Rozwój nauk medycznych i przyrodniczych
advertisement
Rozwój nauk medycznych i przyrodniczych Rozwój nauk medycznych i przyrodniczych Redakcja: Agata Pietraszek Krzysztof Bałękowski Lublin 2015 Recenzenci: dr Artur Banach prof. dr hab. Grażyna Bator dr Agnieszka Kuźniar dr Agnieszka Malik dr n. med. Michał Pikuła prof.dr hab.n.med.Ryszard Pogłód dr Anna Pytlak dr n. med. Ewa Rojczyk dr Joanna Rossowska dr n. med. Sylwia Smolińska dr Anna Szafranek-Nakonieczna Wszystkie opublikowane rozdziały otrzymały pozytywne recenzje. Skład i łamanie: Ilona Żuchowska Projekt okładki: Agnieszka Ciurysek © Copyright by Fundacja na rzecz promocji nauki i rozwoju TYGIEL ISBN 978-83-65272-19-5 Wydawca: Fundacja na rzecz promocji nauki i rozwoju TYGIEL ul. Głowackiego 35/348, 20-060 Lublin www.fundacja-tygiel.pl Spis treści Arkadiusz Macheta, Agnieszka Szymczyk Historia transfuzjologii – przetaczanie krwi dawniej i dziś ................................. 7 Agnieszka Szymczyk, Arkadiusz Macheta, Monika Podhorecka Medycyna transplantacyjna – krótki rys historyczny......................................... 17 Anna Knapik, Marcin Michalik Wpływ otyłości na rozwój chorób układu oddechowego u kobiet i mężczyzn po 40 roku życia, chorych leczonych w CSK w Katowicach ........................... 28 Marcin Michalik, Anna Knapik Porównanie częstości oddechów u osób zdrowych oraz chorych, leczonych z powodu zaostrzenia POChP na oddziale Pneumonologii w CSK ................. 39 Agnieszka Szymczyk, Arkadiusz Macheta, Monika Podhorecka Przewlekła białaczka limfocytowa – diagnostyka i wybrane czynniki prognostyczne.............................................. 49 Ewelina Wieczerzak, Anna Trawicka, Agnieszka Szymczyk Postępy w leczeniu szpiczaka mnogiego – przegląd piśmiennictwa ................ 59 Agnieszka Kareńko Zastosowanie inhibitorów topoizomeraz DNA w terapii przeciwnowotworowej ......................................................................... 70 Maria Misiorek, Alina Owsiak Terapeutyczne zastosowanie cytokin .................................................................. 82 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz, Gabriela Dyrda Cytotoksyczność wybranych metaloftalocyjanin wobec mikroorganizmów... 98 Katarzyna Barchiewicz, Martyna Sztandera, Karolina Jakubczyk, Rudolf Słota Lipofilowe ftalocyjaniny dla terapii fotodynamicznej PDT ............................ 112 Irena Boluch, Jakub Knurek, Monika Kurpas Rola miRNA w leczeniu chorób nowotworowych na przykładzie raka szyjki macicy..................................................................... 130 Karol Nowosad, Piotr Stępień, Paula Musiał Sekwencjonowanie DNA – przegląd metod .................................................... 141 Maja Zakrzyk, Karina Kocot, Rudolf Słota Właściwości ftalocyjaniny europu i iterbu w obecności akceptora elektronów ................................................................... 154 Karina Kocot, Maja Zakrzyk, Gabriela Dyrda Ftalocyjaniny w fotokatalizatorach hybrydowych MPc-TiO2 do degradacji 4-nitrofenolu w wodzie............................................................... 168 Kornelia Malarczyk, Eugeniusz Milchert Techniczne znaczenie olejów roślinnych ......................................................... 182 Grzegorz Babiarz, Konrad Terpiłowski, Lucyna Hołysz Swobodna energia powierzchniowa szkieł stosowanych w rolnictwie .......... 193 Indeks autorów ................................................................................................... 210 Arkadiusz Macheta1, Agnieszka Szymczyk2 Historia transfuzjologii – przetaczanie krwi dawniej i dziś 1. Wprowadzenie Współczesny stan wiedzy na temat krwi i jej funkcji w ustroju człowieka i zwierząt, rozwijał i udoskonalał się na przekroju wielu tysiącleci. Od czasów prehistorycznych poszukiwano sposobów uzupełniania zasobów krwi ludzkiej, utraconej zarówno podczas zabiegów chirurgicznych, jak i na polach walki. Historia krwiolecznictwa, podobnie jak historia samej medycyny ma długą tradycję, sięgającą zamierzchłych czasów. Już w piśmiennictwie starożytnym oraz w dziełach sztuki asyryjskiej, babilońskiej czy greckiej można odnaleźć wzmianki o leczniczych kąpielach z krwi czy o zastosowaniu jej jako składnika niektórych wówczas wyrabianych leków. Zanim natomiast zaczęto przetaczać krew, opierając się na wierze w jej życiodajną moc, najpierw próbowano ją pić. Rzymianie i Grecy pili świeżą krew zwierząt, a także gladiatorów zabitych na arenie, wierząc, że przyczyni się to do polepszenia stanu ich zdrowia. Taką terapię polecano szczególnie osobom chorym, bądź osłabionym. Przekazy o terapeutycznym piciu krwi znajdziemy także w piśmiennictwie średniowiecznym, kiedy to w 1492 roku papież Innocenty VIII miał wypić krew pozyskaną od trzech młodych chłopców, jednakże bez efektu leczniczego – cała procedura miała skutkować śmiercią zarówno papieża, jak i dawców [1, 2]. Idee wyrażone we wspomnianych okresach mogły w praktyce być zrealizowane dopiero w epoce nowożytnej, po wyjaśnieniu podstawowych zjawisk fizjologicznych zachodzących w organizmie ludzkim. Za symboliczny i przełomowy moment w historii transfuzjologii uważa rok 1628, kiedy to opublikowano dzieło autorstwa angielskiego lekarza Williama Harveya o budowie i funkcjonowaniu układu krążenia człowieka. Na podstawie tej pracy, w drugiej połowie XVII wieku, podjęto się licznych prób przetaczania ludziom krwi zwierzęcej, szczególnie psiej i jagnięcej – z różnym efektem [1, 3]. 1 [email protected] , Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku, I Wydział Lekarski z Oddziałem Dentystycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, https://www.umlub.pl/ 2 [email protected], Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku, I Wydział Lekarski z Oddziałem Dentystycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, https://www.umlub.pl/ 7 Arkadiusz Macheta, Agnieszka Szymczyk 2. Ewolucja wiedzy o układzie krwionośnym Pierwszym znanym uczonym, opisującym anatomię układu krążenia był grecki lekarz - Diogenes z Apolonii (V wiek p.n.e.). Zróżnicował on krew żylną od tętniczej, stwierdził także, że główne naczynia przebiegają parzyście po obu stronach kręgosłupa, a od nich odchodzą odgałęzienia naczyń mniejszych. Również Arystoteles ze Stagiry (IV wiek p.n.e.) podjął się wyjaśnienia tejże problematyki. Sugerował, iż krew jest wytwarzana w jamach serca i za pomocą naczyń krwionośnych jest z niego pompowana, po czym rozchodzi się po organizmie, nie powracając już do serca. Autorami kolejnego poglądu byli w III wieku p.n.e. Herofilos z Chalcedonu oraz Erazistrat z Keos – stwierdzili, że w tętnicach znajduje się powietrze zaopatrujące w tlen wszystkie regiony ciała. Teza ta została w kolejnym wieku obalona przez Galena, rzymskiego lekarza pochodzenia greckiego w trakcie nieskomplikowanego eksperymentu – podwiązał on naczynie krwionośne z obu stron i po wykonaniu nacięcia wypuścił z niego krew. Poglądy Galena do XVII wieku traktowane były na miarę dogmatu naukowego, do jego założeń zalicza się opis dwukomorowego mięśnia sercowego z otworkami w przegrodzie międzykomorowej i przedsionkach będących przedłużeniem pni naczyniowych. Filozof proces krwiotworzenia przypisał wątrobie, a przepływ krwionośny miał przebiegać w łożysku naczyniowym jednokierunkowo – od serca do obwodu. Wyjątkiem miała być żyła główna dolna, którą krew miała być zasysana do komory prawej i dalej wtłaczana do płuc, których rolą było ochładzanie i oczyszczanie krwi. Za zasysanie powietrza z płuc i nadanie tętnicom siły pulsacyjnej miała odpowiadać natomiast komora lewa [1]. Obowiązujące od wieków poglądy zostały poddane weryfikacji w epoce Renesansu. Zapoczątkował ją artysta i anatom włoski Leonardo da Vinci oraz uczony flamandzki Andreas Vesalius, który w swym dziele z 1543 roku, pt.: "Budowa ludzkiego ciała", wykazał liczne błędy w tezach Galena, m.in. negując istnienie otworów w przegrodzie między komorami serca i poddając w wątpliwość przepływ krwi między obiema komorami. Wkład w rozwój anatomii układu krążenia miał hiszpański uczony Miguel Serveto, który w swoim dziele z 1553 roku po raz pierwszy opisał zjawisko małego krążenia oraz stwierdził, iż krew płynie z serca do płuc i odwrotnie, a podczas przepływu do lewej komory przez naczynia płucne, krew zmienia kolor na jaśniejszy. Istotną rolę w rozwoju wiedzy o układzie krwionośnym przypisuje się również Polakowi – Józefowi Strusiowi z Poznania, który w swoim dziele z 1555 roku opisał badanie tętna jako ważny element postępowania diagnostycznego i został autorem pierwszego na świecie jego zapisu graficznego [1, 3]. 8 Historia transfuzjologii – przetaczanie krwi dawniej i dziś Pozostającymi w zainteresowaniu licznych uczonych elementami strukturalnymi układu krwionośnego były m.in. zastawki żylne. Choć wzmiankę o nich można znaleźć już w V wieku w opisie Teodoreta z Cyru, to ich szczegółowy rozwój przypada na czasy Odrodzenia. Jednak powstałe dzieła dotyczyły wyłącznie budowy owych struktur, nie mówiąc wiele o ich czynności. Dopiero publikacja dzieła wspomnianego wcześniej Wiliama Harveya w roku 1628 doprowadziła do przełomu w wyjaśnieniu funkcji zastawek, jaką jest zapobieganie cofaniu się krwi w naczyniach. Harvey wykazał także, że krążenie krwi charakteryzuje układ zamknięty, a serce nie zasysa krwi, tylko tłoczy ją na obwód, powodując powstanie fal tętna. Kolejne odkrycie, dokonane w 1661 roku przez Marcello Malphighiego, polegające na opisie naczyń włosowatych, uzupełniło zaawansowany już stan wiedzy dotyczący układu krążenia, dając tym samym nadzieję na rozwój krwiolecznictwa wraz z opracowaniem metodyki dożylnej aplikacji medykamentów i krwi [1, 4]. 3. Nowatorskie próby przetaczania krwi Pierwsze udokumentowane zabiegi przetoczenia krwi u zwierząt odnotowuje się w drugiej połowie XVII wieku. Za prekursorów uważa się powszechnie Anglików, pierwszym z nich był profesor Christopher Wren, który podawał leki i płyny do krwioobiegu zwierząt, a za pionierską transfuzję uchodzi doświadczenie londyńskiego lekarza Richarda Lowera, przeprowadzone na psach. W 1665 roku przetoczył on krew metodą bezpośredniej transfuzji z tętnicy szyjnej jednego do żyły szyjnej drugiego zwierzęcia, a wyniki tych badań opublikował w rozprawie "Tractatus de corde" w 1669 roku. Z pozoru udane doświadczenie Lowera, poskutkowało podjęciem przez uczonych prób przetoczenia do ludzkiego krwioobiegu krwi zwierzęcej i różnych medykamentów w celach leczniczych [4, 5]. Jednym z pierwszych, który podjął się w 1663 roku podawania leków i wody do żył pacjentom był Johann Elsholtz, natomiast pionierskiej transfuzji krwi człowiekowi dokonał w 1667 roku Jean Baptiste Denis. Przetoczył on do żyły piętnastoletniego chorego chłopca krew z tętnicy szyjnej owcy. Pacjent ozdrowiał, a jedynym działaniem niepożądanym po owym zabiegu było czarne zabarwienie moczu. Pozytywny efekt zabiegu tłumaczono wówczas rozcieńczeniem przez obcą krew, zagęszczonej wskutek gorączki, krwi żylnej pacjenta. Po owym niewątpliwym sukcesie terapeutycznym nastąpiła cała seria nieudanych zabiegów transfuzji, kończących się zgonem pacjentów, w mechanizmie określanym obecnie mianem wstrząsu hemolitycznego. Wkrótce francuski parlament w porozumieniu ze środowiskami lekarskimi i prawniczymi wydał wyrok sądowy zabraniający przeprowadzania przetaczania krwi. Niedługo po tym także 9 Arkadiusz Macheta, Agnieszka Szymczyk w innych krajach Europy zastosowano podobne rozwiązania prawne, które poskutkowały zaprzestaniem procedur transfuzji i infuzji dożylnych u ludzi aż do XIX wieku [1, 4, 6]. Idea leczenia krwią, szczególnie w przypadku masywnych krwotoków, skłaniała lekarzy do podejmowania kolejnych prób i została wznowiona na początku XIX wieku przez angielskiego położnika i fizjologa Jamesa Blundella, który przetoczył ludzką krew 10 kobietom po krwotokach okołoporodowych, dzięki czemu przeżyła połowa z nich. Wówczas też zaobserwowano wystąpienie szeregu różnych powikłań występujących podczas, jak też po zabiegu, takich jak niepokój, drgawki, drżenie rąk, wymioty i bóle brzucha [7]. Udział w postępie w zakresie transfuzjologii miał również niemiecki chirurg Johann Friedrich Dieffenbach. W 1828 roku przedstawił on możliwości przetoczenia krwi pozbawionej włóknika, a zatem pozbawionej również krzepliwości [1, 8]. Za pierwszego Polaka, który podjął się przetoczenia ludzkiej krwi, uważa się Ludwika Bierkowskiego, który w latach 30-tych XIX wieku opublikował kilka artykułów dotyczących krwiolecznictwa. Wspomnieć należy również o Karolu Marcinkowskim, który w 1836 roku przedstawił pracę pt.: "O przetaczaniu krwi jako środka leczniczego" [9]. Mimo niepokojących, dość licznych powikłań i ciągle sporej śmiertelności transfuzje krwi uległy rozpowszechnieniu zarówno w Europie, jak i Ameryce. Liczne publikacje z tamtego okresu związane z przetaczaniem krwi, wskazują na świadomość ryzyka związanego z zabiegiem transfuzji, jednak w żaden sposób nie wyjaśniają potencjalnych przyczyn powikłań poprzetoczeniowych u chorych. Kolejna fala spadku popularności przetaczania krwi u ludzi nastąpiła jednak wkrótce po zasugerowaniu przez niemieckiego chirurga Alberta Landerera, że w przypadku straty krwi, skuteczne i jednocześnie niosące za sobą zdecydowanie mniej powikłań, może być uzupełnienie objętości łożyska naczyniowego fizjologicznym roztworem soli [1, 10]. 4. Odkrycie i klasyfikacja grup krwi Pierwszy opis zjawiska rozpadu krwinek czerwonych (hemolizy) jest autorstwa niemieckiego fizjologa Leonarda Landoisa z 1874 roku, który proces ten uznał za poważne powikłanie poprzetoczeniowe. Jednak interpretacja zjawiska hemolizy była błędna, gdyż zasugerował on, że jest to objaw jakiejś choroby [1, 11]. Odkrycie istnienia grup krwi i warunki jej bezpiecznego przetaczania objaśnione zostały w 1900 roku przez austriackiego immunologa Karla Landsteinera, który wykazał, że krew dwóch osób w bezpośrednim kontakcie ze sobą ulega zlepieniu (aglutynacji). Po roku uczony przedstawił wnioski, że zjawisko to jest następstwem kontaktu krwi z obcą surowicą, a na krwinkach występują 10 Historia transfuzjologii – przetaczanie krwi dawniej i dziś dwa rodzaje antygenów. W ten sposób zidentyfikował trzy grupy ludzkiej krwi - A, B i 0 (tę ostatnią opisał jako C). Słusznie także stwierdził, że przetoczenie krwi między dwojgiem ludzi z tą samą grupą krwi nie prowadzi do niszczenia krwinek czerwonych, co miało miejsce w przypadku transfuzji krwi u osób z różnymi grupami krwi. W 1902 roku Alfredo von Decastello i Adrian Sturly uzupełnili tę klasyfikację odkrywając czwartą grupę krwi – AB. Korzystając z dorobku poprzedników, dwóch innych naukowców, Polak Ludwik Hirszfeld wraz ze swoim współpracownikiem Emilem von Dungernem wprowadzili oznaczenie grup z użyciem symboli A, B, AB oraz 0. Klasyfikacja ta, nazwana układem AB0, została w 1928 roku powszechnie przyjęta na całym świecie i jest aktualna do dzisiaj [3, 12, 13]. Obecnie również powszechnie wiadomo, że osobie z grupą krwi AB można przetoczyć krwinki czerwone każdej grupy (uniwersalni biorcy), a osoba z grupą krwi 0 może być dawcą krwinek czerwonych dla biorców każdej innej grupy z tego układu (uniwersalni dawcy). Wynika to stąd, że osoby z grupą AB nie produkują przeciwciał przeciwko żadnej z grup krwi. Odkrycie przez Landsteinera w 1940 roku czynnika Rh spowodowało przełom w transfuzjologii i zdecydowanie zwiększyło bezpieczeństwo krwiolecznictwa (Rysunek 1.). Pozwoliło na dokładniejsze poznanie przyczyn powikłań poprzetoczeniowych, wyjaśniło także przyczynę konfliktów serologicznych między matką a płodem. Dość szybkie zaakceptowanie przez środowisko medyczne leczenia krwią jako postępowania ratującego życie, przyczyniło się do dalszego rozwoju transfuzjologii. W 1914 roku Argentyńczyk Louis Agote i Belg Albert Hustin, niezależnie od siebie, wykonali pierwsze transfuzje krwi z zastosowaniem skutecznego i jednocześnie nietoksycznego związku przeciwdziałającego krzepnięciu krwi - cytrynianu sodu. Użycie tej substancji zapoczątkowało rozwój w zakresie metodyki konserwacji i przechowywania krwi, umożliwiając tym samym zarówno pośrednie przetoczenia lecznicze, jak też transfuzje podczas operacji chirurgicznych [1, 2, 13÷16]. 11 Arkadiusz Macheta, Agnieszka Szymczyk Rys. 1. Tabela przedstawiająca zgodność grup krwi w układzie AB0 i Rh [8]. 5. Krwiolecznictwo dzisiaj Pobieraniem, oddzielaniem poszczególnych składników, konserwacją oraz ekspedycją zajmują się odpowiednie dla danego kraju instytucje służby krwi, a krew i składniki krwi wciąż należą do jednych z częściej stosowanych środków leczniczych. Na świecie wykonuje się obecnie około 80 milionów donacji krwi rocznie, a w Polsce wykonuje się co roku około 1,5 miliona przetoczeń jej składników [17]. Obecnie składniki krwi stosuje się w wielu dziedzinach medycyny. Jako że w przypadku licznych chorób stwierdza się niedobór pewnych krwinek lub też nie działają one prawidłowo, uzupełnienie brakującego elementu krwi przez jego przetoczenie jest często najskuteczniejszą metodą terapeutyczną. Decyzja o transfuzji podejmowana jest przeważnie w takich przypadkach, gdy chory nie może być skutecznie leczony w inny sposób, a oczekiwane korzyści przewyższają ryzyko związane z możliwymi powikłaniami. Na decyzję o przetoczeniu wpływa przede wszystkim stan kliniczny pacjenta, a nie tylko wyniki badań laboratoryjnych (morfologia krwi). Wskazania do transfuzji składników krwi są ściśle określone. Obowiązująca zasada współczesnego krwiolecznictwa polega na przetaczaniu jedynie tych składników krwi, których niedobór jest przyczyną objawów 12 Historia transfuzjologii – przetaczanie krwi dawniej i dziś choroby, natomiast transfuzja krwi pełnej jest wyjątkowo rzadko wykonywana. Powszechnie przetaczanie składniki krwi to: koncentrat krwinek czerwonych (KKCz) – znajdujący zastosowanie w leczeniu niedokrwistości, tj. stanu, w którym stężenie hemoglobiny (nośnik tlenu) jest znacznie poniżej wartości referencyjnych, a pacjentowi grozi niedotlenienie tkanek, zwłaszcza niedotlenienia ważnych życiowo narządów; koncentrat krwinek płytkowych (KKP) – są to krwinki płytkowe uzyskane albo w trakcie pobierania i dalszego rozdzielania krwi pełnej, albo na drodze automatycznej przy użyciu separatora komórkowego. KKP stosuje się w leczeniu chorych z małopłytkowością, czyli niedoborem płytek krwi. Pacjenci z małopłytkowością wykazują skłonność do przedłużonych krwawień, a przy znacznym nasileniu są narażeni są na ryzyko poważnych, a nawet śmiertelnych powikłań krwotocznych; osocze świeżo mrożone (FFP) – osocze zamrożone w czasie, który umożliwia zachowanie czynnościowego stanu labilnych czynników krzepnięcia. W świetle aktualnej wiedzy wskazania kliniczne do zastosowania samego FFP są bardzo ograniczone i dotyczą kilku sytuacji klinicznych (np. gdy koncentraty białek osocza - czynników krzepnięcia, otrzymane na drodze przemysłowej nie są dostępne). Drogą kontrolowanego rozmrażania z FFP można uzyskać krioprecypitat, stosowany w leczeniu chorych z hemofilią A lub też chorobą von Willebranda. Obecnie osocze ludzkie stosuje się nie tylko do przetoczeń. Na dużo większą skalę poddaje się je fabrycznemu przetworzeniu metodą frakcjonowania na tzw. produkty krwiopochodne. Należą do nich: o koncentraty czynników krzepnięcia, stosowane w leczeniu i profilaktyce krwawień u chorych z osoczowymi skazami krwotocznymi (np. koncentrat czynnika krzepnięcia VIII, stosowany w leczeniu hemofilii A i czynnika IX w hemofilii B); o albumina, stosowana w klinice w stanach zmniejszonego wypełnienia naczyń układu krwionośnego (hipowolemia) – do szybkiego wypełnienia objętości tych naczyń np. w przebiegu krwotoku, bądź w stanach niedoboru tego białka; o immunoglobuliny, stosowane głównie w leczeniu schorzeń o podłożu immunologicznym, np. w stanach niedoboru odporności, a także w profilaktyce konfliktu matczynopłodowego w układzie Rh. 13 Arkadiusz Macheta, Agnieszka Szymczyk Do dynamicznego rozwoju krwiolecznictwa, który nastąpił w drugiej połowie dwudziestego wieku, przyczyniły się szczególnie następujące dokonania: wynalezienie metod izolacji poszczególnych składników komórkowych krwi; opracowanie technik podziału osocza na frakcje, co umożliwiło pozyskanie m.in. immunoglobulin, albumin i koncentratów czynników krzepnięcia; skonstruowanie separatorów komórkowych, pozwalających na wybiórcze pobieranie bezpośrednio od dawcy poszczególnych składników krwi, np. osocza czy płytek; zastosowanie technik biotechnologicznych do wytwarzania koncentratów czynników krzepnięcia (tzw. rekombinowane czynniki krzepnięcia); zastosowanie zestawów z tworzyw sztucznych do pobierania, preparatyki, magazynowania oraz przetaczania krwi i jej składników; wdrożenie nowoczesnych metod badawczych i preparatyki krwi, celem eliminacji możliwych zagrożeń związanych z transfuzją. Należy też wspomnieć, że w niektórych przypadkach można do transfuzji używać własnej krwi pacjenta, pobranej odpowiednio wcześniej. Jest to tzw. autotransfuzja, czyli pobranie, a następnie przetoczenie własnej krwi pacjenta. Dotyczy to zwłaszcza planowanych operacji chirurgicznych. Innym kierunkiem poszukiwań są badania nad wytworzeniem tzw. „sztucznej krwi”. Pod określeniem tym rozumie się albo syntetycznie otrzymane zamienniki (np. syntetyczne nośniki tlenu czy roztwory hemoglobiny) albo krwinki czerwone wytworzone przez komórki macierzyste na drodze biotechnologicznej. Badania te cieszą się dużym zainteresowaniem i wiązane są z nimi duże nadzieje. [2, 17, 18, 19]. Wydaje się jednak, że z uwagi na różnorodność zastosowań i niejednokrotnie na brak innej opcji terapeutycznej, leczenie krwią i jej składnikami krwi otrzymanymi od krwiodawców jeszcze przez długi czas pozostaną w zakresie podstawowymi i powszechnie stosowanymi metodami leczniczymi na świecie. Literatura 1. 2. 3. Historia medycyny, red. T. Brzeziński, Warszawa, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2004 Korsak J., Historia leczenia krwią i jej składnikami [w:] Transfuzjologia kliniczna, red. J. Korsak, M. Łętowska, Bielsko-Biała, Wyd. Alfa Medica Press, 2009 Seyda B., Rys dziejów medycyny w Polsce [w:] Dzieje medycyny w zarysie, B. Seyda, Warszawa, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 1977 14 Historia transfuzjologii – przetaczanie krwi dawniej i dziś 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. Historia zdrowia i choroby, G. Vigarello, Warszawa, Wydawnictwo Aletheia, 2011 Rudowski W., O rozwoju leczenia przetaczaniem krwi, "Polski Tygodnik Lekarski", 1947, Tom II, 27, 831 Wójtowicz J., Wojtuń S., Gil J., Historical schedule of management of bleeeding from the upper part of gastrointestinal tract, "Polski Merkuriusz Lekarski", 2009, 26 (155), 504-505 Dzik W.H., The James Blundell Award Lecture 2006: transfusion and the treatment of haemorrhage: past, present and future, "Transfusion Medicine", 2007, 17, 367-374 Współczesna transfuzjologia, red. W. Rudowski, S. Pawelski, Warszawa, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 1985 Ludwik Bierkowski, A. Wrzosek, Kraków, 1911 Ilustrowana historia medycyny, red. Lyons A.S., Petrucelli R.J., Wyd. Penta, 1996 Zarys leczenia przetaczaniem krwi, R. Fidelski, Warszawa, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 1950 Historia jednego życia, L. Hirszfeld, Kraków, Wydawnictwo Literackie, 2011 Kelus A., Odkrycie grup krwi [w:] Grupy krwi, red. H. Hirszfeldowa, Warszawa, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 1958 Sieńkowski E., Kucharski A., Transfuzja krwi i infuzja płynów w Polsce w XIX wieku, "Archiwum Historii i Filozofii Medycyny", 1987, 50, 26-27 Konserwowanie i przetaczanie krwi, red. A. Hausmann, Warszawa, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 1954 Bendarzewski S., Przetaczanie krwi, "Pielęgniarka Polska", 1949, 10, 7-16 http://www.darkrwi.info.pl/portal/pokaz/23/jakie-byly-poczatkikrwiodawstwa-i-krwiolecznictwa.html (dostęp 21.05.2015r.) Rosiek A. Substytuty krwinek czerwonych [w:] Transfuzjologia kliniczna, red. J. Korsak, M. Łętowska, Bielsko-Biała, Wyd. Alfa Medica Press, 2009 Paddock C. Lab-made blood to enter human trials in 2 years. Medical News Today. 26.06.2015 dostępny http://www.medicalnewstoday.com/articles/295925.php 15 Arkadiusz Macheta, Agnieszka Szymczyk Historia transfuzjologii - przetaczanie krwi dawniej i dziś Streszczenie Transfuzja krwi jest procedurą leczniczą często stosowaną w różnych dziedzinach medycyny. Współczesne krwiolecznictwo nie mogłoby istnieć bez zaawansowanych metod pobierania, przechowywania, przetwarzania i badania krwi. Próby leczenia krwią (takie jak picie krwi zwierząt, młodych chłopców czy gladiatorów) można znaleźć w odległej przeszłości. W zasadzie jednak znaczące badania w zakresie transfuzji krwi rozpoczęły się w XVII wieku, poczynając od doświadczeń Williama Harveya dotyczących krążenia krwi i po udanych eksperymentalnych przetoczeniach między zwierzętami. Jednak transfuzje krwi zwierzęcej do układu żylnego ludzi, podjęte przez badaczy, często kończyły się tragicznie. Przetaczanie krwi wciąż pozostawało niebezpieczne i wiele z nich kończyło się śmiercią pacjentów. Pod koniec XIX wieku transfuzje zostały uznane za zbyt ryzykowne i w dużej mierze były odrzucane przez środowiska medyczne. Dopiero w XX wieku, kiedy zostały odkryte grupy krwi ludzkiej (0, A, B i AB), a następnie czynnik Rh, przetoczenia stały się bezpieczne. Obecne procedury przetaczania krwi w niczym nie przypominają wczesnych początków transfuzji. Należy jednak podkreślić, że większość przełomowych wydarzeń w medycynie transfuzjologicznej osiągnięto podczas ostatnich kilkudziesięciu lat. Obecnie transfuzje składników krwi są wykorzystywane w różnych schorzeniach, celem zastąpienia utraconych, bądź nie wytwarzanych w wystarczającej ilości przez organizm krwinek. W przeszłości transfuzje polegały na przetaczaniu krwi pełnej, natomiast dziś w praktyce medycznej używa się tylko poszczególnych składników krwi, takich jak krwinki czerwone, płytki krwi, krwinki białe, osocze. Z osocza ponadto uzyskuje się produkty krwiopochodne takie jak koncentraty czynników krzepnięcia, albuminę i immunoglobuliny – cenne leki w nowoczesnej medycynie. Słowa kluczowe: krew, grupy krwi, krwiolecznictwo 16 Agnieszka Szymczyk1, Arkadiusz Macheta2, Monika Podhorecka3 Medycyna transplantacyjna – krótki rys historyczny 1. Wstęp Późnołacińskie określenie transplantare (z łac. transplantare – szczepić i plantare – sadzić), które upowszechniło się w języku polskim jako transplantacja oznacza przeszczepienie, czyli przeniesienie komórek, tkanek lub całych narządów z organizmu dawcy do organizmu biorcy w celu poprawy jego stanu zdrowia. Transplantowane tkanki lub narządy nazywane są transplantami czyli przeszczepami, a przyczyną dokonywania procedury transplantacji jest ubytek, uszkodzenie, brak lub uszkodzenie tkanki albo narządu. Ze względu na związek pomiędzy dawcą a biorcą rozróżnia się kilka rodzajów przeszczepienia: autotransplantacje – dawca i biorca przeszczepu jest tą samą osobą (nazywamy je także transplantacjami własnopochodnymi, autogenicznymi lub autologicznymi); izotransplantacje – dawca i biorca są identycznymi pod względem genetycznymi osobnikami (są bliźniakami jednojajowymi); transplantacje alogeniczne – transplantacje w obrębie jednego gatunku; ksenotransplantacje – przeszczepienie tkanek lub narządów od osobnika innego gatunki [1]. Pomysły związane z zamianą utraconych lub nieuleczalnie uszkodzonych tkanek lub narządów były marzeniem ludzkości od dawna. Już w czasach starożytnych interesowano się przeszczepianiem tkanek i narządów, jednak z uwagi na fakt, że główne trudności i niepowodzenia procedury transplantacji wynikają przede wszystkim ze skomplikowanych 1 [email protected], Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku, I Wydział Lekarski z Oddziałem Dentystycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, https://www.umlub.pl/ 2 [email protected] , Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku, I Wydział Lekarski z Oddziałem Dentystycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, https://www.umlub.pl/ 3 [email protected], Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku, I Wydział Lekarski z Oddziałem Dentystycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, https://www.umlub.pl/ 17 Agnieszka Szymczyk, Arkadiusz Macheta, Monika Podhorecka procesów immunologicznych, dopiero XX wiek, kiedy opracowano skuteczne metody przełamywania bariery immunologicznej, przyniósł rozwój transplantologii [1, 2]. 2. Legendy, przekazy i doniesienia starożytne dotyczące transplantologii O pierwszych próbach transplantacji świadczyć mogą ryciny powstałe w starożytności w cywilizacjach Azteków, Majów, Etrusów, Tybetu i Chin. W wielu książkach i artykułach podawane są liczne przekazy dotyczące „cudownych wydarzeń” związanych z przeszczepianiem tkanek i narządów. Według nich święty Antoni Padewski dokonał transplantacji stopy żołnierza, który stracił ją w trakcie walki oraz odtworzył pierś młodej kobiety, która utraciła ja w trakcie zmagań z żołnierzem rzymskim. Święci Kosma i Damian – medycy z Cylicji, którzy praktykowali medycynę wśród ubogich na terenie Syrii za czasów panowania Dioklecjana (III w.) dokonali przeszczepienia dolnej kończyny pielgrzymowi cierpiącemu na gangrenę. Podczas snu w miejsce chorej nogi wstawili nową, którą pobrali od niedawno zmarłego czarnego mężczyzny. W związku z powyższym w tradycji chrześcijańskiej Europy są oni patronami transplantologii [2, 3, 4]. W dziejach starożytnej medycyny hinduskiej również można znaleźć doniesienia dotyczące przeszczepiania narządów i tkanek. Prawdopodobnie już wówczas stosowano technikę odwróconego przeszczepu skóry z czoła celem rekonstrukcji nosa, a hinduski chirurg Sushruta odtwarzał przestępcom odcięte nosy. Zgodnie z przekazami, które nie w pełni zostały udokumentowane podejmowano także pierwsze próby przeszczepiania skóry (opisywane w księgach hinduskich z 600 r.p.n.e.) i kończyn [2, 4]. Do innych przekazów należą opisy zabiegów wykonywanych w starożytnych Indiach i Chinach – według nich Hua To przeszczepił narządy jamy brzusznej, natomiast Tsin Yue Jen dokonał przeszczepienia serca [3]. 3. Początki transplantologii Już w średniowieczu przeszczepiano płat skórny wędrujący z innej okolicy ciała na twarz (płat włoski). W renesansie natomiast Branca (1442r.) wykonywał uszypułowane przeszczepy skóry policzka celem rekonstrukcji nosa, a Gasparo Tagliacozzi (1597r.) wprowadził technikę etapowego przeniesienia skóry z ramienia na nos, którą można nazwać próbą autotransplantacji skór. W Polsce w tym okresie Wojciech Oczko po raz pierwszy dokonał rekonstrukcji nosa z zastosowaniem przeszczepienia skóry [2, 3]. Współczesna era medycyny transplantacyjnej sięga czasów Huntera, który w 1771 r. dokonał pierwszej implantacji zdrowych zębów przed- 18 Medycyna transplantacyjna – krótki rys historyczny trzonowych u człowieka. W 1804. Giuseppe Baronio wykazał, że skóra owcy przyjmuje się po transplantacji w inne miejsce, ale jedynie u tego samego zwierzęcia, a w 1816r. powodzeniem zakończyła się operacja przeszczepu skóry człowieka na człowieka, której dokonał angielski chirurg Capue. Dwa lata później angielski fizjolog i położnik Blundel z sukcesem przetoczył krew wykrwawionej położnicy. W 1858r. Louis Oliver dokonał pierwszego eksperymentalnej transplantacji kości, a w 1883r. Emil Theodor Kocher próbował dokonać przeszczepienia tarczycy. Felix Guyon w Paryżu i niezależnie w Genewie Jasques Reverdin wykonywali autoprzeszczepu skóry w przypadku trudno gojących się owrzodzeń – obaj doszli do wniosku, że najkorzystniejsze jest stosowanie małych fragmentów skórnych, natomiast w Lipsku Carl Thiersch po raz pierwszy zastosował cienkie, wolne płaty skórne do pokrywania dużych powierzchni po oparzeniach [2, 3, 4]. 4. Rozwój transplantologii Za prekursora nowoczesnej transplantologii uważa się francuskiego chirurga i biologa Carella, który pracując na uniwersytecie w Chicago opracował nie tylko technikę szwu naczyniowego, który jest stosowany do dzisiaj, ale także wykonał przeszczep nerki u królika, a razem z Guthriem dokonał heterotropowej transplantacji serca u tego zwierzęcia. Dowiódł, że własna nerka przeszczepiona w inne miejsce może długo funkcjonować prawidłowo, natomiast transplantowana innemu osobnikowi z reguły szybko obumiera. Opracował on także zasady krążenia pozaustrojowego, zasady zabezpieczania narządu przeznaczonego do transplantacji przed zmianami wynikającymi z niedokrwienia oraz poruszył wiele innych zagadnień patologii chirurgicznej. Za swoje osiągnięcia w 1912r. otrzymał nagrodę Nobla [2, 3, 4]. W 1914r. Leser zaobserwował, że alogeniczny przeszczep skóry obumiera w ciągu 14-20 dni od przeszczepienia, czego nie obserwuje się w przypadku transplantacji autologicznej. Nieco później Holman wykazał, że drugi przeszczep pochodzący od tego samego osobnika ulega szybszemu zniszczeniu niż pierwszy [2]. Pierwsze doniesienia naukowe dotyczące odrzucania przeszczepu opublikował w 1923r. Wiliams. Dokonując transplantacji autologicznej i alogenicznej skóry psów zauważył, że jej przeżycie jest najprawdopodobniej związane z obecnością innych antygenów niż antygeny układu AB0. Przełom medycyny transplantacyjnej dokonał się jednak w latach 30. XX w., kiedy Georgie Snell odkrył locus zgodności tkankowej u myszy (nazwany później H2), a Gorer odkrył pierwszy antygen zgodności tkankowej u człowieka. W 1943r. Peter Medawar wykazał, iż odczyn na 19 Agnieszka Szymczyk, Arkadiusz Macheta, Monika Podhorecka przeszczepioną skórę od dawcy spokrewnionego jest mniejszy niż w przypadku dawcy niespokrewnionego genetycznie. Opisał również trzy fazy odczynu immunologicznego (rozpoznawania antygenu, destrukcji i pamięci immunologicznej). Zastosował ponadto steroidy w eksperymencie na królikach dotyczącym istoty odrzucania przeszczepu skóry [2, 3]. Dausset w latach 50. wykazał, że na ludzkich leukocytach znajdują się swoiste antygeny inne niż antygeny układu AB0, a w surowicy osób, u których wielokrotnie przetaczano krew można wykryć leukoaglutyniny. Okrycie to przyczyniło się do odkrycia antygenów układu HLA i ich lokalizacji w obrębie chromosomu 6 [2, 3]. W 1952r. F. Dixon odkrył zjawisko immunosupresji radiologicznej, a w latach 1951-1953 D. Hume stosował immunosupresję sterydową przy przeszczepach nerki bez wszczepienia moczowodu. Merril w 1959r. wprowadził napromienianie promieniami Roentgena biorcy w przeszczepach rodzinnych, a francuscy lekarze w Necker Hopitaux w Paryżu zastosowali bombę kobaltową do napromieniania. Okazało się jednak, że z napromienianiem całego ciała związane są liczne powikłania infekcyjne i nie zapobiega ona odrzuceniu przeszczepu [2, 3]. Próbowano także opanować zjawiska immunologiczne związane z odrzucaniem przeszczepu wprowadzając nowe środki farmakologiczne. W 1959r. R. Schwartz i W. Dameshek wykazali w doświadczeniach na królikach wpływ 6-merkaptopuryny na tolerancję obcogatunkowego białka. W 1961r. wprowadzono azatioprynę do leczenia immunosupresyjnego. W latach 70. natomiast próbowano stosować surowicę, następnie glubulinę antylimfocytarną, a później przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw antygenom limfocytarnym. Zsyntetyzowanie cyklosporyny, którą w 1985r. zastosowano jako lek immunosupresyjny okazało się odkryciem przełomowym w transplantologii – lek ten umożliwił skuteczne przeszczepianie tkanek i narządów. W ostatnim dziesięcioleciu do terapii wprowadzono szereg nowych, wykazujących dużą skuteczność leków, takich jak: takrolimus, rapamycyna, mykofenolan mofetylu, monoklonalne przeciwciała przeciw receptorowi interleukiny 2 oraz wiele innych przeciwciał monoklonalnych [3]. 