Tom 39 zeszyt 2 - Łódzkie Towarzystwo Naukowe
advertisement
Spis treści Agnieszka Szymczyk, Ewa Forma ................................................................. 151 Struktura i funkcje białka Klotho Structure and functions of Klotho protein Agnieszka Szymczyk, Ewa Forma, Anna Krześlak, Paweł Jóźwiak, Adam Madej, Waldemar Różański, Magdalena Bryś .................................... 189 Genetic polymorphism of Klotho gene and bladder cancer risk Polimorfizm genu Klotho a ryzyko raka pęcherza moczowego Ewa Forma, Magdalena Bryś ....................................................................... 207 Rola metalotionein i kadmu w rozwoju raka piersi Role of metalothioneins and cadmium in breast carcinogenesis Paweł Jóźwiak................................................................................................ 245 Rola transporterów GLUT1 i GLUT3 w pobieraniu glukozy i kwasu dehydroaskorbinowego przez komórki nowotworowe The role of transporters GLUT1 and GLUT3 in glucose and dehydroascorbic acid uptake in cancer cells Piotr K. Zakrzewski ....................................................................................... 265 Zaburzenia kaskady transformujących czynników wzrostu typu β w wybranych patologiach człowieka Aberrations in the signalling cascade of transforming growth factor β type in selected human pathologies Magdalena Bryś, Magdalena Laskowska, Ewa Forma, Anna Krześlak ....... 293 Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu Telomerase – structure, function and the regulation of gene expression Od Redakcji.................................................................................................... 330 Lista Recenzentów w latach 2011-2012 List of Reviewers in 2011-2012 Informacja dla autorów ................................................................................. 331 Folia Medica Lodziensia, 2012, 39/2:151-187 Struktura i funkcje białka Klotho Structure and functions of Klotho protein AGNIESZKA SZYMCZYK, EWA FORMA Katedra Cytobiochemii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytet Łódzki Streszczenie Gen Klotho, odkryty został w roku 1997, a jego nazwa wywodzi się od imienia greckiej bogini Klotho, która przędła nić ludzkiego żywota. Myszy z inaktywowanym genem Klotho wykazują cechy przedwczesnego starzenia się, natomiast nadekspresja Klotho skutkuje wydłużeniem czasu ich życia. Białko Klotho występuje w dwóch formach - transbłonowej oraz sekrecyjnej, którym przypisuje się odmienne funkcje. Najwyższą ekspresję transbłonowej formy Klotho obserwuje się w nerkach i splotach naczyniówkowych komór mózgowych. Forma ta, funkcjonuje jako koreceptor dla czynnika wzrostu fibroblastów 23 (FGF23), który uczestniczy w utrzymywaniu homeostazy fosforanowej oraz regulacji metabolizmu witaminy D. Sekrecyjna postać białka, której obecność wykazano w osoczu, płynie mózgowordzeniowym oraz w moczu, funkcjonuje jako czynnik humoralny. Reguluje ona aktywność kanałów jonowych, transporterów błonowych, a także receptorów dla czynników wzrostu. Poprzez modyfikację N-glikanów kanałów TRPV5, Klotho sekrecyjne bierze udział w utrzymywaniu homeostazy jonów wapnia. Ponadto, sekrecyjna postać białka uczestniczy w hamowaniu szlaku insuliny/insulinopodobnego czynnika wzrostu. Ostatnie doniesienia sugerują, iż Klotho spełnia także rolę supresora procesu nowotworzenia. Obniżenie ekspresji genu Klotho wykazano m.in. w raku piersi, trzustki, żołądka, jelita grubego, płuc oraz w raku szyjki macicy. Spadek ekspresji genu Klotho skorelowany jest z bardziej agresywnym fenotypem badanych nowotworów. Wśród mechanizmów leżących u podstaw obniżenia ekspresji Klotho wyróżnia się m.in. hipermetylację wysp CpG w obrębie regionu promotorowego oraz deacetylację histonów. Adres do korespondencji: dr Ewa Forma, Katedra Cytobiochemii, Uniwersytet Łódzki; 90-236 Łódź, ul. Pomorska 141/143; e-mail: [email protected]; Tel.:+ 48 42 635 4371, Fax: +48 42 6354484 Struktura i funkcje białka Klotho 152 Słowa kluczowe: białko Klotho, TRPV, wapń, fosfor, witamina D, czynniki wzrostu fibroblastów, nowotwory. Abstract Klotho gene was identified in 1997, and named after a Greek goddess Klotho, who spun the thread of life. The inactivation of Klotho gene in mice leads to a syndrome resembling aging, whereas the overexpression of Klotho extends their life span. Protein Klotho exists in two forms: membrane and secreted Klotho which play different functions. The highest expression of transmembrane form of Klotho is observed in the kidney and choroid plexus in the brain. The transmembran form of Klotho acts as a coreceptor for fibroblast growth factor 23 (FGF23) and regulates phosphate homeostasis band vitamin D metabolism. The secreted form of Klotho, which was detected in plasma, cerebrospinal fluid and urine functions as a humoral factor that regulates the activity of several ion channels, transporters, and growth factor receptors. Moreover, this form of Klotho protein can modify N-glycans of TRPV5 channel and regulate calcium homeostasis. The secreted Klotho can also inhibit the insulin and insulin-like growth factor 1 (IGF-1) pathways. Last data suggest that Klotho can act as a tumor supressor gene. The decrease of Klotho expression was observed in the breast, pancreas, stomach, colon, lung and cervical cancer. Moreover, the decrease of Klotho expression was correlated with the more aggressive phenotype of examined cancers. Downregulation of Klotho gene was associated with CpG hypermethylation of promoter region and histones deacetylation. Key words: Klotho protein, TRPV, calcium, phosphorus, vitamin D, fibroblast growth factors, neoplasms. Wstęp Gen Klotho (KL, określany również jako αKL) został po raz pierwszy zidentyfikowany w 1997 roku u myszy transgenicznych, które otrzymano w wyniku przypadkowej insercji transgenu do fragmentu 5’ regionu A. Szymczyk, E. Forma 153 promotorowego genu KL, co doprowadziło do jego inaktywacji [1]. Początkowo linia myszy KL–/– uważana była za bezużyteczną, gdyż wprowadzony do genomu myszy transgen nie powodował zmian fenotypowych. Pogląd ten uległ zmianie, gdy u myszy, które do 3-4 tygodnia życia rozwijały się prawidłowo, niemal tak samo jak heterozygoty KL–/+ lub osobniki typu dzikiego, w kolejnych tygodniach obserwowano zahamowanie wzrostu oraz występowanie szeregu zmian charakterystycznych dla procesu starzenia, takich jak: miażdżyca tętnic, zwapnienie naczyń i tkanek miękkich, rozedma płuc, dysplazja gonad, bezpłodność, atrofia skóry, zaburzenia słuchu, przedwczesny zanik grasicy, osteopenia, sarkopenia, hipoglikemia oraz hiperfosfatemia. Myszy Klotho (KL–/–) umierały przedwcześnie około 8-9 tygodnia życia [1-3]. Z kolei nadekspresja Klotho skorelowana jest ze zwiększeniem długości życia myszy. W odniesieniu do myszy typu dzikiego długość życia samców z nadekspresją Klotho ulega wydłużeniu o około 31%, zaś samic o około 19% [3, 4]. Struktura genu i białka Klotho Nazwa genu i białka wywodzi się od greckiej bogini Klotho, która wraz z siostrami Lachesis i Atropos przędła nić ludzkiego życia i decydowała o jego długości [4, 6]. Gen KL człowieka obejmujący około 50 kpz zlokalizowany jest na chromosomie 13q12 (u myszy na chromosomie 5) i składa się z 5 eksonów [2, 7]. W regionie promotorowym genu KL nie stwierdzono obecności typowej kasety TATA oraz kasety CAAT, natomiast w regionie tym znajduje się pięć potencjalnych miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego Sp1, które często występują w promotorach nie zawierających kasety TATA [2; 8]. Ponadto w regionie obejmującym fragment sekwencji promotora oraz pierwszy ekson genu KL (łącznie 1304 pz) stwierdzono obecność wyspy CpG [8]. Na podstawie Struktura i funkcje białka Klotho 154 podobieństwa sekwencji zidentyfikowano kolejne 2 geny należące do rodziny Klotho, tj. βKlotho oraz γKlotho, który określany jest jako KLPH (ang. KL lactase phlorizin hydrolase) lub LCTL (ang. lactase-like protein) [9]. Analiza sekwencji cDNA KL wykazała istnienie dwóch transkryptów powstających w wyniku alternatywnego składania mRNA. Pierwszy transkrypt obejmujący otwartą ramkę odczytu (ORF, ang. open reading frame) o długości 3036 pz koduje białko transbłonowe składające się z 1012 reszt aminokwasowych. Drugi transkrypt KL różni się od pierwszego obecnością insercji o długości 50 pz zawierającej kodon STOP, który sprawia, że ORF jest krótsza (1647 pz), a powstające białko składa się z 549 reszt aminokwasowych. Jest to sekrecyjna forma białka Klotho (sKL). Miejsce alternatywnego składania znajduje się w obrębie 3 eksonu [2, 8, 10]. Transbłonowa forma białka Klotho człowieka składa się z 1012 aminokwasów i wykazuje 86% homologię w stosunku do białka myszy (1014 aa) [2]. Masa cząsteczkowa białka Klotho wynosi 130 kDa i na jej wartość ma wpływ N-glikozylacja. Traktowanie komórek CHOTM2 N-glikozydazą oraz tunikamycyną, będącą inhibitorem procesu glikozylacji, pozwoliło na detekcję białka Klotho o masie cząsteczkowej 110 kDa, która wydaje się być zgodna z masą cząsteczkową przewidywaną na podstawie sekwencji aminokwasowej [11]. W strukturze białka KL wyróżnia się trzy domeny: krótką, wewnątrzkomórkowa domenę C-końcową (11 aa), domenę transbłonową (21 aa), która tylko raz przebija błonę komórkową oraz długą, zewnątrzkomórkową domenę N-końcową (980 aa) [12]. W domenie zewnątrzkomórkowej wyróżnia się dwa powtórzenia sekwencji składające się z 440 aminokwasów każde, które określane są jako KL1 i KL2 (Ryc. 1). A. Szymczyk, E. Forma 155 Ryc. 1. Struktura białka Klotho, w którym wyróżnia się N-końcową domenę zewnątrzkomórkową z powtórzeniami KL1 i KL2, domenę transmembranową (TM) oraz cytoplazmatyczną (CYT). Pomiędzy powtórzeniami KL1 i KL2 znajduje się odcinek łącznikowy (linkerowy), w obrębie którego znajduje się sekwencja Lys-Lys-Arg-Lys, stanowiąca potencjalne miejsce cięcia proteolitycznego [2, 8, 12]. Powtórzenia KL1 i KL2 wykazują aktywność enzymatyczną i na podstawie podobieństwa strukturalnego białko Klotho zostało zaliczone do rodziny 1 glikozydaz. Zarówno KL1 jak i KL2 charakteryzują się 20-40% podobieństwem do β-glukozydaz występujących u bakterii i roślin oraz do hydrolazy florydzynowej ssaków [4, 12]. Kluczową rolę dla aktywności β-glukozydaz pełnią dwie reszty kwasu glutaminowego. Pierwsza z nich funkcjonuje jako nukleofil, druga zaś spełnia rolę kwasu/zasady. W przypadku białka Klotho reszty te zostają jednak zastąpione resztami innych aminokwasów, przy czym w obu powtórzeniach zmiana dotyczy tylko jednej reszty kwasu glutaminowego. W przypadku KL1 reszta kwasu glutaminowego, pełniąca funkcję nukleofila, zastąpiona jest asparaginą, natomiast w KL2 kwas glutaminowy funkcjonujący jako kwas/zasada zastąpiony jest przez serynę. Wykazano, że hydrolizie przy udziale białka Klotho podlegają m.in. glukoronidy estradiolu, estronu i estriolu [12, 13]. Najwyższy poziom ekspresji transbłonowego białka Klotho obserwuje się w kanalikach nerkowych i splocie naczyniówkowym w mózgu. Ponadto ekspresję Klotho wykazano w przysadce, uchu wewnętrznym, mózgu, przytarczycach, trzustce, jelicie grubym, mięśniach 156 Struktura i funkcje białka Klotho szkieletowych, pęcherzu moczowym, jajnikach, jądrach oraz w komórkach nabłonkowych piersi [4, 14, 15]. Forma sekrecyjna białka Klotho, to druga obok transbłonowej postać tego białka [2, 8, 12, 16]. Powstaje ona w wyniku alternatywnego składania i obejmuje 549 reszt aminokwasowych i dopowiada fragmentowi KL1 białka błonowego [2, 8]. Wykazano, że sKL może powstawać z transbłonowego białka Klotho w wyniku cięcia proteolitycznego, dzięki aktywności enzymów należących do rodziny ADAM (ang. a disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein), tj. ADAM10 i ADAM17. Białka te dokonują cięcia białka Klotho na dwa sposoby, które nazwane są cięciem α oraz β i generują odpowiednio fragmenty o masie cząsteczkowej 130 i 68 kDa. Cięcie α zachodzi tuż za domeną transbłonową białka Klotho a powstający w jego wyniku fragment zawiera zarówno KL1 jak i KL2. Cięcie β zachodzi natomiast w obrębie odcinka o łączącego fragment KL1 i KL2. Na skutek różnej wydajności obu procesów fragment powstający w wyniku cięcia α stanowi dominującą formę sKL. Obecność sekrecyjnego białka Klotho wykazano w osoczu, płynie mózgowo-rdzeniowym oraz w moczu [17]. Funkcje sekrecyjnej formy białka Klotho Udział białka Klotho w homeostazie jonów wapnia Wapń pełni istotną rolę w skali całego organizmu. Funkcjonuje on zarówno jako czynnik zewnątrzkomórkowy, jak i wewnątrzkomórkowy [18]. Dorosły człowiek spożywa w ciągu dnia około 1000 mg wapnia. Resorpcja jonów wapnia przebiega w komórkach nabłonka jelita cienkiego, gdzie wchłaniane jest około 400 mg wapnia pobranego z pożywieniem oraz w dystalnych kanalikach nerkowych [19]. Wchłanianie jonów wapnia stanowi A. Szymczyk, E. Forma 157 proces trzystopniowy. Pierwszy etap obejmuje wniknięcie jonów Ca2+ przez błonę luminalną bądź apikalną zgodnie z gradientem stężeń. Pasywny transport jonów wapniowych odbywa się przy udziale selektywnych kanałów zmiennopotencjałowych receptorów waniloidowych (TRPV, ang. transient receptor potential vanilloid), tj. receptorów typu piątego (TRPV5) w nerkach oraz zlokalizowanych w jelicie cienkim receptorów typu szóstego (TRPV6). Jony wapniowe dyfundują następnie przez cytozol, gdzie wiążą się z białkami pomocniczymi: kalbindyną 28 (D28K, ang. calbindin D-28, vitamin D-dependent calcium-binding protein) i kalbindyną 9 (D9K, ang. calbindin D-9). Obecność kalbindyny D28K stwierdza się głównie w nabłonku nerek, natomiast kalbindyna D9K zlokalizowana jest przede wszystkim w jelicie. W ostatnim etapie jony wapnia przenoszone są do krwioobiegu przez błonę podstawną komórek nerek bądź jelita. Zachodzący wbrew gradientowi stężeń transport jonów Ca2+, odbywa się w nerkach przy udziale białka NCX1 (ang. Na+/Ca2+exchanger-1), ponadto w nerkach i w jelicie w transport jonów wapnia zaangażowana jest ATPaza Ca2+ (PMCA1b, ang. plasma membrane calcium-ATPase 1b) [20-22]. Zmiennopotencjałowe receptory waniloidowe TRPV5 i 6 są białkami składającymi się z około 730 aminokwasów. Geny kodujące wyżej wymienione receptory zlokalizowane są u człowieka na chromosomie 7q35 i obejmują 15 eksonów [20, 22]. Receptory TRPV5 i 6 ulegają N-glikozylacji w obrębie odcinka łączącego domenę 1 i 2, znajdującego się w przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Miejsce glikozylacji stanowi asparagina w pozycji 358 oraz 357 [23]. W regionie N-końcowym białek TRPV5 i 6 odnotowano obecność powtórzeń ankirynowych, zaangażowanych w proces tworzenia tetrametrów, w postaci których kanały te spełniają swoje fizjologiczne funkcje [20]. Receptory TRPV5 i 6 są najbardziej selektywnymi kanałami dla 158 Struktura i funkcje białka Klotho jonów wapnia, spośród wszystkich poznanych dotąd kanałów zmiennopotencjałowych. Właściwość ta uwarunkowana jest obecnością reszty kwasu asparaginowego w regionie formującym kanał jonowy. W przypadku TRPV5 reszta kwasu asparaginowego znajduje się w pozycji 542, natomiast w TRPV6 w pozycji 541 [20, 22, 24]. W nerkach poziom ekspresji TRPV5 podlega regulacji m.in. przez hormony kalcytropowe, tj. parathormon (PTH), kalcytriol oraz dostarczane z pożywieniem jony Ca2+. Ekspresja TRPV5 kontrolowana jest również przez hormony płciowe (estrogeny, testosteron), a także równowagę kwasowozasadową [19, 22]. Oprócz wzrostu ekspresji TRPV5, parathormon może również stymulować transport jonów Ca2+ poprzez aktywację szlaku kinazy białkowej A (PKA, ang. protein kinase A). Uruchomienie tego szlaku sygnalizacyjnego prowadzi do zależnej od PTH fosforylacji TRPV5, w wyniku której dochodzi do zwiększenia aktywności kanałów. Parathormon poprzez szlak kinazy białkowej C (PKC, ang. protein kinase C) może również przyczyniać się do hamowania endocytozy TRPV5. Inhibicja endocytozy skutkuje z kolei zwiększeniem liczności kanałów na powierzchni komórek [19]. U myszy pozbawionych kanałów TRPV5, pomimo wysokiego stężenia kalcytriolu odnotowuje się obniżenie nerkowej resorpcji jonów wapnia, która z kolei jest po części rekompensowana przez jelita, na terenie których obserwuje się zwiększenie ekspresji TRPV6 oraz kalbindyny D9K. Mimo to, myszy wykazują nieprawidłowości w strukturze kości, dochodzi u nich m.in. do zmniejszenia grubości kości korowej i beleczkowej. U myszy TRPV5−/− obserwowano również obniżenie nerkowej ekspresji białka Klotho. Wspólna lokalizacja białka Klotho oraz TRPV5 na terenie kanalików dystalnych była podstawą sugestii, iż białko to zaangażowane jest w regulację gospodarki A. Szymczyk, E. Forma 159 wapniowej poprzez wpływ na aktywność kanałów TRPV [22, 24]. W wyniku traktowania komórek HEK293 (ang. human embryonic kidney 293) sekrecyjną formą białka Klotho dochodziło do nagromadzenia kanałów TRPV5 na powierzchni badanych komórek. W przypadku podstawienia, kluczowej dla N-glikozylacji TRPV5, reszty asparaginy innym aminokwasem nie obserwowano takiego efektu. [12, 24, 25]. Wykazująca aktywność β-glukuronidazy sekrecyjna forma białka Klotho, przyczynia się zatem do zwiększenia resorpcji jonów wapnia na terenie nerek. Białko Klotho uczestniczy w modyfikacji N-glikanów kanałów TRPV5 poprzez usuwanie reszt kwasu sjalowego. N-glikany glikoprotein takich jak TRPV5 składają się z nie więcej niż czterech ramion. Utworzenie owych ramion inicjowane jest poprzez dołączenie czterech cząsteczek N-acetyloglukozaminy do rdzenia pentasacharydowego Man3GlcNAc2 poprzez wiązania β2-, β4- i β6-glikozydowe. W następnej kolejności dochodzi do przyłączenia reszt galaktozy i utworzenia disacharydów: galaktoza-N-acetyloglukozamina, określanych jako N-acetylolaktozamina (LacNAc, ang. N-acetyl lactosamine). W przypadku N-glikanów kanałów TRPV5 cząsteczkę końcową stanowi kwas sjalowy przyłączony do galaktozy wiązaniami α2,3- bądź α2,6-glikozydowym. Enzymami odpowiedzialnymi za syntezę wiązań są sialotransferazy: α2,3- oraz α2,6-sjalotransferaza [12, 25]. Modyfikację N-glikanów kanałów TRPV5 przez białko Klotho zaobserwowano m.in. w komórkach HEK293. W przypadku komórek CHO (ang. chinese hamster ovary), w których α2,6-sialotransferaza nie ulega ekspresji endogennie, Klotho sekrecyjne nie wpływało na poziom ekspresji kałów TRPV5 w błonie komórkowej. Wyniki te sugerują zatem, iż reszta kwasu sjalowego przyłączona do galaktozy wiązaniem α2,6- a nie α2,3-glikozydowym stanowi substrat dla białka Klotho [12, 25, 26]. Struktura i funkcje białka Klotho 160 Mechanizm, za sprawą którego modyfikacja N-glikanów prowadzi do zwiększenia liczby kanałów TRPV5 na powierzchni komórki wyjaśniony został przez Cha i wsp. [26]. Usunięcie reszty kwasu sjalowego z N-glikanów kanału TRPV5 przez białko Klotho umożliwia wiązanie się TRPV5 z galektyną 1. Substratem dla galektyny 1 jest N-acetylolaktozamina połączona z kwasem sjalowym wiązaniem α2,3-glikozydowym. Usunięcie przez białko Klotho reszty kwasu sjalowego z N-glikanów TRPV5 prowadzi do odsłonięcia N-acetylolaktozaminy, stanowiącej substrat dla galektyny 1. Za sprawą galektyny 1 dochodzi następnie do sieciowania N-glikanów sąsiadujących kanałów TRPV5. w konsekwencji Połączenie czego to dochodzi ogranicza do z kolei zwiększenia ich retencji endocytozę, TRPV5 na powierzchni komórek [12, 25, 26]. Sugeruje się, że regulacja gospodarki wapniowej podlega również kontroli przez transbłonową formę białka. Klotho zaangażowane jest bowiem w regulację aktywności ATPazy sodowo-potasowej. ATPaza Na+K+ jest szeroko rozpowszechnionym enzymem stanowiącym integralny składnik błon wielu komórek. Białko to składa się z podjednostki α (ok. 113 kDa) oraz β (ok. 35 kDa). Podjednostka α odpowiada za transport jonów oraz aktywność katalityczną, natomiast podjednostka β zaangażowana jest w regulację aktywności podjednostki α [21]. ATPaza Na+K+ jest ważnym regulatorem wewnątrzkomórkowego stężenia jonów sodu i potasu. Gradient sodowo-potasowy stanowi z kolei siłę napędową dla transportu wielu cząsteczek przez błonę komórkową. Sugeruje się, że wytwarzany przez ATPazę Na+K+ gradient jonów sodu zaangażowany jest również w regulację transepitelialnego transportu jonów wapniowych na terenie splotów naczyniówkowych, przytarczyc oraz nerek [21, 27]. Wykorzystując metodę frakcjonowania subkomórkowego udowodniono, iż ATPaza sodowo-potasowa ma zdolność A. Szymczyk, E. Forma 161 wiązania się z niedojrzałą formą białka Klotho (120 kDa) w obrębie siateczki śródplazmatycznej, natomiast w obrębie aparatu Golgiego i wczesnych endosomów ATPaza Na+K+ oddziałuje z dojrzałą formą białka Klotho o masie cząsteczkowej 135 kDa. Sugeruje się, że oddziaływanie ATPazy Na+K+ z białkiem Klotho umożliwia jej rekrutację do błony komórkowej [28]. Badania in vitro prowadzone na komórkach nabłonkowych splotów naczyniówkowych dowiodły, iż aktywność ATPazy Na+K+ wzrasta w przypadku niedoborów jonów wapnia. Wykazano, że w wyniku obniżenia stężenia wapnia dochodziło do wzrostu ilości ATPazy Na+K+ w błonie komórkowej o około 12%. Wysoka podaż jonów Ca2+ skutkowała z kolei zmniejszeniem poziomu tego enzymu w błonie komórkowej o około 8% [21, 27]. Nie wykazano natomiast wpływu zewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia na poziom ekspresji ATPazy Na+K+ w błonie komórkowej komórek nabłonkowych splotów naczyniówkowych myszy Klotho. Wydaje się to potwierdzać sugestię, iż białko Klotho jest kluczowym czynnikiem wpływającym na rekrutację ATPazy Na+K+ do błony komórkowej [21]. Sugeruje się, iż w odpowiedzi na spadek zewnątrzkomórkowego + poziomu wapnia, Klotho wzmaga rekrutację + ATPazy Na K do błony komórkowej, a wytwarzany przez enzym gradient jonów sodu i potasu stymuluje uwalnianie PTH w przytarczycach. W przypadku niedoboru jonów wapnia, hormon ten poprzez zwiększanie syntezy kalcytriolu w nerkach stymuluje wchłanianie wapnia w jelicie cienkim. Działając na komórki kości zwiększa również uwalniania wapnia z zasobów szkieletowych oraz wzmaga ich resorpcję w nerkach (Ryc. 2) [21, 28]. Potwierdzeniem tezy, iż kompleks Klotho–ATPaza Na+K+ odpowiedzialny jest za stymulowanie uwalniania PTH może być fakt, iż obniżenie wydzielania PTH odnotowano m.in. u myszy, u których dochodziło do zaburzenia ekspresji bądź aktywności 162 Struktura i funkcje białka Klotho białka Klotho. Podobny efekt uzyskano również po zastosowaniu inhibitora ATPazy sodowo-potasowej [21]. Ryc. 2. Rola białka Klotho i ATPazy Na+K+ w regulacji homeostazy wapniowej. Udział białka Klotho w hamowaniu szlaku insuliny/insulinopodobnego czynnika wzrostu Szlaki sygnalizacyjne inicjowane przez insulinę, insulinopodobny czynnik wzrostu1 (IGF-1, ang. insulin-like growth factor 1) oraz ich homologi odgrywają istotną rolę w kontroli starzenia się wielu organizmów. Wykazano związek mutacji wpływających na poziom ekspresji bądź aktywność biologiczną insuliny, IGF-1 i ich homologów u myszy, Drosophila melanogaster oraz nicieni z żywotnością tych organizmów [29]. Myszy z niedoborem białka Klotho A. Szymczyk, E. Forma 163 wykazują hipoglikemię i wysoką wrażliwość na insulinę, natomiast przy nadekspresji Klotho obserwowano umiarkowaną oporność na działanie insuliny i IGF-1. Mimo insulinooporności myszy te wykazują jednak prawidłowy poziom glukozy we krwi i nie chorują na cukrzycę. Dane te, były podstawą twierdzenia, iż białko Klotho zaangażowane jest w tłumienie szlaku insuliny/IGF-1 [4-5]. Należące do podrodziny kinaz tyrozynowych receptory insuliny oraz IGF-1 są tetramerycznymi białkami składającymi się z dwóch podjednostek α oraz dwóch β. Funkcjonują one jako enzymy allosteryczne, w których w przypadku braku liganda, podjednostki α hamują aktywność kinazową podjednostek β. W wyniku połączenia podjednostek α z ligandem, receptory te ulegają autofosforylacji w obrębie pętli aktywacyjnych. Aktywacja receptorów skutkuje również fosforylacją reszt tyrozynowych, stanowiących miejsce przyłączenia substratów. Jak dotąd zidentyfikowano co najmniej dziewięć substratów przyłączanych do aktywnego receptora dla insuliny/IGF-1. Cztery z nich należą do rodziny IRS (ang. insulin-receptor substrate), wśród pozostałych wyróżnić można substraty takie jak: Gab-1 (ang. Grb2-associated binder 1), p60dok (ang. p60 docking protein), Cbl (ang. casitas B-lineage lymphoma), APS (ang. adapter protein with pleckstrin homology and Src homology 2 domains) oraz izoformy Shc (ang. src homology/collagen homology). Kolejnym komponentem na szlaku insuliny/IGF-1 jest 3-kinaza fosfatydyloinozytolu (PI3K). Kinaza ta składa się z podjednostki katalitycznej (110 kDa) oraz regulatorowej (85 kDa), w obrębie której znajdują się dwie domeny SH2 (ang. SRC homology 2) umożliwiające wiązanie z białkami IRS. PI3K katalizuje reakcję fosforylacji fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforanu (PIP2) do fosfatydyloinozytolo-3,4,5-trisfosforanu (PIP3). PIP3 zaangażowany jest z kolei w aktywację trzech klas cząsteczek sygnalizacyjnych: serynowo-treoninowych Struktura i funkcje białka Klotho 164 kinaz z podrodziny AGC (ang. cAMP-dependent, cGMP-dependent and protein kinase C), białek Rho (ang. Ras homologous), a także kinaz tyrozynowych TEC (ang. tyrosine kinase expressed in hepatocellular carcinoma) [30]. Kinaza PI3K zaangażowana jest również w aktywację szlaku sygnalizacyjnego mTOR/FRAP (ang. mammalian target of rapamycin kinase/FKBP12-rapamycin associated protein). Jedną z najlepiej scharakteryzowanych kinaz AGC jest PDK1 (ang. phosphoinositide-dependent kinase 1). Aktywna kinaza PDK1 fosforyluje i aktywuje serynowo-treoninową kinazę Akt/PKB (ang. protein kinase B). Białko to nie jest zakotwiczone w błonie komórkowej, w związku z czym może ono swobodnie przemieszczać się fosforylując liczne białka docelowe. Białka aktywowane na szlaku PI3K/Akt zaangażowane są w regulację procesów związanych ze wzrostem, metabolizmem, przeżyciem oraz proliferacją komórek [30, 31]. Mutacje genów kodujących ortologi receptora insulinowego, jego substratów (IRS) oraz PI3K skutkowały wydłużeniem czasu przeżycia u C. elegans oraz D. melanogaster [32-35]. Występujący u nicieni i D. melanogaster pojedynczy szlak insuliny/IGF-1 w toku ewolucji u ssaków został rozdzielony na dwie ścieżki sygnalizacyjne. Pomimo, iż ich funkcje nakładają się, szlak inicjowany przez insulinę zaangażowany jest głównie w regulację metabolizmu, z kolei oś IGF-1/hormonu wzrostu (GH, ang. growth hormone) warunkuje wzrost, rozwój i prawdopodobnie długowieczność. Wpływ insuliny na metabolizm podlega kontroli przez hormony o działaniu przeciwstawnym. IGF-1 jest składową większego systemu, który obejmuje hormon wzrostu oraz liczne białka wiążące, biorące udział w regulacji funkcji oraz wzrostu komórek. Pomimo widocznych różnic w funkcji owych szlaków, mechanizm, za sprawą którego IGF-1 sprzyja długowieczności zależny jest w dużej mierze od prawidłowego metabolizmu insuliny [35]. Interesujących A. Szymczyk, E. Forma 165 danych dostarczyły m.in. badania przeprowadzone na karłowatych myszach szczepów Ames i Snell. W odniesieniu do myszy typu dzikiego, myszy z homozygotyczną mutacją w genach Prop1 (ang. prophet of Pit-1) oraz Pit-1 (ang. POU domain, class 1, transcription factor 1) były o 66% mniejsze, jednakże czas ich życia ulegał znacznemu wydłużeniu (42-70%). Myszy te cierpiały jednak na bezpłodność [36]. Na skutek zaburzeń wydzielania hormonu wzrostu przez przysadkę, karłowate myszy wykazywały niskie stężenie IGF-1 w surowicy krwi. Obserwowano u nich również obniżone stężenie insuliny, a także zwiększoną wrażliwość na insulinę podawaną egzogennie [34, 36]. Dłuższą przeżywalność odnotowano również u heterozygotycznych myszy pozbawionych genu receptora dla IGF-1. Myszy homozygotyczne pod względem tej mutacji umierały tuż po urodzeniu. W przypadku heterozygot wydłużenie czasu przeżycia uzależnione było od płci, w odniesieniu do myszy typu dzikiego samice żyły o 33% dłużej, natomiast samce o 16%. Myszy te nie wykazywały zmian metabolicznych, ani też zaburzeń płodności. U osobników dorosłych obserwowano jednak zwiększone stężenie IGF-1, które prawdopodobnie niwelowało efekty mutacji receptora dla tego czynnika wzrostu. Myszy wykazywały prawidłowy poziom glukozy na czczo, jednakże po posiłku w porównaniu do kontroli u samców poziom ten był o 12% wyższy, u samic z kolei obserwowano spadek o 4,4% [34, 37, 38]. Ciekawych spostrzeżeń dostarczyły również badania prowadzone na linii myszy FIRKO (ang. fat-specific insulin receptor knockout mice), u których dokonano wyłączenia ekspresji receptora insulinowego na terenie tkanki tłuszczowej. Myszy te charakteryzowały się niską masą ciała, mimo że spożywały więcej pokarmu. Ponadto wykazywały one mniejszą insulinemię i nie rozwijała się u nich związana z wiekiem insulinooporność. Długość życia myszy FIRKO 166 Struktura i funkcje białka Klotho ulegała zwiększeniu o ok. 18% [36, 38, 39]. Fakt, iż szlaki aktywowane przez insulinę i IGF-1 są silnie zakonserwowane ewolucyjnie może sugerować, że odgrywają one istotną rolę w regulacji długowieczności u ludzi. Badania wykazały, iż wraz z wiekiem dochodzi do zmniejszenia wydzielania GH, a w konsekwencji obniżenie stężenia IGF-1. Fenotyp starzenia obejmuje m.in. zwiększenie tkanki tłuszczowej, insulinooporność, choroby układu krążenia (miażdżyca, nadciśnienie). Wszystkie spośród wyżej wymienionych cech obserwuje się również u osób z niedoborem GH [34]. U osób cierpiących na zespół Larona (niewrażliwość na GH) odnotowuje się wysokie stężenie hormonu wzrostu oraz niskie stężenia IGF-1. Chorych charakteryzuje niski wzrost, otyłość, opóźnienie umysłowe, a także nietolerancja glukozy. Fenotyp ten, nie skutkuje jednak krótkim czasem przeżycia, gdyż pacjenci z zespołem Larona dożywają sędziwego wieku (niekiedy ponad 90 lat) [34, 40]. Osoby cierpiące na akromegalię (nadprodukcja GH) mają zwiększone ryzyko zgonu z powodu rozwijających się u nich chorób układu krążenia, cukrzycy oraz nowotworów [34]. Ponadto terapia substytucyjna GH u osób z niedoborem tego hormonu prowadziła do rozwoju insulinooporności, nietolerancji glukozy, bólów stawów, obrzęków, retencji sodu oraz nadmiernej aktywacji mitogenów, skutkującej najprawdopodobniej rozwojem nowotworów [34]. Mechanizm, za sprawą którego sekrecyjna forma białka Klotho przyczynia się do inhibicji szlaku insuliny i IGF-1 nie został do końca poznany. Wiadomo jednak, że funkcja Klotho opiera się na hamowaniu autofosforylacji receptorów, nie zaś na blokowaniu ich interakcji z ligandem. Inhibicja autofosforylacji receptorów insuliny i IGF-1 skutkuje obniżeniem aktywności IRS, blokowaniem ich oddziaływań z PI3K, a w konsekwencji hamowaniem aktywacji dalszych białek szlaku. W badaniach in vitro udowodniono, iż białko to może również hamować A. Szymczyk, E. Forma 167 fosforylację receptorów uprzednio aktywowanych przez insulinę bądź IGF-1. Aktywność sekrecyjnego białka Klotho jest specyficzna dla receptorów dla insuliny i IGF-1, ponieważ nie wykazywało ono podobnego efektu w stosunku do receptorów płytkowego czynnika wzrostu (PDGF, ang. platelet-derived growth factor) i czynnika wzrostu naskórka (EGF, ang. epidermal growth factor), które również posiadają aktywność kinaz tyrozynowych [5]. Aktywność enzymatyczna Klotho, skłania również do sugestii, iż białko to może modyfikować N-glikany receptorów insuliny i IGF-1, wynikiem czego jest blokowanie ich aktywności lub/i zmniejszenie liczby tych receptorów na powierzchni komórek Potwierdzeniem tej tezy może być fakt, iż traktowanie hodowli komórek sialidazą indukuje insulinooporność. Ponadto nadekspresja sialidazy na powierzchni komórek, skutkuje u myszy rozwojem insulinooporności oraz nietolerancji glukozy [4]. Sugeruje się, iż białko Klotho przyczynia się do przedłużenia żywotności dzięki dwóm współdziałającym ze sobą mechanizmom, tj. hamowaniu sygnalizacji IGF-1 oraz zwiększaniu oporności na stres oksydacyjny. Zablokowanie transmisji sygnału na szlaku zależnym od insuliny/IGF-1 prowadzi do zahamowania aktywacji kinazy Akt, która fosforyluje czynnik transkrypcyjny FOXO (ang. forkhead transcription factor). Nieufosforylowany czynnik FOXO zlokalizowany jest w jądrze komórkowym gdzie spełnia rolę czynnika transkrypcyjnego [4, 41]. Występujące u ssaków czynniki transkrypcyjne FOXO stanowią ortologi obecnego u C. elegans czynnika DAF-16 (ang. abnormal dauer formation protein 16). U gryzoni zidentyfikowano do tej pory cztery czynniki z rodziny FOXO: FOXO1, FOXO3a FOXO4 oraz FOXO6 [42]. W swej strukturze czynniki transkrypcyjne z rodziny forkhead posiadają silnie zakonserwowaną domenę wiążącą DNA (ang. winged helix/forkhead domain). Białka należące do 168 Struktura i funkcje białka Klotho rodziny FOXO odgrywają istotną rolę w procesach różnicowania komórek, embriogenezie, nowotworzeniu oraz w regulacji metabolizmu [43]. Czynniki transkrypcyjne FOXO zaangażowane są w regulację ekspresji wielu genów, w tym enzymów antyoksydacyjnych takich jak katalaza czy mitochondrialna manganowa dysmutaza ponadtlenkowa (SOD2, ang. superoxide dismutase 2). Enzymy te usuwając reaktywne formy tlenu przyczyniają się do redukcji stresu oksydacyjnego. Redukcja stresu oksydacyjnego może być zatem czynnikiem kluczowym w procesie hamowania starzenia się organizmów, u których doszło do inhibicji szlaku insuliny/IGF-1 [4]. W badaniach prowadzonych na komórkach HeLa wykazano, iż forma sekrecyjna białka Klotho zmniejsza peroksydację lipidów, powstającą na skutek traktowania komórek herbicydem generującym nadtlenki (paraquat). Na przykładzie linii komórek HeLa oraz CHO udowodniono również, iż białko to może chronić komórki przed apoptozą indukowaną stresem oksydacyjnym [41]. Myszy z nadekspresją Klotho wykazują zwiększoną ekspresję SOD2 na terenie mięśni, a także niższy poziom fosforylacji czynników FOXO w porównaniu do myszy typu dzikiego. U myszy tych odnotowuje się również spadek stężenia w moczu 8-hydroksydeoksyguanozyny (8-OHdG, ang. 8-hydroxydeoxyguanosine), będącej markerem oksydacyjnych uszkodzeń DNA. Ponadto śmiertelna dla myszy typu dzikiego dawka paraquatu, nie okazała się być letalną dla myszy z nadekspresją Klotho, co wskazuje na udział Klotho w redukcji stresu oksydacyjnego [4, 41]. Antyapoptotyczna aktywność Klotho potwierdzona została również w badaniach na komórkach śródbłonka żyły pępowinowej człowieka (HUVEC, ang. human umbilical vascular endothelial cells). Apotozę w komórkach HUVEC indukowano nadtlenkiem wodoru. W odniesieniu do kontroli w komórkach HUVEC traktowanych Klotho obserwowano znacznie A. Szymczyk, E. Forma 169 niższą aktywność kaspazy 3 i kaspazy 9. Białko Klotho wykazywało również aktywność antyapoptotyczną w stosunku do komórek, którym podawano epoksyd (inhibitor topoizomerazy II), stymulujący cięcie DNA i kierujący komórki na drogę apoptozy. Przypuszcza się zatem, że obok inhibicji szlaku insuliny/IGF-1/SOD2 istnieje jeszcze inny mechanizm, za sprawą którego białko Klotho chroni komórki przed apoptozą [44]. Rola transbłonowej formy białka Klotho w homeostazie fosforanów Fosfor stanowi ważne ogniwo w regulacji przemian śródkomórkowych organizmu. Zaangażowany jest on m.in. w biosyntezę nukleotydów, fosfolipidów oraz 2,3-difosfoglicerolu, który ułatwia uwalnianie tlenu z hemoglobiny. Fosfor odpowiedzialny jest również za utrzymywanie integralności morfologicznej i czynnościowej układu ruchu. Jest czynnikiem niezbędnym dla prawidłowego przebiegu wielu szlaków metabolicznych [45]. Dorosły człowiek spożywa w ciągu dnia około 1,5 g fosforu, z czego 2/3 wchłaniane jest w jelitach [45]. Fosfor w organizmie człowieka zgromadzony jest głównie w kościach (ponad 80%), mięśniach (około 9%). Około 10,9% fosforu obecne jest w innych tkankach, natomiast fosforany nieorganiczne (Pi) stanowią jedynie ok. 0,1% całkowitej puli fosforu [21]. Kluczową rolę w regulacji stężenia fosforanów w surowicy krwi odgrywają nerki. Około 90% fosforanów zawartych w osoczu podlega filtracji w kłębuszkach nerkowych, przy czym 15% z nich przy prawidłowej diecie wydalane zostaje z moczem. Resorpcja fosforanów ma miejsce głównie w kanalikach proksymalnych i zachodzi ona przy udziale dwóch kotransporterów sodowo-fosforanowych, tj. NaPi-2a (ang. sodium-phosphate cotransporter Struktura i funkcje białka Klotho 170 type-2a) oraz NaPi-2c (ang. sodium-phosphate cotransporter type-2c) [45]. Prawidłowe stężenie fosforanów we krwi utrzymywane jest dzięki równowadze zachodzącej pomiędzy procesami wchłaniania fosforanów zawartych w diecie przez jelita, mobilizacją z kości oraz resorpcją i wydalaniem przez nerki. Procesy te z kolei regulowane są przez szereg czynników endokrynnych takich jak kalcytriol, parathormon, czy FGF23 (ang. fibroblast growth factor 23) [4, 16, 47, 49]. Dowodów na to, w jaki sposób białko Klotho wpływa na regulację gospodarki fosforanowej dostarczyły m.in. badania przeprowadzone na myszach pozbawionych genu FGF23. U myszy tych, podobnie jak u myszy Klotho, zaobserwowano wystąpienie przedwczesnych objawów przypominających starzenie się człowieka. U myszy FGF23−/− obserwowano m.in. zahamowanie wzrostu, kifozę, osteopenię, atrofię gonad, inwolucję grasicy, rozedmę płuc, zaniki mięśniowe i skórne. Myszy FGF23−/− wykazywały również nieprawidłową resorpcję fosforanów w nerkach, a także zwiększoną syntezę kalcytriolu. Przyczyną takiego stanu rzeczy okazał się fakt, iż transbłonowa forma białka Klotho stanowi koreceptor dla FGF23 [5, 9, 50]. Gen FGF23 został pierwotnie zidentyfikowany u pacjentów z autosomalną dominującą krzywicą hipofosfatemiczną (ADHR, ang. autosomal dominant hypophosphatemic rickets). U osób z ADHR stwierdzono występowanie mutacji zmiany sensu w genie FGF23, w wyniku której reszta argininy w pozycji 176 lub 179 zostaje zamieniona na glutaminę. Mutacja ta skutkuje opornością FGF23 na trawienie endopeptydazą, a w konsekwencji zwiększeniem jego stężenia w surowicy krwi. Zwiększony poziomy FGF23 prowadzi natomiast do nadmiernej utraty fosforanów, rozwoju hipofosfatemii oraz krzywicy [3, 9, 16, 48, 51]. Kolejnym schorzeniem objawiającym się zwiększonym poziomem FGF23 w surowicy krwi jest hipofosfatemia sprzężona z chromosomem X (XLH ang. X-linked A. Szymczyk, E. Forma 171 hypophosphataemia). XLH występuje z częstością 1 na 20 000 żywych urodzeń i dziedziczona jest jako cecha dominująca sprzężona z chromosomem X. Jej przyczyną jest mutacja genu PHEX (ang. phosphateregulating gene with homologies to endopeptidases on the X chromosome) kodującego endopeptydazę, która rozpoznaje motyw i dokonuje jego proteolitycznej 176RXXR179 inaktywacji w białku FGF23 [51-53]. Czynnik wzrostu fibroblastów 23 jest białkiem o masie cząsteczkowej 32 kDa zbudowanym z 251 aminokwasów, który ulega ekspresji głównie w komórkach tkanki kostnej, tj. osteocytach i osteoblastach. Nieznaczną ekspresję odnotowano również w nerkach, wątrobie, tarczycy i przytarczycach, jelicie cienkim oraz mięśniach szkieletowych. W wyniku cięcia proteolitycznego pomiędzy resztą Arg179 a Ser180 białko to ulega rozszczepieniu na dwa fragmenty: osiągający masę cząsteczkową 18 kDa fragment N-końcowy oraz fragment C-końcowy o masie cząsteczkowej 12 kDa [45, 54]. FGF23 należy do rodziny 22 czynników wzrostu fibroblastów zgrupowanych w siedmiu podrodzinach określanych jako: FGF1, FGF4, FGF7, FGF8, FGF9, FGF11 oraz FGF19. FGF23 wraz z FGF19 i FGF21, należy do podrodziny FGF19 [21, 55]. Owe trzy czynniki określane są również mianem czynników endokrynnych, gdyż w przeciwieństwie do pozostałych, klasycznych czynników wzrostu fibroblastów, działających w sposób auto- lub parakrynny, funkcjonują one, jako czynniki dokrewne [16, 48]. Czynniki wzrostu fibroblastów pełnią swoje biologiczne funkcje