący
kontaktowanie wielu środków z polipeptydem CCX-CKR2 zawierającym domenę zewnątrzkomórkową przy5
najmniej w 95% identyczną z domeną zewnątrzkomórkową SEK ID NR:2, lub jej fragmentem wiążącym
SDF1 lub I-TAC; i określenie, czy środek ten współzawodniczy z I-TAC lub SDF1 o wiązanie z polipeptydem
CCX-CKR2 lub jego fragmentem; gdzie sposób ten wykonuje się jako test in vitro lub w badaniu opartym na
komórkach.
2. Sposób według zastrzeżenia 1, w którym komórką jest komórka nowotworowa.
10
3. Sposób według zastrzeżenia 1, dalej obejmujący testowanie wybranego środka pod względem jego zdolności do wiązania lub hamowania wzrostu komórki, na przykład, w którym komórką jest komórka nowotworowa.
4. Sposób według zastrzeżenia 1, dalej obejmujący testowanie wybranego środka pod względem jego zdolności do zmiany adhezji komórek do komórek śródbłonka.
15
5. Sposób według zastrzeżenia 1, w którym środkiem jest przeciwciało lub, w którym środkiem jest polipeptyd.
6. Sposób według zastrzeżenia 1, w którym polipeptyd CCX-CKR2 zawiera sekwencje przedstawioną w SEK
ID NR:2.
7. Sposób według zastrzeżenia 1, w którym polipeptyd CCX-CKR2 jest wyrażany w komórce, która nie wyra-
20
ża endogennej wersji CCX-CKR2.
8. Sposób wyznaczania obecności lub braku komórki nowotworowej, który to sposób obejmuje skontaktowanie próbki zawierającej komórkę z przeciwciałem, które specyficznie wiąże SEK ID NR:2; oraz wykrycie wiązania przeciwciała z polipeptydem CCX-CKR2 w próbce, przy czym komórka jest komórką nie-płodową i/lub
komórką inną niż komórka nerki lub mózgu, i w którym wiązanie przeciwciała z próbką oznacza obecność
25
komórki nowotworowej.
9. Sposób według zastrzeżenia 8, w którym próbka pochodzi od człowieka lub, w którym sposób jest stosowany do diagnozowania nowotworu u człowieka lub, w którym nowotwór jest wybrany z grupy obejmującej
raka szyjki macicy, raka sutka, chłoniaka, glejaków, raka gruczołu krokowego i białaczkę lub, w którym nowotworem nie jest mięsak Kaposiego, wieloogniskowa choroba Castlemana lub związany z AIDS pierwotny
30
chłoniak wysiękowy.
10. Sposób według zastrzeżenia 8, w którym przeciwciało współzawodniczy z SDF1 i I-TAC o wiązanie z
SEK ID NR:2.
11. Przeciwciało specyficznie współzawodniczące z SDF-1 i I-TAC o wiązanie z SEK ID NR:2.
12. Przeciwciało według zastrzeżenia 11, przy czym wspomniane przeciwciało jest przeciwciałem monoklo-
35
nalnym.
13. Przeciwciało według zastrzeżenia 12, przy czym wspomniane przeciwciało jest przeciwciałem humanizowanym.
14. siRNA hamujący ekspresję polinukleotydu CCX-CKR2 do zastosowania w leczeniu nowotworu.
15. siRNA według zastrzeżenia 14 do zastosowania w leczeniu nowotworu, przy czym polinukleotyd CCX-
40
CKR2 koduje SEK ID NR:2 lub zawiera SEK ID NR:1.
16. Przeciwciało współzawodniczące z SDF1 i I-TAC o wiązanie z SEK ID NR:2 do zastosowania w leczeniu
nowotworu.
56
EP 1 692 102 B1
17. Przeciwciało według zastrzeżenia 16 do zastosowania w leczeniu nowotworu, w którym nowotwór jest
wybrany z grupy obejmującej raka szyjki macicy, raka gruczołu krokowego, białaczkę, raka sutka, chłoniaka i
glejaki lub, w którym nowotworem nie jest mięsak Kaposiego, wieloogniskowa choroba Castlemana lub
5
związany z AIDS pierwotny chłoniak wysiękowy.