5. Przeszczepianie serca Wielki postęp chirurgii, który obserwowano na przełomie XIX i XX wieku spowodował rozwój technik chirurgicznych, metod zapobiegania zakażeniom oraz możliwość bezbolesnego wykonywania operacji. Rozwojowi chirurgii towarzyszyły zamierzenia transplantacji mające na celu zastąpienie nieodwracalnie uszkodzonych narządów. Duże nadzieje budziły doświadczenia prowadzone na zwierzętach już na początku XX w, 20 Medycyna transplantacyjna – krótki rys historyczny jednak dopiero zdobycze lat 50. przyniosły pierwsze próby transplantacji serca. Wprowadzono wówczas do kardiochirurgii hipotermię oraz aparaturę do krążenia pozaustrojowego [5]. Pierwszej transplantacji serca dokonano jednak znacznie później, ponieważ nie jest ono narządem parzystym, a sam narząd bardzo długo był uważany za symbol życia, dlatego z jego transplantacją wiązały się problemy natury etycznej, prawnej, religijnej i filozoficznej, a problem pozyskiwania transplantantów stanowił istotna barierę [1, 5]. Pierwszego zabiegu transplantacji serca u człowieka dokonał 23. stycznia 1964r. James Hardy. Przeszczepił on 63-letniemu mężczyźnie ze skrajną niewydolnością serca serce szympansa. Zabieg przebiegł bez powikłań, a przeszczepione serce podjęło pracę (rytm zatokowy), jednak zostało ono szybko odrzucone. Pacjent zmarł 90 minut po zakończeniu zabiegu. Operacja wywołała powszechne oburzenie w środowisku medycznym, pomimo tego nie wstrzymano dalszych badań i przygotowań do transplantacji serca u człowieka. Na początku lat 60. znano już przyczyny odrzucania przeszczepianego narządu oraz wiedziano o konieczności dobierania narządów do transplantacji zgodnie z antygenami tkankowymi. Wiedziano także, jak rozpoznać proces odrzucania oraz jak tłumić zjawiska immunologiczne. Kardiochirurdzy przygotowujący się do procedury przeszczepiania serca u człowieka bardzo dobrze opanowali ją w doświadczeniach na psach. 3. grudnia 1967r. w Republice Południowej Afryki w szpitalu Groote Schur w Kapsztadzie profesor Christiaan Barnard przeprowadził jako pierwszy na świecie udaną operację transplantacji ludzkiego serca choremu po 3 zawałach ze schyłkową postacią przewlekłej niewydolności tego narządu. Dawcą była młoda kobieta, która zginęła w wypadku komunikacyjnym. Biorca przeżył jedynie 18 dni. Zmarł z powodu zakażenia układu oddechowego. Trzy dni później – 6. grudnia 1967r. nowojorski chirurg Adrian Kantrowitz przeprowadził transplantację serca u noworodka ze stwierdzoną poważną wrodzoną wada serca. Dziecko przeżyło jedynie 6 godzin po zabiegu. 2. stycznia 1968r. Profesor Barnard przeprowadził drugą transplantację serca. Tym razem chory przeżył ponad 19 miesięcy, a operacje stały się wydarzeniami światowymi [5, 6]. W Polsce przeszczepianiem serca interesował się profesor Jan Moll – kierownik II Kliniki Chirurgicznej Akademii Medycznej w Łodzi. Zarówno sam profesor, jak i jego współpracownicy przeszli szkolenia w wiodących ośrodkach kardiochirurgicznych w Stanach Zjednoczonych. W Polsce dokonywali doświadczalnych transplantacji serca według metody Lowera i Shumwaya lub w modyfikacji Barnarda na psach. 4. stycznia 21 Agnieszka Szymczyk, Arkadiusz Macheta, Monika Podhorecka 1969r. profesor Jan Moll przeprowadził pierwsze przeszczepienie serca w Polsce. Biorcą był 32-letni mężczyzna z nieodwracalnymi zmianami w mięśniu sercowym będącymi następstwem wieloletniego zapalenia wsierdzia, z wadą zastawkową i utrwalonym nadciśnieniem płucnym. Dawcą był 26-letni chory, u którego stwierdzono śmierć mózgową. Po operacji serce podjęło prawidłową czynność, ale po 3 godzinach i 10 minutach wystąpiła rozstrzeń prawej komory i brak skurczów w przeszczepionym narządzie będących następstwem wyczerpania jego siły hemodynamicznej i jak teraz wiadomo była związana z obciążeniami biorcy (nadciśnienie płucne). Pierwsza polska próba transplantacji serca wywołała ogromne kontrowersje, a osoba profesora była negatywnie oceniana przez społeczeństwo, dlatego nie podjął on drugiej próby przeszczepu [6]. W latach 70. zamiar transplantacji serca wyrażał przeszkolony w Stanach Zjednoczonych w chirurgii naczyniowej Zbigniew Religa, jednak odmawiano mu możliwości wykonania tego zabiegu. Swoje marzenia zrealizował dopiero, gdy został kierownikiem Kliniki Kardiochirurgicznej Śląskiej Akademii Medycznej w Zabrzu. 5. listopada 1985r. wykonał drugą transplantację serca w Polsce. Biorcą przeszczepu był 62-letni rolnik ze skrajną niewydolnością serca spowodowaną kardiomiopatią. Pacjent przeżył jedynie 6 dni po zabiegu. Pomimo porażki zespół profesora Religi wykonał kolejne 4 transplantacje. Ostatnia z nich okazała się najbardziej szczęśliwa, gdyż chory po czterotygodniowej hospitalizacji został wypisany do domu w stanie ogólnym dobrym [5, 6]. W ciągu 2 lat od pierwszej transplantacji serca w Klinice Kardiochirurgicznej w Zabrzu wykonano kolejnych 31 przeszczepień. Wkrótce w Polsce powstał kolejny ośrodek transplantacyjny – w Krakowie. 12. października 1988r. w Klinice Chirurgii Serca, Naczyń i Transplantologii w Krakowie wykonano pierwszy zabieg. Liczba przeszczepień w tym ośrodku szybko rosła (w 1997r. osiągnęła liczbę 70) [5, 6]. 6. Przeszczepianie nerek Pierwsze próby zastąpienia uszkodzonej nerki transplantantem podjął już w 1902r. w Wiedniu Ullman, a w roku 1905r. w Chicago Carell – usiłowali przeszczepić nerki psa na szyję zwierzęcia. Niestety zabiegi kończyły się niepowodzeniami, a czynność przeszczepionego organu ustawała w okresie od kilku do 18 dni. Podobne doświadczenia wykonywano także na innych zwierzętach [2]. Nietypowego przeszczepu nerki po raz pierwszy dokonano w 1945r. –Landsteiner, Hufnagel i Hume przyłączyli nerkę dawcy do naczyń prowadzących krew do przedramienia ciężarnej kobiety z bezmoczem 22 Medycyna transplantacyjna – krótki rys historyczny będącym następstwem zatrucia ciążowego. Po 3 dniach funkcja nerek pacjentki powróciła, a przeszczepioną nerkę usunięto [7, 8]. We wczesnych latach 50. opracowano stosowany do dziś sposób przeszczepiania nerek. Wiedziano także, że nie dojdzie do odrzucenia, jeśli dawca i biorca będą identyczni pod względem genetycznym, dlatego pierwsza udana transplantacja była transplantacją syngeniczną. 23. grudnia 1954 r., w Szpitalu Peter Bent Brigham dr Joseph E. Murray przeszczepił pacjentowi nerkę jego brata bliźniaka. Przeszczepiony narząd funkcjonował prawnie przez 8 lat, a chirurg otrzymał w 1990 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie medycyny [8]. Pierwszego zabiegu transplantacji nerki w historii medycyny dokonał 25. grudnia 1952r. dr Michon w Hospital Necker w Paryżu. Było to pierwsze przeszczepienie nerki pobranej od żywego dawcy, a narząd funkcjonował jedynie przez trzy tygodnie. Pierwszego w Polsce udanego przeszczepienia nerki pobranej ze zwłok dokonał profesor Jan Nielubowicz we współpracy z prof. Tadeuszem Orłowskim 26. stycznia 1966 roku w I Klinice Chirurgicznej Akademii Medycznej w Warszawie. Nieco później profesor Wiktor Bross, będący kierownikiem Kliniki Chirurgicznej Akademii Medycznej we Wrocławiu, rozpoczął transplantacje nerek pobranych od zmarłych, a następnie przeprowadził pierwszy w Polsce przeszczep nerki od dawcy rodzinnego. Przez wiele lat transplantacji tego narządu z uwagi na ówczesne uregulowania prawne nie wykonywano często, pomimo że przez środowisko lekarskie były uważane za skuteczny sposób leczenia chorych ze schyłkową niewydolnością nerek [8]. Radykalna zmiana w polskiej transplantologii dokonała się dopiero na przełomie lat 70. i 80. XX wieku, kiedy rozpoczęto w kraju program przeszczepiania nerek ze zwłok i od dawców rodzinnych, co pozwoliło na znaczne zwiększenie liczby wykonywanych transplantacji [7]. 7. Przeszczepy wątroby Pierwszej próby przeszczepienia wątroby dokonał Thomas Starzl w Denver – pacjentem było 3-miesięczne dziecko z atrezją dróg żółciowych. Zabieg zakończył się niepowodzeniem – dziecko zmarło na stole operacyjnym w wyniku masywnego krwotoku. Następne próby transplantacji tego narządu były przeprowadzane także w Stanach Zjednoczonych. Wszystkie kończyły się zgonem chorego we wczesnym okresie pooperacyjnym [2, 9, 10]. Co prawda uważa się, że pierwszy udany przeszczep wątroby został przeprowadzony w 1967r. przez Thomasa Starzla u dziecka z wrodzoną atrezją dróg żółciowych, jednak przez wiele lat zabieg ten z uwagi na wysoką śmiertelność był wykonywany jedynie w ramach badań doświad- 23 Agnieszka Szymczyk, Arkadiusz Macheta, Monika Podhorecka czalnych. Dopiero w 1983r. grono ekspertów zaakceptowało transplantacją wątroby jako znaną metodę leczniczą. Od tego momentu liczba wykonywanych zabiegów sukcesywnie rosła. W Polsce pierwsze próby transplantacji wątroby również były nieudane. W 1987r. R. Kostyrko oraz M. Perdela w Zabrzu wykonali pierwszy tego typu zabieg. Udanego przeszczepienia dokonano dopiero w 1990r. w Centrum Zdrowia Dziecka w Warszawie. Pionierem w tej dziedzinie został Piotr Kaliciński. W 1999r. w tym samym ośrodku przeprowadzono pierwszy przeszczep rodzinny, a pierwszą transplantację u dorosłego biorcy wykonali Jacek Pawlak i Bogdan Michałowicz w 1994r. Pierwszy przeszczep od żywego dawcy miał miejsce w Polsce dopiero w 1999r. [2, 9]. 8. Przeszczepianie innych tkanek i narządów Najpierw próbowano przeszczepiać tkanki – pierwszą z nich była skóra. Później, bo w 1924 roku Vladimir P. Fiłatov dokonał pierwszego przeszczepienia rogówki u człowieka. Transplantacje narządów zdecydowanie były trudniejsze i wiązały się z większą liczbą powikłań, jednak w miarę rozwoju wiedzy na temat procesów immunologicznych i rozwój technik chirurgicznych, coraz częściej dokonywana przeszczepiania narządów. Pierwszym z nich była nerka, później przeszczepiono natomiast serce [2]. W 1966r. Richard Lillehei i William Kelley w Minneapolis przeprowadzili udany przeszczep trzustki, natomiast pierwsze badania dotyczące przeszczepiania wysp trzustkowych na modelu zwierzęcym rozpoczęto już na początku lat 70. XX wieku. Jednak dopiero w 1989 r. Ricordi opracował pierwszą skuteczną metodę izolacji i przeszczepiania ludzkich wysp trzustkowych [11, 2]. W Houston w 1969r. Danton przeprowadził pierwszą udaną jednoczasową transplantację płuc i serca, natomiast w Polsce w 1988r. Jacek Szmidt jednocześnie przeszczepił serce i trzustkę. W 1998r. Duybernard wykonał pierwszy udany przeszczep ręki (odrzut nastąpił po 29 miesiącach), a w 2002r. przeszczepił obie ręce. W Polsce transplantacja ręki została przeprowadzona dopiero w 2006r. przez Jerzego Jabłeckiego [2]. Rok 2002 był owocny dla polskiej transplantologii – w Zabrzu Marian Zembala razem ze swoim zespołem przeprowadził udany jednoczasowy przeszczep płuc i serca, a nieco później udaną transplantację serca i nerki [2]. Z rewolucją biotechnologiczną, której jesteśmy świadkami, nierozłącznie wiąże się rozwój technik hodowli tkankowych in vitro. Już w 1975 roku Green opisał po raz pierwszy seryjną subkulturę ludzkich keratynocytów, a w 1981r. Gallico zastosował wyhodowane, autogenne komórki nabłonka do leczenia rozległych oparzeń. Metody hodowli fibroblastów w macierzy kolagenowej udoskonalili Bell (1983) i Burkę (1987) [12]. 24 Medycyna transplantacyjna – krótki rys historyczny Aktualnie przez zespoły kierowane przez F. Augera z Uniwersytetu w Quebec oraz J. Vacanti z Bostonu są prowadzone obiecujące prace nad stworzeniem naczyń krwionośnych. Naczynia wyhodowane in vitro wszczepiono już z sukcesem zwierzętom laboratoryjnym [12]. Próbowano także wyhodowany nabłonek urotelialny wykorzystać w zabiegach powiększania pęcherza za pomocą wstawki jelitowej pokrytej takim nabłonkiem po wcześniejszym usunięciu jelitowej błony śluzowej Pierwszym ukształtowanym in vitro i przeszczepionym człowiekowi narządem jest pęcherz moczowy – dokonał tego zespół kierowany przez A. Atalę z Uniwersytetu Harvarda [12]. 9. Przeszczepianie komórek krwiotwórczych i szpiku kostnego Już pod koniec XIX wieku wykorzystywano szpik leczniczo – zalecano spożywanie szpiku zwierzęcego w wybranych typach niedokrwistości. Pierwszych prób transplantacji komórek krwiotwórczych dokonywano natomiast w latach 1939-1940 na zwierzętach. Trójka naukowców - Osgood, Riddle, Mathews w 1939r. opisała dożylne podanie szpiku kostnego. Jednak palmę pierwszeństwa oddaje się Polakom – Janowi Stefanowi Raszkowi i Franciszkowi Groerowi, którzy już w 1938r. na Uniwersytecie Jana Kazimierza we Lwowie wykonali pierwsze przeszczepienie szpiku kostnego. Naukowcy szpik podali doszpikowo. Pierwsze zabiegi nie przynosiły sukcesów terapeutycznych [2]. Wydarzenia w Hiroszimie i Nagasaki spowodowały rozwój badań w zakresie medycyny nuklearnej oraz w zakresie transplantologii szpiku. W 1947r. Lorentz i Jacobson wykazali, że podanie szpiku zwierzętom poddanym naświetleniu powoduje odbudowę układu krwiotwórczego i odpornościowego. Początkowo efekt ten przypisywano czynnikom wzrostowym obecnym w szpiku. W 1956r. wyhodowano myszy z aberracjami chromosomowymi, które mogły być markerem przeszczepionych komórek. Udowodniono wówczas, że sukces zabiegu transplantacji jest związany z obecnością komórek macierzystych szpiku dawcy w organizmie biorcy. U ludzi pierwsze próby alogenicznych transplantacji były dokonywane pod koniec lat 50. XX wieku. Pierwotnie udawały się jedynie przeszczepy syngeniczne – pierwszy z nich wykonał w 1957r. Thomas ze swoim zespołem. W 1959r. McGovern opisał natomiast autotransplantację. Krokiem milowym w transplantologii okazało się odkrycie praw rządzących antygenami zgodności tkankowej. Po tym wydarzeniu w latach 60. XX wieku Mathe wykonał pierwszą alogeniczną transplantację szpiku u człowieka, a następnie wykonano pierwsze alogeniczne przeszczepienie od dawcy rodzinnego. Co prawda w 1967r. przeprowadzono już 417 transplantacji u ludzi, jednak należy zauważyć, że jedynie 4 z nich 25 Agnieszka Szymczyk, Arkadiusz Macheta, Monika Podhorecka przyniosły sukces terapeutyczny. Najważniejszego postępu w dziedzinie transplantologii szpiku kostnego dokonał E. Donall Thomas, który wykonał pierwsze udane przeszczepy w grupie chorych na białaczki, a także wprowadził metodę całkowitego napromieniania ciała. W Polsce pierwszy przeszczep szpiku zostały wykonany w Klinice Pediatrii w Poznaniu w 1983r. przez profesor Urszulę Rawańską, jednak w tym przypadku doszło do późnego odrzucenia i zgonu pacjenta. Pierwszej udanej alogenicznej transplantacji od dawcy rodzinnego dokonał w 1984r. profesor W. Jędrzejczak, a w 1985r. autologicznej. Transplantacji od dawcy niespokrewnionego dokonano natomiast w 1997r. w Katowicach [2] W 2000 r. profesor J. Wachowiak wykonał pierwsze przeszczepienie oparte wyłącznie na krwi pępowinowej od niespokrewnionego dawcy, natomiast pierwszego jednoczesnego przeszczepienia 2 jednostek krwi pępowinowej, pochodzącej od dwóch różnych dawców, dokonał prof. W. Jędrzejczak w 2003r. [2]. Pierwotnie szpik kostny do procedury przeszczepienia pobierano w znieczuleniu ogólnym z talerza kości biodrowej. Przełomem we współczesnej transplantologii stanowiły badania Duhrsena nad zastosowaniem czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytranych (G-CSF, ang. granulocyte colony-stimulating factor) w mobilizacji komórek macierzystych, dzięki czemu stało się możliwe kolekcjonowanie komórek macierzystych z krwi obwodowej zarówno od pacjentów, jak i zdrowych dawców [13]. 10. Podsumowanie Transplantacje narządów i komórek krwiotwórczych należą do jednych z największych osiągnięć XX wieku. Co prawda odnotowuje się ciągły wzrost liczby przeszczepień jednak ich ilość jest nadal niewystarczająca. W związku z powyższym niezbędne jest propagowanie idei transplantacji narządów i szpiku kostnego w społeczeństwie, prace nad nowymi lekami immunosupresyjnymi oraz dopracowanie przepisów prawnych (m.in. kwestia domniemanej zgody). Literatura 1. 2. 3. 4. 5. Tokarczyk R., Zarys regulacji transplantacji organów ludzkich, Ruch Prawniczy, Ekonomiczny i Socjologiczny. 2000; LXII (1): 15-31 Sobiak J., Przeszczepianie narządów i komórek krwiotwórczych – rys historyczny, Nowiny Lekarskie, 2011; 80 (2): 157-161 Rowiński W., Wałaszewski J., Pączka L., Transplantologia kliniczna, PZWL, 2004: 21-27 http://www.cxnews.pl/historia-przeszczepiania-narzadow,201.html Sterkowicz S., Czterdzieści lat później. Transplantacja serca – wczoraj, dziś, jutro, Kardiochirurgia i Torakochirurgia Polska, 2007; 4 (4): 423-427 26 Medycyna transplantacyjna – krótki rys historyczny 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Sterkowicz S., Historia pierwszych transplantacji serca w Polsce, Kardiochirurgia i Torakochirurgia Polska, 2009; 6 (3): 313-316 Mucha-Smejda L., Rodzinny przeszczep nerki – dar życia i miłości, Przegląd Urologiczny, 2013; 5 (81) http://www.woia.pl/dokumenty/praca%20specjalizacyjna.pdf Wójcicki M., Pakosz-Golanowska M., Transplantacja wątroby – technika chirurgiczna i powikłania naczyniowe po operacji, Gastroenterologia kliniczna, 2001; 3 (1): 46-54 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25535023 Popow A., Durlik M., Rydzewski A., Przeszczepianie izolowanych wysp trzustkowych: nowa metoda leczenia cukrzycy i jej powikłań, Przegląd Gastroenterologiczny 2006; 1 (4): 202-207 http://www.uj.edu.pl/documents/2387936/4117803/PRZEGL_CHIRURG.pdf http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1359610114000732 Medycyna transplantacyjna – krótki rys historyczny Streszczenie Możliwością przeszczepiania uszkodzonych tkanek lub narządów interesowano się już w starożytności, a same transplantacje zawsze wzbudzało wiele emocji. Jednak dopiero druga połowa XX wieku przyniosła lepsze poznanie procesów immunologicznych leżących u podłoża odrzucania przeszczepionej tkanki lub narządu oraz prężny rozwój transplantologii klinicznej. Pomimo że przeszczepianie komórek krwiotwórczych i narządów obecnie jest niemal rutynową procedurą, pierwsze zabiegi wiązały się z wieloma powikłaniami i często prowadziły do zgonu chorego. Przeszczepianie narządów zrewolucjonizowało medycynę, dało szansę na poprawę jakości życia wielu chorych, a w niektórych przypadkach jest jedyną opcją terapeutyczną. W artykule przedstawiamy najważniejsze kroki milowe transplantologii klinicznej oraz krótki rys historyczny. Słowa kluczowe: transplantologia kliniczna, przeszczepianie komórek krwiotwórczych, przeszczepianie narządów 27 Anna Knapik1, Marcin Michalik2 Wpływ otyłości na rozwój chorób układu oddechowego u kobiet i mężczyzn po 40 roku życia, chorych leczonych w CSK w Katowicach 1. Wstęp i cel pracy Nadwaga i otyłość stają się bardzo poważnym problemem na całym świecie. Szczególnie kraje wysoko rozwinięte borykają się z tym faktem. Ilość osób cierpiących na te choroby rośnie w niezwykle dużym tempie [1]. Walka z ową pandemią jest bardzo ważną kwestią dla zdrowia publicznego na całym świecie, ponieważ zarówno nadwaga jak i otyłość są istotnymi czynnikami w rozwoju chorób układu krążenia, cukrzycy, chorób układu oddechowego takich jak: bezdech senny, astma oskrzelowa, przewlekła obturacyjna choroba płuc; ponadto są przyczyną przedwczesnej śmierci [2]. Nadwaga i otyłość mają wpływ na rozwój nowotworów, badania wykazują, że ryzyko zachorowania u osób o nadmiernej masie ciała jest o 52% wyższe u mężczyzn i o 62% wyższe u kobiet. Nadwaga i otyłość wpływają między innymi na ekspansję raka przełyku, odbytnicy, trzustki, nerek, wątroby oraz na nasilenie wzrostu chłoniaków [3]. WHO informuje, że współczynnik śmiertelności rośnie wraz ze wzrostem BMI (ang. Body Mass Index). Prace na profilaktyką i leczeniem są często utrudnione z powodu problemów z prowadzeniem regularnych statystyk we wszystkich częściach świata. Jak wynika z raportów Światowej Organizacji Zdrowia na rok 2014, aż 1,9 mld dorosłych osób ma nadwagę a 600 mln jest otyłe. Sytuacja wygląda niepokojąco również wśród dzieci, we Francji w przeciągu 20 lat ilość otyłych dzieci wzrosła aż trzykrotnie: z 5% do 16% [4]. W Polsce odsetek ludzi z nadmierną masą ciała jest duży i ma tendencję wzrostową. Biorąc pod uwagę szacowane tempo wzrostu zachorowań, ilość dorosłych osób otyłych na dzień dzisiejszy może stanowić aż 23,7% kobiet oraz 23,3% mężczyzn [5]. Co zaskakujące, statystyki podają, że większość światowej populacji żyje w krajach, gdzie nadwaga i otyłość zabijają więcej ludzi niż niedowaga. Zważywszy na prognozy, ilość osób umierających z powodu chorób serca, dysfunkcji 1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze i Klinice Pneumonologii, wydział Lekarski, Śląski Uniwersytet Medyczny, www.sum.edu.pl 2 [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze i Klinice Pneumonologii, wydział Lekarski, Śląski Uniwersytet Medyczny, www.sum.edu.pl 28 Wpływ otyłości na rozwój chorób układu oddechowego u kobiet i mężczyzn po 40 roku życia, chorych leczonych w CSK w Katowicach. układu oddechowego oraz nowotworów będzie rosła w zastraszającym tempie, w związku z tym walka z otyłością i nadwagą, które są bez wątpienia czynnikami predysponującymi, staje się kluczowym zadaniem dla promocji zdrowia [6]. W poniższej pracy skupiliśmy się przede wszystkim na zależnościach występujących między BMI a bezdechem sennym oraz astmą oskrzelową. Zespół bezdechu śródsennego (ang. Sleep Apnoea Syndrome – SAS) jest chorobą występującą w zależności od czynników ryzyka u 3-7% dorosłych mężczyzn oraz u 2-5% dorosłych kobiet w całej populacji [7]. Bezdech senny jest stosunkowo słabo znaną chorobą, stąd liczba osób chorych jest znacznie większa niż liczba osób zdiagnozowanych. Wyeliminowanie czynników ryzyka znacząco zmniejsza zapadalność na tę chorobę. [8]. Znacznie lepiej poznaną i diagnozowaną chorobą jest astma oskrzelowa. Dane epidemiologiczne informują, że ilość osób chorych na świecie wzrasta z roku na rok. W 2001 roku w Stanach Zjednoczonych było to około 7%, w 2008 roku 8,2% natomiast w 2009 aż 12,3%. Częściej chorują kobiety oraz osoby z biedniejszych regionów świata. Ograniczenia finansowe mają wpływ na dostęp chorych do opieki medycznej oraz leków, co wiąże się z gorszym rozpoznaniem i słabszym leczeniem [9]. Celem naszej pracy było sprawdzenie czy istnieje związek między BMI a chorobami układu oddechowego. Następnie oceniliśmy stopień korelacji między wyżej wymienionymi aspektami. Oprócz tego, staraliśmy się określić różnice występujące między chorymi kobietami i mężczyznami, biorąc pod uwagę ich stosunek masy ciała do wzrostu. 2. Materiały i metody Prowadzone przez nas badania możemy zakwalifikować jako badania typu kliniczno-kontrolnego. Przeprowadziliśmy je w Centralnym Szpitalu Klinicznym Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach na Oddziale Pneumonologii. Zbieranie danych trwało cztery miesiące, od 02.11.2014 r. do 01.03.2015 r. Łącznie zebraliśmy wywiad od 111 hospitalizowanych osób powyżej 40 roku życia, w tym 37 z astmą oskrzelową i 35 z bezdechem sennym. Grupę kontrolną natomiast stanowiło 140 niepalących osób powyżej 40 roku życia, które nigdy nie były leczone oraz hospitalizowane z powodu chorób płuc. Badania te zostały przeprowadzone wśród: członków Klubu Seniora SzopieniceGiszowiec w Katowicach, pracowników SPA Hotelu Klimczok w Szczyrku, pracowników oddziału banku ING w Bielsku Białej, pracowników firmy Moto Katowice, osób uczestniczących w zajęciach prowadzonych przez Uniwersytet Ekonomiczny Trzeciego Wieku w Katowicach oraz wśród przypadkowych osób mieszkających na terenie 29 Anna Knapik, Marcin Michalik Katowic. Najważniejszą informację stanowiło dla nas rozpoznanie choroby, oprócz tego posłużyliśmy się danymi na temat wzrostu i wagi ciała. Użyliśmy ich w celu obliczenia dla każdej osoby BMI. Wszystkie dane zostały zebrane w programie Microsoft Exel 2007 i opracowane w programie Statistica 12.0. Korelacja została wykonana metodą Rang Spearmana. Mamy świadomość, że metoda budzi wiele kontrowersji, jednakże była jedyną możliwą do zastosowania przy tego typu zmiennych. 3. Analiza wyników Analiza statystyczna w naszej pracy została przeprowadzona dla grupy 109 mężczyzn oraz 133 kobiet. W przypadku mężczyzn grupę kontrolną stanowiły 63 zdrowe, niepalącę oraz nigdy nie hospitalizowane z powodu chorób układu oddechowego osoby, po 40 roku życia. Grupa badawcza obejmowała 35 mężczyzn z bezdechem sennym oraz 11 z astmą oskrzelową. Na podstawie zebranego wywiadu został obliczony wskaźnik masy ciała. BMI = masa/(wzrost) ² (1) gdzie: BMI (ang. Body Mass Index) – wskaźnik masy ciała Wyniki pozwoliły zaklasyfikować mężczyzn do odpowiednich grup skali poszerzonej: <16,0 – wygłodzenie; 16.0-16,99 – wychudzenie; 17,0-18,49 – niedowaga; 18,5-24,99 – wartość prawidłowa; 25,0-29,99 – nadwaga; 30,0-34,99 – I stopień otyłości; 35,0-39,99 – II stopień otyłości (otyłość kliniczna); ≥40,0 – III stopień otyłości (otyłość skrajna). W Tabeli 1. zestawiliśmy dane obrazujące częstość występowania chorób w poszczególnych grupach skali poszerzonej BMI. Wśród wszystkich przebadanych mężczyzn zdecydowana większość cierpi na nadwagę (41 osób), u 23 BMI osiąga wartości prawidłowe, natomiast 30 boryka się z otyłością I, II i III stopnia. W grupie mężczyzn chorych na astmę oskrzelową średnia wartość BMI wyniosła 25,11 natomiast w grupie z bezdechem sennym aż 30,68. 30 Wpływ otyłości na rozwój chorób układu oddechowego u kobiet i mężczyzn po 40 roku życia, chorych leczonych w CSK w Katowicach. Tabela 1. Częstość występowania bezdechu sennego i astmy oskrzelowej w grupach mężczyzn zależnie od wartości BMI Ilość pacjentów 0 0 0 28 49 27 3 2 Zakres BMI Klasyfikacja Brak choroby Wygłodzenie Wychudzenie Niedowaga Wartość prawidłowa 25,0-29,99 Nadwaga 30,0-34,99 I stopień otyłości 35,0-39,99 II stopień otyłości ≥40,0 III stopień otyłości Ilość przypadków <16,0 16,0-16,99 17,0-18,49 18,5-24,99 Bezdech senny 0 0 0 11 Astma oskrzelowa 0 0 0 8 30 9 1 2 10 14 3 0 0 0 0 2 53 11 30 0 0 0 4 Źródło: opracowanie własne Tabela 2. Częstość występowania bezdechu sennego i astmy oskrzelowej w grupach kobiet zależnie od wartości BMI Ilość pacjentów 0 1 2 85 37 5 3 0 Zakres BMI Klasyfikacja Brak choroby Wygłodzenie Wychudzenie Niedowaga Wartość prawidłowa 25,0-29,99 Nadwaga 30,0-34,99 I stopień otyłości 35,0-39,99 II stopień otyłości ≥40,0 III stopień otyłości Ilość przypadków <16,0 16,0-16,99 17,0-18,49 18,5-24,99 Bezdech senny 0 0 2 54 Astma oskrzelowa 0 1 0 20 26 4 5 0 1 1 1 0 2 0 0 0 87 26 5 0 0 0 1 Źródło: opracowanie własne Równolegle z analizą grupy mężczyzn analizowaliśmy grupę 133 kobiet, spośród których 97 było zdrowe, niepalące i podobnie jak w grupie kontrolnej mężczyzn, były to kobiety nigdy nie hospitalizowane z powodu chorób układu oddechowego. Grupę badawczą stanowiło 26 kobiet 31 Anna Knapik, Marcin Michalik z rozpoznaniem astmy oskrzelowej oraz 5 kobiet z bezdechem sennym. W Tabeli 2. zostały zaprezentowane wyniki naszej analizy: w przypadku kobiet odsetek z nieprawidłową wagą okazał się zdecydowanie mniejszy, 55% osób miało prawidłową wartość BMI, 27% cierpiało na nadwagę, 7% borykało się z otyłością, a 2% miało zbyt niski wskaźnik masy ciała. Średnia wartość BMI w grupie kobiet chorych na astmę oskrzelową wyniosła 22,00 natomiast w grupie z bezdechem sennym aż 31.71. Następnie zmierzyliśmy stopień związku między uporządkowanymi danymi jakościowymi i ilościowymi. Najważniejszą kwestią było obliczenie korelacji między BMI a wystąpięniem jednostek chorobowych: astmy oskrzelowej i bezdechu sennego. Zarówno w grupie kobiet i mężczyzn bezdech korelował dodatnio ze wzrostem BMI, natomiast astma ujemnie. Oznacza to, że wraz ze wzrostem wskaźnika masy ciała do pewnego momentu wzrastał odsetek osób chorych na bezdech senny. Stopień korelacji u mężczyzn był wyższy niż w przypadku kobiet. Natomiast w przypadku astmy było odwrotnie, ze wzrostem BMI zmniejszała się liczba osób chorych. Korelacje w grupach kobiet i mężczyzn oraz w przypadku obu chorób były obliczane przy 95% przedziale ufności mieszczącym się w <1,9-17,23> i okazały się korelacjami słabymi (współczynnik korelacji znajdował się w przedziale <0,1-0,3>). W przypadku bezdechu sennego iloraz szans (OR-odds ratio) wykazał, że osoby cierpiące na nadwagę i otyłość mają aż pięciokrotnie wyższą szanse na zapadnięcie na tę chorobę niż osoby z prawidłowym wskaźnikiem masy ciała. Obliczając iloraz szans wkorzystaliśmy następujący wzór: 𝑆𝑧𝑎𝑛𝑠𝑎 1 = 𝑃(1) 1−𝑃(1) (1) 𝑆𝑧𝑎𝑛𝑠𝑎 2 = 𝑃(2) 1−𝑃(2) (2) Gdzie: P – prawdopodobieństwo (1) – grupa pierwsza (2) – grupa druga 𝑆𝑧𝑎𝑛𝑠𝑎 (1) 𝑂𝑅 = 𝑆𝑧𝑎𝑛𝑠𝑎 (2) (3) Gdzie: OR – iloraz szans Poniżej zostały przedstawione wykresy obrazujące rozrzut między BMI a jednostkami chorobowymi w grupie mężczyzn (Wykres 1 i 2) oraz w grupie kobiet (Wykres 3 i 4). 32 Wpływ otyłości na rozwój chorób układu oddechowego u kobiet i mężczyzn po 40 roku życia, chorych leczonych w CSK w Katowicach. Wykres 1. Wykres rozrzutu pomiędzy BMI a astmą oskrzelową w grupie mężczyzn. Wszystkie wartości BMI znajdują się w zakresie <18;40> - oznaczone niebieskimi kółkami, wyraźnie widać, że najwięcej wartości dla osób zdrowych znajduje się w przedziale od <23;32>, natomiast dla mężczyzn chorych na astmę w przedziale wartości prawidołowych BMI. Linie przerywane wyznaczają 95% przedział ufności co oznacza, że korelację spełnia 95% wartości. [opracowanie własne] Wykres 2. Wykres rozrzutu pomiędzy BMI a bezdechem sennym w grupie mężczyzn. W grupie kontrolnej wartości BMI najczęściej oscylowały w przedziale <21;32>, natomiast w grupie badanej w przedziale <27;35>. Wyraźnie widać, że jednostka chorobowa koreluje dodatnio z przyrostem BMI [opracowanie własne] 33 Anna Knapik, Marcin Michalik Wykres 3. Wykres rozrzutu między BMI a astmą oskrzelową w grupie kobiet. Zakres wartości BMI zawiera się w przedziale <17; 25>, wśród zdrowych kobiet najczęśniej występują wartości od 19 do 27, natomiast u kobiet chorych na astmę od 20 do 23. W przypadku astmy oskrzelowej korelacja jest słabo ujemna [opracowanie własne] Wykres 4. Wykres rozrzutu między BMI a bezdechem sennym w grupie kobiet. Wśród kobiet zdrowych wartości BMI występują w przedziale <18;30>, u kobiet chorych <22;38>. Zależność jest dodatnia, niewątpliwie bezdech senny koreluje dodatnio z wzrostem BMI [opracowanie własne] 34 Wpływ otyłości na rozwój chorób układu oddechowego u kobiet i mężczyzn po 40 roku życia, chorych leczonych w CSK w Katowicach. 