po związaniu się z odpowiednim receptorem o aktywności kinazy tyrozynowej zlokalizowanym w błonie komórkowej. Aktywne receptory funkcjonują w formie dimerów. W strukturze receptorów dla czynników wzrostu fibroblastów (FGFR, ang. fibroblast growth factor receptor) wyróżnia się domenę zewnątrzkomórkową zawierającą trzy 172 pętle Struktura i funkcje białka Klotho immunoglobulino-podobne (D1-D3), odcinek transbłonowy oraz wykazującą aktywność katalityczną domenę wewnątrzkomórkową [51, 55, 56]. Immunoglobulino-podobne pętle D2 i D3 stanowią miejsce wiązania ligandów. W obrębie odcinka linkerowego pomiędzy pętlą D1 a D2 znajduje się odcinek bogaty w aminokwasy kwaśnie oraz reszty seryny określany jako AB (ang. acid box) [57, 58]. Wśród receptorów dla FGF wyróżnić można 7 izoform, tj. FGFR1b, FGFR1c, FGFR2b, FGFR2c, FGFR3b, FGFR3c oraz FGFR4. Izoformy b i c powstają na skutek alternatywnego składania w obrębie eksonów kodujących trzecią z immunoglobulino-podobnych pętli [21, 45, 49, 55, 56]. Proces dimeryzacji receptorów dla FGF oraz stabilność kompleksu FGFR-FGF regulowane są przez siarczan heparanu (HS, ang. heparan sulfate) bądź heparynę. Czynniki wzrostu fibroblastów z podrodziny 19 (FGF19, 21, 23) w odróżnieniu od pozostałych FGF, wykazują małe powinowactwo do HS, w wyniku czego do aktywacji kinazy tyrozynowej i transdukcji sygnału wymagają dodatkowego koreceptora. Zmniejszenie powinowactwa do HS wynika ze zmian w obrębie domeny wiążącej proteoglikan (nie dochodzi w tym przypadku do utworzenia wiązań wodorowych pomiędzy siarczanem heparanu a aminokwasami domeny wiążącej). Dzięki tej właściwości czynniki te mogą przedostawać się do układu krążenia i funkcjonować jako hormony [47, 48, 55, 56, 59]. Z przeprowadzonych badań wynika, iż C-końcowy region FGF z podrodziny 19 odpowiada za oddziaływanie z koreceptorem (β-Klotho w przypadku FGF19 i FGF21, oraz Klotho w przypadku FGF23), natomiast poprzez N-koniec oddziałują one z odpowiednim receptorem FGFR [59]. Czynniki wzrostu fibroblastów mogą stanowić ligandy dla kilku izoform FGFR. FGF23 wykazuje powinowactwo do izoform FGFR1c, 3c oraz 4. Z owymi izoformami FGFR oddziałuje również białko Klotho, które poprzez tworzenie A. Szymczyk, E. Forma 173 binarnych kompleksów Klotho-FGFR zwiększa ich powinowactwo do FGF23 [5, 16, 21, 45, 47, 48]. FGF23 spełnia swoje biologiczne funkcje poprzez aktywację szlaku MAP kinaz (MAPK, ang. mitogen-activated protein kinase), który uczestniczy w regulacji wzrostu i różnicowania komórek. Wykazujące aktywność kinazy tyrozynowej receptory FGFR po przyłączeniu ligandu (FGF23) w obecności Klotho, ulegają aktywacji i fosforylują kolejne białka. Na szlaku tym dochodzi do aktywacji małych białek Ras (ang. rat sarcoma, Ras protein). Małe białka Ras dokonują fosforylacji kinazy serynowo-treoninowej Raf (ang. rapidly accelerated fibrosarcoma, Raf kinase), która uruchamia kaskadę kinaz MAP, w wyniku czego dochodzi do aktywacji kinazy MEK (ang. mitogen-activated protein kinase kinase, MAPKK), a następnie fosforylacji ERK1/2 (ang. extracellular signal regulated kinases 1/2). Za sprawą białek Ras dochodzi również do aktywacji MEKK (ang. MAP kinase kinase kinase, MAPKKK), a w konsekwencji fosforolylacji kinazy JNK (ang. jun N-terminal kinase), p38 (ang. p38 mitogen-activated protein kinase) oraz CREB (ang. cAMP response element-binding) [50]. Wykazano ponadto, że kompleks FGF23-FGFR1-Klotho aktywuje również szlak 3-kinazy fosfatydyloinozytolu, który prowadzi do aktywacji kinazy Akt, fosforylującej między innymi kinazę IKK (ang. I kappa B kinase) oraz GSK3β (ang. glycogen synthase kinase 3β). Szlak ten sprzyja przeżyciu komórek oraz zaangażowany jest w kontrolę ich proliferacji. Szlak PI3K przeciwdziała również apoptozie poprzez hamowanie indukowanej przez witaminę D aktywacji kaspaz [50]. Przy udziale białka Klotho, FGF23 może pełnić funkcję czynnika fosfaturycznego, którego aktywność polega na hamowaniu resorpcji fosforanów w jelitach i nerkach. Badania in vivo wykazały, że FGF23 jest jednym z głównych regulatorów metabolizmu witaminy D. Aktywna postać witaminy D Struktura i funkcje białka Klotho 174 (1,25(OH)2D3, kalcytriol) syntetyzowana jest głównie przez nerki i odgrywa istotną rolę w regulacji gospodarki mineralnej organizmu. Miejscem działania kalcytriolu są jelita, gdzie promując ekspresję transportera sodowo- fosforanowego NaPi-2b stymuluje on wchłanianie wapnia i fosforu, wpływając tym samym na dodatni bilans fosforanów. W odpowiedzi na zwiększony poziom fosforanów, FGF23 reguluje ekspresję dwóch genów, tj. Cyp27b1 oraz Cyp24, których produkty białkowe uczestniczą w syntezie witaminy D. Gen Cyp27b1 koduje 1α-hydroksylazę, która katalizując reakcję hydroksylacji 25(OH)D3 prowadzi do powstania kalcytriolu. Poprzez zahamowanie ekspresji Cyp27b1, FGF23 hamuje syntezę 1,25(OH)2D3, ograniczając tym samym jelitową resorpcję fosforanów. Promuje on natomiast ekspresję genu Cyp24 kodującego 24-hydroksylazę. Enzym ten katalizuje reakcję hydroksylacji 25(OH)D3 w pozycji 24, której produktem jest nieaktywna forma witaminy D [16, 47, 48, 60]. Utrzymywanie homeostazy fosforanowej odbywa się na zasadzie szeregu sprzężeń zwrotnych. FGF23 hamuje syntezę kalcytriolu, a aktywna postać witaminy D stymuluje ekspresję FGF23 (oś kości–nerki). Kalcytriol wiąże się z receptorem witaminy D (VDR, ang. vitamin D receptor), który tworzy heterodimer wraz z receptorem retinoidowym (RXR, ang. retinoid X receptor). Heterodimer VDR-RXR funkcjonuje jako czynnik transkrypcyjny regulujący ekspresję wielu genów w tym m.in. zwiększający ekspresję FGF23 w osteocytach [9]. Ponadto kalcytriol może być również zaangażowany w regulację ekspresji Klotho, gdyż w regionie promotorowym genu Klotho człowieka zidentyfikowano sekwencję VDRE (ang. vitamin D responsive element), z którą wiąże się VDR-RXR [60]. A. Szymczyk, E. Forma 175 FGF23 hamuje również ekspresję i wydzielanie syntetyzowanego przez przytarczyce parathormonu. W celu utrzymania homeostazy mineralnej PTH wiąże się z receptorami PTH1R (ang. parathyroid hormone 1 receptor) zlokalizowanymi w komórkach kości (osteocyty, osteoblasty, chondrocyty) i kanalikach nerkowych [61]. Mechanizm działania PTH jest złożony i opiera się na promowaniu zarówno syntezy kalcytriolu, jak i wydalania fosforanów z moczem. W przeciwieństwie do kalcytriolu, PTH może zatem selektywnie zwiększać stężenie wapnia we krwi, nie przyczyniając się jednocześnie do wzrostu stężenia fosforanów. FGF23 poprzez oddziaływanie z kompleksem FGFR1c-Klotho w komórkach przytarczyc obniża ekspresję PTH, hamując tym samym nerkową biosyntezę 1,25(OH)2D3. Ekspresja PTH regulowana jest również przez kalcytriol, który na zasadzie sprzężenia zwrotnego (oś nerki-przytarczyce) przyczynia się do obniżenie stężenia parathormonu [4, 9, 45, 47, 61]. W badaniach przeprowadzonych na szczurach, Lavi-Moshayoff i wsp. [61] wykazali wpływ PTH na poziom ekspresji FGF23. Stwierdzono, iż PTH zwiększa ekspresję FGF23 w indukowanej doświadczalnie niewydolności nerek. U zwierząt, którym podawano pokarmy bogate w fosforany i adeninę obserwowano podwyższony poziom FGF23, który ulegał obniżeniu wraz z usunięciem przytarczyc [61]. FGF23 poprzez hamowanie ekspresji kotransporterów sodowo-fosforanowych (NaPi-2a i NaPi-2c) ogranicza również nerkową resorpcję fosforanów. Owe dwa transportery zlokalizowane są na biegunie apikalnym komórek cewkowych. Transportują one do wnętrza komórek kanalika proksymalnego jon wodorofosforanowy (HPO42-) oraz jony sodowe. Transporter NaPi-2a przenosi trzy jony Na+, z kolei NaPi-2c dwa [45]. Struktura i funkcje białka Klotho 176 Z badań przeprowadzonych na myszach wynika, iż mechanizm hamowania ekspresji transporterów odbywa się głównie poprzez interakcje FGF23-Klotho-FGFR1c. Mniejsze znaczenie przypisuje się izoformie FGFR3, natomiast udział FGFR4 w tym procesie określa się jako niewielki [51]. Do obniżenia ekspresji NaPi-2a i 2c przyczynia się również pochodzący z przytarczyc PTH (Ryc. 3) [45]. Hamowanie nerkowej resorpcji fosforanów odbywa się również przy udziale sekrecyjnej formy białka Klotho. Białko to, dzięki aktywności β-glukuronidazy modyfikuje N-glikany transporterów NaPi-2a. W wyniku owej modyfikacji transportery te ulegają inaktywacji i kierowane są na drogę proteolitycznej degradacji [9, 62]. Ryc. 3. Regulacja gospodarki fosforanowej: oś sprzężeń zwrotnych kości – przytarczyce – nerki – jelito. Przerywanymi liniami oznaczono wzrost, ciągłymi zaś spadek ekspresji określonego czynnika. A. Szymczyk, E. Forma 177 Klotho a nowotwory Liczne badania kliniczne i laboratoryjne wskazują, iż u podstaw rozwoju wielu typów nowotworów leżą zaburzenia sygnalizacji inicjowanej przez insulinę, insulinopodobny czynnik wzrostu, a także czynniki wzrostu fibroblastów [63, 64]. Zdolność Klotho do regulacji owych szlaków, była podstawą sugestii, iż białko to może odgrywać znaczącą rolę w inhibicji procesu nowotworzenia [63]. Dane te potwierdzone zostały m.in. w badaniach prowadzonych na komórkach gruczolakoraka trzustki. U ludzi rak ten jest czwartą pod względem częstości przyczyną zgonów z powodu chorób nowotworowych w krajach zachodnich. Gruczolakorak trzustki należy do nowotworów o najgorszym rokowaniu, średni okres przeżycia od postawienia rozpoznania nie przekracza 6 miesięcy. Istotną rolę w rozwoju owego nowotworu przypisuje się szlakom sygnalizacyjnym inicjowanym przez insulinopodobny czynnik wzrostu oraz czynniki wzrostu fibroblastów. Nadmierna aktywacja receptora IGF-1 skutkuje transformacją nowotworową, wzrostem agresywności guza, a także hamowaniem procesu apoptozy. W nowotworach trzustki często odnotowuje się wzrost ekspresji insulinopodobnego czynnika wzrostu i jego receptora. Inhibicja ścieżki sygnalizacyjnej IGF-1 prowadzi natomiast do zahamowania wzrostu guza, a także zwiększa jego wrażliwość na promieniowanie jonizujące i chemioterapię. Szlak sygnalizacyjny FGF zaangażowany jest w regulację różnych etapów rozwoju nowotworów, tj. mitogenezy, różnicowania komórek czy angiogenezy. Zwiększoną ekspresję FGFR oraz ligandów takich jak FGF1, 2, 5 i 7 odnotowano zarówno w przypadku linii komórkowych, jak i komórek nowotworowych określanego pobranych także jako od pacjentów. zasadowy Wysoka czynnik ekspresja wzrostu FGF2, fibroblastów Struktura i funkcje białka Klotho 178 (bFGF, ang. basic fibroblast growth factor), powiązana była również ze stopniem zaawansowania nowotworu oraz krótszym czasem przeżycia chorych [63]. Wyniki badań przeprowadzonych przez zespół Wolfa, wykazały, że białko Klotho pełni funkcję supresora w procesie nowotworzenia trzustki. W odniesieniu do zdrowej tkanki, gruczolakoraki trzustki charakteryzowały się obniżonym poziomem ekspresji tego białka. Nadekspresja Klotho prowadziła natomiast do hamowania wzrostu komórek nowotworowych, zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo. Sugeruje się, iż za ograniczenie aktywności białka Klotho w nowotworach trzustki odpowiadają dwa mechanizmy, tj. epigenetyczne wyciszanie genu KL oraz ekspresja białka o zmniejszonej aktywności [63]. Aktywność supresorowa białka Klotho uwarunkowana jest głównie jego zdolnością do inhibicji szlaku IGF-1. Przypuszcza się jednak, iż nie mniej istotną rolę może odgrywać także blokowanie przez niego ścieżki sygnalizacyjnej bFGF, mechanizm ten odnotowano m.in. w komórkach HEK293, komórkach raka trzustki, a także w nowotworach wywodzących się z innych tkanek [63]. Szlak sygnalizacyjny insuliny/IGF-1 odgrywa także znaczącą rolę w rozwoju raka piersi, który jest najczęstszym nowotworem złośliwym kobiet. Badania immunohistochemiczne wykazały, iż w odniesieniu do tkanki prawidłowej, komórki przedinwazyjnego oraz inwazyjnego przewodowego raka piersi wykazują znacznie niższy poziom ekspresji Klotho [4, 65]. Rubinek i wsp. [66] wykazali, iż obniżenie ekspresji Klotho w nowotworach piersi następuje w wyniku hipermetylacji wysp CpG zlokalizowanych w regionie promotora genu Klotho, a także deacetylacji białek histonowych. Liczne badania przeprowadzone m.in. na linii komórek raka piersi MCF-7 dowiodły, iż wyłączenie ekspresji Klotho skutkuje wzrostem proliferacji A. Szymczyk, E. Forma 179 komórek. Natomiast nadekspresja białka Klotho była związana z zahamowaniem fosforylacji receptora IGF-1 oraz kolejnych białek szlaku, czego skutkiem było ograniczenie proliferacji komórek nowotworowych. Następstwem wyciszenia szlaku IGF-1 przez Klotho w przypadku nowotworów piersi jest podwyższenie ekspresji czynników transkrypcyjnych C/EBP określanych również jako białka wiążące się z sekwencją CCAAT (ang. CCAAT enhancer binding proteins, CCAAT binding factor). Wykazano, że w przypadku nowotworów piersi czynniki te spełniają funkcję supresorów wzrostu [65]. Poziom ekspresji Klotho okazał się być także niezwykle istotny w przebiegu nowotworów płuc, tj. drobnokomórkowego raka płuc (SCLC, ang. small cell lung cancer) oraz wielkokomórkowego raka o cechach neuroendokrynnych (LCNEC, ang. large cell neuroendocrine carcinoma). Nowotwory te, charakteryzuje krótki czas przeżycia, pięcioletnie prognozowane przeżycie chorych sięga średnio 40,3% w przypadku LCNEC oraz 35,7% w SCLC. Wyniki badań histochemicznych dowiodły, iż poziom ekspresji Klotho może spełniać rolę markera prognostycznego w przypadku pacjentów poddanych resekcji zmienionych nowotworowo tkanek. Ekspresja Klotho w guzach pierwotnych raków płuc, związana była bowiem z lepszym rokowaniem i dłuższym czasem przeżycia chorych. Ocena poziomu ekspresji Klotho, może zatem okazać się w przyszłości niezwykle pomocną w doborze terapii dla pacjentów z LCNEC i SCLC [67, 68]. Supresorową funkcję genu Klotho odnotowano również w komórkach raka żołądka, drugiego pod względem śmiertelności nowotworu na świecie. Udowodniono, iż w przypadku raka żołądka, obniżenie ekspresji Klotho następuje w wyniku hipermetylacji wysp CpG w regionie promotorowym tego genu (46% pacjentów). Ocena hipermetylacji promotora Klotho okazała się być również istotnym czynnikiem prognostycznym czasu przeżycia chorych na Struktura i funkcje białka Klotho 180 nowotwory żołądka [64]. Obniżenie ekspresji Klotho, bądź też całkowite jej wyciszenie skorelowane jest również z rozwojem raka jelita grubego, stanowiącego trzecią pod względem częstości przyczynę zgonów z powodu chorób nowotworowych na świecie. Podobnie jak w innych typach nowotworów, zmiana ekspresji Klotho w komórkach tego nowotworu jest konsekwencją hipermetylacji wysp CpG. Metylację CpG odnotowano w przypadku 83,3% badanych linii komórkowych oraz 85% preparatów tkankowych jelita grubego. Nadekspresja białka Klotho poprzez indukcję apoptozy oraz zatrzymanie cyklu komórkowego powodowała zahamowanie proliferacji komórek nowotworowych [69]. Nowe spojrzenie na mechanizmy leżące u podstaw supresorowej funkcji Klotho przyniosły badania przeprowadzone przez Lee i wsp. [70]. Wykazali oni, iż w przypadku raka szyjki macicy, który jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów wśród kobiet na całym świecie, Klotho działa jako inhibitor kanonicznej ścieżki szlaku Wnt (ang. wingless and Int-1). Liczne badania epidemiologiczne wskazują, iż czynnikiem inicjującym rozwój tego nowotworu jest infekcja wirusem brodawczaka ludzkiego HPV (ang. human papilloma virus). Przyjmuje się, iż zależna od β-kateniny ścieżka szlaku Wnt może stanowić kolejny krok w wieloetapowym procesie karcynogenezy szyjki macicy [70]. Szlak Wnt zaangażowany jest w regulację wielu procesów biologicznych, takich jak: samoodnowa komórek macierzystych, proliferacja i różnicowanie komórek, ich migracja czy apoptoza. Aktywacja owego szlaku rozpoczyna się od związania liganda Wnt z obecnym w błonie komórkowej receptorem Fzd (ang. Frizzeled) oraz koreceptorami w postaci białek LRP5 i LRP6 (ang. low-density lipoprotein receptor-related proteins). Połączenie liganda i receptora skutkuje fosforylacją cytoplazmatycznego białka Dishevelled oraz jego translokacją do błony A. Szymczyk, E. Forma 181 komórkowej. Dochodzi wówczas do zablokowania fosforylacji β-kateniny, dzięki czemu może ona ulec translokacji do jądra komórkowego, gdzie pełni rolę czynnika transkrypcyjnego. Przy nieobecności liganda Wnt, β-katenina fosforylowana jest przez kinazę kazeiny γ (CK1γ, ang. casein kinase 1γ) oraz kompleks białek takich jak GSK3β, aksyna i białko APC (ang. adenomatosis polyposis coli). Ufosforylowana β-katenina rozpoznawana jest przez ligazę ubikwityny E3 β-TRCP (ang. β-transducin repeat-containing protein) oraz kierowana na drogę degradacji przez proteasomy [71]. Badania prowadzone na linii komórek nowotworowych szyjki macicy CaSki dowiodły, iż na skutek ektopowej ekspresji sKL dochodzi do zmniejszenia całkowitego poziomu β-kateniny, a także znacznej redukcji aktywnej formy białka. Nadekspresja Klotho prowadzi zatem do spadku ekspresji genów regulowanych przez β-kateninę, takich jak onkogen c-MYC, czy gen CCND1 (ang. cyclin D1) kodujący cyklinę D1 [70]. W przypadku wielu linii komórkowych raka szyjki macicy, a także w preparatach raka inwazyjnego odnotowano spadek poziomu mRNA Klotho. Zmian tych nie wykazano natomiast w raku przedinwazyjnym. Obserwowany spadek ekspresji Klotho był wynikiem metylacji wysp CpG (41%), a także deacetylacji histonów w obrębie regionu promotorowego genu KL. Badania prowadzone na liniach komórkowych raka szyjki macicy SiHa wykazały, że kluczową rolę w procesie epigenetycznego wyciszania genu Klotho odgrywa deacetylacja histonu H3. Dane te sugerują, iż białko Klotho może stanowić w przyszłości cel w terapii raka szyjki macicy, oraz posłużyć jako marker prognostyczny u chorych na ten nowotwór [70]. Struktura i funkcje białka Klotho 182 Podsumowanie Gen Klotho zaangażowany jest w regulację procesu starzenia u ssaków. Za sprawą istnienia dwóch form transbłonowej oraz sekrecyjnej tego białka uczestniczy ono w regulacji licznych procesów komórkowych. Spełnia ono m.in. rolę koreceptora dla FGF23, odgrywając istotną rolę w regulacji homeostazy fosforanów oraz metabolizmu witaminy D. Jest inhibitorem szlaku insuliny/insulinopodobnego czynnika wzrostu przez co przyczynia się m.in. do redukcji stresu oksydacyjnego. Dzięki aktywności enzymatycznej modyfikuje N-glikany kanałów TRPV5, zwiększając nerkową resorpcję jonów wapnia. Molekularny mechanizm działania Klotho nie został jednak do końca poznany. Jego przyszłe poznanie może przyczynić się do lepszego zrozumienia procesu starzenia się organizmów, a także umożliwić zapobieganie chorób związanych z wiekiem. Ostatnie doniesienia o supresorowej funkcji Klotho w wielu typach nowotworów, sugerują, że białko to może posłużyć w przyszłości jako marker molekularny bądź też stać się nowym celem w terapii nowotworów. Piśmiennictwo 1. 2. 3. 4. 5. 6. Kuro-o M, Matsumura Y, Aizawa H, Kawaguchi H, Suga T, Utsugi T i wsp. Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing. Nature 1997; 390: 45-51. Wang Y, Sun Z. Current understanding of Klotho. Ageing Res Rev. 2009; 8: 43-51. Kurosu H, Kuro-o M. The Klotho gene family as a regulator of endocrine fibroblast growth factors. Mol Cell Endocrinol. 2009; 299: 72-78. Kuro-o M. Klotho and aging. Biochim Biophys Acta 2009; 1790: 1049-1058. Kurosu H, Yamamoto M, Clark JD, Pastor JV, Nandi A, Gurnani P i wsp. Suppression of aging in mice by the hormone Klotho. Science 2005; 309: 1829-1833. Kuro-o M. Klotho and βKlotho. Adv Exp Med Biol. 2012; 728: 25-40. A. Szymczyk, E. Forma 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 183 Manya H, Akasaka-Manya K, Endo T. Klotho protein deficiency and aging. Geriatr Gerontol Int. 2010; 10 Suppl 1: 80-87. Matsumura Y, Aizawa H, Shiraki-Iida T, Nagai R, Kuro-o M, Nabeshima Y. Identification of the human klotho gene and its two transcripts encoding membrane and secreted klotho protein. Biochem Biophys Res Commun. 1998; 242: 626-630. Kuro-o M. Klotho and aging process. Korean J Intern Med 2011; 26:113-122. Forster RE, Jurutka PW, Hsieh JC, Haussler CA, Lowmiller CL, Kaneko I i wsp. Vitamin D receptor controls expression of the anti-aging klotho gene in mouse and human renal cells. Biochem Biophys Res Commun. 2011; 414: 557-562. Imura A, Iwano A, Tohyama O, Tsuji Y, Nozaki K, Hashimoto N i wsp. Secreted Klotho protein in sera and CSF: implication for post-translational cleavage in release of Klotho protein from cell membrane. FEBS Lett. 2004; 565: 143-147. Huang CL. Regulation of ion channels by secreted Klotho: mechanisms and implications. Kidney Int. 2010; 77: 855-860. Tohyama O, Imura A, Iwano A, Freund JN, Henrissat B, Fujimori T, Nabeshima Y. Klotho is a novel beta-glucuronidase capable of hydrolyzing steroid beta-glucuronides. J Biol Chem 2004; 279: 9777-9784. Ben-Dov IZ, Galitzer H, Lavi-Moshayoff V, Goetz R, Kuro-o M, Mohammadi M i wsp. The parathyroid is a target organ for FGF23 in rats. J Clin Invest. 2007; 117: 4003-4008. Kamemori M, Ohyama Y, Kurabayashi M, Takahashi K, Nagai R, Furuya N. Expression of Klotho protein in the inner ear. Hear Res 2002; 171: 103-110. Kuro-o M. Klotho. Pflugers Arch. 2010; 459:333-343. Chen CD, Podvin S, Gillespie E, Leeman SE, Abraham CR. Insulin stimulates the cleavage and release of the extracellular domain of Klotho by ADAM10 and ADAM17. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104: 19796-19801. Lewin E, Olgaard K. Klotho, an important new factor for the activity of Ca2+ channels, connecting calcium homeostasis, ageing and uraemia. Nephrol Dial Transplant 2006; 21: 1770-1772. Dimke H, Hoenderop JG, Bindels RJ. Molecular basis of epithelial Ca2+ and Mg2+ transport: insights from the TRP channel family. J Physiol. 2011; 589: 1535-1542. Hoenderop JG, Bindels RJ. Calciotropic and magnesiotropic TRP channels. Physiology (Bethesda) 2008; 23: 32-40. 184 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. Struktura i funkcje białka Klotho Razzaque MS. Klotho and Na+,K+-ATPase activity: solving the calcium metabolizm dilemma? Nephrol Dial Transplant 2008; 23: 459-461. van Abel M, Hoenderop JG, Bindels RJ. The epithelial calcium channels TRPV5 and TRPV6: regulation and implications for disease. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2005; 371: 295-306. Lu P, Boros S, Chang Q, Bindels RJ, Hoenderop JG. The β-glucuronidase klotho exclusively activates the epithelial Ca2+ channels TRPV5 and TRPV6. Nephrol Dial Transplant 2008; 23: 3397-3402. Chang Q, Hoefs S, van der Kemp AW, Topala CN, Bindels RJ, Hoenderop JG. The β-Glucuronidase Klotho hydrolyzes and activates the TRPV5 channel. Science 2005; 310: 490-493. Huang CL, Moe OW. Klotho: a novel regulator of calcium and phosphorus homeostasis. Pflugers Arch. 2011; 462: 185-193. Cha SK, Ortega B, Kurosu H, Rosenblatt KP, Kuro-O M, Huang CL. Removal of sialic acid involving Klotho causes cell-surface retention of TRPV5 channel via binding to galectin-1. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105: 9805-9810. Imura A, Tsuji Y, Murata M, Maeda R, Kubota K, Iwano A i wsp. α-Klotho as a regulator of calcium homeostasis. Science. 2007; 316: 1615-1618. Nabeshima Y, Imura H. α-Klotho: a regulator that integrates calcium homeostasis. Am J Nephrol 2008; 28: 455-464. Bartke A. Long-lived Klotho mice: new insights into the roles of IGF-1 and insulin in aging. Trends Endocrinol Metab. 2006; 17: 33-35. Saltiel AR, Kahn CR. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature 2001; 414: 799-806. Krześlak A. Kinaza Akt: kluczowy regulator metabolizmu i progresji nowotworów. Postępy Hig Med Dośw. 2010; 64: 490-503. Kaletsky R, Murphy CT. The role of insulin/IGF-like signaling in C. elegans longevity and aging. Dis Model Mech. 2010; 3: 415-419. Clancy DJ, Gems D, Harshman LG, Oldham S, Stocker H, Hafen E i wsp. Extension of life-span by loss of CHICO, a Drosophila insulin receptor substrate protein. Science. 2001; 292: 104-106. Rincon M, Rudin E, Barzilai N. The insulin/IGF-1 signaling in mammals and its relevance to human longevity. Exp Gerontol. 2005; 40: 873-877. Tatar M, Bartke A, Antebi A. The endocrine regulation of aging by insulin-like signals. Science. 2003; 299: 1346-1351. Brown-Borg HM. Hormonal regulation of longevity in mammals. Ageing Res Rev. 2007; 6: 28-45. A. Szymczyk, E. Forma 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 185 Holzenberger M, Dupont J, Ducos B, Leneuve P, Géloën A, Even PC i wsp. IGF-1 receptor regulates lifespan and resistance to oxidative stress in mice. Nature. 2003; 421: 182-187. Klöting N, Blühera M. Extended longevity and insulin signaling in adipose tissue. Exp Gerontol. 2005; 40: 878-883. Bluher M, Michael MD, Peroni OD, Ueki K, Carter N, Kahn BB i wsp. Adipose tissue selective insulin receptor knockout protects against obesity and obesity-related glucose intolerance. Dev. Cell 2002; 3: 25–38. Laron Z. The essential role of IGF-1: Lessons from the long-term study and treatment of children and adults with Laron syndrome. J Clin Endocrinol Metab. 1999; 84: 4397–4404. Yamamoto M, Clark JD, Pastor JV, Gurnani P, Nandu A, Kurosu H i wsp. Regulation of oxidative stress by the anti-aging hormone Klotho. J Biol Chem. 2005; 280: 38029–38034. Carter ME, Brunet A. FOXO transcription factors. Curr Biol. 2007; 17: R113-114. Imae M, Fu Z, Yoshida A, Noguchi T, Kato H. Nutritional and hormonal factors control the gene expression of FoxOs, the mammalian homologues of DAF-16. J Mol Endocrinol. 2003; 30: 253-262. Ikushima M, Rakugi H, Ishikawa K i wsp. Anti-apoptotic and anti-senescence effects of Klotho on vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 2006; 339: 827-832. Gattineni J, Baum M. Regulation of phosphate transport by fibroblast growth factor 23 (FGF23): conduplicatio for disorders of phosphate metabolism. Pediatr Nephrol. 2010; 25: 591-601. Razzaque MS. FGF23-mediated regulation of systemic phosphate homeostasis: is Klotho an essential player? Am J Physiol Renal Physiol. 2009; 296: F470-F476. Kuro-o M. A potential link between phosphate and aging – lessons from. Mech Ageing Dev. 2010; 131: 270–275. Kuro-o M. Overview of the FGF23-Klotho axis. Pediatr Nephrol. 2010; 25: 583-590. Kurosu H, Ogawa Y, Miyoshi M, Yamamoto M, Nandi A, Rosenblatt KP i wsp. Regulation of fibroblast growth factor-23 signaling by Klotho. J Biol Chem. 2006; 281: 6120-6123. 186 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. Struktura i funkcje białka Klotho Medici D, Razzaque MS, Deluca S, Rector TL, Hou B, Kang K i wsp. FGF-23-Klotho signaling stimulates proliferation and prevents vitamin D-induced apoptosis. J Cell Biol. 2008; 182: 459-465. Gattineni J, Bates C, Twombley K, Dwarakanath V, L. Robinson M, Goetz R i wsp. FGF23 decreases renal NaPi-2a and NaPi-2c expression and induces hypophosphatemia in vivo predominantly via FGF receptor 1. Am J Physiol Renal Physiol. 2009; 297: F282-F291. Amatschek S, Haller M, Oberbauer R. Renal phosphate handling in human – what can we learn from hereditary hypophosphataemias? Eur J Clin Invest. 2010; 40: 552-560. Perwad F, Portale A. Vitamin D metabolism in the kidney: Regulation by phosphorus and fibroblast growth factor 23. Mol Cell Endocrinol. 2011; 347: 17-24. Mazzaferro S, Pasquali M, Pirrò G, Rotondi S, Tartaglione L. The bone and the kidney. Arch Biochem Biophys. 2010; 503: 95-102. Fon Tacer K, Bookout AL, Ding X, Kurosu H, John GB, Wang L i wsp. Research resource: Comprehensive expression atlas of the fibroblast growth factor system in adult mouse. Mol Endocrinol. 2010; 24: 2050-2064. Goetz R, Beenken A, Ibrahimi OA, Kalinina J, Olsen SK, Eliseenkova AV i wsp. Molecular insights into the Klotho-dependent, endocrine mode of action of FGF19 subfamily members. Mol Cell Biol 2007; 27: 3417-3428. Kalinina J, Dutta K, Ilghari D, Beenken A, Goetz R, Eliseenkova AV i wsp. The alternatively spliced acid box region plays a key role in FGF receptor autoinhibition. Structure. 2012; 20: 77-88. Yie J, Wang W, Deng L, Tam LT, Stevens J, Chen MM, i wsp. Understanding the physical interactions in the FGF21/FGFR/β-Klotho complex: structural requirements and implications in FGF21 signaling. Chem Biol Drug Des. 2012; 79: 398-410. Wu X, Lemon B, Li X, Gupte J, Weiszmann J, Stevens J, i wsp. C-terminal tail of FGF19 determines its specificity toward Klotho co-receptors. J Biol Chem. 2008; 283: 33304-33309. Prie D, Friedlander G. Reciprocal Control of 1,25-dihydroxyvitamin D and FGF23 formation involving the FGF23/Klotho system. Clin J Am Soc Nephrol 2010; 5: 1717-1722. A. Szymczyk, E. Forma 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 187 Lavi-Moshayoff V, Wasserman G, Meir T, Silver J, Naveh-Many T. PTH increases FGF23 gene expression and mediates the high-FGF23 levels of experimental kidney failure: a bone parathyroid feedback loop. Am J Physiol Renal Physiol 2010; 299: F882-F889. Hu MC, Shi M, Zhang J, Pastor J, Nakatani T, Lanske B, i wsp. Klotho: a novel phosphaturic substance acting as an autocrine enzyme in the renal proximal tubule. FASEB J. 2010; 24: 3438-3450. Abramovitz L, Rubinek T, Ligumsky H, Bose S, Barshack I, Avivi C i wsp. KL1 internal repeat mediates klotho tumor suppressor activities and inhibits bFGF and IGF-I signaling in pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 2011; 17: 4254-4266. Wang L, Wang X, Wang X, Jie P, Lu H, Zhang S, i wsp. Klotho is silenced through promoter hypermethylation in gastric cancer. Am J Cancer Res. 2011; 1: 111-119. Wolf I, Levanon-Cohen S, Bose S, Ligumsky H, Sredni B, Kanety H, i wsp. Klotho: a tumor suppressor and a modulator of the IGF-1 and FGF pathways in human breast cancer. Oncogene. 2008; 27: 7094-7105. Rubinek T, Shulman M, Israeli S, Bose S, Avraham A, Zundelevich A i wsp. Epigenetic silencing of the tumor suppressor klotho in human breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2012; 133: 649-657. Usuda J, Ichinose S, Ishizumi T, Ohtani K, Inoue T, Saji H i wsp. Klotho predicts good clinical outcome in patients with limited-disease small cell lung cancer who received surgery. Lung Cancer. 2011; 74: 332-337. Usuda J, Ichinose S, Ishizumi T, Ohtani K, Inoue T, Saji H i wsp. Klotho is a novel biomarker for good survival in resected large cell neuroendocrine carcinoma of the lung. Lung Cancer. 2011; 72: 355-359. Pan J, Zhong J, Gan LH, Chen SJ, Jin HC, Wang X, Wang LJ. Klotho, an antisenescence related gene, is frequently inactivated through promoter hypermethylation in colorectal cancer. Tumour Biol. 2011; 32: 729-735. Lee J, Jeong DJ, Kim J, Lee S, Park JH, Chang B, i wsp. The anti-aging gene KLOTHO is a novel target for epigenetic silencing in human cervical carcinoma. Mol Cancer. 2010; 9: 109. Kharaishvili G, Simkova D, Makharoblidze E, Trtkova K, Kolar Z, Bouchal J. Wnt signaling in prostate development and carcinogenesis. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2011; 155: 11-18. Folia Medica Lodziensia, 2012, 39/2:189-205 Genetic polymorphism of Klotho gene and bladder cancer risk Polimorfizm genu Klotho a ryzyko raka pęcherza moczowego AGNIESZKA SZYMCZYK1, EWA FORMA1, ANNA KRZEŚLAK1, PAWEŁ JÓŹWIAK1, ADAM MADEJ2, WALDEMAR RÓŻAŃSKI2, MAGDALENA BRYŚ1 1 Katedra Cytobiochemii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytet Łódzki 2 II Klinika Urologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Abstract Introduction: Bladder cancer is the most frequent tumor of the urinary tract in Poland. Klotho gene can act as an suppressor gene. Therefore, variability of this gene might be implicated in the carcinogenesis of urinary bladder. The aim of the study was analysis of the association between the g.33590184 G>A (rs1207568), g.33634983 C>T (rs564481), g.33628193 G>C (rs9527025) polymorphisms of the Klotho gene and bladder cancer risk. Materials and methods: The study included 96 patients diagnosed with transitional cell carcinoma of the bladder (TCC) and 114 healthy, cancer-free individuals. Three selected polymorphisms were typed by PCR with confronting two-pair primers (PCR-CTPP) and Real Time PCR with TaqMan probes. Results: The GA and AA genotypes of the rs1207568 polymorphism increased the risk of bladder cancer (OR = 1.86, 95% CI [1.04-3.33], p = 0.03 and OR = 6.58, 95% CI [1.27-34.02], p = 0.01, respectively). Individuals who were heterozygous and homozygous for the A variant had 2.10-fold higher risk of bladder cancer (OR = 2.10, 95% CI [1.20-3.65], p = 0.009). On the other hand, heterozygous subjects and homozygous carriers of the wild-type allele (G) had a decreased bladder cancer risk (OR = 0.19, 95% CI [0.04-0.95], p = 0.043). Also, the occurrence of bladder cancer was positively correlated with the presence of the GC genotype of the rs9527025 polymorphism (OR = 2.84, 95% CI [1.57-5.15], p = 0.0001). Corresponding author: Dr hab. Magdalena Bryś, prof. nadzw. UŁ; Katedra Cytobiochemii, Uniwersytet Łódzki, 90-236 Łódź, ul. Pomorska 141/143; e-mail: [email protected]; Tel.:+ 48 42 6354371; Fax: +48 42 6354484 190 Klotho gene and bladder cancer Conclusions: Two polymorphisms of Klotho gene (rs1207568 and rs9527025) may play a role in susceptibility to bladder cancer. Key words: genetic polymorphism, Klotho, bladder cancer, SNP Streszczenie Wstęp: Rak pęcherza moczowego jest najczęściej występującym nowotworem układu moczowego w Polsce. Sugeruje się, że gen Klotho może pełnić funkcje genu supresorowego. W związku z tym, polimorfizm genu Klotho może mieć wpływ na proces transformacji nowotworowej pęcherza moczowego. Celem przedstawionych badań był analiza związku pomiędzy występowaniem wybranych polimorfizmów pojedynczych nukleotydów g.33590184 G>A (rs1207568), g.33634983 C>T (rs564481), g.33628193 G>C (rs9527025) a ryzykiem zachorowania na raka pęcherza moczowego. Materiały i metody: Do badań włączono 96 pacjentów ze zdiagnozowanym przejściowokomórkowym rakiem pęcherza moczowego (TCC; transitional cell carcinoma) oraz 114 osób zdrowych, u których nie stwierdzono choroby nowotworowej. Występowanie trzech wybranych polimorfizmów analizowano przy użyciu techniki PCR z dwiema parami przeciwstawnych starterów (PCR-CTPP; PCR with confronting two-pair primers) oraz metody Real Time PCR z sondami fluorescencyjnymi TaqMan. Wyniki: Genotypy GA i AA polimorfizmu rs1207568 wpływają na wzrost ryzyka zachorowania na przejściowokomórkowego raka pęcherza moczowego (OR = 1,86, 95% PU [1,04-3,33], p = 0,03 oraz OR = 6,58, 95% CI [1,27-34,02], p = 0,01, odpowiednio). U osób będących heterozygotami lub homozygotami pod względem allela A wykazano ponad 2-krotnie wyższe ryzyko zachorowania na raka pęcherza moczowego (OR = 2,10, 95% PU [1,20-3,65], p = 0,009). Natomiast w przypadku nosicieli allela G, w układzie homozygotycznym lub heterozygotycznym, obserwowano spadek ryzyka zachorowania na badany nowotwór (OR = 0,19, 95% PU [0,04-0,95], p = 0,043). W przypadku polimorfizmu rs952705 wykazano, że genotyp GC zwiększa ryzyko zachorowania na przejściowokomórkowego raka pęcherza moczowego (OR = 2,84, 95% PU [1,57-5,15], p = 0,0001). A. Szymczyk et al. 191 Wnioski: Dwa spośród badanych polimorfizmów genu Klotho (rs1207568 i rs9527025) mogą mieć wpływ na predyspozycję do zachorowania na przejściowokomórkowego raka pęcherza moczowego. Słowa kluczowe: polimorfizm genów, Klotho, rak pęcherza, SNP Introduction In Europe, bladder cancer is the 5th most commonly diagnosed cancer type and the 9th leading cause of cancer mortality [1]. In addition, bladder cancer is the most frequent tumor of the urinary tract in Poland [2]. It affects men more frequently than women. Typical of solid tumors, bladder cancer incidence increases with age. Tumor of the bladder rarely occur before the age of 40 – 50, arising most commonly in the seventh decade of life [1]. The most important risk factors for the development of bladder cancer are smoking and occupational exposure to toxic chemicals, such as aromatic amines and polycyclic aromatic hydrocarbons [3]. Recent studies have facilitated even more rapid progress in the identification of the molecular mechanisms involved in bladder cancer initiation and progression. Many transforming and tumor suppressor genes, such as FGFRs (fibroblast growth factor receptors), Ras, p53 and RB (retinoblastoma) may be involved in bladder carcinogenesis [4, 5]. The fibroblast growth factor receptors (FGFRs) play a role in tumor associated angiogenesis, as some receptors (FGFR3) are mutated and others (FGFR 1, 2, and 4) are abnormally expressed in bladder cancers. Overexpression of wild-type FGFR4 in bladder tumors can be associated with progression and aggressive clinical behavior of this cancer [5]. Recent studies indicate that Klotho (KL) protein can modulate FGF/FGFR signaling and act as tumor suppressor [6]. The Klotho gene named after a Greek goddess who spins the thread of life, was originally identified as 192 Klotho gene and bladder cancer a gene mutated in a mouse strain that inherits a premature aging syndrome in an autosomal recessive manner [7, 8]. The Klotho gene is composed of five exons and encodes a type I single-pass transmembrane protein of 1,012 amino acid long (~130 kDa). The intracellular part of Klotho protein is very short (10 amino acid) and has no known functional domains. The extracellular domain is composed of two internal repeats with homology to family 1 glycosidases that hydrolyze β-glucosidic linkage in saccharides, glycoproteins, and glycolipids [9, 10]. The extracellular domain is also subject to ectodomain shedding. As a result, the entire extracellular domain is released into the extracellular space and is detectable in blood, urine, and cerebrospinal fluid [11, 12]. Thus, the Klotho protein exist in two forms: membrane Klotho and secreted Klotho. Membrane Klotho functions as a coreceptor for endocrine FGF23 that regulates excretion of phosphate and synthesis of active vitamin D [13-16]. Secreted Klotho functions as a humoral factor with pleiotropic activities, including suppression of growth factor signaling, suppression of oxidative stress, and regulation of ion channels and transporters [17, 18]. Furthermore, secreted Klotho protein may modify glycans of receptor tyrosine kinases, such as insulinand IGF-1 receptors and FGFRs, which inhibits their activity and/or alters cell surface abundance [19]. Goetz et al. [20] suggested that the association of Klotho protein with FGFR not only enhances the binding affinity of the receptor for endocrine FGFs such as FGF23 but at the same time also suppresses the binding and activation of FGFR by FGF8 subfamily ligands and possibly other paracrine FGFs [20]. A. Szymczyk et al. 193 We hypothesized that genetic polymorphisms in Klotho gene may be associated with development of bladder cancer. To test our hypothesis we evaluated the association between the g.33590184 G>A (G-395A, rs1207568), g.33634983 C>T (C1818T, rs564481), g.33628193 G>C (C370S, rs9527025) polymorphisms of the Klotho gene and bladder cancer. Table 1. Characteristics of the bladder cancer patients and healthy participants Characteristic Sample size Age, years No. of healthy participants (%) pa 96 114 – 66.3 ± 8.1 67.8 ± 12.2 – No. of patients (%) Histologic cell type Transitional cell carcinoma 96 (100) Sex Male Female 68(70.8) 28 (29.2) Grade 1 or 2 3 64 (66.6) 32 (33.4) Stage Noninvasive pTa pTis pT1 Muscle invasive pT2a or pT2b pT3a or pT3b pT4 Disease recurrence Yes No a χ2 test – – <0.001 46 (40.3) 68 (59.7) – – – – – – 41 (42.7) 22 (22.9) 1 (1.0) 18 (18.7) 55 (57.3) 21 (21.8) 23 (23.9) 11 (11.7) 15 (15.6) 81 (84.4) Klotho gene and bladder cancer 194 Material and methods Patients The study included 96 patients diagnosed with