10
15
57
EP 1 692 102 B1
Figura
LEGENDA: h = ludzka; m = mysia; Eeotaxin = Eeotaksyna; Fractalkine = Fraktalkina
58
EP 1 692 102 B1
Figura
LEGENDA: h = ludzka; m = mysia; Eeotaxin = Eeotaksyna; Fractalkine = Fraktalkina; alpha = alfa; Lymphotactin = Limfotaktyna
5
59
EP 1 692 102 B1
Figura
LEGENDA: h = ludzka; m = mysia; rat = szczurza; Eeotaxin = Eeotaksyna; Fractalkine = Fraktalkina; alpha =
alfa; Lymphotactin = Limfotaktyna; leucotactin = leukotaktyna
5
60
EP 1 692 102 B1
Figura
LEGENDA: h = ludzka; m = mysia; rat = szczurza; Eeotaxin = Eeotaksyna; Fractalkine = Fraktalkina; Lymphotactin = Limfotaktyna
5
61
EP 1 692 102 B1
Figura
LEGENDA: h = ludzka; m = mysia; rat = szczurza; Eeotaxin = Eeotaksyna; Fractalkine = Fraktalkina; Lymphotactin = Limfotaktyna
5
62
EP 1 692 102 B1
Figura
LEGENDA: h = ludzka; m = mysia; rat = szczurza; Eeotaxin = Eeotaksyna; Fractalkine = Fraktalkina; Lymphotactin = Limfotaktyna; leucotactin = leukotaktyna
5
63
EP 1 692 102 B1
Figura
LEGENDA: h = ludzka; m = mysia; Eeotaxin = Eeotaksyna
64
EP 1 692 102 B1
Figura
LEGENDA: h = ludzka; m = mysia; rat = szczurza; Eeotaxin = Eeotaksyna; Fractalkine = Fraktalkina; Lymphotactin = Limfotaktyna; leucotactin = leukotaktyna
5
65
EP 1 692 102 B1
Figura
LEGENDA: h = ludzka; m = mysia; rat = szczurza; Eeotaxin = Eeotaksyna; Fractalkine = Fraktalkina; Lymphotactin = Limfotaktyna
5
66
(procent hamowania)
(procent hamowania)
(procent hamowania)
(procent hamowania)
EP 1 692 102 B1
Figura
67
(procent hamowania)
(procent hamowania)
(procent hamowania)
(procent hamowania)
(procent hamowania)
(procent hamowania)
EP 1 692 102 B1
Figura 3
68
I SDF-1 α (związane zliczenia)
125
I SDF-1 α (związane zliczenia)
125
EP 1 692 102 B1
Figura 4
Chemokina
Chemokina
5
69
I SDF-1α (procent hamowania)
125
I SDF-1α (procent hamowania)
125
EP 1 692 102 B1
Figura 5
70
EP 1 692 102 B1
Samo podłoże
Figura 6
Traktowanie
71
EP 1 692 102 B1
Komórki/fov
Figura 7
podłoże
72
EP 1 692 102 B1
Figura 8
Średnie objętości guzów
Objętość guza (mm3)
podłoże
Czas (dni)
73
EP 1 692 102 B1
ODNIESIENIA CYTOWANE W OPISIE
Lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma jedynie służyć wygodzie czytelnika. Nie stanowi ona
części europejskiego dokumentu patentowego. Mimo że wyboru odnośników dokonano z wielką starannością, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń, a EUP nie bierze żadnej odpowiedzialności w tym względzie.
Dokumenty patentowe cytowane w opisie
Literatura niepatentowa cytowana w opisie
5
10
15
74
EP 1 692 102 B1
75
EP 1 692 102 B1
76
EP 1 692 102 B1
77