4. Dyskusja Zarówno bezdech senny jak i astma oskrzelowa są bardzo poważnymi chorobami, które niosą wiele powikłań i znacząco obniżają jakość życia chorych osób. Światowa Inicjatywa Zwalczania Astmy (ang. Global Initiative for Asthma – GINA) definiuje ją jako przewlekłe zapalenie dróg oddechowych, w czasie którego istotną rolę odgrywa wiele rodzajów komórek oraz ich elementów. Jest związane z nadreaktywnością dróg oddechowych, które może prowadzić do ponawiającego się świszczącego oddechu, problemów ze złapaniem oddechu, uciskiem klatki piersiowej oraz kaszlem zwłaszcza w nocy lub rano. Rozwój choroby jest wynikiem współdziałania złożonych i nie w pełni zrozumiałych interakcji czynników. Mają one wpływ na przebieg astmy oskrzelowej oraz na jej leczenie [10]. Etiologia choroby niewątpliwie obejmuje czynniki środowiskowe, behawioralne oraz genetyczne. Do dwóch pierwszych należy zaliczyć palenie tytoniu, zanieczyszczenia powietrza, ekspozycję na alergeny w zamkniętych pomieszczeniach oraz infekcje [11]. Pojawianie się astmy oskrzelowej w rodzinie jest genetycznym czynnikiem ryzyka. Do końca 2005 roku z chorobą było kojarzone aż 25 genów zarówno związanych z układem odpornościowym oraz tych odpowiedzialnych za modulowanie reakcji zapalnej [12]. Astma oskrzelowa znacznie częściej rozwija się u osób cierpiących na atopowe zapalenie skóry i katar sienny, a badania dowodzą również że czynnikiem predysponującym jest otyłość. Prawdopodobnie wiążę się to zarówno z faktem, że odkładanie tkanki tłuszczowej osłabia wydolność oddechową oraz z tym, że adipocyty odgrywają rolę w aktywności prozapalnej [13]. W naszym badaniu nie została wykazana dodatnia korelacja BMI z występowaniem astmy oskrzelowej. Przyczyną tego może być zbyt mała ilość osób w grupie badanej i zbyt duża rozpiętość wieku. Zupełnie inaczej przedstawiają się wyniki dotyczące bezdechu sennego, zostaną wobec tego omówione szerzej. Zespół bezdechu śródsennego (ang. Sleep Apnoea Syndrome - SAS) charakteryzuje się bezdechami w czasie snu. Za taki epizod uważa się ustanie wentylacji płuc przez okres dłuższy niż 10 sekund lub spłycenie oddechu poniżej 50%. Jest to zespół chorobowy poważnie zagrażający życiu. Występują trzy postacie bezdechu sennego, najczęściej spotykana to postać zaporowa inaczej nazywana obturacyjną. Mechanizm powstawania charakteryzuje się zaburzeniem przepływu powietrza przez górne drogi oddechowe. Drugą postacią jest ośrodkowa, której mechanizm nie jest do końca jasny i polega na zaburzeniach napędu oddechowego, które pochodzą z ośrodka oddechowego. Współistnienie powyższych postaci jest przyczyną powstawania typu mieszanego [14]. Objawy bezdechu sennego są uciążliwe i znacząco 35 Anna Knapik, Marcin Michalik wpływają nie tylko na sen ale i na samopoczucie w ciągu dnia. Do objawów nocnych oprócz epizodów ustania lub spłycenia wentylacji płuc, zaliczane jest głośne, nieregularne chrapanie, nadmierna potliwość, potrzeba oddawania moczu w trakcie nocy, niespokojny, przerywany sen, wybudzenia charakteryzujące się uczuciem braku powietrza, przyśpieszonym oddechem lub tętnem, oraz problemy z zaśnieciem z powodu napadów lęku. Również objawy dzienne są przykre i utrudniają normalne funkcjonowanie. Chory po przebudzeniu często odczuwa bóle głowy, czuje się niewypoczęty, senny i rozdrażniony. Oprócz tego ma duże problemy z pamięcią i koncentracją, a w przypadku mężczyzn także z potencją. Oczywiste jest, że konieczne dla utrzymania drożności dróg oddechowych są prawidłowa budowa struktur anatomicznych oraz mechanizmy nerwowo-mięśniowe. Przyczynami rozwoju choroby są bezwątpienia dysfukncje dróg układu oddechowego takie jak opadające, wydłużone podniebienie miękkie i języczek, wąskie drogi oddechowe, krótka szyja, cofnięta żuchwa, przerośnięte migdałki podniebienne i gardłowy, skrzywiona przegroda nosa oraz obecność polipów lub przerośniętych małżowin nosowych [15]. W patogenezie bezdechu sennego bierze udział również otyłość, która może wpływać na chorobę w dwojaki sposób. Jak wynika z naszych badań, wzrost BMI ma znaczenie w rozwoju bezdechu sennego. Przede wszystkim osoba z nadmierną masą ciała jest mniej wydolna oddechowo, objętość płuc jest zdecydowanie mniejsza, w szczególności czynnościowa pojemność zalegająca. Z tego powodu tchawica ma zmniejszoną przyczepność i następuje destabilizacja dróg oddechowych [15]. Nadwaga i otyłość wpływają również na obwód szyi, który w przypadku nieprawidłowego BMI jest większy niż u osob o prawidłowej masie ciała. Jest on przyczyną zwężenia górnych dróg oddechowych, powoduje ich zapadanie się i zmniejsza światło przepływu powietrza. Tkanka tłuszczowa odkładająca się w nadmiarze w okolicy okołogardłowej nie tylko wpływa mechanicznie na rozwój bezdechu sennego, ale również jest miejscem syntezy białek sygnalizacyjnych mających wpływ na kontrolę nerwową oddychania. Niestety nie wszystkie mechanizmy zostały dokładnie poznane. Faktem jest, że tkanka tłuszczowa wpływa bezpośrednio na powstawanie stanów zapalnych, więc jest obfitym źródłem mediatorów prozapalnych: TNF-α, TGF-β, Il-1β, Il-6, Il-8. Substancje te oraz komórki układu immunologicznego mają wpływ na mięśnie oddechowe, co może być przyczyną rozwoju choroby [16]. 36 Wpływ otyłości na rozwój chorób układu oddechowego u kobiet i mężczyzn po 40 roku życia, chorych leczonych w CSK w Katowicach. 5. Wnioski Etiologia omówionych chorób płuc jest bardzo złożona. Czynniki ryzyka rozwoju zespołu bezdechu sennego obejmują nie tylko dysfunkcje mechaniczne dróg układu oddechowego ale również nadwagę i otyłość. Nadmierna masa ciała przyczynia się niewątpliwie do rozwoju choroby oraz powoduje nasilenie jej objawów. Nasza praca wykazała związek między BMI<25 a rozwojem bezdechu sennego, jedak nie stwierdziliśmy powiązania z astmą oddechową. Obie choroby są bardzo poważnymi zaburzeniami układu oddechowego a ilość ludzi na nie cierpiąca wciąż wzrasta. Nadwaga i otyłość stają się problemem na skale światową. Są czynnikami predysponującymi do rozwoju niezliczonej ilości chorób, których rokowania poprawiają się po obniżeniu masy ciała. W naszej pracy potwierdziliśmy hipotezę mówiącą o związku nadwagii i otyłości z chorobami układu oddechowego, wobec tego, zapobieganie im i leczenie powinny być kluczowymi zadaniami promocji zdrowia. Literatura 1. 2. 3. Abelson P., Kennedy D., The obesity epidemic, Science, 304 (2004), s. 1413 Haslam D., James P. Obesity, Lancet., 366 (2005), s. 1197-1209 Eugenia E., Rodriguez C., Walker-Thurmond K., Overweight, Obesity, and Mortality from Cancer in a Prospectively Studied Cohort of U.S. Adults, The New England Journal of Medicine, 348 (2003), s. 1625-1638 4. http://www.who.int/bulletin/volumes/91/8/13-020813/en/ 5. Krzysztoszek J., Wierzejska E., Zielińska A., Obesity,Arch Med Sci, 1 (2015), s. 24-33 6. Christopher J., Murray L., Lopez D., Alternative projections of mortality and disability by cause 1990–2020: Global Burden of Disease Study, Lancet, 349 (1997), s.1489-1504 7. Punjabi N., The Epidemiology of Adult Obstructive Sleep Apnea, Proceedings of the American Thoracic Society, 5 (2008), s. 136-143 8. Young T., Peppard P., Gottlieb D., Epidemiology of Obstructive Sleep Apnea, American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 165 (2002), s. 1217-1239 9. Onofrey S., Church D., Kludt P., Asthma Prevalence, Disease Characteristics, and Self- Management Education – United states 2001-2009, Weekly, 60 (2011), s. 547-555 10. Martinez F. D., Genes, environments, development and asthma: a reappraisal, Eur Respir J, 29 (2007), s. 179-84 11. Wright R., Gold D.R., Population disparities in asthma, Annu Rev Public Health, 26 (2005), s. 89-113 12. Ober C., Hoffjan S., Asthma genetics 2006: the long and winding road to gene discovery, Genes Immun, 7(2006), s. 95-100 37 Anna Knapik, Marcin Michalik 13. Wood L., Gibson P., Dietary factors lead to innate immune activation in asthma, Pharmacol. Ther, 123 (2009), s. 37-53 14. White D., Pathogenesis of Obstructive and Central Sleep Apnea, Amercican Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 172 (2005), s. 1363-1370 15. Susheel P., Schneider H., Schwartz R., Adult Obstructive Sleep Apnea, Chest Journal, 132 (2007), s. 325-337 16. Schwartz R., Patil P., Laffan M., Obesity and Obstructive Sleep Apnea, Proceedings of the American Thoracic Society, 5 (2008), s. 185-192 Wpływ otyłości na rozwój chorób układu oddechowego u kobiet i mężczyzn po 40 roku życia, chorych leczonych w CSK w Katowicach Streszczenie Wstęp Otyłość jest uważana za pandemię XXI w. Badania epidemiologiczne informują że, ilość osób cierpiących na tę chorobę na świecie wciąż wzrasta. W Polsce około 18% społeczeństwa jest otyłe a 35% ma nadwagę (dane Głównego Urzędu Statystycznego z 2009 r.), a co za tym idzie narażone na wiele dolegliwości w tym choroby układu oddechowego. Stosunek masy ciała do wzrostu ma wpływ między innymi na bezdech senny, czyli chorobę spowodowaną powtarzającymi się wielokrotnie w czasie snu epizodami zatrzymania oddychania lub jego znacznego spłycenia. Ocenia się, że klinicznie istotny bezdech senny występuje u około 4-10% dorosłych mężczyzn i 2-4% kobiet. Celem naszej pracy była ocena korelacji między BMI (body mass index- wskaźnik masy ciała) osób badanych a zachorowalnością na choroby układu oddechowego, takie jak bezdech senny oraz astma oskrzelowa. Metody Badania kliniczno - kontrolne zostały przeprowadzone w Centralnym Szpitalu Klinicznym w Katowicach w okresie od 02.11.2014 r. do 01.03.2015 r. wśród 111 osób z chorobami układu oddechowego w tym 37 z astmą oskrzelową i 35 z bezdechem sennym. Grupa kontrolna obejmowała 140 zdrowych osób po 40 roku życia. Oprócz rozpoznania choroby, posłużyliśmy się wzrostem oraz wagą, dzięki którym zostało wyliczone BMI. Dane pacjentów zostały zebrane w Microsoft Exel i opracowane w programie Statistica. Wyniki W swoich badaniach wykazaliśmy dodatnią korelacje wzrostu BMI do częstości występowania bezdechu, przy czym u kobiet stopień korelacji jest niższy niż u mężczyzn. Wśród przebadanych osób cierpiących na bezdech senny aż 82% ma znacznie podwyższoną masę ciała, odbiegającą od prawidłowej, w tym 31% to nadwaga a 51% to otyłość. Iloraz szans czyli OR (odds radio) informuje nas o tym, że bezdech senny u osób otyłych pojawi się aż pięć razy częściej niż u osób o normalnej wadze. W przypadku astmy korelacja jest ujemna co oznacza że, więcej zachorowań występuje w grupie o niższym BMI. Tylko 14% z przebadanych osób ma nadwagę a 3% jest otyłe, można więc przypuszczać, że stosunek masy ciała do wzrostu u osób z astmą oskrzelową ma nikły związek z rozwojem choroby. Słowa kluczowe: bezdech senny, astma oskrzelowa, otyłość, nadwaga 38 Marcin Michalik1, Anna Knapik2 Porównanie częstości oddechów u osób zdrowych oraz chorych, leczonych z powodu zaostrzenia POChP na oddziale Pneumonologii w CSK 1. Wstęp i cel pracy Dane epidemiologiczne WHO dotyczące przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) dotyczą w głównej mierze krajów wysoko rozwiniętych, przez co są one w znacznym stopniu niedoszacowane i zaniżone. Według tych danych POChP stanowiła piątą przyczynę zgonów na całym świecie w 2002 roku. Jednocześnie Światowa Organizacja Zdrowia alarmuje, że zarówno zapadalność na tą chorobę oraz umieralność z jej powodu będzie rosnąć aby w 2030 roku stanowić samodzielnie trzecią przyczynę zgonów na świecie, tym samym doganiając udary mózgu [1]. Szacuje się, że w 2010 roku, globalnie, z powodu przewlekłej obturacyjnej choroby płuc cierpiało około 329 milinów osób, co stanowi 4,8% światowej populacji [2]. W Polsce sytuacja jest zdecydowanie gorsza. Podczas badań przeprowadzonych w Zabrzu, na grupie 559 osób, w wieku – 19-69 lat, POChP zdiagnozowano u 10.1% [3]. Z kolei badania przeprowadzone w Warszawie, na grupie 676 mieszkańców, w wieku 42-71 lat, wykazały 10,2% chorobowość [4]. Na podstawie tych badań możemy założyć, że w całej Polsce, w grupie wiekowej 19-71 lat, z powodu POChP cierpi około 10% osób co odpowiada około 2 milionom obywateli. Procent ten jest nieporównywalnie wyższy niż w krajach Europy zachodniej, ponadto, ogromny problem stanowi niska rozpoznawalność tego schorzenia. Fakt ten wiąże się z niespecyficznymi wczesnymi objawami choroby, które często są lekceważone. Jednym z takich objawów jest patologicznie przyspieszony oddech, czyli tachypnoe, którym zajmowaliśmy się w naszych badaniach. Celem naszej pracy było określenie, w jak sposób zaostrzenie przebiegu przewlekłej obturacyjnej choroby płuc wpływa na częstość oddechów pacjenta, określenie ilorazu szans (OR), który informuje nas o tym ile większe jest ryzyko wystąpienia tachypnoe wśród osób chorych na POChP, 1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze i Klinice Pneumonologii, wydział Lekarski, Śląski Uniwersytet Medyczny, www.sum.edu.pl 2 [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze i Klinice Pneumonologii, wydział Lekarski, Śląski Uniwersytet Medyczny, www.sum.edu.pl 39 Marcin Michalik, Anna Knapik w porównaniu do osób zdrowych. Ponadto, określenie jak częstość oddechów kształtuje się w różnych grupach wiekowych wśród zdrowych oraz chorych kobiet i mężczyzn. 2. Materiały i metody Przeprowadzona przez nas analiza jest badaniem kliniczno-kontrolnym. Grupę kontrolną stanowiło 160 osób niepalących, w wieku 16-89 lat, które nie są oraz nie były nigdy hospitalizowane z powodu chorób układu oddechowego. Badania były przeprowadzone wśród: członków Klubu Seniora Szopienice-Giszowiec w Katowicach, pracowników SPA Hotelu Klimczok w Szczyrku, pracowników oddziału banku ING w Bielsku Białej, pracowników firmy Moto Katowice, osób uczestniczących w zajęciach prowadzonych przez Uniwersytet Ekonomiczny Trzeciego Wieku w Katowicach oraz wśród przypadkowych mieszkańców Katowic. Grupę badawczą stanowiło 56 osób chorych, w wieku 34-85 lat, leczonych z powodu zaostrzenia POChP na oddziale Pneumonologii w Centralnym Szpitalu Klinicznym w Katowicach. Minutowy pomiar oddechu był wykonywany dwoma metodami. Metodą subiektywną, bazującą na obserwacji ruchów klatki piersiowej osoby badanej oraz metodą obiektywną przy użyciu skonstruowanego przez nas urządzenia (rys. 1), podłączonego do laptopa. Urządzenie to jest lekkie, przenośne i umożliwia dokonanie pomiaru bez odrywania pacjenta od jego zajęć. Rejestrowany dźwięk wydychanego powietrza, przy próbkowaniu 44100Hz, był zapisywany graficznie przy użyciu darmowego programu komputerowego Audacity w wersji 2.0.6. Następnie dokonywaliśmy liczenia tych elementów widma dźwięku, które odpowiadają za fazę wydechu (Rys. 1). Statystyczną analizę danych przeprowadzono przy użyciu programu Statistica 12.0. Podczas dokonywania pomiarów w szpitalu zaobserwowano, pewną zależność. Im pomiar obiektywny, za pomocą skonstruowanego przez nas urządzenia był wyższy tym, większe były różnice pomiędzy nim a pomiarem subiektywnym, czyli minutową obserwacją ruchu klatki piersiowej pacjenta. Jednak po analizie ustaliśmy że różnice te są na poziomie około 1.5% co oznacza, że jest to nieznacząca różnica na poziomie błędu statystycznego. Przy analizie wyników i przedstawianiu ich w sposób graficzny na wykresach wzięliśmy pod uwagę pomiar obiektywny, gdyż już podczas przeprowadzania badań zauważyliśmy rozbieżności w wynikach, o których szerzej wspomnimy w dalszej części publikacji. 40 Porównanie częstości oddechów u osób zdrowych oraz chorych, leczonych z powodu zaostrzenia POChP na oddziale Pneumonologii w CSK Rys. 1. Na lewym obrazku urządzenie służące do pomiaru obiektywnego. A – mikrofon MEDIATECH Clip Microphone Pro. B – elastyczny drut, umożliwiający ustawienie mikrofonu pod nosem pacjenta. Na prawym obrazku, zapis widma dźwięku wydychanego powietrza osoby zdrowej w programie Audacity. C – zwiększenie amplitudy natężenia dźwięku, odpowiadające fazie wydechu. [opracowanie własne] 3. Wyniki W celu porównania liczby oddechów u ludzi zdrowych oraz cierpiących z powodu POChP i sprawdzenia czy u tych drugich występuje tachypnoe, stworzyliśmy przedziały wiekowe: <30 lat, 31-40 lat, 41-50 lat, 51-60 lat, 61-70 lat oraz >70 lat, dla których wyliczyliśmy: minimalną, maksymalną oraz średnią ilość oddechów. Wśród zdrowych mężczyzn oraz kobiet średnia oraz maksymalna ilość oddechów na minutę rosła wraz z wiekiem (Rys. 2). Rys. 2. Porównanie częstości oddechów wśród kobiet i mężczyzn zdrowych Niestety, w czasie, w którym prowadzono badania w Centralnym Szpitalu Klinicznym w Katowicach nie przebywał żaden pacjent cierpiący z powodu przewlekłej obturacyjnej choroby płuc, w wieku poniżej 30 lat. Jest to jednak zrozumiałe zjawisko ze względu na fakt, iż szczyt zapadalności na POChP przypada na okres 40-50 lat. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, iż średnia ilość oddechów, zarówno 41 Marcin Michalik, Anna Knapik u chorych kobiet jak i mężczyzn jest bardzo zbliżona w poszczególnych grupach wiekowych (Rys. 3). Możemy jedynie zauważyć, że wartości minimalne są niższe u kobiet ale także wartości maksymalne są wyższe niż u mężczyzn. Rys. 3. Częstość oddechów u osób cierpiących z powodu POChP Porównując częstotliwości oddechów u osób zdrowych i chorych stwierdzono, że wszystkie trzy funkcje: min, max oraz średnia są wyższe w każdej grupie wiekowej wśród kobiet chorych (Rys. 4). Przyjęta przez nas średnia prawidłowa ilość oddechów na poziomie 18/min została przekroczona w każdej z grup wiekowych, tak więc możemy mówić o występującym tachypnoe. (Rys. 4). Porównanie częstotliwości oddechów wśród kobiet cierpiących z powodu POChP oraz zdrowych Sytuacja wśród mężczyzn była identyczna (Rys. 5). We wszystkich grupach wiekowych sprawdzane przez nas parametr były wyższe niż 42 Porównanie częstości oddechów u osób zdrowych oraz chorych, leczonych z powodu zaostrzenia POChP na oddziale Pneumonologii w CSK w próbie kontrolnej. Również średni pomiar w każdej z grup jest większy od 18 oddechów/min, przez co możemy mówić o wystąpieniu tachypnoe. Rys. 5. Porównanie częstotliwości oddechów wśród chorych i zdrowych mężczyzn. Kolejnym etapem analizy danych było wyliczenie ilorazu szans (OR), który jest wskaźnikiem informującym nas o tym ile razy większe jest prawdopodobieństwo wystąpienia danego zjawiska w jednej grupie w porównaniu z drugą grupą. Ryzyko wystąpienia tachypnoe u osób chorych na POChP w porównaniu do osób zdrowych obliczono korzystając ze wzorów na iloraz szans: 𝑆𝑧𝑎𝑛𝑠𝑎 1 = 𝐴 𝐵 (1) 𝑆𝑧𝑎𝑛𝑠𝑎 2 = 𝐶 𝐷 (2) Gdzie: A – liczba chorych z tachypnoe, B – liczba chorych bez tachypnoe, C – liczba zdrowych z tachypnoe, D – liczba zdrowych bez tachypnoe 𝑂𝑅 = 𝑆𝑧𝑎𝑛𝑠𝑎 (1) 𝑆𝑧𝑎𝑛𝑠𝑎 (2) (3) Gdzie: OR – iloraz szans Obliczono, że ryzyko wystąpienia tachypnoe wśród pacjentów z POChP jest 28,6 razy większe, przy 95% przedziale ufności mieszczącym się w <9,8 – 83,42>. W celu wyliczenia 95% przedziału ufności wykorzystano wzory: 𝑆𝐸 ln 𝑂𝑅 = 1 𝐴 1 1 1 +𝐵+𝐶+𝐷 (4) Gdzie: SE – odchylenie standardowe 43 Marcin Michalik, Anna Knapik 95%𝐶𝐼 = exp 𝑙𝑛 𝑂𝑅 − 1.96 × 𝑆𝐸 𝑙𝑛 𝑂𝑅 (5) 𝑑𝑜 exp 𝑙𝑛 𝑂𝑅 + 1.96 × 𝑆𝐸 𝑙𝑛 𝑂𝑅 Gdzie: 95%CI – przedział ufności Ten wynik jest zdecydowanie niezadawalający, podejrzewamy, że może to być spowodowane zbyt małą grupą badawczą. 4. Dyskusja W celu podkreślenia znaczenia problemu, uświadamiania oraz mając w planach walkę z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc w 1998 roku powstał Światowy Ruch na rzecz Rozpoznawania, Leczenia i Prewencji Przewlekłej Obturacyjnej Choroby Płuc (GOLD) [5]. Już w 2001 roku stworzony został pierwszy raport, w którym między innymi została zawarta klasyfikacja stadiów zaawansowania choroby w zależności od obserwowalnych zmian w badaniu spirometrometrycznym. Przedstawiono 4 stadia zaawansowania choroby: I – umiarkowane zwężenie dróg oddechowych z możliwym wystąpieniem kaszlu i odpluwaniem plwociny, w tym stadium chorzy nie są świadomi swojej choroby.; II – następuje dalsze pogarszanie przepływu powietrza, pojawiają się duszności, szczególnie po wysiłku. W tym stadium pacjenci zazwyczaj szukają porady lekarza; III – znaczące pogorszenie zdolności do wytrzymywania wysiłku, chory szybko się męczy, dotychczasowe objawy pogłębiają się. Następuje znaczący spadek jakości życia; IV – dochodzi do niewydolności oddechowej i spadku ciśnienia parcjalnego tlenu w płucach poniżej 60mm Hg lub wzrostu ciśnienia parcjalnego dwutlenku węgla powyżej 45mm Hg. Zmiany te prowadzą do rozwoju serca płucnego czyli niewydolności prawo komorowej. Stan IV jest poważnym zagrożeniem życia pacjenta [6]. W poniższej części naszej pracy chcieliśmy odpowiedzieć na pytanie: dlaczego u osób chorujących na przewlekłą obturacyjną chorobę płuc występuje tachypnoe oraz jakie są implikacje tego zjawiska? Na samym początku warto podkreślić, że choroba ta jest nieuleczalna. Można jedynie próbować spowolnić jej przebieg i tak jak w przypadku większości chorób, wczesne rozpoznanie zwiększa szanse na skuteczne leczenie. Nie jest to jednak proste ze względu na niespecyficzne, często lekceważone objawy, które dodatkowo mogą być różne u kobiet; częstsze duszności oraz kaszel (prawdopodobnie ze względu na mniejszą średnicę dróg oddechowych) i różne u mężczyzn; częstsze odpluwanie plwociny [7]. Ponadto u obu płci z podobną częstotliwością występują słyszalne świsty wydechowe. Bardzo 44 Porównanie częstości oddechów u osób zdrowych oraz chorych, leczonych z powodu zaostrzenia POChP na oddziale Pneumonologii w CSK niespecyficznymi i niezauważalnymi objawami przewlekłej obturacyjnej choroby płuc są niepokój oraz depresja rozpoznawane odpowiednio u 1019% pacjentów [8]. Nie wiadomo dlaczego ryzyko wystąpienia depresji oraz niepokoju wśród pacjentów cierpiących na przewlekłą obturacyjną chorobę płuc jest tak duże. Badanie tego zjawiska jest bardzo trudne ze względu na potrzebę stworzenie badawczego zespołu interdyscyplinarnego składającego się z lekarzy kilku specjalności. Czynnikami ryzyka, które sprzyjają rozwojowi POChP są przede wszystkim palenie tytoniu, narażenie na zanieczyszczenie powietrza – głównie pyły zawieszone, nawracające zapalenia płuc przebyte w dzieciństwie oraz wiek pacjenta [9]. Jednak nie tylko styl życia i narażenie środowiskowe mają wpływ na rozwój przewlekłej obturacyjnej choroby płuc, szuka się również podłoża genetycznego. Postuluje się, że w genie kodującym jedno z białek regulatorowych ścieżki sygnalizacyjnej hedgehog – HHIP (hedgehoginteracting protein), w dwóch miejscach zachodzi tzw. polimorfizm pojedynczych nukleotydów. Zmiana DNA o takim samym charakterze zachodzi w genie kodującym białka, budujące receptory cholinergiczne typu nikotynowego. Zmiany te są uważane za jedne z możliwych mutacji biorących udział w patogenezie POChP [10]. Mocno podkreślany jest związek między genetycznie uwarunkowanym niedoborem α1-antytrypsyny a możliwością rozwoju przewlekłej obturacyjnej choroby płuc. Alfa-1-antytrypsyna (A1AT) jest produkowana w wątrobie a jej efektem działania jest hamowanie elastazy wydzielanej przez neutrofili między innymi w płucach. W przypadku braku takiego hamowania dochodzi do niszczenia prawidłowej tkanki łącznej sprężystej płuc [11]. Ludzie posiadający mutację genu SERPINA1, posiadają zmniejszoną aktywność α1-antytrypsyny o około 60%. W przypadku ludzi niepalących jest to wystarczające aby chronić płuca przed działaniem elastazy, jednak w przypadku palaczy, mechanizm ten staje się niewydolny, co doprowadza do rozkładu mikrofibryliny w płucach [12]. W ostatnich latach popularne stało się doszukiwanie podłoża autoimmunologicznego w różnych chorobach, o których wydawałoby się wiemy prawie wszystko. Nie inaczej jest w przypadku przewlekłej obturacyjnej choroby płuc. Istnieje hipoteza, według której dym tytoniowy indukuje proliferację oraz napływ do płuc limfocytów T CD4+ oraz CD8+. Dodatkowo w tkance limfatycznej oskrzeli u palaczy stwierdzono zwiększoną ilość komórek prezentujących antygeny. Hipoteza ta w pewnym stopniu może wyjaśniać fakt, dlaczego nawet u osób które rzuciły palenie na długo przed zdiagnozowaniem przewlekłej obturacyjnej choroby płuc, takie zaburzenia wystąpiły [13]. W badaniu histopatologicznym płuc chorych stwierdza się rozległą reakcję zapalną. W badaniach biochemicznych przedstawia się to jako wzrost stężenia białka CRP (C Reactive Protein). Stan zapalny charakteryzuje się 45 Marcin Michalik, Anna Knapik napływem do płuc: neutrofili, eozynofili, makrofagów oraz limfocytów, głównie T. Komórki układu odpornościowego wydzielają do środowiska w którym się znajdują mediatory zapalne: TNF-α, TGF-β, Il-1β, Il-6, Il-8. Substancje te oraz bezpośrednie działanie komórek układu immunologicznego prowadzi do rozwoju zmian o charakterze włóknienia, przede wszystkim drobnych drogach oddechowych oraz do rozedmy. Te patomorfologiczne zmiany wpływają na obniżenie sprawności mechanizmu wymiany gazowej, dochodzi do spadku natężonej objętości wydechowej pierwszo sekundowej (FEV1). Ponadto dochodzi do spadku pojemności wdechowej (IC), ze wzrostem czynnościowej powierzchni zalegającej (FRC). Sumarycznie zmiany te powodują znacznie utrudnioną wymianę gazową, przez co częstość oddechów pacjenta zwiększa się, w celu zrekompensowania utraconej powierzchni wymiany gazowej – pojawia się tachypnoe. Zjawisko to jest analogiczne do procesów zachodzących w pracującym sercu: aby utrzymać pojemność minutową przy spadku frakcji wyrzutowej musi dość do zwiększenia częstości uderzeń na minutę. Podczas naszych badań zaobserwowaliśmy różnice w wyglądzie graficznego zapisu widma dźwięku. Osoby cierpiące z powodu chorób układu oddechowego takich jak: bezdech senny, astma oskrzelowa, POChP mają różniące się od siebie widma oraz różnią się one od zapisu osoby zdrowej (Rys. 6). Odchylenia te nie zostały szczegółowo opisane w tej pracy ale są na tyle interesujące, że prawdopodobnie w najbliższym czasie zostaną przez nas poddane dalszej analizie. Rys. 6. A – Widmo oddechów osoby chorej na POChP. B – Widmo osoby zdrowej. C – charakterystyczne przedłużenie fazy wydechu obserwowalne u osób chorych. D – charakterystyczna głośna, intensywna faza wdechu u osób chorych. Dodatkowo widać różnice w częstotliwości oddychania. 5. Wnioski Zapobieganie i leczenie przewlekłej obturacyjnej choroby płuc jest poważnym wyzwaniem dla współczesnej medycyny. Na rozwój POChP wpływa szereg czynników zarówno czynniki środowiskowe, behawioralne 46 Porównanie częstości oddechów u osób zdrowych oraz chorych, leczonych z powodu zaostrzenia POChP na oddziale Pneumonologii w CSK jak i uwarunkowania genetyczne prowadzą do nieodwracalnych zmian w drobnych drogach oddechowych, włóknienia oraz rozedmy. Zmiany te bardzo poważnie upośledzają mechanizm wentylacji, prowadzą do spadku objętości wdechowej płuc. Spadek ten jest rekompensowany poprzez wzrost częstotliwości oddechów. U osób chorych na POChP zaobserwowaliśmy tachypnoe, pojawiło się ono zarówno u kobiet jak i u mężczyzn w każdej z grup wiekowych. Szansa na wystąpienie przyspieszonego oddechu u chorych jest prawie 30 razy większa. Badane przez nas choroby układu oddechowego w tym: astma oskrzelowa, bezdech senny i POChP różnią się charakterystycznym się zapisem graficznym widma dźwięku, co zostanie poddane analizie. W kolejnych pracach również planujemy porównać częstotliwość oddechów w wyżej wymienionych chorobach płuc. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. http://www.who.int/topics/chronic_obstructive_pulmonary_disease/en Vos T., Flaxman A.D., Naghavi M., Lozano R., Michaud C., Ezzati M., Shibuya K., Salomon J.A., Abdalla S., Aboyans V. et al., Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990–2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010, Lancet, 380 (2012), s. 2163-2196 Niepsuj G., Kozielski J., Niepsuj K. i wsp., Przewlekła obturacyjna choroba płuc wśród mieszkańców Zabrza, Wiadomości Lekarskie, 55 (2002), s. 354-359 Pływaczewski R., Bedarek M., Jonczak I., Zieliński J., Częstość występowania POChP wsród mieszkańców prawobrzeżej Warszawy, Polish Pneumonology and Alergology, 71 (2003), s. 329-335 Ekberg-Aronsson M., Pehrsson K., Nilsson J.A., Nilsson P.M., Lofdahl C.G., Mortality in GOLD stages of COPD and its dependence on symptoms of chronic bronchoitis, Respiratory Research, 6 (2005), s. 1465-1474 Rabe K.F., Hurd S., Anzueto A., Barnes P.J., Buist S.A.. Calverley P. et al., Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease, American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 176 (2007), s. 532-555 Watson L., Schouten J.P., Lofdahl C.G., Pride N.B., Laitinen L.A., Postma D.S., Predictors of COPD symptoms: does the sex of the patient matter?, European Respiratory Journal, 28 (2006), s. 311-318 Karajgi B., Rifkin A., Doddi S. et al., The prevalence of ankiety disorders in patients with chronic obstructive pulmonary disease, American Journal Psychiatry, 147 (1990), s. 200-201 Jansen D.F., Schouten J.P., Vonk J.M., et al., Smoking and Airways hyperresponsiveness especially in the presence of blond eosinophilia increase the risk to develop respiratory symptoms: a 25-year follow-up study in the general adult population, American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 160 (1999), s. 259-264 47 Marcin Michalik, Anna Knapik 10. Regan E.A., Hokanson J.E., Murphy J.R., Make B., Lynch D.A., Beaty T.H., Curran-Everett D., Silverman E.K., Crapo J.D., Genetic Epidemiology of COPD (COPDGene) Study Design, National Institutes of Health, 7 (2010), s. 32-43 11. Stoller J.K., Aboussouan L.S., Alpha1-antitripsin deficiency, Lancet, 365 (2005), s. 2225-2236 12. Strange C., Dickson R., Carter C., Carpenter M.J., Holladay B., Lundquist R., Brantly M.L., Genetic Testing for Alpha 1-Antitripsin deficiency, Genetics in Medicine, 6 (2004), s. 204-210 13. Augusti A., MacNee W., Donaldson K., Cosio M., Hypothesis: Does COPD have and autoimmune komponent?, Thorax, 58 (2003), s. 832-834 Porównanie częstości oddechów u osób zdrowych oraz chorych, leczonych z powodu zaostrzenia POChP na oddziale Pneumonologii CSK Streszczenie Celem niniejszej pracy było wykazanie jak zmienia się częstość oddechów u osób z rozpoznanym zaostrzeniem przewlekłej obturacyjnej choroby płuc w porównaniu z osobami zdrowymi oraz określenie ilorazu szans na wystąpienie tachypnoe, czyli patologicznie przyspieszonego oddechu u osób chorych. W celu obiektywizacji pomiaru skonstruowaliśmy urządzenie składające się z mikrofonu przymocowanego na stałe do okularów, umożliwiając tym samym jego łatwe ustawienie bezpośrednio pod nosem pacjenta. Dźwięk wydychanego powietrza rejestrowany był na podłączony do mikrofonu laptopie i prezentowany graficznie przy użyciu programu Audacity. Grupę kontrolą badania stanowiło 160 osób zdrowych, niepalących, nieleczonych z powodu chorób ze strony układu oddechowego. Grupę badawczą stanowiło 56 pacjentów leczonych z powodu zaostrzenia POChP, na oddziale Pneumonologii Centralnego Szpitala Klinicznego w Katowicach. Analizę statystyczna wyników została wykonana w programie Statistica 12.0. Wykazała ona średnią ilość oddechów na minutę u zdrowych mężczyzn na poziomie 17,7/min natomiast u zdrowych kobiet 17,8/min. Na podstawie tych danych została przyjęta wartość 18/min jako prawidłowa częstość oddechów u obu płci. Średnia częstość wentylacji minutowej u osób chorych wyniosła 22,8/minutę, co świadczy o wystąpieniu tachypnoe. Ponadto zauważona została różnica w strukturze widma wydechu osób zdrowych i chorych, jednak nie była ona przedmiotem dalszej analizy. Słowa kluczowe: POChP, tachypnoe, częstość oddechów 48 Agnieszka Szymczyk1, Arkadiusz Macheta2, Monika Podhorecka3 Przewlekła białaczka limfocytowa – diagnostyka i wybrane czynniki prognostyczne 1. Wstęp Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL, chronic lymphocytic leukemia), zaliczana do nowotworów limfoproliferacyjnych, jest najczęściej rozpoznawanym typem białaczki u osób dorosłych. Szacuje się, że w populacji europejskiej zapadalność roczna wynosi około 3,5 zachorowań na 100 tys. mieszkańców i wzrasta z wiekiem. Dwukrotnie częściej chorują mężczyźni. Etiologia choroby co prawda nie jest znana, jednak wiadomo, że zarówno czynniki środowiskowe, jak i zawodowe nie zwiększają ryzyka zachorowania. Wykazano, że około 10% chorych z rozpoznaniem CLL ma w rodzinie chorego z rozpoznaniem nowotworu limfoproliferacyjnego, a choroba w drugim pokoleniu z reguły występuje wcześniej i ma bardziej agresywny przebieg [1]. Pochodzenie komórek białaczkowych nie zostało od końca ustalone – prawdopodobnie wywodzą się one z CD5-dodatnich limfocytów B1 stanowiących większość limfocytów B w życiu płodowym i zarodkowym. Udowodniono, iż u podłoża procesu limfoproliferacyjnego leżą zaburzenia regulacji procesów apoptozy, czego przejawem jest nadekspresja onkogenu bcl2 i nagromadzenie w komórkach biała BCL2. W wyniku tego procesu dochodzi do akumulacji monoklonalnych limfocytów w krwi obwodowej, narządach limfatycznych i szpiku kostnym. Zaburzenia apoptozy wynikają także z zaburzeń w funkcjonowaniu wewnątrzkomórkowych kinaz, które są odpowiedzialne za regulację procesów programowanej śmierci komórki. Udowodniono także, że istotne znaczenie w patogenezie CLL ma stała stymulacja antygenowa receptora BCR (ang. B-Cell Receptor). Anergia po 1 [email protected], Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku, I Wydział Lekarski z Oddziałem Dentystycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, https://www.umlub.pl/ 2 [email protected] , Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku, I Wydział Lekarski z Oddziałem Dentystycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, https://www.umlub.pl/ 3 [email protected], Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku, I Wydział Lekarski z Oddziałem Dentystycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, https://www.umlub.pl/ 49 Agnieszka Szymczyk, Arkadiusz Macheta, Monika Podhorecka stymulacji antygenem prowadzi do upośledzenia odporności typu humoralnego oraz ujawnienia się zjawiska autoagresji [2]. CLL definiuje się jako monoklonalną limfocytozę B-komórkową, trwającą co najmniej 3 miesiące, o wartości powyżej 5K/ul lub bez względu na wysokość limfocytozy w przypadku obecności cytopenii we krwi obwodowej wtórnej do zajęcia szpiku. Klonalność limfocytozy należy potwierdzić cytometrycznie. Komórki CLL charakteryzuje koekspresja antygenów typowych dla limfocytów B (CD19, CD20) oraz słaba ekspresja immunoglobulin powierzchniowych, natomiast nie stwierdza się na powierzchni błony komórkowej ekspresji CD10, CD25, CD103, FMC7 i cykliny D1 [3]. Pomimo postępu w terapii, jaki dokonał się w ciągu ostatnich lat, wyłączając niewielką grupę chorych kwalifikujących się do allogenicznego przeszczepienia krwiotwórczych komórek macierzystych (allo-HSCT, allogenic hematopoietic stem cell transplantation), CLL nadal zaliczana jest do schorzeń nieuleczalnych. Nawet w przypadku pacjentów, u których w wyniku zastosowanego leczenia cytostatycznego uzyskano całkowitą remisję (CR, complete response) z niewykrywalną minimalną chorobą resztkową (MRD, minimal residual disease) dochodzi do nawrotu choroby. Włączenie do schematów chemioterapii przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko antygenowi CD20 przyczyniło się do zwiększenia odsetka całkowitej odpowiedzi na leczenie (ORR, overall response rates), całkowitych remisji, wydłużenia przeżycia wolnego od progresji (PFS, progression-free survival), poprawę jakości życia (QoL, quality of life), a także wydłużenia przeżycia całkowitego (OS, overall survival) w niektórych grupach pacjentów [4]. 2. Diagnostyka Samej diagnozy dokonuje się na podstawie rozmazu krwi obwodowej oraz immunofenotypu komórek nowotworowych. Natomiast pozostałe badania diagnostyczne służą do różnicowania CLL z innymi nowotworami układu chłonnego, ale również do oceny rokowania i monitorowania choroby [3]. Należy mieć na uwadze, aby nie rozpoznać błędnie CLL w przypadku monoklonalnej limfocytozy komórek B, co jest obserwowane u 2-3% zdrowych osób spokrewnionych w pierwszym stopniu z chorymi na CLL i nie kwalifikuje się do rozpoznania białaczki [6]. Kryteria diagnostyczne według National Cancer Institute przedstawiono w tabeli 1. [3]: 50 Przewlekła białaczka limfocytowa – diagnostyka i wybrane czynniki prognostyczne Tab. 1. Kryteria diagnostyczne CLL wg National Cancer Institute [3]: Limfocytoza krwi obwodowej ≥ 5000/μl w ciągu ostatnich 3 miesięcy Limfocyty dojrzałe morfologicznie, wśród nich komórki limfoplazmacytoidalne i prolifmocyty stanowią < 55% Monoklonalna ekspresja łańcuchów lekkich immunoglobulin (kappa lub lambda) 2.1. Najistotniejsze badania przeprowadzane w trakcie diagnostyki w kierunku CLL 2.1.1. morfologia krwi obwodowej W badaniu morfologicznym krwi obwodowej stwierdza się leukocytozę z jednoczesną bezwzględną limfocytozą powyżej 5000/μl [7]. Przewagę liczebną posiadają małe, dojrzałe limfocyty z wąskim rąbkiem cytoplazmy oraz pojedyncze prolimfocyty i formy blastyczne limfocytów z towarzyszącą nierzadko granulocytopenią, trombocytopenią i/lub niedokrwistością [8]. Charakterystyczną cechą obrazu krwi obwodowej są też cienie komórkowe, zwane cieniami Gumprechta, powstałe podczas rozmazywania krwi na szkiełku jako efekt podatności na uszkodzenia białaczkowych limfocytów i ich rozpadu [9]. Przy ocenie rozmazu, należy zwrócić uwagę na odsetek prolimfocytów – na tej podstawie różnicuje się CLL z przewlekłą białaczką prolimfocytową B-komórkową (BP-B). Punktem odcięcia jest poziom 55% prolimfocytów – jeśli odsetek ten nie przekracza 55% diagnozuje się CLL, jeśli jest wyższy to należy traktować to jako BP-B lub jako progresję w tę postać białaczki [10]. 