transitional cell carcinoma of the bladder at the 2nd Clinic of Urology, Medical University of Łódź, Poland between 2009 and 2012. The gender was 68 male and 28 female. The mean age of patients was 66.3 years. Clinicopathological characteristics of participants are shown in Table 1. The control group consisted of 114 healthy individuals (46 male and 68 female) recruited from the 2nd Clinic of Urology, Medical University of Łódź, Poland, from periodic health check-ups. The controls were genetically unrelated cancer-free individuals and frequency matched to the cases based on age (mean age 67.8 years). This study was approved by the Ethical Committee of the Medical University of Łódź. Each subject donated a venous blood samples of ~ 2 mL, 250 µL of which was used for genomic DNA extraction. Blood samples of all patients and controls were collected into ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) tubes and store at -20°C until further use. DNA preparation and storage Genomic DNA was obtained from a 250 µl aliquot of blood using a commercially available AxyPrepTM Blood genomic DNA Miniprep Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA), according to the manufacturer’s instructions. DNA purity and concentration were determined spectrophotometrically at 260 and 280 nm. The purified genomic DNA was stored in TE buffer at -20°C. A. Szymczyk et al. 195 SNP Table 2. Sequence of primers and probes used for the genotyping of Klotho gene Method of genotyping Sequence (5’-3’) Reference rs1207568 F1:GTTTCGTGGACGCTCAGGTTCATTCTC PCR-CTPP F2:GAGAAAAGGCGCCGACCAACTTTC (21) R1:GATCCCGCCCC CAAGTCGGGA R2:GTCCCTCTAGGATTTCGGCCAG rs564481 F1:CTCAGTTTACCGACCTGAATGTTTACCTG PCR-CTPP F2:CAGATCGCTTTACTCCAGGAAATGCAC (21) R1:GTCCAGGGAGAAGCGAAAATGTGTAACA R2:5’- GAGCTCTTGAAAGCACAGTCGGGC-3’ F:AGTTCATCAAAGGAACTGCT GACTT rs9527025 R:CTTCATGTGAGGGTCCAAAA GTT TaqMan® assay S1 (allele G) FAMTTGCTCTTTGCTTTGGACCCACCT-BHQ1 S2 (allele C) VICTTGCTCTTTCCTTTGGACCCACCTT-BHQ1 (22) Klotho gene and bladder cancer 196 PCR-CTPP The genotyping of g.33590184 G>A (G-395A, rs1207568) in the promoter region and g.33634983 C>T (C1818T, rs564481) in exon 4 was performed using PCR with confronting two-pair primers (PCR-CTPP) assay (21). In this assay, confronting pairs of primers (four primers in all) are used as shown in Table 2. The regions containing studied polymorphism were amplified by PCR with these primers with the initial denature at 95°C for 1 min, at 65°C (rs1207568) or 69°C (rs564481) for 1 min, at 72°C for 1 min and additionally at 72°C for 10 min. PCR products were visualized on a 2% agarose gel with ethidium bromide staining. Genotyping was performed as follows: rs1207568 – 252, 175 bp for GG genotype, 252, 175, 121 bp for GA genotype, 252, 121 bp for AA genotype (Fig. 1) and rs564481 – 416, 291 bp for CC genotype, 416, 291, 179 bp for CT genotype, and 416, 179 bp for TT genotype (Fig. 2). Fig. 1. Genotypes of the g.33590184 G>A (G-395A) polymorphism (rs1207568) determined by PCR-CTPP method and analyzed by 2% agarose gel electrophoresis stained with ethidium bromide and viewed under UV. A. Szymczyk et al. 197 Fig. 2. Genotypes of the g.33634983 C>T (C1818T) polymorphism (rs564481) determined by PCR-CTPP method and analyzed by 2% agarose gel electrophoresis stained with ethidium bromide and viewed under UV. TaqMan® Assay Genotyping for g.33628193 G>C (C370S, rs9527025) allelic variant in exone two was performed with using TaqMan® genotyping assay in which a fluorogenic probe, consisting of an oligonucleotide labeled with both a fluorescent reporter dye (FAM or VIC) and a quencher dye, is included in a typical PCR. Amplification of the probe-specific product causes cleavage of the probe, generating an increase in reporter fluorescence. Sequences of pair of primers and two probes are shown in Table 2 (22). The PCR thermal cycling was as follows: initial denaturing at 95°C for 10 min; 45 cycles of 95°C for 30 sec and 60°C for 60 sec were carried out and fluorescence was measured at the end of each cycle and at endpoint. Detection was carried out by qPCR in an Eppendprf realplex thermocycler (Eppendorf, Germany). All samples were determined in duplicate and genotypes were assigned by gene identification software (RealPlex 2.0, Eppendorf, Germany). Klotho gene and bladder cancer 198 Statistical data analysis Genotype distributions were evaluated for agreement with Hardy–Weinberg equilibrium by the Chi-square test. All genotype distributions of Klotho gene fit Hardy–Weinberg equilibrium. Unconditional multiple logistic regression models were used to calculate odds ratios (ORs) and 95 % confidence intervals (CIs) for the association of genotype with bladder cancer risk. Genotype data were analyzed with the homozygote of the common allele as the reference group. Variants of homozygotes and heterozygotes were combined to evaluate the dominant effect. Reported p values were two sided. Probabilities were considered significant whenever p value was lower than 0.05. All analyses were completed using STATA software (version 11.0 Stata-Corp., Texas, USA). Results The PCR-CTPP and Real Time TaqMan® PCR analyses were successful for all cases and controls. The characteristics of the patients and controls are presented in Table 1. There were significantly more male among the patients than controls (70.8% vs 40.3%, p<0.001). The genotype and allele distributions of the g.33590184 G>A (rs1207568), g.33634983 C>T (rs564481) and g.33628193 G>C (rs9527025) Klotho polymorphisms in bladder cancer patients and controls are summarized in Table 3. In our study, all the observed genotype frequencies were in agreement with Hardy-Weinberg equilibrium calculated for the cases and controls (p>0.05). As shown in Table 3 the differences in the frequency distributions of genotypes of the rs1207568 and rs9527025 polymorphisms between the cases and controls were statistically significant (p<0.05). A. Szymczyk et al. 199 Table 3. Associations between Klotho SNPs and bladder cancer risk Cases (%)/Controls (%) OR (95% CI)a GG 45 (46.9)/ 74 (64.9) 1.00 GA 43 (44.8)/ 38 (33.3) 1.86 (1.04-3.33) 0.03 AA 8 (8.3)/ 2 (1.8) 6.58 (1.27-34.02) 0.01 p-trenda 0.002 GA or AA vs. GGb 51 (53.1)/ 40 (35.1) 2.10 (1.20-3.65) 0.009 GA or GG vs AAc 88 (91.7)/ 112 (98.2) 0.19(0.04-0.95) 0.043 CC 43 (44.8)/ 48 (42.1) 1.00 CT 39 (40.6)/ 54 (47.4) 0.81 (0.45-1.45) 0.47 TT 14 (14.6)/ 12 (10.5) 1.30 (0.54-3.14) 0.55 p-trenda 0.88 CT or TT vs. CCb 53 (55.2)/ 66 (57.9) 1.15 (0.87-1.52) 0.32 CC or CT vs. TTc 82 (85.4)/ 102 (89.5) 1.41 (0.92-2.19) 0.11 GG 67 (70.0)/ 79 (69.3) 1.00 GC 27 (28.1)/ 33 (28.9) 2.84 (1.57-5.15) 0.0001 CC 2 (1.9)/ 2 (1.8) 1.84 (0.25-13.65) 0.55 p-trenda 0.98 GC or CC vs. GGb 29 (30.2)/ 35 (36.4) 1.02 (.57-1.85) 0.94 GG or GC vs. CCc 94 (97.9)/ 112 (98.2) 1.19 (0.16-8.62) 0.86 SNP genotype p rs1207568 rs564481 rs9527025 a Testing additive genetic model (Cochran-Armitage test for trend); b Testing dominant genetic model; c Testing recessive genetic model Klotho gene and bladder cancer 200 An association between bladder cancer and the GA and AA genotypes of the rs1207568 polymorphism was found. Both genotypes increased the risk of bladder cancer occurence (OR = 1.86, 95% CI [1.04-3.33], p = 0.03 and OR = 6.58, 95% CI [1.27-34.02], p = 0.01, respectively). Moreover, we found that individuals who were heterozygous and homozygous for the A variant had 2.10-fold higher risk of bladder cancer (OR = 2.10, 95% CI [1.20-3.65], p=0.009). On the other hand, heterozygous subjects and homozygous carriers of the wild-type allele (G) had a decreased bladder cancer risk (OR = 0.19, 95% CI [0.04-0.95], p=0.043). In addition, the occurrence of bladder cancer was positively correlated with the presence of the GC genotype of the rs9527025 polymorphism (OR=2.84, 95% CI [1.57-5.15], p = 0.0001). Discussion In recent years, the role of genetic factors in bladder cancer development has been extensively investigated. Numerous case-control studies have confirmed the association between single nucleotide polymorphisms (SNPs) and bladder cancer [23-25]. We analyzed three single nucleotide polymorphisms in Klotho gene. One SNP (rs1207568) is located in the promoter region of Klotho gene. We also analyzed a G to C transversion at the position g.33628192 (rs9527025) located in the second exon of this gene. This polymorphism causes change of cysteine to serine at the amino acid position 370 (C370S) of Klotho protein. The third SNP (rs564481) is located within exon 4 and is synonymous mutation (His589His) [26]. We found significant association between rs1207568 and rs9527025 polymorphisms and bladder cancer risk in Polish population. To our knowledge, this is the first study to report an association of SNPs in Klotho with the risk of bladder cancer. Polymorphisms of Klotho gene have A. Szymczyk et al. 201 been studied for their associations with risk for a variety of disease, such as osteoarthritis, ischemic stroke, coronary artery disease, metabolic syndrome and type 2 diabetes [22, 26-30]. There are a few studies analyzing the correlation between Klotho SNPs and breast and ovarian cancer risk [31, 32]. A functional variant of Klotho, termed KL-VS, contains six sequence variants in complete linkage disequilibrium, two of which result in amino acid substitutions F352V and C370S. The presence of phenylalanine at a position equivalent to position 352 in the human Klotho gene is highly conserved among species and its substitution to valine may alter the excretion and enzymatic activity of the protein [31]. Wolf et al. [31] analyzed the association between KL-VS and cancer risk among BRCA1/BRCA2 mutation carriers of Ashkenazi origin. Among BRCA1 carriers, heterozygosity for the KL-VS allele was associated with increased breast and ovarian cancer risk and younger age at breast cancer diagnosis [31]. The effect of KL-VS variant on breast and ovarian cancer risk in non-Jewish BRCA1/BRCA2 mutation carriers has not been reported [32]. Moreover, recent studies indicate that Klotho protein can act as tumor suppressor [6]. Analysis of KL protein expression in breast tissue revealed high Klotho expression in normal breast samples but very low expression in breast cancer [33, 34]. Klotho gene expression was also downregulated in cell lines and tissue samples of human gastric, colorectal, cervical and lung cancer [35-39]. In the case of cervical cancer samples, loss of Klotho mRNA was observed in invasive carcinoma but not during the early, preinvasive phase of primary cervical tumorigenesis. Abramovitz et al. [6] showed that Klotho expression is downregulated in pancreatic adenocarcinoma. Overexpression of KL, or treatment with soluble Klotho, reduced growth of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo [6]. Klotho gene and bladder cancer 202 In conclusion, our work shows that genetic polymorphisms of the Klotho gene may be associated with development of bladder cancer. These findings may be helpful in increasing our understanding of carcinogenesis of urinary bladder. References 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Letasiova S, Medve'ova A, Sovcikova A, Dusinska M, Volkovova K, Mosoiu C et al. Bladder cancer, a review of the environmental risk factors. Environ Health. 2012; 11 Suppl 1: 11. Nawrocki S, Milecki P, Skacel T, Skoneczna I, Kwias Z. Treatment of bladder cancer: present and perspectives. Współczesna Onkologia 2002; 7: 465-472. Griffiths TR. Current perspectives in bladder cancer management. Int J Clin Pract. 2012; doi: 10.1111/ijcp.12075. Al Hussain TO, Akhtar M. Molecular basis of urinary bladder cancer. Adv Anat Pathol. 2013; 20: 53-60. Czerniak B. Molecular pathology and biomarkers of bladder cancer. Cancer Biomark. 2010; 9: 159-176. Abramovitz L, Rubinek T, Ligumsky H, Bose S, Barshack I, Avivi C et al. KL1 internal repeat mediates klotho tumor suppressor activities and inhibits bFGF and IGF-I signaling in pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 2011; 17: 4254-4266. Kuro-o M, Matsumura Y, Aizawa H, Kawaguchi H, Suga T, Utsugi T et al. Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing. Nature 1997; 390: 45-51. Kuro-o M. Overview of the FGF23-Klotho axis. Pediatr Nephrol. 2010; 25: 583-590. Kuro-o M. Klotho. Pflugers Arch. 2010; 459: 333-343. Mian IS. Sequence, structural, functional, and phylogenetic analyses of three glycosidase families. Blood Cells Mol Dis. 1998; 24: 83-100. Imura A, Iwano A, Tohyama O, Tsuji Y, Nozaki K, Hashimoto N et al. Secreted Klotho protein in sera and CSF: implication for post-translational cleavage in release of Klotho protein from cell membrane. FEBS Lett. 2004; 565: 143-147. Bloch L, Sineshchekova O, Reichenbach D, Reiss K, Saftig P, Kuro-o M et al. Klotho is a substrate for alpha-, beta- and gamma-secretase. FEBS Lett. 2009; 583: 3221-3224. A. Szymczyk et al. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 203 Kurosu H, Ogawa Y, Miyoshi M, Yamamoto M, Nandi A, Rosenblatt KP et al. Regulation of fibroblast growth factor-23 signaling by klotho. J Biol Chem. 2006; 281: 6120-6123. Urakawa I, Yamazaki Y, Shimada T, Iijima K, Hasegawa H, Okawa K et al. Klotho converts canonical FGF receptor into a specific receptor for FGF23. Nature 2006; 444: 770-774. Kuro-o M. Klotho as a regulator of fibroblast growth factor signaling and phosphate/calcium metabolism. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2006; 15: 437-441. Martin A, David V, Quarles LD. Regulation and function of the FGF23/klotho endocrine pathways. Physiol Rev. 2012; 92: 131-155. Kuro-o M. Klotho and the aging process. Korean J Intern Med. 2011; 26: 113-122. Yamamoto M, Clark JD, Pastor JV, Gurnani P, Nandi A, Kurosu H et al. Regulation of oxidative stress by the anti-aging hormone klotho. J Biol Chem. 2005; 280: 38029-38034. Kuro-o M. Klotho and aging. Biochim Biophys Acta 2009; 1790: 1049-1058. Goetz R, Ohnishi M, Ding X, Kurosu H, Wang L, Akiyoshi J et al. Klotho coreceptors inhibit signaling by paracrine fibroblast growth factor 8 subfamily ligands. Mol Cell Biol. 2012; 32: 1944-1954. Shimoyama Y, Nishio K, Hamajima N, Niwa T. KLOTHO gene polymorphisms G-395A and C1818T are associated with lipid and glucose metabolism, bone mineral density and systolic blood pressure in Japanese healthy subjects. Clin Chim Acta 2009; 406: 134-138. Rhee EJ, Oh KW, Lee WY, Kim SY, Jung CH, Kim BJ et al. The differential effects of age on the association of KLOTHO gene polymorphisms with coronary artery disease. Metabolism 2006; 55: 1344-1351. Dodurga Y, Tataroglu C, Kesen Z, Satiroglu-Tufan NL. Incidence of fibroblast growth factor receptor 3 gene (FGFR3) A248C, S249C, G372C, and T375C mutations in bladder cancer. Genet Mol Res. 2011; 10: 86-95. Liu ZH, Bao ED. Quantitative assessment of the association between TP53 Arg72Pro polymorphism and bladder cancer risk. Mol Biol Rep. 2012; doi: 10.1007/s11033-012-2319-z Zhi Y, Yu J, Liu Y, Wei Q, Yuan F, Zhou X et al. Interaction between polymorphisms of DNA repair genes significantly modulated bladder cancer risk. Int J Med Sci. 2012; 9: 498-505. 204 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. Klotho gene and bladder cancer Zhang F, Zhai G, Kato BS, Hart DJ, Hunter D, Spector TD et al. Association between KLOTHO gene and hand osteoarthritis in a female Caucasian population. Osteoarthritis Cartilage. 2007; 15: 624-629. Tsezou A, Furuichi T, Satra M, Makrythanasis P, Ikegawa S, Malizos KN. Association of KLOTHO gene polymorphisms with knee osteoarthritis in Greek population. J Orthop Res. 2008; 26: 1466-1470. Majumdar V, Nagaraja D, Christopher R. Association of the functional KL-VS variant of Klotho gene with early-onset ischemic stroke. Biochem Biophys Res Commun. 2010; 403: 412-416. Majumdar V, Christopher R. Association of exonic variants of Klotho with metabolic syndrome in Asian Indians. Clin Chim Acta 2011; 412: 1116-1121. Freathy RM, Weedon MN, Melzer D, Shields B, Hitman GA, Walker M et al. The functional "KL-VS" variant of KLOTHO is not associated with type 2 diabetes in 5028 UK Caucasians. BMC Med Genet. 2006; 7: 51. Wolf I, Laitman Y, Rubinek T, Abramovitz L, Novikov I, Beeri R et al. Functional variant of KLOTHO: a breast cancer risk modifier among BRCA1 mutation carriers of Ashkenazi origin. Oncogene 2010; 29: 26-33. Laitman Y, Kuchenbaecker KB, Rantala J, Hogervorst F, Peock S, Godwin AK, Arason A et al. The KL-VS sequence variant of Klotho and cancer risk in BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res Treat. 2012; 132: 1119-1126. Wolf I, Levanon-Cohen S, Bose S, Ligumsky H, Sredni B, Kanety H et al. Klotho: a tumor suppressor and a modulator of the IGF-1 and FGF pathways in human breast cancer. Oncogene 2008; 27: 7094-7105. Rubinek T, Shulman M, Israeli S, Bose S, Avraham A, Zundelevich A et al. Epigenetic silencing of the tumor suppressor klotho in human breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2012; 133: 649-657. Wang L, Wang X, Wang X, Jie P, Lu H, Zhang S et al. Klotho is silenced through promoter hypermethylation in gastric cancer. Am J Cancer Res. 2011; 1: 111-119. Pan J, Zhong J, Gan LH, Chen SJ, Jin HC, Wang X et al. Klotho, an antisenescence related gene, is frequently inactivated through promoter hypermethylation in colorectal cancer. Tumour Biol. 2011; 32: 729-735. Lee J, Jeong DJ, Kim J, Lee S, Park JH, Chang B et al. The anti-aging gene KLOTHO is a novel target for epigenetic silencing in human cervical carcinoma. Mol Cancer. 2010; 9: 109. A. Szymczyk et al. 38. 39. 205 Usuda J, Ichinose S, Ishizumi T, Ohtani K, Inoue T, Saji H et al. Klotho is a novel biomarker for good survival in resected large cell neuroendocrine carcinoma of the lung. Lung Cancer 2011; 72: 355-359. Usuda J, Ichinose S, Ishizumi T, Ohtani K, Inoue T, Saji H et al. Klotho predicts good clinical outcome in patients with limited-disease small cell lung cancer who received surgery. Lung Cancer 2011; 74: 332-337. Folia Medica Lodziensia, 2012, 39/2: 207-244 Rola metalotionein i kadmu w rozwoju raka piersi Role of metalothioneins and cadmium in breast carcinogenesis EWA FORMA, MAGDALENA BRYŚ Katedra Cytobiochemii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytet Łódzki Streszczenie Metalotioneina (MT) została po raz pierwszy odkryta ponad 50 lat temu, jako białko wiążące kadm w nerce konia. Metalotioneiny są grupą powszechnie występujących białek o niskiej masie cząsteczkowej, wysokiej zawartości reszt cysteiny, których grupy tiolowe wiążą jony takich metali jak kadm (Cd), cynk (Zn) i miedź (Cu). U ssaków wyróżnia się cztery izoformy metalotioneiny oznaczone jak MT-1 – MT-4. Do podstawowych funkcji metalotionein zalicza się utrzymanie homeostazy metali ciężkich, ochronę przed ich toksycznym działaniem, a także ochronę przed stresem oksydacyjnym. Kadm, który został zakwalifikowany do substancji karcynogennych I klasy, może między innymi stymulować proliferację komórek, hamować naprawę uszkodzeń DNA, zaburzać proces apoptozy oraz promować rozwój nowotworów w licznych tkankach. Kadm znajdujący się w środowisku naturalnym pochodzi ze źródeł naturalnych, jak i antropogenicznych, przy czym ilość kadmu dostająca się do środowiska w wyniku działalności człowieka od 3 do 10 razy przekracza ilości kadmu pochodzące ze źródeł naturalnych. Kadm akumuluje się w organizmie człowieka, a jego okres biologicznego półtrwania wynosi od 10 do 30 lat. Zarówno akumulacja Cd, jak i zaburzenia ekspresji metalotionein mogą mieć związek z rozwojem wielu typów nowotworów, w tym raka piersi. Słowa kluczowe: metalotioneiny, kadm, rak piersi. Abstract Metallothionein (MT) was first discovered over 50 years ago, as a cadmiumbinding protein in the kidney of a horse. Metallothioneins are a class of Adres do korespondencji: dr Ewa Forma; Katedra Cytobiochemii, Uniwersytet Łódzki; 90-236 Łódź; ul. Pomorska 141/143; e-mail: [email protected], Tel.: + 48 42 6354371; Fax: +48 42 6354484 Metalotioneiny i kadm a rak piersi 208 ubiquitously occurring cysteine and metal-rich proteins of low molecular weight, containing sulfur-based metal clusters formed with zinc (Zn), cadmium (Cd), and copper (Cu). In mammals, four distinct MT isoforms designated MT-1 – MT-4 are identified. The major physiological functions of metallothioneins include the homeostasis of essential metals Zn and Cu and the protection against oxidative stress and toxic effects of heavy metals such as Cd. Cadmium ,which has been classified as class I carcinogen, can stimulate cell proliferation, inhibit DNA repair, impair apoptosis and promote the development of cancer in a number of tissues. Significant quantities of Cd are introduced into the environment both by natural and anthropogenic activities, with anthropogenic activities contributing 3–10 times more Cd to the environment than natural activities. Cadmium accumulates in the human body with a long biological half-life ranging from 10 to 30 years. Cd accumulation and the aberrant expression of MTs have been found to be associated with the development of many types of cancers, including breast cancer. Key words: metallothioneins, cadmium, breast cancer. Wstęp Metalotioneiny (MTs, ang. metallothioneins) to grupa wewnątrz- komórkowych białek charakteryzujących się niską masą cząsteczkową (6 – 7 kDa) oraz wysoką zawartością reszt cysteiny, które stanowią około 30% wszystkich aminokwasów budujących łańcuch polipeptydowy. W białkach tych brak jest aminokwasów aromatycznych oraz histydyny [1, 2]. MT mają zdolność do wiązania różnych jonów metali, w tym cynku, kadmu, rtęci, miedzi, ołowiu i srebra [2]. Białka te odpowiadają za homeostazę jonów cynku i miedzi, detoksykację metali ciężkich (zwłaszcza Cd i Hg) oraz ochronę przed uszkodzeniami oksydacyjnymi i apoptozą [3, 4]. Kadm jest związkiem karcynogennym wykazującym negatywny wpływ na wiele procesów komórkowych. Jony kadmu biorą udział we wszystkich etapach transformacji E. Forma, M. Bryś nowotworowej [5-7]. Związek metalotionein 209 i kadmu z procesem karcynogenezy analizowano w odniesieniu do wielu typów nowotworów, w tym raka płuc, prostaty, jelita grubego, wątroby oraz nerek [8-13]. Klasyfikacja metalotionein Podział metalotionein na rodziny, podrodziny, podgrupy i izoformy opiera się na podobieństwie sekwencji i pokrewieństwie filogenetycznym. Metalotioneiny podzielono na 4 grupy: MT-1, MT-2, MT-3 oraz MT-4. Geny MT-1 kodują szereg izoform (MT-1A, -B, -E, -F, -G, -H, -I, -J, -K, -L, -X), natomiast pozostałe białka z rodziny metalotionein kodowane są przez pojedyncze geny (MT-2A, MT-3 i MT-4) [3]. Struktura metalotionein Metalotioneina została po raz pierwszy wyizolowana z nerki konia przez Margoshesa i Vallee’a w 1957 r., jako niskocząsteczkowe białko wiążące kadm. W 1990 roku dzięki zastosowaniu spektroskopii NMR i krystalografii rentgenowskiej określono trójwymiarową strukturę metalotioneiny [14, 15]. Geny metalotionein znajdują się na długim ramieniu chromosomu 16 (16q13) [15]. MT-1 i MT-2A zbudowane są z 61, MT-3 z 68, a MT-4 z 62 reszt aminokwasowych. MT-3 jest najdłuższą izoformą metalotionein w ludzkich komórkach. Różnica w długości łańcucha polipeptydowego między MT-1/MT-2A a MT-3 związana jest z obecnością w tej ostatniej izoformie reszty treoniny w pozycji 5 i heksapeptydu o charakterze kwaśnym poniżej pozycji 53, których brak jest w MT-1 i MT-2A. Podobnie jak w MT-3, tak i w MT-4 w pozycji 5 znajduje się reszta kwasu glutaminowego, której brak jest w pozostałych izoformach. MT-3 wykazuje 70% zgodność sekwencji 210 Metalotioneiny i kadm a rak piersi z MT-1/MT-2A, natomiast MT-4 różni się od MT-1 i MT-2A większością aminokwasów niebędących resztami cysteiny [14, 16-19]. W cząsteczkach MT nie występują aminokwasy aromatyczne [1, 2]. Wszystkie izoformy MT zawierają w swojej strukturze 20 konserwatywnie zachowanych reszt cysteiny, znajdujących się w obrębie charakterystycznych sekwencji: Cys-x-Cys, Cys-x-yCys i Cys-Cys, gdzie x i y to aminokwasy inne niż Cys [14, 20, 21]. Obecność dwóch konserwatywnych reszt proliny, znajdujących się w charakterystycznej dla MT-3 sekwencji Cys-Pro-Cys-Pro, zawartej między pozycją 6 i 9 łańcucha białkowego decyduje o aktywności biologicznej MT-3 [14, 17, 18]. Atomy siarki grup tiolowych reszt cysteiny biorą udział w koordynacyjnym wiązaniu jonów metali dwuwartościowych (Zn2+, Cd2+, Hg2+, Pb2+) i jednowartościowych (Cu+, Ag+) [3]. Pierwszą izoformą MT, której struktura trójwymiarowa została poznana była pochodząca z wątroby szczura MT-2A [14, 18]. Późniejsze badania wykazały, że w analogiczny do MT-2A sposób zbudowane są pozostałe izoformy MT. W cząsteczce metalotioneiny wyróżnia się dwie globularne domeny odpowiadające za wiązanie metali (Ryc. 1). W N-końcowej części MT-2A znajduje się domena β, odpowiadająca resztom aminokwasowym od 1 do 30. W domenie tej znajduje się 9 reszt cysteiny, które uczestniczą w koordynacyjnym wiązaniu trzech jonów metali, co można opisać stechiometrycznie M3IIS9, gdzie MII to jon metalu na drugim stopniu utlenienia, a S to atom siarki grupy tiolowej Cys biorący udział w wiązaniu metali. C-końcową część białka stanowi domena α składająca się z aminokwasów od 31 do 61. W domenie tej znajduje się 11 reszt cysteiny wiążących cztery jony metali grupy II – stechiometrycznie M4IIS11. Wymiana metali w domenie β zachodzi szybciej niż w domenie α, ponieważ jest ona bardziej reaktywna. E. Forma, M. Bryś 211 Ryc. 1. Schemat genu, mRNA oraz białka metalotioneiny 2A. Domeny MT połączone są konserwatywnym segmentem, składającym się z dwóch reszt lizyny znajdujących się w pozycjach 30 i 31 i pełniącym funkcję ruchomego zawiasu. W MT-4 w pozycji 30 (region zawiasu), zamiast występującej w innych izoformach reszty lizyny, znajduje się reszta argininy. W MT 20 reszt cysteiny pozwala na związanie 7 jonów Zn2+, Cd2+, Hg2+ lub 12 jonów Cu+ (jony Cu2+ nie są wiązane przez MT). MT niezawierająca jonów Metalotioneiny i kadm a rak piersi 212 nosi nazwę apo-MT lub tioneiny. Cechuje ją nieuporządkowana struktura, wysoka niestabilność i podatność na utlenianie oraz proteolizę. Związanie jonów metali przez apo-MT powoduje wzrost stabilności termodynamicznej i oporności na trawienie proteolityczne, co w konsekwencji prowadzi do akumulacji metali związanych przez MT [18, 20, 22-24]. Charakterystyka poszczególnych izoform metalotionein Metalotioneiny MT-1 i MT-2 MT-1 i MT-2 ulegają ekspresji we wszystkich tkankach ssaków, przy czym najwyższe ich stężenie obserwuje się w hepatocytach [3, 25]. Wysoki poziom ekspresji MT-1 i MT-2 charakterystyczny jest również dla komórek nerki, trzustki i jelita [26]. Wysokie stężenie tych białek w wątrobie sugerować może, iż główną funkcją MT-1 i MT-A2 jest detoksykacja metali ciężkich (zwłaszcza Cd), utrzymanie homeostazy cynku i miedzi oraz ograniczenie uszkodzeń oksydacyjnych [27]. MT-2A wykazuje wyższy poziom ekspresji niż MT-1 w tkankach ludzkich [20]. Stężenie MT-1 i MT-2A wzrasta w czasie proliferacji i różnicowania komórek, co może być związane ze wzrostem zapotrzebowania na cynk, który jest niezbędnym składnikiem enzymów i czynników transkrypcyjnych, kluczowych dla tych procesów. Metalotioneiny są białkami cytoplazmatycznymi, jednakże w czasie proliferacji i różnicowania ulegają przejściowej translokacji do jądra komórkowego dostarczając cynk do miejsc zwiększonego zapotrzebowania [15, 20, 25, 27, 28]. Najwyższe stężenie MT-1 i MT-2A w jądrze komórkowym występuje w późnej fazie G1 oraz w fazie S [29]. Ekspresja MT-1 i MT-2A, w przeciwieństwie do ekspresji dwóch pozostałych lizoform, tj. MT-3 i MT-4, indukowana jest przez wiele czynników E. Forma, M. Bryś 213 chemicznych i fizycznych, w tym przez metale, stres oksydacyjny, hormony (głównie glukortykoidy), cytokiny oraz promieniowanie [19, 25, 30, 31]. Metalotioneina MT-3 Izoforma MT-3 po raz pierwszy została zidentyfikowana jako czynnik hamujący wzrost komórek nerwowych (GIF, ang. growth inhibitory factor). W wyniku dalszych badań czynnik GIF zaliczono do rodziny metalotionein jako izoformę MT-3 [3, 32]. Ekspresję tego białka obserwuje się przede wszystkim w neuronach i astrocytach mózgu, szczególnie w korze mózgu, hipokampie oraz ciele migdałowatym [2]. Obniżony poziom ekspresji MT-3 neuronach mózgu występuje u osób cierpiących na chorobę Alzheimera 3, 14]. Bardzo niski poziom ekspresji MT-3 charakterystyczny jest dla komórek trzustki, jelita, żołądka, serca i nerki. [20, 25, 32, 33]. Jak wykazały badania prowadzone na myszach transgenicznych przez Quaife i wsp. [34] nadekspresja MT-3 w tkankach zlokalizowanych poza ośrodkowym układem nerwowym wywołuje efekt letalny w wyniku atrofii trzustki. MT-3 uważana jest za niespecyficzny inhibitor procesu proliferacji [14, 35]. Metalotioneina MT-4 Izoforma MT-4 jest najpóźniej odkrytym białkiem zaliczanym do metalotionein i najmniej poznanym. MT-4 ulega ekspresji w nabłonku wielowarstwowym płaskim, gdzie prawdopodobnie pełni funkcje w regulacji stężenia jonów cynku w czasie procesu różnicowania się komórek [14, 15, 27, 32, 36]. Ekspresję MT-4 zaobserwowano w komórkach błony śluzowej jamy ustnej, języka i nosogardzieli, górnej części żołądka oraz w skórze [2, 27]. Metalotioneiny i kadm a rak piersi 214 Funkcje metalotionein Zasadniczą funkcją metalotionein, wynikającą z ich budowy, jest utrzymywanie homeostazy jonów metali niezbędnych dla prawidłowego metabolizmu, detoksykacja ustroju z metali toksycznych oraz ochrona przed uszkodzeniami oksydacyjnymi [1, 19, 25]. Udział metalotionein w homeostazie cynku Cynk odgrywa ważną rolę w metabolizmie i jest niezbędny dla prawidłowego funkcjonowania organizmu człowieka [33]. Cynk jest kofaktorem ponad 300 enzymów, w tym dehydrogenazy mleczanowej, fosfatazy zasadowej, anhydrazy węglanowej, dysmutazy ponadtlenkowej i dehydrogenazy alkoholowej. Bierze on udział w tworzeniu motywu palca cynkowego (ZF, ang. zinc finger motif), który występuje w białkach wiążących się z DNA, w tym w czynnikach transkrypcyjnych oraz receptorach dla hormonów sterydowych, hormonów tarczycy, kalcytriolu i retinoidów, które po związaniu ligandu pełnią funkcje czynników transkrypcyjnych [4, 23, 27, 37-39]. Najwyższe stężenie cynku występuje w wątrobie, nerce, siatkówce, prostacie i mięśniach [4, 40]. Głównymi wewnątrzkomórkowymi białkami wiążącymi cynk są metalotioneiny, które pełnią ważną funkcję w regulacji pobierania, dystrybucji, magazynowania i uwalniania Zn [3, 4, 33]. W utrzymaniu homeostazy Zn2+ bierze udział układ metalotioneina/tioneina. Wzrost dostępności cynku indukuje syntezę tioneiny i prowadzi do formowania metalotioneiny. Cynk uwalniany jest z MT wówczas, gdy obniża się stężenie wolnego Zn [4, 23, 27]. Uwalnianie cynku z MT może zachodzić na drodze utleniania grup tiolowych reszt cysteiny. W procesie tym ważną rolę pełni glutation. Układ zredukowany/utleniony glutation (GSH/GSSG) moduluje uwalnianie cynku z Zn7-MT w zależności od stężenia E. Forma, M. Bryś 215 Zn i statusu redoks [19, 23, 27, 38, 41]. Liczne badania in vitro wykazały, że układ metalotioneina/tioneina poprzez uwalnianie lub wiązanie Zn2+ wpływa na aktywność białek zależnych od cynku i może modulować zdolność wiązania się czynników transkrypcyjnych, zawierających motyw palca cynkowego, z DNA [33, 41, 42]. Wiązanie jonów cynku przez tioneinę prowadzi również do aktywacji enzymów, których aktywność hamowana jest przez ten metal [41, 42]. Wiązanie kadmu przez metalotioneiny Metalotioneiny uczestniczą w detoksykacji metali ciężkich dzięki zdolności wiązania różnych metali, w tym toksycznych metali ciężkich, do których zaliczamy kadm i rtęć. MT wykazują wyższe powinowactwo do metali takich jak Cd i Hg niż do Zn. Dzięki temu metale ciężkie zatrzymywane są we wnętrzu cząsteczek tych białek, co chroni komórkę przed ich toksycznym działaniem [2-4, 25, 35, 43]. Kadm jest metalem toksycznym występującym w środowisku naturalnym w glebie, w wodzie i powietrzu. Do organizmu kadm dostaje się wraz z pożywieniem, dymem tytoniowym i zanieczyszczonym powietrzem. Również wykonywanie pewnych zawodów wiąże się z narażeniem na wyższe stężenia Cd w miejscu pracy [5, 6, 44-49]. W 1993 roku Cd został uznany za związek karcynogenny dla ludzi [45, 46, 50-53]. Kadm charakteryzuje się bardzo długim okresem biologicznego półtrwania ocenianym u ludzi na 10 – 30 lat [50, 54, 55]. W następstwie długotrwałej ekspozycji na kadm, metal ten gromadzi się w organizmie - głównie w wątrobie i nerkach. Nerki są najważniejszym narządem docelowego działania kadmu. W komórkach cewek nerkowych kadm gromadzi się w postaci związanej z metalotioneiną, a po przekroczeniu tzw. stężenia krytycznego powoduje dysfunkcje cewek nerkowych, a następnie zwłóknienie śródmiąższowe nerek [48, 55, 56]. Kadm Metalotioneiny i kadm a rak piersi 216 wpływa na proliferację, różnicowanie się komórek, apoptozę oraz inne procesy komórkowe. Zaburzenia tych mechanizmów są bezpośrednio zaangażowane w proces karcynogenezy [7, 50]. Liczne badania wykazały wpływ kadmu na rozwój raka płuc, prostaty, nerki, wątroby i żołądka. [50, 53, 57]. Ponieważ kadm cechuje wyższe powinowactwo do metalotionein niż cynk dlatego też wypiera cynk z tych białek [2, 4, 18, 20]. W konsekwencji prowadzi to do zaburzenia homeostazy cynku, co wpływa niekorzystnie na proces transkrypcji, proliferacji i różnicowania komórek [5, 6, 30, 39, 50, 58] Regulacja ekspresji genów metalotionein Ekspresja najlepiej poznanych MT-1 i MT-2 jest indukowana przez liczne metale, cytokiny i hormony [20]. Wzrost stężenia MT-1 i MT-2 wiąże się z odpowiedzią na różnego typu czynniki stresowe pochodzenia wewnętrznego np. stany zapalne, jak i zewnętrznego np. ekspozycja na działanie metali ciężkich takich jak Cd [2, 25]. Struktura regionów regulatorowych genów MT-1 i MT-2 Rdzeń promotora genów MT-1 i MT-2 zawiera sekwencję TATA oraz region inicjatorowy, do których przyłącza się czynnik transkrypcyjny IID (TFIID, ang. preinicjacyjnego transcription factor uczestniczącego w IID) będący transkrypcji częścią [25]. kompleksu W regionie promotorowym znajdują się sekwencje odpowiedzi na: (1) glukokortykoidy (GRE; ang. glucocorticoid responsive element), (2) jony metali (MRE; ang. metal responsive element), (3) stres oksydacyjny (ARE; ang. antioxidant responsive element) oraz sekwencja aktywowana przez czynnik transkrypcyjny STAT (ang. signal transducers and activator of transcription). W komórkach E. Forma, M. Bryś 217 człowieka region promotorowy MT zawiera sześć sekwencji MRE [2, 25, 35]. W regionie promotorowym wszystkich genów MT znajduje się motyw bogaty w pary GC (GGGGCGGGG), z którym łączą się czynniki transkrypcyjne z rodziny Sp, w tym białko Sp1 (ang. specificity protein 1) [25]. Regulacja ekspresji genów MT-1 i MT-2 przez jony metali Geny MT-1 i MT-2 w przeciwieństwie do genów MT-3 i MT-4 są silnie indukowane w komórkach ssaków przez jony metali włączając w to Zn2+, Cd2+, Hg2+ i Cu+. Metale te wiążą się z MT. Nikiel i kobalt również zdolne są do indukcji transkrypcji MT jednakże nie wiążą się z tymi białkami [25, 59]. W regulacji ekspresji genów MT-1 i MT-2 przez metale ciężkie biorą udział sekwencje MRE, które są również konieczne do transkrypcji tych genów na poziomie podstawowym. Sekwencje MRE (CTNTGC(G/A)CNCGGCCC) obecne są w wielu kopiach w regionach promotorowych genów MT u ssaków. Z sekwencjami MRE oddziałuje zależny od cynku czynnik transkrypcyjny MTF-1 (ang. metal responsive transcription factor 1) [2, 25, 54, 60-64]. MTF-1 po raz pierwszy został opisany przez Westina i Schaffnera w 1988 roku jako białko wiążące się z sekwencją MRE, wymagające podwyższonego stężenia Zn do optymalnego wiązania się z DNA. Brak czynnika MTF-1 daje efekt letalny na poziomie rozwoju zarodkowego. Czynnik ten niezbędny jest do rozwoju wątroby w życiu płodowym oraz odpowiedzi na stres [25, 64-69]. Gen kodujący ludzki czynnik MTF-1 znajduje się na krótkim ramieniu chromosomu 1 (1p33) i koduje białko zbudowane z 753 aminokwasów. W N-końcowej części MTF-1 znajduje się sześć motywów palca cynkowego (ZF, ang zinc finger) typu Cys2-His2, które odpowiadają za wiązanie się z sekwencjami MRE. W C-końcowej części białka znajduje się domena transaktywacyjna obejmująca 218 Metalotioneiny i kadm a rak piersi region bogaty w aminokwasy kwaśne, region bogaty w reszty proliny oraz region bogaty w reszty seryny i treoniny. W N-końcowej części MTF-1, bezpośrednio przed motywami ZF znajduje się sekwencja lokalizacji jądrowej (NLS, ang. nuclear localization signal), uczestnicząca w translokacji czynnika MTF-1 z cytoplazmy do jądra komórkowego. W regionie bogatym w aminokwasy kwaśne zlokalizowany jest sygnał eksportu jądrowego (NES, ang. nuclear export signal) [25, 60, 65-68, 70]. W wyniku działania czynników stresowych takich jak hipoksja, stres oksydacyjny czy ekspozycja na działanie metali, MTF-1 ulega translokacji z cytoplazmy do jądra komórkowego, gdzie bierze udział w regulacji transkrypcji MT-1 i MT-2 poprzez bezpośrednie lub pośrednie oddziaływanie z czynnikami transkrypcyjnymi związanymi z RNA polimerazy II [25, 62, 68, 70, 71]. Wiązanie MTF-1 do MRE wymaga wysycenia cynkiem motywów palca cynkowego. Wysokie stężenie metali ciężkich (Cd, Hg) może powodować wypieranie cynku z wewnątrzkomórkowych białek odpowiadających za jego magazynowanie, w wyniku czego wzrasta pula wolnego cynku zdolnego do aktywacji MTF-1. Wolne jony Zn wiążą się z MTF-1 dzięki czemu wzrasta zdolność wiązania się tego czynnika z DNA, co z kolei prowadzi do aktywacji transkrypcji genów MT [25, 62, 65, 67, 72, 73]. Ekspresja metalotionein na poziomie podstawowym regulowana jest także przez czynnik transkrypcyjny Sp1, który zawiera trzy motywy palca cynkowego, a jego aktywność zależy od stężenia wolnych jonów Zn2+ [25]. Kadm silniej indukuje transkrypcję genów MT niż wynikałoby to ze wzrostu siły wiązania MTF-1 z DNA. Sugeruje to, że Cd aktywuje ekspresję MT przez mechanizmy niezależne od wzmocnienia oddziaływania MTF-1/DNA. Kadm ma wyższy potencjał oksydacyjny niż cynk i indukuje zjawisko stresu oksydacyjnego oraz spadek stężenia glutationu. Stres oksydacyjny wywołany E. Forma, M. Bryś 219 ekspozycją na Cd może powodować aktywację transkrypcji genów MT-1 i MT-2A bezpośrednio przez sekwencję ARE, na którą nachodzi sekwencja wiązania czynnika transkrypcyjnego USF (ang. upstream stimulatory factor). W warunkach stresu oksydacyjnego dochodzi do zwiększenia dostępności Zn w wyniku utlenienia grup tiolowych MT, co powoduje uwolnienie jonów tego metalu. Kadm wypiera Zn z MT zwiększając tym samym pulę dostępnego cynku zdolnego do wiązania się z motywami palca cynkowego MTF-1 [25, 41, 74, 75]. Oprócz Cd również jony Cu, Pb, Ag, Hg i Bi mogą wypierać Zn z MT [20]. Ważną rolę w regulacji ekspresji genów MT-1 i MT-2 odgrywa fosforylacja czynnika MTF-1 [61, 62, 70, 72]. W warunkach fizjologicznych MTF-1 ulega konstytutywnej fosforylacji na resztach seryny i treoniny [60, 65, 71, 73, 76]. Jony metali ciężkich, takie jak Zn i Cd, powodują wzrost poziomu fosforylacji MTF-1. W proces ten zaangażowane są kinaza białkowa C (PKC, ang. protein kinase C), kinaza białkowa fosforylyjąca N-koniec białka Jun (JNK, ang. Jun N-terminal kinase), 3-kinaza fosfatydyloinozytolu (PI3K, ang. phosphoinositol-3 kinase), kinaza tyrozynowa, II kinaza kazeiny (CK II, ang. casein kinase II) oraz szlak sygnałowy z udziałem jonów Ca2+ [25, 61, 62, 68, 77]. Analiza sekwencji MTF-1 wykazała obecność konserwatywnie zachowanych potencjalnych miejsc fosforylacji przez PKC, CK II, kinazę tyrozynową i JNK [62, 76, 78]. Indukcja ekspresji genów MT-1 i MT-2 przez metale obejmuje trzy zasadnicze etapy, tj. translokację MTF-1 z cytoplazmy do jądra komórkowego, związanie się MTF-1 z sekwencjami MRE oraz aktywację transkrypcji [62, 65]. Wyniki badań sugerują, że poziom fosforylacji MTF-1 może mieć wpływ na translokację tego czynnika transkrypcyjnego do jądra komórkowego oraz na aktywację transkrypcji genów, których ekspresja regulowana jest przez MTF-1. W wyniku ekspozycji komórek na działanie Cd2+ i Zn2+ dochodzi do nagromadzenia Metalotioneiny i kadm a rak piersi 220 ufosforylowanej formy MTF-1 w jądrze komórkowym. Zjawisko to może mieć związek z fosforylacją tyrozyny w pozycji 140 łańcucha polipeptydowego, która znajduje się za sekwencją NLS, obejmującą aminokwasy od 133 do 139 (KRKEVKR) [62, 70, 71]. Wzrost poziomu fosforylacji MTF-1 może odgrywać również ważną rolę w indukcji ekspresji genów MT-1 i MT-2 przez metale ciężkie. Potwierdzeniem roli fosforylacji w aktywacji transkrypcji genów przez MTF-1 są wyniki badań, których celem było określenie wpływu inhibitorów kinaz białkowych na poziom ekspresji MT-1 i MT-2. Zastosowanie inhibitorów PKC, II kinazy kazeiny i kinazy tyrozynowej prowadziło do zablokowania indukowanej cynkiem i kadmem transkrypcji genów MT-1 i MT-2. Inhibitory kinaz białkowych nie wpływały natomiast na wiązanie się MTF-1 z DNA. Sugeruje to, że wiązanie się białka MTF-1 z MRE jest konieczne, ale niewystarczające do aktywacji transkrypcji genów MT-1 i MT-2A [62, 71, 76]. Kadm poprzez stymulację aktywności licznych kinaz białkowych prowadzi do zaburzenia wielu szlaków transdukcji sygnałów. Wynikiem tych zmian może być wzrost aktywności czynników transkrypcyjnych i nieprawidłowa ekspresja wielu genów. Do czynników transkrypcyjnych, których aktywność wzrasta w wyniku fosforylacji indukowanej przez kadm należy między innymi MTF-1 [68, 73, 77]. Czynnik MTF-1 uczestniczy również w regulacji ekspresji ZnT1 (ang. zinc transporter 1), α-fetoproteiny, C/EBPα (ang. CCAAT-enhancer binding protein α), syntazy γ-glutamylocysteiny (γ-GCS, ang. γ-glutamylocystein synthase) oraz γ-glutamylotranspeptydazy [37, 65, 67, 69]. E. Forma, M. Bryś 221 Indukcja ekspresji genów MT-1 i MT-2 w wyniku stresu oksydacyjnego Indukcja ekspresji MT-1 i MT-2 w wyniku stresu oksydacyjnego zachodzi z udziałem sekwencji ARE (TGACNNNGC). Na sekwencję ARE nakłada się sekwencja odpowiedzialna za wiązanie się czynnika transkrypcyjnego USF, zwanego także MLTF (ang. adeno major late transcription factor). USF/MLTF jest białkiem wiążącym się z DNA dzięki obecności motywu heliks-pętla-heliks (HLH) [25, 59, 67, 79]. Występują trzy izoformy USF, tj. USF-1, USF-2a i USF-2b. USF-1 (42 kDa) i USF-2 (44 kDa) kodowane są przez odrębne geny. W wyniku alternatywnego składania pierwotnego transkryptu powstają dwie izoformy USF-2 (USF-2a i USF-2b) [75, 80]. Sekwencje ARE biorą udział w regulacji ekspresji genów związanych z odpowiedzią na stres oksydacyjny poprzez oddziaływanie z czynnikiem Nrf-2 (ang. NF-E2- related factor 2). Związanie Nrf-2 z sekwencją ARE powoduje ekspresję genów regulowanych przez tę sekwencję, w tym MT. Ekspresja tych genów ulega represji w wyniku przyłączenia białek Fos (ang. Finkel-Biskis-Jinkins murine osteosarcoma) i Fra-1 (ang. Fos-related antygen-1). Innymi genami, których transkrypcja regulowana jest przez sekwencję ARE jest gen podjednostki Ya S-transferazy glutationowej, gen UDP-glukuronylotransferazy oraz inne geny kodujące enzymy biorące udział w drugiej fazie detoksykacji ksenobiotyków [25, 59, 81]. Indukcja ekspresji genów MT-1 i MT-2 przez glukokortykoidy Receptory glukortykoidów (GR, ang. glucocorticoid hormone receptor) znajdują się na terenie cytoplazmy i związane są z białkami szoku cieplnego Hsp (ang. heat shock protein), które utrzymują GR w nieaktywnej formie. Glukokortykoidy przechodzą przez błonę komórkową i łączą się z nieaktywnymi monomerami GR, co powoduje odłączenie białek Hsp i Metalotioneiny i kadm a rak piersi 222 aktywację GR. Aktywowane monomery GR tworzą aktywne homodimery ulegające translokacji do jądra komórkowego, gdzie łączą się z sekwencjami GRE i aktywują transkrypcję. W ludzkich komórkach ekspresja MT-2A jest silniej indukowana przez glukokortykoidy niż MT-1 [2, 25]. Rola matolotionein i kadmu w rozwoju nowotworów Wpływ kadmu na regulację ekspresji genów i szlaki przekaźnictwa sygnałów w komórce Zaburzenia regulacji ekspresji genów stanowią podstawę procesu nowotworzenia. Jony kadmu indukują geny natychmiastowej odpowiedzi na mitogeny (IERG, ang. immediate early response gene), które kodują czynniki transkrypcyjne zaangażowane w proces proliferacji i różnicowania się komórek. Produkty białkowe genów IERG stymulują podziały komórek, a ich nadekspresja jest często obserwowana w wielu typach nowotworów [7, 49, 77]. Do genów IERG, których ekspresja indukowana jest przez kadm zalicza się komórkowe onkogeny Fos, Jun, Myc [7, 52, 61, 74]. Protoonkogeny Fos i Jun kodują białka tworzące czynnik transkrypcyjny AP-1 (ang. activating protein 1), który reguluje ekspresję wielu genów kontrolujących wzrost i różnicowanie się komórek [7, 53, 74, 82, 83]. Aktywacja protoonkogenów Jun i Fos przez kadm uważana jest za główny mechanizm transformacji nowotworowej indukowanej przez ten metal [7]. W wyniku ekspozycji na kadm dochodzi również do aktywacji innych czynników transkrypcyjnych takich jak MTF-1, USF, NF-κB (ang. nuclear factor κB), Nrf-2 i TFIIH (ang. transcription factor IIH) [7, 52, 61, 74]. E. Forma, M. Bryś 223 Jony kadmu indukują również ekspresję genów odpowiedzi na stres, do których zalicza się geny metalotionein i białek szoku cieplnego, białek biorących udział w odpowiedzi na stres oksydacyjny i kontrolujących syntezę glutationu [7, 44, 52]. Hsp to grupa zróżnicowanych białek o masie cząsteczkowej w granicach 25 – 110 kDa, odpowiadających za przeżycie komórki w warunkach stresu [7, 83]. Kadm powoduje powstawanie zdenaturowanych lub nieprawidłowo zwiniętych białek w wyniku zmiany ich struktury na drodze wiązania się z grupami tiolowymi lub poprzez podstawienie cynku. Pojawienie się w komórce białek o nieprawidłowej strukturze jest sygnałem prowadzącym do indukcji ekspresji białek Hsp [7]. Glutation oraz białka zawierające liczne grupy tiolowe odgrywają kluczową rolę w obronie komórki przed toksycznym działaniem kadmu [7, 49]. Kadm nie uczestniczy w reakcji Fentona, ponieważ w warunkach fizjologicznych nie jest ani donorem ani akceptorem elektronów, jednakże powoduje wzrost stężenia reaktywnych form tlenu (ROS, ang. reactive oxygen species) w sposób pośredni poprzez wpływ na system antyoksydacyjny komórki [7, 84]. Ważną rolę w usuwaniu ROS, powstających w wyniku działania kadmu, odgrywa peroksydaza glutationowa i reduktaza glutationowa, odpowiadające za cykl oksydoredukcyjny GSH. Jednakże kadm silnie hamuje aktywność peroksydazy glutationowej i innych enzymów, takich jak dysmutaza ponadtlenkowa i katalaza, które uczestniczą w usuwaniu wolnych rodników powstających w komórce w wyniku procesów fizjologicznych. Pod wpływem działania kadmu w komórce dochodzi do indukcji ekspresji genu γ-GCS oraz S-transferazy glutationowej. Enzymy te odpowiadają za syntezę glutationu, którego podwyższone stężenie umożliwia szybką i efektywną eliminację kadmu [6, 7, 44, 49, 74, 77]. Jony kadmu powodują również wzrost wewnątrzkomórkowego Metalotioneiny i kadm a rak piersi 224 stężenia Ca2+. Jony wapnia wpływają bezpośrednio na ekspresję wielu genów poprzez czynnik transkrypcyjny CREB (ang. cAMP-response element binding protein). Kadm może również pośrednio uczestniczyć w aktywacji kinaz białkowych, które poprzez fosforylację określonych czynników transkrypcyjnych powodują wzrost ich aktywności. Do kinaz tych zalicza się kinazę białkową C, kinazę tyrozynową, CK II oraz kinazy rodziny MAPK (ang. mitogen activated protein kinase), tj. kinazy ERK (ang. extracellular signal regulated kinase), JNK i p38 [7, 49, 74, 77, 83]. Kadm a apoptoza Apoptoza odgrywa istotną rolę w homeostazie komórkowej i embriogenezie. Prawidłowy przebieg tego procesu zapewnia właściwy wzrost i rozwój narządów oraz różnicowanie komórek. W wyniku apoptozy dochodzi również do eliminacji uszkodzonych i nieprawidłowych komórek [85, 86]. Apoptoza obejmuje szereg zmian morfologicznych, do których zaliczamy obkurczanie się komórek, kondensację powstawanie ciałek chromatyny, apoptotycznych fragmentację oraz jądra komórkowego, biochemicznych takich jak fragmentacja DNA, proteoliza białek strukturalnych i enzymatycznych [86-88]. Do inicjacji programowanej śmierci komórki może dojść w wyniku działania czynników uszkadzających DNA i zaburzających cykl komórkowy, aktywacji określonych receptorów błonowych, szoku cieplnego, stresu oksydacyjnego oraz promieniowania jonizującego [86]. Również jony kadmu mogą prowadzić do apoptozy [5, 7, 84, 89, 90]. Podatność na apoptozę indukowaną kadmem zależy od stężenia metalotionein, które wiążąc ten metal chronią komórkę przed jego toksycznym działaniem [90, 91]. W czasie apoptozy indukowanej jonami kadmu dochodzi do zwiększenia przepuszczalności błony mitochondrialnej, uwolnienia E. Forma, M. Bryś 225 cytochromu c oraz aktywacji prokaspazy 9. Kadm powoduje wzrost ekspresji proapoptotycznego białka Bad (ang. Bcl-2 antagonist of cell death), które powoduje niestabilność błony mitochondrialnej. Kadm zwiększa przepuszczalność błony mitochondrialnej w wyniku koordynacyjnego wiązania się z grupami tiolowymi białek budujących tę błonę oraz zaburza działanie łańcucha oddechowego, przez co wzrasta w komórce stężenie reaktywnych form tlenu. Antyoksydanty komórkowe, do których zaliczamy również MT chronią komórkę przed apoptozą indukowaną kadmem [7, 90, 92]. Zmiany zachodzące w czasie indukcji apoptozy przez kadm charakterystyczne są dla szlaku wewnętrznego, zwanego inaczej mitochondrialnym [85-87]. Ponadto, Aimola i wsp. [93] wykazali, że w komórkach nowotworowych prostaty kadm indukuje apoptozę zależną od białka p53. Kadm a naprawa uszkodzeń DNA Uszkodzenia DNA mogą powstawać w wyniku działania czynników egzogennych takich jak mutagenne związki chemiczne oraz promieniowanie jonizujące i UV. Endogennymi przyczynami uszkodzeń DNA są ROS powstające w łańcuchu oddechowym oraz błędy w procesie replikacji. Uszkodzenia te jeżeli nie zostaną usunięte powodują powstawanie mutacji, które mogą być przyczyną rozwoju nowotworu [7]. W każdej komórce istnieje szereg mechanizmów naprawy DNA, których zadaniem jest zachowanie integralności genomu. Kadm może przyczyniać się do wzrostu częstości powstawania mutacji poprzez hamowanie systemów naprawy DNA [7, 49, 53, 94]. Metal ten uniemożliwia rozpoznanie uszkodzeń DNA usuwanych za pomocą systemu NER (ang. nucleotide excision repair) poprzez wiązanie się z białkiem XPA (ang. xeroderma pigmentosum, complementation group A) odpowiedzialnym za Metalotioneiny i kadm a rak piersi 226 ten etap [7, 95, 96]. W wyniku utlenienia dGTP powstaje 8-okso-dGTP, którego obecność w DNA jest przyczyną transwersji AT→ CG w czasie replikacji. Kadm może prowadzić do wzrostu liczby mutacji i rozwoju nowotworu poprzez hamowanie aktywność 8-okso-dGTPazy, odpowiadającej za usuwanie 8-oksodGTP z DNA. [7, 49]. Hamowanie metylacji DNA przez kadm Metylacja wysp CpG jest procesem epigenetycznym prowadzącym do wyciszenia ekspresji określonych genów. Enzymem katalizującym metylację cytozyny w pozycji 5’ jest metylotransferaza DNA [25, 97, 98]. Kadm powoduje spadek aktywności tego enzymu, co prowadzi do obniżenia poziomu metylacji DNA i nadekspresji protoonkogenów. Aktywacja onkogenów komórkowych jest jednym z podstawowych mechanizmów transformacji nowotworowej [7, 49]. Wpływ kadmu na adhezję międzykomórkową E-kadheryna jest charakterystyczną dla komórek epitelialnych transbłonową glikoproteiną wiążącą jony wapnia i odpowiadającą za adhezję międzykomórkową. Domena wewnątrzkomórkowa E-kadheryny wiąże się z kateniną β, która oddziałuje z cytoszkieletem aktynowym. Część zewnątrzkomórkowa E-kadheryny zawiera miejsca wiązania jonów wapnia, które są niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania tego białka oraz domeny odpowiedzialne za oddziaływanie kadheryna-kadheryna w przylegających komórkach [7, 99]. Jony Ca2+ w domenie zewnątrzkomórkowej mogą być wypierane przez Cd2+. W wyniku tego dochodzi do zmiany konformacji tej domeny i zaburzenia adhezji międzykomórkowej. Osłabienie przylegania komórek ułatwia proces przerzutowania nowotworu. Zmiana konformacji E. Forma, M. Bryś 227 E-kadheryny w wyniku wyparcia jonów wapnia prowadzi również do odłączenia kateniny β od cytoszkieletu i jej translokację do jądra komórkowego, gdzie łącząc się z czynnikami transkrypcyjnymi wpływa na ekspresję protoonkogenów takich jak Jun i Myc. Zaburzenie ekspresji onkogenów komórkowych w wyniku uwolnienia kateniny β z kompleksów z E-kadheryny może stanowić ważny krok w procesie nowotworzenia [7, 100-104]. Udział kadmu i metalotionein w regulacji aktywności czynników transkrypcyjnych Rola motywów palca cynkowego i jonów cynku w procesie karcynogenezy Motyw palca cynkowego występuje w wielu grupach białek, do których zalicza się czynniki transkrypcyjne oraz białka systemów naprawy uszkodzeń DNA. Palce cynkowe stanowią domeny białkowe składające się najczęściej z 30 – 40 aminokwasów, a przestrzenna struktura tych domen utrzymywana jest przez koordynacyjne wiązanie cynku przez grupy tiolowe cystein i/lub pierścienie imidazolowe histydyn. Cynk nie oddziałują bezpośrednio z DNA, ale jest niezbędny dla utrzymania prawidłowej konformacji motywów ZF [96]. Struktura palców cynkowych może zostać zaburzona w wyniku podstawienia cynku przez kadm, który tworzy wysoce stabilne wiązania z grupami tiolowymi wchodzącymi w skład tych domen. Konsekwencją tego jest utrata zdolności wiązania się białek zawierających palce cynkowe z DNA i zaburzenia ekspresji genów i naprawy uszkodzeń DNA [89, 96]. Ważnym czynnikiem wpływającym na aktywność białek zawierających motyw ZF jest deficyt jonów cynku. W przypadku niedoboru tego pierwiastka obserwuje się wzrost częstości uszkodzeń DNA oraz ryzyka rozwoju nowotworu w wyniku działania związków karcynogennych [39]. Objawy niedoboru Zn w komórce niekoniecznie wynikają Metalotioneiny i kadm a rak piersi 228 z braku tego metalu w diecie, ale mogą być związane z nadekspresją MT, która powoduje obniżenie stężenia wolnych jonów cynku poprzez silne ich wiązanie [105]. Regulacja aktywności białka p53 przez kadm i metalotioneiny Białko p53, będące produktem genu supresorowego, uczestniczy w odpowiedzi komórki na uszkodzenia DNA, hipoksję, stres oksydacyjny i aktywację onkogenów [106-108]. Białko p53 nazywane jest „strażnikiem genomu” ponieważ główną jego funkcją jest zachowanie integralności genomu. Jeżeli uszkodzenia DNA powstające w wyniku działania czynników stresowych są możliwe do usunięcia przez komórkę, to białko p53 prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego w fazie G1 lub G2 dając tym samym komórce czas na naprawę DNA. W przeciwnym wypadku białko p53 kieruje komórkę na drogę apoptozy [39, 106, 108-111]. Białko p53 jest czynnikiem transkrypcyjnym odgrywającym istotną rolę w regulacji cyklu komórkowego, naprawie uszkodzeń DNA oraz apoptozie [39, 112-115]. Białko p53 pełni funkcję inhibitora proliferacji komórek poprzez nasilenie ekspresji genów regulujących cykl komórkowy, np. genu p21, którego produkt jest inhibitorem kinaz zależnych od cyklin – CDK (ang. cyclin-dependent kinases) i decyduje o zatrzymaniu cyklu komórkowego w punkcie kontrolnym G1/S [107, 109, 115-118]. Białko p21 prowadzi do zahamowania replikacji oraz wpływa na naprawę uszkodzeń DNA w wyniku oddziaływania z białkiem PCNA (ang. proliferating cell nuclear antigen), które jest ważnym czynnikiem biorącym udział w systemach naprawy DNA poprzez wycinanie nukleotydów i zasad azotowych. [115, 117]. Ekspozycja komórek na działanie kadmu prowadzi do nasilenia ekspresji białka p53, a co za tym idzie również białka p21. E. Forma, M. Bryś 229 W wyniku wzrostu stężenia białka p21 dochodzi do obniżenia ekspresji CDK1, CDK2 oraz cykliny A i B, a tym samym do zatrzymania cyklu komórkowego w punkcie kontrolnym G2/M [116; 118, 119]. Białko p53 indukuje również ekspresję białka GADD45 (ang. growth arrest and DNA damage 45) odpowiedzialnego za zahamowanie wzrostu komórki i odpowiedź na uszkodzenia DNA w punkcie kontrolnym G2/M. Kolejnymi białkami, których ekspresja zależy od białka p53 jest białko 14-3-3σ, uczestniczące w transdukcji sygnału prowadzącego do zatrzymania cyklu komórkowego w czasie przejścia komórki z fazy G2 do M oraz szereg białek proapoptotycznych, do których zalicza się białko Bax (ang. Bcl-2- associated x protein) regulujące przepuszczalność błony mitochondrialnej oraz receptor śmierci – Fas [29, 119]. Cynk ma zasadnicze znaczenie dla utrzymania prawidłowej konformacji i stabilności białka p53. Jony tego metalu wpływają również na powinowactwo p53 do specyficznych sekwencji DNA oraz na aktywność transkrypcyjną tego białka [29, 107, 108, 113, 120, 121]. Niedobór Zn może prowadzić do powstania uszkodzeń DNA indukujących ekspresję p53. Jednakże zbyt niski poziom cynku może prowadzić do nieprawidłowego formowania motywów ZF białka p53, co znacznie obniża zdolność wiązania się tego białka z DNA i prowadzi do zaburzeń ekspresji genów niezbędnych do naprawy powstałych uszkodzeń DNA. Badania prowadzone przez Méplan i wsp. [122] wykazały, że ekspozycja komórek na działanie kadmu prowadzi do zaburzenia prawidłowej struktury białka p53 i zahamowania jego wiązania z DNA. Inaktywacja p53 jest wynikiem podstawienia cynku przez kadm [29, 39, 58, 112]. Zahamowanie aktywności białka p53 przez kadm może odgrywać kluczową rolę w procesie nowotworzenia z udziałem tego metalu [122]. Do deficytu cynku w komórce może dochodzić na skutek nadekspresji apo-MT wywołanej stresem Metalotioneiny i kadm a rak piersi 230 oksydacyjnym i działaniem metali ciężkich [97, 113, 123]. Apo-MT-1 wiąże się z białkiem p53, co uniemożliwia wiązanie się tego ostatniego z DNA oraz chroni tioneinę przed degradacją. Apo-MT wiąże się za pomocą grup tiolowych z cynkiem obecnym w cząsteczce p53. Tioneina, poprzez chelatowanie Zn2+, hamuje również aktywność innych czynników transkrypcyjnych takich jak TFIIA (ang. transcription factor IIA) i Sp1. Istnieją również doniesienia o bezpośrednim oddziaływaniu apo-MT z motywami palca cynkowego TFIIA [113]. Utrata funkcji białka p53 (w wyniku mutacji lub niedoboru cynku) prowadzi do niestabilności genetycznej, wzrostu aktywności proliferacyjnej komórki, braku kontroli cyklu komórkowego w punkcie kontrolnym G1/S oraz oporności na apoptozę [115]. Regulacja aktywności czynnika NF-κB przez metalotioneiny NF-κB/Rel (ang. nuclear factor κB/ viral oncogene v-rel homolog reticuloendotheliosis) jest to rodzina dimerycznych czynników transkrypcyjnych, charakteryzujących się obecnością homologicznej domeny Rel (RHD, ang. Rel homology domain). Domena RHD składa się z około 300 aminokwasów. W jej obrębie znajduje się miejsce wiązania się z DNA, sekwencja odpowiedzialna za dimeryzację, sygnał lokalizacji jądrowej oraz miejsce wiązania inhibitora IκB (ang. inhibitor κB) [124-126]. Klasyczny czynnik NF-κB jest heterodimerem składającym się z podjednostki p65 i p50 [125-127]. Czynnik jądrowy κB występuje w cytoplazmie w formie nieaktywnego kompleksu ze specyficznym białkiem inhibitorowym określanym jako IκB. Aktywacja NF-κB zachodzi w wyniku fosforylacji i ubikwitynozależnej degradacji IκB. Aktywny dimer p65/p50 ulega translokacji do jądra komórkowego, gdzie wiąże się z sekwencjami κB w DNA [30, 74, 126]. E. Forma, M. Bryś 231 Czynnikami aktywującymi NF-κB są między innymi czynnik martwicy nowotworu (TNFα, ang. tumor necrosis factor α), promieniowanie, chemioterapeutyki, erytropoetyna, interleukina 1 [124-126].Czynnik NF-κB chroni komórkę przed apoptozą oraz pełni ważną rolę w kontroli proliferacji komórek i onkogenezie [30, 74, 126, 127]. Obok aktywności antyapoptotycznej czynnik NF-κB wykazuje również działanie proapoptyczne poprzez nasilanie ekspresji p53 [128]. Zaburzenia procesu aktywacji NF-κB w wyniku destabilizacji IκB zaobserwowano we wczesnych etapach transformacji nowotworowej. Białko NF-κB uczestniczy w przekazywaniu sygnałów indukujących proliferację komórek. Czynnik ten bezpośrednio aktywuje protoonkogen myc. Interleukiny i czynniki wzrostu wpływają na podziały komórek poprzez aktywację NF-κB [126]. Opisywany czynnik transkrypcyjny stymuluje proliferację komórek poprzez indukcję ekspresji genu cykliny D1 [124]. Ważnymi regulatorami aktywności NF-κB są jony cynku i metalotioneiny. Badania prowadzone przez Kim i wsp. [30] wykazały, że wysokie stężenie Zn2+ hamuje wiązanie się NF-κB z DNA. Wzrost ekspresji MT wywołuje spadek stężenia Zn, co prowadzi do przywrócenia zdolności wiązania się NF-κB z DNA. Czynniki indukujące ekspresję MT przyczyniają się do aktywacji NF-κB, a co za tym idzie do stymulacji proliferacji komórek i hamowania apoptozy. MT wiąże się z podjednostką p50 i ulega translokacji do jądra komórkowego w połączeniu z aktywnym czynnikiem NF-κB. MT stabilizuje wiązanie czynnika jądrowego κB z odpowiednimi sekwencjami DNA [30, 33, 78, 113]. Czynniki wpływające na poziom wolnych jonów cynku i ekspresję metalotionein pośrednio uczestniczą w regulacji aktywności transkrypcyjnej NF-κB [105]. Do czynników 232 Metalotioneiny i kadm a rak piersi tych zaliczamy jony kadmu, reaktywne formy tlenu i azotu powstające w warunkach stresu oksydacyjnego [25, 35]. Metalotioneiny a nowotwory piersi Spośród siedmiu funkcjonalnych izoform MT-1 w komórkach nowotworów piersi wykryto mRNA dla MT-1A, MT-1E, MT-1F, MT-1G, MT-1H i MT-1X. W guzach piersi ekspresji nie ulega MT-1B. Jednakże spośród wyżej wymienionych izoform metalotionein najwyższe stężenie osiągały MT-1E i MT-1F i te białka uznaje się za charakterystyczne dla przewodowego raka piersi [15, 21, 58, 129, 130]. Ekspresja MT-1E jest negatywnie skorelowana z obecnością receptora estrogenowego (ER, ang. estrogen receptor). Stężenie mRNA MT-1E w komórkach nowotworowych charakteryzujących się brakiem funkcjonalnego receptora estrogenowego jest wyższe niż w komórkach z prawidłowym ER [15, 58, 131, 132]. Ekspresja receptora estrogenowego jest ważnym czynnikiem prognostycznym w nowotworach piersi. Brak prawidłowo funkcjonującego receptora dla estrogenów świadczy o złym rokowaniu i oporności na terapię hormonalną. Estrogeny odgrywają istotną rolę w prawidłowym rozwoju piersi oraz wpływają na rozwój raka piersi [131, 133]. Aktywne receptory estrogenowe pełnią funkcję czynników transkrypcyjnych regulujących ekspresję genów mających wpływ na wzrost i proliferację komórek [131, 133, 134]. Przyjmuje się, że w przypadku ekspresji nieprawidłowego receptora estrogenowego, jego funkcje w regulacji proliferacji komórki przejmuje MT-1E. Stąd może wynikać podwyższona ekspresja tej izoformy w nowotworach piersi posiadających zmutowany ER [131]. MT-1F obok MT-2 jest główną izoformą wpływająca na proliferację komórek przewodowego raka piersi [15, 58]. Znacząco wyższy poziom ekspresji MT-1F charakterystyczny jest dla nowotworów o większej złośliwości histologicznej. Sugeruje to, że MT-1F E. Forma, M. Bryś 233 wpływa na procesy różnicowania się komórek w przewodowym raku piersi. Wysoki poziom ekspresji MT-1F w komórkach nowotworowych wskazuje na gorsze rokowanie [130]. MT-2A osiąga najwyższe stężenie spośród wszystkich izoform MT ulegających ekspresji w nowotworach piersi [15, 21, 58]. Poziom ekspresji MT-2 jest pozytywnie skorelowany z aktywnością proliferacyjną komórek. Wykazano, że nadekspresja MT-2A powoduje dwukrotny wzrost liczby podziałów komórkowych, podczas gdy w przypadku nadekspresji MT-1E i MT-3 nie obserwowano takiego efektu [21]. Potwierdzeniem wpływu MT-2A na proliferację komórek jest korelacja między poziomem ekspresji tej izoformy metalotionein a ekspresją Ki-67, markera proliferacji [123]. Zarówno stężenie MT-2A jak i mRNA dla tej izoformy jest wyższe w nowotworach bardziej zaawansowanych niż w nowotworach w niższych stadiach rozwoju. Silna korelacja między ekspresją MT-2A a aktywnością proliferacyjną nowotworów piersi wskazuje na potencjalne znaczenie tej izoformy w procesie karcynogenezy [123]. Wojnar i wsp. [135] wykazali wyższy poziom ekspresji MT-1 i MT-2A w rakach piersi w najwyższym stopniu zaawansowania w porównaniu do pozostałych nowotworów. Ponadto ekspresja MT-1 i MT-2 była pozytywnie skorelowana z ekspresją markerów proliferacji takich jak Ki-67 i MCM-2 [135, 136]. Na ryzyko zachorowania na raka piersi wydają się mieć również wpływ polimorfizmy pojedynczych nukleotydów stwierdzone w genach metalotionein [137]. MT-4 nie ulega ekspresji ani w prawidłowych ani w nowotworowych komórkach raka piersi. Natomiast około 90% przypadków raka piersi wykazuje ekspresję MT-3, której nie obserwuje się w tkance prawidłowej [123, 138]. Obecność MT-3 w komórkach guza świadczy o złym rokowaniu [15, 58, 138]. Nadekspresja tego białka jest przyczyną wysokiego stężenia apo-MT, co prowadzi do niedoboru cynku i zaburzenia fundamentalnych procesów komórkowych [15]. Metalotioneiny i kadm a rak piersi 234 Podsumowanie Metalotioneiny to grupa powszechnie występujących białek, które uczestniczą w utrzymaniu homeostazy jonów metali ciężkich głównie cynku i kadmu, ochronie przed ich toksycznym działaniem oraz ochronie przed stresem oksydacyjnym. Zmiany ekspresji metalotionein oraz akumulacja jonów kadmu mogą prowadzić do zaburzenia wielu procesów komórkowych, takich jak proliferacja komórek, apoptoza, transmisja sygnału, odpowiedź na stres oksydacyjny, a tym samym przyczyniać się do rozwoju nowotworów, w tym raka piersi. Praca finansowana w ramach Grantu Prezydenta Miasta Łodzi na realizację pracy magisterskiej o Łodzi dla Ewy Formy na projekt pt.: „Udział kadmu i polimorfizmu genu metalotioneiny w nowotworzeniu piersi kobiet z Łodzi i regionu łódzkiego” Piśmiennictwo 1. 2. 3. 4. 5. Arriaga JM, Levy EM, Bravo AI, Bayo SM, Amat M, Aris M i wsp. Metallothionein expression in colorectal cancer: relevance of different isoforms for tumor progression and patient survival. Hum Pathol. 2012; 43: 197-208. Sabolic I, Breljak D, Skarica M, Herak-Kramberger CM. Role of metallothionein in cadmium traffic and toxicity in kidneys and other mammalian organs. Biometals. 2010; 23: 897-926. Babula P, Masarik M, Adam V, Eckschlager T, Stiborova M, Trnkova L i wsp. Mammalian metallothioneins: properties and functions. Metallomics. 2012; 4: 739-750. Chasapis CT, Loutsidou AC, Spiliopoulou CA, Stefanidou ME. Zinc and human health: an update. Arch Toxicol. 2012; 86: 521-534. Hartwig A. Mechanisms in cadmium-induced carcinogenicity: recent insights. Biometals. 2010; 23: 951-960. E. Forma, M. Bryś 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 235 Joseph P. Mechanisms of cadmium carcinogenesis. Toxicol Appl Pharmacol. 2009; 238: 272-279. Waisberg M, Joseph P, Hale B, Beyersmann D. Molecular and cellular mechanisms of cadmium carcinogenesis. Toxicology. 2003; 192: 95-117. Werynska B, Pula B, Muszczynska-Bernhard B, Gomulkiewicz A, Piotrowska A, Prus R i wsp. Metallothionein 1F and 2A overexpression predicts poor outcome of non-small cell lung cancer patients. Exp Mol Pathol. 2012; 94: 301-308. Forma E, Krzeslak A, Wilkosz J, Jozwiak P, Szymczyk A, Rozanski W i wsp. Metallothionein 2A genetic polymorphisms and risk of prostate cancer in a Polish population. Cancer Genet. 2012; 205: 432-435. Gumulec J, Masarik M, Krizkova S, Hlavna M, Babula P, Hrabec R i wsp. Evaluation of alpha-methylacyl-CoA racemase, metallothionein and prostate specific antigen as prostate cancer prognostic markers. Neoplasma. 2012; 59: 191-201. Yan DW, Fan JW, Yu ZH, Li MX, Wen YG, Li DW, Zhou CZ, Wang XL, Wang Q, Tang HM, Peng ZH. Downregulation of metallothionein 1F, a putative oncosuppressor, by loss of heterozygosity in colon cancer tissue. Biochim Biophys Acta. 2012; 1822: 918-926. Schöpfer J, Drasch G, Schrauzer GN. Selenium and cadmium levels and ratios in prostates, livers, and kidneys of nonsmokers and smokers. Biol Trace Elem Res. 2010; 134: 180-187. Sakamoto LH, DE Camargo B, Cajaiba M, Soares FA, Vettore AL. MT1G hypermethylation: a potential prognostic marker for hepatoblastoma. Pediatr Res. 2010; 67: 387-393. Vašák M, Meloni G. Chemistry and biology of mammalian metallothioneins. J Biol Inorg Chem. 2011; 16: 1067-1078. Cherian MG, Jayasurya A, Bay BH. Metallothioneins in human tumors and potential roles in carcinogenesis. Mutat Res. 2003; 533: 201-209. Palacios O, Atrian S, Capdevila M. Zn- and Cu-thioneins: a functional classification for metallothioneins? J Biol Inorg Chem. 2011; 16: 991-1009. Cai B, Zheng Q, Teng XC, Chen D, Wang Y, Wang KQ i wsp. The role of Thr5 in human neuron growth inhibitory factor. J Biol Inorg Chem. 2006; 11: 476-482. Romero-Isart N, Vašák M. Advances in the structure and chemistry of metallothioneins. J Inorg Biochem. 2002; 88: 388-396. Vašák M. Advances in metallothionein structure and functions. J Trace Elem Med. Biol. 2005; 19: 13-17. 236 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. Metalotioneiny i kadm a rak piersi Coyle P, Philcox JC, Carey LC, Rofe AM. Metallothionein: the multipurpose protein. Cell Mol Life Sci. 2002; 59: 627-647. Jin R, Huang J, Tan PH, Bay BH. Clinicopathological significance of metallothioneins in breast cancer. Pathol Oncol Res. 2004; 10: 74-79. Sutherland DE, Summers KL, Stillman MJ. Noncooperative metalation of metallothionein 1a and its isolated domains with zinc. Biochemistry. 2012; 51: 6690-700. Maret W. The function of zinc metallothionein: a link between cellular zinc and redox state. J Nutr. 2000; 130(5S Suppl): 1455-1458 Rigby KE, Stillman MJ. Structural studies of metal-free metallothionein. Biochem Biophys Res Commun. 2004; 325: 1271-1278. Haq F, Mahoney M, Koropatnick J. Signaling events for metallothionein induction. Mutat Res. 2003; 533: 211-226. Davis SR, Cousins RJ. Metallothionein expression in animals: a physiological perspective on function. J Nutr. 2000; 130: 1085-1088. Tapiero H, Tew KD. Trace elements in human physiology and pathology: zinc and metallothioneins. Biomed Pharmacother. 2003; 57: 399-411. Jayasurya A, Bay BH, Yap WM, Tan NG, Tan BK. Proliferative potential in nasopharyngeal carcinoma: correlations with metallothionein expression and tissue zinc levels. Carcinogenesis. 2000; 21: 1809-1812. Méplan C, Richard MJ, Hainaut P. Metalloregulation of the tumor suppressor protein p53: zinc mediates the renaturation of p53 after exposure to metal chelators in vitro and in intact cells. Oncogene. 2000; 19: 5227-5236. Kim CH, Kim JH, Lee J, Ahn YS. Zinc-induced NF-kappaB inhibition can be modulated by changes in the intracellular metallothionein level. Toxicol Appl Pharmacol. 2003; 190: 189-196. Tanji K, Irie Y, Uchida Y, Mori F, Satoh K, Mizushima Y i wsp. Expression of metallothionein-III induced by hypoxia attenuates hypoxia-induced cell death in vitro. Brain Res. 2003; 976: 125-129. Thirumoorthy N, Shyam Sunder A, Manisenthil Kumar K, Senthil Kumar M, Ganesh G, Chatterjee M. A review of metallothionein isoforms and their role in pathophysiology. World J Surg Oncol. 2011; 9: 54. Vasák M, Hasler DW. Metallothioneins: new functional and structural insights. Curr Opin Chem Biol. 2000; 4: 177-183. Quaife CJ, Kelly EJ, Masters BA, Brinster RL, Palmiter RD. Ectopic expression of metallothionein-III causes pancreatic acinar cell necrosis in transgenic mice. Toxicol Appl Pharmacol. 1998; 148: 148-157. E. Forma, M. Bryś 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 237 Sato M, Kondoh M. Recent studies on metallothionein: protection against toxicity of heavy metals and oxygen free radicals. Tohoku J Exp Med. 2002; 196: 9-22. Quaife CJ, Findley SD, Erickson JC, Froelick GJ, Kelly EJ, Zambrowicz BP i wsp. Induction of a new metallothionein isoform (MT-IV) occurs during differentiation of stratified squamous epithelia. Biochemistry. 1994; 33: 7250-7259. Eide DJ. Zinc transporters and the cellular trafficking of zinc. Biochim Biophys Acta. 2006; 1763: 711-722. Giles NM, Watts AB, Giles GI, Fry FH, Littlechild JA, Jacob C. Metal and redox modulation of cysteine protein function. Chem Biol. 2003; 10: 677-693. Ho E. Zinc deficiency, DNA damage and cancer risk. J Nutr Biochem. 2004; 15: 572-578. Bryś M, Nawrocka AD, Miekoś E, Zydek C, Foksiński M, Barecki A, Krajewska WM. Zinc and cadmium analysis in human prostate neoplasms. Biol Trace Elem Res. 1997; 59: 145-152. Maret W. Redox biochemistry of mammalian metallothioneins. J Biol Inorg Chem. 2011; 16: 1079-1086. Maret W, Jacob C, Vallee BL, Fischer EH. Inhibitory sites in enzymes: zinc removal and reactivation by thionein. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96: 1936-1940. Namdarghanbari M, Wobig W, Krezoski S, Tabatabai NM, Petering DH. Mammalian metallothionein in toxicology, cancer, and cancer chemotherapy. J Biol Inorg Chem. 2011; 16: 1087-1101. Cuypers A, Plusquin M, Remans T, Jozefczak M, Keunen E, Gielen H i wsp. Cadmium stress: an oxidative challenge. Biometals. 2010; 23: 927-940. Pappas RS. Toxic elements in tobacco and in cigarette smoke: inflammation and sensitization. Metallomics. 2011; 3: 1181-1198. Fatur T, Tusek M, Falnoga I, Scancar J, Lah TT, Filipic M. DNA damage and metallothionein synthesis in human hepatoma cells (HepG2) exposed to cadmium. Food Chem Toxicol. 2002; 40: 1069-1076. Himeno S. Application of metallothionein null cells to investigation of cadmium transport. J Inorg Biochem. 2002; 88: 207-212. Mlynek V, Skoczyńska A. Prozapalne działanie kadmu, Postępy Hig. Med. Dośw. 2005; 59: 1–8. Stavrides JC. Lung carcinogenesis: pivotal role of metals in tobacco smoke. Free Radic Biol Med. 2006; 41: 1017-1030. 238 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. Metalotioneiny i kadm a rak piersi Templeton DM, Liu Y. Multiple roles of cadmium in cell death and survival. Chem Biol Interact. 2010; 188: 267-275. Kakkar P, Jaffery FN. Biological markers for metal toxicity. Environ Toxicol Pharmacol. 2005; 19: 335-349. Liu J, Kadiiska MB, Corton JC, Qu W, Waalkes MP, Mason RP i wsp. Acute cadmium exposure induces stress-related gene expression in wild-type and metallothionein-I/II-null mice. Free Radic Biol Med. 2002; 32: 525-535. Waalkes MP. Cadmium carcinogenesis in review. J Inorg Biochem. 2000; 79: 241-244. Kita K, Miura N, Yoshida M, Yamazaki K, Ohkubo T, Imai Y i wsp. Potential effect on cellular response to cadmium of a single-nucleotide A --> Gpolymorphism in the promoter of the human gene for metallothionein IIA. Hum Genet. 2006; 120: 553-560. Lu J, Jin T, Nordberg G, Nordberg M. Metallothionein gene expression in peripheral lymphocytes and renal dysfunction in a population environmentally exposed to cadmium. Toxicol Appl Pharmacol. 2005; 206: 150-156. Garrett SH, Phillips V, Somji S, Sens MA, Dutta R, Park S i wsp. Transient induction of metallothionein isoform 3 (MT-3), c-fos, c-jun and c-myc in human proximal tubule cells exposed to cadmium. Toxicol Lett. 2002; 126: 69-80. Klaassen CD, Liu J, Diwan BA. Metallothionein protection of cadmium toxicity. Toxicol Appl Pharmacol. 2009; 238: 215-220. Theocharis SE, Margeli AP, Klijanienko JT, Kouraklis GP. Metallothionein expression in human neoplasia. Histopathology. 2004; 45: 103-118. Bi Y, Palmiter RD, Wood KM, Ma Q. Induction of metallothionein I by phenolic antioxidants requires metal-activated transcription factor 1 (MTF-1) and zinc. Biochem J. 2004; 380: 695-703. Laity JH, Andrews GK. Understanding the mechanisms of zinc-sensing by metalresponse element binding transcription factor-1 (MTF-1). Arch Biochem Biophys. 2007; 463: 201-210. LaRochelle O, Gagné V, Charron J, Soh JW, Séguin C. Phosphorylation is involved in the activation of metal-regulatory transcription factor 1 in response to metal ions. J Biol Chem. 2001; 276: 41879-41888. Saydam N, Adams TK, Steiner F, Schaffner W, Freedman JH. Regulation of metallothionein transcription by the metal-responsive transcription factor MTF-1: identification of signal transduction cascades that control metal-inducible transcription. J Biol Chem. 2002; 277: 20438-20445. E. Forma, M. Bryś 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 239 Vasconcelos MH, Tam SC, Hesketh JE, Reid M, Beattie JH. Metal- and tissuedependent relationship between metallothionein mRNA and protein. Toxicol Appl Pharmacol. 2002; 182: 91-97. Wang Y, Wimmer U, Lichtlen P, Inderbitzin D, Stieger B, Meier PJ, Hunziker L, Stallmach T, Forrer R, Rülicke T, Georgiev O, Schaffner W. Metal-responsive transcription factor-1 (MTF-1) is essential for embryonic liver development and heavy metal detoxification in the adult liver. FASEB J. 2004; 18: 1071-1079. Günther V, Lindert U, Schaffner W. The taste of heavy metals: gene regulation by MTF-1. Biochim Biophys Acta. 2012; 1823: 1416-1425. Chen X, Zhang B, Harmon PM, Schaffner W, Peterson DO, Giedroc DP. A novel cysteine cluster in human metal-responsive transcription factor 1 is required for heavy metal-induced transcriptional activation in vivo. J Biol Chem. 2004; 279: 4515-4522. Günes C, Heuchel R, Georgiev O, Müller KH, Lichtlen P, Blüthmann H, Marino S, Aguzzi A, Schaffner W. Embryonic lethality and liver degeneration in mice lacking the metal-responsive transcriptional activator MTF-1. EMBO J. 1998; 17: 2846-2854. Lichtlen P, Schaffner W. The "metal transcription factor" MTF-1: biological facts and medical implications. Swiss Med Wkly. 2001; 131: 647-652. Wimmer U, Wang Y, Georgiev O, Schaffner W. Two major branches of anticadmium defense in the mouse: MTF-1/metallothioneins and glutathione. Nucleic Acids Res. 2005; 33: 5715-5727. Rutherford JC, Bird AJ. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryot Cell. 2004; 3: 1-13. Adams TK, Saydam N, Steiner F, Schaffner W, Freedman JH. Activation of gene expression by metal-responsive signal transduction pathways. Environ Health Perspect. 2002; 110 Suppl 5: 813-817. Bourdineaud JP, Baudrimont M, Gonzalez P, Moreau JL. Challenging the model for induction of metallothionein gene expression. Biochimie. 2006; 88: 1787-1792. Vergani L, Lanza C, Borghi C, Scarabelli L, Panfoli I, Burlando B i wsp. Effects of growth hormone and cadmium on the transcription regulation of two metallothionein isoforms. Mol Cell Endocrinol. 2007; 263: 29-37. Thévenod F. Cadmium and cellular signaling cascades: to be or not to be? Toxicol Appl Pharmacol. 2009; 238: 221-239. Andrews GK. Regulation of metallothionein gene expression by oxidative stress and metal ions. Biochem Pharmacol. 2000; 59: 95-104. 240 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82. 83. 84. 85. 86. 87. 88. 89. Metalotioneiny i kadm a rak piersi Jiang H, Fu K, Andrews GK. Gene- and cell-type-specific effects of signal transduction cascades on metal-regulated gene transcription appear to be independent of changes in the phosphorylation of metal-response-elementbinding transcription factor-1. Biochem J. 2004; 382: 33-41. Lau AT, Zhang J, Chiu JF. Acquired tolerance in cadmium-adapted lung epithelial cells: roles of the c-Jun N-terminal kinase signaling pathway and basal level of metallothionein. Toxicol Appl Pharmacol. 2006; 215: 1-8. Rao PS, Jaggi M, Smith DJ, Hemstreet GP, Balaji KC. Metallothionein 2A interacts with the kinase domain of PKCmu in prostate cancer. Biochem Biophys Res Commun. 2003; 310: 1032-1038. Ray PD, Huang BW, Tsuji Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signal. 