2.1.2. badanie szpiku kostnego Nie jest to badanie niezbędne do rozpoznania CLL. Materiał z biopsji aspiracyjnej ukazuje typ infiltracji szpiku przez limfocyty białaczkowe, gdzie ich odsetek przekracza 30% [11]. Układ czerwonokrwinkowy i granulocytarny w pewnym stopniu jest stłumiony [8]. W trepanobiopsji szpiku można ocenić typ naciekania szpiku, wyróżniając w tym typ guzkowy (w 10% przypadków), śródmiąższowy (30%) lub rozlany (35%) oraz występujący u 25% pacjentów typ mieszany, czyli guzkowośródmiąższowy [1]. 51 Agnieszka Szymczyk, Arkadiusz Macheta, Monika Podhorecka 2.1.3. badanie immunofenotypu białaczkowych limfocytów w krwi obwodowej i/lub szpiku kostnym Celem badania jest wykazanie populacji białaczkowych limfocytów z koekspresją antygenów CD19, CD20, CD21, CD23, CD24 i antygenu CD5, charakterystycznego dla prawidłowych limfocytów linii T oraz obecność klonalnych łańcuchów immunoglobulin κ lub λ, przy jednoczesnej nieobecności ekspresji antygenów CD22 i FMC7 [11]. Stwierdza się także słabą ekspresję powierzchniowych immunoglobulin, najczęściej w klasie IgM lub IgD [5]. Immunofenotypowanie służy więc zarówno do ustalenia rozpoznania CLL, jak również rokowania, m.in. poprzez oznaczanie ekspresji antygenu CD38 czy wewnątrzkomórkowego białka związanego ZAP-70. Badanie to także pomaga w różnicowaniu CLL z innymi jednostkami chorobowymi przebiegającymi z limfocytozą [11]. 2.1.4. badanie cytogenetyczne i molekularne Zastosowanie cytogenetyki w CLL ogranicza się głównie do celów prognostycznych. Obecnie, ze względu stosunkowo znikomej przydatności klasycznych metod molekularnych, zastosowanie posiada szczególnie technika hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH, ang fluorescence in situ hybrydization), można z jej użyciem wykrywać aberracje chromosomowe, które w przypadku CLL dotyczą najczęściej delecji chromosomu 11, 13, 17, trisomii chromosomu 12, rzadziej wykrywana jest trisomia chromosomów 19 lub 18 oraz mutacje chromosomu 6. Innym ważnym przykładem zastosowania tych metod jest ocena stanu zmutowania genów dla zmiennej części ciężkiego łańcucha immunoglobulin IgV H, uznanego za niezależny czynnik rokowniczy w przebiegu CLL [12]. 2.1.5. badania obrazowe Wykonywane są celem oceny stopnia zajęcia węzłów centralnych, hepato- oraz splenomegalii czy nacieków pozawęzłowych [1]. 2.1.6. badanie patomorfologiczne węzła chłonnego i nacieków pozawęzłowych Może ukazać zaburzoną architekturę węzła przez rozlany naciek limfocytarny. Wskazaniem do badania jest podejrzenie progresji histologicznej CLL lub wystąpienia wtórnej choroby nowotworowej [5, 1]. 52 Przewlekła białaczka limfocytowa – diagnostyka i wybrane czynniki prognostyczne 2.1.7. bezpośredni test antyglobulinowy Wykonywany w kierunku diagnostyki niedokrwistości autoimmunologicznej – w przypadku jej potwierdzenia test Coombsa jest dodatni, co występuje u około 10% pacjentów z CLL [13]. 2.1.8. proteinogram Elektroforezę białek surowicy krwi wykorzystuje się do oceny dość powszechnych w przypadku CLL cech, tj. hipogammaglobulinemii (występująca u większości pacjentów) lub rzadziej obecności białka monoklonalnego, zwykle w klasie IgM (u 5% chorych) [8]. Hipogammaglobulinemia świadczy o zaburzeniu odporności humoralnej, co jest uwarunkowane zaburzeniami zarówno limfocytów białaczkowych, jak i upośledzenia czynności reaktywnych limfocytów T, przy czym niski poziom sIg determinuje ich nieefektywność w prezentowaniu antygenów limfocytom T [14]. 3. Wybrane czynniki prognostyczne CLL charakteryzuje się różnorodnym przebiegiem klinicznym, rokowaniem i odpowiedzią na leczenie cytostatyczne, a moment rozpoczęcia leczenia jest indywidualny dla każdego chorego i uzależniony od stopnia zaawansowania klinicznego lub progresywnego charakteru choroby. U ok. 1/3 chorych CLL diagnozuje się we wczesnym stadium zaawansowania, choroba postępuje wolno i nie wymaga stosowania leczenia cytostatycznego, a zgon następuje z przyczyn naturalnych (smouldering CLL). Następna 1/3 chorych jest diagnozowana we wczesnym stadium, a leczenie jest wdrażane w momencie progresji choroby. Do wskazań do rozpoczęcia leczenia CLL wg NCI (National Center Institute) zaliczamy: występowanie objawów ogólnych choroby (gorączka powyżej 38°C, poty nocne, ubytek masy ciała większy niż 10% w ciągu ostatnich 6 miesięcy); zaawansowany stan kliniczny; cytopenie wtórne do nacieczenia szpiku; narastająca limfadenopatia i splenomegalia; anemia i trombocytopenia o podłożu autoimmunohemolitycznym oporne na kortykosterydoidy; podwojenie limfocytozy w czasie krótszym niż 6 miesięcy (lub zwiększenie limfocytozy o 50% w ciągu 2 miesięcy) [15]. Przez wiele lat najistotniejszym czynnikiem prognostycznym decydującym o rozpoczęciu terapii był stopień zaawansowania klinicznego 53 Agnieszka Szymczyk, Arkadiusz Macheta, Monika Podhorecka oceniany według klasyfikacji Rai`a lub Bineta. Wadą obu jest brak możliwości wyodrębnienia grupy chorych, u których z dużym prawdopodobieństwem można przewidzieć agresywny przebieg choroby i konieczność zastosowania agresywnej chemioterapii. Także parametry takie jak: wartości bezwzględnej limfocytozy we krwi obwodowej, czas podwojenia limfocytozy, charakter infiltracji szpiku kostnego przez limfocyty białaczkowe, stężenie rozpuszczalnego antygenu CD23 i beta2-mikroglobuliny, a także aktywność kinazy tymidynowej i dehydrogenazy mleczanowej mogą być pomocne w podjęciu decyzji o rozpoczęciu terapii, jednak nie pozwalają na odróżnienie choroby o powolnym i agresywnym przebiegu [16]. W ciągu ostatnich lat ustalono wiele nowych czynników prognostycznych, które stały się podstawą opracowania nowych strategii terapeutycznych. Można zaliczyć do nich markery immunofenotypowe komórek białaczkowych (CD38 i ZAP-70) oceniane za pomocą cytometrii przepływowej, stan hipermutacji somatycznej fragmentu zmiennego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny (IgVH) oraz aberracje cytogenetyczne. W korelacji z innymi parametrami immunofenotypowymi, w tym CD5 i CD23, pozwalają także na skuteczniejszą ocenę efektów terapii oraz jej monitorowania na poziomie choroby resztkowej [15, 16, 17]. 3.1. Stan hipermutacji somatycznej IgVH Analiza genetyczna chorych z rozpoznaniem CLL wykazała, że w zależności od pochodzenia białaczkowych limfocytów B o fenotypie CD19+/CD5+ możliwe jest wyodrębnienie dwóch postaci klinicznych choroby, a ich rozróżnienie jest możliwe dzięki ocenie stanu mutacji regionu zmiennego genu dla łańcucha ciężkiego immunoglobulin IgV H). Typ I (przedzarodkowy) choroby cechuje się obecnością niezmutowanego, a typ II (pozazarodkowy) obecnością zmutowanego regionu zmiennego dla łańcucha ciężkiego immunoglobulin (IgV H) [18, 19] . Szacuje się, że obecność zmutowanych regionów zmiennych genów dla immunoglobulin (IgVH) można stwierdzić u około 2/3 chorych. Wykazano ponadto, że ta populacja pacjentów charakteryzuje się łagodniejszym przebiegiem choroby w odróżnieniu od chorych z niezmutowanym genem IgVH, tj. zgodnym z linią zarodkową >98%. Obserwacje te zostały potwierdzone przez Hamblina i wsp., którzy opisali istotnie dłuższe przeżycie u chorych ze zmutowanymi genami IgV H niezależnie od stadium zaawansowania choroby. Czas przeżycia chorych z mutacją genu IgV H wynosił średnio 293 miesiące, w porównaniu do 117 miesięcy dla grupy chorych z niezmutowanymi genami IgV H. Wyjątkową populację stanowią 54 Przewlekła białaczka limfocytowa – diagnostyka i wybrane czynniki prognostyczne natomiast chorzy się z rearanżacją części zmiennej V3-21, którzy mają gorsze rokowanie niezależnie od stanu mutacji genu IgVH [19]. Udowodniono także, że chorzy z obecnością niezmutowanego genu IgVH mają zwykle bardziej zaawansowany okres kliniczny choroby w chwili rozpoznania. Częściej występują u nich także inne niekorzystne aberracje genetyczne. Krótszy jest także czas od momentu rozpoznania do rozpoczęcia leczenia oraz czas całkowitego przeżycia w porównaniu z grupą chorych ze zmutowanym genem IgVH [15, 19]. 3.2. Ekspresja CD38 Antygen błonowy CD38 jest cząsteczką pełniącą funkcję receptora błonowego, będącą jednołańcuchową glikoproteiną typu II o ciężarze cząsteczkowym 45kDa. Cechuje się zdolnością do agregacji i tworzenia dimerów oraz tetrametrów, a także posiada właściwości enzymatyczne cyklazy ADP-rybozylowej. Jej ekspresję wykazano na limfocytach B i T, komórkach NK, monocytach oraz komórkach dendrytycznych. Poziom ekspresji CD38 jest uzależniony od stadium zróżnicowania komórki. Dzięki swoim właściwościom enzymatycznym antygen błonowy CD38 odgrywa kluczową rolę w wielu procesach komórkowych (podział, proliferacja, odnowa populacji komórek macierzystych, wydzielanie neuroprzekaźników). Ponadto CD38 bierze udział w transdukcji sygnałów wewnątrzkomórkowych inicjujących syntezę cytokin, aktywację i proliferację komórek, a także ich apoptozę. Podczas rozwoju limfocytów B ekspresja CD38 jest ściśle regulowana. Udowodniono, że komórki prekursorowe zlokalizowane w szpiku kostnym cechuje wysoka ekspresja CD38, natomiast na limfocytach B krwi obwodowej ekspresja CD38 jest niska. W związku z powyższym przyjmuje się, że stopień ekspresji antygenu CD38 jest powiązany ze stopniem dojrzałości limfocytów B [19]. Stwierdzono także, że antygen CD38 odgrywa kluczową rolę w supramolekularnym kompleksie obejmującym receptory pośredniczące w transdukcji sygnału komórkowego, cząsteczki adhezyjne, receptory dla chemokin oraz metaloproteazy matrix komórkowego. Wykazano także, że ekspresja CD38 w obrębie białek wymienionego kompleksu ściśle koreluje z wydajniejszą transdukcją sygnału komórkowego, chemotaksją oraz homingiem. Z tych powodów sugeruje się, że CD38 jest cząsteczką, która integruje sygnały proliferacyjne i migracyjne komórek [15,19]. 3.3. Ekspresja ZAP-70 Białko ZAP70, kodowane przez gen o tej samej nazwie zlokalizowany na chromosomie 1, jest enzymem, który pełni funkcję niereceptorowej 55 Agnieszka Szymczyk, Arkadiusz Macheta, Monika Podhorecka białkowej kinazy tyrozynowej związanej z łańcuchem zeta o ciężarze właściwym 70kDa (zeta-chain-associated protein kinase 70). Został on zidentyfikowany po raz pierwszy w populacji chorych z rozpoznaniem CLL za pomocą techniki DNA microarray w trakcie poszukiwania genów powiązanych ze stanem mutacyjnym IgVH. Crespo i wsp. wprowadzili natomiast technikę cytometrii przepływowej dla oceny ekspresji ZAP70 na powierzchni komórek B-CLL, a Schroers i wsp. wykazali związek pomiędzy ekspresją ZAP70 a agresywnym przebiegiem choroby. Wykazano korelację pomiędzy ekspresją ZAP70 a skróceniem średniego czasu całkowitego przeżycia przy jednoczesnym braku związku z wyjściowym stopniem zaawansowania choroby [15, 17]. 3.4. Zmiany cytogenetyczne Udowodniono, że występowanie zaburzeń cytogenetycznych w komórkach białaczkowych CLL ma znaczenie prognostyczne – ich obecność w badaniu metodą FISH wykazano u około 80% chorych z rozpoznaniem CLL. Najczęściej stwierdza się obecność delecji 13q14, delecji 11q22-23, delecji 17p13, trisomii chromosomu 12 oraz delecji 6q. Delecja 11q22-23 jest obecna 10-20% chorych z B-CLL. Istotą tego defektu jest delecja obszaru chromosomu zawierającego gen ATM (ataxia teleangiectasia mutated). Znaczenie prognostyczne ma także mutacja w obrębie samego genu ATM, która koreluje z szybką progresją choroby, masywną limfadenopatią, złą odpowiedzią na leczenie, a także ze znamiennie krótszym okresem przeżycia całkowitego (około 80 miesięcy). Delecja 17p13 stwierdza się u około 8-10% pacjentów z CLL w momencie rozpoznania choroby i u około 30% chorych z opornością na leczenie. Jest ona również zaliczana do niekorzystnych zmian cytogenetycznych w populacji chorych z CLL. U podłoża defektu leży utrata genu supresorowego wzrostu guza (p53, ang. tumor supressor gene), a stwierdzenie jego obecnościjest powiązane z szybką progresją choroby, złą odpowiedzią na analogi puryn oraz leki alkilujące oraz krótszym czasem przeżycia całkowitego (około 30 miesięcy) [15, 17, 19]. 4. Podsumowanie CLL można zdiagnozować na podstawie rozmazu krwi obwodowej oraz badania immunofenotypowego limfocytów krwi obwodowej, jednak niezwykle ważne jest określenie dodatkowych czynników prognostycznych. Ich lepsze poznanie może wiązać się ze zmianą strategii terapeutycznych, zwłaszcza w grupie chorych, którzy nie spełniają kryteriów rozpoczęcia terapii według aktualnych wytycznych, a u których progresja choroby jest nieuchronna. Prawdopodobnie ta grupa pacjentów będzie wymagała wcześniejszego rozpoczęcia leczenia w celu zwiększenia skuteczności 56 Przewlekła białaczka limfocytowa – diagnostyka i wybrane czynniki prognostyczne terapii. Pomimo że w ostatnich latach do terapii wprowadzono szereg nowych leków, które zwiększają szansę na uzyskanie całkowitej remisji oraz remisji molekularnej, CLL nadal jest chorobą nieuleczalną. W związku z powyższym należałoby zintensyfikować badania mające na celu poznanie czynników prognostycznych, co przyczyniłoby się także do rozszerzenia badań nad alternatywnymi formami terapii. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Szczeklik A., Choroby wewnętrzne 2005; 1513-1518 Dmoszyńska A, Robak T, Hus I., Podstawy hematologii, 2005; 271-280 Hallek M. Chronic lymphocytic leukemia: 2013 update on diagnosis, risk stratification and treatment, Am J Hematol, 2013; 88(9): 803-16 Dudziński M., Miejsce ofatumumabu w terapii chłoniaków B-komórkowych, Hematologia 2011; 2(3): 246-255 Dmoszyńska A, Robak T., Podstawy hematologii, 2003; 269-277 Montserrat E, Moreno C., Chronic lymphocytic leukemia: a short overview. Annals of Oncology, 2008; 19,17: 320-325 Robak T., Czynniki prognostyczne w przewlekłej białaczce limfatycznej, Acta Haematol. Pol, 2003; 34,4 Mariańska B, Fabijańska-Mitek J, Windyga J., Badania laboratoryjne w hematologii, 2006: 59-60 Montserrat E, Gomis F, Vallespi T, Rios A, Romero A, Soler J, Alcala A, Morey M, Ferran C, Diaz-Mediavilla J. Presenting features and prognosis of CLL in younger adults, Blood 1991; 78: 1545-1551 Cheson BD, Benett J.M, Grever M, Kay N, Keating M.J, O’Brien S, Rai K.R. National Cancer Institute – Sponsored Working Group guidelines for chronic lymphocytic leukemia: revised guidelines for diagnosis and treatment, Blood 1996; 87: 4990-4997 Robak T, Hus I, Błoński J, Giannopoulos K, Jamroziak K, Roliński J, Smolewski P, Wołowiec D., Diagnostic and therapeutic recommendations of the Polish Society of Hematology and Transfusion Medine and Polish Adult Leukemia Group – CLL for chronic lymphocytic leukemia in 2014, Acta Haematol Pol, 2014; 45: 221-239 Palacz A, Korycka A., Diagnostyczne i rokownicze znaczenie badań cytogenetycznych w przewlekłej białaczce limfocytowej, Acta Haematol. Pol, 2008; 39,3: 443-459 Abott B., Chronic lymphocytic leukemia. Recent advances in diagnosis and treatment, The Oncologist 2006; 11: 21-30 Juszczyński P, Warzocha K., Biologia i klinika przewlekłej białaczki limfatycznej, Onkol. Pol. 2001; 4,2: 7-84 Wrzocha K., Optymalizacja strategii leczenia pierwszej linii przewlekłej białaczki limfocytowej, Onkologia w praktyce klinicznej 2007; 3,2: 78-86 Urbanowicz I., Ekspresja wybranych białek jąderkowych w limfocytach przewlekłej białaczki limfocytowej, Journal of Laboratory Diagnostics 2012; 48,1: 63-70 57 Agnieszka Szymczyk, Arkadiusz Macheta, Monika Podhorecka 17. Dziaczkowska-Suszek J, Krawczyk-Kuliś M, Bartkowska-Chrobok A, KyrczKrzemień S., Znaczenie czynników prognostycznych przy rozpoznaniu przewlekłej białaczki limfocytowej, Postępy Nauk Medycznych 2013; XXVI, 3: 248-254 18. Giannopoulos K., Biology and prognosis in chronic lymphocytic leukemia, Acta Haematol Pol 2010; 41,3: 433-440 19. Robak T., Czynniki prognostyczne w przewlekłej białaczce limfatycznej, 2003; 34,4: 395-405 Przewlekła białaczka limfocytowa – diagnostyka i wybrane czynniki prognostyczne Streszczenie Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL, chronic lymphocytic leukemia) jest najczęstszym typem białaczki wśród osób dorosłych w krajach zachodnich i Stanach Zjednoczonych, w przebiegu której dochodzi do nagromadzenia czynnościowo nieprawidłowych, monoklonalnych komórek B we krwi, szpiku kostnym, węzłach chłonnych i śledzionie. Charakteryzuje się bardzo zmiennym przebiegiem klinicznym - u części chorych obserwuje się łagodny przebieg i długie przeżycie, u pozostałych osób natomiast choroba ma przebieg agresywny, prowadząc, mimo intensywnej terapii, do zgonu w ciągu 2-3 lat. Dlatego bardzo istotna wydaje się rola czynników prognostycznych, pozwalających przewidzieć rokowanie oraz wybranie optymalnej opcji terapeutycznej. W pracy opisujemy na podstawie dostępnych danych literaturowych kryteria diagnostyczne CLL oraz wybrane czynniki rokownicze. Słowa kluczowe: przewlekła białaczka limfocytowa, diagnostyka, czynniki prognostyczne 58 Ewelina Wieczerzak1, Anna Trawicka2, Agnieszka Szymczyk3 Postępy w leczeniu szpiczaka mnogiego – przegląd piśmiennictwa 1. Wstęp Szpiczak plazmocytowy (szpiczak mnogi, ang. multiple myeloma, MM) jest chorobą nowotworową układu krwiotwórczego wywodzącą się z komórek B w końcowym etapie różnicowania, po dokonaniu rekombinacji klasy (zmiana izotopu) łańcucha ciężkiego immunoglobulin. U podłoża procesu chorobowego leży nadmierna proliferacja i gromadzenie monoklonalnych plazmocytów, które wytwarzają nieprawidłową monoklonalną immunoglobulinę bądź jej fragmenty [1]. Pomimo że MM po raz pierwszy został opisany w 1848r. [2], pierwsze sukcesy terapeutyczne (średnie przeżycie 3-4 lat) odnotowywano dopiero ponad 100 lat później, czyli pod koniec lat 60. XX wieku [3]. Niestety etiologia choroby wciąż nie została do końca poznana, a leczenie pozostaje sporym wyzwaniem. Rzadko dochodzi do trwałego wyleczenia, a głównym celem terapeutycznym jest uzyskanie jak najdłuższej remisji i wydłużenie przeżycia bez nawrotu choroby. Jak dotąd podstawę leczenia stanowiła terapia indukująca remisję z następowym autologicznym przeszczepem komórek krwiotwórczych (ang. autologous stem cell transplantation, ASCT) w populacji chorych kwalifikujących się do tej procedury. Obecnie wiąże się ogromne nadzieje z zastosowaniem nowych schematów leczenia, leków immunomodulujących, a także inhibitorów proteasomów. Celem pracy było przedstawienie postępów w terapii MM na podstawie analizy najnowszych danych klinicznych w korelacji z wybranymi czynnikami rokowniczymi oraz wynikami odległymi zastosowanego leczenia. 1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze i Klinice Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku, I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, http://www.stn.umlub.pl/opisy-kol/katedrze-i-klinicehematoonkologii-i-transplantacji-szpiku/ 2 [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze i Klinice Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku, I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, http://www.stn.umlub.pl/opisy-kol/katedrze-i-klinice-hematoonkologii-itransplantacji-szpiku/ 3 [email protected], Katedra i Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku UM w Lublinie, http://www.klinika.hematoonkologia.pl/index.html 59 Ewelina Wieczerzak, Anna Trawicka, Agnieszka Szymczyk 2. Ważniejsze leki stosowane w terapii szpiczaka 2.1. Talidomid Talidomid jest pierwszym lekiem z grupy nowych preparatów (ang. novel agents) wykorzystanym w leczeniu MM. Może być stosowany zarówno w monoterapii jak i w skojarzeniu z innymi lekami w terapii pierwszo liniowej oraz w grupie chorych z postacią nawrotową MM. W leczeniu nowo rozpoznanego szpiczaka plazmocytowego u chorych kwalifikujących się do ASCT w leczeniu indukującym remisję podaje się talidomid w skojarzeniu z deksametazonem i cyklofosfamidem (schemat CTD) [5]. U pacjentów, którzy nie mogą być poddani procedurze autologicznego przeszczepienia komórek krwiotwórczych standardem jest chemioterapia w układzie MPT (talidomid, melfalan i prednizon) [4, 5]. W grupie chorych, u których w terapii zastosowano talidomid w większości przypadków obserwowano szybką odpowiedź na zastosowane leczenie. Wprowadzenie tego leku do terapii było przełomem w leczeniu MM, ponieważ spowodowało znaczące wydłużenie czasu przeżycia całkowitego (OS, overall survival) oraz czasu przeżycia wolnego od progresji choroby (PFS, progression-free survival) we wszystkich grupach wiekowych [6]. Obecnie jednak schematy zawierające talidomid są stosowane rzadko ze względu na liczne działania niepożądane obserwowane w trakcie terapii. Do najważniejszych powikłań wywołanych przez talidomid w leczeniu szpiczaka plazmocytowego należą: polineuropatia obwodowa, zakrzepica żył głębokich oraz mielosupresja szpiku kostnego [3, 4, 5, 6]. Z zastosowania talidomidu wynikają jednak pewne korzyści, które mogą uzasadnić dalsze stosowanie tego leku. Należą do nich niski koszt terapii, możliwość podania doustnego oraz mniej kłopotliwe leczenie w porównaniu z innymi schematami leczenia (np. VAD w skład którego wchodzi winkrystyna, adriamycyna i deksametayon) z zachowaniem porównywalnej skuteczności [6]. 2.2. Lenalidomid Lenalidomid, choć jest pochodną talidomidu, charakteryzuje się większą skutecznością i jest lepiej tolerowany [7]. Wprowadzenie tego leku do terapii w skojarzeniu z deksametazonem przyniosło obiecujące rezultaty, zwiększając odpowiedź na leczenie (RR, response rate) o 91% w przypadku dużych dawek deksametazonu i wydłużając OS u stosujących niższe dawki deksametazonu [6]. Do najczęstszych zdarzeń niepożądanych w trakcie leczenie można zaliczyć neutropenię i epizody zakrzepowo-zatorowe (w tym nawet zator tętnicy płucnej) [3]. Lenalidomid może być stosowany zarówno w terapii nawrotowego szpiczaka mnogiego, jak i terapii 60 Postępy w leczeniu szpiczaka mnogiego – przegląd piśmiennictwa pierwszoliniowej w grupie chorych niekwalifikujących się do ASCT. Wykorzystanie lenalidomidu w leczeniu pacjentów, u których planuje się pobranie komórek macierzystych do autotransplantacji, nie jest korzystne, ponieważ lek ten wywołuje znaczną mielosupresję. Obecnie trwają badania oceniające stosunek skuteczności do toksyczności po włączeniu cyklofosfamidu i czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF). Takie połączenie mogłoby znieść uszkadzające działanie lenalidomidu na szpik i umożliwić ASCT [4]. 2.3. Bortezomib Bortezomib to pierwszy lek z klasy inhibitorów proteasomów, będący pochodną kwasu borowego. Atom boru zawarty w jego cząsteczce pełni główną rolę w odwracalnym hamowaniu proteasomu 26S, będącego kompleksem białkowym odpowiedzialnym za degradację białek komórkowych. Bortezomib wykazuje wielokierunkowe działanie przeciwnowotworowe – hamuje proces rozrostowy oraz tworzenie naczyń w obrębie guza [8]. Wykazano także, że może również przyczyniać się do kościotworzenia, stymulować aktywność osteoblastów, zmniejszać resorpcję kości i aktywność kościogubną osteoklastów [9]. W leczeniu nawrotowego szpiczaka plazmocytowego bortezomib może być stosowany w monoterapii (obecnie rzadko) lub w skojarzeniu z innymi lekami. Schematy oparte na tym leku są również stosowane w terapii konsolidacyjnej po ASCT oraz w leczeniu podtrzymującym. Bortezomib może być także stosowany w terapii indukującej remisję, zarówno u chorych kwalifikujących się do ASCT, jak i u pacjentów nie kwalifikujących się do autotransplantacji. Dodatkową zaletą leku jest możliwość podania podskórnego [9]. Do najważniejszych działań niepożądanych należą polineuropatia obwodowa, zaburzenia żołądkowo-jelitowe oraz małopłytkowość. Obecnie pokładane są nadzieje w skojarzeniu bortezomibu z inhibitorami białek ostrej fazy, inhibitorami kinazy B lub inhibitorami deacetylazy histonowej. Przyjmuje się, że takie kombinacje leków mogłyby zwiększyć skuteczność leczenia oraz zniwelować jego toksyczność [3]. 2.4. Karfilzomib Karfilzomib jest lekiem drugiej generacji, nieodwracalnym inhibitorem proteasomu o strukturze i mechanizmie działania podobnym do bortezomibu [10]. Charakteryzuje się większą selektywnością działania oraz wykazuje skuteczność w przypadku oporności na bortezomib. Jest lekiem z wyboru w grupie chorych, u których pomimo zastosowania przynajmniej dwóch schematów leczenia (w tym co najmniej jednego 61 Ewelina Wieczerzak, Anna Trawicka, Agnieszka Szymczyk łączącego bortezomib z innymi lekami immunomodulującymi) nie uzyskano odpowiedzi na terapię. W Polsce aktualnie jest dostępny jedynie w ramach badań klinicznych [11]. 2.5. Pomalidomid Pomalidomid to kolejny (silniejszy od lenalidomidu) lek immunomodulujący, analog talidomidu. Posiada w porównaniu z nimi silniejszy efekt antyszpiczakowy wykazany in vitro. Zgodnie z charakterystyką produktu leczniczego lek ten znajduje zastosowanie w przypadkach, w których pomimo wcześniejszego zastosowania dwóch schematów chemioterapeutycznych uwzględniających lenalidomid i bortezomib nie uzyskano remisji lub stabilizacji choroby. Działanie antyapoptotyczne (poprzez wpływ na kaspazę 8) oraz działanie antyangiogenetyczne jest podobne jak w przypadku talidomidu i lenalidomidu. Wciąż trwają badania nad skutecznością pomalidomidu w monoterapii oraz terapii skojarzonej z innymi lekami [11]. 3. Leczenie indukujące remisję Termin leczenie indukujące remisję w odniesieniu do początkowej terapii szpiczaka plazmocytowego przez wiele lat prawie nie funkcjonował [4]. Rolą tego etapu leczenia jest indukcja remisji, a ta w przypadku MM była rzadkością, ponieważ konwencjonalna chemioterapia nie przynosiła efektów. Całkowitą remisję (CR, complete remission) u chorych leczonych według schematu MP w dawkach należnych (melfalan, prednizon) uzyskiwano jedynie u 5% pacjentów, a w przypadku schematów z deksametazonem mniej niż u 10% [4]. Uzyskanie remisji było możliwe jedynie po połączeniu standardowego leczenia dużymi dawkami chemioterapeutyków z następowym autologicznym przeszczepieniem komórek krwiotwórczych. Choć ta metoda zwiększyła odsetek CR do 20-40%, nie znalazła zastosowania w populacji osób starszych (> 65 roku życia), które stanowią największą grupę chorujących na szpiczaka plazmocytowego. Problemem pozostaje także postępowanie w przypadku MM opornego na terapię oraz leczenie nawrotów choroby. Powyższe ograniczenia wymagają dostosowania schematów leczenia dla chorych kwalifikujących się do autologicznego przeszczepu komórek krwiotwórczych i tych, u których transplantacja jest przeciwwskazana. Odmienną terapię stosuje się również w przypadku wznowy lub braku odpowiedzi na dotychczas stosowane leczenie. 62 Postępy w leczeniu szpiczaka mnogiego – przegląd piśmiennictwa 3.1. Leczenie indukujące remisję w grupie chorych niekwalifikujących się do ASCT Przyjęto, że podeszły wiek (powyżej 65. roku życia) jest przeciwwskazaniem do wykonania autologicznego przeszczepu komórek macierzystych, ze względu na znaczne ryzyko powikłań i niepowodzenia tej metody leczniczej. Obecnie jednak nie sam wiek jest brany pod uwagę w kwalifikacji do ASCT, ale choroby współistniejące, a ogólna wydolność organizmu („wiek biologiczny”) jest kryterium ważniejszym niż wiek metrykalny [12]. Leczenie pierwszoliniowe poprzedzające ASCT jest zatem obecnie wdrażane nawet u osób starszych, ale wydolnych narządowo, bez względu na wiek. Faktem jest, że współistnienie chorób towarzyszących to problem, który najczęściej dotyczy pacjentów z najstarszej grupy wiekowej. W związku z tym u tych chorych wciąż rzadko wykonuje się ASCT. Przez długi czas standardem w leczeniu indukującym remisję w populacji osób starszych było zastosowanie schematu MP, który charakteryzował się znikomą skutecznością – CR udawało się osiągnąć najwyżej w 5% przypadków [4]. Dopiero, gdy zaczęto stosować talidomid w skojarzeniu z prednizonem i melfalanem (schemat MPT) udało się uzyskać lepszą odpowiedź na leczenie, zwiększyć częstość uzyskiwanej remisji i wydłużyć czas bez progresji choroby [4]. Podobne wyniki można osiągnąć dzięki skojarzeniu cyklofosfamidu, talidomidu i deksametazonu (schemat CTD) – remisję uzyskuje się w 13-16% przypadków, jednak wzrost efektywności leczenia często niwelują poważne działania niepożądane ze strony talidomidu [12]. Kolejnym stosowanym obecnie standardem jest kombinacja melfalanu i prednizonu z bortezomibem (schemat VMP), którego zastosowanie pozwoliło na wydłużenie średniego czasu przeżycia o ponad rok w porównaniu do chemioterapii w układzie MP [13]. U osób z poważnymi chorobami współistniejącymi włączenie do schematu środka alkilującego, takiego jak np. melfalan, mogłoby się okazać zbyt toksyczne i wiązać się ze zwiększonym ryzykiem poważnych skutków niepożądanych. W tych przypadkach bortezomib może być stosowany jedynie w połączeniu z deksametazonem. W takim skojarzeniu możliwe jest uzyskanie dobrej odpowiedzi na leczenie (70%), a całkowitą remisję można uzyskać nawet w 25% przypadków [12]. 3.2. Leczenie indukujące remisję w grupie chorych poniżej 65. roku życia W tej grupie wiekowej chorych standardem jest następujący schemat: leczenie indukujące remisję, a następnie autologiczny przeszczep komórek 63 Ewelina Wieczerzak, Anna Trawicka, Agnieszka Szymczyk krwiotwórczych. Ważnym warunkiem, który musi spełniać pacjent kwalifikowany do takiego leczenia (poza wiekiem) jest prawidłowa funkcja nerek. Etap indukcji chemioterapią ma na celu uzyskanie przynajmniej częściowej remisji choroby. Wyniki badania klinicznego IFM 90 [14] wykazały jednoznacznie, że uzyskanie CR (czyli zupełnego braku białka M w surowicy) lub częściowej bardzo dobrej odpowiedzi (VGPR, very good partial response, czyli obniżenia jego stężenia o 90% lub więcej) powoduje znaczne wydłużenie OS. Schematy leczenia nie zawierające melfalanu stosuje się nie tylko u chorych kwalifikowanych do transplantacji komórek macierzystych, ale także u nowozdiagnozowanych chorych lub pacjentów po ASCT w celu leczenia podtrzymującego remisję. Najczęściej używanymi zestawami leków w terapii pierwszoliniowej są: talidomid/deksametazon; lenalidomid/deksametazon (niskodawkowany); bortezomib/deksametazon; bortezomid/doksorubicyna/deksametazon; bortezomib/talidomid/deksametazon; bortezomib/lenalidomid/deksametazon; cyklofosfamid/talidomid/deksametazon; bortezomib/cyklofosfamid/deksametazon. Stosuje się też terapie wielolekowe. 3.2.1. Talidomid/deksametazon Połączenie talidomidu z deksametazonem jest obarczone wysoką toksycznością. Dane literaturowe donoszą, że odsetek powikłań zakrzepowo-zatorowych w przypadku tego typu terapii wynosi ok. 20%, natomiast współczynnik śmiertelności we wczesnej fazie leczenia aż 10%, dlatego chorzy otrzymujący talidomid w jakimkolwiek skojarzeniu powinni otrzymywać jednocześnie profilaktykę przeciwzakrzepową: aspirynę, heparynę drobnocząsteczkową lub warfarynę [15]. 3.2.2. Lenalidomid/deksametazon Lenalidomid jest nowszym, bardziej skutecznym i obarczonym mniejszą toksycznością analogiem talidomidu. Badania dotyczące dawkowania deksametazonu w skojarzeniu z lenalidomidem wykazały, że OS w przypadku zastosowania tego leku wzrósł do 96% (w przypadku talidomidu 87%). Obserwowano także spadek śmiertelności wczesnej z 5% do 0,5% [16, 17]. 64 Postępy w leczeniu szpiczaka mnogiego – przegląd piśmiennictwa 3.2.3. Bortezomid/deksametazon W badaniach porównujących skuteczność połączenia bortezomibu z deksametazonem (schemat VD) ze schematem VAD (winkrystyna, adriamycyna i deksametazon) odsetek CR wynosił odpowiednio 38% i 15% [18]. 3.2.4. Bortezomid/deksametazon + talidomid lub lenalidomid Kombinacje trójlekowe dają w porównaniu z wyżej wymienionymi połączeniami dwulekowymi lepszą ogólną odpowiedź na leczenie, wyższy odsetek CR i dłuższy OS. W badaniach klinicznych wykazano, że skojarzenie bortezomibu z talidomidem i deksametazonem (schemat VTD) cechuje się wyższą skutecznością w porównaniu ze schematem TD (talidomid z deksametazonem) [19]. Analogicznie wypadły wyniki porównania wyżej wymienionego połączenia trójlekowego ze schematem VD (bortezomib w skojarzeniu z deksametazonem). Skojarzenie bortezomibu z lenalidomidem i deksametazonem wykazuje porównywalną skuteczność z pozostałymi wyżej wymienionymi schematami trójlekowymi. 3.2.5. Schematy z doksorubicyną Wykazano, że w przypadku zastosowania schematów, w skład których wchodzi doksorubicyna, takich jak np. TAD (talidomid, doksorubicyna z deksametazonem) czy PAD (bortezomib, doksorubicyna z deksametazonem) uzyskuje się lepszą odpowiedź kliniczną w porównaniu z grupą chorych, u których do terapii włączono schematy bez tego cytostatyku. 3.2.6. Terapie wielolekowe Terapia wielolekowa jak np. VDT-PACE (bortezomib, deksametazon, talidomid, cisplatyna, doksorubicyna, cyklofosfamid i etopozyd) mogą być zastosowane przy bardzo agresywnym i rozlanym przebiegu postaci wieloogniskowej. 4. Przeszczep 4.1. Autologiczny przeszczep komórek macierzystych (ASCT) Szacuje się, że zastosowanie ASCT wydłuża czas remisji i przeżycie całkowite o około 12 miesięcy [20]. Według danych literaturowych, autologiczne przeszczepienie komórek krwiotwórczych powinno być traktowane jako standardowy etap terapii MM, jednak nie określa się jaki jest optymalny moment na jego wdrożenie. Decyzja, w którym momencie zdecydować się na ASCT powinna być oparta na wynikach leczenia indukującego remisję, powikłaniach po chemioterapii indukującej remisję, wieku pacjenta oraz chorobach współistniejących. 65 Ewelina Wieczerzak, Anna Trawicka, Agnieszka Szymczyk 4.2. Tandemowy przeszczep komórek krwiotwórczych Skuteczność przeszczepu tandemowego w grupie chorych z rozpoznaniem MM oceniano w pięciu dużych badaniach klinicznych, jednak jedynie w dwóch z nich badano wpływ zastosowania tej procedury na ogólny czas przeżycia chorego. W obu tych badaniach wykazano znamienne wydłużenie PFS i OS. Należy jednak podkreślić względnie wyższą toksyczność w porównaniu z przeszczepem pojedynczym. 