2012; 24: 981-990. Corre S, Galibert MD. USF as a key regulatory element of gene expression. Med Sci (Paris). 2006; 22: 62-67. Venugopal R, Jaiswal AK. Nrf1 and Nrf2 positively and c-Fos and Fra1 negatively regulate the human antioxidant response element-mediated expression of NAD(P)H: quinone oxidoreductase1 gene. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93: 14960-14965 Ozanne BW, McGarry L, Spence HJ, Johnston I, Winnie J, Meagher L i wsp. Transcriptional regulation of cell invasion: AP-1 regulation of a multigenic invasion programme. Eur J Cancer. 2000, 36: 1640-1648. Beyersmann D, Hechtenberg S. Cadmium, gene regulation, and cellular signaling in mammalian cells. Toxicol Appl Pharmacol. 1997; 144: 247-261. Pathak N, Khandelwal S. Role of oxidative stress and apoptosis in cadmium induced thymic atrophy and splenomegaly in mice. Toxicol Lett. 2007; 169: 95-108. Bednarek J, Kiliańska ZM.Białka przestrzeni międzybłonowej mitochondriów uczestniczące w procesie apoptozy. Postępy Biochem. 2005; 51: 447–458. Kiliańska ZM, Miśkiewicz A. Kaspazy kręgowców: ich rola w przebiegu apoptozy. Postępy Biol Kom. 2003; 30: 129–152. Łabędzka K, Grzanka A, Izdebska M. Mitochondrium a śmierć komórki. Postępy Hig Med Dośw. 2006; 60: 439–446. Rogalińska M. Alterations in cell nuclei during apoptosis. Cell Mol Biol Lett. 2002; 7: 995-1018. Hamada T, Tanimoto A, Sasaguri Y. Apoptosis induced by cadmium. Apoptosis.1997; 2: 359-367 E. Forma, M. Bryś 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98. 99. 100. 101. 102. 241 Pulido MD, Parrish AR. Metal-induced apoptosis: mechanisms. Mutat Res. 2003; 533: 227-241. Kim MS, Kim BJ, Woo HN, Kim KW, Kim KB, Kim IK i wsp. Cadmium induces caspase-mediated cell death: suppression by Bcl-2. Toxicology. 2000; 145: 27-37. Kondo Y, Rusnak JM, Hoyt DG, Settineri CE, Pitt BR, Lazo JS. Enhanced apoptosis in metallothionein null cells. Mol Pharmacol. 1997; 52: 195-201. Aimola P, Carmignani M, Volpe AR, Di Benedetto A, Claudio L, Waalkes MP, van Bokhoven A, Tokar EJ, Claudio PP. Cadmium induces p53-dependent apoptosis in human prostate epithelial cells. PLoS One. 2012; 7: e33647. Hengstler JG, Bolm-Audorff U, Faldum A, Janssen K, Reifenrath M, Götte W i wsp. Occupational exposure to heavy metals: DNA damage induction and DNA repair inhibition prove co-exposures to cadmium, cobalt and lead as more dangerous than hitherto expected. Carcinogenesis. 2003; 24: 63-73. Asmuss M, Mullenders LH, Eker A, Hartwig A. Differential effects of toxic metal compounds on the activities of Fpg and XPA, two zinc finger proteins involved in DNA repair. Carcinogenesis. 2000; 21: 2097-2104. Witkiewicz-Kucharczyk A, Bal W. Damage of zinc fingers in DNA repair proteins, a novel molecular mechanism in carcinogenesis. Toxicol Lett. 2006; 162: 29-42. Jacob ST, Majumder S, Ghoshal K. Suppression of metallothionein-I/II expression and its probable molecular mechanisms. Environ Health Perspect. 2002; 110 Suppl 5: 827-30. Morahan JM, Yu B, Trent RJ, Pamphlett R. Are metallothionein genes silenced in ALS? Toxicol Lett. 2007; 168: 83-87. Beavon IR. The E-cadherin-catenin complex in tumour metastasis: structure, function and regulation. Eur J Cancer. 2000; 36: 1607-1620. Edwards JR, Kolman K, Lamar PC, Chandar N, Fay MJ, Prozialeck WC. Effects of cadmium on the sub-cellular localization of β-catenin and β-catenin-regulated gene expression in NRK-52E cells. Biometals. 2012 DOI 10.1007/s10534-0129592-0 Chakrabarty S, Radjendirane V, Appelman H, Varani J. Extracellular calcium and calcium sensing receptor function in human colon carcinomas: promotion of E-cadherin expression and suppression of beta-catenin/TCF activation. Cancer Res. 2003; 63: 67-71. Conacci-Sorrell M, Zhurinsky J, Ben-Ze'ev A. The cadherin-catenin adhesion system in signaling and cancer. J Clin Invest. 2002; 109: 987-991. 242 103. 104. 105. 106. 107. 108. 109. 110. 111. 112. 113. 114. 115. 116. 117. Metalotioneiny i kadm a rak piersi Curran S, Murray GI. Matrix metalloproteinases: molecular aspects of their roles in tumour invasion and metastasis. Eur J Cancer. 2000; 36: 1621-1630. Heimann R, Hellman S. Individual characterisation of the metastatic capacity of human breast carcinoma. Eur J Cancer. 2000; 36: 1631-1639. Beattie JH, Owen HL, Wallace SM, Arthur JR, Kwun IS, Hawksworth GM i wsp. Metallothionein overexpression and resistance to toxic stress. Toxicol Lett. 2005; 157: 69-78. Fan LZ, Cherian MG. Potential role of p53 on metallothionein induction in human epithelial breast cancer cells. Br J Cancer. 2002; 87: 1019-1026. Méplan C, Richard MJ, Hainaut P. Redox signalling and transition metals in the control of the p53 pathway. Biochem Pharmacol. 2000; 59: 25-33. Reaves SK, Fanzo JC, Arima K, Wu JY, Wang YR, Lei KY. Expression of the p53 tumor suppressor gene is up-regulated by depletion of intracellular zinc in HepG2 cells. J Nutr. 2000; 130: 1688-1694. Agarwal ML, Agarwal A, Taylor WR, Stark GR. p53 controls both the G2/M and the G1 cell cycle checkpoints and mediates reversible growth arrest in human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA. 1995; 92: 8493-8497. Murphy KL, Rosen JM. Mutant p53 and genomic instability in a transgenic mouse model of breast cancer. Oncogene. 2000; 19: 1045-1051. Wani MA, Zhu QZ, El-Mahdy M, Wani AA. Influence of p53 tumor suppressor protein on bias of DNA repair and apoptotic response in human cells. Carcinogenesis. 1999; 20: 765-772. Koedrith P, Seo YR. Advances in carcinogenic metal toxicity and potential molecular markers. Int J Mol Sci. 2011; 12: 9576-9595. Ostrakhovitch EA, Olsson PE, Jiang S, Cherian MG. Interaction of metallothionein with tumor suppressor p53 protein. FEBS Lett. 2006; 580: 1235-1238. Lozano G. The oncogenic roles of p53 mutants in mouse models. Curr Opin Genet Dev. 2007; 17: 66-70. Elledge RM, Allred DC. Prognostic and predictive value of p53 and p21 in breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 1998; 52: 79-98. Svechnikova I, Ammerpohl O, Ekström TJ. p21waf1/Cip1 partially mediates apoptosis in hepatocellular carcinoma cells. Biochem Biophys Res Commun. 2007; 354: 466-471. Thor AD, Liu S, Moore DH 2nd, Shi Q, Edgerton SM. p(21WAF1/CIP1) expression in breast cancers: associations with p53 and outcome. Breast Cancer Res Treat. 2000; 61: 33-43. E. Forma, M. Bryś 118. 119. 120. 121. 122. 123. 124. 125. 126. 127. 128. 129. 130. 243 Xie J, Shaikh ZA. Cadmium induces cell cycle arrest in rat kidney epithelial cells in G2/M phase. Toxicology. 2006; 224: 56-65. Taylor WR, DePrimo SE, Agarwal A, Agarwal ML, Schönthal AH, Katula KS, Stark GR. Mechanisms of G2 arrest in response to overexpression of p53. Mol Biol Cell. 1999; 10: 3607-3622. Jiang H, Fu K, Andrews GK. Gene- and cell-type-specific effects of signal transduction cascades on metal-regulated gene transcription appear to be independent of changes in the phosphorylation of metal-response-elementbinding transcription factor-1. Biochem J. 2004; 382: 33-41. Fan LZ, Cherian MG. Potential role of p53 on metallothionein induction in human epithelial breast cancer cells. Br J Cancer. 2002; 87: 1019-1026. Méplan C, Mann K, Hainaut P. Cadmium induces conformational modifications of wild-type p53 and suppresses p53 response to DNA damage in cultured cells. J Biol Chem. 1999; 274: 31663-31670. Jin R, Chow VT, Tan PH, Dheen ST, Duan W, Bay BH. Metallothionein 2A expression is associated with cell proliferation in breast cancer. Carcinogenesis. 2002; 23: 81-86. Cogswell PC, Guttridge DC, Funkhouser WK, Baldwin AS Jr. Selective activation of NF-kappa B subunits in human breast cancer: potential roles for NF-kappa B2/p52 and for Bcl-3. Oncogene. 2000; 19: 1123-1131. Doszczak MM, Kaszubowska L, Pierzchalski A, Bigda J. Mechanizm aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-κB przez czynnik martwicy nowotworu (TNF). Postępy Biochem. 2002; 48: 54–65. Kim DW, Sovak MA, Zanieski G, Nonet G, Romieu-Mourez R, Lau AW i wsp. Activation of NF-kappaB/Rel occurs early during neoplastic transformation of mammary cells. Carcinogenesis. 2000; 21: 871-879. Liu P, Kimmoun E, Legrand A, Sauvanet A, Degott C, Lardeux B i wsp. Activation of NF-kappa B, AP-1 and STAT transcription factors is a frequent and early event in human hepatocellular carcinomas. J Hepatol. 2002; 37: 63-71. Gruber BM. Czynnik transkrypcyjny NF-κB – nowa perspektywa w leczeniu nowotworów. Postępy Biochem. 2004; 50: 118–130. Jin R, Bay BH, Chow VT, Tan PH, Dheen T. Significance of metallothionein expression in breast myoepithelial cells. Cell Tissue Res. 2001; 303: 221-226. Jin R, Bay BH, Chow VT, Tan PH. Metallothionein 1F mRNA expression correlates with histological grade in breast carcinoma. Breast Cancer Res Treat. 2001; 66: 265-272. 244 131. 132. 133. 134. 135. 136. 137. 138. Metalotioneiny i kadm a rak piersi Jin R, Bay BH, Chow VT, Tan PH, Lin VC. Metallothionein 1E mRNA is highly expressed in oestrogen receptor-negative human invasive ductal breast cancer. Br J Cancer. 2000; 83: 319-323. Barnes NL, Ackland ML, Cornish EJ. Metallothionein isoform expression by breast cancer cells. Int J Biochem Cell Biol. 2000; 32: 895-903. Platet N, Cathiard AM, Gleizes M, Garcia M. Estrogens and their receptors in breast cancer progression: a dual role in cancer proliferation and invasion. Crit Rev Oncol Hematol. 2004; 51: 55-67. Osborne CK. Steroid hormone receptors in breast cancer management. Breast Cancer Res Treat. 1998; 51: 227-238. Wojnar A, Pula B, Piotrowska A, Jethon A, Kujawa K, Kobierzycki C i wsp. Correlation of intensity of MT-I/II expression with Ki-67 and MCM-2 proteins in invasive ductal breast carcinoma. Anticancer Res. 2011; 31: 3027-3033. Gomulkiewicz A, Podhorska-Okolow M, Szulc R, Smorag Z, Wojnar A, Zabel M i wsp. Correlation between metallothionein (MT) expression and selected prognostic factors in ductal breast cancers. Folia Histochem Cytobiol. 2010; 48: 242-248. Krześlak A, Forma E, Jóźwiak P, Szymczyk A, Smolarz B, RomanowiczMakowska H i wsp. Metallothionein 2A genetic polymorphisms and risk of ductal breast cancer. Clin Exp Med. 2012; DOI 10.1007/s10238-012-0215-4 Somji S, Garrett SH, Zhou XD, Zheng Y, Sens DA, Sens MA. Absence of Metallothionein 3 Expression in Breast Cancer is a Rare, But Favorable Marker of Outcome that is Under Epigenetic Control. Toxicol Environ Chem. 2010; 92: 1673-1695. Folia Medica Lodziensia, 2012, 39/2:245-264 Rola transporterów GLUT1 i GLUT3 w pobieraniu glukozy i kwasu dehydroaskorbinowego przez komórki nowotworowe The role of transporters GLUT1 and GLUT3 in glucose and dehydroascorbic acid uptake in cancer cells PAWEŁ JÓŹWIAK Katedra Cytobiochemii Wydział Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Łódzkiego Streszczenie Charakterystyczną cechą komórek nowotworowych jest zwiększony metabolizm połączony z zahamowaniem fosforylacji oksydacyjnej. Oddychanie przebiegające w warunkach beztlenowych prowadzi do przyspieszonej glikolizy i wzrostu zapotrzebowania na glukozę. W nasilonym pobieraniu glukozy przez komórki pośredniczą transportery glukozy – GLUT (ang. glucose transporters). Nadekspresję białek GLUT, w szczególności regulowanych warunkami hipoksji GLUT1 i GLUT3 zaobserwowano w wielu typach nowotworów. Ponieważ transportery te wykazują wysokie powinowactwo do glukozy i przenoszą ją z dużą wydajnością, stanowią one kluczowy czynnik limitujący metabolizm glukozy w komórkach guza. Dotychczasowe badania koncentrowały się na roli jaką odgrywają transportery GLUT1 i GLUT3 w transporcie glukozy pomijając aspekt związany z metabolizmem witaminy C. Transportery GLUT pośredniczą w pobieraniu przez komórkę kwasu dehydroaskorbinowego (DHA), który wewnątrz komórki ulega redukcji do biologicznie aktywnej formy witaminy C. W warunkach fizjologicznych witamina C ma właściwości antyoksydacyjne, chroniąc komórki przed stresem oksydacyjnym. Jednakże w zależności od warunków, witamina C może również wywoływać efekty pro-oksydacyjne związane z generowaniem reaktywnych form tlenu. Stwierdzono, że niski poziom wolnych rodników i nadtlenku wodoru stymuluje żywotność i proliferację komórek, podczas gdy wysokie stężenie reaktywnych form tlenu prowadzi do apoptozy lub nekrozy. W pracy przedstawiono aktualny stan wiedzy na temat Adres do korespondencji: mgr Paweł Jóźwiak, Katedra Cytobiochemii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki; 90-236 Łódź, ul. Pomorska 141/143; Tel.: 0 42 635 44 03, Fax.: 0 42 635 44 84, e-mail: [email protected] 246 Rola transporterów GLUT1 i GLUT3 w nowotworach transportu glukozy i kwasu dehydroaskorbinowego z udziałem transporterów GLUT1 i GLUT3 w komórkach nowotworowych Słowa kluczowe: GLUT1, GLUT3, glukoza, kwas dehydroaskorbinowy, kwas askorbinowy, nowotwory Abstract Cancer cells are characterized by acceleration in energy consumption, together with the inhibition of oxidative phosphorylation. The anaerobic respiration leads to the enhancement of glycolysis and the higher rate of glucose uptake into cancer cells. The upregulation of glucose transport across the plasma membrane is mediated by facilitative glucose transporters named GLUTs. The overexpression of GLUTs, especially the hypoxia responsive GLUT1 and GLUT3, has been frequently observed in the variety of human malignancies. Since GLUT1 and GLUT3 have a high transporting efficiency and affinity to glucose, these proteins are key rate-limiting factors in glucose uptake by cancer cells. The reported data focus on the glucose transport mediated by GLUT1 and GLUT3, ignoring the participation of both carriers in vitamin C metabolism. The GLUT proteins transport dehydroascorbic acid (DHA) which intracellularly is reduced to an antioxidant, protecting cells from oxidative stress. However, vitamin C may also have pro-oxidant effects, via its ability to generate reactive oxygen species (ROS). It has been shown, that the low level of free radicals and hydrogen peroxide stimulates cell proliferation and viability, whereas the high concentration of reactive oxygen species may induce apoptosis or necrosis. This paper presents the current state of knowledge concerning the transport of glucose and dehydroascorbic acid mediated by hypoxia-induced facilitative glucose transporters in cancer cells. Key words: GLUT1, GLUT3, glucose, dehydroascorbic acid, ascorbic acid, cancers P. Jóźwiak 247 Wprowadzenie Powszechnie wiadomo, że komórki nowotworowe charakteryzują się odmiennym metabolizmem w porównaniu z komórkami prawidłowymi. W komórkach nowotworowych obserwuje się zahamowanie procesu fosforylacji oksydacyjnej i transportu elektronów na tlen, co prowadzi do nasilonej produkcji reaktywnych form tlenu, które zwiększają poziom mutacji w obrębie protoonkogenów [1, 2]. Warunki hipoksji nowotworu przesuwają metabolizm w stronę glikolizy beztlenowej, której kontynuacja wymaga regeneracji koenzymu NAD+. W tym celu komórki nowotworowe preferują przemianę pirogronianu do mleczanu poprzez indukcję izoformy A dehydrogenazy mleczanowej. W reakcji produkcji mleczanu odtworzony zostaje koenzym NAD+ umożliwiający cykliczność procesu glikolizy, a całkowity zysk energetyczny oddychania beztlenowego stanowią dwie cząsteczki ATP [3, 4]. Wysokie wymagania energetyczne komórek nowotworowych prowadzą do kompensacji niskiego zysku energetycznego oddychania beztlenowego poprzez 20-30-krotne zintensyfikowanie procesu glikolizy. Nasileniu procesu glikolizy towarzyszy zwiększone pobieranie glukozy przez komórki nowotworowe, które odbywa się za pośrednictwem transporterów glukozy określanych jako GLUT [2, 5]. Oprócz transportu glukozy, białka GLUT uczestniczą w metabolizmie witaminy C, która w zależności od stężenia w komórce wywołuje efekty anty- lub pro-oksydacyjne [6]. Zależne od warunków hipoksji transportery GLUT1 i GLUT3 mogą odgrywać istotną rolę w regulacji stanu czynnościowego komórek nowotworowych. Rola transporterów GLUT1 i GLUT3 w nowotworach 248 Transportery GLUT Rodzina transporterów GLUT składa się z 14 białek, które zostały zgrupowane w trzech klasach. Klasa I zawiera najlepiej scharakteryzowane transportery GLUT1-GLUT4 i niedawno poznany transporter GLUT14. Do klasy II należy transporter fruktozy GLUT5 oraz transportery GLUT7, GLUT9 i GLUT11. Pozostałe transportery: GLUT6, GLUT8, GLUT10, GLUT12 i transporter HMIT (HMIT, ang. H+-coupled myo-inositol transporter) wchodzą w skład klasy III [7, 8]. Wszystkie transportery GLUT zawierają 12 hydrofobowych α-helikalnych transmembranowych domen z dużą wewnątrzkomórkową pętlą (pomiędzy domeną 6 i 7) (Ryc. 1). Regiony N- i C- końcowe tych białek zlokalizowane są po stronie cytoplazmatycznej. Białka GLUT klasy I i II mają pomiędzy domeną transmembranową 1 i 2 zewnątrzkomórkową pętlę z miejscem N-glikozylacji [9, 10]. N-glikozylacja GLUT1 na Asn45 zwiększa jego stabilność i aktywność transportową [11]. Analogiczne miejsce N-glikozylacji w przypadku transporterów klasy III występuje pomiędzy domeną transmembranową 9 i 10. Wszystkie białka GLUT transportują heksozy niezależnie od energii, zgodnie z gradientem stężeń, z różną kinetyką i powinowactwem względem substratu. Największe powinowactwo do glukozy mają indukowane warunkami hipoksji transportery GLUT1 i GLUT3 oraz insulino-zależny transporter GLUT4. Poszczególne tkanki organizmu cechują się odmiennym profilem ekspresji transporterów GLUT. P. Jóźwiak 249 Ryc. 1 Schemat budowy transporterów glukozy GLUT (opis w tekście – wg. [12]; w modyfikacji własnej) W tej samej tkance można obserwować ekspresję kilku izoform GLUT, jak również wiele tkanek może transportować heksozy z udziałem tego samego transportera [7,12]. Nadekspresję transporterów GLUT, w szczególności zależnych od warunków hipoksji nowotworu GLUT1 i GLUT3 zaobserwowano w wielu typach nowotworów. Obecnie sugeruje się, że specyficzny profil ekspresji białek GLUT mógłby stanowić prognostyczny wskaźnik złośliwości Rola transporterów GLUT1 i GLUT3 w nowotworach 250 oraz stopnia zaawansowania klinicznego nowotworu, który umożliwiłby wyodrębnienie pacjentów wymagających agresywniejszego leczenia [13, 14]. Transport glukozy z udziałem transporterów GLUT1 i GLUT3 w nowotworach Transportery GLUT1 i GLUT3 charakteryzują się wyższym powinowactwem do glukozy w porównaniu z pozostałymi białkami rodziny GLUT. Stwierdzono, że nadekspresja obu izoform, wynikająca ze wzmożonego zapotrzebowania komórek nowotworowych na energię, koreluje ze wzrostem rozmiarów i inwazyjnością guza [15]. Proces zwiększonego transportu glukozy do komórek nowotworowych znalazł kliniczne zastosowanie w diagnostyce wielu typów nowotworów i ich przerzutów przez znakowanie guzów analogiem glukozy [18F]-fluoro-2-deoksy-D-glukozą (18FDG) z wykorzystaniem techniki pozytonowej tomografii standardaryzowana emisyjnej wartość (PET) wychwytu 18 [16]. Wysoka FDG (SUV(max)) maksymalna związana z podwyższonym poziomem ekspresji GLUT1 w płaskonabłonkowych rakach płuc w porównaniu z gruczolakami, korelowała ze stopniem zróżnicowania komórek nowotworu oraz przerzutami do węzłów chłonnych [17]. Podobnie w rakach pleomorficznych płuc zaobserwowano ścisły związek pomiędzy poziomem ekspresji transporterów GLUT1 i GLUT3, a wychwytem 18FDG [18]. Warunkiem aktywnego transportu cukru z udziałem białek GLUT jest ich translokacja z przestrzeni wewnątrzkomórkowej do błony komórkowej. Ponad dwukrotnie niższy wychwyt 18FDG skorelowany z translokacją GLUT3 z błony plazmatycznej do cytozolu stwierdzono w liniach komórkowych wrażliwych na gefitynib – inhibitor kinazy EGFR (EGFR, ang. epidermal growth factor receptor) [19]. Z kolei, stymulacja insuliną linii komórkowych mięsaków P. Jóźwiak 251 kościopochodnych podnosiła konsumpcję glukozy w wyniku przemieszczenia GLUT1 do błony komórkowej [20]. Regulacja ekspresji transporterów GLUT1 i GLUT3 jest złożonym procesem, w którym bierze udział wiele czynników takich jak: hipoksja, czynniki wzrostu, hormony, onkogeny i geny supresorowe [21-25]. Z drugiej strony nadekspresja transporterów GLUT, w szczególności indukowanych warunkami hipoksji nowotworu GLUT1 i GLUT3, umożliwia lepszą akumulację w komórkach nowotworowych pochodnych glukozy oraz skoniugowanych z nimi związków o potencjale terapeutycznym. Jednym z takich analogów jest 2-deoksyglukoza (2-DG), której działanie prowadzi do kompetycyjnej inhibicji glikolizy [26]. Wewnątrz komórki 2-DG podlega fosforylacji przez heksokinazę, ale nie stanowi ona substratu dla izomerazy glukozo-fosforanowej. W rezultacie, nagromadzenie fosforylowanej 2-deoksyglukozy w komórce prowadzi do zatrzymania glikolizy, cyklu komórkowego i uruchomienia apoptozy [27]. Ponadto, 2-DG hamuje N-glikozylację transporterów GLUT, która jest niezbędna dla ich translokacji do błony komórkowej [28]. Szereg badań przeprowadzonych na wielu typach linii nowotworowych wskazuje na fakt, że 2-DG wspomaga stosowaną powszechnie radioterapię. Sugeruje się, że efekt ten ma związek ze wzrostem stresu oksydacyjnego wynikającego z zahamowania metabolizmu tioli (związków zawierających grupę –SH, np.: cysteina) [29]. Co więcej, liczne badania wykazały, że 2-DG uwrażliwia komórki nowotworowe na chemioterapię. Traktowanie komórek glejaka oraz nowotworu złośliwego skóry 2-DG w połączeniu z kamptotecyną (inhibitor topoizomerazy I) i etopozydem (inhibitor topoizomerazy II) znacząco podnosiło cytotoksyczność terapii, co skutkowało nasileniem apoptozy lub śmierci mitotycznej komórek [30]. Podobne wspomagające działanie 2-DG związane ze wzrostem cytotoksyczności 252 Rola transporterów GLUT1 i GLUT3 w nowotworach zaobserwowano w przypadku chemioterapii innych linii nowotworowych z zastosowaniem adriamycyny i paklitakselu [31]. Ponadto, 2-DG hamuje transkrypcję wirusa brodawczaka ludzkiego, co sugeruje, że związek ten może uwrażliwiać na chemioterapię lekooporne nowotwory szyjki macicy [29]. Obok rozwoju terapii łączonej z wykorzystaniem niemetabolizowanych analogów glukozy, rośnie zainteresowanie syntezą koniugatów konwencjonalnych cytotoksycznych leków z cząsteczkami glukozy. Głównym celem takich połączeń jest zwiększenie biodostępności i efektywności stosowanej obecnie chemioterapii. Za przykład może posłużyć 2-GluSNAP – koniugat powstały z połączenia glukozy z donorem tlenku azotu S-nitrozo-N-acetyl-penicyllaminą (SNAP), którego cytotoksyczność koreluje z poziomem ekspresji transportera GLUT1 [32]. W odróżnieniu od komórek prawidłowych, głównym substratem energetycznym komórek nowotworowych jest glukoza. Fakt ten sprzyja postępowi badań nad zastosowaniem niemetabolizowanych analogów glukozy w terapii nowotworów. Transport witaminy C do komórek nowotworowych W dostępnych danych literaturowych dotyczących roli transporterów GLUT w patogenezie i terapii nowotworów autorzy skupiają uwagę na aspektach związanych z transportem glukozy i jej analogów pomijając znaczenie jakie odgrywają transportery GLUT w metabolizmie witaminy C. Transport kwasu askorbinowego (AA) do komórek może zachodzić na drodze dwóch różnych mechanizmów: transportu czynnego z udziałem transporterów zależnych od jonów sodu SVCT (ang. sodium-dependent vitamin C transporter) lub dyfuzji ułatwionej za pośrednictwem transporterów glukozy GLUT. Wysokie stężenie kwasu askorbinowego hamuje ekspresję transporterów SVCT P. Jóźwiak 253 na zasadzie sprzężenia zwrotnego, natomiast transport z udziałem białek GLUT wymaga utlenienia kwasu askorbinowego do kwasu dehydroaskorbinowego (DHA), który następnie wewnątrz komórki jest redukowany do aktywnej biologicznie witaminy C (Ryc. 2). Ryc. 2. Transport i rola witaminy C w degradacji podjednostek α czynnika transkrypcyjnego HIF. SVCT – transporter witaminy C zależny od jonów sodu (ang. sodium-dependent vitamin C transporter); GLUT – transporter glukozy (ang. glucose transporter); AA – kwas askorbinowy (ang. ascorbic acid); DHA – kwas dehydroaskorbinowy (ang. dehydroascorbic acid); HIF-α – podjednostka α czynnika transkrypcyjnego indukowanego warunkami hipoksji (ang. hypoxia-inducible factor α); vHL – białko von Hippel-Lindau (von Hippel-Lindau); 2-OG – 2-oksoglutaran (2-oxoglutarate); PHD – hydroksylaza prolinowa (ang. prolyl hydoxylase); FIH – hydroksylaza asparaginianowa hamująca ekspresję czynnika HIF (ang. asparaginyl hydroxylase, factor inhibiting HIF) (opis w tekście) Rola transporterów GLUT1 i GLUT3 w nowotworach 254 Ze względu na podobieństwo strukturalne DHA do glukozy, oba substraty, w zależności od typu komórek, mogą rywalizować o wiązanie do transportera [6, 33]. Przeprowadzone badania sugerują, że w dyfuzji ułatwionej DHA do komórki pośredniczą izoformy pierwszej klasy białek GLUT, tj. GLUT1, GLUT3 oraz GLUT4, a wydajność transportu DHA z udziałem wymienionych białek, określona na podstawie stałych kinetycznych, jest zbliżona do wydajności transportu glukozy [34, 35]. Do tej pory nie wiadomo, który z mechanizmów odgrywa istotniejszą rolę w akumulacji askorbinianu w komórkach nowotworowych. Komórki chłoniaka Nb2 transportują zarówno AA jak i DHA, podczas gdy komórki białaczki szpikowej HL-60 transportują tylko utlenioną formę witaminy C [36, 37]. Badania przeprowadzone na liniach komórkowych czerniaka i prawidłowych melanocytach człowieka wykazały, że obie linie transportują witaminę C na drodze zależnej i niezależnej od jonów sodu. Jednakże, komórki czerniaka gromadzą ponad sto razy więcej askorbinianu w wyniku transportu DHA drogą dyfuzji ułatwionej w porównaniu z komórkami prawidłowymi [38]. Przypuszcza się, że istnieją mechanizmy, które prowadzą do utlenienia AA do DHA w mikrośrodowisku komórek nowotworowych. Prawdopodobnie w procesie zewnątrzkomórkowego utleniania askorbinianiu uczestniczy γ-glutamylotransferaza – enzym pro-oksydacyjny zakotwiczony w błonie komórkowej [39]. Opublikowane przez KC i wsp. [40] wyniki badań, wykazały że oprócz transportu przez błonę plazmatyczną GLUT1 pośredniczy w transporcie DHA do mitochondriów. Stwierdzono, że niskie stężenia AA chronią mitochondria przed stresem oksydacyjnym, natomiast wysokie stężenia indukują spadek potencjału błony mitochondrialnej i uwolnienie cytochromu c z mitochondrium do cytozolu, co promuje apoptozę [40]. P. Jóźwiak 255 Biologiczne funkcje kwasu askorbinowego w nowotworach Kwas askorbinowy uczestniczy w wielu procesach biochemicznych katalizowanych przez dioksygenazy zależne od Fe2+ i 2-oksoglutaranu. Askorbinian stabilizuje żelazo na II stopniu utlenienia dzięki czemu dioksygenazy uzyskują pełną aktywność enzymatyczną [41]. Stwierdzono, że kwas askorbinowy działa stymulująco na produkcję kolagenu typu I i III w fibroblastach człowieka. Białka kolagenowe wydzielane do macierzy zewnątrzkomórkowej hamują inwazyjność i metastazę komórek nowotworowych [42, 43]. Witamina C jest ważnym kofaktorem hydroksylaz, które uczestniczą w regulacji ekspresji aktywowanego niedotlenieniem czynnika transkrypcyjnego HIF-1, [44]. HIF-1 reguluje transkrypcję wielu genów, których produkty białkowe są zaangażowane w metabolizm glukozy, angiogenezę i metastazę komórek nowotworowych. Białko HIF jest heterodimerem składającym się z podjednostki HIF-α, oraz konstytutywnie stabilnej podjednostki HIF-β [5]. W warunkach fizjologicznych podjednostki HIF-α podlegają hydroksylacji przez hydroksylazy prolinowe (PHD1, PHD2 i PHD3) oraz hydroksylazę asparaginianową, których aktywność jest uwarunkowana obecnością tlenu. Oprócz tlenu, hydroksylazy prolinowe i asparaginianowe, podobnie jak inne dioksygenazy zależne od Fe2+ i 2-oksoglutaranu, wymagają askorbinianu niezbędnego do utrzymania stopnia utlenienia żelaza i osiągnięcia pełnej aktywności enzymatycznej (Ryc. 2). Hydroksylacja umożliwia wiązanie podjednostek HIF-α z białkiem vHL (von Hippel-Lindau) rozpoznawanym przez ligazę ubikwitynową, a następnie proteolityczną degradację powstałego kompleksu [45]. Badania wskazują na związek pomiędzy poziomem askorbinianu a ekspresją czynnika HIF-1 w nowotworach. Askorbinian obniża Rola transporterów GLUT1 i GLUT3 w nowotworach 256 poziom ekspresji HIF-1 zmniejszając złośliwość guza nowotworowego [46]. Kolejną grupą enzymów, których kofaktorem jest kwas askorbinowy stanowią demetylazy histonowe [47]. Zaobserwowano zwiększoną acetylację histonów oraz ekspresję demetylaz histonowych po suplementacji embrionalnych komórek macierzystych człowieka askorbinianem [48]. Sugeruje to, że wewnątrzkomórkowy poziom kwasu askorbinowego może wpływać na status epigenetyczny komórek. Ponieważ rozwój nowotworu jest związany z hipermetylacją DNA, przypuszcza się, że witamina C i inne suplementy diety pośrednio uczestnicząc w mechanizmach epigenetycznych mogą chronić przed nowotworzeniem [49]. Anty- i pro-oksydacyjne właściwości kwasu askorbinowego Antyoksydacyjne działanie kwasu askorbinowego obniża peroksydację lipidów, chroni przed mutacjami w obrębie genów oraz zmniejsza oksydację reszt aminokwasowych zwiększając integralność białek komórkowych [50]. Badania dowodzą, że suplementacja witaminą C ogranicza ryzyko wystąpienia przewlekłych chorób w tym także nowotworów. Bogata w kwas askorbinowy dieta poprzez niszczenie wolnych rodników tlenowych produkowanych intensywnie w trakcie przebiegu zakażenia Helicobacter pylori oraz hamowanie procesu nitrozowania amin biogennych chroni przed rozwojem raka żołądka [51]. W warunkach fizjologicznych stężenie kwasu askorbinowego w surowicy krwi człowieka wynosi od 40 do 80 µM/L. Kwas askorbinowy redukując rodniki takie jak: hydroksylowy (OH•), nadtlenolipidowy (LOO•), alkoksylowy (RO•) czy tiolowy (GS•) ulega utlenieniu do znacznie mniej reaktywnego rodnika askorbylowego (Asc•–). Ponadto, w wyniku redukcji, powstałego w reakcji z produktami peroksydacji lipidów, rodnika α-tokoferoksylowego (TO•) kwas P. Jóźwiak 257 askorbinowy istotnie zwiększa poziom witaminy E w komórce. Regeneracja rodnika askorbylowego do reaktywnej cząsteczki askorbinianu następuje pod wpływem działania NADH- lub NADPH-zależnej reduktazy występującej w siateczce śródplazmatycznej i błonie komórkowej [6]. Paradoksalnie, kwas askorbinowy może wywoływać efekty pro-oksydacyjne. Właściwości te wynikają z redukcji jonów metali przejściowych takich jak żelaza lub miedzi, które następnie reagując z nadtlenkiem wodoru generują wysoce reaktywne rodniki hydroksylowe. W warunkach fizjologicznych metale przejściowe występują głównie w formie związanej z białkami. Uważa się, że w wysokich terapeutycznych stężeniach pro-oksydacyjne działanie kwasu askorbinowego wynika z produkcji nadtlenku wodoru i może przebiegać niezależnie od jonów metali przejściowych. W komórkach nowotworowych obserwuje się zahamowanie działania glutationu oraz aktywności enzymów neutralizujących stres oksydacyjny, na przykład katalazy i dysmutazy ponadtlenkowej [52]. Stres oksydacyjny odgrywa istotną rolę na każdym etapie rozwoju nowotworu. W wielu typach komórek niskie stężenie wolnych rodników i nadtlenku wodoru stymulowało proliferację, podczas gdy wysoki poziom stresu oksydacyjnego stawał się cytotoksyczny i prowadził do indukcji apoptozy lub nekrozy. Wolne rodniki hamują aktywność fosfataz komórkowych prawdopodobnie poprzez interakcję z grupami sulfhydrylowymi cystein, których utlenienie prowadzi do powstania wewnątrz- lub międzycząsteczkowych wiązań dwusiarczkowych. Zmiany konformacyjne białek wynikające z zaburzeń statusu redox powodują stymulację kaskad sygnalizacyjnych z udziałem kinaz MAPK (ang. mitogenactivated protein kinases), PI3K (ang. phosphatidylinositol-3-kinase) oraz kinazy src/Abl (ang. sarcoma/Abelson murine leukemia tyrosine kinase), które pośredniczą w kontroli wzrostu komórek guza. Sygnalizacja z udziałem Rola transporterów GLUT1 i GLUT3 w nowotworach 258 wymienionych kinaz prowadzi do aktywacji czynników transkrypcyjnych odpowiedzialnych za zmianę statusu redox komórki takich jak: AP-1 (ang. activator-protein 1), NF-ӄB (ang. nuclear factor kappa-light-chainenhancer of activated B cells), p53 (ang. protein 53), HIF-1 (ang. hypoxiainducible factor-1), NFAT (ang. nuclear factor of activated T cells) [53, 54]. Witamina C w terapii nowotworów Początkowe badania kliniczne polegające na doustnej suplementacji pacjentów wysokimi dawkami kwasu askorbinowego nie przyniosły oczekiwanych rezultatów z powodu niskiej biodostępności witaminy C w krwiobiegu [55]. Stężenie kwasu askorbinowego w surowicy zależy od dwóch procesów, w których pośredniczą transportery SVCT: absorpcji z przewodu pokarmowego oraz wchłanianiu zwrotnemu w nerkach. Ponieważ ekspresja transporterów SVCT jest hamowana wysokim stężeniem substratu, nie można poprzez doustną suplementację osiągnąć wysokiego stężenia witaminy C w surowicy [56]. Doustne przyjmowanie kwasu askorbinowego w dawce 3 g odpowiadało 206 µM/L stężeniu askorbinianu w surowicy, a w dawce 1,25 g odpowiednio 187 µM/L stężeniu w surowicy [57]. Ponadto, poziom askorbinianu w organizmie jest regulowany przez składniki krwi takie jak: limfocyty, monocyty i płytki krwi, które gromadzą około 4 mM witaminy C. Wysoki poziom askorbinianu występuje również w niektórych narządach. Na przykład, milimolowe stężenie witaminy C chroni tkanki oka przed radiacyjnym działaniem promieni słonecznych [6]. Osiągnięcie wysokich terapeutycznych stężeń witaminy C w surowicy jest możliwe jedynie drogą dożylnej iniekcji. Zainteresowanie witaminą C w terapii nowotworów, wynika z postępu badań klinicznych, które dowodzą, że wysokie dawki kwasu P. Jóźwiak 259 askorbinowego hamują rozwój guza i wspomagają konwencjonalną chemioi radioterapię. Efekt ten wynika z pro-oksydacyjnych właściwości witaminy C. Terapeutyczne stężenia kwasu askorbinowego obniża poziom białka C-reaktywnego i prozapalnych cytokin w komórkach nowotworowych. Stwierdzono, że w nowotworach złośliwych prostaty zmniejszenie stanu zapalnego koreluje z obniżoną ekspresją markera PSA [58]. W badaniach Espeya i wsp. [59] stosowanie wysokich dawek askorbinianu w połączeniu z gemcytabiną zwiększało cytotoksyczność chemioterapii w komórkach nowotworowych trzustki. W innym przypadku terapeutyczne dawki witaminy C poprawiały jakość życia pacjentek z rakiem piersi podczas oraz po stosowanej radio- i chemioterapii [60]. Podsumowanie Zależne od warunków hipoksji transportery GLUT1 i GLUT3 transportują zarówno glukozę jak i kwas dehydroaskorbinowy odgrywając tym samym istotną rolę w regulacji statusu czynnościowego komórki. Ponieważ nadekspresja obu białek jest obserwowana w wielu typach nowotworów, w przyszłości dokładniejsze poznanie struktury i regulacji transporterów GLUT może wpłynąć na rozwój nowych metod diagnostyki i terapii nowotworów. Podziękowania Autor pragnie podziękować Pani prof. dr hab. Annie Lipińskiej za cenne uwagi w trakcie pisania niniejszego artykułu. Praca została wykonana w ramach dotacji na finansowanie działalności polegającej na prowadzeniu badań naukowych lub prac rozwojowych oraz zadań 260 Rola transporterów GLUT1 i GLUT3 w nowotworach z nimi związanych służących rozwojowi młodych naukowców oraz uczestników studiów doktoranckich (Rozporządzenie MNiSW z 5 listopada 2010 r.). Piśmiennictwo 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Ferreira LMR. Cancer metabolism: the Warburg effect today. Exp Mol Pathol., 2010; 89: 372-380. Ganapathy V, Thangaraju M, Prasad PD. Nutrient transporters in cancer: relevance to Warburg hypothesis and beyond. Pharmacol Ther. 2009; 121: 29-40. Thangaraju M, Carswell KN, Prasad PD, Ganapathy V. Colon cancer cells maintain low levels of pyruvate to avoid cell death caused by inhibition of HDAC1/HDAC3. Biochem J., 2009; 417: 379-389. Xie H, Valera VA, Merino MJ, Amato AM, Signoretti S, Linehan WM i wsp. LDH-A inhibition, a therapeutic strategy for treatment of hereditary leiomyomatosis and renal cell cancer. Mol Cancer Ther. 2009; 8: 626-635. Airley RE, Mobasheri A. Hypoxic regulation of glucose transport, anaerobic metabolism and angiogenesis in cancer: novel pathways and targets for anticancer therapeutics. Chemotherap. 2007; 53: 233-256. Du J, Cullen JJ, Buettner GR. Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer. Biochi Biophys Acta. 2012; 1826: 443-457. Wood IS, Trayhurn P. Glucose transporters (GLUT and SGLT): expanded families of sugar transport proteins. Br J Nutr. 2003; 89: 3-9. Wu X, Freeze HH. GLUT14, a duplicon of GLUT3, is specifically expressed in testis as alternative splice forms. Genomics. 2002; 80: 553-557. Joost HG, Thorens B. The extended GLUT-family of sugar/polyol transport facilitators: nomenclature, sequence characteristics, and potential function of its novel members (Review). Mo Membr Biol. 2001; 18: 247-256. Zhao FQ, Keating AF. Functional properties and genomics of glucose transporters. Curr Genomics. 2007; 8: 113-128. Samih N, Hovsepian S, Notel F, Prorok M, Zattara-Cannoni H, Mathieu S i wsp. The impact of N- and O-glycosylation on the functions of Glut-1 transporter in human thyroid anaplastic cells. Biochim Biophys Acta. 2003; 1621: 92-101. Macheda ML, Rogers S, Best JD. Molecular and cellular regulation of glucose transporter (GLUT) proteins in cancer. J Cell Physiol. 2005; 202: 654-662. P. Jóźwiak 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 261 Younes M, Brown RW, Stephenson M, Gondo M, Cagle PT. Overexpression of GLUT1 and GLUT3 in stage I nonsmall cell lung carcinoma is associated with poor survival. Cancer. 1997; 80: 1046-1051. Ayala FR., Rocha RM, Carvalho KC, Carvalho AL, da Cunha IW, Lourenco SV, i wsp. GLUT1 and GLUT3 as potential prognostic markers for oral squamous cell carcinoma. Molecules. 2010; 15: 1046-1051. Furuta E, Okuda H, Kobayashi A, Watabe K. Metabolic genes in cancer: their roles in tumor progression and clinical implications. Biochim Biophys Acta, 2010; 1805: 141-152. Maschauer S, Prante O, Hoffmann M, Deichen JT, Kuwert T. Characterization of 18F-FDG uptake in human endothelial cells in vitro. J Nucl Med. 2004; 45: 455-460. Usuda K, Sagawa M, Aikawa H, Ueno M, Tanaka M, Machida Y i wsp. Correlation between glucose transporter-1 expression and 18F-fluoro-2deoxyglucose uptake on positron emission tomography in lung cancer. Gen Thorac Cardiovasc Surg. 2010; 58: 405-410. Kaira K, Endo M, Abe M, Nakagawa K, Ohde Y, Okumura T i wsp. Biologic correlates of ¹⁸F-FDG uptake on PET in pulmonary pleomorphic carcinoma. Lung Cancer. 2011; 71: 144-150 Su H, Bodenstein C, Dumont RA, Seimbille Y, Dubinett S, Phelps ME. Monitoring tumor glucose utilization by positron emission tomography for the prediction of treatment response to epidermal growth factor receptor kinase inhibitors. Clin Cancer Res. 2006; 12: 5659-5667. Cifuentes M, García MA, Arrabal PM, Martínez F, Yañez MJ, Jara N i wsp. Insulin regulates GLUT1-mediated glucose transport In MG-63 human osteosarcoma cells. J Cell Physiol. 2011; 226: 1425-1432. Hayashi M, Sakata M, Takeda T, Yamamoto T, Okamoto Y, Sawada K i wsp. Induction of glucose transporter 1 expression through hypoxia-inducible factor 1α under hypoxic conditions in trophoblast-derived cells. J Endocrinol. 2004; 183: 145-154. Frolova A, Flessner L, Chi M, Kim ST, Foyouzi-Yousefi N, Moley KH. Facilitative glucose transporter type 1 is differentially regulated by progesterone and estrogen in murine and human endometrial stromal cells. Endocrinology. 2009; 150: 1512-1520. Díaz M, Vraskou Y, Gutiérrez J, Planas JV. Expression of rainbow trout glucose transporters GLUT1 and GLUT4 during in vitro muscle cell differentiation and 262 24. 25. 26. 27. 28. 29 30. 31. 32. 33. 34. Rola transporterów GLUT1 i GLUT3 w nowotworach regulation by insulin and IGF-I. Am J Physiol Regu Integr Comp Physiol. 2009; 296: R794-R800. Schwartzenberg-Bar-Yoseph F, Armoni M, Karnieli E. The tumor suppressor p53 down-regulates glucose transporters GLUT1 and GLUT4 gene expression. Cancer Res. 2004; 64: 2627-2633. Yun J, Rago C, Cheong I, Pagliarini R, Angenendt P, Rajagopalan H i wsp. Glucose deprivation contributes to the development of KRAS pathway mutations in tumor cells. Science. 2009; 325: 1555-1559 Maher JC, Savaraj N, Priebe W, Liu H, Lampidis TJ. Differential sensitivity to 2-deoxy- D-glucose between two pancreatic cell lines correlates with GLUT1 expression. Pancreas. 2005; 30: e34-e39. Aft RL, Zhang FW, Gius D. Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanizm of cell death. Br J Cancer. 2002; 87: 805-812. Kurtoglu M, Gao N, Shang J, Maher JC, Lehrman MA, Wangpaichitr M, i wsp. Under normoxia, 2-deoxy-D-glucose elicits cell death in select tumor types not by inhibition of glycolysis but by interfering with N-linked glycosylation. Mol Cancer Ther. 2007; 6: 3049-3058. Dwarakanath BS. Cytotoxicity, radiosensitization, and chemosensitization of tumor cells by 2-deoxy-D-glucose in vitro. J Cancer Res Ther. 2009; 5 Suppl. 1: 27-31. Dwarakanath BS, Khaitan D, Ravindranath T. 2-deoxy-D-glucose enhances the cytotoxicity of topoisomerase inhibitors in human tumor cell lines. Cancer Biol Ther. 2004; 3: 864-870. Maschek G, Savaraj N, Priebe W, Braunschweiger P, Hamilton K, Tidmarsh GF. 2-deoxy-D-glucose increases the efficacy of adriamycin and paclitaxel in human osteosarcoma and non-small cell lung cancers in vivo. Cancer Res. 2004; 64: 31-34. Subbarayan PR, Wang PG, Lampidis TJ, Ardalan B, Braunschweiger P. Differential expression of GLUT1 mRNA and protein levels correlates with increased sensitivity to the glyco-conjugated nitric oxide donor (2-glu-SNAP) in different tumor cell types. J Chemother. 2008; 20: 106-111. Corti A, Casini AF, Pompella A. Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate. Arch Biochem Biophys. 2010; 500: 107-115 Rumsey SC, Kwon O, Xu GW, Burant CF, Simpson I, Levine M. Glucose transporter isoforms GLUT1 and GLUT3 transport dehydroascorbic acid. J Biol Chem. 1997; 272: 18982-18989. P. Jóźwiak 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 263 Rumsey SC, Daruwala R, Al-Hasani H, Zarnowski MJ, Simpson IA, Levine M. Dehydroascorbic acid transport by GLUT4 in Xenopus oocytes and isolated rat adipocytes. J Biol Chem. 2000; 275: 28246-28253. Bode AM, Liang HQ, Green EH, Meyer TE, Buckley DJ, Norris A. Ascorbic acid recycling in Nb2 lymphoma cells: implications for tumor progression. Free Radic Biol Med. 1999; 26: 136-147. Vera JC, Rivas CI, Zhang RH, Farber CM, Golde DW. Human HL-60 myeloid leukemia cells transport dehydroascorbic acid via the glucose transporters and accumulate reduced ascorbic acid. Blood. 1994; 84: 1628-1634. Spielholz C, Golde DW, Houghton AN, Nualart F, Vera JC. Increased facilitated transport of dehydroascorbic acid without changes in sodium-dependent ascorbate transport in human melanoma cells. Cancer Res. 57: 2529-2537. Corti A, Raggi C, Franzini M, Paolicchi A, Pompella A, Casini AF. Plasma membrane gamma-glutamyltransferase activity facilitates the uptake of vitamin C in melanoma cells. Free Radic Biol Med. 2004; 37: 1906-1915. KC S, Cárcamo JM, Golde DW. Viatmin C enters mitochondria via facilitative glucose transporter 1 (Glut1) and confers mitochondrial protection against oxidative injury. FASEB J. 2005; 19: 1657-1667 Ozer A, Bruick RK. Non-heme dioxygenases: cellular sensors and regulators jelly rolled into one? Nat Chem Biol. 2007; 3: 144-153. Tajima S, Pinnell SR. Ascorbic acid preferentially enhances type I and III collagen gene transcription in human skin fibroblasts. J Dermato Sci. 1996; 11: 250-253. Groblewska M, Mroczko B, Szmitkowski M. The role of selected matrix metalloproteinases and their inhibitors in colorectal cancer development. Postepy Hig Med Dosw. 2010; 64: 22-30. Bruick RK, McKnight SL. A conserved family of prolyl-4-hydroxylases that modify HIF. Science. 2001; 294: 1337-1340. Pagé EL, Chan DA, Giaccia AJ, Levine M, Richard DE. Hypoxia-inducible factor-1α stabilization in nonhypoxic conditions: role of oxidation and intracellular ascorbate depletion. Mol Biol Cell 2008; 19: 86-94. Li SH, Ryu JH, Park SE, Cho YS, Park JW, Lee WJ i wsp. Vitamin C supplementation prevents testosterone-induced hyperplasia of rat prostate by down-regulating HIF-1alpha. J Nutr Biochem. 2010; 21: 801-808. Cascella B, Mirica LM. Kinetic analysis of iron-dependent histone demethylases: α-ketoglutarate substrate inhibition and potential relevance to the regulation of histone demethylation in cancer cells. Biochemistry. 2012; 51: 8699-8701. 264 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. Rola transporterów GLUT1 i GLUT3 w nowotworach Esteban MA, Pei D. Vitamin C improves the quality of somatic cell reprogramming. Nat Genet. 2012; 44: 366-367. Ong TP, Moreno FS, Ross SA. Targeting the epigenome with bioactive food components for cancer prevention. J Nutrigenet Nutrigenomics. 2011; 4: 275-292. Li Y, Schellhorn HE. New development and novel therapeutic perspectives for vitamin C. J Nutr. 2007; 137: 2171-2184. Aditi A, Graham DY. Vitamin C, gastritis, and gastric disease: a historical review and update. Gig Dis Sci. 2012; 57: 2504-2515. Verrax J, Calderon PB. The controversial place of vitamin C in cancer treatment. Biochem Pharmacol. 2008; 76: 1644-1652 Valko M, Rhodes CJ, Moncol J, Izakovic M, Mazur M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chem Biol Interact. 2006; 160: 1-40 Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MT, Mazur M, Telser J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol. 2007; 39: 44-84. Cameron E, Campbell A. The orthomolecular treatment of cancer. II. Clinical trial of high-dose ascorbic acid supplements in advanced human cancer. Chem Biol Interact. 1974; 9: 285-315. Mandl J, Szarka A, Bánhegyi G. Vitamin C: update on physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 2009; 157: 1097-1110. Padayatty SJ, Sun H, Wang Y, Riordan HD, Hewitt SM, Katz A, i wsp. Vitamin C pharmacokinetics: implications for oral and intravenous use. Ann Intern Med. 2004; 140: 533-537. Mikirova N, Casciari J, Rogers A, Taylor P. Effect of high-dose intravenous vitamin C on inflammation in cancer patients. J Transl Med. 2012; 10:187. Espey MG, Chen P, Chalmers B, Drisko J, Sun AY, Levine M, i wsp. Pharmacologic ascorbate synergizes with gemcitabine in preclinical models of pancreatic cancer. Free Radic Biol Med. 2011; 50: 1610-1619. Vollbracht C, Schneider B, Leendert V, Weiss G, Auerbach L, Beuth J. Intravenous vitamin C administration improves quality of life in breast cancer patients during chemo-/radiotherapy and aftercare: results of a retrospective, multicentre, epidemiological cohort study in Germany. In Vivo. 2011; 25: 983-990. Folia Medica Lodziensia, 2012, 39/2: 265-292 Zaburzenia kaskady transformujących czynników wzrostu typu β w wybranych patologiach człowieka Aberrations in the signalling cascade of transforming growth factor β type in selected human pathologies PIOTR K. ZAKRZEWSKI Katedra Cytobiochemii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytet Łódzki Streszczenie Kaskada sygnalizacyjna transformujących czynników wzrostu typu β (TGFβ) stanowi indukowany przez wiele cytokin szlak przekazywania sygnału w komórce, pod kontrolą którego znajduje się szereg procesów komórkowych odpowiedzialnych za prawidłowe funkcjonowanie ludzkiego organizmu. Znaczenie zaburzeń sygnalizacji indukowanej czynnikami TGFβ pozostaje nadal nie do końca poznane. Niemniej jednak już na obecnym etapie badań stwierdzić można ich bezsprzeczny udział w patologiach układu kostno-mięśniowego, układu krwionośnego czy układu rozrodczego. Słowa kluczowe: transformujące czynniki wzrostu typu β - TGFβ, sygnalizacja komórkowa, patofizjologia, polimorfizm, mutacje. Abstract A transforming growth factor β type (TGFβ) cascade is a multifactorial signalling pathway, which controls the plethora of cellular processes responsible for human organism homeostasis. The importance of alterations of TGFβ-induced signalling remains unknown. Up till now, impaired TGFβ signalling has been observed in pathologies of the musculoskeletal, cardiovascular and reproductive systems. Abnormalities in the TGFβ pathway can be either genetically determined or appear as spontaneous disorders which emerged during embryonic development. Understanding the role of the TGFβ Adres do korespondencji: Piotr Zakrzewski; Katedra Cytobiochemii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki 90-236 Łódź, ul. Pomorska 141/143, tel.: 42 635-52-99, fax.: 42 635-44-84, e-mail: [email protected] TGFβ w chorobach człowieka 266 pathway in the aetiology of various diseases appears to be necessary as it may serve in developing new strategies for therapeutic or diagnostic methods. Key words: transforming growth factor β type - TGFβ, cellular signalling, pathophysiology, polymorphism, mutations. Wstęp Różnorodność funkcji i procesów komórkowych jest następstwem udziału wysoce specyficznych szlaków sygnalizacyjnych, dzięki aktywności których sygnał pochodzący z zewnątrz komórki, zostaje przekazany do jej wnętrza, czego konsekwencją jest regulacja transkrypcji określonych genów. Inicjacja sygnalizacji komórkowej zwykle następuje pod wpływem interakcji ligandów obecnych w macierzy zewnątrzkomórkowej ze specyficznymi receptorami, będącymi nieodzownymi elementami błony komórkowej. Przekazywanie tak zainicjowanego sygnału następuje często dzięki aktywności kinazowej (tyrozynowej lub serynowo/treoninowej) domeny cytoplazmatycznej receptorów. Funkcja receptorów może być modulowana przez dodatkowe białka błonowe pełniące rolę receptorów pomocniczych (ang. accessory receptors, auxilliary receptors, co-receptors), których głównym zadaniem jest prezentowanie ligandów ich specyficznym receptorom. Przykładem szlaku sygnalizacyjnego inicjowanego ligandami obecnymi w macierzy zewnątrzkomórkowej jest szlak transformujących czynników wzrostu typu β (TGFβ, ang. transforming growth factor β). W szlaku tym przekazywanie sygnału następuje dzięki aktywności kinazowej serynowo/treoninowej specyficznych transbłonowych receptorów. Aktywność tych receptorów dodatkowo modulowana jest przez transbłonowe lub zakotwiczone na P.K. Zakrzewski 267 powierzchni błony białka, odpowiedzialne za prezentowanie ligandów receptorom dla transformujących czynników wzrostu typu β. Tabela 1. Zaburzenia kaskady TGFβ w wybranych patologiach człowieka. Komponent szlaku TGFβ Choroba Zaburzenie Układ kostno-mięśniowy Zespół Camuratiego-Engelmana TGFβ1 wzrost ekspresji ALK2 mutacja aktywująca ALK3 wzrost ekspresji BMP-4 wzrost ekspresji Chondrodysplazja typu Grebego (CGT), chondrodysplazja Huntera-Thompsona (CHTT) GDF-5 utrata funkcji Brachodaktylia typu A2 (BDA2) ALK6 utrata funkcji Zrosty kostne stawów śródręczno-paliczkowych GDF-5 mutacja aktywująca Osteoporoza TGFβ1 wzrost ekspresji Dystrofia mięśniowa Duchenne’a (DMD) GDF-8 mutacja aktywująca Postępujące kostniejące zapalenie-mięśni (FOP) Układ naczyniowy Wrodzona naczyniakowatość krwotoczna (HHT), zespół Rendu-Oslera-Webera endoglina (CD105) utrata funkcji ALK1 utrata funkcji Układ rozrodczy Zespół przetrwałych przewodów Müllera (PMDS) Pierwotna niewydolność jajników (POF) MIS/AMH obniżenie ekspresji MISRII/AMHRII utrata funkcji BMP-15 inhibina A utrata funkcji utrata funkcji TGFβ w chorobach człowieka 268 Różnorodność transformujących czynników wzrostu typu β pociąga za sobą mnogość procesów fizjologicznych regulowanych przez te czynniki. Zaburzenia przekazywania sygnału w kaskadzie TGFβ są przyczyną wielu chorób człowieka zarówno dziedzicznych, jak i pozbawionych komponenty genetycznej. Do chorób tych należą nieprawidłowości w układzie kostno-mięśniowym oraz tkanki łącznej, choroby układu krwionośnego, nieprawidłowości budowy i funkcji układu rozrodczego będące przyczyną bezpłodności, jak również zaburzeń rozwojowych (Tabela. 1). Kaskada TGFβ Rodzina transformujących czynników wzrostu typu β to liczna grupa ewolucyjnie zakonserwowanych (utrwalonych) białek, których cytokinowa aktywność wykazuje plejotropowy efekt w wielu fizjologicznych i patologicznych procesach. Do rodziny TGFβ zalicza się oprócz trzech izoform TGFβ, tj. TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, które to uznawane są za białka prototypowe, ponad 30 polipeptydów takich jak: aktywiny A i B (ang. activins), inhibiny A i B (ang. inhibins), białka morfogenetyczne kości 1-20 (BMP, ang. bone morphogenetic proteins), czynniki wzrostu i różnicowania (GDF, ang. growth differentiation factors), np. miostatyna, czynniki determinujące asymetrię lewoprawo, tj. nodal i lefty 1 i 2, oraz MIS/AMH (ang. Müllerian-inhibiting substance/anti-Müllerian hormone) [1-3]. Na podstawie podobieństwa w obrębie ich sekwencji aminokwasowej, jak i rodzaju szlaku sygnalizacyjnego, który może zostać indukowany ich aktywnością, wspomniane czynniki podzielone zostały na dwie podrodziny – TGFβ/aktywiny/nodal/lefty/miostatyna oraz BMP/GDF/MIS [4-7]. Cechą wspólną wszystkich czynników należących do rodziny TGFβ jest siedem ewolucyjnie zakonserwowanych reszt P.K. Zakrzewski 269 cysteinowych tworzących strukturę rdzeniową (ang. cysteine knot) [8]. Ligandy te funkcjonujące w formie dimerów syntetyzowane są w formie prekursorowego pre-probiałka. Aktywną formę TGFβ stanowią dimery o masie cząsteczkowej 25 kDa. W tak złożonym homodimerze, obie podjednostki polipeptydów połączone są ze sobą wiązaniami disiarczkowymi, a całość struktury stabilizowana jest oddziaływaniami hydrofobowymi. Prekursor TGFβ w wyniku działania proteaz pozbawiony zostaje peptydu sygnałowego o długości 112 reszt aminokwasowych od strony C-końca, czemu towarzyszy uwolnienie dojrzałej formy białka. Postać dojrzała białka pozostaje związana w sposób niekowalencyjny z N-końcowym fragmentem probiałka (LAP, ang. latencyassociated peptide). Kompleks formy dojrzałej oraz białka LAP tworzy dimer nazywany małym kompleksem latentnym (SLC, ang. small latency complex). SLC łącząc się następnie z białkiem LTBP (ang. latent TGFβ binding protein) formuje tzw. duży kompleks latentny (LLC, ang. large latent complex). LTBP ze względu na swoją strukturę, oddziałuje z białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM, ang. extracellular matrix), a tym samym odpowiedzialny jest za magazynowanie TGFβ w ECM do momentu jego aktywacji [8-10]. Wydzielone do macierzy zewnątrzkomórkowej latentne formy czynnika TGFβ podlegają różnorodnym procesom, prowadzącym do ich aktywacji [11], tak aby mogły oddziaływać ze specyficznymi receptorami błonowymi o aktywności kinaz serynowo/treoninowych. W obrębie receptorów dla czynników TGFβ wyróżnić można dwie podstawowe grupy, tj. receptory typu I oraz typu II. Podział ten został dokonany na podstawie właściwości strukturalnych obu typów receptorów. Receptory typu I cechuje obecność w ich strukturze aminokwasowej regionu regulatorowego bogatego w reszty glicyny i seryny (ang. GS region), ulokowanego powyżej domeny kinazowej [12]. W komórkach człowieka 270 TGFβ w chorobach człowieka zidentyfikowano siedem receptorów typu I, które określa się wspólnym mianem ALK (ang. activin receptor-like kinases), z jednoczesnym wskazaniem numeru od 1 do 7 dla odpowiedniego receptora. Natomiast w przypadku receptorów typu II zidentyfikowano pięć białek, tj. ActRII, ActRIIB (ang. activin receptor), BMPRII (ang. BMP receptor), MISRII/AMHRII (ang. Müllerian-inhibiting substance receptor/anti-Müllerian hormone receptor) oraz TGFβRII (ang. TGFβ receptor II) [9]. Ligandy mogą wiązać się zarówno z receptorem typu I jak i typu II w sposób niezależny lub jak ma to miejsce w przypadku izoform TGFβ, w pierwszej kolejności powstaje kompleks ligand-receptor typu II, do którego następnie przyłączany jest receptor typu I. W przypadku braku ligandów w macierzy zewnątrzkomórkowej receptor typu II może ulegać homodimeryzacji, jak również heterooligomeryzacji z podjednostkami receptora typu I [13]. Niektóre czynniki z rodziny TGFβ oddziałują z więcej niż jednym receptorem typu II, co skutkuje interakcją powstałego kompleksu z różnymi receptorami typu I (Tabela 2). Aktywowane receptory typu I i II przekazują sygnał wewnątrzkomórkowym mediatorom, tj. białkom z rodziny Smad (ang. similar to mother against + mother against decapentaplegic) [14]. Pierwszymi zidentyfikowanymi białkami będącymi homologami białek z rodziny Smad, występującymi u kręgowców, były odkryte u Drosphila melanogaster białko Mad (ang. mother against decapentaplegic) oraz trzy białka występujące u Caenorhabditis elegans: Sma-2, Sma-3 oraz Sma-4 (ang. similar to mother against). Białka Smad kręgowców podzielone zostały na trzy podklasy ze względu na pełnione przez nie w komórce funkcje: receptorowe Smad – R-Smad (ang. receptor-activated Smad), inhibitorowe Smad – I-Smad (ang. inhibitory Smad) oraz pośredniczące Smad – Co-Smad (ang. common-mediators Smad). Aktywacja białek R-Smad, do których należą Smad1, Smad2, Smad3, Smad5 P.K. Zakrzewski 271 i Smad8 następuje w wyniku fosforylacji przez receptory TGFβ typu I. Białka Smad1, Smad5 i Smad8 są efektorami sygnalizacji inicjowanej BMP, natomiast Smad2 i Smad3 zaangażowane są w przekazywanie sygnału pochodzącą od czynników TGFβ/aktywiny/nodal. Tabela 2. Receptory i ich ligandy w kaskadzie TGFβ. Nazwa receptora Ligandy Receptory typu I ALK1 aktywina A, BMP-9, TGFβ1, TGFβ3 ALK2 aktywina A, BMP-6, BMP-7, MIS/AMH, TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3 ALK3 (BMPRIA) BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7 ALK4 aktywina A, GDF-1, GDF-11, nodal ALK5 (TGFβRI) TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3 ALK6 (BMPRIB) BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, GDF-5, GDF-6, GDF-9b, MIS/AMH ALK7 nodal Receptory typu II ActRII ActRIIB BMPRII aktywina A, BMP-2, BMP-6, BMP-7, GDF-1, GDF-5, GDF-8, GDF-9b, GDF-11, inhibina A, inhibina B aktywina A, BMP-2, BMP-6, BMP-7, GDF-5, GDF-8, GDF-11, inhibina A, inhibina B, nodal BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, GDF-5, GDF-6, GDF-9b MISRII/AMHRII MIS/AMH TGFβRII TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3 Receptory pomocnicze BETAGLIKAN (TGFβRIII) BMP-2, BMP-4, BMP-7, GDF-5, inhibina, TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3 ENDOGLINA (CD105) aktywina A, BMP-2, BMP-7, TGFβ1, TGFβ3 CD109 TGFβ1, TGFβ3 TGFβ w chorobach człowieka 272 Aktywowane białka R-Smad tworzą wraz białkiem Smad4 (Co-Smad) heteromeryczne kompleksy, które po translokacji do jądra komórkowego modulują w sposób bezpośredni lub w kompleksach z innymi czynnikami transkrypcyjnymi ekspresję genów docelowych (Ryc. 1) [15, 16]. Ryc. 1. Przekazywanie sygnału w kaskadzie TGFβ. Badania nad mechanizmem przekazywania sygnału indukowanego czynnikami TGFβ pozwoliły stwierdzić, że oprócz udziału receptorów typu I i typu II, ważną rolę odgrywają inne białka zlokalizowane na powierzchni błony komórkowej. W literaturze określane są one jako receptory pomocnicze (ang. auxiliary, accessory receptors) lub receptory typu III. Receptory pomocnicze są białkami transbłonowymi lub zakotwiczonymi w błonie komórkowej za P.K. Zakrzewski 273 pośrednictwem glikolipidów. W swej strukturze posiadają silnie rozbudowaną domenę zewnątrzkomórkową, zdolną do wiązania ligandów, lecz pozbawione są domeny funkcjonalnej o aktywności enzymatycznej. Główną ich funkcją jest modulowanie siły sygnału poprzez tworzenie z ligandami kompleksów oraz prezentowanie ich stosownym receptorom. Ze względu na brak aktywności enzymatycznej, termin receptory pomocnicze, nie może zostać uznany za pojęcie systematyczne, gdyż receptory te nie stanowią aktywnych przekaźników sygnału. Do tej pory zidentyfikowano trzy główne receptory pomocnicze kaskady TGFβ, tj. betaglikan (TGFβRIII), endoglinę (antygen CD105) oraz antygen CD109 (Tabela 2). Betaglikan wykazuje w komórkach ludzkich powinowactwo do wszystkich trzech izoform TGFβ, niemniej jednak oddziaływanie to nie zachodzi z taką samą siłą w stosunku do każdej izoformy. Betaglikan najefektywniej wiąże się z TGFβ2, tym samym wzmacnia sygnał pochodzący od tej właśnie izoformy. Niektórzy badacze postulują, że to właśnie tylko za pośrednictwem betaglikanu następuje przekazywanie sygnału indukowanego czynnikiem TGFβ2, ponieważ powinowactwo tej izoformy do receptorów TGFβRI i TGFβRII jest stosunkowo niskie. Potwierdzeniem tego jest fakt, iż komórki niewykazujące ekspresji betaglikanu, są niewrażliwe na stymulację czynnikiem TGFβ2 [17-20]. Analizując rolę endogliny w przekazywaniu sygnału stwierdzono, że oddziałuje ona zarówno z receptorem TGFβRI jak i TGFβRII. W przeciwieństwie do betaglikanu endoglina nie tworzy bezpośrednio kompleksów z izoformami czynników TGFβ. Tworzenie kompleksów z receptorami następuje niezależnie od obecność ligandów. Endoglina wykazuje powinowactwo tylko do izoform TGFβ1 i TGFβ3, przy czym najsilniej oddziałuje z izoformą TGFβ1. Taki sposób oddziaływania z czynnikami TGFβ wynika ze specyficzności wiązania TGFβ w chorobach człowieka 274 się receptora TGFβRII ze wspomnianymi izoformami. W literaturze znaleźć można również informacje wskazujące, na zdolność endogliny do oddziaływania z kompleksami sygnalizacyjnymi innych czynników z rodziny TGFβ. Stwierdzono, że endoglina wykazuje powinowactwo do aktywiny i czynnika BMP-7 związanych z receptorami ActRII lub ActRIIB, jak również z czynnikiem BMP-2 związanym z receptorem ALK3 lub ALK6 [21]. Zaburzenia w układzie kostno-mięśniowym Układ kostny pełni w organizmie człowieka różnorodne funkcje wśród których wyróżnić można: regulowanie stężenia jonów wapnia we krwi, stabilizację oraz ochronę narządów wewnętrznych, jak i miejsce procesów krwiotwórczych. Zbudowany jest on w głównej mierze z organicznej macierzy utworzonej przez kolagen typu I, wysyconej nieorganicznymi kryształami hydroksyapatytu. Mineralno-organiczna budowa kości determinuje zachodzące w nich ciągłe procesy mineralizacji i demineralizacji, określane łącznie jako proces remodelowania, zachodzący przy udziale osteoklastów oraz osteoblastów. Znaczącą rolę w procesach resorpcji oraz formowania kości, odgrywa jedna z trzech izoform czynnika TGFβ, tj. izoforma pierwsza. TGFβ1 zaangażowany jest w proces tworzenia kości, tj. stymulację proliferacji i różnicowanie komórek progenitorowych osteoblastów. Ekspresja TGFβ w tkance kostnej nie ograniczona jest tylko do okresu rozwoju embrionalnego, lecz ma miejsce również w organizmach dorosłych, w których to zaobserwowano podwyższony poziom ekspresji czynników TGFβ zwłaszcza podczas zrastania się złamań. Ponadto na skutek aktywności TGFβ1 zahamowaniu ulega proces apoptozy osteoblastów [22]. Rolę TGFβ1 w procesach fizjologicznych tkanki kostnej potwierdziły badania na modelu P.K. Zakrzewski 275 mysim. Zwierzęta, u których zablokowano jego ekspresję wykazywały zahamowanie wzrostu i mineralizacji kości, a ponadto kości ich posiadały obniżoną elastyczność oraz aktywność fosfatazy alkalicznej. Innym ważnym czynnikiem z rodziny TGFβ zaangażowanym w metabolizm tkanki kostnej jest czynnik BMP, którego aktywność indukuje proces formowania kości. Selektywne zablokowanie ekspresji dwóch czynników z rodziny BMP, tj. BMP-2 oraz BMP-4 w listku mezenchymalnym, odpowiedzialnym za wykształcenie kończyn u myszy powodowało poważne zaburzenia w ich formowaniu [23]. Jednakże wyciszenie ekspresji powyższych czynników w sposób niezależny, tj. każdego z czynników z osobna, nie wpływało ujemnie na proces formowania kości kończyn. Niemniej jednak w przypadku czynnika BMP-2 przyczyniało się do zwiększenia podatności osobników na złamania, a także powodowało zahamowanie inicjacji procesu zrastania się złamanych kończyn. Podobnego efektu nie stwierdzono w przypadku braku ekspresji czynnika BMP-4 [24, 25]. Równie ważną rolę w procesie kościotworzenia pełnią odpowiednie receptory dla białek morfogenetycznych kości, tj. BMPR1A oraz BMPR1B, których wyciszenie ekspresji w chondrocytach jest przyczyną chondrodysplazji oraz zaburzeń formowania kości, na skutek zaburzonej proliferacji i różnicowania chondrocytów [26]. Jednostką chorobową związaną z mutacjami w genie kodującym izoformę TGFβ1 jest zespół wad wrodzonych Camuratiego-Engelmanna (CED, ang. Camurati-Engelmann disease), określany inaczej jako postępująca dysplazja kości długich (ang. progressive diaphyseal dysplasia). Dziedziczony jest on w sposób autosomalny dominujący, natomiast najczęstszymi objawami tej niezwykle rzadkiej choroby genetycznej jest zwiększona gęstość oraz stwardnienie kości, zwłaszcza trzonów kości długich oraz czaszki, upośledzone funkcjonowanie szpiku kostnego, jak również 276 TGFβ w chorobach człowieka zmniejszenie siły motorycznej mięśni, kaczkowaty chód oraz silne bóle kostne [22, 27]. Do tej pory zidentyfikowano około 40 mutacji w genie TGFβ1. Większość z nich dotyczy fragmentu genu kodującego region LAP, podczas gdy inne mają miejsce w regionie kodującym peptyd sygnałowy. Najczęściej występującymi mutacjami są mutacje typu „zmiany sensu” (ang. missense mutation), które prowadzą do zwiększonej ekspresji izoformy TGFβ1, a tym samym wzmożonej odpowiedzi komórki na sygnał przez nią indukowany [28]. Ponadto badania na liniach komórkowych nabłonka nerki, które charakteryzowały mutacje identyfikowane w zespole Camuratiego-Engelmanna, wykazały zwiększony efekt autokrynny oraz nasilenie transkrypcji genów aktywowanych czynnikami TGFβ [27]. Kolejną chorobą związaną z układem kostno-mięśniowym, u podstaw której leżą zaburzenia przekazywania sygnału szlaku TGFβ jest postępujące kostniejące zapalenie mięśni (FOP, ang. fibrodysplasia ossificans progressiva). Jest to choroba autosomalna dominująca, charakteryzująca się postępującym kostnieniem tkanki mięśniowej, co ma miejsce w sposób spontaniczny lub na skutek doznanego urazu, zabiegu chirurgicznego, bądź infekcji wirusowej. Molekularną przyczyną FOP jest mutacja w genie ACVR1, kodującym receptor typu I ALK2, prowadząca do podstawienia reszty argininy, zlokalizowanej w domenie GS receptora, resztą histydyny [29]. Mutacja ta wydaje się być charakterystyczna dla sporadycznych, jak i rodzinnych postaci choroby. Podobnie jak w przypadku mutacji obserwowanych w zespole CED, mutacja ta ma charakter aktywujący, tj. receptor nabiera konstytutywnej aktywności kinazowej w sposób niezależny od obecności ligandu [29, 30]. Analiza ekspresji genów w limfocytach oraz w komórkach progenitorowych zębów mlecznych pacjentów cierpiących na FOP wykazała zwiększony poziom ekspresji czynnika BMP-4, jak również P.K. Zakrzewski 277 zwiększoną ekspresję genów indukowanych tymi czynnikami. Podwyższony poziom ekspresji obserwowano też w przypadku receptora typu I ALK3, co sugeruje jako przyczynę FOP zaburzenia przekazywania sygnału indukowanego czynnikami BMP. Równolegle stwierdzono również wzmożoną aktywność szlaku kinaz MAP (ang. mitogen-activated protein), które aktywowane są czynnikami BMP [31-34]. Zaburzenia w sygnalizacji BMP potwierdzone zostały na modelu mysim. Transgeniczne osobniki, u których indukowano nadekspresję czynnika BMP-4 wykazywały cechy fenotypowe zbliżone do ludzkiej postaci FOP [34]. Chorobami manifestującymi się skróceniem elementów szkieletowych i/lub nieprawidłowo wykształconymi stawami są chondrodysplazja typu Grebego (CGT, ang. chodrodysplasia Grebe type), bądź chondrodysplazja Huntera-Thompsona (CHTT, ang. chodrodysplasia Hunter-Thompson type). Pod względem molekularnym CHTT spowodowana jest mutacją zmiany sensu w obu allelach genu kodującego czynnik GDF-5, tym samym dziedziczona jest w sposób autosomalny recesywny. Mutacja ta powoduje całkowitą utratą funkcji wspomnianego białka [35]. Natomiast w przypadku CGT obserwowana jest w domenie funkcjonalnej substytucja zachowanej ewolucyjnie reszty cysteiny resztą tyrozyny. Rezultatem takiej zamiany jest nabycie przez białko GDF-5 zdolności do tworzenia heterokompleksów z białkami należącymi do podrodziny BMP [35-37]. Eksperymenty na zwierzętach, u których blokowano ekspresję czynnika GDF-5, potwierdziły jego funkcję w procesie kostnienia. Osobniki takie wykazywały zaburzenia kondensacji chrząstki oraz proliferacji chondrocytów [37]. Mutacje w genie GDF-5, których rezultatem jest zmniejszenie powinowactwa czynnika GDF-5 do receptora typu I ALK6 zostały zidentyfikowane także w brachodaktylii typu A2 (BDA2, ang. brachodactyly type A2). Choroba ta charakteryzuje się autosomalnym dominującym modelem TGFβ w chorobach człowieka 278 dziedziczenia, a objawia się skróceniem i zakrzywieniem paliczków palca wskazującego oraz pierwszego i drugiego palca u stóp [38]. Ponadto obserwowane są również mutacje zmiany sensu w regionie GS oraz domenie kinazowej receptora typu I ALK6. Delecja genu GDF-5 u myszy manifestowała się silną redukcją kości kończyn oraz nieprawidłowo wykształconymi połączeniami stawowymi [39]. Przeciwny skutek mutacji w genie GDF-5, tzn. wzrost powinowactwa receptora typu I ALK6 stwierdzono u osób dotkniętych zrostami kostnymi stawów śródręczno-paliczkowych (ang. symphalangism) czyli dziedziczoną autosomalnie chorobą manifestującą się występowaniem sztywnych połączeń kostnych w stawach stóp i dłoni. Kolejną chorobą związana z nieprawidłowościami w szlaku sygnalizacyjnym TGFβ jest osteoporoza (zrzeszotnienie kości). W przeciwieństwie do omawianych wcześniej rzadkich jednostek chorobowych, ta występuje stosunkowo często, zwłaszcza wśród kobiet w wieku pomenopauzalnym. Rozwój osteoporozy jest wynikiem zaburzenia równowagi między procesami resorpcji i kostnienia, które w warunkach fizjologicznych podlegają wieloczynnikowej regulacji. Do głównych przyczyn związanych z czynnikami TGFβ należy zaliczyć występowanie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP, ang. single nucleotide polymorphism) w genach kodujących izoformę TGFβ1 [22], receptory TGFβRI oraz TGFβRII, jak również białka efektorowe szlaku TGFβ, tj. Smad2, Smad3, Smad4 i Smad7 [40]. Polimorfizmy genu kodującego TGFβ1 podzielono ze względu na miejsce ich występowania, tj. na promotorowe, kodujące, bądź intronowe. Pierwsze z nich przyczyniają się do zmienionego poziomu ekspresji czynnika TGFβ1. Efektem polimorfizmów w obrębie sekwencji kodujących najczęściej są zaburzenia struktury czwartorzędowej lub zmieniony metabolizm kodowanego białka. Natomiast w przypadku P.K. Zakrzewski 279 polimorfizmów zlokalizowanych w intronach, sugeruje się ich bezpośredni wpływ na proces składania pierwotnego transkryptu i możliwość powstawania różnych wariantów funkcjonalnych [22]. Potwierdzeniem powyższych przypuszczeń jest fakt występowania podwyższonego stężenia TGFβ1 w surowicy krwi osób, u których zidentyfikowano wspomniane polimorfizmy. Ponadto, u osób z osteoporozą zaobserwowano obniżony efekt terapeutyczny witaminy D [41, 42], która wzmaga procesy formowania kości poprzez indukcję proliferacji osteoblastów oraz mineralizację macierzy zewnątrzkomórkowej [22]. Omówione powyżej zaburzenia funkcji niektórych elementów kaskady TGFβ skutkowały nieprawidłowościami w procesie resorpcji oraz formowania kości, niemniej jednak istnieją dowody potwierdzające także ich znaczący udział w patogenezie chorób związanych z tkanką mięśniową. Za przykład może posłużyć dystrofia mięśniowa Duchenne’a (DMD, ang. Duchenne muscular dystrophy), będąca jedną z najczęściej diagnozowanych chorób zanikowych mięśni. Początkowo dystrofii ulegają mięśnie szkieletowe, lecz wraz z postępem choroby obserwuje się zmiany także w mięśniu sercowym, prowadzące do kardiomiopatii. Pod względem etiologicznym pierwotną przyczyną DMD jest mutacja w genie niezwiązanym ze szlakiem TGFβ, kodującym białko dystrofinę [43]. Recesywny allel tego genu zlokalizowany jest na chromosomie X, przez co choroba ta podlega dziedziczeniu sprzężonemu z płcią. Obecność wspomnianej mutacji przyczynia się do obniżonego poziomu produktu białkowego. U pacjentów z DMD stwierdzono dodatkowo współistnienie mutacji zmiany sensu w genie czynnika GDF-8, znanego również z racji pełnionej funkcji jako miostatyna. GDF-8 to tkankowo specyficzny ligand z rodziny TGFβ, którego ekspresja charakterystyczna jest dla komórek tkanki mięśniowej. Pod jego kontrolą znajdują się procesy wzrostu komórek mięśniowych, a dokładniej TGFβ w chorobach człowieka 280 hamowanie ich wzrostu. Potwierdzeniem potencjalnej roli czynnika GDF-8 są wyniki badań, które wykazały, że u myszy knock-out genu GDF-8 z jednoczesnym współwystępowaniem mutacji genu dystrofiny powoduje pojawienie się fenotypu przeciwstawnego do obserwowanego w DMD, tj. zwiększoną masę oraz siłę mięśniową zwierząt [44, 45]. Nieprawidłowości w układzie naczyniowym Układ naczyniowy człowieka obejmują naczynia krwionośne oraz limfatyczne, zbudowane z pojedynczej warstwy komórek endotelium, otoczonych wieloma warstwami komórek tkanki mięśniowej gładkiej, a także perycytami. Procesy formowania układu naczyniowego noszą nazwę procesów waskulogenezy i angiogenezy [46]. Pierwszy z wymienionych procesów dotyczy formowania de novo pierwotnych naczyń w rozwijającym się zarodku, podczas gdy angiogeneza dotyczy wytwarzania nowych rozgałęzień już istniejącej funkcjonalnej sieci naczyń. Angiogenezę obserwuje się podczas całego życia organizmu, jego wzrostu oraz w trakcie gojenia się ran, jak również w następstwie i przerzutowania niektórych zmian procesów patofizjologicznych, nowotworowych oraz w tj. przypadku progresji chorób naczyniowych [47]. Regulacja procesów angiogenezy pozostaje pod ścisłą kontrolą różnorodnych współoddziałujących ze sobą szlaków sygnalizacyjnych, wśród których istotną rolę odgrywa kaskada sygnałowa inicjowana czynnikami TGFβ. Jednakże w przypadku aktywności czynników z rodziny TGFβ zjawisko regulacji procesu angiogenezy cechuje znacząca złożoność, wynikająca z plejotropowego wpływu tych czynników na komórki nabłonka. Czynniki te mogą pełnić rolę inhibitorów i/lub aktywatorów procesu formowania nowych naczyń. Ich wpływ nie zależy tylko od rodzaju działającego czynnika, lecz P.K. Zakrzewski 281 również od stopnia zaawansowania całego procesu. Niektóre z nich początkowo pełnią funkcję ograniczającą rozrost naczyń włosowatych, tak aby w późniejszych etapach przybrać charakter aktywujący. Rola poszczególnych komponentów szlaku TGFβ została bliżej poznana dzięki badaniom na modelach mysich, w których hamowanie ekspresji wybranych elementów kaskady powodowało ujawnienie się patologicznego fenotypu. Nieprawidłowości dotyczące układu krwionośnego stwierdzono w przypadku wyciszania genów kodujących receptory typu I i II ALK1, ALK5 i TGFβRII, receptory pomocnicze betaglikan i endoglinę oraz białka efektorowe Smad1, Smad2, Smad4, Smad5, Smad6 i Smad7. Zahamowanie ekspresji receptorów ALK1, ALK5 oraz TGFβRII przyczyniało się do zaburzeń rozwoju sieci naczyń krwionośnych, natomiast brak ekspresji białek z rodziny Smad skutkował nieprawidłowościami w rozwoju i funkcjonowaniu serca. Ponadto stwierdzono komórkowospecyficzną ekspresję endogliny w intensywnie proliferujących komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych. Komórki endotelium pochodzące od embrionów o fenotypie endoglina -/- wykazywały obniżony poziom migracji oraz niezdolność do prawidłowej proliferacji w warunkach in vitro [47-50]. Dotychczas zidentyfikowane zostało kilkadziesiąt mutacji w genach kodujących komponenty szlaku TGFβ mających jak się okazało decydujące znaczenie w rozwoju wybranych chorób układu naczyniowego. Przykładem choroby w etiologię, której naczyniakowatość zaangażowana krwotoczna jest (HHT, kaskada ang. TGFβ hereditary jest wrodzona hemorrhagic telangiectasia), określana również jako zespół Rendu-Oslera-Webera. Jest to choroba dziedziczona w sposób autosomalny dominujący, charakteryzująca się częstością występowania około 1/7500 przypadków [51]. Do głównych jej objawów należą dysplazje naczyń włosowatych, obejmujące zależnie od typu TGFβ w chorobach człowieka 282 (HHT1, HHT2) różne narządy wewnętrzne. W przypadku HHT1 obserwowana jest przewaga zaburzeń w wykształceniu połączeń tętniczo-żylnych w obrębie płuc, wątroby oraz mózgu, podczas gdy w HHT2 występujące malformacje tętniczo-żylne dotyczą znacznie częściej kanalików nerkowych [52]. Podobieństwo cech klinicznych obu typów HHT sprawia, że jednoznaczna diagnoza może zostać postawiona jedynie dzięki badaniom genetycznym na obecność określonych mutacji. Liczne badania potwierdziły bezsporny udział komponentów szlaku TGFβ, tj. endogliny oraz receptora typu I ALK1 w rozwoju HHT [50]. Mutacje w genie ENG kodującym endoglinę stwierdzono u chorych na HHT typu pierwszego. Lokalizacja mutacji ograniczona jest do regionu kodującego domenę zewnątrzkomórkową endogliny. Przyczyniają się one zatem do nieprawidłowego wiązania ligandów, co skutkuje wadliwym przekazywaniem sygnału indukowanego czynnikami TGFβ. Mutacje genu endogliny obejmują szeroki wachlarz zmian, tj. delecje, insercje, mutacje zmiany sensu, nonsensowne, jak również zmiany składania pierwotnego transkryptu [53, 54]. Większość z tych mutacji skutkuje biosyntezą białka posiadającego skrócony łańcuch aminokwasowy, co uniemożliwia jego eksport do błony komórkowej, miejsca występowania i aktywności endogliny [55]. Natomiast typ drugi HHT związany jest z obecności mutacji genu ACVRL1, który odpowiedzialny jest za syntezę receptora typu I ALK1. W przeciwieństwie do mutacji w genie endogliny, zidentyfikowane mutacje dotyczą sekwencji kodujących domenę zewnątrz- oraz wewnątrzkomórkową, jak również fragment transbłonowy białka. Największą liczbę mutacji wykryto w domenie cytoplazmatycznej, która ma decydujące znaczenie w przekazywaniu sygnału [51, 55, 56]. Głównym mechanizmem, którego zaburzenia prowadzą do rozwoju wrodzonej naczyniakowatości krwotocznej jest współistnienie w komórkach P.K. Zakrzewski 283 endotelium dwóch wykluczających się szklaków indukowanych czynnikami z rodziny TGFβ [57]. W pierwszym z nich przekazanie sygnału ma miejsce za pośrednictwem receptora typu I ALK1, co skutkuje aktywacją procesów proliferacji i migracji komórek endotelium. Przeciwstawny efekt obserwowany jest natomiast w sytuacji, gdy sygnał zewnątrzkomórkowy przekazywany jest do wnętrza komórki przez receptor typu I ALK5 [51, 55]. Klamrą spinającą oba mechanizmy jest w tym przypadku endoglina, która może oddziaływać zarówno z receptorem ALK1 oraz ALK5 [58-60]. Nieprawidłowości w układzie rozrodczym Rodzina czynników TGFβ odgrywa również znaczącą rolę w rozwoju i funkcjonowaniu układu rozrodczego. Dzięki aktywności ligandów TGFβ regulowane są takie procesy jak rozwój pęcherzyków jajnikowych, rekrutowanie pęcherzyków pierwotnych, proliferacja komórek warstwy ziarnistej i osłonki oocytu, ekspresja receptorów gonadotropin, dojrzewanie oocytu, owulacja, luteinizacja oraz formowanie ciałka żółtego, czy rozwoju jąder [61, 62]. Kluczową rolę w wymienionych procesach odgrywają aktywiny oraz inhibiny, które są wzajemnymi antagonistami. Poprzez wiązanie się z receptorem pomocniczym kaskady TGFβ betaglikanem, inhibiny działają hamująco na sygnalizację pochodzącą od aktywin, blokując im tym samym dostępność receptora typu II. Innym zidentyfikowanym antagonistą aktywin warunkującym zahamowanie sygnalizacji pochodzącej od czynników BMP jest folistatyna [63, 64]. Wpływ aktywin i inhibin w fizjologicznych warunkach na rozwój i funkcjonowanie układu rozrodczego potwierdzają badania na modelach mysich w których wykazano, że nadekspresja inhibiny A prowadzi u osobników męskich do obniżenia wielkości jąder, podczas gdy u samic skutkuje 284 TGFβ w chorobach człowieka upośledzeniem dojrzewania pęcherzyków jajnikowych. Zwiększona ekspresja inhibiny A przyczynia się do zaburzonej sekrecji hormonu folikulotropowego (FSH, ang. follicle-stimulating hormone) przez przysadkę [65]. Podobny efekt do nadekspresji inhibiny A uzyskano wyciszając ekspresję genu receptora dla aktywiny ACVR2, co prowadziło u samic do bezpłodności, podczas gdy u samców dochodziło do zmniejszenia wielkości jąder [62]. W warunkach fizjologicznych, podczas rozwoju embrionalnego ssaków, komórki Sertolego obecne w jądrach wytwarzają hormony odpowiedzialne za prawidłowe wykształcenie męskiego układu rozrodczego. Pod wpływem testosteronu przewody Wolffa ulegają przekształceniu w najądrze, nasieniowód oraz kanaliki nasienne, podczas gdy czynnik z rodziny TGFβ, tj. MIS/AMH warunkuje zanik przewodów Müllera w rozwijającym się jądrze. W przypadku braku sekrecji czynnika MIS/AMH przez komórki Sertolego, przewody Müllera rozwijają się w jajowody, macicę oraz pochwę. Brak regresji przewodów Müllera w zarodku męskim charakteryzuje bardzo rzadką jednostkę chorobową, uwarunkowaną genetycznie o recesywnym modelu dziedziczenia, określaną jako zespół przetrwałych przewodów Müllera (PMDS, ang. persistent Müllerian duct syndrome). Choroba ta manifestuje się obecnością jajowodów oraz macicy u osobników fenotypowo męskich na skutek zbyt niskiego poziomu czynnika MIS/AMH w trakcie rozwoju płodowego. Aktualnie zidentyfikowano 38 mutacji w genie kodującym czynnik MIS/AMH, odpowiedzialnych za obniżenie jego stężenia. Najczęściej są to mutacje zmiany sensu w obrębie domeny C-końcowej. Obecność mutacji w genie kodującym MIS/AMH skutkuje nieprawidłowym transportem syntetyzowanych cząsteczek czynnika z siateczki śródplazmatycznej, bądź wpływa na tworzenie struktur wyższego rzędu i obniżenie stabilność produktu białkowego w komórce. Oprócz obniżonego P.K. Zakrzewski 285 poziomu ekspresji czynnika MIS/AMH u osób z PMDS obserwuje się również mutacje w genie kodującym receptor typu II dla tego czynnika, tj. MISRII/AMHRII. Rezultatem mutacji w receptorze MISRII/AMHRII jest formowanie postaci rozpuszczalnej receptora lub syntetyzowanie skróconego białka pozbawionego domeny kinazowej. Forma rozpuszczalna receptora nie wbudowuje się do błony cytoplazmatycznej komórki, podczas gdy brak domeny kinazowej uniemożliwia prawidłowe wiązanie ligandu przez receptor. Oba zaburzenia molekularne dają podobny obraz kliniczny i są praktycznie nie do odróżnienia bez badań molekularnych. Ponadto zidentyfikowano również przypadki kliniczne, w których pomimo prawidłowej ekspresji czynnika MIS/AMH i receptora MISRII/AMHRII występują cechy zespołu przetrwałych przewodów Müllera. Jednakże dotychczasowe badania dotyczące innych komponentów kaskady TGFβ nie wykazały obecności zaburzeń molekularnych na tym poziomie [66-69]. Inną jednostką chorobową związaną z zaburzeniami w sygnalizacji TGFβ, a dotyczącą układu rozrodczego człowieka jest zespół przedwczesnego wygasania funkcji jajników (POF, ang. premature ovarian failure). Choroba ta wiąże się z z zanikiem funkcji jajników u kobiet poniżej czterdziestego roku życia i jest jedną z przyczyn wtórnego braku miesiączki oraz niepłodności. Czynnikami związanymi z chorobą jest wysokie stężenie gonadotropin oraz hipoestrogenizm, jak również zanik czynności jajników, w którym dochodzi do rozwoju tkanki łącznej w miejscu pęcherzyków jajnikowych. Obecnie zidentyfikowane zostały mutacje w genach kodującym czynnik BMP-15 oraz podjednostkę α inhibiny A. Wydaje się również, że za występowanie POF odpowiedzialny jest polimorfizm w eksonie 12 genu kodującego receptor pomocniczy kaskady TGFβ, tj. betaglikan [70-73]. TGFβ w chorobach człowieka 286 Podsumowanie Nieprawidłowości w kaskadzie TGFβ mają charakter zarówno uwarunkowany genetycznie, jak i są zaburzeniami spontanicznymi, zaistniałymi podczas rozwoju embrionalnego. Identyfikacja molekularnych przyczyn dysfunkcji na poziomie przekazywania sygnału w szlaku TGFβ umożliwi w przyszłości wytypowanie nowych potencjalnych celów dla interwencji farmakologicznych. Poznanie roli szlaku TGFβ w etiologii różnych chorób wydaje się być cenne w opracowywaniu nowych strategii terapeutycznych lub metod diagnostycznych. Podziękowania Podziękowania dla prof. dr hab. Wandy M. Krajewskiej za pomoc oraz cenne uwagi podczas przygotowywania pracy. Praca finansowana z dotacji na prowadzeniu badań naukowych lub prac rozwojowych oraz zadań z nimi związanych służących rozwojowi młodych naukowców oraz uczestników studiów doktoranckich (Rozporządzenie MNiSW z 5 listopada 2010 r.). Piśmiennictwo 1. 