4.3. Przeszczep allogeniczny Ten typ transplantacji w populacji chorych z rozpoznaniem MM wykonuje się niezwykle rzadko, ponieważ ryzyko choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD), a także śmiertelności około przeszczepowej (nawet w przypadku dawcy spokrewnionego) jest znacznie większe niż w przypadku przeszczepu autologicznego. 5. Leczenie podtrzymujące Nawet jeśli przeszczep komórek krwiotwórczych zakończy się powodzeniem, ryzyko progresji choroby pozostaje wysokie. W leczeniu podtrzymującym również sprawdzają się schematy oparte na lenalidomidzie lub talidomidzie. Są włączane zarówno w przypadku chorych po ASCT, jak i pacjentów niekwalifikujących się do przeszczepu. Wykazano, że leczenie podtrzymujące jest w stanie wydłużyć PFS nawet o około 1,5 roku [5]. Nie wykazano jednak wpływu terapii podtrzymującej na OS. 6. Leczenie wspomagające 6.1.1. Niedokrwistość U podłoża towarzyszącej MM niedokrwistości leży zazwyczaj wiele czynników sprawczych. Ustępuje ona często w wyniku zastosowania leczenia cytostatycznego i poprawy stanu klinicznego chorego, jednak najczęściej wymaga odpowiedniej farmakoterapii. W tym celu włączana jest do leczenia erytropoetyna. Jednakże jej stosowanie może pogorszyć wyniki leczenia chemioterapeutycznego, a w połączeniu z lenalidomidem lub talidomidem spowodować powikłania zakrzepowo-zatorowe [6]. Tak więc w przypadku gdy niedokrwistość nie ustępuje pomimo skuteczności leczenia chemioterapeutycznego (i leczenie hemopoetyczne musi być włączone) należy wdrożyć profilaktykę przeciwzakrzepową. 66 Postępy w leczeniu szpiczaka mnogiego – przegląd piśmiennictwa 6.1.2. Bisfosfoniany Bisfosfoniany (kwas zoledronowy, pamidronian, klodronian) stosowane są w grupie chorych ze zmianami kostnymi. Rutynowo czas leczenia wynosi od 12 do 18 miesięcy od rozpoznania choroby. 6.1.3. Leczenie nawracających infekcji U chorych z MM dużym problemem są nawracające infekcje, które należy intensywnie leczyć ze względu na współistniejące zaburzenia odporności. Profilaktyczne zastosowanie antybiotyków niesie ryzyko wywołania oporności, jednak w dwóch pierwszych miesiącach trwania terapii indukującej remisję może przynieść znaczne korzyści. 7. Podsumowanie Postęp, który dokonał się w ciągu ostatnich lat w leczeniu szpiczaka plazmocytowego, zawdzięczamy zarówno wprowadzeniu nowych leków, jak i lepszemu poznaniu biologii tej choroby oraz zidentyfikowaniu nowych czynników rokowniczych. Mimo tych znaczących postępów choroba ta nadal pozostaje nieuleczalna. Obecnie dąży się do personalizacji leczenia mającego na celu uzyskanie jak najdłuższego czasu remisji choroby z jednoczesnym zachowaniem jak najlepszej jakości życia. Leczenie MM jest nadal problemem nie tylko dla naukowców, ale przede wszystkim dla lekarzy klinicystów, ponieważ właściwe postępowanie lecznicze w najwyższym stopniu uzależnione jest od indywidualnych potrzeb i stanu chorego, a także odpowiedzi na zastosowanie leczenie w konkretnym przypadku klinicznym. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. Choroby wewnętrzne na podstawie Interny Szczeklika pod redakcją Piotra Gajewskiego, Kraków 2013, s. 853 Shah D., Multiple Myeloma, Medscape, 2014 http://emedicine.medscape.com/article/204369-overview (data dostępu: 10.04.2015) Podar K., Tai Y.T., Hideshima T., Vallet S., Richardson P.G., Anderson K.C Emerging therapies for multiple myeloma, Expert Opinion on Emerging Drugs, marzec 2009, s. 99-127 Harousseau J.L. Induction Therapy in Multiple Myeloma, ASH Education Book, styczeń 2008, s. 306-3012 Morgan G.J., Davies F.E. Role of thalidomide in the treatment of patients with multiple myeloma, Critical Reviews in Oncology/Hematology, październik 2013, s. 14-22 67 Ewelina Wieczerzak, Anna Trawicka, Agnieszka Szymczyk 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Jurczyszyn A. Leczenie chorych na szpiczaka mnogiego poniżej 65.-70. roku życia oraz rola terapii podtrzymującej po przeszczepieniu komórek macierzystych, OncoReview, 4(2011), s. 258-271 McCormack P.L. Lenalidomide: A Review of Its Continuous Use in Patients with Newly Diagnosed Multiple Myeloma Not Eligible for Stem-Cell Transplantation, Drugs and Aging, 4(2015) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25925941 (data dostępu: 17.05.2015) Hideshima T, Richardson P.G., Anderson K.C. Mechanism of action of proteasome inhibitors and deacetylase inhibitors and the biological basis of synergy in multiple myeloma, Molecular Cancer Therapeutics, 10(2011), s. 2034-2042 Moreau P., Richardson P.G., Cavo M., Orlowski R.Z., San Miguel J.F., Palumbo A., Harousseau J.L. Proteasome inhibitors in multiple myeloma: 10 years later, Blood Journal, sierpień 2012, s. 947-959 Teicher B.A., Tomaszewski J.E. Proteasome Inhibitors, Biochemical Pharmacology, kwiecień 2015 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006295215002130 (data dostępu: 17.05.2015) Kuhn D.J., Chen Q., Voorhees P.M., Strader J.S., Shenk K.D., Sun C.M., Demo S.D., Bennett M.K., van Leeuwen F.W.B., Chanan-Khan A.A., Orlowski R.Z. Potent activity of carfilzomib, a novel, irreversible inhibitor of the ubiquitin-proteasome pathway, against preclinical models of multiple myeloma, Blood Journal, listopad 2007, s. 3281-3290 Quach H., Joshua D., Ho J., Szer J., Spencer A., Harrison S., Mollee P., Roberts A., Horvath N., Talaulikar D., To B., Zannettino A., Brown R., Catley L., Augustson B., Jaksic W., Gibson J., Prince H.M. Treatment of patients with multiple myeloma who are not eligible for stem cell transplantation: position statement of the myeloma foundation of Australia Medical and Scientific Advisory Group, Interbal Medicine Journal, 3 (2015), s. 335-343 San Miguel J.F., Schlag R., Khuageva N.K., Dimopoulos M.A., Shpilberg O., Kropff M. et al. Persistent overall survival benefit and no increased risk of second malignancies with bortezomib-melphalan-prednisone versus melphalan-prednisone in patients with previously untreated multiple myeloma, Journal of Clinical Oncology, 31 (2013), s. 448-455 van de Velde H.J.K., Liu X., Chen G., Cakana A., Draedt W., Bayssas M. Complete response correlates with long-term survival and progression-free survival in high-dose therapy in multiple myeloma, Haematologica, 92 (2007), s.1399-1406 Rajkumar S.V., Blood E., Vesole D.H., Fonseca R., Greipp P.R. Phase III clinical trial of thalidomide plus dexamethasone compared with dexamethasone alone in newly diagnosed multiple myeloma: a clinical trial coordinated by the Eastern Cooperative Oncology Group, J Clin Oncol, 24 (2006) s. 431-436 Gay F. et al. Lenalidomide plus dexamethasone versus thalidomide plus dexamethasone in newly diagnosed multiple myeloma: a comparative analysis of 411 patients, Blood Journal, 115 (2010), s. 1343-1350 68 Postępy w leczeniu szpiczaka mnogiego – przegląd piśmiennictwa 18. Rajkumar S.V., Jacobus S., Callander N.S., Fonseca R., Vesole D.H., Williams M.E., Abonour R., Siegel D.S., Katz M., Greipp P.R. Eastern Cooperative Oncology Group, The Lancet Oncology, styczeń 2010, s. 29-37 19. Harousseau J.L., Attal M., Avet-Loiseau H., Marit G., Caillot D., Mohty M., Lenain P., Hulin C., Facon T., Casassus P., Michallet M., Maisonneuve H., Benboubker L., Maloisel F., Petillon M.O., Webb I., Mathiot C., Moreau P. Bortezomib plus dexamethasone is superior to vincristine plus doxorubicin plus dexamethasone as induction treatment prior to autologous stem-cell transplantation in newly diagnosed multiple myeloma: results of the IFM 2005-01 phase III trial, Journal of Clinical Oncology, październik 2010, s. 4621-4629 20. Cavo M. et al. Bortezomib-thalidomide-dexamethasone compared with thalidomide-dexamethasone as induction and consolidation therapy before and after double autologous transplantation in newly diagnosed multiple myeloma: results from a randomized phase 3 study [abstract], Blood Journal, 116 (2010), (ASH Annual Meeting Abstracts):a42 21. Attal M., Harousseau J.L., Stoppa A.M., Sotto J.J., Fuzibet J.G., Rossi J.F., Casassus P., Maisonneuve H., Facon T., Ifrah N., Payen C., Bataille R. A prospective, randomized trial of autologous bone marrow transplantation and chemotherapy in multiple myeloma. Intergroupe Français du Myélome, The New England Journal of Medicine, lipiec 1996, s. 91-97 Postępy w leczeniu szpiczaka mnogiego – przegląd piśmiennictwa Streszczenie Do niedawna szpiczak mnogi (choroba nowotworowa charakteryzująca się klonalną proliferacją plazmocytów atypowych) był wyrokiem śmierci szczególnie dla ludzi w starszym wieku, gdyż oni najczęściej zapadają na ten typ nowotworu. W Europie znane są dwa podstawowe schematy leczenia chemioterapeutycznego tej choroby. Jednak pacjenci w bardziej zaawansowanym wieku, nie kwalifikujący się do terapii wysokimi dawkami cytostatyków bądź do terapii komórkami macierzystymi mieli jak dotąd małe szanse na uzyskanie remisji choroby. Ponadto, nawet jej uzyskanie nie gwarantuje, że nie nastąpi częsty dla tego typu nowotworu nawrót choroby. Dlatego są prowadzone nowe badania, których celem jest wydłużanie czasu remisji szpiczaka. Jak dotąd standardowa strategia składała się u pacjentów poniżej 65 r.ż. z dwóch etapów: leczenia indukującego remisję i autologicznego przeszczepu komórek macierzystych z krwi obwodowej (rzadko allogenicznego). Obecnie nadzieje pokładane są zastosowaniu nowego połączenia znanych już leków immunomodulujących i inhibitorów proteasomów: lenalidomidu, bortezomibu i karfilzomibu (trwają próby kliniczne dowodzące skuteczności tej metody). Jednocześnie badane są inne zestawy leków, na przykład wpływ klarytromycyny na wzrost skuteczności leczenia w połączeniu z tradycyjną chemioterapią. Celem pracy jest przedstawienie dokonanych zmian w charakterystyce leczenia szpiczaka mnogiego na podstawie najnowszych danych klinicznych, zmian dotyczących rokowania, przebiegu samego procesu leczenia oraz porównania jego skuteczności z tradycyjnymi metodami. Słowa kluczowe: szpiczak mnogi, nowotwór układu krwiotwórczego, plazmocyty 69 Agnieszka Kareńko1 Zastosowanie inhibitorów topoizomeraz DNA w terapii przeciwnowotworowej 1. Wprowadzenie Choroby nowotworowe są najczęstszą przyczyną zgonów u ludzi. Największy odsetek osób chorych dotyczy krajów rozwijających się. Z uwagi na dość późne wykrywanie choroby wielu pacjentów nie ma szans na wyzdrowienie. Niestety współczesna medycyna boryka się z wieloma problemami, m.in. poważnymi skutkami ubocznymi stosowanej terapii, czy zbyt szybkiego usuwania leków z organizmu. Ważnym aspektem w leczeniu nowotworów jest także brak selektywności w działaniu leków i atakowania komórek nowotworowych i zdrowych. Z uwagi, na coraz częstszy odsetek osób chorych poszukuje się nowych leków i terapii pozwalających na całkowite wyleczenie pacjentów. Dlatego też ważne jest bardzo dokładne poznanie mechanizmów nowotworzenia, jak też możliwości wykorzystania naturalnych substancji i ich pochodnych uzyskiwanych na drodze chemicznej syntezy, jako potencjalnych środków w terapii [1, 2]. Celem niniejszej pracy jest charakterystyka substancji współcześnie stosowanych oraz tych w fazie badań klinicznych, które mają swoje zastosowanie w terapii przeciwnowotworowej a ich celem działania są topoizomerazy. 2. Topoizomerazy DNA Do jednych z najważniejszych enzymów można zaliczyć topoizomerazy. Enzymy te biorą udział w procesach, w których dochodzi do rozplątywania DNA, między innymi w replikacji czy transkrypcji DNA. Są ważnym ogniwem w kondensacji chromosomów i rozdziale materiału genetycznego podczas anafazy. Topoizomerazy z uwagi na różnice w budowie i mechanizmie działania podzielono na dwie klasy: topoizomerazy typu I (topo I) oraz topoizomerazy typu II (topo II). Zadaniem tych pierwszych jest relaksacja superskręconych struktur DNA, zaś drugich dodawanie ujemnych superhelikalnych skrętów. Topoizomerazy wymagają różnych sekwencji aminokwasów potrzebują odmiennych warunków przeprowadzanych 1 [email protected], Studenckie Koło Biologów, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki 70 Zastosowanie inhibitorów topoizomeraz DNA w terapii przeciwnowotworowej reakcji, a mianowicie topoizomerazy typu I w odróżnieniu od typu II nie wymagają energii z hydrolizy ATP i tną tylko jedną nić DNA [3, 4]. 2.1. Klasyfikacja W obrębie dwóch głównych klas topoizomerazy zaklasyfikowano do dwóch rodzin (Rys. 1.). Do topoizomeraz typu I zaliczyć można: rodzinę IA, w której skład wchodzą bakteryjne topoizomerazy I oraz eukariotyczne topoizomerazy III; rodzinę IB włączającą topoizomerazy pokswirusowe, a także topo I eukariotów. Topoizomerazy klasy II występują w dwóch izoformach: α i β. Przedstawicielami topoizomerazy IIα jest gyraza – bakteryjna topoizomeraza II oraz topo IV, zaś do IIβ zaliczono topoizomerazy archeonów [4, 5]. Topoizomerazy DNA Topoizomerazy klasy II Topoizomerazy klasy I Topo IA Topo IB Topo IIα Bakteryjne topo I, Eukariotyczne topo III Pokswirusowe topo, Eukariotyczne topo I Gyraza, Topo IV Topo IIβ Topo archeonów Rysunek 1. Podział topoizomeraz [opracowanie własne na podstawie 5] 2.2. Budowa Budowa topoizomeraz klasy cechuje się domenę N-terminalną, która wiąże jony magnezu za pomocą domeny TopRim, rdzeniem oraz domeną C-końcową z aktywną tyrozyną niezbędną do przecięcia i ponownego połączenia nici DNA (Rys. 2.A). Enzymy z rodziny IA wiążą się z DNA z 5’ końcem, w przeciwieństwie do topoizomeraz IB, które przyłączają się do końca 3’. 71 Agnieszka Kareńko Cechami charakterystycznymi dla izomeraz topo II jest obecność domeny N-końcowej z domeną wiążącą ATP i jonami magnezu (domena TopRim), domeny rdzeniowej z aktywną tyrozyną oraz domeny C-końcowej (Rys. 2.B). Podczas gdy topo IIα najczęściej występuje, jako homodimer. Topo IIβ katalizuje reakcje w postaci heterotetrameru. Obydwie izoformy wymagają obecności w środowisku jonów Mg2+, a miejscem wiązania kowalencyjnego dla obydwu topoizomeraz jest 5’ koniec przeciętnej nici. Nasilona ekspresja podjednostek topo II zależy od fazy cyklu komórkowego. Ekspresja izoformy IIα osiąga najwyższe stężenie w fazie G2/M, natomiast stężenie izoformy IIβ jest na stałym poziomie przez cały cykl komórki [3, 6] A N-koniec Rdzeń tyrozyna domena TopRim B N-koniec domena wiążąca ATP domena TopRim C-koniec Rdzeń C-koniec tyrozyna Rysunek 2. Budowa domenowa topoizomeraz I (A) i II (B) [opracowanie własne na podstawie 6] 2.3. Mechanizm działania 2.3.1. Mechanizm działania topoizomeraz I Zasada działania topoizomeraz (Rys.3.) polega na czasowym rozcięciu jednej nici DNA. W zależności od rodziny enzymu wybierany jest odpowiedni koniec nici (3’ lub 5’) Na początku cząsteczka enzymu wiąże się z nicią DNA za pomocą domeny C-końcowej (1). Samo rozcięcie zachodzi poprzez atak nukleofilowy reszty tyrozyny na nić i utworzeniem wiązania z resztą fosfodiestrową DNA (2). Nić ciągła przechodzi wówczas przez powstałą przerwę (3-4). Po przejściu łańcucha polinukleotydowego cząsteczka enzymu ponownie łączy wcześniej rozciętą nić (5-6). Efektem końcowym jest zmniejszenie w helisie liczby skrętów o jeden (7-8) [3, 6]. 72 Zastosowanie inhibitorów topoizomeraz DNA w terapii przeciwnowotworowej Rysunek 3. Mechanizm działania topoizomeraz I [opracowanie własne na podstawie 3] 2.3.2. Mechanizm działania topoizomeraz II Topoizomerazy II mają zdolność cięcia obydwu nici DNA (Rys. 4.) i łączenia się z segmentem G (od ang. Gap - przerwa), który przechodzi przez bramę N zbudowaną z domen wiążących ATP i DNA. Następnie do „środka” wnika segment T (od ang. Transport – transport), a także dwie cząsteczki ATP, których obecność potrzebna jest do zamknięcia okienka (1). Następnie dochodzi do hydrolizy ATP i rozcięcia segmentu G. Powstają dwa wiązania fosfotyrozynowe między cząsteczką enzymu, a końcem 5’ nici DNA (2). Przez utworzoną lukę przechodzi segment T (3-4), a następnie dochodzi do połączenia przerwanych łańcuchów polinukleotydowych segmentu G (5). Segment T wydostaję się na zewnątrz przez bramę C, zaś segment G bierze udział w dalszej reakcji katalitycznej bądź opuszcza cząsteczkę przez bramę N (6) [3, 7]. 73 Agnieszka Kareńko Rysunek 4. Mechanizm działania topoizomeraz II [opracowanie własne na podstawie 7] 2.4. Ludzkie topoizomerazy Ludzkie komórki wykazują ekspresję dwóch izoform topoizomeraz II – α i β. Pomimo, iż kodowane są przez geny zlokalizowane na różnych chromosomach (geny dla izoformy α znajdują się na chromosomie 17, locus 21-22 ramienia długiego → 17q21-22, zaś dla izoformy β na chromosomie 3, locus 24 ramienia krótkiego → 3p24) wykazują 70% homologi sekwencji. Zarówno forma α, jak i β są homodimerami. Ekspresja i funkcje tych izoform różnią się od siebie. Topoizomerazy IIα występują w komórkach proliferujących, a ich stężenie najwyższe jest w fazie G2/M w przeciwieństwie do izoformy IIβ, która występuje na stałym i wysokim poziomie w każdej fazie cyklu komórkowego. Jednakże nie ma możliwości zrekompensować braku izoformy IIα. Jej obecność wymagana jest podczas rozwoju układu nerwowego ssaków. Dodatkową cechą 74 Zastosowanie inhibitorów topoizomeraz DNA w terapii przeciwnowotworowej różniącą obydwie izoformy jest fakt, iż podczas mitozy, topo IIα jest związana z chromosomami, a izoforma IIβ dysocjuje od nici DNA. Mimo to, uważa się, że forma IIβ odgrywa ważną rolę w rozwojowej i hormonalnej regulacji genów [8÷10]. 3. Inhibitory topoizomeraz 3.1. Charakterystyka Inhibitory topoizomerazy DNA umownie podzielono na dwie grupy: trucizny kompleksów rozszczepialnych oraz inhibitory katalityczne. Pierwszych zadaniem jest związanie się z DNA w miejscu jego przecięcia chwytają jeden z wolnych końców powodując powstawanie uszkodzeń strukturalnych. Zadaniem inhibitorów katalitycznych jest objęcie klamrą cząsteczkę enzymu, co hamuje jej aktywność ATPazową i w konsekwencji uniemożliwia wyzwolenie nici DNA po jej przejściu przez przerwę w pochwyconym wcześniej odcinku dwuniciowej cząsteczki DNA [10]. Do najpopularniejszych trucizn zaliczamy: kamptotecynę i jej pochodne, (np. topotekan czy irinotekan), które działają na topoizomerazy I oraz niektóre antybiotyki antracyklinowe jak doksorubicyna i daunorubicyna, czy związki takie jak etopozyd czy genisteina wpływające na topoizomerazy II. Wśród inhibitorów katalitycznych można wyróżnić bisdioksopiperazyny (ICRF-193, ICRF-187, ICRF-159) oraz aklarubicynę, czy suraminę [9÷12]. 3.2. Mechanizm działania Inhibitory działają w różny sposób, w zależności od klasy topoizomeraz. 3.2.1. Działanie trucizn kompleksu rozszczepialnego Inhibitory tej grupy stabilizują kompleks rozszczepialny, co zapobiega naprawie pęknięć w helisie DNA, powstałych na skutek działania topoizomerazy I. Uszkodzenia DNA pojawiają się w chwili zahamowania odtwarzania wiązań DNA poprzez związanie się cząsteczki inhibitora z kompleksem enzym-DNA. Widełki replikacyjne nie mogą przesuwać się po matrycy, gdyż na swojej drodze napotykają stabilizowany trójskładnikowy kompleks rozszczepialny. Dochodzi do indukcji transkrypcji TP53 i akumulacji białkowego produktu – białka p53 w jądrze. W konsekwencji zatrzymywana jest proliferacja komórek. Kolejnym etapem działania jest indukcja białka Bax oraz apoptozy. Cały proces ma miejsce w fazie S. Związek ten może działać także podczas transkrypcji, gdzie zmiany powstają na skutek oddziaływania polimerazy RNA oraz kompleksów rozszczepialnych stabilizowanych topoizomerazą I na 75 Agnieszka Kareńko matrycowym DNA, które ulega transkrypcji. Skutkiem jest nagromadzenie białka p53 i indukcja białka p21 z równoczesnym aktywowaniem apoptozy przez Bax. Co ciekawe inhibitory te działają skuteczniej, w momencie występowania wysokiego stężenia topo I, co może stanowić cel terapii przeciwnowotworowej przeciwko nowotworowi złośliwemu jajnika, jelita grubego czy przełyku, gdzie stwierdzono podwyższony poziom tego enzymu [10]. 3.2.2. Działanie inhibitorów katalitycznych Inhibitory katalityczne wiążą się z regionem ATPazowym enzymu w chwili, gdy topoizomeraza przyłączy się do DNA. Nie dochodzi do uwolnienia cząsteczki ATP i nici DNA, gdyż uniemożliwione jest rozsunięcie podjednostek enzymu. Powstaje tak zwana zamknięta klamra zbudowana z elementów cząsteczki enzymu, gdzie w jej środku znajduje się cząsteczka DNA. Unieruchomiona topoizomeraza nie może zapoczątkować kolejnej reakcji enzymatycznej. Konsekwencją są zaburzenia w kondensacji chromatyny i segregacji chromosomów. Powstają liczne podwójne pęknięcia DNA oraz uszkodzenia strukturalne, które prowadzą do śmierci komórek [10, 11]. 4. Zastosowanie inhibitorów w terapii przeciwnowotworowej Leki przeciwnowotworowe inaczej cytostatyki możemy podzielić na: leki alkilujące, inhibitory mitozy, antymetabolity czy inhibitory topoizomeraz. W ostatnich latach szerokim zainteresowaniem objęto inhibitory topoizomeraz [1]. Reprezentują one jedną z najliczniejszych i najefektywniejszych grup chemioterapeutyków wykorzystywanych do leczenia nowotworów między innymi takich jak: nowotwór złośliwy jajnika, piersi, żołądka, płuc, czerniaka i wielu innych [10]. 4.1. Topotekan Półsyntetyczna pochodna kamptotecyny jest rozpuszczalna w wodzie stosowana od roku 1996 w leczeniu raka piersi, czy drobnokomórkowego raka płuc. Jej okres półtrwania jest dużo niższy w porównaniu do innych analogów kamptotecyny, co skutkuje brakiem akumulacji leku w organizmie. Mechanizm topotekanu, tak jak innych pochodnych kamptotecyny polega na stabilizacji kompleksu rozszczepialnego i generacji pęknięć DNA. Topotekan jest szczególnie stosowany w przypadku, gdy występuje oporność na cisplatynę. Najnowsze badania wykazują właściwości radiouczulające topotekanu. W literaturze można odnaleźć badania, które były prowadzone na małej grupie kobiet z rakiem szyjki macicy dowiodły, że stosowanie topotekanu 76 Zastosowanie inhibitorów topoizomeraz DNA w terapii przeciwnowotworowej w połączeniu z paklitakselem daje aż 54% pozytywną odpowiedź wśród badanych. Doszło do całkowitej lub częściowej remisji lub zatrzymaniu postępu choroby. Terapia ta obecnie jest w fazie III badań klinicznych [5,10,16÷17]. 4.2. Irinotekan Powszechnie stosowany chemioterapeutyk, inaczej zwany CPT-11, który jest kolejną pochodną kamptotecyny. Jego działanie przeciwnowotworowe wykazano w leczeniu szerokiej gamy nowotworów np. żołądka, trzustki, nerek, czy nowotworów złośliwych głowy i szyi poprzez wpływ na stabilizację kompleksu rozszczepialnego. Jednak najlepszy efekt cytostatyczny wykazano przy chemioterapii przeciw nowotworowi jelita grubego oraz drobnokomórkowym i niedrobnokomórkowym raku płuc. Jest to pierwszy lek, który wykazuje efekt pozytywny u pacjentów, którzy wcześniej przyjmowali 5-fluorouracyl (5-FU) lub kwas folinowy (FA), nawet, gdy pierwotna terapia była nieskuteczna. Pozytywne wyniki badań II fazy klinicznych oraz brak reakcji krzyżowej między chemioterapeutykami dały przesłanki do sprawdzenia leku skojarzonego z CPT-11, FA i 5-FU w leczeniu przerzutowego raka jelita grubego. Badania III fazy klinicznej wykazały skuteczność preparatów skojarzonych, u 39% badanych doszło do całkowitej lub częściowej remisji w porównaniu do próby kontrolnej leczonej samymi FA i 5-FU. Wyniki tych badań dały podstawy do kolejnych badań nad lekami skojarzonymi z CPT-11 [10, 14÷16]. 4.3. Lurtotekan Jest to pochodna kamptotecyny, rozpuszczalna w wodzie. Obecnie prowadzone są badania kliniczne. Lurtotekan przeszedł pomyślnie II fazę badań klinicznych w odniesieniu do nowotworów takich jak: rak jajnika, czy nowotwory głowy i szyi. Jego podawanie w kapsułkach liposomowych zwiększa okres półtrwania i wydłuża efekt terapeutyczny [5]. 4.4. Edotokaryna Jest to inhibitor wpływający na topoizomerazę I. Edotokaryna (J-107088) obecnie jest na wczesnym etapie II fazy badań mających na celu ustalenie dawki bezpiecznej w połączeniu z 5-FU i leukoworyną (LV). Grupę badaną stanowiło 14 pacjentów z guzami litymi. Jak się okazało wszystkie skutki uboczne sprowadzały się do spadku liczby granulocytów obojętnochłonnych. Lek wykazał efekt cytotoksyczny wobec guzów litych wątroby. Niestety z uwagi na silne działanie powodujące neutropenię inhibitor nie uzyskał pozytywnych rekomendacji [17]. 77 Agnieszka Kareńko 4.5. Etopozyd Związek ten jest pochodną epidofilotoksyny, który nie interkaluje z DNA. Jego działanie polega na związaniu się z kompleksem DNA-topo IIα. Szeroko stosowany jest przy leczeniu nowotworów mózgu, czy chłoniaków. Jedne z najnowszych badań wskazują na możliwości zahamowania proliferacji i syntezy materiału genetycznego komórek nowotworowych prostaty za pomocą etopozydu przy udziale androgenu. Inne badania pokazują, że stosowanie tego inhibitora wraz z cisplatyną daje zaskakujące pozytywne wyniki w leczeniu wielu nowotworów. Efekt ten zauważalny jest również w przypadku, gdy pacjenci wcześniej byli oporni na działanie cisplatyny. Daje to nowe szanse dla pacjentów, którzy z uwagi na ciężkie zaburzenia pracy serca i wątroby nie mogą przyjmować antybiotyków antracyklinowych [9,16]. 4.6. Genisteina Jeden z najbardziej znanych izoflawonów, występujący w soi. Od dawna stosowana w zapobieganiu nowotworów piersi i prostaty. Obecne badania wskazują że ma działanie podobne do etopozydu, a dodatkowo udowodniono, że potęguje aktywność cytotoksyczną cisplatyny i doksorubicyny. Jej mechanizm polega na wpływie na topoizomerazę II. Jednakże istnieją też wyniki badań mówiące o tym, że dieta bogata w ten izoflawonoid spożywana przez kobiety w ciąży może zwiększyć ryzyko ostrych białaczek szpikowych, które stanowią ponad 15% wszystkich białaczek u niemowląt [5,13]. 4.7. ICRF-187 Inhibitor ten potocznie znany jest jako deksrazoksan interkaluje z cząsteczką topoizomerazy II z domeną ATPazową tworząc zamkniętą klamrę, co uniemożliwia wyswobodzenie nici DNA generując poważne uszkodzenia w materiale genetycznym. Obecnie prowadzone są badania nad użyciem ICRF-187, jako środka kardioochronnego przy leczeniu nowotworów antybiotykami antracyklinowymi. Związek ten obniża częstość występowania kradiomiopatii poantracyklinowej, co pozwala na stosowanie wyższych stężeń tych antybiotyków. Innym ważnym aspektem stosowania ICRF-187 jest zwiększane efektu terapeutycznego w leczeniu raka piersi za pomocą doksorubicyny, 5-fluorouracyly i cyklofosfamidu poprzez spowolnienie wystąpienia oporności wielolekowej. Co ciekawe, działanie ICRF-187 ogranicza się jedynie to inhibitorów topoizomerazy II. Obecnie istnieją przesłanki, aby zastosować deksrazoksan przy leczeniu nowotworów mózgu za pomocą etopozydu, czy tenipozydu. ICRF-187 działa antagonistycznie w stosunku 78 Zastosowanie inhibitorów topoizomeraz DNA w terapii przeciwnowotworowej to etopozydu. Efekt ten wyraża się mniejszym stężeniem kompleksów rozszczepialnych inhibitor-enzym-DNA, które działają cytotoksycznie. Niestety deksrazoksan nie przenika bariery krew-mózg, dlatego jego stosowanie ogranicza się do obszarów poza ośrodkowym układem nerwowym [11]. 4.8. Aklarubicyna Antybiotyk antracyklinowy, który w porównaniu do doksorubicyny czy daunorubicyny wykazuje mniej działań niepożądanych. Stosowany przy leczeniu białaczek szpikowych i nowotworów układu chłonnego. Jego działanie polega na zmniejszeniu powinowactwa enzymu do DNA, poprzez wiązanie się z nicią DNA i redukowaniu liczby skrętów superhelikalnych. W konsekwencji chromatyna zostaje pofragmentowana, a komórka obumiera [9]. 5. Podsumowanie Inhibitory topoizomeraz I i II stanowią ogromną pulę chemioterapeutyków i odgrywają znaczącą rolę w walce z chorobami nowotworowymi. Obecnie poszukuje się zarówno nowych substancji jako inhibitorów oraz koniugowanych terapii na podstawie już istniejących substancji. Stosowanie cytostatyków różnych grup daje większą szansę na całkowite wyleczenie pacjenta. Dlatego tak ważne jest, aby poszerzać wiedzę w tym zakresie, tym samym przyczyniając się do zapobiegania tak poważnych schorzeń jakimi są nowotwory. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. Ma N., Wang Y., Zhao B. X., Ye W. C., Jiang S., The application of click chemistry in the synthesis of agents with anticancer activity, Drug Desing, Development and Therapy, 9 (2015), s. 1585-1599 Sosińska-Mielcarek K., Jassem J., Predykcyjna rola ekspresji topoizomerazy IIα w chemioterapii raka piersi z udziałem antracyklin, NOWOTWORY Journal of Oncology, 55 (2005), s. 252-256 Balańa-Fouce R., Álvarez-Velilla R., Fernández-Prada Ch., García-Estrada C., Reguera R. M., Trypanosomatids topoisomerase Re-visited. New structural findings and role in drug Discovery, International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistane, 4 (2014), s. 326-337 Terekhova K., Marco J. F., Mondragón A., Studiem of bacterial topoisomerases I and III at the single molecule level, Biochemical Society Translactions, 41 (2013), s. 571-575 Hyz K., Spektroskopia NMR inhibitorów pochodzenia naturalnego topoizomerazy I i II - praca doktorska, (2011), s. 29-32, 40-59 79 Agnieszka Kareńko 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Szafran M., J. Zakrzewska-Czerwińska, Jakimowicz D., Bakteryjne topoizomerazy typu I – rola biologiczna i zastosowanie jako potencjalnych celów dla antybiotyków*, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 67 (2013), s. 130-142 Nitiss J.L., DNA topoisomerase II its growing repertoire of biological functions, Nature Reviews Cancer, 9 (2009), s. 327-337 Pendleton MJ., Lindley R. H. Jr., Felix C. A., Grimwade D., Osheroff N., Topoisomerase II and leukemia, Annals of the New York Academy of Sciences, 1310 (2013), s. 98-110 Lepiarczyk M., Bielawska A., Sosnowska K., Bielawski K., Ludzka topoizomeraza typu II jako molekularny punkt uchwytu leków przeciwnowotworowych, Gazeta Farmaceutyczna, 4 (2011), s. 24-26 Omyła-Staszewska J., Deptała A., Inhibitory topoizomerazy I – unikalna grupa leków przeciwnowotworowych, Współczesna Onkologia, 7 (2003), s. 45-53 Kik K., Szmigiero L., Deksrazoksan (ICRF-187) – czynnik kardioochronny i modulator działania niektórych leków przeciwnowotworowych, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 60 (2006), s. 584-590 Grabina G. L., Senapedis W., McCauley D., Baloglu E., Shacham S., Festuccia C. , Nucleo-cytoplasmic transport as a therapeutic target of cancer, Journal of Hematology and Oncology 7 (2014), s. 1-9 Spector L. G., Xie Y., Robison L. L., Heerema N. A., Maternal diet and infant leukemia: the DNA topoisomerase II inhibitor hypothesis: a report from the children's oncology group, Cancer Epidemiol Biomarkers Previous, 14 (2005), s. 651-655 Leśniewski-Kmak K., Chemioterapia zaawansowanego raka jelita grubego z zastosowaniem irinotekanu, Współczesna Onkologia, 10 (2006), s. 133-135 Coiffier B., Federico M., Caballero D., Dearden C., Morschhauser F., Jäger U., Trümper L., Zucca E., Gomes da Silva M., Pettengell R., Weidmann E., d’Amore F., Tilly H., Zinzani P. L., Therapeutic options in relapsed or refractory peripheral T-cell lymphoma, Cancer Treatment Rewievs, 40 (2014), s. 1080-1088 Chan B. A., Howard J. I. G., Chemotherapy advances in samll-cell lung cancer, Journal of Thoracic Disease, 5 (2013), s. 565-578 Saif M. W., Sellers S., Diasio R. B., Douillard J. Y., A phase I dose-escalation study of edotecarin (J-107088) combined with infusional 5- fluorouracil and leucovorin in patients with advanced/metastatic solid tumors, Anticancer Drugs, 21 (2010), s. 716-723 80 Zastosowanie inhibitorów topoizomeraz DNA w terapii przeciwnowotworowej Zastosowanie inhibitorów topoizomeraz DNA w terapii przeciwnowotworowej Streszczenie Choroby nowotworowe obejmują coraz szerszą grupę ludzi. Stosowane strategie leczenia nie dają gwarancji, że choroba nie powróci. Jednocześnie obarczone są one wieloma efektami ubocznymi. Często zdarza się, iż pacjenci w wyniku stosowanej np. chemioterapii umierają z powodu problemów kardiologicznych. Z tych powodów poszukuje się skutecznych sposobów walki z nowotworami. Topoizomerazy to rodzina enzymów biorąca udział w wielu ważnych dla komórki procesów jak replikacja czy transkrypcja. Oprócz tego odgrywają ważną rolę w kondensacji chromatyny oraz rozdziale chromatyd siostrzanych do przeciwległych biegunów komórki. Z uwagi na budowę i mechanizm działa można je podzielić na dwie klasy: I i II. Topoizomerazy I nie wymagają ATP i tną tylko jedną nić DNA. Topoizomerazy II mają zdolność do przecięcia obydwóch nici DNA, a co się z tym wiąże wymagają energii z hydrolizy ATP. Sposób działania topoizomeraz i procesy, w których biorą udział stały się celem terapii przeciwnowotworowych. w chemioterapii stosuje się substancję powoduję inhibicję topoizomeraz. Inhibitory topoizomeraz podzielono na dwie grupy: trucizny kompleksów rozszczepialnych i inhibitory katalityczne. Pierwsze stabilizują kompleks enzym-DNA, uniemożliwiając ruch widełek replikacyjnych i naprawę powstałych uszkodzeń DNA. Komórki wówczas nie proliferują i kierowane są na drogę apoptozy. Mechanizm działania inhibitorów katalitycznych polega na blokowaniu domen wiążących ATP, tym samym nić DNA zostaje objęta klamrą, wówczas nie może być uwolniona. Dochodzi do licznych pęknięć chromosomów, nieprawidłowego rozdziału materiału genetycznego i w konsekwencji śmierci komórek. W poniższej pracy zaprezentowano kilka zastosowań wybranych inhibitorów topoizomeraz. Z uwagi na stosowanie dużej liczby substancji hamujących działanie topoizomeraz w leczeniu wielu nowotworów. Słowa kluczowe: topoizomerazy DNA, inhibitory topoizomeraz, trucizny kompleksu rozszczepialnego, terapia przeciwnowotworowa 81 Maria Misiorek1, Alina Owsiak2 Terapeutyczne zastosowanie cytokin Skuteczna odpowiedź immunologiczna wymaga współdziałania limfocytów, komórek hematopoetycznych oraz komórek uczestniczących w reakcjach zapalnych. W złożonych interakcjach pomiędzy nimi pośredniczą cytokiny, określane często jako hormony układu odpornościowego. Cytokiny są to niskocząsteczkowe białka lub glikoproteiny wytwarzane przez leukocyty i inne typy komórek i biorące udział w takich procesach, jak: proliferacja, różnicowanie czy migracja komórek. Szersze zastosowanie cytokin w praktyce klinicznej stało się możliwe dzięki produkcji cytokin na masową skalę w pro- lub eukariotycznych systemach ekspresji rekombinowanych białek, np. w bakteriach (Escherichia coli), drożdżach (Saccharomyces cerevisie)lub komórkach jajników chomika. Obecnie prowadzone są liczne badania nad opracowaniem bezpiecznych i efektywnych terapii z udziałem cytokin, szczególnie w łagodzeniu ostrych lub przewlekłych stanów zapalnych, leczeniu nowotworów, chorób zakaźnych i alergii oraz w leczeniu immunosupresyjnym po transplantacji narządów. Celem niniejszej pracy był krótki przegląd cytokin stosowanych w immunoterapii, z uwzględnieniem ich skuteczności terapeutycznej. 