2. 3. Heldin CH, Miyazono K, ten Dijke P. TGF-beta signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins. Nature. 1997; 390: 465-471. Miyazono K, Maeda S, Imamura T. BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev. 2005; 16: 251-263. De Caestecker M. The transforming growth factor-beta superfamily of receptors. Cytokine Growth Factor Rev. 2004; 15: 1-11. P.K. Zakrzewski 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 287 Shi Y, Massague J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 2003; 113: 685-700. Massague J. TGFbeta in Cancer. Cell. 2008; 134: 215-230. Derynck R, Akhurst RJ. Differentiation plasticity regulated by TGF-beta family proteins in development and disease. Nat Cell Biol. 2007; 9: 1000-1004. Roberts AB, Wakefield LM. The two faces of transforming growth factor beta in carcinogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100: 8621-8623. Rahimi RA, Leof EB. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 2007; 102: 593-608. Padua D, Massague J. Roles of TGFbeta in metastasis. Cell Res. 2009; 19: 89-102. Mokrosinski J, Krajewska WM. TGF beta signalling accessory receptors. Postepy Biochem. 2008; 54: 264-273. Yang Z, Mu Z, Dabovic B, Jurukovski V, Yu D, Sung J i wsp. Absence of integrin-mediated TGFbeta1 activation in vivo recapitulates the phenotype of TGFbeta1-null mice. J Cell Biol. 2007; 176: 787-793. Massague J, Gomis RR. The logic of TGFbeta signaling. FEBS Lett. 2006; 580: 2811-2820. Stover DG, Bierie B, Moses HL. A delicate balance: TGF-beta and the tumor microenvironment. J Cell Biochem. 2007; 101: 851-861. Glasgow E, Mishra L. Transforming growth factor-beta signaling and ubiquitinators in cancer. Endocr Relat Cancer. 2008; 15: 59-72. ten Dijke P, Hill CS. New insights into TGF-beta-Smad signalling. Trends Biochem Sci. 2004; 29: 265-273. Miyazawa K, Shinozaki M, Hara T, Furuya T, Miyazono K. Two major Smad pathways in TGF-beta superfamily signalling. Genes Cells. 2002; 7: 1191-1204. Rotzer D, Roth M, Lutz M, Lindemann D, Sebald W i wsp. Type III TGF-beta receptor-independent signalling of TGF-beta2 via TbetaRII-B, an alternatively spliced TGF-beta type II receptor. EMBO J. 2001; 20: 480-490. Bernabeu C, Lopez-Novoa JM, Quintanilla M. The emerging role of TGF-beta superfamily coreceptors in cancer. Biochim Biophys Acta. 2009; 1792: 954-973. Santander C, Brandan E. Betaglycan induces TGF-beta signaling in a ligandindependent manner, through activation of the p38 pathway. Cell Signal. 2006; 18: 1482-1491. Wiater E, Harrison CA, Lewis KA, Gray PC, Vale WW. Identification of distinct inhibin and transforming growth factor beta-binding sites on betaglycan: 288 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. TGFβ w chorobach człowieka functional separation of betaglycan co-receptor actions. J Biol Chem. 2006; 281: 17011-17022. Barbara NP, Wrana JL, Letarte M. Endoglin is an accessory protein that interacts with the signaling receptor complex of multiple members of the transforming growth factor-beta superfamily. J Biol Chem. 1999; 274: 584-594. Janssens K, ten Dijke P, Janssens S, Van Hul W. Transforming growth factorbeta1 to the bone. Endocr Rev. 2005; 26: 743-774. Bandyopadhyay A, Tsuji K, Cox K, Harfe BD, Rosen V, Tabin CJ. Genetic analysis of the roles of BMP2, BMP4, and BMP7 in limb patterning and skeletogenesis. PLoS Genet. 2006; 2: e216. Tsuji K, Cox K, Bandyopadhyay A, Harfe BD, Tabin CJ, Rosen V. BMP4 is dispensable for skeletogenesis and fracture-healing in the limb. J Bone Joint Surg Am. 2008; 90 Suppl 1: 14-18. Tsuji K, Bandyopadhyay A, Harfe BD, Cox K, Kakar S, Gerstenfeld L i wsp. BMP2 activity, although dispensable for bone formation, is required for the initiation of fracture healing. Nat Genet. 2006; 38: 1424-1429. Yoon BS, Ovchinnikov DA, Yoshii I, Mishina Y, Behringer RR, Lyons KM. Bmpr1a and Bmpr1b have overlapping functions and are essential for chondrogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102: 5062-5067. Janssens K, ten Dijke P, Ralston SH, Bergmann C, Van Hul W. Transforming growth factor-beta 1 mutations in Camurati-Engelmann disease lead to increased signaling by altering either activation or secretion of the mutant protein. J Biol Chem. 2003; 278: 7718-7724. Harradine KA, Akhurst RJ. Mutations of TGFbeta signaling molecules in human disease. Ann Med. 2006; 38: 403-414. Groppe JC, Shore EM, Kaplan FS. Functional modeling of the ACVR1 (R206H) mutation in FOP. Clin Orthop Relat Res. 2007; 462: 87-92. Yu PB, Deng DY, Lai CS, Hong CC, Cuny GD, Bouxsein ML i wsp. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic [corrected] ossification. Nat Med. 2008; 14: 1363-1369. Fiori JL, Billings PC, De La Pena LS, Kaplan FS, Shore EM. Dysregulation of the BMP-p38 MAPK signaling pathway in cells from patients with fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP). J Bone Miner Res. 2006; 21: 902-909. Billings PC, Fiori JL, Bentwood JL, O'Connell MP, Jiao X, Nussbaum B i wsp. Dysregulated BMP signaling and enhanced osteogenic differentiation of P.K. Zakrzewski 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 289 connective tissue progenitor cells from patients with fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP). J Bone Miner Res. 2008; 23: 305-313. Kaplan FS, Fiori J, De La Pena LS, Ahn J, Billings PC, Shore EM. Dysregulation of the BMP-4 signaling pathway in fibrodysplasia ossificans progressiva. Ann N Y Acad Sci. 2006; 1068: 54-65. Kan L, Hu M, Gomes WA, Kessler JA. Transgenic mice overexpressing BMP4 develop a fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP)-like phenotype. Am J Pathol. 2004; 165: 1107-1115. Massague J, Blain SW, Lo RS. TGFbeta signaling in growth control, cancer, and heritable disorders. Cell. 2000; 103: 295-309. Kawabata M, Imamura T, Miyazono K. Signal transduction by bone morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 1998; 9: 49-61. Thomas JT, Lin K, Nandedkar M, Camargo M, Cervenka J, Luyten FP. A human chondrodysplasia due to a mutation in a TGF-beta superfamily member. Nat Genet. 1996; 12: 315-317. Lehmann K, Seemann P, Stricker S, Sammar M, Meyer B, Suring K i wsp. Mutations in bone morphogenetic protein receptor 1B cause brachydactyly type A2. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100: 12277-12282. Seemann P, Schwappacher R, Kjaer KW, Krakow D, Lehmann K, Dawson K i wsp. Activating and deactivating mutations in the receptor interaction site of GDF5 cause symphalangism or brachydactyly type A2. J Clin Invest. 2005; 115: 2373-2381. Watanabe Y, Kinoshita A, Yamada T, Ohta T, Kishino T, Matsumoto N i wsp. A catalog of 106 single-nucleotide polymorphisms (SNPs) and 11 other types of variations in genes for transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1) and its signaling pathway. J Hum Genet. 2002; 47: 478-483. Yamada Y, Harada A, Hosoi T, Miyauchi A, Ikeda K, Ohta H i wsp. Association of transforming growth factor beta1 genotype with therapeutic response to active vitamin D for postmenopausal osteoporosis. J Bone Miner Res. 2000; 15: 415-420. Yamada Y, Miyauchi A, Goto J, Takagi Y, Okuizumi H, Kanematsu M i wsp. Association of a polymorphism of the transforming growth factor-beta1 gene with genetic susceptibility to osteoporosis in postmenopausal Japanese women. J Bone Miner Res. 1998; 13: 1569-1576. Nishiyama A, Takeshima Y, Saiki K, Narukage A, Oyazato Y, Yagi M i wsp. Two novel missense mutations in the myostatin gene identified in Japanese patients with Duchenne muscular dystrophy. BMC Med Genet. 2007; 8: 19 290 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. TGFβ w chorobach człowieka Wagner KR, McPherron AC, Winik N, Lee SJ. Loss of myostatin attenuates severity of muscular dystrophy in mdx mice. Ann Neurol. 2002; 52: 832-836. Bogdanovich S, Krag TO, Barton ER, Morris LD, Whittemore LA, Ahima RS i wsp. Functional improvement of dystrophic muscle by myostatin blockade. Nature. 2002; 420: 418-421. Brouillard P, Vikkula M. Genetic causes of vascular malformations. Hum Mol Genet. 2007; 16 Spec No. 2: R140-R149. Goumans MJ, Liu Z, ten Dijke P. TGF-beta signaling in vascular biology and dysfunction. Cell Res. 2009; 19: 116-127. Gordon KJ, Blobe GC. Role of transforming growth factor-beta superfamily signaling pathways in human disease. Biochim Biophys Acta. 2008; 1782: 197-228. Otten J, Bokemeyer C, Fiedler W. Tgf-Beta superfamily receptors-targets for antiangiogenic therapy? J Oncol. 2010; 2010: 317068ten Dijke P, Arthur HM. Extracellular control of TGFbeta signalling in vascular development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007; 8: 857-869. Fernandez L, Sanz-Rodriguez F, Blanco FJ, Bernabeu C, Botella LM. Hereditary hemorrhagic telangiectasia, a vascular dysplasia affecting the TGF-beta signaling pathway. Clin Med Res. 2006; 4: 66-78. Sabba C, Pasculli G, Lenato GM, Suppressa P, Lastella P, Memeo M i wsp. Hereditary hemorrhagic telangiectasia: clinical features in ENG and ALK1 mutation carriers. J Thromb Haemost. 2007; 5: 1149-1157. van den Driesche S, Mummery CL, Westermann CJ. Hereditary hemorrhagic telangiectasia: an update on transforming growth factor beta signaling in vasculogenesis and angiogenesis. Cardiovasc Res. 2003; 58: 20-31. Prigoda NL, Savas S, Abdalla SA, Piovesan B, Rushlow D, Vandezande K i wsp. Hereditary haemorrhagic telangiectasia: mutation detection, test sensitivity and novel mutations. J Med Genet. 2006; 43: 722-728. Abdalla SA, Letarte M. Hereditary haemorrhagic telangiectasia: current views on genetics and mechanisms of disease. J Med Genet. 2006; 43: 97-110. Park SO, Lee YJ, Seki T, Hong KH, Fliess N, Jiang Z, i wsp. ALK5- and TGFBR2-independent role ofALK1 in the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2. Blood. 2008; 111: 633-642. Goumans MJ, Valdimarsdottir G, Itoh S, Rosendahl A, Sideras P, ten Dijke P. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors. EMBO J. 2002; 21: 1743-1753. P.K. Zakrzewski 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 291 Lebrin F, Deckers M, Bertolino P, ten Dijke P. TGF-beta receptor function in the endothelium. Cardiovasc Res. 2005; 65: 599-608. Lebrin F, Goumans MJ, Jonker L, Carvalho RL, Valdimarsdottir G, Thorikay M i wsp. Endoglin promotes endothelial cell proliferation and TGF-beta/ALK1 signal transduction. EMBO J. 2004; 23: 4018-4028. Blanco FJ, Santibanez JF, Guerrero-Esteo M, Langa C, Vary CP, Bernabeu C. Interaction and functional interplay between endoglin and ALK-1, two components of the endothelial transforming growth factor-beta receptor complex. J Cell Physiol. 2005; 204: 574-584. Knight PG, Glister C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 2006; 132: 191-206. Matzuk MM, Kumar TR, Bradley A. Different phenotypes for mice deficient in either activins or activin receptor type II. Nature. 1995; 374: 356-360. Bilezikjian LM, Blount AL, Donaldson CJ, Vale WW. Pituitary actions of ligands of the TGF-beta family: activins and inhibins. Reproduction. 2006; 132: 207-215. Lewis KA, Gray PC, Blount AL, MacConell LA, Wiater E, Bilezikjian LM i wsp. Betaglycan binds inhibin and can mediate functional antagonism of activin signalling. Nature. 2000; 404: 411-414. Pierson TM, Wang Y, DeMayo FJ, Matzuk MM, Tsai SY, Omalley BW. Regulable expression of inhibin A in wild-type and inhibin alpha null mice. Mol Endocrinol. 2000; 14: 1075-1085. Josso N, Belville C, di Clemente N, Picard JY. AMH and AMH receptor defects in persistent Müllerian duct syndrome. Hum Reprod Update. 2005; 11: 351-356. Belville C, Van Vlijmen H, Ehrenfels C, Pepinsky B, Rezaie AR, Picard JY i wsp. Mutations of the anti-müllerian hormone gene in patients with persistent müllerian duct syndrome: biosynthesis, secretion, and processing of the abnormal proteins and analysis using a three-dimensional model. Mol Endocrinol. 2004; 18: 708-721. Belville C, Josso N, Picard JY. Persistence of Müllerian derivatives in males. Am J Med Genet. 1999; 89: 218-223. Belville C, Marechal JD, Pennetier S, Carmillo P, Masgrau L, Messika-Zeitoun L i wsp. Natural mutations of the anti-Müllerian hormone type II receptor found in persistent Müllerian duct syndrome affect ligand binding, signal transduction and cellular transport. Hum Mol Genet. 2009; 18: 3002-3013. Beck-Peccoz P, Persani L. Premature ovarian failure. Orphanet J Rare Dis. 2006; 1: 9 292 71. 72. 73. TGFβ w chorobach człowieka Di Pasquale E, Rossetti R, Marozzi A, Bodega B, Borgato S, Cavallo L i wsp. Identification of new variants of human BMP15 gene in a large cohort of women with premature ovarian failure. J Clin Endocrinol Metab. 2006; 91: 1976-1979. Chand AL, Ooi GT, Harrison CA, Shelling AN, Robertson DM. Functional analysis of the human inhibin alpha subunit variant A257T and its potential role in premature ovarian failure. Hum Reprod. 2007; 22: 3241-3248. Shelling AN, Burton KA, Chand AL, van Ee CC, France JT, Farquhar CM i wsp. Inhibin: a candidate gene for premature ovarian failure. Hum Reprod. 2000; 15: 2644-2649. Folia Medica Lodziensia, 2012, 39/2: 293-326 Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu Telomerase – structure, function and the regulation of gene expression MAGDALENA BRYŚ, MAGDALENA LASKOWSKA, EWA FORMA, ANNA KRZEŚLAK Katedra Cytobiochemii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki Streszczenie Telomer jest to fragment chromosomu zlokalizowany na jego końcu, który zabezpiecza go przed uszkodzeniem podczas kopiowania. Telomery są także czynnikami kontrolującymi liczbę podziałów komórkowych i dlatego uważane są za supresory transformacji nowotworowej, ponieważ ograniczona, ściśle kontrolowana liczba podziałów zapobiega ewentualnemu kumulowaniu się mutacji w komórce. Przyjęto, że obecność 4-6 mutacji w materiale genetycznym jest czynnikiem karcynogennym, a po granicznej liczbie podziałów (około 60-70) komórka wchodzi w fazę spoczynku M1. Enzymem, którego zadaniem jest dobudowanie 3'-końcowego odcinka nici DNA i tym samym wydłużanie sekwencji telomerowych jest enzym telomeraza. Białko to jest polimerazą DNA zależną od RNA, która syntetyzuje telomery na zasadzie odwrotnej transkrypcji. Unikalną cechą telomerazy jest to, że jej integralnym składnikiem jest matryca RNA służąca do syntezy DNA. Telomeraza występuje w intensywnie dzielących się komórkach, a jej aktywność zmniejsza się wraz z wiekiem. W komórkach prawidłowych zwykle nie stwierdza się aktywności telomerazy, natomiast w nowotworowych aktywność tego enzymu zwykle jest podwyższona. W pracy omówiono strukturę sekwencji telomerowych oraz udział białek zaangażowanych w jej utrzymanie. Szczegółowo przedstawiono także strukturę i funkcję genu/białka telomerazy, z uwzględnieniem regulacji ekspresji genu na poziomie transkrypcji. Scharakteryzowano ponadto udział telomerazy w procesach transformacji nowotworowej. Adres do korespondencji: dr hab. Magdalena Bryś, prof. nadzw. UŁ; Katedra Cytobiochemii, Uniwersytet Łódzki; 90-236 Łódź; ul. Pomorska 141/143; e-mail: [email protected] Tel.: + 48 42 6354371; Fax: +48 42 6354484 Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu 294 Słowa kluczowe: telomeraza, gen, białko, ekspresja genu, czynniki transkrypcyjne. Abstract A telomere is a fragment localized at the end of chromosome which protects the chromosome from damage during replication. Telomeres are also factors that control number of cell divisions and are thought to be a suppressors of carcinogenesis since limited, strictly determined number of cell divisions protects from accumulation of mutations in cell. It is assumed that presence of 4-6 mutation in genetic material is a carcinogenic factor and after about 60-70 divisions, the cell enter the resting phase. Telomerase is an enzyme which adds DNA sequence to the 3’ end of DNA and extends the telomere region. This protein is a DNA polymerase dependent on RNA, which syntheses telomere by reverse transcription. The unique characteristics of telomerase is that RNA matrix for DNA synthesis is an integral component of this enzyme. Telomerase is present in intensively dividing cells and its activity is decreasing with age. In normal cells usually activity of telomerase is undetectable but in cancer cells activity of this enzyme is high. The aim of this work is to present the structure of telomeres and the role of proteins involved in maintaining the structure. In details, the structure and function of the telomerase gene/protein is described, including the regulation of gene expression at the transcriptional level. The involvement of telomerase in the neoplastic transformation has been also characterized. Key words: telomerase, gene, protein, gene expression, transcription factors. Wstęp Opisy struktury i funkcji telomeru pojawiły się w literaturze naukowej w latach 30. XX wieku. Po raz pierwszy w 1978 roku sekwencja telomeru została określona u jednokomórkowego orzęska Tetrahymena pyriformis [1]. M. Bryś i wsp. 295 W latach 90. XX wieku Jerry Shay i współpracownicy wykryli telomerazę w 90 na 101 preparatach komórek pobranych z różnych nowotworów człowieka i nie wykazali obecności telomerazy w żadnej z 50 różnych, prawidłowych komórek somatycznych. Wyniki tych badań sugerowały, że telomeraza pełni istotną funkcję w procesie transformacji nowotworowej [2]. W 1997 r. Robert A. Weinberg wraz z zespołem badawczym sklonowali gen kodujący podjednostkę telomerazy o aktywności odwrotnej transkryptazy [3]. W 2009 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny za odkrycie, w jaki sposób telomery i enzym telomeraza chronią chromosomy, otrzymała trójka amerykańskich uczonych - Elizabeth H Blackburn, Jack W Szostak i Carol W Greiner [4]. Zgodnie z prawami natury, celem nadrzędnym wszystkich organizmów jest utrzymanie ciągłości gatunku i dokonuje się to poprzez przekazywanie materiału genetycznego organizmom potomnym. Aby organizm mógł prawidłowo funkcjonować, w czasie jego rozwoju osobniczego muszą zachodzić w ściśle określonym czasie procesy syntezy i naprawy uszkodzeń materiału genetycznego oraz programowanej śmierci komórki, czyli apoptozy. Zgodnie z teorią Kirkwooda oraz w związku z faktem, iż średnia długość życia człowieka wydłuża się, korzystniejsze jest wydatkowanie większej części energii na procesy naprawcze organizmu niż reprodukcyjne. Wraz z długością życia zwiększeniu ulega ryzyko związane z powstawaniem nowotworów, co bezpośrednio wynika z wydłużenia okresu działania czynników karcynogennych na komórki oraz z gromadzenia się nieprawidłowości na poziomie molekularnym [5]. Odmienna specyfika aktywności telomerazy w materiale prawidłowym i nowotworowym stała się podstawą do rozważania tego enzymu w kontekście terapii przeciwnowotworowej. Komórki nowotworowe charakteryzują się Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu 296 znacznie krótszymi telomerami niż komórki prawidłowe i zależne są od aktywności telomerazy. Zablokowanie aktywności tego enzymu może wpływać na zahamowanie transformacji nowotworowej bez równoczesnego ingerowania w funkcjonowanie komórek prawidłowych [6, 7] Odmienna specyfika aktywności telomerazy w materiale prawidłowym i nowotworowym stała się podstawą do rozważania tego enzymu w kontekście terapii przeciwnowotworowej. Komórki nowotworowe charakteryzują się znacznie krótszymi telomerami niż komórki prawidłowe i zależne są od aktywności telomerazy. Zablokowanie aktywności tego enzymu może wpływać na zahamowanie transformacji nowotworowej bez równoczesnego ingerowania w funkcjonowanie komórek prawidłowych [6, 7]. Struktura i funkcje telomerów Telomery (gr. telos – koniec i meros – część) są to wyspecjalizowane kompleksy nukleoproteinowe, które chronią zakończenia prawidłowych chromosomów przed degradacją i fuzją, co w konsekwencji przekłada się na utrzymanie stabilności genomu [1, 8, 9]. W komórkach człowieka występują 92 telomery, po jednym na każdym końcu chromosomu. Wysoce konserwatywne sekwencje telomerowe są kilkutysięcznymi, nie kodującymi, powtarzającymi się motywami nukleotydowymi, bogatymi w reszty guaniny i tyminy [10]. U człowieka i większości kręgowców powtarzającym się motywem jest sekwencja TTAGGG [11, 12]. Sekwencje telomerowe wybranych organizmów zawarte zostały w Tabeli 1. M. Bryś i wsp. 297 Tabela1. Sekwencje telomerowego DNA u wybranych zwierząt i roślin [wg 13, 14] ORGANIZM Sekwencja (5’→3’) człowiek (łac.Homo sapiens) TTAGGG drożdże (łac. Saccharomyces cerevisiae) TGTGGGTGTGGTG glista ludzka (łac. Ascaris lumbricoides) TTAGGC jedwabnik (łac. Bombyx mori) TTAGG mysz polna (łac. Apodemus agrarius) TTAGGG pantofelek (łac. Paramecium caudatum) TTGGG(T/G) rzodkiewnik pospolity (łac. Arabidopsis thaliana) TTTAGGG tasiemiec uzbrojony (łac. Taenia solium) TTAGGC zawłotnia (łac. Chlamydomonas) TTTTAGGG U człowieka powtórzenia (TTAGGG)n mają długość około 15-20 kpz w chwili narodzin, ale już u osób dorosłych ulegają skróceniu do 8-10 kpz. Długość sekwencji telomerowych wykazuje zmienność osobniczą, jak również może wahać się w zależności od komórki czy tkanki [15, 16]. Obowiązujący aktualnie model struktury telomeru uzyskano dzięki badaniom z użyciem mikroskopu elektronowego. Jest on zdecydowanie bardziej złożony w swojej przestrzennej strukturze, niż wynikało to z modelu klasycznego, który zakładał strukturę liniową. W obecnym modelu jednoniciowe końce 3’ chromosomów, o długości około 75–200 pz, tworzą strukturę przestrzenną zwaną kwartetem G (G4-DNA), który uniemożliwia dostęp egzonukleaz do końcowych odcinków telomerów i tym samym zabezpiecza nić DNA przed degradacją. Różne struktury przestrzenne kwartetu G zostały przedstawione na ryc. 1 i 2. 298 Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu Ryc. 1. Struktura kwartetu G [wg 20, w modyfikacji własnej]. Oddziaływanie z białkiem G4BP (białko oddziałujące z sekwencją kwartetu G, ang. G-quadruplex binding protein) dodatkowo wzmacnia konstrukcję kwartetu G (Ryc. 3) [17-19]. Dwuniciowe fragmenty DNA na końcach telomerów formują dwie pętle – pętlę T (ang. T-loop) oraz pętlę D (ang. D-loop). Pętla T zakończona jest jednoniciowym „zwisającym” fragmentem na końcu 3’. Pętla D natomiast, powstaje kilkaset nuklotydów wcześniej niż pętla T i jest formowana dzięki oddziaływaniu między jednoniciowym i dwuniciowym DNA, na zasadzie wyparcia jednej nici dupleksu (Ryc. 4) [18]. Konfiguracja pętli T jest strukturą zabezpieczającą, dzięki której koniec 3’ chromosomu jest ukryty. Uniemożliwia to błędne uznanie go przez systemy naprawcze DNA jako uszkodzenie ciągłości nici [23]. M. Bryś i wsp. 299 Ryc. 2. Przestrzenne struktury kwartetu G. DNA bogate w reszty guaniny może tworzyć różne struktury kwartetu G. Pojedyncza nić DNA może składać się ku sobie, tworząc wewnętrzny kwartet G, podczas gdy dwie i cztery nici DNA mogą się łączyć odpowiednio, w struktury dimeryczne lub tetrameryczne. Strzałki wskazują orientację DNA – równoległą i przeciwrównoległą. Reszty guanozyny przedstawione zostały w różnych kolorach, według konfiguracji wiązania glikozydowego. Wiązanie glikozydowe typu „anty” – kolor szary, typu „trans” – kolor czarny [wg 21; w modyfikacji własnej]. 300 Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu Ryc. 3. (A) Schemat sekwencji nukleotydowej oraz przestrzennej organizacji kwartetu G. (B) Model końca telomeru niezabezpieczonego przed trawieniem egzonukleolitycznym oraz telomer z uformowanym kwartetem G i przyłączonym do niego białkiem G4BP [wg 22; w modyfikacji własnej]. M. Bryś i wsp. 301 Ryc. 4. Schemat obrazujący powstawanie pętli na zakończeniach chromosomów [wg 22; w modyfikacji własnej]. Telomery chronione są przez wyspecjalizowane kompleksy białkowe, które rozpoznają podwójną nić DNA oraz kwartet G. Taki białkowy kompleks w komórkach ssaków nazywany jest „shelterin” i składa się z sześciu białek: TRF1 i TRF2 (czynnik wiążący się do podwójnych powtórzeń TTAGGG 1, 2, ang. telomeric repeat binding factor 1, 2), RAP1 (białko represorowoaktywatorowe, ang. repressor - activator protein 1), TIN2 (czynnik jądrowy oddziałujący z TRF1 2, ang. TRF1 interacting nuclear factor 2), TPP1 (trójpeptydylopeptydaza 1, ang. tripeptidyl peptidase 1) i POT1 (białko chroniące telomery 1, ang. protection of telomeres 1) [24]. Białka TRF1 TRF2 łączą się bezpośrednio z telomerowym dwuniciowym DNA, natomiast białka RAP1, TIN2, TPP1 i POT1 stabilizują strukturę kompleksu „shelterin” [25-27]. 302 Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu Układ przestrzenny i charakterystyka wyżej wymienionych białek została przedstawiona na rycinie 5 oraz w Tabeli 2. Ryc. 5. Układ przestrzenny kompleksu „shelterin” oraz konfiguracja białek podtrzymująca strukturę pętli T i pętli D telomeru [wg 28, 29; w modyfikacji własnej]. Białko POT1 łącząc się z pojedynczą nicią telomerowego DNA oddziałuje z białkiem TPP1. Guanina na końcu 3' telomerowego DNA jest „zanurzona” w białku POT1, co powoduje niedostępność substratu dla telomerazy i najprawdopodobniej hamuje wydłużanie nici DNA. Z kolei białko Rap1 łączy się z białkiem TIN2 oraz białkami TRF1 i TRF2. Białko TIN2 oddziałuje również zarówno z białkiem TRF1, jak i TRF2, a jego zadaniem jest rekrutacja białek POT1 oraz TPP1 do dwuniciowego fragmentu telomeru [30, 31] M. Bryś i wsp. 303 Tabela 2. Funkcje białek tworzących kompleks “shelterin” [wg 25; 31]. Białko Funkcje TRF1 Negatywnie reguluje długość telomerów, zapobiega przyłączaniu się telomerazy do matrycy RNA, może występować w postaci dimeru z białkiem TRF2, rozpoznając dwuniciowy fragment telomeru, wiąże się z nim poprzez domenę Myb. TRF2 Zapobiega fuzji końców telomerów, ułatwia tworzenie się pętli T. TIN2 Reguluje dostęp telomerazy do telomerów, umożliwia białkom TPP1 i POT1 związanie się z dwuniciowym fragmentem telomeru. TPP1 Umożliwia oddziaływanie między białkami POT1 i TIN2. POT1 Reguluje długość telomerów, odgrywa kluczową rolę w tworzeniu się pętli D. RAP1 Reguluje długość telomerów, zapobiega fuzji końców telomerów. Białko TRF1 oraz TRF2 ulegają ekspresji we wszystkich typach ludzkich komórek. Wiążą się z telomerowymi powtórzeniami w czasie cyklu komórkowego i bezpośrednio wpływają na regulację długości telomerów, bądź za pomocą oddziaływania z innymi czynnikami. TRF1 współdziała z telomerazą oraz TIN2. TRF2 oddziałuje z białkiem Rap1 i kompleksem naprawy DNA Mre11/Rad50/Nbs1. Także inne czynniki zaangażowane w detekcję oraz naprawę uszkodzeń DNA oddziałują z białkiem TRF2 i wiążą się z telomerowym DNA. Jest to, między innymi, heterodimer Ku70/80 [25]. Wydaje się, że kompleks ten może działać tylko jako całość, ponieważ zaburzenia w jednym ze składników mogą mieć wpływ na działalność pozostałych komponentów i prowadzić do utraty ochronnej funkcji telomerów [32]. Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu 304 Telomery jako struktury dynamiczne, ochraniające końce chromosomów przed degradacją, odpowiadają między innymi za umożliwienie systemom naprawczym rozpoznania prawidłowych i uszkodzonych zakończeń chromosomów, przestrzenną organizację jądra komórkowego oraz regulację transkrypcji genów zlokalizowanych w pobliżu telomerów [33, 34]. Ponadto, telomery zapobiegają translokacjom, amplifikacjom i delecjom materiału genetycznego. Zabezpieczając przed fuzją chromosomów, zapewniają prawidłowy przebieg procesu rekombinacji i zapobiegają powstawaniu chromosomów dicentrycznych. W przypadku uszkodzenia telomeru często dochodzi do procesu rekombinacji. W zależności od typu tego zjawiska, dochodzi do fuzji ramion chromosomów typu p-p, p-q i q-q [35, 36]. Po osiągnięciu krytycznego stanu skrócenia telomerów (3 kpz), przy którym zakończenia chromosomów nie są w stanie utrzymać charakterystycznej dla telomerów struktury pętli, telomery nie mogą chronić chromosomów przed utratą materiału genetycznego i niestabilnością genomu, co prowadzi do śmierci komórki. Jest to jeden z mechanizmów inicjujących apoptozę i naturalna konsekwencja starzenia się komórek [37]. Aż do wczesnych lat 60 uważano, że hodowane prawidłowe komórki człowieka, mogą dzielić się nieskończenie wiele razy, tak długo jak dobre warunki hodowli zostaną utrzymane. Przełom nastąpił w 1965 roku za sprawą Leonarda Hayflick’a, który obalił dotychczasową koncepcję i wykazał, iż prawidłowe komórki człowieka mają ograniczoną liczbę podziałów. To zjawisko starzenia replikacyjnego prawidłowych komórek ludzkich bardzo często nazywane jest „limitem Hayflicka” (około 60 podziałów). Każdy podział komórki związany jest z nieodwracalnym skracaniem sekwencji telomerowej o ok. 50-150 pz., co jest związane z problem replikacji końców nici opóźnionej. M. Bryś i wsp. 305 Polimeraza DNA replikuje tylko w kierunku 5’→3’, a do uruchomienia replikacji wymaga starterowych fragmentów RNA, co powoduje niepełną replikację nici DNA przy końcu 5’ [38, 39]. Telomer jest tzw. molekularnym zegarem biologicznym wyznaczającym ściśle określoną liczbę podziałów komórkowych. Komórki mają więc ograniczony potencjał proliferacyjny, a co za tym idzie po pewnej liczbie podziałów wkraczają w etap starzenia się. Tracą wtedy zdolność podziałów, ale nadal są aktywne metabolicznie [40]. Telomery dzięki określonej liczbie podziałów komórkowych stają się supresorami procesu nowotworzenia, gdyż w ten sposób zapobiegają nagromadzeniu się mutacji prowadzących do rozwoju nowotworu [35, 36, 41, 42]. Telomeraza – struktura i funkcje U większości ssaków za utrzymanie odpowiedniej długości telomerów odpowiada specyficzna odwrotna tranksyptaza – telomeraza. Jest to enzym odgrywający kluczową rolę także w takich procesach jak proliferacja komórki i transformacja nowotworowa [43]. Unikalną cechą telomerazy jest to, że jej integralnym składnikiem jest matryca RNA służąca do syntezy DNA. Telomeraza jest polimerazą DNA zależną od RNA, która syntetyzuje telomery na zasadzie odwrotnej transkrypcji. Jest to duży kompleks rybonukleoproteinowy - masa cząsteczkowa holoenzymu telomerazy przekracza 500 kDa [44]. Telomeraza człowieka składa się z fragmentu nici RNA (hTERC/hTR) oraz podjednostki białkowej o aktywności odwrotnej transkryptazy (hTERT) [45]. Struktura genu TERC u różnych organizmów różni się pod względem rozmiaru, jak i sekwencji nukleotydowej. Dojrzała struktura genu TERC u Saccharomyces cerevisiae składa się z 1167 nukleotydów, podczas, gdy u pierwotniaków i 306 Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu ssaków jest ona znacząco krótsza i wynosi odpowiednio około 150 i 450 nukleotydów [46-49]. Struktura TERC zawiera: • domenę centralną • miejsce wiązania białek odpowiedzialnych za dojrzewanie i stabilizację domeny • miejsce wiązania z TERT Ryc. 6. Schemat ludzkiego chromosomu 3 z zaznaczoną lokalizacją genu hTERC (q26). Gen hTERC zlokalizowany jest na chromosomie 3q26 (Rys 6). Jest on transkrybowany przez polimerazę RNA II. Składa się z 445 nukleotydów, z powtarzającą się sekwencją 11 nukleotydową: 5’-(CUAACCCUAAC)-3’, która jest komplementarna do sekwencji telomeru (TTAGGG) [50]. Sekwencja nukleotydowa oraz konformacja przestrzenna podjednostki TR przedstawiona została na rycinie 7. M. Bryś i wsp. 307 Ryc. 7. Sekwencja nukleotydowa (z zaznaczoną sekwencją komplementarną do sekwencji telomeru) oraz konformacja przestrzenna podjednostki TR telomerazy [wg Telomerase Database, www.telomerase.asu.edu; w modyfikacji własnej]. Struktura przestrzenna podjednostki o aktywności odwrotnej transkryptazy to tak zwana „struktura rękawiczki”. Umożliwia ona owinięcie się enzymu dookoła końca chromosomu w celu dodania jednoniciowych powtórzeń. TERT jako odwrotna transkryptaza syntetyzuje na matrycy RNA pojedynczy łańcuch DNA złożony z telomerowych powtórzeń. hTERT jest stosunkowo dużym Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu 308 białkiem, jego masa cząsteczkowa wynosi 127 kDa. Gen dla tej podjednostki zlokalizowany jest na krótszym ramieniu chromosomu 5 (p15.33) (Ryc.8). Obejmuje on 37 pz genomowego DNA i składa się z 16 eksonów [43]. Ryc. 8. Schemat ludzkiego chromosomu 5 z zaznaczoną lokalizacją genu hTERT (p15.33). Chociaż struktura krystaliczna dla białka TERT nie została jeszcze w pełni poznana, sugeruje się istnienie trzech domen: • N-końowej (NTE, ang. N-terminal extension) – zawierającej motyw wiążący RNA oraz DNA • centralnej (RT, ang. reverse transcriptase) o aktywności katalitycznej • C-końcowej (CTE, ang. C-terminal extension) [51-53]. Na rycinie 9 przedstawiony podjednostki TERT telomerazy. został schemat organizacji strukturalnej M. Bryś i wsp. 309 Ryc. 9. Schemat organizacji strukturalnej podjednostki TERT telomerazy. U większości organizmów domena TERT składa się z długiego N-końca (NTE), domeny centralnej o aktywności katalitycznej (RT) oraz krótkiego C-końca (CTE). Na schemacie zaznaczono motywy CP, QFP i TS, wchodzące w skład odcinka TRBD oraz telomerazowo specyficzną domenę IFD (pole zakreślone ukośnie). W obrębie N-końca znajduje się region „linkerowy” łączący domenę TEN i TRBD [wg 55; w modyfikacji własnej]. Domena N-końcowa zawiera dwa motywy - TEN (N-końcowy motyw telomerazy, ang. telomerase essential N-terminal) i TRBD (motyw wiążący się z RNA, ang. telomerase RNA-binding domain). Oba odpowiedzialne są za fałdowanie białka zaangażowanego w wiązanie się z jednoniciowym kwasem nukleinowym. Pomiędzy tymi regionami znajduje się stosunkowo długi region łącznikowy, który może mieć znaczenie w utrzymaniu elastyczności holoenzymu. N-końcowa część białka TERT zawiera również kilka specyficznych dla telomerazy motywów, w tym CP, QFP i TS. Regiony te odgrywają rolę w oddziaływaniach TERT-TERC, a także mają wpływ na szybkość kopiowania matrycy podczas syntezy telomerów [44]. Katalityczna domena białka TERT zawiera siedem ewolucyjnie konserwatywnych motywów RT, istotnych dla aktywności enzymatycznej telomerazy. Domena RT zorganizowana jest w dwie poddomeny, które przypominają „palce” i „dłoń”. Regiony te połączone są w pętlę, która zawiera konserwatywny region 310 Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu „primer grip”, determinujący aktywność enzymatyczną. Pętla ta umożliwia bezpośredni kontakt hybrydy RNA-DNA z końcem 3’ jednoniciowego DNA, co sugeruje, że region „primer grip” może brać udział w lokowaniu końca 3’ DNA w centrum aktywnym enzymu. Unikatową cechą domeny RT jest obecność poddomeny IFD (domena odcinka RT białka TERT, ang. insertion in fingers). Składa się ona z dwóch antyrównoległych helis α, które umieszczone są pomiędzy „palcami” a „dłonią”. Poddomena IFD zaangażowana jest w wewnątrzcząsteczkowe oddziaływania białko-białko, które warunkują i stabilizują konformację przestrzenną tego regionu domeny RT [44, 54]. Domena C-końcowa w przeciwieństwie do domeny N-końcowej i domeny RT, jest słabo zachowana ewolucyjnie. Pozwala to wnioskować, iż może ona spełniać specyficzne gatunkowo funkcje. Jak dotąd nie wyjaśniono kwestii dlaczego domena C-końcowa jest niezbędna dla aktywności telomerazy u, na przykład orzęska i człowieka, ale nie jest wymagana dla aktywności tego enzymu u drożdży i w ogóle nie występuje u innych organizmów [44]. Z wymienionymi podjednostkami telomerazy zasocjowane są liczne białka, jak na przykład TP1 (białko związane z telomerazą 1, ang. telomerase associated protein 1), Hsp23, Hsp90 (białka szoku cieplnego 23 i 90, ang. heat shock protein 23, 90), hStau (białko łączące się z dwuniciowym RNA, ang. human Staufen), L22 i dyskeryna. Ich obecność nie jest jednak konieczna dla zachowania aktywności telomerazy [56-59]. Wydaje się, że domena hTERT jest głównym wyznacznikiem aktywności telomerazy. Zgodnie z danymi literaturowymi, gen hTERC ulega ekspresji we wszystkich typach tkanek, natomiast ekspresja genu hTERT ograniczona jest do tak zwanych tkanek telomerazowo-dodatnich, co sugeruje, że hTERT odpowiedzialnym za enzymatyczną aktywność telomerazy. jest czynnikiem M. Bryś i wsp. 311 Ryc. 10. Schemat przedstawia podstawowe etapy cyklu reakcji telomerazy: rozpoznanie i związanie startera, wydłużanie nici DNA oraz translokację enzymu. Telomerazowy RNA (TR) przedstawiony został jako czarna linia (brak zachowania skali). TR dostarcza matrycy do syntezy telomeru. Synteza DNA katalizowana jest przez TERT [wg 43; w modyfikacji własnej]. Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu 312 Wykazano, że sztucznie wymuszona ekspresja genu TERT wydłuża żywotność komórki w ponad dwudziestu różnych typach komórek [50, 60, 61]. Rzeczywisty mechanizm reakcji telomerazy można opisać w trzech etapach. W pierwszym etapie, krótka telomerowa sekwencja na końcu 3’ chromosomu wiąże się z matrycowym RNA telomerazy. Kolejny etap stanowi wydłużanie nici, gdzie podjednostka TERT wykorzystuje fragment RNA jako matrycę do produkcji nowego zakończenia telomeru. Ostatnim etapem jest translokacja bądź dysocjacja, gdzie telomeraza przenosi się na nowy koniec 3’ chromosomu w celu dodawania kolejnych powtórzeń lub opuszcza obszar telomeru [50]. Rycina 10 przedstawia mechanizm telomerazy. Regulacja ekspresji genu TERT na poziomie mRNA i białka odbywać się może na poziomie transkrypcji genu poprzez udział czynników transkrypcyjnych oraz modyfikacje potranskrypcyjne i potranslacyjne [62, 63]. Ścisła korelacja między ekspresją genu hTERT na poziomie mRNA a aktywnością telomerazy sugeruje, że regulacja transkrypcji tego genu jest jednym z podstawowych mechanizmów regulujących aktywność enzymu [64; 65]. Analiza promotora genu hTERT wykazała obecność szeregu potencjalnych miejsc dla oddziaływania z czynnikami transkrypcyjnymi, zarówno wzmacniającymi, jak i wyciszającymi transkrypcję genu. Schemat obszaru promotorowego genu TERT z zaznaczonymi miejscami oddziaływania z wybranymi czynnikami transkrypcyjnymi, przedstawia rycina 11. Dwie sekwencje oddziałujące z białkami c-Myc i Mad/Max oznaczane są jako dalszy i bliższy motyw E-box (ang. distal/proximal E-box) [58, 65-67]. M. Bryś i wsp. 313 Ryc. 11. Schemat obszaru promotorowego genu TERT z zaznaczonymi miejscami oddziaływania z wybranymi czynnikami transkrypcyjnymi. [wg 63; w modyfikacji własnej]. ER Sp1 MZF2 WT1 c-Myc Mad HAT HDAC – receptor dla estrogenów (ang. estrogen receptor); – czynnik transkrypcyjny; – czynnik transkrypcyjny (ang. myeloid-specific zinc finger protein); – czynnik transkrypcyjny (ang. Wilms tumor); – czynnik transkrypcyjny (ang. cellular homologue to the transforming sequences of the avian myelocytomatosis retrovirus); – czynnik transkrypcyjny (ang. Max dimerization protein 1); – acetylotransferaza histonów (ang. histone acetylotransferase); – deacetylaza histonów (ang. histone deacetylase) 314 Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu Tabela 3. Zestawienie czynników regulujących ekspresję genu TERT [wg 68]. Czynnik regulujący i szlak komórkowy, w którym bierze udział Cykl komórkowy CDK2 – kinaza zależna od cyklin (ang. cyclin dependent kinase) CDK4 - kinaza zależna od cyklin (ang. cyclin dependent kinase) cyklina D cyklina E p21 p53 p27 Rb (retinoblastoma; ang retinoblastoma protein) E2F1 (ang. E2F transcriptiom factor 1) p14 MDM2 (mysie biało MDM2; ang. murine double minute 2) p16 Szlak TGF-β TGF-β (transformujący czynnik wzrostu β; ang. transforming growth factor beta) TGF-βR1 (receptor 1 dla transformującego czynnika wzrostu β; ang. transforming growth factor beta receptor 1) TGF-βR2 (receptor 2 dla transformującego czynnika wzrostu β; ang. transforming growth factor beta receptor 2) SMAD3 (Sma i MAD; MAD ang. mothers against decapentaplegic 3) SMAD4 (Sma i MAD; MAD ang. mothers against decapentaplegic 4) E2F4 (ang. E2F transcriptiom factor 4) E2F5 (ang. E2F transcriptiom factor 5) Szlak PI3K/Akt PI3K (kinaza fosfatydyloinozytolu 3; ang. phosphatidylinositide 3-kinases) Akt PTEN (ang. phosphatase and tensin homolog) mTOR (ang. mammalian target of rapamycin) IKK (inhibitor kinazy kappaB; ang. inhibitor of kappaB kinase) Funkcja związane z regulacją transkrypcji genu TERT aktywator aktywator aktywator aktywator represor represor represor represor represor represor aktywator represor represor represor represor represor represor represor represor aktywator aktywator represor aktywator aktywator M. Bryś i wsp. 315 Tabela 3. Zestawienie czynników regulujących ekspresję genu TERT [wg 68]. (cd) Czynnik regulujący i szlak komórkowy, w którym bierze udział Funkcja związane z regulacją transkrypcji genu TERT Szlak NF-κB (kanoniczny) NF-κB (p50) (ang. nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) NF-κB (p65) IKK (ang. inhibitor of kappaB kinase) IκB (ang. inhibitor of kappa B) aktywator aktywator aktywator represor Szlak NF-κB (niekanoniczny) NIK (ang. NF-kappaB-inducing kinase) IKK NF-κB (p100) NF-κB (RelB) aktywator aktywator aktywator aktywator Szlak kinaz MAP RAS (ang. rat sarcoma) MEK (ang. mitogen extracellular kinase) ERK (ang. extracellular signal-regulated kinase) aktywator aktywator aktywator Szlak erbB EGF (ang. epidermal growth factor) EGFR (ang. epidermal growth factor receptor) erB-2 (ang. human epidermal growth factor 2) PI3K aktywator aktywator aktywator aktywator Inne AP2 (ang. activator protein 2) AP4 (ang. activating enhancer-binding protein 4) BRCA1 (ang. breast cancer type 1 susceptibility protein 1) c-Ets-2 (ang. v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 2) c-Myb (ang. myeloblastosis) CREB/ATF (ang. cAMP responsive element binding protein/ activating transcription factors) CTCF (ang. CCCTC-binding factor) AP1 (ang. activator protein 1) ERβ (ang. estrogen receptor beta) IK2 (ang. I kappaB kinase-like 2) aktywator aktywator represor aktywator aktywator aktywator represor aktywator/represor aktywator aktywator 316 Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu Tabela 3. Zestawienie czynników regulujących ekspresję genu TERT [wg 68]. (cd) Czynnik regulujący i szlak komórkowy, w którym bierze udział Funkcja związane z regulacją transkrypcji genu TERT Inne (cd) INHBC (ang. inhibin beta C chain) MAD3 (ang. mitotic spindle assembly checkpoint protein MAD3) MAZ (ang. Myc-associated zinc finger protein) Menin MNT (ang. MAX binding protein) MyoD (ang. myoblast determination protein) MZF-2 (ang. myeloid zinc finger protein 2) NF1 (ang. nuclear factor 1) NFAT (ang. nuclear factor of activated T-cells) NF-E2 [ang. nuclear factor (erythroid-derived 2)] PITX1 (ang. paired-like homeodomain 1) Sp1 (ang. specificity protein 1) USF1/USF2 (ang. upstream stimulatory factor 1/2) WT1 (ang. Wilms tumor) aktywator represor aktywator represor represor aktywator/represor represor aktywator aktywator aktywator represor aktywator aktywator/represor represor W Tabeli 3 zestawiono czynniki oddziałujące z sekwencjami regulatorowymi genu TERT, wzmacniające oraz wyciszające jego ekspresję. Czynniki podzielono na grupy odnośnie do ich udziału w szlakach komórkowych [68]. Szczegółowo opisany został mechanizm regulacji ekspresji genu TERT z udziałem czynnika transkrypcyjnego c-Myc. Białko to jest produktem protoonkogenu c-MYC i należy do klasy białek posiadających domenę typu helisa-pętla-helisa (HLH; ang. helix-loop-helix). Czynnik ten oddziałuje z DNA wyłącznie w postaci kompleksu z białkiem Max. W przypadku negatywnej regulacji transkrypcji z udziałek białka c-Myc, konieczne jest dodatkowe oddziaływanie czynnika transkrypcyjnego Max (ang. myc-associated factor X) z białkiem jądrowym Mad (ang. MAX dimerization protein). W komórkach nowotworowych M. Bryś i wsp. 317 konsekwencją tego procesu jest przesunięcie równowagi w kierunku kompleksu Myc-Max, co prowadzi do ciągłych podziałów komórkowych [69]. Aktywacja ekspresji genu TERT wymaga oddziaływania z DNA, w obrębie regionu promotorowego, zarówno czynników modyfikujących strukturę chromatyny, jak i podstawowych czynników transkrypcyjnych. W przypadku regulacji ekspresji genu TERT za pośrednictwem białka c-Myc, zidentyfikowano poza kompleksem Mad-Max, białka koregulatorowe takie jak, koaktywatory transkrypcji o aktywności acetylotransferazy histonów (p300/CBP; (ang. CREB binding protein and binding protein p300), kompleks STAGA (SPT3-TAF9-GCN5-acetylaza; SPT3; ang. suppressor of Ty 3, TAF9; ang. TBP-associated factor 9, GCN5, acetylase) pełniący funkcję koaktywatora i kompleks Mediator (kompleks białkowy oddziałujący z polimerazą RNA II) [70-74]. Szczegółowy model składania kompleksu preinicjacyjnego na promotorze genu TERT, przy udziale czynnika transkrypcyjnego c-Myc, przedstawia rycina 12. Czynniki transkrypcyjne, których udział w regulacji ekspresji genu TERT został stwierdzony, podlegają wzajemnym oddziaływaniom (ang. cross talk). W wyniku tych procesów mogą one osłabiać lub wzmacniać swoją aktywność [77]. Rycina 13 przedstawia hipotetyczny schemat wzajemnego oddziaływania i regulacji białek uczestniczących w szlakach transmisji sygnału z udziałem estrogenów, czynnika NFkB oraz transformującego czynnika wzrostu β (TGF-β). 318 Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu Ryc. 12. Schemat formowania się kompleksu preinicjacyjnego oraz modulacji ekspresji genu TERT z udziałem czynnika transkrypcyjnego c-Myc, białka Max i kompleksu Mediator [wg 73; w modyfikacji własnej]. M. Bryś i wsp. CBP/p300 - koaktywatory transkrypcji o aktywności acetylotransferazy histonów (ang. CREB binding protein and binding protein p300); c-Myc - czynnik transkrypcyjny (ang. cellular homologue to the transforming sequences of the avian myelocytomatosis retrovirus); CREB - czynnik transkrypcyjny oddziałujący z sekwencją CRE aktywowany w wyniku fosforylacji przez PKA (ang. cAMP response element binding); GCN5 - acetylotransferaza histonów; Max - czynnik transkrypcyjny (ang. myc-associated factor X); p300/CBP - koaktywatory transkrypcji o aktywności acetylotransferazy histonów (ang. CREB binding protein and binding protein p300); SPT3 - białko wchodzące w skład kompleksu STAGA (ang. suppressor of Ty 3); STAGA - kompleks białkowy o funkcji acetylazy histonów i aktywatora transkrypcji (ang. SPT-ADA-GCN5 acetylase); TAF - czynnik oddziałujący z białkiem TBP (ang. TBP-associated factor); TATA - sekwencja DNA znajdująca się obszarze promotorowym genów eukariotycznych (ang. TATA-box); TBP - białko łączące się z sekwencją TATA (ang. TATA-box binding protein); TF - podstawowy czynnik transkrypcyjny (ang. transcription factor); TRRAP - białko o aktywności fosfatazy (ang. tartrate-resistant acid phosphatase). 319 Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu 320 Ryc. 13. Hipotetyczny schemat wzajemnego oddziaływania i regulacji białek uczestniczących w szlakach transmisji sygnału z udziałem estrogenów, czynnika NFκB oraz transformującego czynnika wzrostu β (TGF-β) [wg 77; w modyfikacji własnej]. IL-6 TAK FOXL2 – interleukina 6 (ang. interleukin 6); – kinaza aktywowana przez TGF (ang. TGF-activated kinase); – czynnik transkrypcyjny (ang. forkhead box protein L2). Udział telomerów i telomerazy w transformacji nowotworowej Związek pomiędzy telomerami, telomerazą a starzeniem komórkowym i transformacją nowotworową wydaje się być oczywisty, mimo to, nadal jest trudny do wyjaśnienia. Ekspresja telomerazy sprzyja nieograniczonej proliferacji komórek i jest jedną z cech nowotworów [4, 35]. W większości komórek M. Bryś i wsp. 321 somatycznych człowieka stwierdza się aktywność telomerazy poniżej granicy wykrywalności, podczas gdy nowotwory złośliwe cechują się wysoką aktywnością tego enzymu. Ulega ona ekspresji w prawie 90% nowotworów człowieka (Tabela 4.). Tabela 4. Aktywność telomerazy w wybranych nowotworach człowieka [wg 75]. UKŁAD NERWOWY mózg (prawidłowy) 0% siatkówczak (łac. retinoblastoma) 50% glejak wielopostaciowy (łac. glioblastoma multiforme) 75% skąpodrzewiak (łac. oligodendroglioma) 100% gwiaździak anaplastyczny (łac. astrocytoma anaplasticum) 100% oponiaki (łac. meningiomas) 17-100% nerwiak płodowy (łac. neuroblastoma) 94% GŁOWA I SZYJA błona śluzowa jamy ustnej (prawidłowa) 3% rak kolczystokomórkowy skóry (łac. carcinoma spinocellulare) 86% PŁUCA rak płaskonabłonkowy drobnokomórkowy (łac. carcinoma planoepitheliale microcellulare) 100% rak płaskonabłonkowy niedrobnokomórkowy (łac. carcinoma planoepitheliale non microcellulare) 86% GRUCZOŁ PIERSIOWY tkanka prawidłowa 0% gruczolakowłókniak (łac. fibroadenoma) 28% rak nieinwazyjny przewodowy (łac. carcinoma ductale in situ) 75% rak przewodowy lub zrazikowy (łac. carcinoma ductale or lobulare) 88% WĄTROBA tkanka prawidłowa 0% nowotwory łagodne 29% rak pierwotny (łac. carcinoma hepatocellulare) 86% 322 Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu Tabela 4. Aktywność telomerazy w wybranych nowotworach człowieka [wg 75]. (cd) UKŁAD POKARMOWY gruczolak żołądka (łac. adenoma ventriculi,) 27% rak żołądka (łac. carcinoma ventriculi,) 86% polip gruczolakowaty (łac polypus adenomatosus) 48% rak jelita grubego (łac. carcinoma coli et recti) 85% rak trzustki (łac. carcinoma pancreatis) 95% UKŁAD ROZRODCZY - KOBIETY jajniki 33% błona śluzowa trzonu macicy (prawidłowa) 0% mięśniak gładkokomórkowy (łac. leiomyoma) 0% mięsak gładkokomórkowy (łac. leiomyosarcoma) 100% rak endometrium (łac. carcinoma endometriale) 100% rak jajnika (łac. carcinoma ovarii) 91% UKŁAD ROZRODCZY - MĘŻCZYŹNI jądra (łac. testis) 100% gruczoł krokowy (łac. prostata) 0% łagodny rozrost gruczołu krokowego (łac. hyperplasia prostatae) 5% rak gruczołu krokowego (łac. carcinoma prostatae) 90% SKÓRA naskórek (łac. epidermis) 44% czerniak (łac. melanoma malignum) 86% Wysoka aktywność telomerazy może prowadzić do tzw. „unieśmiertelnienia” komórki i/lub umożliwić jej nieograniczoną proliferację. W przypadku braku aktywności tego enzymu, telomery ulegają skracaniu w każdej rundzie podziału komórkowego, aż do osiągnięcia długości progowej [76]. Nowotwory złośliwe są chorobami charakteryzującymi się niekontrolowaną proliferacją oraz naciekaniem otaczających tkanek lub odległych narządów. Większość komórek somatycznych człowieka nie wykazuje aktywności telomerazy, ma ograniczoną żywotność i w celu wydłużenia długości ich życia konieczne jest uaktywnienie telomerazy. Doniesienia literaturowe sugerują, że telomeraza może sprzyjać procesowi transformacji nowotworowej niezależnie M. Bryś i wsp. 323 od długości telomerów [33, 78]. Poprzez stabilizację długości telomerów i stymulowanie nieograniczonych podziałów komórek nowotworowych, telomeraza odgrywa kluczową rolę w etiologii i progresji nowotworów. Uważa się, iż telomeraza może być aktywowana na różnych etapach procesu nowotworowego. W niektórych przypadkach ekspresja tego enzymu może być obserwowana w stanach przednowotworowych, podczas gdy w innych przypadkach telomeraza może być aktywowany dopiero na etapie progresji procesu nowotworowego. Różnice te mogą w bardzo istotny sposób rzutować na kliniczną użyteczność telomerazy jako markera nowotworowego oraz określenie czy enzym ten może być wykorzystany w przesiewowych badaniach pacjentów z grupy wysokiego ryzyka, w diagnostyce wczesnego wykrywania, czy też do celów prognostycznych [79]. Pomimo, iż w większości komórek somatycznych obserwuje się brak aktywności telomerazy, to jednak niektóre tkanki posiadają wyspecjalizowane komórki, takie jak limfocyty, komórki rozrodcze, komórki nabłonkowe, które wykazują niewielki poziom aktywności tego enzymu. W tkankach zawierających wymienione wyżej komórki, wykrywanie aktywności telomerazy jest utrudnione i wymaga precyzyjnego określenia czy aktywność enzymu pochodzi z prawidłowych, telomerazowo-dodatnich komórek, czy też z komórek zmienionych nowotworowo. Jak już zostało wspomniane, aktywność ludzkiej telomerazy uwarunkowana jest obecnością dwóch głównych składowych - fragmentu nici RNA (hTERC) oraz podjednostki o aktywności odwrotnej tranksryptazy (hTERT). Prowadzone obecnie badania naukowe i kliniczne koncentrują się na osobnej analizie ekspresji tych dwóch elementów, jako doskonalszych zamienników w stosunku do oznaczania aktywności telomerazy [52, 80]. Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu 324 Podsumowanie Poznanie struktury i funkcji telomerów oraz telomerazy przyczyniło się do opracowania nowych form leczenia przeciwnowotworowego. Przewiduje się, że blokowanie aktywności telomerazy zaowocuje w niedalekiej przyszłości opracowaniem skuteczniejszych leków dla pacjentów cierpiących z powodu chorób nowotworowych, jak również rozszerzy możliwość ich chemoprewencji. Najbardziej efektywne wydaje się zastosowanie kombinacji klasycznych chemioterapeutyków z bezpośrednimi inhibitorami aktywności telomerazy, czy związkami blokującymi oddziaływania telomeraza-telomer. Dzięki takiemu postępowaniu terapeutycznemu być może uda się zmniejszyć dawki stosowanych leków, a tym samym zmniejszyć skutki uboczne terapii. Piśmiennictwo 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Zvereva MI, Shcherbakova DM, Dontsova OA. Telomerase: structure, functions, and activity regulation. Biochemistry. 2010; 75: 1563-1583. Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PL i wsp. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 1994; 266: 2011-2015. Meyerson M, Counter CM, Eaton EN, Ellisen LW, Steiner P, Caddle SD i wsp. Hest2, the putative human telomerase catalytic subunit gene, is up-regulated in tumor cells and during immortalization. Cell. 1997; 90:785–795. Sikora E. Telomery i telomeraza — starzenie komórkowe nagroda nobla z fizjologii lub medycyny. Kosmos. 2009; 59: 286–287. Wright WE, Shay JW. Telomere biology in aging and cancer. J Am Geriatr Soc. 2005; 53: 292-294. Kowalska A, Kowalik A. Telomer i telomeraza w ontogenezie. Współczesna Onkologia. 2006; 10: 485–496. Shay JW, Wright WE. Telomerase therapeutics for cancer: challenges and new directions. Nat Rev Drug Discov. 2006; 5: 577-584. Cheung AL, Deng W. Telomere dysfunction, genome instability and cancer. Front Biosci. 2008; 13: 2075–2090. M. Bryś i wsp. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 325 McGrath M, Wong JY, Michaud D, Hunter DJ, De Vivo I. Telomere length, cigarette smoking, and bladder cancer risk in men and women. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2007; 16:815–819. Allshire RC, Dempster M, Hastie ND. Human telomeres contain at least three types of G-rich repeat distributed non-randomly. Nucleic Acids Res. 1989; 17: 4611–4627. Blackburn EH, Gall JG. A tandemly repeated sequence at the termini of the extrachromosomal ribosomal RNA genes in Tetrahymena. J Mol Biol. 1978; 120:33–53. Griffith JD, Comeau L, Rosenfield S, Stansel RM, Bianchi A, Moss H i wsp. Mammalian telomeres end in a large duplex loop. Cell. 1999; 97: 503–514. Moyzis RK, Buckingham JM, Cram LS, Dani M, Deaven LL, Jones MD i wsp. A highly conserved repetitive DNA sequence, (TTAGGG)n, present at the telomeres of human chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988; 85: 6622-6626. Witzany G. Viral origins of telomeres and telomerases. And their important role in eukaryogenesis and genome maintenance. Biosemiotics. 2008; 1: 191. Aubert G, Lansdorp PM. Telomeres and aging. Physiol Rev. 2008; 88: 557-579. Marión RM, Blasco MA. Telomeres and telomerase in adult stem cells and pluripotent embryonic stem cells. Advexpmed Biol. 2010; 695:118-131. Bryan TM, Baumann P. G-quadruplexes: from guanine gels to chemotherapeutics. Mol Biotechnol. 2011; 49: 198-208. Oeseburg H, de BoerR A, van Gilst WH, van der Harst P. Telomere biology in healthy aging and disease. Eur J Physiol. 2010; 459: 259–268. Songyang Z. Introduction to telomeres and telomerase. Methods Mol Biol. 2011; 735: 1-11. Oganesian L, Moon IK, Bryan TM, Jarstfer MB. Extension of G-quadruplex DNA by ciliate telomerase. EMBO J. 2006; 25: 1148-1159. Oganesian L, Karlseder J. Telomeric armor: the layers of end protection. J Cell Sci. 2009; 122: 4013-4025. Olaussen KA, Dubrana K, Domont J, Spano JP, Sabatier L, Soria JCh. Telomeres and telomerase as a targets for anticancer drug development. Crit Rev in Oncol/Hematol. 2006; 57:191-214. De Lange T. T-loops and the origin of telomeres. Nat Rev Mol Cell Biol. 2004; 5: 323–329. 326 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu Akbay EA, Peña CG, Ruder D, Michel JA, Nakada Y, Pathak S i wsp. Cooperation between p53 and the telomere-protecting shelterin component Pot1a in endometrial carcinogenesis. Oncogene. 2012; 11. doi: 10.1038/onc.2012.232. O’Sullivan RJ, Karlseder J. Telomeres: protecting chromosomes against genome instability. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010; 11: 171–181. Stewart JA, Chaiken MF, Wang F, Price CM. Maintaining the end: roles of telomere proteins in end-protection, telomere replication and length regulation. Mutat Res. 2012; 730: 12-19. Xin H, Liu D, Songyang Z. The telosome/shelterin complex and itsfunctions. Genome Biol. 2008; 9:232.1-232.7. Bayne S, Liu JP. Hormones and growth factors regulate telomerase activity in ageing and cancer. Mol Cell Endocrinol. 2005; 240:11–22. Martinez P, Blasco MA. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins. Nat Rev Cancer. 2011; 11: 161-176. Bianchi A, de Lange T. Ku binds telomeric DNA in vitro. J Biol Chem. 1999; 274: 21223-21227. Van Steensel B, de Lange T. Control of telomere length by the human telomeric protein TRF1. Nature. 1997; 385:740-743. De Lange T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 2009; 326: 948-952. Deng Y, Chang S. Role of telomeres and telomerase in genomic instability, senescence, and cancer. Lab Invest. 2007; 87: 1071–1076. Urquidi V, Tarin D, Goodison S. Role of telomerase.in cell senescense and oncogenesis. Annu Rev Med. 2000; 51: 65-79. Artandi SE, DePinho RA. Telomeres and telomerase in cancer. Carcinogenesis. 2010; 31: 9–18. McNees CJ, Tejera AM, Martinez P, Murga M, Mulero F, Fernandez-Capetillo O i wsp. ATR suppresses telomere fragility and recombination but is dispensable for elongation of short telomeres by telomerase. J Cell Biol. 2010; 188: 639–652. Zhu H, Belcher M, van der Harst P. Healthy aging and disease: role for telomere biology? Clinical Science. 2011; 120: 427–440. Lingner J, Cooper JP, Cech TR. Telomerase and DNA end replication: no longer a lagging strand problem? Science. 1995; 269: 1533–1534. Zhong Z-H, Jiang W-Q, Cesare AJ, Neumann AA, Wadhwa R, Reddel R R. Disruption of telomere maintenance by depletion of the MRE11/RAD50/NBS1 complex in cells that use alternative lengthening of telomeres. J Biol Chem. 2007; 282: 29314-29322. M. Bryś i wsp. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 327 Georgin-Lavialle S, Aouba A, Mouthon L, Londono-Vallejo JA, Lepelletier Y, Gabet AS i wsp. The telomere/telomerase system in autoimmune and systemic immune-mediated diseases. 2010; 9: 646-651. Azzalin CM, Reichenbach P, Khoriauli L, Giulotto E, Lingner J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 2007; 318:798–801. Baur JA, Zou Y, Shay JW, Wright WE. Telomere position effect in human cells. Science. 2001; 292: 2075–2077. Podlevsky JD, Chen JJL. It all comes together at the ends: Telomerase structure, function, and biogenesis. Mutat Res. 2012; 730:3-11. Wyatt HD, West SC, Beattie TL. In TERT preting telomerase structure and function. Nucleic Acids Res. 2010; 38: 5609-5622. Philippi C, Loretz B, Schaefer UF, Lehr CM. Telomerase as an emerging target to fight cancer — Opportunities and challenges for nanomedicine. J Control Release. 2010; 146: 228–240. Chen JL, Blasco MA, Greider CW. Secondary structure of vertebrate telomerase RNA. Cell. 2000; 100: 503-514. Dandjinou AT, Levesque N, Larose S, Lucier JF, Abou Elela S, Wellinger RJ. A phylogenetically based secondary structure for the yeast telomerase RNA. Curr Biol. 2004; 14: 1148-1158. Romero DP, Blackburn EH. A conserved secondary structure for telomerase RNA. Cell. 1991; 67:343-353. Zappulla DC, Cech TR. Yeast telomerase RNA: a flexible scaffold for protein subunits. Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101: 10024-10029. Feng J, Funk WD, Wang SS, Weinrich SL, Avilion AA, Chiu CP i wsp. The RNA component of human telomerase. Science. 1995; 269: 1236–1241. Autexier C, Lue NF. The structure and function of telomerase reverse transcriptase. Annu Rev Biochem. 2006; 75: 493–517. Avendaño C, Menéndez JC. Medicinal Chemistry of Anticancer Drugs. Elsevier, Amsterdam, 2008. Collins K. The biogenesis and regulation of telomerase holoenzymes. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006; 7: 484–494. Wyatt HD, Lobb DA, Beattie TL. Characterization of physical and functional anchor site interactions in human telomerase. Mol Cell Biol. 2007; 27:32263240. Nicholls C, Li H, Wang JQ, Liu JP. Molecular regulation of telomerase activity in aging. Protein Cell. 2011; 2:726–738. 328 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. Telomeraza – struktura i funkcja oraz regulacja ekspresji genu Blackburn EH. Switching and signaling at the telomere. Cell. 2001; 106: 661-673. Horikawa L, Oshimura M, Barrett JC. Repression of the telomerase catalytic subunit by a gene on human chromosome 3 that induces cellular senescence. Mol Carcinog. 1998; 22: 65-72. Kyo S, Takakura M, Kanaya T, Zhuo W, Fujimoto K, Nishio Y i wsp. Estrogen activates telomerase. Cancer Res. 1999; 59: 5917–5922. Nakamura TM, Morin GB, Chapman KB, Weinrich SL, Andrews WH, Lingner J i wsp. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science. 1997; 277: 955–959. Nakayama J, Tahara H, Tahara E, Saito M, Ito K, Nakamura H i wsp. Telomerase activation by hTRT in human normal fibroblasts and hepatocellular carcinomas. Nat Genet. 1998; 18: 65–68. Weinrich Sl, Pruzan R, Ma L, Ouellette M, Tesmer Vm, Holt Se i wsp. Reconstitution of human telomerase with template RNA component hterc and the catalytic proteinsubunit htert. Nat Genet. 1997; 17: 498–502. Liu JP. Studies of the molecular mechanisms in the regulation of telomerase activity. FASEB J. 1999; 13: 2091–2104. Liu JP. Telomerase: Not just black and white, but shades of gray. Mol Cell Biol Res Commun. 2000; 3: 129–135. Bodnar AG, Ouellette M, Frolkis M, Holt SE, Chiu CP, Morin GB i wsp. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science. 1998; 279: 349–352. Xu D, Gruber A, Bjorkhold M, Peterson C, Pisa P. Suppression of telomerase reverse transcriptase (hTERT) expression in differentiated HL-60 cells: regulatory mechanisms. Br J Cancer. 1999; 80: 1156–1161. Horikawa I, Cable PL, Afshari C, Barrett JC. Cloning and characterization of the promoter region of human telomerase reverse transcriptase gene. Cancer Res. 1999; 59: 826–830. Misiti S, Nanni S, Fontemaggi G, Cong YS, Wen J, Hirte HW i wsp. Induction of hTERT expression and telomerase activity by estrogens in human ovary epithelium cells. Mol Cell Biol. 2000; 20: 3764–3771. Daniel M, Peek GW, Tollefsbol TO. Regulation of the human catalytic subunit of telomerase (hTERT). Gene. 2012; 498: 135-46. Ścibior-Bentkowska D, Czeczot H. Komórki nowotworowe a stres oksydacyjny. Postępy Hig Med Dośw. 2009; 63: 58-72. M. Bryś i wsp. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 329 Conaway RC, Conaway JW. Origins and activity of the Mediator complex. Semin Cell Dev Biol. 2011; 22: 729-734. Gamper AM, Kim J, Roeder RG. The STAGA subunit ADA2b is an important regulator of human GCN5 catalysis. Mol Cell Biol. 2009; 29: 266-280. Holmlund T, Lindberg MJ, Grander D, Wallberg AE. GCN5 acetylates and regulates the stability of the oncoprotein E2A-PBX1 in acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 2012; doi: 10.1038/leu.2012.265. Liu X, Vorontchikhina M, Wang YL, Faiola F, Martinez E. STAGA recruits Mediator to the MYC oncoprotein to stimulate transcription and cell proliferation. Mol Cell Biol. 2008; 28: 108-121. Taatjes DJ. The human Mediator complex: a versatile, genome-wide regulator of transcription. Trends Biochem Sci. 2010; 35: 315-322. Granger MP, Wright WE, Shay JW. Telomerase in cancer and aging. Crit Rev Oncol Hematol. 2002; 41: 29-40. .Biroccio A, Leonetti C. Telomerase as a new target for the treatment of hormone-refractory prostate cancer. Endocr Relat Cancer. 2004; 11:407-421. Drummond AE, Fuller PJ. Activin and inhibin, estrogens and NFκB, play roles in ovarian tumourigenesis is there crosstalk? Mol Cell Endocrinol. 2012; 359: 85-91. Heaphy CM, Meeker AK. The potential utility of telomere-related markers for cancer diagnosis. J Cell Mol Med. 2011; 15: 1227-1238. Wanat JJ, Johnson FB. Telomere stability and carcinogenesis: an off-again, on-again relationship. J Clin Invest. 2012; 122: 1962-1965. Elmore LW, Forsythe R, Forsythe H, Bright AT, Nasim S, Endo K i wsp. Overexpression of telomerase-associated chaperone proteins in prostatic intraepithelial neoplasia and carcinomas. Oncol Rep. 2008; 20:613-617. 330 Od Redakcji Redakcja „Folia Medica Lodziensia” składa serdeczne podziękowania recenzentom prac nadesłanych w latach 2011-2012 i opublikowanych w tomach 38 i 39 Magdalena Bryś, Ewa Brzezińska-Błaszczyk, Jan Brzeziński, Jan Chojnacki, Adam Cygankiewicz, Marian Danilewicz, Wojciech Dębek, Andrzej Głąbiński, Anna Głowacka, Małgorzata Karbownik-Lewińska, Zofia M. Kiliańska, Józef Kobos, Jolanta Kunert-Radek, Anna Kreślak, Marek Lipiński, Zbigniew Maziarz, Beata Olas, Marek Pawlikowski, Bogusława Pietrzak, Stanisław Sporny, Katarzyna Starska, Ewa Toporowska-Kowalska, Elżbieta Waszczykowska, Anna Zalewska-Janowska, Wojciech Zieleniewski 331 Folia Medica Lodziensia Informacje dla autorów Informacje ogólne Czasopismo Folia Medica Lodziensia (FML) jest wydawnictwem środowiska medycznego skupionego wokół Łódzkiego Towarzystwa Naukowego, w którym publikowane są oryginalne prace badawcze (kliniczne i doświadczalne) i artykuły poglądowe z zakresu nauk medycznych, farmaceutycznych i biologicznych. Pierwotna wersja czasopisma jest drukowana. Bieżące i archiwalne numery FML dostępne są w internecie: www.ltn.lodz.pl/index.php?option= com_content&view=article&id=97&Itemid=64 Zasady recenzowania prac Każda praca nadesłana do Redakcji jest oceniana pod względem wartości merytorycznych takich jak: nowatorskie przedstawienie tematu, znaczenia dla rozwoju badań naukowych i postępowania klinicznego. Manuskrypty oceniane są wstępnie przez Redakcję FML. Prace niekompletne lub nie spełniające warunków publikacji ustalonych przez Redakcję są zwracane Autorowi bez oceny merytorycznej. Po nadesłaniu pracy Autor otrzymuje potwierdzenie jej wpłynięcia i numer referencyjny manuskryptu, którym powinien posługiwać się przy kontaktach z Redakcją. Autor pracy może zaproponować nazwiska recenzentów, jednakże prawo ostatecznego ich wyboru należy do Redakcji. Przyjęcie pracy do druku odbywa się na podstawie pozytywnych opinii recenzentów. Redakcja nie informuje autora o nazwiskach recenzentów. Zasady przygotowania manuskryptu Zasady publikacji zgłaszanych do druku artykułów opracowano na podstawie International Committee of Medical Journal Editors - Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals (http://www.icmje.org/). Prace 332 zawierające wyniki badań przeprowadzonych na ludziach i/lub zwierzętach powinny posiadać pozytywną opinię odpowiedniej lokalnej Komisji Etycznej. Folia Medica Lodziensia ogłasza prace w języku polskim i angielskim. W pracach oryginalnych preferowany jest język angielski, a w pracach poglądowych język polski. Po uprzednim uzgodnieniu z Redakcją istnieje także możliwość publikowania monografii (np. prac habilitacyjnych) na koszt Autora. Monografie również podlegają recenzji. Objętość prac oryginalnych nie powinna przekraczać 3000 słów, a prac poglądowych (pisanych w zasadzie na zamówienie Redakcji) 6000 słów. Z limitu wyłączone jest piśmiennictwo, tabele, ryciny i streszczenie. Manuskrypt powinien być napisany standardową jednolitą czcionką (Times New Roman lub Arial) o rozmiarze 12, z podwójnym odstępem na arkuszu formatu A4, zawierać 27-30 wierszy na stronie z 2,5 cm marginesami z każdej strony. Tekst winien być pisany bez żadnych wyróżnień (podkreśleń, spacjowania, pisania dużymi literami). Nie należy stosować przenoszeń wyrazów. Struktura nadsyłanych prac Każda praca powinna zawierać stronę tytułową, streszczenie, właściwy tekst pracy, piśmiennictwo oraz w zależności od potrzeby ryciny i tabele. Podziękowania i dodatkowe informacje (np. źródło finansowania) można umieszczać po właściwym tekście pracy przed spisem piśmiennictwa. Strona tytułowa powinna zawierać tytuł pracy, imiona i nazwiska wszystkich Autorów, pełną nazwę instytucji, w której praca została wykonana, skrócony tytuł (maksimum 45 znaków), listę 5-8 słów lub wyrażeń kluczowych zgodnych z Medical Subject Headings Index Medicus oraz imię i nazwisko Autora odpowiedzialnego za korespondencję, a także jego adres, numer telefonu i faksu oraz adres e-mailowy. Ponadto, należy umieścić informację o grantach i innych źródłach finansowania oraz aktualne miejsce pracy Autorów. 333 W każdej pracy (zarówno napisanej w języku polskim jak i w języku angielskim) tytuł pracy, treść streszczenia, słowa i/lub wyrażenia kluczowe oraz objaśnienia do rycin i tabel powinny być napisane w wersji polskiej i angielskiej. Streszczenie winno zawierać od 200 do 250 słów. W streszczeniu pracy oryginalnej należy wyodrębnić następujące części składowe: wstęp (zawierający cel pracy), materiały i metody, wyniki, wnioski. Treść streszczenia powinna umożliwić zorientowanie się w tematyce pracy bez szczegółowego czytania całego tekstu. Streszczenie wymagane jest także do pracy poglądowej. W pracach oryginalnych właściwy tekst powinien zawierać następujące części: wstęp, materiały i metody, wyniki, dyskusję i piśmiennictwo. W tekście prac poglądowych należy wyróżnić wstęp, właściwe omówienie tematu z podziałem na szczegółowe zagadnienia oraz wnioski końcowe lub podsumowanie. Piśmiennictwo w pracy powinno być cytowane przez umieszczenie numeru pozycji w nawiasach zgodnie z kolejnością cytowania w tekście. Spis piśmiennictwa powinien zawierać pozycje w kolejności cytowania. Pozycja będąca pracą oryginalną winna zawierać nazwisko autora (autorów), inicjały imion, tytuł pracy, skrót nazwy czasopisma wg Index Medicus, rok wydania; tom: strony (od-do). W przypadku więcej niż sześciu autorów należy podać nazwiska pierwszych sześciu i skrót et al. (lub w wersji polskojęzycznej - i wsp.) W przypadku monografii należy podać nazwisko autora (autorów), inicjały imion, tytuł monografii, wydawcę, miejsce i rok wydania. W przypadku dzieł zbiorowych należy podać nazwiska autorów, inicjały imion, tytuł pracy (rozdziału). W: tytuł monografii, nazwisko i inicjały imion redaktora (redaktorów), wydawcę, miejsce i rok wydania: strony (od-do). 334 Przykłady: Artykuł w czasopiśmie: 1. Axelrod J. The pineal gland: a neurochemical transducer. Science. 1974; 184: 1341-1348. 2. Frisch RE, Wyshak G, Yincent L. Delayed menarche and amenorrhea in ballet dancers. New Engl J Med. 1980; 303: 17-19. 3. Lardone PJ, Carrillo-Vico A, Naranjo MC, De Felipe B, Vallejo A, Karasek M et al. Melatonin synthesized by Jurkat human leukemic T cell line is implicated in IL-2 production. J Cell Physiol. 2006; 206: 273-279. Monografia: 4. Kokot P, Stupnicki R. Metody radioimmunologiczne i radiokompetycyjne stosowane w klinice. PZWL, Warszawa, 1985. Rozdział w książce: 5. Landolt AM, Strebel P. Technique of transsphenoidal operation of pituitary adenomas. W: Advances and technical standards in neurosurgery, Vol. 7, Krayenbuhl K. (red.), Springer, Vienna-New York, 1980: 119-177. Tabele i ryciny Tabele winny być pisane bez wyróżnień, wytłuszczeń i zmiany rodzaju czcionki, każda na oddzielnej stronie i numerowane od góry cyframi arabskimi. Opis do tabeli (w języku polskim i angielskim) winien być umieszczony w oddzielnym wierszu nad tekstem tabeli. Ryciny winny być wykonane techniką komputerową w postaci wektorowej lub rastrowej, względnie stanowić wysokiej jakości fotografie (czarno-białe – min. 300 dpi; kolorowe – min. 600 dpi). Przekazanie praw autorskich i pozwolenie na druk Przesłanie manuskryptu do Redakcji jest równoznaczne ze stwierdzeniem, że praca nie była uprzednio publikowana, ani nie została złożona do oceny 335 w innym czasopiśmie (z wyłączeniem streszczeń nie przekraczających 250 słów). Jeżeli praca zawiera elementy (np. ryciny, tabele itp.) uprzednio publikowane należy dołączyć pisemną zgodę na ponowne ich wydanie, zarówno od poprzedniego wydawcy, jak i autorów oryginalnej pracy. Ponadto wszyscy Autorzy pracy oświadczają, że po zaakceptowaniu materiałów do publikacji w FML automatycznie i nieodpłatnie przekazują Wydawcy wszelkie prawa autorskie do wydawania i rozpowszechniania nadesłanych materiałów we wszystkich znanych formach eksploatacji. Autor korespondujący zobowiązany jest do podpisania w imieniu własnym i współautorów pracy Umowy o przeniesieniu praw autorskich na Wydawcę FML - Łódzkie Towarzystwo Naukowe (wzór umowy na stronie www.ltn.lodz.pl/index.php?option= com_content&view =article&id=97&Itemid=64). Konflikt interesów Złożeniem manuskryptu jest równoznaczne z ujawnieniem wszystkich zobowiązań finansowych oraz wszelkich niezgodności interesów związanych z pracą badawczą. Dostarczenie manuskryptu do Redakcji Prosimy o przesyłanie prac za pomocą poczty elektronicznej na adres [email protected]. Po uzyskaniu wstępnej akceptacji należy dostarczyć 3 wydrukowane egzemplarze pracy (1 oryginał i 2 kopie) oraz tekst, tabele i ryciny zapisane na nośniku CD-ROM. Każda rycina powinna być wydrukowana na oddzielnej stronie i winna być podpisana nazwiskiem Autora korespondującego oraz kolejnym numerem z zaznaczeniem góry ryciny. Na oddzielnej stronie należy dołączyć podpisy do rycin. Do materiałów ilustracyjnych poprzednio publikowanych powinna być dołączona pisemna zgoda Wydawcy na ponowną publikację. Do manuskryptu należy dołączyć List przewodni do Redakcji stwierdzający, że: − praca nie została opublikowana ani obecnie nie została złożona do innej redakcji; 336 − − − − wszyscy Autorzy pracy wyrażają zgodę na jej publikację; w chwili zaakceptowania manuskryptu do druku Autorzy zobowiązują się do podpisania Umowy o przeniesieniu praw autorskich na Wydawcę; Autorzy zapoznali się z zasadami publikacji prac ogłaszanych w Folia Medica Lodziensia i zobowiązują się do ich przestrzegania; Autorzy są gotowi pokryć koszty druku kolorowych ilustracji. Schemat Listu przewodniego jest dostępny na stronie: www.ltn.lodz.pl/index.php?option=com_content&view=article&id=97&Itemid= 64 Uwagi końcowe Redakcja i Wydawca dokładają wszelkich starań, by informacje opublikowane w FML były wiarygodne i dokładne. Jednakże treści i opinie zawarte w artykułach i reklamach są publikowane na wyłączną odpowiedzialność Autorów i/lub Reklamodawców, a Redakcja i Wydawca FML nie ponoszą odpowiedzialności za publikowane informacje.