1. Interferony Interferony są cytokinami, które wykazują silne działanie przeciwwirusowe, antyproliferacyjne i immunomodulujące. Zostały odkryte w 1957 roku przez A. Isaacsa i J. Lindenmanna. Komórki ludzkie wytwarzają trzy typy interferonów: I, II i III, zaklasyfikowane na podstawie wiązania ich do swoistych heterodimerycznych receptorów transbłonowych. Do typu I zaliczane są interferony: α, β, ε, κ i ω działające przez receptory IFNAR[1]. Do typu II należy tylko interferon γ wiążący się z IFNGR [2]. Natomiast, typ III obejmuje cztery interferony λ (IFN-λ1-4), które działają przez receptor zbudowany z długiego łańcucha IFN-λR1 i krótkiego łańcucha IL-10R2, który jest wspólny dla receptora interleukin: IL10, IL-22 i IL-26 [3]. 1 [email protected], Pracownia Chemii Bioorganicznej, Wydział Chemiczny, Politechnika Rzeszowska im I. Łukasiewicza, www.prz.edu.pl 2 [email protected], Katedra Biochemii i Biologii Komórki, Uniwersytet Rzeszowski, www.ur.edu.pl 82 Terapeutyczne zastosowanie cytokin Spośród wszystkich cytokin interferony mają największe znaczenie terapeutyczne. Wskazania kliniczne do ich stosowania zestawiono w tabeli 1. Tabela 1. Wskazania kliniczne do stosowania interferonów [4] Typ interferonu IFN-α Wskazania kliniczne Białaczka włochatokomórkowa Szpiczak mnogi Przewlekła białaczka szpikowa Chłoniak grudkowy T-komórkowe chłoniaki skórne Mięsak Kaposiego Czerniak złośliwy Rak nerki Rak wątroby Kłykciny kończyste Przewlekłe zapalenie wątroby typu B Przewlekłe zapalenie wątroby typu C IFN-β Stwardnienie rozsiane IFN-γ Przewlekła choroba ziarniniakowa IFN-λ Przewlekłe zapalenie wątroby typu C 1.1. Interferon α (IFN-α) Organizm ludzki wytwarza 13 podtypów interferonów α, kodowanych przez 13 genów zlokalizowanych na krótkim ramieniu chromosomu 9 [5]. Ich łańcuchy polipeptydowe zbudowane są z 165-166 aminokwasów. Najwyższą ekspresję IFN-α stwierdzono w plazmacytoidalnych komórkach dendrytycznych. Wellferon jest naturalnym interferonem α otrzymywanym z ludzkich komórek limfoblastycznych, stymulowanych wirusem Sendai. W preparacie tym dominuje IFN-α1. Interferony o nazwie handlowej Roferon-A (IFN-α-2a) i Intron A (IFN-α-2b) są rekombinowanymi białkami, które różnią się między sobą rodzajem aminokwasu w pozycji 24. W Roferonie A występuje lizyna, natomiast w Intronie A – arginina. Interferon α jest produkowany w dwóch formach: klasycznej (IFN-α) i pegylowanej (PegIFN-α), która ma dołączaną cząsteczkę glikolu poli-etylenowego. Pegylacja hamuje wydalanie interferonu przez nerki, poprawiając efektywność terapeutyczną preparatu. Ze względów ekonomicznych 83 Maria Misiorek, Alina Owsiak w większości krajów, zwłaszcza rozwijających się, pacjentom podawany jest zwykły, niepegylowany interferon α (np. w Chinach – około 80%). Interferon α wykorzystuje się w leczeniu przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu B, C i D, a także w zakażeniach narządów płciowych ludzkim wirusem brodawczaka (HPV). Po zastosowaniu terapii interferonem α, tylko u 30-40% pacjentów z przewlekłym zapaleniem wątroby typu B następowała serokonwersja [6]. Molekularny mechanizm braku klinicznej odpowiedzi niektórych pacjentów na leczenie interferonemnie został dotychczas poznany [7,8].Pegylowany interferon α w skojarzeniu z rybawiryną jest stosowany w terapii 2-lekowej przewlekłego zapalenia wątroby typu C. Trwałą odpowiedź przeciwwirusową na taki schemat leczenia uzyskuje około 40-50% pacjentów z genotypem 1 wirusa HCV, natomiast z genotypem 2 i 3 - 80% [9]. W celu zmniejszenia prawdopodobieństwa lekooporności, wraz z PegINF-α i rybawiryną podawane są inhibitory proteaz, co umożliwia uzyskanie trwałej odpowiedzi przeciwwirusowej u 63-92% chorych [9]. Pegylowane interferony: α-2a (Pegasys) i α-2b (PegIntron) stosowano w leczeniu przewlekłego zapalenia wątroby typu D, wywoływanej defektywnym, niekompletnym wirusem delta, który do swojej replikacji wymaga obecności wirusa HBV. Po 12-miesięcznej terapii nie stwierdzono RNA HDV lub RNA i DNA obu wirusów u 32% pacjentów [10]. Wszystkie rodzaje interferonow α były jednakowo skuteczne w leczeniu kłykcin kończystych (brodawek narządów płciowych), jednak interferon podany miejscowo (iniekcje doogniskowe) działał znacznie szybciej, niż podany ogólnie (podskórnie lub domięśniowo) [11]. Interferon α znalazł także zastosowanie w terapii złośliwych nowotworów. Obecnie wykorzystywany jest w leczeniu białaczki włochatokomórkowej, przewlekłej białaczki szpikowej, raka nerki i czerniaka złośliwego. U pacjentów z białaczką włochatokomórkową IFN-α powodował polepszenie, a nawet całkowitą normalizację morfologii krwi: następowała redukcja cytopenii i eliminacja nieprawidłowych limfocytów B [12]. Przewlekła białaczka szpikowa charakteryzuje się wzrostem liczby granulocytów i zaczyna się od wolno przebiegającej fazy przewlekłej, która przekształca się w fazę przyśpieszenia i kończy się fazą wyniszczenia, która jest zwykle oporna na leczenie. Badania kliniczne dowodzą skuteczność stosowania IFN-α w fazie przewlekłej (wykazano odpowiedź na leczenie u 70% chorych), w tym u 20% pacjentów nastąpiła kompletna remisja choroby [13].Począwszy od końca 1980 roku, interferonα uznano za podstawę leczenia miejscowo zaawansowanego lub przerzutowego raka nerki. Obecnie, ze względu na niski całkowity odsetek odpowiedzi (12%) i znaczną toksyczność, interferon α podawany jest w połączeniu z nowszymi lekami anty-angiogennymi (bewacyzumab, temsyrolimus, talidomid). Jednak, 84 Terapeutyczne zastosowanie cytokin pacjentom nadal może być zalecana monoterapia interferonem α, gdy inhibitory angiogenezy nie są dostępne lub są przeciwwskazane [14]. W randomizowanym badaniu z udziałem INF-α w leczeniu czerniaka złośliwego wykazano, że ma on istotny wpływ na wydłużenie okresu remisji choroby(z 1 do 1,7 lat) oraz na czas całkowitego przeżycia(z 2,8 do 3,8 lat) w grupie chorych na czerniaka w II i III stopniu zaawansowania klinicznego po leczeniu chirurgicznym[15]. W terapii skojarzonej IFN-α2a z pochodnymi kwasu retinowego następowała regresja zaawansowanej postaci raka płaskonabłonkowego skóry oraz raka szyjki macicy [16, 17]. Ponadto, interferon hamował migrację i proliferację komórek śródbłonka naczyń, znajdując zastosowanie w terapii naczyniaków [18]. Podczas terapii interferonem α mogą występować objawy niepożądane, takie jak: zespół grypopodobny, supresja szpiku kostnego, brak apetytu, retinopatia, zaburzenia neuropsychiatryczne. 1.2. Interferon β (IFN-β) Ludzki interferon β jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej 22,5 kDa i jest zbudowany z 166 aminokwasów. Kodowany jest przez gen zlokalizowany na chromosomie 9. Wytwarzają go głównie fibroblasty. Obecnie komercyjnie dostępne są dwa rodzaje preparatów rekombinowanego interferonu β: IFN-β-1a i IFN-β-1b. IFN-β-1a (domięśniowy Avonex i podskórny Rebif) produkowany jest przez linie komórek jajników chomika i jest prawie identyczny z naturalnym interferonem β. IFN-β-1b (Betaferon/Betaseron i Extavia) jest produkowany w komórkach bakteryjnych E. coli, jest krótszy o jeden aminokwas od IFN-β-1a i nie jest glikozylowany [19]. Ponadto, interferon β-1b ma serynę zamiast cysteiny w pozycji 17 [20]. Soluferon jest chemicznie modyfikowanym IFN-β, w którym osiem aminokwasów hydrofobowych i jedna cysteina zostały zastąpione przez hydrofilowe reszty seryny, w wyniku czego hydrofobowość została zredukowana, a dostępność biologiczna w porównaniu z naturalnym interferonem β wzrosła 6-krotnie. Rekombinowany IFN-β jest stosowany w leczeniu ustępująconawracającej postaci stwardnienia rozsianego (MS) u dzieci powodując zmniejszenie liczby nawrotów oraz zaostrzeń choroby [21]. Objawy niepożądane w czasie leczenia interferonem β są podobne jak u chorych leczonych interferonem α. 85 Maria Misiorek, Alina Owsiak 1.3. Interferon γ (IFN-γ) Ludzki interferon γ ma masę cząsteczkową 45 kDa i jest zbudowany z 146 aminokwasów. Jest kodowany przez gen zlokalizowany na chromosomie 12 i posiadający trzy introny. Jest wytwarzany przede wszystkim przez limfocyty pomocnicze typu 1 (Th1), limfocyty cytotoksyczne CD8+, komórki NK, ale także przez limfocyty B, limfocyty NKT, profesjonalne komórki prezentujące antygen (APC) [22]. Actimmune jest rekombinowanym ludzkim interferonem γ-1b, produkowanym przez komórki E. coli. Łańcuch polipeptydowy IFN-γ-1b zbudowany jest ze 140 aminokwasów i jest krótszy o trzy aminokwasy od naturalnego IFN-γ. Nie jest on glikozylowany. Ponadto, posiadana swoim N-końcu metioninę, podczas gdy w naturalnym interferonie γ N-końcowy aminokwas jest zablokowany piroglutaminianem. Rekombinowany IFN-γ1b jest wykorzystywany w terapii przewlekłej choroby ziarniniakowej (ang. chronic granulomatous disease - CGD), która ma związek z upośledzoną zdolnością fagocytów do zabijania bakterii. Pacjenci z CGD podatni są na nawracające zakażenia spowodowane przez liczne bakterie (Staphylococcus aureus, Klebsiella, Pseudomonas i in.) oraz grzyby (Aspergillus, Candida). W randomizowanych badaniach klinicznych stwierdzono, że rekombinowany IFN-γ znacząco redukuje częstość występowania ciężkich zakażeń u pacjentów z CGD, lecz nie zwiększa produkcji reaktywnych form tlenu w fagocytach, jak wcześniej sądzono [23]. Actimmune stosowany jest także w leczeniu uwarunkowanej genetycznie choroby Albersa-Schönberga (osteopetrozy), która charakteryzuje się zaburzeniami funkcji osteoklastów oraz zmniejszeniem produkcji anionorodnika ponadtlenkowego przez leukocyty. Terapia rekombinowanym interferonem γ nasilała resorpcję kości i hematopoezę oraz poprawiała funkcje leukocytów [24]. Rekombinowany IFN-γ wykazuje działanie antyproliferacyjne, antynaczyniotwórcze i proapoptotyczne. Stwierdzono, że w wyniku działania interferonu γ następuje hamowanie wzrostu komórek rakowych, rozpoznanie i eliminacja ich przez komórki odpowiedzi immunologicznej. Po raz pierwszy zastosowano go do leczenia przewlekłej białaczki szpikowej, samodzielnie i w połączeniu z rekombinowanym IFN-α, jednak nie wykazano żadnych znaczących pozytywnych efektów. Interferon γ był również wykorzystywany w terapiach różnych nowotworów złośliwych, takich jak: rak pęcherza, rak jajnika, T-komórkowa białaczka/chłoniak dorosłych [25].Interferon γ wprowadzony do pęcherza moczowego zapobiegał nawrotom choroby, powodując znaczące zwiększenie liczby limfocytów T i komórek NK. W randomizowanych badaniach fazy III pacjentkom z rakiem jajnika interferon γ podawano podskórnie w połączeniu 86 Terapeutyczne zastosowanie cytokin z cisplatyną. Całkowita odpowiedź kliniczna na leczenie wyniosła 68%, a średni czas przeżycia wolnego od postępu choroby – 48 miesięcy. Ze względu na możliwą do zaakceptowania toksyczność, IFN-γ może być używany jako lek pierwszego rzutu w raku jajnika. Interferon γ został zarejestrowany w Japonii jako lek na T-komórkową białaczkę dorosłych, który może indukować trwałą remisję choroby [25].Jednak, w zależności od specyficzności i składników mikrośrodowiska guza, a także od intensywności przekazywania sygnałów w komórce, IFN-γ może wykazywać także działanie pro-nowotworowe, które obejmuje sygnały proliferacyjne i przeciwapoptyczne, w wyniku czego komórki rakowe unikają rozpoznania i cytolizy przez cytotoksyczne limfocyty T i komórki NK [26]. Ze względu na podwójny mechanizm działania, leczenie nowotworów interferonem γ powinno być ustalane indywidualnie dla każdego pacjenta. Najczęściej występującymi działaniami niepożądanymi podczas terapii interferonem γ są objawy grypopodobne, takie jak: gorączka, dreszcze, bóle mięśni i głowy oraz zmęczenie i nudności. 1.4. Interferon λ (IFN-λ) Interferony λ kodowane są przez cztery geny zlokalizowane na długim ramieniu chromosomu 19. IFN-λ1-4 wykazują podobieństwo w sekwencji aminokwasowej (41-97% aminokwasów konserwatywnych), zwłaszcza w pierwszej i ostatniej helisie α, które biorą udział w oddziaływaniu z białkiem receptorowym IFN-λR1. Na chwilę obecną interferon λ nie jest zarejestrowany i powszechnie dostępny jako lek, jednak przeszedł on pozytywnie badania podstawowe, przedkliniczne oraz kliniczne I i II fazy, a obecnie w wielu ośrodkach klinicznych prowadzona jest faza III badań. Spośród wszystkich czterech interferonów λ najsilniejsze działanie przeciwwirusowe ma IFN-λ1.Badania in vitro wykazały, że IFN-λ1 hamuje namnażanie wirusów HBV i HCV w modelach replikacyjnych. Działanie przeciwwirusowe IFN-λ1 jest słabsze, niż IFN-α. Jednak wspólne użycie tych interferonówzwiększa skuteczność redukcji wirusowego RNA. Stwierdzono również, że interferony λ1 i γ działają synergistycznie, takie połączenie jest bardziej skuteczne w eliminacji wirusa HCV, niż stosowanie samego IFN-α [27]. W fazie Ib badań klinicznych nad zastosowaniem pegylowanego IFN-λ1 w leczeniu przewlekłego zapalenia wątroby typu C u osób z genotypem 1 wirusa HCV stwierdzono, że interferon ten jest dobrze tolerowany i daje małe działanieuboczne. Ze względu na krótki okres badania (4 tygodnie) nie wykazano stanu trwałej odpowiedzi przeciwwirusowej, jednak 87 Maria Misiorek, Alina Owsiak u większości pacjentów liczba wirusowego RNA zmalała. Badania te wskazują, że pegylowanyIFN-λ1może być alternatywą dla leczenia chorych z przewlekłym zapaleniem wątroby typu C [28, 29]. W fazie III badań klinicznych wyznaczono zalecaną dawkę IFN-λ1ana 180 mg. Interferon ma być podawany w połączeniu z rybawiryną oraz lekiem działającym bezpośrednio na wirusy, a długość całego okresu leczenia zależy od genotypu wirusa HCV (24-48 tygodni u chorych z genotypem wirusa 1 i 4 oraz 12-24 tygodni - z genotypem 2 i 3) [30, 31]. Pegylowany interferon λ, w przeciwieństwie do interferonu α, był dobrze tolerowany i powodował znacznie mniej działań niepożądanych, np. u pacjentów nie występowała toksyczność hematologiczna. 2. Interleukiny (IL) Intrerleukina-2 (IL-2)została odkryta w 1975 roku jako czynnik wzrostowy dla limfocytów T. Jest ona glikoproteiną o masie cząsteczkowej ok. 15 kDa. Gen kodujący IL-2 u człowieka jest zlokalizowany na chromosomie 4. IL-2 jest cytokiną o silnym działaniu immunoregula-cyjnym wobec efektorowych i regulatorowych limfocytów T, komórek NK i NKT. W badaniach przedklinicznych interleukinę-2 stosowano w leczeniu takich nowotworów, jak: czerniak złośliwy, rak prostaty, nerwiak płodowy oraz rak wątroby [32]. Po raz pierwszy naturalna IL-2 otrzymana z prawidłowych, pobudzonych limfocytów T została zastosowana w roku 1983 do leczenia czerniaka złośliwego, jednak małe dawki nie pozwoliły na uzyskanie efektu terapeutycznego. Otrzymanie rekombinowanej IL-2 pozwoliło na opracowanie wysokodawkowanej dożylnej terapii tym preparatem. Komercyjnie dostępny preparat Aldesleukin jest rekombinowaną ludzką interleukiną-2, w której występuje pojedyncza modyfikacja reszty aminokwasowej w pozycji 125 oraz brakuje alaniny na końcu aminowym łańcucha polipeptydowego. Obecnie IL-2 ma dwa główne zastosowania: w leczeniu raka nerki i czerniaka oraz w immunoterapii pacjentów z HIV [33].W rozsianym raku nerki całkowitą odpowiedź na leczenie wykazano u 15-20% pacjentów, jednak skutkiem terapii były poważne toksyczne uszkodzenia wszystkich życiowo ważnych narządów. Interleukina-12 (IL-12) jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej 75 kDa. Jest heterodimerem zbudowanym z dwóch podjednostek (35 i 40 kDa) połączonych mostkiem dwusiarczkowym. IL-12 została zidentyfikowana i oczyszczona z supernatantów ludzkich komórek limfoblastycznych przez dwa niezależne zespoły badawcze i była początkowo opisana jako „czynnik dojrzewania limfocytów cytotoksycznych” oraz „czynnik stymulujący 88 Terapeutyczne zastosowanie cytokin komórki NK” [34]. Głównym źródłem IL-12 w organizmie ludzkim są monocyty/makrofagi oraz limfocyty B. Interleukina-12 odgrywa kluczową role w regulacji wrodzonych i nabytych reakcji immunologicznych, może działać samodzielnie lub synergicznie wraz z innymi cytokinami, wykazując silne działanie przeciwnowotworowe iimmunoregulacyjne Mechanizm terapeutycznego działaniainterleukiny-12 polega na indukcji ekspresji endogennego interferonu γ, który m. in. pobudza ekspresję cząsteczek MHC klasy Ii II umożliwiając prezentację antygenów nowotworowych oraz indukuje różnicowanie limfocytów pomocniczych Th w kierunku limfocytów Th1. Rekombinowana ludzka interleukina-12 jest stosowana w przeciwnowotworowej terapii skojarzonej z innymi interleukinami. IL-2 i IL-12 mogą działać synergistycznie. Synergizm znacząco wpływa na wzrost biologicznych efektów każdej poszczególnej cytokiny. W I fazie badań klinicznych nad czerniakiem i rakiem nerki chorzy otrzymywali interleukinę-12 wraz z niskimi dawkami interleukiny-2. Terapia ta była dobrze tolerowana i charakteryzowała się szybkim ustępowaniem toksyczności, objawami której są: gorączka, dreszcze, niedokrwistość, zmęczenie, nudności lub wymioty oraz nadciśnienie ortostatyczne [35]. Połączenie tych dwóch interleukin powodowało znaczącą ekspansję komórek NK oraz znaczący wzrost ekspresji INF-γ i indukowanego przez niego białka IP-10, które są kluczowymi immunomodulującymi cytokinami biorącymi udział w regulacji unaczynienia guza [36]. Inretleukina-11 (IL-11) jest trombopoetycznym czynnikiem wzrostu, który stymuluje proliferację hematopoetycznych komórek macierzystych oraz komórek progenitorowych megakariocytów, indukuje dojrzewanie megakariocytów, zwiększając produkcję trombocytów. Oprócz tego reguluje wzrost nabłonka jelitowego, hamuje adipogenezę, indukuje syntezę białek ostrej fazy oraz hamuje produkcję cytokin prozapalnych przez makrofagi. Oprelvekin jest rekombinowaną ludzkąIL-11, która produkowana jest w komórkach E. coli. Jej łańcuch polipeptydowy zbudowany jest ze 177 aminokwasów i w porównaniu z naturalną IL-11 jest krótszy o jeden aminokwas – prolinę na aminowym końcu łańcucha.Rekombinowana IL-11 stosowana jest jako lek zapobiegający trombocytopenii u chorych na nieszpikowe nowotwory złośliwe, po przebytej terapii lekami o działaniu mielosupresyjnym, w wyniku czego zmniejsza się zapotrzebowanie na transfuzje trombocytów [37]. 89 Maria Misiorek, Alina Owsiak 3. Hematopoetyny Czynniki krwiotwórcze stanowią grupę cytokin odpowiedzialnych za wzrost i dojrzewanie komórek progenitorowych odpowiednich krwinek. Biorą również udział w modulowaniu odpowiedzi immunologicznej. Do tej grupy zaliczane są: erytropoetyna (EPO), czynnik komórek macierzystych (SCF) oraz czynniki stymulujące tworzenie kolonii: granulocytów (G-CSF), makrofagów (M-CSF), granulocytów i makrofagów (GM-CSF). 3.1. Erytropoetyna Erytropoetyna jest jednym z głównych regulatorów erytropoezy. Stymuluje proliferację i różnicowanie komórek progenitorowych erytrocytów i megakariocytów [38]. Około 80% erytropoetyny jest produkowane w nerkach, w warunkach znacznego niedotlenienia, natomiast reszta – w wątrobie [39]. Erytropoetyna była pierwszym czynnikiem krwiotwórczym, który został zidentyfikowany, oczyszczony, którego gen sklonowano oraz przeprowadzono ekspresję [40]. Dzięki identyfikacji receptorów EPO na różnych typach komórek stwierdzono, że erytropoetyna ma bezpośredni wpływ na komórki układu immunologicznego [41÷43], komórki nabłonka, komórki zrębowe szpiku kostnego, a także na komórki serca, układu rozrodczego, przewodu pokarmowego, mięśni, nerek, trzustki i układu nerwowego [44÷48]. Po raz pierwszy erytropoetynę zastosowano w leczeniu pacjentów ze schyłkową niewydolnością nerek oraz niedokrwistością będącą wynikiem braku EPO [40, 49]. Terapia spowodowała wzrost ilości erytrocytów oraz poziomu hemoglobiny i hematokrytu, znosząc całkowicie potrzebę transfuzji krwi [50]. Erytropoetyna była także podawana pacjentom z niedokrwistością występującą w przebiegu nowotworów. Jednak, u chorych z niewydolnością nerek bardzo szybko występowały skutki uboczne, włącznie z komplikacjami kardiologicznymi, co mogło być efektem wpływu erytropoetyny również na inne typy komórek [51÷53]. Prowadzone są badania nad zastosowaniem rekombinowanej ludzkiej erytropoetyny w leczeniu niedokrwistości spowodowanej nowotworami, niewydolnością nerek i serca. U chorych z niewydolnością nerek po zastosowaniu rekombinowanej EPO następowało zmniejszenie niedokrwistości. Jednak, u pacjentów z niewydolnością serca w wielu próbach klinicznych nie stwierdzono pozytywnych efektów. Ponadto, erytropoetyna mogła być nawet niebezpieczna dla tych pacjentów, ponieważ powodowała wzrost ryzyka zakrzepów z zatorami [54]. 90 Terapeutyczne zastosowanie cytokin 3.2. Czynniki stymulujące rozwój kolonii (G-CSF i GM-CSF) Czynniki stymulujące rozwój kolonii granulocytów (G-CSF) oraz granulocytów i makrofagów (GM-CSF) są glikoproteinami o masie cząsteczkowej, odpowiednio 30 kDa i 22 kDa. Wytwarzane są przez monocyty, fibroblasty i komórki nabłonka. Ich funkcja polega na stymulowaniu granulopoezy, odporności wrodzonej oraz regulacji różnicowania komórek progenitorowych w szpiku kostnym w granulocyty i makrofagi. Obie cytokiny działają poprzez specyficzne receptory błonowe [55]. W onkologii klinicznej rekombinowane G-CSF i GM-CSF stosowane są do łagodzenia neutropenii wywołanej chemioterapią i radioterapią. Filgrastim (Neupogen) jest ludzkim rekombinowanym G-CSF. Stosowany jest do łagodzenia ciężkiej, przewlekłej neutropenii wywołanej chemioterapią i radioterapią lub po przeszczepie szpiku kostnego. Pegfilgrastim jest pegylowaną forma Filgrastima, podawany jest pacjentom po chemioterapii mielosupresyjnej w celu zmniejszenia podatności na infekcje. Sargramostim (Leukine) jest ludzkim rekombinowanym GM-CSF produkowanym w komórkach drożdży(S. cerevisiae), stosowany jest do odbudowy szpiku po autologicznych i allogenicznych przeszczepach szpiku kostnego. Tabela 2. Pro- i przeciwnowotworowe właściwości G-CSF and GM-CSF [55] Typ nowotworu Niedrobnokomórkowy rak płuca Glejak Rak pęcherza Rak jelita grubego Czerniak Rak skóry Przerzuty do kości w raku prostaty i piersi G-CSF GM-CSF Angiogenne, immunosupresyjne za pośrednictwem mieloidalnychkomóreksupresorowychMDSC(myeloidderivedsuppressorcell) Auto-/parakrynowa stymulacja wzrostu Auto? /parakrynowa (brak dowodów na działanie onkogenne lub stymulacja hamujące wzrost nowotworu) wzrostu Rakotwórcze Supresja nowotworu zależna i niezależna od układu immunologicznego Rakotwórcze Przeciwangiogenne za pośrednictwem rozpuszczalnego receptora śródbłonkowego czynnika wzrostu VEGFR (vascular endothelial growth factor receptor); Rakotwórcze za pośrednictwem mieloidalnychkomóreksupresorowychMDSC Synergistyczne rakotwórcze i angiogenne Wzmocnienie fenotypu nowotworowych komórek macierzystych 91 Maria Misiorek, Alina Owsiak Stwierdzono również, że G-CSF i GM-CSF mogą powodować działanie pro- lub przeciwnowotworowe w litych guzach pewnego pochodzenia (tabela 2). Znajomość profilu cytokin u pacjentów z danym typem nowotworu może pomóc w doborze zindywidualizowanego programu terapii. 4. Czynnik martwicy nowotworów α (TNF-α) Czynnik martwicy nowotworów α (TNF-α) jest plejotropową cytokiną, która bierze udział w takich procesach, jak: apoptoza, przeżywalność komórek, zapalenie i odporność. Jest białkiem o masie cząsteczkowej 17 kDa, zbudowanym ze 157 aminokwasów. Gen kodujący TNF-α został zmapowany na ludzkim chromosomie 6 [56]. Czynnik martwicy nowotworów α syntetyzowany jest w formie prekursorowej (26 kDa), która jest związana z błoną. Biologicznie czynna forma jest rozpuszczalnym homotrimerem i powstaje na skutek enzymatycznego przekształcenia formy prekursorowej. TNF-α działa poprzez dwa receptory: TNFR-1 (p60) i TNFR-2 (p80). Produkowany jest głównie przez aktywowane makrofagi, limfocyty T i komórki NK. Mniejszą ekspresję stwierdzono w innych typach komórek, m.in. w fibroblastach, komórkach mięśni gładkich oraz komórkach nowotworowych [57]. W zależności od stężenia TNF-α w mikrośrodowisku guza, może on powodować działanie pro- lub przeciwnowotworowe. Główny mechanizm działania przeciwnowotworowego polega, prawdopodobnie, na wywołaniu martwicy krwotocznej guzów litych. Faza I badań klinicznych dowiodła, że rekombinowany TNF-α podany dożylnie ma działanie wysoce toksyczne: w 92% przypadków występowało niedociśnienie, w 42% – hepatotoksyczność, a w 17% – dreszcze i gorączka [58]. W monoterapii TNF-α odpowiedź na leczenie obserwowano tylko u 2-4% chorych. Niskie dawki TNF-α podane wraz z liposomalną formą leków miały działanie immunomodulujące [59]. Natomiast, wysokie dawki rekombinowanego TNF-α podane w skojarzeniu z interferonem γ i melfalanem w izolowanej perfuzji kończyny były bardzo skuteczne u chorych na czerniaka i mięsaki. Całkowitą odpowiedź na leczenie wykazano u ponad 75% pacjentów z czerniakiem i u ponad 80% - z mięsakami [60]. Jednak nadal jest to leczenie eksperymentalne. 5. Podsumowanie Od czasu odkrycia cytokin w połowie XX wieku, wykorzystywane są one w immunoterapii(m. in. niedokrwistości, chorób wirusowych, nowotworów złośliwych). Efektywnośćterapeutycznego zastosowania cytokinw leczeniu różnych chorób jest bardzo różna. Na wzrost efektywności mogą mieć wpływ takie czynniki jak pegylacja cytokin, sposób ich podania, a także zastosowanie cytokinw skojarzeniu z innymi lekami. 92 Terapeutyczne zastosowanie cytokin Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. de Weerd N.A., Samarajiwa S.A., Hertzog P.J. Type I interferon receptors: biochemistry and biological functions, Journal of Biological Chemistry., 282 (2007), s. 20053-20057 Bach E.A., Aguet M., Schreiber R.D. The IFN gamma receptor: a paradigm for cytokine receptor signaling, Annual Review of Immunology.,15 (1997), s. 563-591 Kotenko S.V., Gallagher G., Baurin V.V., Lewis-Antes A., Shen M., Shah N.K., Langer J.A., Sheikh F., Dickensheets H., Donnelly R.P. IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex, Nature Immunology.,4 (2003), s. 69-77 Lasfar A., Walid A., Murugabaskar B., Cohen-Solal K.A. Interferon lambda: a new sword in cancer immunotherapy, Clinical and Developmental Immunology., 2011 (2011) Gibbert K., Schlaak J.F., Yang D., Dittmer U. IFN-a subtypes: distinct biological activities in anti-viral therapy, British Journal of Pharmacology., 168 (2013), s. 1048-1058 Trépo C., Chan H.L., Lok A. Hepatitis B virus infection, TheLancet., 384 (2014), s. 2053-2063 Tseng T.C., Kao J.H., Chen D.S. Peginterferonα in the treatment of chronic hepatitis B, Expert Opinion on Biological Therapy., 14 (2014), s. 995-1006 Moucari R., Mackiewicz V., Lada O., Ripault M.P., Castelnau C., MartinotPeignoux M. , Dauvergne A., Asselah T., Boyer N., Bedossa P., Valla D., Vidaud M., Nicolas-Chanoine M.H., Marcellin P. Early serum HBsAg drop: a strong predictor of sustained virological response to pegylated interferon alfa-2a in HBeAg-negative patients, Hepatology., 49 (2009), s. 1151-1157 Mutimer D., Aghemo A., Diepolder H., Negro F., Robaeys G., Ryder S., Zoulim F. , Peck M., Craxi A., Fried M., Zeuzem S. EASL clinical practice guidelines: management of hepatitis C virus infection,Journal of Hepatology., 60 (2014), s. 392-420 Bahcecioglu I.H., Ispiroglu M., Demirel U., Yalniz M. Pegylated interferon αtherapy in chronic delta hepatitis: aone-center experience, HepatitisMonthly.,15(2015), e24366 Yang J., Pu Y., Zeng Z., Yu Z., Huang N., Deng Q. Interferon for the treatment of genital warts: a systematic review, BMC Infectious Diseases., 9 (2009), s. 156-165 Maevis V., Mey U., Schmidt-Wolf G., Schmidt-Wolf G.H. Hairy cell leukemia: short review, today's recommendations and outlook, Blood Cancer Journal., 4 (2014), e. 184 Talpaz M., Mercer J., Hehlmann R.The interferon-alpha revival in CML, Annals of Hematology., 94 (2015), s. S195-S207 Koneru R., Hotte S.J. Role of cytokine therapy for renal cell carcinoma in the era of targeted agents, Current Oncology., 16 (2009), s. S40-S44 Kirkwood J.M., Strawderman M.H., Ernstoff M.S., Smith T.J., Borden E.C., Blum R.H. Interferon alfa-2b adjuvant therapy of high-risk resected cutaneous 93 Maria Misiorek, Alina Owsiak 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. melanoma: the Eastern Cooperative Oncology Group Trial EST 1684, Journal of Clinical Oncology., 14 (1996), s. 7-17 Lippman S.M., Parkinson D.R., Itri L.M., Weber R.S., Schantz S.P., Ota D.M., Schusterman M.A., Krakoff I.H., Gutterman J.U., Hong W.K. 13-cis-retinoic acid and interferon alpha-2a: effective combination therapy for advanced squamous cell carcinoma of the skin, Journal of the National Cancer Institute., 84 (1992), s. 235-241 Park T.K., Lee J.P., Kim S.N., Choi S.M., Kudelka A.P., Kavanagh J.J. Interferon-alpha 2a, 13-cis-retinoic acid and radiotherapy for locally advanced carcinoma of the cervix: a pilot study, European Journal of Gynaecological Oncology., 19 (1998), s. 35-38 Ricketts R.R., Hatley R.M., Corden B.J., Sabio H., Howell C.G. Interferonalpha-2a for the treatment of complex hemangiomas of infancy and childhood, Annals of Surgery., 219 (1994), s. 605-614 Dhib-Jalbut S. Mechanisms of action of interferons and glatiramer acetate in multiple sclerosis, Neurology., 58 (2002), s. S3-S9 Runkel L., Meier W., Pepinsky R., Karpusas M., Whitty A., Kimball K., Brickelmaier M., Muldowney C., Jones W., Goelz S.E. Structural and functional differences between glycosylated and non-glycosylated forms of human interferon-beta (IFN-beta), Pharmaceutical Research., 15 (1998), s. 641-649 Etheridge L.J., Beverley D.W., Ferrie C., McManus E.The use of interferon beta in relapsing-remitting multiple sclerosis, Archives of Disease in Childhood., 89 (2004), s. 789-791 Schroder K., Hertzog P.J., Ravasi T., Hume D.A. Interferon-γ: an overview of signal, mechanisms and functions, Journal of Leukocyte Biology., 75 (2004), s. 163-189 Gallin J.I., Malech H.L., Melnick D.A., Weening R.S., Roos D., Wendt H., Woodman R.C., Curnutte J.T., Seger R.A., Muhlebach T., Bourquin J.P., Axtell R.A., Boxer L.A., Pierson C.L., Anderson D.C., Shearer W.T., Rosenblatt H.M., Torkildson J.C., et al (The International Chronic Granulomatous Disease Cooperative Study Group)A controlled trial of interferon gamma to prevent infection in chronic granulomatous disease, The New England Journal of Medicine., 324 (1991), s. 509-516 Jr Key L.L., Rodriguiz R.M., Willi S.M., Wright N.M., Hatcher H.C., Eyre D.R., Cure J.K., Griffin P.P., Ries W.L. Long-term treatment of osteopetrosis with recombinant human interferon gamma, The New England Journal of Medicine., 332 (1995), s. 1594-1599 Miller C.H., Maher S.G., Young H.A. Clinical use of interferon-gamma, Annals of the New York Academy of Sciences., 1182 (2009), s. 69-79 Zaidi M.R., Merlino G. The Two Faces of Interferon-γ in cancer, Clinical Cancer Research., 17 (2011), s. 6118-6124 Pagliaccetti N.E., Eduardo R., Kleinstein S.H., Mu X.J., Bandi P., Robek M.D. Interleukin-29 functions cooperatively with interferon to induce antiviral gene expression and inhibit hepatitis C virus replication, Journal of Biological Chemistry., 283 (2008), s. 30079-30089 94 Terapeutyczne zastosowanie cytokin 28. Muir A.J., Shiffman M.L., Zaman A., Yoffe B., de la Torre A., Flamm S., Gordon S.C. , Marotta P., Vierling J.M., Lopez-Talavera J.C., Byrnes-Blake K., Fontana D., Freeman J., Gray T., Hausman D., Hunder N.N., Lawitz E. Phase 1bstudy of pegylated interferon lambda 1 with or without ribavirinin patients with chronic genotype 1 hepatitis C virus infection,Hepatology., 52 (2010), s. 822-832 29. Ramos E.L. Preclinical and clinical development of pegylated interferonlambda1in chronic hepatitis C, Journal of Interferon & Cytokine Research., 30 (2010), s. 591-595 30. Wang X., Hruska M., Chan P., Ahmad A., Freeman J., Horga M.A., Hillson J., Kansra V., Lopez-Talavera J.C. Derivation of Phase 3 dosing for peginterferon lambda-1a in chronic hepatitis C, Part 1: modeling optimal treatment duration andsustained virologic response rates,The Journal of Clinical Pharmacology.,55(2015), s. 63-72 31. Hruska M., Wang X., Chan P., Ahmad A., Freeman J., Horga M.A., Hillson J., Kansra V., Lopez-Talavera J.C. The Derivation of Phase 3 dosing for peginterferon lambda-1a in chronic hepatitis C, Part 2: exposure-response analyses for efficacy and safety variables. Journal of Clinical Pharmacology., 55(2015), s. 73-80 32. Roth C., Rochlitz C., Kourilsky P. Immune response against tumors, Advancies in Immunology., 57 (1994), s. 281-351 33. Gaffen S.L., Liu K.D. Overview of interleukin-2 function, production and clinical applications, Cytokine., 28 (2004), s. 109-123 34. Banks R.E., Patel P.M., Selby P.J. Interleukin 12: a new clinical player in cytokine therapy, British Journal of Cancer., 71 (1995), s. 655-659 35. Gollob A., Veenstra K.G., Parker R.A., Mier J.W., McDermott D.F., Clancy D., Tutin L., Koon H., Atkins M.B. Phase I trial of concurrent twice-weekly recombinanthuman interleukin-12 plus low-dose IL-2 in patients with melanoma or renal cell carcinoma, Journal of Clinical Oncology., 21 (2003), s. 2564-2573 36. Weiss J.M., Subleski J.J., Wigginton J.M., Wiltrout R.H. Immunotherapy of cancer by IL-12-based cytokine combinations, Expert Opinion on Biological Therapy., 7 (2007), s. 1705-1721 37. Bhatia M., Davenport V., Cairo M.S. The role of interleukin-11 to prevent chemotherapy-induced thrombocytopenia in patients with solid tumors, lymphoma, acute myeloid leukemia and bone marrow failure syndromes, Leukemia & Lymphoma., 48 (2007), s. 9-15 38. Mastromarino V., Volpe M., Musumeci M.B., Autore C., Conti E. Erythropoietin and the heart: Facts and perspectives,Clinical Science (London)., 120 (2011), s. 51-63 39. Krantz S.B. Erythropoietin, Blood., 77 (1991), s. 419-434 40. Papayannopoulou T., Migliaccio A.R., Abkowitz J.L., D’Andrea A.D. Biology of erythropoiesis, erythroid differentiation, and maturation. W:Hematology: Basic Principles and Practice. Fifth edition. R. Hoffman, E.J. Jr. Benz, S.J. Shattil, B. Furie, L.E. Silberstein, P. McGlave, H. Heslop, J. Anastasi, editors. Elsevier Churchill Livingston, Philadelphia, (2009), s. 276-294 95 Maria Misiorek, Alina Owsiak 41. Broxmeyer H.E. Erythropoietin surprises: an immune saga, Immunity., 34 (2011), s. 6-7 42. Nairz M., Schroll A., Moschen A.R., Sonnweber T., Theurl M., Theurl I., Taub N., Jamnig C., Neurauter D., Huber L.A., Tilg H., Moser P.L., Weiss G. Erythropoietin contrastingly affects bacterial infection and experimental colitis by inhibiting nuclear factor-κB-inducible immune pathways, Immunity., 34 (2011), s. 61-74 43. Nairz M., Sonnweber T., Schroll A., Theurl I., Weiss G. The pleiotropic effects of erythropoietin in infection and inflammation,Microbes and Infection.,14 (2012), s. 238-246 44. Brines M., Cerami A.Discovering erythropoietin’s extra-hematopoietic functions: biology and clinical promise, Kidney International., 70 (2006), s. 246-250 45. Choi D., Schroer S.A., Lu S.Y., Wang L., Wu X., Liu Y., Zhang Y., Gaisano H.Y., Wagner K.U., Wu H., Retnakaran R., Woo M. Erythropoietin protects against diabetes through direct effects on pancreatic beta cells,Journal of Experimental Medicine.,207 (2010), s. 2831-2842 46. Hand C.C., Brines M. Promises and pitfalls in erythopoietin-mediated tissue protection: are nonerythropoietic derivatives a way forward?, Journal of Investigative Medicine., 59 (2011), s.1073-1082 47. McGee S.J., Havens A.M., Shiozawa Y., Jung Y., Taichman R.S. Effects of erythropoietin on the bone microenvironment, Growth Factors., 30 (2012), s. 22-28 48. Sytkowski A.J. The neurobiology of erythropoietin, Cellular and Molecular Neurobiology.,31 (2011),s. 931-937 49. Shaheen M., Broxmeyer H.E. The humoral regulation of hematopoiesis. W: Hematology: Basic Principles and Practice. Fifth edition. R. Hoffman, E.J. Jr. Benz, S.J. Shattil, B. Furie, L.E. Silberstein, P. Mc Glave, H. Heslop, J. Anastasi, editors. Elsevier Churchill Livingston, Philadelphia, (2009), s. 253-275 50. Rizzo J.D., Brouwers M., Hurley P., Seidenfeld J., Arcasoy M.O., Spivak J.L., Bennett C.L., Bohlius J., Evanchuk D., Goode M.J., et al; American Society of Hematology and the American Society of Clinical Oncology Practice Guideline Update Committee. 2010. American Society of Hematology/American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update on the use of epoetin and darbepoetin in adult patients with cancer 51. Szenajch J., Wcislo G., Jeong J.Y., Szczylik C., Feldman L. The role of erythropoietin and its receptor in growth, survival and therapeutic response of human tumor cells. From clinic to bench - a critical review, Biochemical et Biophysical Acta., 1806 (2010), s. 82-95 52. Hedley B.D., Allan A.L., Xenocostas A. The role of erythropoietin and erythropoiesis-stimulating agents in tumor progression, Clinical Cancer Research., 17 (2011), s. 6373-6380 53. Oster H.S., Neumann D., Hoffman M., Mittelman M. Erythropoietin: the swinging pendulum, Leukemia Research., 36 (2012), s. 939-944 54. Swedberg K., Young J.B., Anand I.S., Cheng S., Desai A.S., Diaz R., Maggioni A.P. , McMurray J.J., O'Connor C., Pfeffer M.A., Solomon S.D., 96 Terapeutyczne zastosowanie cytokin 55. 56. 57. 58. 59. 60. Sun Y.V., Tendera M., van Veldhuisen D.J. Treatment of anemia with darbepoetin alfa in systolic heart failure, The New England Journal of Medicine., 368 (2013), s. 1210-1219 Aliper A.M., Frieden-Korovkina V.P., Buzdin A., Roumiantsev S.A., Zhavoronkov A. A role for G-CSF and GM-CSF in nonmyeloid cancers, Cancer Medicine., 3 (2014), s. 737-746 Muller U., Jongeneel C.V., Nedospasov S.A., Lindahl K.F., Steinmetz M. Tumor necrosis factor and lymphotoxin genes map close to H-2D in the mouse major histocompatibility complex, Nature., 325 (1987), s. 265-267 Bemelmans M.H., van Tits L.J., Buurman W.A. Tumor necrosis factor: function, release and clearance, Critical Reviews in Immunology., 16 (1996), s. 1-11 Feinberg B., Kurzrock R., Talpaz M., Blich M., Saks S., Gutterman J. A phase I of intravenous administrated recombinant tumor necrosis factor-alpha in cancer patients, Journal of Clinical Oncology., 6 (1988), s. 1328-1334 van Horssen R., ten Hagen T.L.M, Eggermont A.M.M. TNF-α in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility, The Oncologyst., 11 (2006), s. 397-408 Lienard D., Ewalenko P., Delmotte J.J., Renerd N., Lejeune F.J. High-dose recombinant TNF-alpha in combination with INF-gamma and melphalan in isolation perfusion of the limbs for melanoma and sarcoma, Journal of Clinical Oncology., 10 (1992), s. 52-60 Terapeutyczne zastosowanie cytokin Streszczenie Cytokiny są to niskocząsteczkowe białka lub glikoproteiny wytwarzane przez leukocyty i inne typy komórek i biorące udział w takich procesach, jak: proliferacja, różnicowanie czy migracja komórek. Od czasu odkrycia cytokin w połowie XX wieku, wykorzystywane są one w immunoterapii nowotworów, chorób zakaźnych i autoimmunologicznych oraz niedokrwistości różnego pochodzenia. Szersze zastosowanie cytokin w praktyce klinicznej stało się możliwe dzięki produkcji cytokin na masową skalę w prolub eukariotycznych systemach ekspresji rekombinowanych białek, np. w bakteriach (Escherichia coli), drożdżach (Saccharomycescerevisie) lub komórkach jajników chomika. Obecnie prowadzone są liczne badania nad opracowaniem bezpiecznych i efektywnych terapii z udziałem cytokin. Największe znaczenie terapeutyczne mają interferony (α, β, γ i λ), interleukiny (IL-2, IL-12, IL-11), hematopoetyny (erytropoetyna, czynniki stymulujące rozwój kolonii granulocytów oraz granulocytów i makrofagów), a także czynnik martwicy nowotworów α. W pracy przedstawiono krótki przegląd cytokin stosowanych w immunoterapii, z uwzględnieniem ich skuteczności terapeutycznej. Słowa kluczowe: cytokiny, terapia, interferony, interleukiny, hematopoetyny 97 Karolina Jakubczyk1, Katarzyna Barchiewicz, Gabriela Dyrda Cytotoksyczność wybranych metaloftalocyjanin wobec mikroorganizmów 1. Wstęp Ftalocyjaniny, jako analogi występujących w przyrodzie i w organizmach żywych porfiryn, zyskują coraz większe uznanie w medycynie jako substancje przeciwnowotworowe. Liczne badania, które zyskały już miano badań klinicznych, potwierdzają szerokie właściwości fotochemiczne tych związków. Zdolność wytwarzania wolnych rodników pod wpływem naświetlania promieniami o odpowiedniej długości fali, zapoczątkowuje szereg reakcji utleniania i kaskadę reakcji prowadzącą do apoptozy lub nekrozy komórki. Właściwości fotochemiczne ftalocyjanin postanowiono wykorzystać do zwalczania patogennych mikroorganizmów i wirusów, wśród których znalazły się np. Staphylococcus aureus, Candida albicans, Mycobacterium tuberculosis czy wirus opryszczki HSV (Herpes Simplex Virus) [1÷7]. 1.1. Ftalocyjaniny jako fotouczulacze w terapii fotodynamicznej Cząsteczka ftalocyjaniny zbudowana jest czterech pierścieni izoindolowych, połączonych ze sobą mostkami azametinowymi. Cząsteczka jest więc płaskim układem sprzężonych wiązań podwójnych, z 18 zdelokalizowanymi elektronami π. Układ taki decyduje o tym, że cząsteczki ftalocyjanin są stabilne i odporne chemicznie. Najistotniejsze są jednak właściwości spektralne ftalocyjanin. Cząsteczki silnie absorbują promieniowanie UV-Vis (ε > 105), a maksima absorpcji promieniowania znajdują się przy długości fali około 340 nm (tzw. pasmo B) oraz w zakresie 600 - 800 nm (tzw. pasmo Q). Dzięki takim właściwościom, ftalocyjaniny mogą być stosowane w układach żywych bowiem pasma absorpcji nie pokrywają się z pasmami barwników żywych komórek, takich jak hemoglobina czy melanina. W zależności od dostępności tlenu, zaobserwowano dwa mechanizmy działania ftalocyjanin – typ I (rodnikowy) – przy małym stężeniu tlenu i typ II (generowanie tlenu singletowego) przy dużym stężeniu tlenu (Rys.1) [1÷7]. 1 [email protected]; Zakład Chemii Ogólnej, Wydział Chemii, Uniwersytet Opolski 98 Cytotoksyczność wybranych metaloftalocyjanin wobec mikroorganizmów W reakcji typu I fotouczulacz w stanie wzbudzonym reaguje bezpośrednio z znajdującymi się najbliżej cząsteczkami, które są w stanie przyjąć wodór lub elektron. Jednocześnie fotouczulacz staje się rodnikiem i wchodząc w reakcje z tlenem, generuje rodniki nadtlenkowe ˙O2- i aniony nadtlenkowe O22-. Cząsteczki te reagują następnie ze składnikami komórek, doprowadzając do jej dezintegracji. Rodnik nadtlenkowy ponadto może reagować z wodą, wytwarzając rodnik hydroksylowy ˙OH, który również utlenia składniki błony komórkowej i innych struktur komórki [1, 2]. Mechanizm typu II opiera się na reakcji wzbudzonego fotouczulacza z tlenem, dzięki czemu powstaje tlen singletowy 1O2, o dużej stabilności, długim czasie życia i silnych właściwościach utleniających [1,2]. Rysunek 1. Schemat reakcji fotochemicznej [3] Zarówno tlen singletowy jak i powstające rodniki tlenowe doprowadzają do zniszczenia komórki, utleniając nienasycone kwasy tłuszczowe (kwas oleinowy, linolowy, arachidonowy i steroidy – cholesterol), reorganizując białka (reakcje z aminokwasami posiadającymi aromatyczne lub heterocykliczne łańcuchy boczne na przykład tryptofan, tyrozyna, histydyna, jak również z aminokwasami zawierającymi atomy siarki, na przykład cysteina, metionina), czy uszkadzając DNA komórek (reakcja z purynami i pirydynami, szczególnie z guanozyną) . Wysokie stężenie fotouczulacza i naświetlanie promieniowaniem o odpowiedniej długości fali powoduje nekrozę, natomiast podawanie fotouczulacza w niskim stężeniu lecz w kilku dawkach, oraz dłuższy czas inkubacji powoduje apoptozę komórki [1, 2]. 99 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz, Gabriela Dyrda 1.2. Ftalocyjaniny w zwalczaniu patogennych mikroorganizmów (PACT) Właściwości ftalocyjanin jako fotosensybilizatorów postanowiono wykorzystać do zwalczania patogennych mikroorganizmów. Istotą jest jednak zdolność transportu cząsteczek do wnętrza komórki lub ulokowanie się w błonie komórkowej. Ze względu na różnice w budowie ścian komórkowych bakterii Gram-dodatnich (G+) i Gram-ujemnych (G-) oraz grzybów i wirusów, proces ten będzie przebiegał z różną wydajnością lub z różną lokacją. Bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne reagują różnie na terapię fotodynamiczną (Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy – PACT). U bakterii Gram-ujemnych początkowo stwierdzono odporność na terapię fotodynamiczną - PDT (Photodynamic Therapy), do momentu kiedy zauważono, że fosfolipidy, złożone lipoproteiny i polisacharydy występujące w dodatkowej zewnętrznej otoczce E. coli, P. aeruginosa, K. pneumonia i H. influenza hamują wiązanie anionowych cząsteczek fotouczulaczy (o ile nie są stosowane dodatkowe manipulacje, które ułatwiają transport przez membranę). Na szczęście, istnieje duża liczba alternatywnych strategii, które opracowano w celu pokonania tej bariery. Obejmują one zastosowanie nienaładowanych (np. deuteroporfiryny) lub dodatnio naładowanych fotouczulaczy (na przykład tetrakationowych substytutów porfiryn, ftalocyjanin, błękit toluidyny, błękit metylenowy). Co ciekawe, kationowe fotouczulacze wykazują znacznie większą szybkość wychwytu do komórek bakteryjnych. Zdolność manipulowania tym zjawiskiem może stać się ważna w kontrolowaniu skutków ubocznych terapii PACT [8÷11]. Komórki bakteryjne wykazują duże zróżnicowanie rozmiarów, elementów subkomórkowych i składu biochemicznego. Bakterie Gramdodatnie są otoczone przez zewnętrzną ścianę, która jest oddzielona od błony komórkowej przestrzenią peryplazmatyczną. 20-80 nm grubości ścianka tworzy strukturę ochronną utworzoną głównie przez warstwy peptydoglikanu, które są przecinane przez zakotwiczone w błonie, ujemnie naładowane kwasy lipotejchojowy i tejchuronowy. Taki układ przestrzenny nie działa ściśle jako bariera przepuszczalności (Rys. 2). Okazało się, że makrocząsteczki o masie cząsteczkowej do około 60 kDa łatwo dyfundują przez ścianę, aby osiągnąć wewnętrzną membranę. Dlatego najczęstsze środki uwrażliwiające, których masa cząsteczkowa nie jest na ogół większa niż 1,5 kDa, mogą przejść przez ścianę zewnętrzną i zlokalizować się w bezpośrednim otoczeniu światłoczułych struktur wewnątrzkomórkowych. 100 Cytotoksyczność wybranych metaloftalocyjanin wobec mikroorganizmów Rysunek 2. Schemat budowy ściany komórkowej bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych [12] Z drugiej strony, Gram-ujemne bakterie, charakteryzują się obecnością dodatkowego ok. 10 nm, grubego zewnętrznego elementu konstrukcyjnego - sieci peptydoglikanu, którego części składowe (na przykład lipoproteiny, lipopolisacharydy, kwas tejchojowy i kwas lipotejchojowy) powodują na powierzchni ujemnie naładowaną powłokę. Ten wysoce zorganizowany system hamuje wnikanie związków o masie cząsteczkowej większej niż 600-700 Da. Gruba ścianka zewnętrzna, składająca się z mieszaniny lipoprotein, glukanu, chityny i mannanu, jest także obecna w drożdżach i w grupie heterogenicznych organizmów eukariotycznych, które są czynnikami sprawczymi różnych chorób zakaźnych. Ściana jest oddzielona od błony cytoplazmatycznej za pomocą przestrzeni peryplazmatycznej. Przepuszczalność tej ściany jest bardzo podobna do typowej przepuszczalności dla komórek Gram-dodatnich. Szczególnie istotne w przypadku leczenia infekcji bakteryjnych, jest to, że ponad 60% z nich jest wynikiem wzrostu biofilmu bakteryjnego. Biofilmy są zbiorowiskami komórek otoczonych przez sieć polimerów zewnątrzkomórkowych. Komórki mogą rosnąć w małych koloniach lub jako pojedyncze organizmy (w przypadku bakteriemii). Biofilmy są niezwykle ważne w chorobie zakaźnej. Prawdopodobnie są one produkowane przez wszystkie patogeny bakteryjne i mogą się znaleźć nie tylko na skórze i narządach wewnętrznych, ale również na urządzeniach medycznych, które mają bezpośredni kontakt z pacjentem, np. cewniki. Komórki biofilmu znajdują się w różnych fazach wzrostu, co jest czynnikiem powodującym różnice we wrażliwości na antybiotyki. Co ciekawe, po izolacji i hodowli in vitro, prawie wszystkie komórki biofilmu były wrażliwe na antybiotyki, co wskazuje, że nie ma wewnętrznej oporności komórek biofilmu na wybrane leki. Jednak w praktyce uważa się, że leczenie antybiotykami likwiduje większość 101 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz, Gabriela Dyrda bakterii biofilmu, ale obecność zewnątrzkomórkowej sieci polimeru polisacharydowego, silnie hamuje eliminację części komórek bakterii. Tak więc "uporczywe" osobniki przetrwają, zwłaszcza gdy poziom antybiotyku zanika, co umożliwia ich wzrost i odnawianie kolonii w obrębie sieci polimerowej. Efektowi PACT biofilmów poświęcono wiele uwagi, zwłaszcza w odniesieniu do zakażeń skóry i jamy ustnej, gdzie jest bezpośredni dostęp do miejsca zakażenia. W większości badań in vitro wykazano, że PACT jest rzeczywiście bardziej efektywny niż konwencjonalne leczenie antybiotykami w ograniczaniu populacji biofilmu. Efekt nie jest jednak całkowity. Jedynym ograniczeniem może być wnikanie fotosensybilizatora (PS) przez złożoną matrycę biofilmu, który w zależności od składu chemicznego może wiązać się, a tym samym hamować osiągnięcie swojego celu przez fotouczulacz. Zjawisko to może być zniwelowane przez zastosowanie innych strategii dostarczania PS, takich jak użycie nanocząstek lub koniugację z nośnikami białkowymi. Inną alternatywą jest równoczesne zastosowanie środków chelatujących, takich jak EDTA, które mogą pomóc PS w dyfuzji w otoczce polisacharydowej [11]. Chorobotwórcze pierwotniaki stanowią również grupę organizmów strukturalnie rozbieżnych, które są skomplikowanym problemem dla jakiegokolwiek podejścia terapeutycznego. Obejmują pasożytnicze pierwotniaki formy chorobotwórcze i oportunistyczne, które charakteryzują się skomplikowanymi cyklami życiowymi i są często niezdolne do przeżycia poza organizmem gospodarza. Na przykład, ogólny schemat cyklu życiowego pierwotniaków z grupy ameb: Entamoeba histolytica i Acanthamoeba spp., polega na przemiennym stadium życia i torbieli. Torbiele, które rozwijają się w niekorzystnych warunkach środowiskowych (brak żywności, osuszanie), mogą przetrwać w naturze do czasu poprawy warunków wzrostu i mogą pozostać żywe nawet przez 25 lat. Cysty otoczone są przez ścianę, która może składać się z dwóch lub trzech warstw, każda o grubości aż do 300 nm, co stanowi barierę fizyczną. U Acanthamoeba castellanii ściany składają się głównie z celulozy i nierozpuszczalnych w kwasach białek. Z drugiej strony, trofozoid (postać aktywna) jest słabo przystosowany do przeżycia przez dłuższe okresy czasu, i odpowiedzialny jest za infekcje różnych tkanek, po których szybko się rozprzestrzenia. Z powyższych rozważań wynika, że bakterie Gramujemne i cysty pierwotniaków stanowią największe wyzwanie dla każdego typu leczenia przeciwbakteryjnego. Warto podkreślić, że w wielu wypadkach zakażenia są wywoływane przez heterogeniczne drobnoustroje, a więc terapia takich infekcji nie może się koncentrować na jednym rodzaju patogenie, ale musi charakteryzować się szerokimi możliwościami działania na drobnoustroje chorobotwórcze o bardzo różnych cechach 102 Cytotoksyczność wybranych metaloftalocyjanin wobec mikroorganizmów biologicznych, fizjologicznych i morfologicznych. PDT wykazuje szczególne cechy, które pozwalają rozwiązać ten problem w odpowiedni sposób [13]. 1.3. Enkapsulacja jako czynnik zwiększający wydajność PACT Istnieje kilka kwestii, które powinny być rozwiązane, aby PACT zyskał szerokie zastosowanie w praktyce klinicznej. Jednym z nich jest nagromadzenie PS w komórce. Podczas gdy kationowe fotouczulacze mogą działać w komórkach mikroorganizmów szybciej niż w normalnych komórkach ssaków, niespecyficzna akumulacja w normalnych komórkach organizmu może wciąż powodować skutki uboczne, takie jak uczulenia skóry na światło. Jeden ze sposobów przezwyciężenia tego problemu może być umieszczenie fotouczulaczy w liposomach wyznakowanych cząsteczką nośnika, specyficznego dla komórki docelowej. Działanie PDT dotyczy nie tylko bakterii, lecz także prowadzi do lepszego dostarczania związku i zwiększonej cytotoksyczności. Zjawisko to zostało już zaobserwowane za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego, gdzie zaobserwowano fuzję liposomów zawierających antybiotyki z błonami zewnętrznymi bakterii Gram-ujemnych. U Gram-dodatnich bakterii oddziaływanie liposomu z zewnętrznym peptydoglikanem prawdopodobnie umożliwia uwolnienie zawartości liposomu i jego dyfuzji przez ściany komórek (Rys. 3). Ponadto, lokalne stosowanie liposomów z uwięzionymi lekami pomaga przedłużyć ich działanie w zainfekowanych tkankach i zapewnia przedłużone uwalnianie składników aktywnych [11]. Rysunek 3. Schemat dostarczania fotouczulaczy do komórek za pomocą liposomów [14] 103 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz, Gabriela Dyrda Nawet bez dodatkowego efektu kierowania, kapsułkowanie może spowodować zwiększenie lokalizacji aktywnego leku do przedziału tkanki docelowej. Wykazano, że tobramycyna zamknięta w liposomie utrzymywała wysoki poziom aktywności w płucach szczurów z przewlekłym zapaleniem płuc (zakażonych P. aeruginosa), podczas gdy jedynie niewielkie ilości znaleziono w nerkach. Podobnie było w przypadku doksorubicyny, gdzie wykazano od 3 do 15-krotnie większe nagromadzenie antybiotyku w komórkach nowotworowych, gdy lek został dostarczony poprzez liposomy. Po zbadaniu skuteczności bakteriobójczej przeciwko wielu bakteriom Gram-dodatnich, w tym MRSA, (Methicilin Resistant Staphylococcus aureus) hematoporfiryny i chloryny e6 uwięzionych w liposomie lub miceli, wykazano, że formy leków umieszczone w liposomach zmniejszały przeżywalność bakterii w stosunku do wolnych form leków, a uwięzione w micelach PS wywierały pełne działanie bakteriobójcze. Zatrzymywane PS w postaci nanocząstek nie zawsze prowadzą do nasilenia aktywności cytotoksycznej. Podano, że chloryna była bardziej skuteczna w postaci wolnej niż w dowolnej postaci liposomowej, natomiast hematoporfiryna, jak również naładowane dodatnio fotouczulacze 5- [4- (1-dodekanoilopirydylo)] -10,15,20-trifenyloporfiryny są mniej skuteczne w postaci wolnej niż zamknięte w lipidach kationowych lub wprowadzone do liposomów składających się z pochodnych fosfatydylocholiny. Wyniki można wyjaśnić różnicami w chemii fotouczulaczy, które wpływają na związek z elementami liposomów, płynność lipidów i lokalizację pęcherzyków liposomów [11]. Błękit metylenowy (MB), równie często stosowany w PACT, uwięziony w liposomach, złożonych z fosfatydylocholiny, neutralnej dipalmitoilofosfatydylocholiny (DPPC) lub fosfatydylocholiny żółtka jaj (EPC), z lub bez dodatków dimirystoilofosfatydyloglicerolu (DMPG) i oktadecyloamin (OA), skutecznie dostarczany jest do szeregu bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, wśród których są: S. lutea, S. aureus, S. epidermidis, E. coli i S. flexneri. Skład lipidowy liposomów rzeczywiście wpływa na dostawę PS do komórek. Najlepsze wyniki otrzymano dla DPPC/DMPG EPC liposomów. DPPC/DMPG EPC liposomy były najbardziej skuteczne w transporcie błękitu metylenowego, w związku z jego dodatnim ładunkiem, co było szczególnie przydatne we wprowadzaniu do liposomu o ładunku ujemnym. Mniejszą wydajność odnotowano w przypadku umieszczania dodatnio naładowanego fotouczulacza do kationowych pęcherzyków. Badano również wpływ enkapsulacji PS na powodzenie PACT i wykazano, że wolne i liposomalne formy PS były w stanie podobnie uwrażliwić S. aureus dzięki mocy naświetlania zewnętrznego. Krzywe reakcji na dawkę światła wolnych i uwięzionych w liposomach MB były bardzo podobne, choć zanotowano 2-krotnie lepsze hamowanie wzrostu bakterii 104 Cytotoksyczność wybranych metaloftalocyjanin wobec mikroorganizmów w przypadku zastosowania cząsteczek zamkniętych w liposomach. Wyniki te sugerują, że przynajmniej w warunkach in vitro, włączenie PS do Gramdodatnich bakterii, jest nieznacznie bardziej wydajne dzięki inkapsulacji cząsteczek fotouczulacza w liposomach [11]. W warunkach in vitro wykonano badania nad kapsułkowanymi w liposomach ftalocyjaninami jako alternatywna strategia zwiększania absorpcji u komórek drożdży. Wyniki nie były jednak zadowalające, gdyż wielkość liposomów mieści się w zakresie od 20 do 100 nm, a tylko struktury kuliste o średnicy mniejszej niż 5,8 nm, mogą przejść przez ścianę komórkową drożdży. Nie stwierdzono, że również mutagennych skutków terapii fotodynamicznej z zastosowaniem ClAlPc u K. marxianus i C. albicans [2]. 1.4. Wpływ struktury cząsteczki ftalocyjaniny na skuteczność PACT Obecnie dostępna jest duża liczba ftalocyjanin syntetycznych. Wszystkie te związki zawierają makropierścienie o jednakowej strukturze chemicznej wynikającej ze sprzężenia czterech jednostek benzopirolowych. Jednakże różnią się one od siebie pod względem właściwości chemicznych, które można zmieniać poprzez modyfikację atomu centralnego w kompleksie (metalu, niemetalu) czy liczby i rodzaju łańcuchów bocznych. Atom centralny metalu odgrywa ważną rolę w kształtowaniu aktywności fotobiologicznej, wpływa również na trwałość ftalocyjaniny. Wprowadzenie podstawników polarnych w łańcuchach bocznych, powoduje zmianę polaryzacji i równowagi. Bilans hydrofobowo-hydrofilowy jest bardzo istotny przy rozważaniu chemicznej aktywności ftalocyjanin i jej wychwytu przez mikroorganizmy. Makrocykl ftalocyjaniny jest zasadniczo hydrofobowy, a stwierdzono, że związki hydrofobowe są mało skuteczne. Jednak również hydrofilowe mono- i tetrasulfonowane ftalocyjaniny glinu (AlPc) nie dezaktywują drożdży Kluyveromyces marxianus, podczas gdy znaczące ilości innych substancji rozpuszczalnych w wodzie, na przykład monosulfonowane ZnPcS zostały mocno związane ze strukturami wewnątrzkomórkowymi i wykazywały wysoką aktywność w komórkach S. cerevisiae. Tę rozbieżność można wyjaśnić wskazując, że obecność kationowych podstawników jest konieczna do dezaktywacji C. albicans, ale nadmiar ładunków, zwłaszcza równomiernie rozmieszczonych, powoduje obniżenie aktywności. Otrzymano podobne wyniki, które wykazały wyższą wrażliwość C. albicans do kationowej tetrakis-(3metylopirydyloksy)ftalocyaniny cynku (II) (ZnPcMe) niż anionowej tetrakis-(4-sulfophenoksy)ftalocjaniny cynku (II) (ZnPcS), choć obie są rozpuszczalne w wodzie. Na podstawie tych informacji, tetrakationowa 105 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz, Gabriela Dyrda ZnPc, mając cztery aminoalkilowe podstawniki peryferyjne okazała się wysoce skuteczna w unieszkodliwianiu szczepów C. albicans, które są oporne na wiele leków. Ostatnie badania dotyczące przeciwgrzybicznego działania ftalocyjanin wobec C. albicans wykazały osłabioną aktywność metaboliczną grzybów. Apoptoza nastąpiła na skutek zwiększonej eksternalizacji fosfatydyloseryny i fragmentacji DNA [15]. Wykorzystane w innych badaniach in vitro ftalocyjaniny mają grupy kationowe rozmieszczone w peryferyjnych częściach makropierścienia: Rysunek 4. Struktury badanych ftalocyjanin: ZnAPc4+, ZnPPc4+, ZnEPc4+ [14] W cząsteczce ZnAPc4+ ładunek znajduje się bezpośrednio w pierścieniu, podczas gdy w cząsteczkach ZnPPc4+ i ZnEPc4+ podstawniki kationowe oddzielone są od pierścienia wiązaniem eterowym (Rys. 4). Wszystkie cząsteczki rozpuszczone w dimetyloformamidzie (DMF) wykazują charakterystyczną dla ftalocyjanin cynkowych absorbancję – pasmo Soreta przy ok. 350 nm oraz pasmo Q przy ok. 670 nm. Wykazano, że ZnPPc4+ powoduje prawie 100% inaktywację komórek E.coli (G-), podobnie jak ZnEPc4+ wobec komórek S. mitis (G+). Oba związki wykazują większą aktywność niż ZnAPc4+. Wynika z tego, że podstawniki kationowe oddzielone od pierścienia ftalocyjaninowego, zapewniają łatwiejsze wiązanie się cząsteczek do błon bakterii [15-18]. W kolejnych badaniach wykorzystano komórki Escherichia coli, Enterococcus seriolicida oraz Pseudomonas aeruginosa. Naświetlanie komórek E. coli, które były poddane działaniu pirydynoftalocyjaniny (PPC) spowodowało znaczne zwiększenie ich śmiertelności. Gram-ujemne bakterie, P. aeruginosa, są także inaktywowane za pomocą PPC. Są one jednak mniej wrażliwe na fotouczulacze niż E. coli, co wymaga ekspozycji na 25 μg/ml PPC i naświetlenia przez 60 min. Obie bakterie naświetlane w obecności 50 μg/ml neutralnej tetradietanoloaminoftalocyjaniny (TDEPC) lub ujemnie naładowanej tetrasulfonowanej ftalocyjaniny (TSPC) 106 Cytotoksyczność wybranych metaloftalocyjanin wobec mikroorganizmów nie wykazały znaczącego spadku przeżycia komórek. Wykazano także zależność, że śmiertelność tych komórek uwarunkowana jest zarówno stężeniem PPC jak i czasem naświetlania [19]. W warunkach in vitro testowano wpływ ftalocyjanin na opóźnienie wzrostu komórek bakteryjnych. Eksperymenty wykazujące opóźnienie wzrostu prowadzono w podłożu bakteryjnym, gdy komórki nie były w warunkach głodowych lub narażone na potencjalnie szkodliwe skutki innych roztworów (np. buforu fosforanowego). Wykazano, że w tych warunkach wzrost został zatrzymany, gdy E. coli zostały narażone na działanie PPC. Po 30 min oświetlenia w obecności 1, 5 lub 10 μg/ml PPC, komórki już nie wykazywały wzrostu. Komórki E. coli, wystawione na działanie 10 μg/ml PPC w ciemności lub 10 μg/ml SPC lub TDEPC w świetle nie wykazały opóźnienie wzrostu w porównaniu z grupą kontrolną. Podobny wynik wyzyskano dla komórek P. aeruginosa poddanych działaniu 10, 25 lub 50 μg/ml PPC. Stopień śmiertelności komórek E. coli i Pseudomonas aeruginosa wzrastał wraz ze wzrostem stężenia PPC i czasu oświetlenia. Na przykład, komórki E. coli narażone na 10 μg/ml PPC i oświetlone przez 60 min wykazywały ponad 99,997% śmiertelność. Zatem dane wskazują na bakteriobójczy efekt na komórki, a nie działanie bakteriostatyczne [19]. E. seriolicida narażone na PPC wykazują zwiększoną śmiertelność. Inkubacja E. seriolicida w 10 μg/ml PPC i naświetlanie przez 15 minut prowadziło do spadku przeżycia komórek. Ekspozycja na TDEPC (tetradietanolaminoftalocyjanina) lub TSPC (tetrasulfonowana ftalocyjanina) i 15 minutowe naświetlanie nie spowodowało śmierci komórek. Obserwacja ta jest zaskakująca, ponieważ istnieje kilka doniesień o obojętnych lub anionowych porfirynach i ftalocyjaninach w procesie inaktywacji bakterii Gram-dodatnich [19]. Wykazano, że wiązanie fotosensybilizatora do komórek jest konieczne aby zaszedł proces absorpcji oraz aby fotouczulacz mógł wywierać swoje działanie fotocytotoksyczne. Jednakże fakt, że TDEPC nie wykazuje wpływu na trzy badane organizmy oznacza, że całkowity wychwyt komórkowy fotouczulacza nie wywoła śmierci komórek. To oznacza że istotna jest lokalizacja fotouczulacza w komórce. Błony komórkowe mogą być elementem docelowym dostarczania leków. Wiele makromolekuł, będących ich składnikami, reaguje z tlenem singletowym powstałym w reakcji fotochemicznej, typowej dla terapii fotodynamicznej. Do takich błon zalicza się błony otaczające komórkę, błony retikulum endoplazmatycznego, błony mitochondrialne i aparatu Golgiego [19]. W innych badaniach wykazano, że biofilm może być inaktywowany, stosując różne właściwości i źródła światła. Najlepsze wyniki przeciwko 107 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz, Gabriela Dyrda C. albicans otrzymywano przez zastosowanie ftalocyaniny cynku i galu (ZnPc, GaPc2). Podczas badania wychwytu monoftalocyjaniny i diftalocyjaniny galu (GaPc i GaPc2) przeprowadzono pomiary emisji (fluorescencji) próbek zawierających różne stężenia związków. Ilość wchłaniania GaPc (1 mM) u czterech badanych gatunków oszacowano przez widmo fluorescencyjne zawiesin komórek i supernatantów: (1) w PBS (roztwór chlorku sodu buforowany fosforanami) po inkubacji (2) w PBS po trzykrotnym płukaniu komórek i (3) po ekstrakcji mieszaniną 2% SDS (laurylosiarczan sodu): THF (tetrahydrofuran) (9: 1). Widma rejestrowano w zakresie 650-800 nm, przy długości fali wzbudzenia 635 nm. Jako wartość wychwytu przyjęto liczbę ładunków dodatnich. Wychwyt GaPc był o 1,5 razy mniejszy w porównaniu z GaPc2, co sugerowało, lepszą penetrację membrany przez osiem pozytywnych ładunków w GaPc2 w porównaniu do czterech dodatnich ładunków w GaPc. Sorpcja GaPc maleje ze wzrostem gęstości komórek w granicach 105- 109 CFU/ml. Stwierdzono, że zdolność akumulacji GaPc zmniejsza się niezależnie od badanych szczepów bakteryjnych [10]. Doświadczenie to zostało wykonane analogicznie do badań nad podstawionymi ftalocyjaninami cynku o różnej hydrofobowości i ładunkach. Proces wiązania następuje poprzez elektrostatyczny mechanizm interakcji i wiązania niekowalencyjne. Kationowe związki łatwiej dostają się do komórek ze względu na charakter dwuwarstwowej membrany. Ponadto, większa ilość dodatnich ładunków sprzyja lepszemu nagromadzeniu leku i adhezji do komórek, które są istotne dla opornych szczepów bakterii Gram-ujemnych. O zjawisku odwrotnej zależności liczby cząsteczek barwnika na gęstość komórek donosi Demidova i Hamblin dla fotodynamicznych sensybilizatorów i komórek bakteryjnych. Niniejsze badanie przyczynia się do dalszego zrozumienia zależności między strukturą i funkcją GaPc jako sensybilizatorów fotodynamicznych wobec komórek patogennych. Obie ftalocyjaniny galu wybrano jako leki perspektywiczne, z powodu wysokiej akumulacji w komórkach chorobotwórczych z grupy bakterii Gram-dodatnich, Gram-ujemnych i grzybów. Wyniki badań wychwytu GaPc podają, że kationowe kompleksy są bardziej tolerowane przez błony biologiczne niż anionowe i nie obdarzone ładunkiem analogi ftalocyjanin. Porównanie GaPc do ZnPcMe, wykazuje nieznaczną różnicę między GaPc dla komórek bakterii S. aureus (MRSA). To sugeruje, że skoordynowany jon metalu nie wpływa znacząco ona ogólny rozkład ładunku cząsteczek MPc z podstawnikami i ich zachowanie wobec błon biologicznych [20]. 108 Cytotoksyczność wybranych metaloftalocyjanin wobec mikroorganizmów 2. Podsumowanie Terapia fotodynamiczna skierowana przeciwko mikroorganizmom (PACT) opiera się na zniszczeniu struktur komórkowych, przez wytworzone w reakcji fotochemicznej reaktywne formy tlenu. Badania wykazują, że istnieją pewne parametry, które sprzyjają zachodzeniu tego procesu: struktura cząsteczki powinna zawierać fragmenty o ładunku dodatnim, czynnikiem wzmagającymi działanie antymikrobiologiczne jest obecność łańcuchów węglowodorowych, polipeptydów kationowych czy połączeń z przeciwciałami. Optymalny czas inkubacji to 5-10 minut dla bakterii Gram–dodatnich, 30 minut dla drożdży i bakterii Gram–ujemnych przy stężeniu 0,1- 0,5 mM. Warto zauważyć, że pomimo dużej liczby badań nad wpływem PACT na mikroorganizmy, nie odnotowano rozwoju oporności na PDT. To ważne zjawisko nie wydaje się być ograniczone tylko w stosunku do mikroorganizmów. Wykazano, że oprócz niezwykle rzadkich przypadków, komórki rakowe również nie rozwijają odporności na PDT. Nie jest jeszcze jasne, dlaczego PDT różni się pod tym względem od innych cytotoksycznych strategii, takich jak antybiotykoterapia i chemioterapia przeciwnowotworowa, gdzie rozwój oporności wielolekowej jest normą w następstwie powtarzającego się narażenia na działanie wolnego leku. Temat ten zasługuje na dalsze badania, a zrozumienie mechanizmów zaangażowanych w ten proces może pomóc w opracowaniu lepszych strategii dla innych form leczenia farmakologicznego. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. Kadish K., Guilard R., Smith K., The Porphyrin Handbook, Volume 17: Phthalocyanines: Properties and Materials, 17 (2002) Trytek M., Makarska M., Polska K., Radzki S., Fiedurek J., Porfiryny i ftalocyjaniny. Cz.1. Właściwości i niektóre zastosowania, Biotechnologia, 4 (71) (2005), s. 109-127 Hamblin M. R., Antimicrobial Photodynamic Therapy and Photodynamic Inactivation, or Killing Bugs with Dyes and Light, Photochemistry and Photobiology 88, (4) (2012), s. 496-498 Castano A. P., Demidova T. N., Hamblin M. R., Mechanism In photodynamic therapy: part one – photosensitizers, photochemistry and cellular localization, Photodiagnosis and Photodyamic Therapy, 1 (2004), s. 279-293 Castano A. P., Demidova T. N., Hamblin M. R., Mechanism In photodynamic therapy: part two – cellular signaling, cell metabolizm, and models of cell Heath, Photodiagnosis and Photodyamic Therapy, 2 (2005), s. 1-23 Castano A. P., Demidova T. N., Hamblin M. R., Mechanism In photodynamic therapy: part three – photosensitizer, pharmacokinetics, biodistribution, tumor localization and models of tumor destruction, Photodiagnosis and Photodyamic Therapy, 2 (2005), s. 91-106 109 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz, Gabriela Dyrda 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Calzavara-Pinton P., Rossi T., Salla R., Venturini M., Photodynamic Antifungal Chemotherapy, Photochemistry and photobiology, 88 (2012), s. 512-522 Contakes M. S., Beatty S. T., Dailey K. K., Rauchfuss T. B., Fenske D., πComplexes of Phthalocyanines and Metallophthalocyanines, Organometallics 19 (2000), s. 4767-4774 Wright M., Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT), Journal of Antimicrobial Chemotherapy 42 (1998), s. 13-28 Gośliński T., Konopka K., Piskorz J., Kryjewski M., Wierzchowski M., Sobiak S., Perspektywy zastosowania fotodynamicznej terapii skierowanej przeciw mikroorganizmom - PACT , Postępy mikrobiologii, 47, 4 (2008), s. 447-456 Sung N., Back S., Junh J., Kim K-H., Kim J-K., Lee J., Ra Y., Yang H., Lim Ch., Cho S., Kim K., Jiheon S., Inactivation of multidrug resistant (MDR) - and extensively drug resistant (XDR) Mycobacterium tuberculosis by photodynamic therapy, Photodiagnosis and photodynamic Therapy,10 (2013), s. 694-702 http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Barwienie-Grama/ Nyokong T., Effect of substituents on the photochemical and photophysical properties of main group metal phthalocyanines, Coordination Chemistry Rewievs, 251 (2007), s. 1707-1722 Yang K., Gitter B., Rugger R., Albrecht V., Wieland G. D., Fahr A., Wheat Germ Agglutinin Modified Liposomes for the Photodynamic Inactivation of Bacteria, Photochemistry and photobiology, 88 (4), (2012), s. 548-556 Nakonechny F., Nisnevitch M., Nitzan Y., Firer M., New techniques in antimicrobial photodynamic therapy: scope of application and overcoming drug resistance in nosocomial infections, Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances (2011). Spesia M. B., Caminos D. A., Pons P., Durantini E. N., Mechanistic inside of the photodynamin inactivation of Escherichia coli by a tetracationic zinc(II) pfthalocyanine derivative, Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, 6 (2009), s. 52-61 Spesia M. B., Rovera M., Durantini E. N., Photodynamic inactivation of Escherichia coli and Streptococcus mitis by cationic zinc(II) phthalocyanines in media with blood derivatives, European Journal of Medicinal Chemistry, 45 (2010), s. 2198-2205 Mantareva V., Kussovski V., Angelov I., Wohrle D., Dimitrov R., Popova E., Dimitrov S., Non-aggregated Ga(III)-phthalocyanines in the photodynamic inactivation of planktonic and biofilm cultures of pathogenic microorganisms. Photochemical and Photobiological Sciences, 10 (91) (2011), s. 91-102. Minnock A., Vernon D. I., Schofield J., Griffiths J., Parish J. H., Brown S. B., Photoinactivation of bacteria. Use of a cationic water-soluble zinc phthalocyanine to photoinactivate both Gram-negative and Gram-positive bacteria, Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 32 (1996), s. 159-164 Jori G., Camerin M., Soncin M., Guidolin L., Coppellotti O., Antimicrobial Photodynamic Therapy: Basic Principles, http://pubs.rsc.org | doi:10.1039/9781849733083-00001 110 Cytotoksyczność wybranych metaloftalocyjanin wobec mikroorganizmów 21. Mele G., Garcia-Lopez E., Palmisano L., Dyrda G., Słota R., Photocatalytic Degradation of 4-Nitrophenol in Aqueous Suspension by Using Polycrystalline TiO2 Impregnated with Lanthanide Double-Decker Phthalocyanine Complexes, Journal of Physical Chemistry C, 111 (2007), s. 6581-6588 Cytotoksyczność wybranych metaloftalocyjanin wobec mikroorganizmów Streszczenie Dokonano przeglądu literatury w zakresie cytotoksyczności metaloftalocyjanin wobec mikroorganizmów. W pracy zwrócono uwagę przede wszystkim na właściwości fotosensybilizacyjne ftalocyjanin oraz metaloftalocyjanin, które mogą być wykorzystane w terapii fotodynamicznej (PDT) oraz w fotodynamicznej terapii skierowanej przeciwko mikroorganizmom (PACT). Wykazano, że metaloftalocyjaniny bez podstawników, jak i kompleksy z podstawnikami aksjalnymi i/lub peryferyjnymi (t.j. pirydyna, grupy sulfonowe lub aminowe), a także ftalocyjaniny kationowe mogą być skuteczne w zwalczaniu bakterii (S. aureus E. coli), grzybów (np. S. cerevisiae) oraz wirusów (HSV). Działanie tych związków zależy głównie od możliwości ich przedostania się do wnętrza komórki lub osadzenia w błonie, na co ma wpływ budowa ściany komórkowej. Mechanizm procesów fotodynamicznych w komórkach mikroorganizmów jest nadal przedmiotem badań i jest on z pewnością równie złożony jak w przypadku komórek nowotworowych. Słowa kluczowe: metaloftalocyjaniny, cytotoksyczność, E. coli, S. cerevisiae, S. aureus 111 Katarzyna Barchiewicz1, Rudolf Słota4 Martyna Sztandera2, Karolina Jakubczyk3, Lipofilowe ftalocyjaniny dla terapii fotodynamicznej PDT 1. Wstęp 1.1. PDT Problemy, z jakimi borykają się klasyczne terapie przeciwnowotworowe, takie jak mała selektywność, czy skutki uboczne, skłoniły naukowców do poszukiwania nowych metod walki z nowotworami. Obiecująca wydaje się być terapia fotodynamiczna (PDT, photodynamictherapy), w której jako leki stosuje się fotouczulacze (PS, photosensitizer) - związki zdolne do absorpcji światła o określonej energii i następnie aktywowania innych cząsteczek. Taki lek nie wykazuje żadnej toksyczności, dopóki nie zostanie naświetlony światłem o odpowiedniej długości fali [1÷3]. Terapia polega na podaniu fotouczulacza pacjentowi a następnie, gdy nastąpi jego kumulacja w tkance nowotworowej, lek jest aktywowany poprzez naświetlanie. Pochłonięcie fotonu przez fotosensybilizator skutkuje jego wzbudzeniem, co jest początkiem kaskady reakcji prowadzącej do wytworzenia reaktywnych form tlenu (ROS, reactiveoxygenspecies), odpowiedzialnych za śmierć komórek nowotworowych. Warto przy tym zaznaczyć, że część energii pochłoniętej przez naświetlony fotouczulacz może zostać wyemitowana jako fluorescencja, co jest efektem wykorzystywanym w diagnostyce fotodynamicznej (PDD, photodynamicdiagnosis) [1÷3]. Ponadto PDT, poza terapią nowotworów,może znaleźć też zastosowanie w leczeniu m.in. reumatoidalnego zapalenia stawów, zwyrodnienia starczego plamki, a także zakażeń bakteryjnych, grzybiczych i wirusowych [4÷6]. 1.2. Lipofilowe ftalocyjaniny Związkami mogącymi znaleźć zastosowanie jako fotouczulacze są ftalocyjaniny – syntetyczne związki o intensywnej barwie, będące analogami 1 [email protected], Zakład Chemii Ogólnej, Wydział Chemii, Uniwersytet Opolski [email protected], Zakład Chemii Ogólnej, Wydział Chemii, Uniwersytet Opolski 3 [email protected], Zakład Chemii Ogólnej, Wydział Chemii, Uniwersytet Opolski 4 [email protected], Zakład Chemii Ogólnej, Wydział Chemii, Uniwersytet Opolski 2 112 Lipofilowe ftalocyjaniny dla terapii fotodynamicznej PDT porfiryn. W ich skład wchodzi makropierścień zbudowany z czterech pierścieni izoindolowych, połączonych mostkami azometinowymi i stabilizowany przez sprzężony układ wiązań π. Dodatkowo, atomy azotu w centrum pierścienia mogą skompleksować atom metalu. Kompleksy metaloftalocyjanin mogą mieć różnorodne struktury, spośród których dwa przykłady przedstawiono na rys. 1 [4]. Rysunek 5. Przykłady struktur molekularnych kompleksów ftalocyjaniny a) struktura płaska b) struktura sandwiczowa [opracowanie własne] Kompleksy ftalocyjaniny charakteryzuje bardzo duża stabilność termiczna i fotochemiczna. Są silnymi chromoforami, o maksimum absrobcji w granicach 600-800 nm, co jest szczególnie pożądaną cechą dla fotouczulaczy przeznaczonych do terapii fotodynamicznych. Takie pasma absorpcji nazywa się „oknami transmisyjnymi tkanek”, gdyż nie pokrywają się z pasmami absorpcji barwników występujących w układach biologicznych (np. hemu krwi). Dodatkowo ftalocyjaniny mają skłonność do kumulowania się w tkankach nowotworowych, a zastosowanie dodatkowo nośników leków (np. liposomów) może dodatkowo polepszać ten efekt [4, 7]. Szczególnie interesujące pod kątem wykorzystania w terapii PDT są diftalocyjaniny lantanowców. Kompleksy te charakteryzują się wysoką stabilnością oraz niską wydajnością kwantową fluorescencji, co oznacza, że większa część pochłoniętej przez nie energii zostanie spożytkowana z utworzeniem reaktywnych form tlenu, które stanowią podstawę terapii PDT. Na efektywność terapii fotodynamicznej wpływa też lokalizacja fotosensybilizatora w komórce. Czas życia ROS jest krótki, co sprawia, że działać będą one w pobliżu miejsca powstawania. Stwierdzono, że wyższą cytotoksyczność wobec komórek nowotworowych osiąga się wtedy, gdy fotouczulacz dostarczany jest do błony komórkowej, niż w przypadku wprowadzania go do wnętrza komórki. Taką lokalizację można osiągnąć 113 Katarzyna Barchiewicz, Martyna Sztandera, Karolina Jakubczyk, Rudolf Słota stosując lipofilowefotouczulacze, zwłaszcza jeśli ich transport odbywa się na nośniku w postaci liposomów [8, 9]. Przykładem związków łączących powyższe cechy są diftalocyjaniny lantanowców zawierające podstawniki pentadecylofenoksylowe (rys. 2). Zastosowane peryferyjne podstawniki nadają tym związkom wyjątkowo silne właściwości lipofilowe, znacznie zwiększając oddziaływanie z błoną komórkową, a tym samym efektywność lokalizacji w jej wnętrzu [8]. Rysunek 6. Struktura molekularna LnPc2-C8, gdzie C – podstawnik pentadecylofenoksylowy [opracowanie własne] 1.3. Liposomy Liposomy to sferyczne lub owalne struktury wodno-lipidowe, której rdzeń stanowi mikrokropelka fazy wodnej, otoczona bądź pojedynczą otoczką, zbudowaną z podwójnej warstwy lipidowej, bądź też kilkoma otoczkami złożonymi z błon lipidowych ułożonych naprzemiennie z warstwami wodnymi. Z powodu podobieństwa budowy liposomów do komórek, są one często wykorzystywane w badaniach jako uproszczony model do badania właściwości błon komórkowych [10]. Głównym składnikiem błon komórkowych są fosfolipidy (rys. 3). Cząsteczki fosfolipidów mają charakter amfifilowy – w ich budowie można wyróżnić część polarną (głowa fosfolipidu) i część niepolarną (ogony 114 Lipofilowe ftalocyjaniny dla terapii fotodynamicznej PDT fosfolipidu). Najważniejszym fosfolipidem budującym błonę komórkową jest fosfatydylocholina (rys. 4). Liposomy otrzymać można z wielu surowców, m. in. z lecytyny izolowanej z jaj kurzych (tzw. EYL, eggyolklecithine), której głównym składnikiem, podobnie jak błon komórkowych, jest fosfatydylocholina [11, 12]. Rysunek 7. Struktura błony fosfolipidowej komórek oraz liposomów [13] Rysunek 8. Budowa cząsteczki fosfatydylocholiny [opracowanie własne] Liposomy budzą szczególne zainteresowanie jako potencjalne nośniki leków, co wynika z ich licznych zalet. Ich budowa sprawia, że mogą być nośnikami zarówno leków hydrofilowych, które wówczas są transportowane w wodnym rdzeniu, jak i hydrofobowych, transportowanych wówczas we wnętrzu błony liposomalnej. Liposomy są obojętne dla układu immunologicznego organizmu, więc po wprowadzeniu leku w takim nośniku, nie będzie on niszczony przez przeciwciała. Nośniki te mogą być również stosowane w terapii celowanej, zwiększając efektywność transportu leków. Wszystkie te cechy czynią liposomy obiecującym nośnikiem, który być może zostanie wykorzystany również w terapii fotodynamicznej nowotworów PDT [10]. 115 Katarzyna Barchiewicz, Martyna Sztandera, Karolina Jakubczyk, Rudolf Słota 1.4. EPR Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR – Electronic Paramagnetic Resnonance) jest techniką pozwalającą badać układy zawierające niesparowane elektrony, np. rodniki. Metodę tę można zastosować również do badania układów, w których normalnie nie występują centra paramagnetyczne, jakimi są błony biologiczne. Wówczas konieczne jest wprowadzenie tzw. znaczników spinowych, zazwyczaj w postaci niedużych cząsteczek, posiadających trwałe centra paramagnetyczne (np. nitroksylowe). Cząsteczki sond spinowych lokują się w błonie komórkowej, gdzie ich ustawienie, jak i dynamika ruchu wymuszana jest sąsiedztwem fosfolipidów. W zależności od rodzaju użytej sondy, możliwe jest scharakteryzowanie błony fosfolipidowej w różnych obszarach dwuwarstwy [14, 15]. 1.4.1. Sonda 16-DOXYL, sonda TEMPO Sondy typu DOXYL lokują się w wewnętrznej części błony, gdzie polarność środowiska jest niewielka. Parametrem pomiarowym dla tego typu sond jest współczynnik korelacji rotacji τ, charakteryzujący szybkość rotacji sondy w błonie. Im większa jest sztywność błony lipidowej, tym większa jest wartość współczynnika τ. Sondy te występują w różnych odmianach, w zależności od położenia rodnika nitroksylowego w łańcuchu węglowodorowym i dzięki temu pozwalają scharakteryzować błonę na różnej głębokości (rys. 5). Wykorzystywana w badaniach sonda 16-DOXYL ma grupę nitroksylową w pozycji n=16 (rys. 6) i pozwala scharakteryzować centralną część błony [14, 15]. Rysunek 9. Schemat błony lipidowej interkalowanej hydrofobowym lekiem oraz sondami typu DOXYL [opracowanie własne] 116 Lipofilowe ftalocyjaniny dla terapii fotodynamicznej PDT Rysunek 10. Sonda 16-DOXYL Sonda TEMPO (rys. 7) pozwala scharakteryzować zmiany zachodzące w warstwie powierzchniowej błony. Jest ona rozpuszczalna w tłuszczach, alkoholu i wodzie, a parametrem pomiarowym jest w tym wypadku tzw. spektroskopowy współczynnik podziału F. Współczynnik F określa, w jakim stopniu sonda penetruje środowisko lipidowe. Gdy błona fosfolipidowa upłynnia się, rośnie udział sondy w warstwie lipidowej, a wartość współczynnika F rośnie (rys. 8) [16]. Rysunek 11. Sonda TEMPO Rysunek 12. Schemat błony lipidowej interkalowanej hydrofobowym lekiem oraz sondą typu TEMPO [opracowanie własne] 117 Katarzyna Barchiewicz, Martyna Sztandera, Karolina Jakubczyk, Rudolf Słota 2. Cel pracy Celem pracy było zbadanie nowego typu lipofilowychdiftalocyjanin neodymu, europu i gadolinu, zawierających peryferyjny podstawniki pentadecylofenoksylowe, pod kątem ich potencjalnego wykorzystania w terapii fotodynamicznej PDT. W badaniach wykorzystano technikę elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) dla określenia stopnia modyfikacji struktury modelu błony biologicznej, jaki stanowiły liposomy otrzymane z naturalnej lecytyny (EYL). W badaniach koncentrowano się na zmianach płynności błony, zarejestrowanych w jej warstwie powierzchniowej oraz centralnej, wywołanych przez wprowadzone do układu kompleksy diftalocyjanin. Ponieważ fotouczulacze w terapii PDT powinny charakteryzować się wysoką fotostabilnością, kolejnym etapem badań było określenie poziomu degradacji badanych kompleksów diftalocyjanin pod wpływem światła widzialnego oraz promieniowania UV. 3. Materiały i metody W badaniach wykorzystano diftalocyjaniny lantanowców LnPc2-C8 (gdzie Ln = Nd, Eu, Gd) zawierające peryferyjne podstawniki pentadecylofenoksylowe (C) z długimi łańcuchami alifatycznymi (C15H31), zsyntezowane w Zakładzie Chemii Ogólnej (Wydział Chemii, Uniwersytet Opolski); W badaniach EPR wykorzystano spektrometr EPR typ MX-210R oraz sondy spinowe 16-DOXYL i TEMPO (Sigma-Aldrich®); Lecytynę (EYL – eggyolklecithin), z której preparowano liposomy, otrzymano z żółtek jaj kurzych w laboratorium Wydziału Chemii Uniwersytetu Opolskiego; Liposomy preparowano z wykorzystaniem dezyntegratora ultradźwiękowego TECHPAN UD-20; Fotostabilność kompleksów ftalocyjaniny badano przy użyciu oświetlacza z wbudowaną lampą UV (typ Hg NU-8 firmy Herolab, λUV= 352 nm) oraz Spektrofotometru JASCO 650 UV-Vis. Badania fotostabilności wykonano w ramach niezależnej pracy [8]; Do wizualizacji i obróbki widm użyto programów: EPR System oraz Grapher 7 (Golden Software). 118 Lipofilowe ftalocyjaniny dla terapii fotodynamicznej PDT 4. Analiza wyników W badaniach zastosowano metodę elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) w celu sprawdzenia, w jakim stopniu wybrane lipofilowediftalocyjaniny o peryferyjnych podstawnikach pentadecylofenoksylowych (LnPc2-C8) mogą modyfikować błonę komórkową. Badania prowadzono na modelu błony komórkowej, jaki stanowiły liposomy otrzymane na drodze sonikacji z lecytyny wyizolowanej z żółtek jaj kurzych (EYL). W badaniach stosowano dwa rodzaje sond spinowych (16-DOXYL i TEMPO) pozwalające badać zmiany zachodzące na różnych głębokościach błony [17], na podstawie wartości parametrów spektroskopowych τ i F, wyznaczonych ze zmierzonych widm EPR (p. 4.1 i 4.2). Stężenie sond spinowych w próbce dobiera się eksperymentalnie i utrzymuje na odpowiednio niskim poziomie, aby zapobiec efektowi poszerzenia linii widmowych EPR, wywoływanym przez wzajemne oddziaływania między cząsteczkami sond. W przeprowadzonych badaniach stężenie znaczników w próbce nie przekraczało 1% molowego w stosunku do ilości cząsteczek lipidów błonowych. Oznakowane sondami liposomy domieszkowano ftalocyjaninami: NdPc2-C8, EuPc2-C8, GdPc2-C8 w ilości od 0,25% do 2,00% względem lecytyny. Dla każdego stężenia wykonano badania EPR dla 3 niezależnych próbek a punkty na wykresach w p. 4.1 i 4.2 przedstawiają wartości średnie. Wyniki pomiarów wszystkich wartości spektroskopowych były odczytywane bezpośrednio z widma wygenerowanego przez program obsługujący spektrometr EPR, z dokładnością do 1 piksela. Niepewności pomiarowe wyznaczono metodą różniczki zupełnej (ze wzorów na τ i F) i wynosiły one 1,5 – 2,0% i 2.0 – 3,0% odpowiednio dla parametru τ i F. Dichlorometan stosowano jako rozpuszczalnik dla badanych ftalocyjanin, a jego wpływ na błonę liposomalną został zbadany w próbie kontrolnej. Przykładowe uzyskane widma EPR przedstawiono na rys. 9. Badania fotostabilności omawianych kompleksów LnPc2-C8 wykonano w ramach niezależnej pracy, w niniejszej publikacji omówiono jedynie wnioski wynikające z uzyskanych wyników (dotyczą one dokładnie tych samych substancji) [8]. Stwierdzono, że w postaci stałej badane kompleksy nie ulegały fotodegradacji pod wpływem światła widzialnego jak również intensywnego promieniowania UV (λUV = 352 nm, irradiancja IUV = 300 μW/cm2). Natomiast w roztworze kompleksy te wykazywały różną trwałość. Stopień fotodegradacji LnPc2-C8 określano za pomocą spektrofotometru UV-Vis na podstawie pomiarów zmian absorbancji roztworów kompleksów poddanych działaniu promieniowania UV. Pomiary wykonywano w zakresie 190 – 1100 nm. Wyniki omówiono w p. 4.3. 119 Katarzyna Barchiewicz, Martyna Sztandera, Karolina Jakubczyk, Rudolf Słota Rysunek 13. Widma EPR zarejestrowane dla liposomów uzyskanych z EYL oraz dla tych samych liposomów z dodatkiem 2,0% EuPc2-C8; a) widma uzyskane przy użyciu sondy 16DOXYL; b) widma uzyskane przy użyciu sondy TEMPO [17] 4.1. EPR z użyciem sondy 16-DOXYL Sonda 16-DOXYL lokuje się wewnątrz błony lipidowej, dzięki czemu można scharakteryzować jej centralną część, na poziomie dolnego fragmentu łańcucha węglowodorowego fosfolipidów. Parametrem charakteryzującym płynność błony jest w tym przypadku współczynnik korelacji rotacyjnej τ [s], który określa szybkość rotacji sondy w błonie. Im mniejsza jest jego wartość, tym bardziej płynne jest środowisko lipidowe. Współczynnik korelacji rotacyjnej wyraża się wzorem przedstawionym na rys. 10. Rysunek 14. Wyznaczanie współczynnika korelacji rotacyjnej τ na podstawie widma EPR uzyskanego dla sondy 16-DOXYL [18] 120 Lipofilowe ftalocyjaniny dla terapii fotodynamicznej PDT czas korelacji rotacyjnej τ·10-10 [s] Jako rozpuszczalnik stosowany do wprowadzania diftalocyjanin do liposomów wybrano dichlorometan, stanowi więc on tło zmian zachodzących pod wpływem kompleksów. W próbie kontrolnej badano wpływ samego rozpuszczalnika na płynność błony (rys. 11). Stwierdzono, że dichlorometan powoduje wyraźne upłynnienie błony, o czym świadczy zmniejszenie wartości czasu korelacji rotacyjnej τ. Wpływ ten jest zależny od stężenia domieszki rozpuszczalnika do liposomów, choć nie jest to zależność prostoliniowa. CH2Cl2 6 5 4 3 2 1 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,50 2,00 stężenie domieszki [%mol] Rysunek 15. Wpływ stężenia domieszki rozpuszczalnika (dichlorometanu) na płynność dwuwarstwy lipidowej; wyniki otrzymane przy zastosowaniu sondy 16-DOXYL Największą zmianę stopnia upłynnienia błony obserwuje się przy dodatku pierwszej porcji rozpuszczalnika (0,25%). Sukcesywne zwiększenie ilości dichlorometanu do wartości 1,5 % nie spowodowało większych fluktuacji płynności w centralnej części błony (ok. 8% w stosunku do średniej wartości τ w tym zakresie), jednak przy stężeniu 2% ponownie następuje znaczne upłynnienie błony (rys. 11). Największy wpływ na stopień upłynnienia błony wywierał kompleks z europem (EuPc2-C8). Chociaż przy stężeniu 0,75% zaobserwowano niewielkie zwiększenie wartości parametru τ w stosunku do mniejszych stężeń domieszki, to generalnie kompleks ten upłynnia błonę, o czym świadczy znaczne zmniejszenie wartości czasu korelacji rotacyjnej przy stężeniu 2% (rys. 12). 121 Katarzyna Barchiewicz, Martyna Sztandera, Karolina Jakubczyk, Rudolf Słota EuPc2-C8 czas korelacji rotacyjnej τ·10-10 [s] 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,25 0,50 0,75 1,00 1,50 2,00 stężenie domieszki [%mol] Rysunek 16. Wpływ stężenia domieszki kompleksu EuPc2-C8 na płynność dwuwarstwy lipidowej; wyniki otrzymane przy zastosowaniu sondy 16-DOXYL Kompleks z neodymem (NdPc2-C8) charakteryzował się dość dużą dynamiką zmian płynności błony. Przy niskich stężeniach – do 0,75% parametr τ malał, co świadczyło o upłynnieniu błony. W przedziale 0,751,5% stężenia domieszki następowało usztywnienie błony lipidowej, natomiast powyżej 1,5% stężenia – ponowne upłynnienie błony (rys. 13). Duże wahania parametru τ zaobserwowano również dla kompleksu diftalocyjaniny gadolinu (GdPc2-C8). Przy niewielkim stężeniu domieszki (0,25%) błona była znacznie upłynniania, natomiast w przedziale 0,25-0,75% następowało stopniowe usztywnianie się błony lipidowej. Powyżej tego stężenia ponownie następowało upłynnianie się błony, a przy najwyższym, 2% stężeniu domieszki – ponowne jej usztywnienie (rys. 13). Wahania parametru τ w kierunku usztywnienia się błony mogą być spowodowane przez agregację kompleksów diftalocyjanin. Tworzenie się agregatów jest szczególnie znaczące dla kompleksu z gadolinem, gdyż jak zaobserwowano w trakcie badań, kompleks ten charakteryzował się najmniejszą rozpuszczalnością w środowisku lipidowym. 122 Lipofilowe ftalocyjaniny dla terapii fotodynamicznej PDT Rysunek 17. Zestawienie zmian płynności błony liposomów EYL pod wpływem dodatku kompleksów diftalocyjanin: NdPc2-C8, EuPc2-C8, GdPc2-C8, w porównaniu do samego rozpuszczalnika (CH2Cl2) oraz ftalocyjaniny bezmetalicznej (H2Pc-C4) 4.2. EPR z użyciem sondy TEMPO Sonda TEMPO pozwala scharakteryzować zmiany zachodzące na granicy faz przy powierzchni błony. Jest ona rozpuszczalna zarówno w wodzie, jak i alkoholach oraz tłuszczach. Parametrem pomiarowym dla tego rodzaju sondy jest tzw. spektroskopowy współczynnik podziału (F), określający, w jakim stopniu sonda penetruje środowisko lipidowe, a w jakim środowisko wodne otaczające liposomy. Im większa jest wartość parametru F, tym większy jest udział sondy TEMPO w warstwie lipidowej i tym większa jest płynność błony. Spektroskopowy współczynnik podziału wyrażony jest wzorem przedstawionym na rys. 14. Rysunek 18. Wyznaczanie spektroskopowego współczynnika podziału F na podstawie widma EPR uzyskanego dla sondy TEMPO, gdzie: H – określa udział sondy w warstwie lipidowej; P – określa udział sondy w warstwie wodnej [18] 123 Katarzyna Barchiewicz, Martyna Sztandera, Karolina Jakubczyk, Rudolf Słota Dichlorometan w niewielkim stopniu rozpuszcza się w wodzie, sam jest dobrym rozpuszczalnikiem dla tłuszczów, stąd spodziewano się wzrostu płynności błony lipidowej przy jego dodatku. Badania potwierdziły to przypuszczenie – wraz ze wzrostem stężenia domieszki dichlorometanu zwiększała się wartość współczynnika F, co świadczy o tym, że większa część sond TEMPO dyfundowała z fazy wodnej do fazy lipidowej (rys. 15). CH2Cl2 współczynnik F 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,0 0,3 0,5 0,8 1,0 stężenie domieszki [%mol] 1,5 2,0 Rysunek 19. Wpływ stężenia domieszki rozpuszczalnika (dichlorometanu)na płynność dwuwarstwy lipidowej; wyniki otrzymane przy zastosowaniu sondy TEMPO W przypadku kompleksu z neodymem (NdPc2-C8) zaobserwowane zmiany płynności nie odbiegały znacznie od tych zaobserwowanych dla samego dichlorometanu, co świadczy o tym, że ten kompleks w niewielkim stopniu modyfikuje warstwę powierzchniową błony liposomów. Niewiele większe fluktuacje parametru F zaobserwowano dla kompleksu z gadolinem (GdPc2-C8), choć i w tym przypadku stwierdzić można, że aktywność kompleksu w warstwie powierzchniowej błony liposomalnej była niewielka. Największe fluktuacje wartości parametru F zaobserwowano w przypadku diftalocyjaniny europu (EuPc2-C8). Przy niewielkim stężeniu domieszki kompleksu (do 0,5%) nastąpiło nieznaczne usztywnienie błony. W przedziale 0,5-1,0% stężenia domieszki następowało stopniowe upłynnienie błony, o czym świadczy wzrost wartości parametru F. Powyżej tego stężenia powierzchniowa część błony ponownie ulegała usztywnieniu (rys. 16). 124 Lipofilowe ftalocyjaniny dla terapii fotodynamicznej PDT EuPc2-C8 współczynnik F 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,25 0,50 0,75 1,00 1,50 2,00 stężenie domieszki [%mol] Rysunek 20. Wpływ stężenia domieszki kompleksu EuPc2-C8 na płynność dwuwarstwy lipidowej; wyniki otrzymane przy zastosowaniu sondy TEMPO Chociaż zaobserwowano pewne zmiany wartości współczynnika F, to były one raczej niewielkie, co świadczy o tym, że stosowane dodatki były aktywne głównie w środkowej części błony, a znacznie mniej wpływały na warstwę powierzchniową. Porównując wyniki otrzymane przy zastosowaniu sond 16-DOXYL i TEMPO można stwierdzić, że stosowany rozpuszczalnik (dichlorometan) powodował upłynnienie błony. Stwierdzono również, że kompleksem najsilniej oddziałującym z błoną liposomalną był EuPc2-C8, przy czym kompleks ten lokował się głównie wewnątrz dwuwarstwy lipidowej. Badania kinetyki zmian płynności błony wykonano przy użyciu sondy TEMPO, w czasie 130 h. Wyniki przedstawiono na rys. 17. Wartości otrzymane dla poszczególnych kompleksów LnPc2-C8 oraz ftalocyjaniny bezmetalicznej H2Pc-C4 są do siebie podobne, jak również nie odbiegają od wyników uzyskanych dla próbki kontrolnej użytego rozpuszczalnika (dichlorometanu). Świadczy to o tym, że stosowane domieszki w niewielkim stopniu modyfikowały powierzchniową warstwę błony lipidowej. 125 Katarzyna Barchiewicz, Martyna Sztandera, Karolina Jakubczyk, Rudolf Słota Rysunek 21. Kinetyka zmian spektroskopowego współczynnika podziału F w funkcji czasu dla badanych kompleksów diftalocyjanin (NdPc2-C8, EuPc2-C8, GdPc2-C8) w porównaniu do monoftalocyjaninybezmetalicznej (H2Pc-C4) i czystego rozpuszczalnika (CH2Cl2) Wraz z upływem czasu wartości spektroskopowego współczynnika podziału malały, co świadczy o zmniejszeniu się udziału sondy TEMPO w warstwie lipidowej, a więc o usztywnieniu się błony. Przyczyną takiego zjawiska może być stopniowe uporządkowanie cząsteczek domieszek w strukturze błony fosfolipidowej w czasie. Najbardziej aktywny wydaje się być przy tym kompleks z gadolinem, natomiast największy efekt stabilizujący zaobserwowano dla kompleksu z europem. 4.3. Fotostabilność Fotouczulacze stosowane w terapii fotodynamicznej powinny charakteryzować się odpowiednio dużą fotostabilnością. Kompleksy diftalocyjanin badano pod względem fotostabilności w warunkach naświetlania promieniowaniem UV-352 nm w czasie 6 h. Stopień degradacji związków określano na podstawie różnic w widmach absorpcyjnych próbki przed i po naświetleniu. Analizowano zmiany absorbancji dla najbardziej intensywnych pasm w zakresie 325-345 nm oraz 620-690 nm. Stwierdzono, że podczas naświetlania kompleksy EuPc2C8 i GdPc2-C8 ulegały fotodegradacji w ilości 7%. Kompleks NdPc2-C8 w tych warunkach wykazywał znacznie mniejszą fotostabilność – degradował on w 19% [8]. Wszystkie badane kompleksy diftalocyjanin były natomiast odporne na światło widzialne. 126 Lipofilowe ftalocyjaniny dla terapii fotodynamicznej PDT 5. Wnioski 1. Diftalocyjaniny lantanowców, zawierające lipofilowe grupy pentadecylofenoksylowe (NdPc2-C8, EuPc2-C8, GdPc2-C8) lokują się w wewnętrznej części błony lipidowej, o czym świadczą zmiany czasu korelacji rotacyjnej sondy 16-DOXYL. 2. Badane diftalocyjaniny nie lokują się w zewnętrznej części dwuwarstwy lipidowej, o czym świadczą niewielkie zmiany spektroskopowego współczynnika podziału dla sondy TEMPO. 3. Najbardziej aktywnym kompleksem był EuPc2-C8, co świadczy o tym, że najsilniej oddziałuje z błoną lipidową. 4. Dichlorometan, użyty jako rozpuszczalnik, w znacznym stopniu wpływał na płynność błony, co miało wpływ na wyniki i interpretację pomiarów EPR. Problem ten powinien zostać rozwiązany przed kolejnym etapem badań, np. poprzez zmianę rodzaju stosowanego rozpuszczalnika. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Choromańska A., Kulbacka J., Saczko J.,Terapia fotodynamiczna – założenia, mechanizm, aplikacje kliniczne, Nowa Medycyna, 1 (2013), s. 26-30 Mroz P.,Yaroslavsky A.,Kharkwal G. B.,Hamblin M. R., Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer, Cancers, 2 (2011), s. 2516-2539 Osmałek T., Gośliński T., Mielcarek J., Osmałek E., Nowe tendencje oraz bezpieczeństwo terapii fotodynamicznej, Przegląd Lekarski, 69 (2012), s. 1205-1208 Trytek M., Makarska M., Polska K., Radzki S., Fiedurek J., Porfiryny i ftalocyjaniny. Cz.1. Właściwości i niektóre zastosowania. Biotechnologia, 71 (2005), s. 109-127 O’Riordan K., Akilov O. E., Hasan T.,The potential for photodynamic therapy in thetreatment of localized infections, Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, 2 (2005), s. 247-262 Donelly R. F., McCarron P. A., Tunney M. M., Antifungal photodynamic therapy, Microbiological Research, 163 (2008), s. 1-12 Jiang, Z. Shao, J. Yang, T. Wang, J, Jia, L. Pharmaceutical development, composition and quantitative analysis of phthalocyanine as the photosenstizer for cancer photodynamic therapy, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 87 (2014), s. 98-104 Słota R., Dyrda G., Hofer M., Mele G., Bloise E., Del Sole R., Novel lipophilic lanthanide bis-phthalocyanines functionalized by pentadecylphenoxy groups: Synthesis, characterization and UV-photostability, Molecules 17 (2012), s. 10738-10753 Kima J., Santos O. A., Park J-H, Selective photosensitizer delivery into plasma membrane for effective photodynamic therapy, Journal of Controlled Release, 191 (2014), s. 98-104 127 Katarzyna Barchiewicz, Martyna Sztandera, Karolina Jakubczyk, Rudolf Słota 10. Jankowski A., Sarecka-Hujar B., Wysocka J., Liposomy – postać modyfikująca transport substancji aktywnych przez skórę. Część 1. Zastosowanie w transporcie leków o działaniu miejscowym, Annales Academiae Medicae Silesiensis, 65, (2011), s. 38-44 11. Alberts B., Bray D., Hopkin K., Johnson A, Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P., Podstawy biologii komórki. Część 2,Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2007 12. Sarecka-Hujar B., Jankowski A.,Wysocka J., Liposomy – postać modyfikująca transport substancji aktywnych przez skórę. Część 2. Zastosowanie w transporcie leków o działaniu ogólnoustrojowym, Annales Academiae Medicae Silesiensis, 65 (2011), s. 45-50 13. Elnaggar Y. S. R., El-Refaie W. M., El-Massik M. A., Abdallah O. Y., Lecithin-based nanostructured gels for skin delivery: An update on state of art and recent applications, Journal of Controlled Release, 180 (2014), s. 10-24 14. Man D., Słota R., Broda M. A., Mele G., Li J., Metalloporphyrin intercalation in liposome membranes: ESR study, Journal of Biological Inorganic Chemistry, 16 (2011), s. 173-181 15. Nowak J., Nedoszytko B., Badania strukturalne błon komórkowych erytrocytów, limfocytów i granulocytów u chorych z łuszczycą z wykorzystaniem metody znakowania spinowego, Annales Academiae Medicae Gedanensis, 35 (2005), s. 139-147 16. Boniewska-Bernacka E., Man D., Słota R., Broda M. A., Effect of tin and lead chlorotriphenyl analogues on selected living cells, Journal of Biochemical and Molecular Toxicology, 25 (2011), s. 231-237 17. Sztandera M., Badania aktywności biochemicznej wybranych ftalocyjanin zawierających lipofilowa grupy funkcyjne, praca magisterska, Zakład Chemii Ogólnej, Uniwersytet Opolski, Opole 18. Hemminga M. A., Interpretation of ESR and saturation transfer ESR spectra of spin labeled lipids and membranes, Chemistry and Physics of Lipids 32 (1983), s. 323-383 128 Lipofilowe ftalocyjaniny dla terapii fotodynamicznej PDT Lipofilowe ftalocyjaniny dla terapii fotodynamicznej PDT Streszczenie Terapia fotodynamiczna (PDT) jest nowym typem terapii chorób, zwłaszcza nowotworowych, wykorzystujących światłoczułe związki, które po naświetleniu światłem o odpowiedniej długości fali mają zdolność do wytwarzania reaktywnych form tlenu, które niszczą chore komórki. Szczególnie interesujące wydają się funkcjonalizowane diftalocyjaniny lantanowców, gdyż wykazują one silną absorpcję promieniowania o długości fali powyżej 600 nm, co jest ważne dla terapii PDT. Efektywność PDT jest również zależna od miejsca lokalizacji fotouczulacza w komórce, co jest bezpośrednio związane z jego budową chemiczną. Fotouczulaczelipofilowe stosunkowo łatwo penetrują warstwę fosfolipidową i mają tendencję do kumulowania się w błonie komórkowej. W trakcie badań sprawdzano możliwość penetracji błony fosfolipidowej przez lipofilowediftalocyjaniny Nd, Eu i Gd z podstawnikami pentadecylofenoksylowymi, zawierającymi człon alifatyczny C 15H31. Badania prowadzono wykorzystując model liposomowy i metodę sond spinowych EPR, umożliwiającą analizę zmian płynności środowiska fosfolipidowego błony pod wpływem wprowadzonego do niej związku. Stwierdzono, że badane ftalocyjaniny przenikają do wnętrza błony i mają wyższą tendencję do lokalizacji w jej środkowej części, niż w warstwie granicznej. Najbardziej aktywny był kompleks z Eu – najsilniej upłynniał błonę, najmniejsze upłynnienie natomiast uzyskano w przypadku kompleksu z Nd. Wykazano również, że pewien wpływ na płynność błony wywierał sam rozpuszczalnik, co uwzględniono w wynikach. Otrzymane wyniki świadczą o tym, że badane diftalocyjaniny mogą przenikać do tkanek poprzez błonę komórkową i prawdopodobnie mogą być dostarczane do komórki za pośrednictwem liposomów, co jest bardzo ważne ze względu na ich potencjalne wykorzystanie dla celów PDT. Słowa kluczowe: PDT, diftalocyjaniny lantanowców, błona komórkowa, liposomy, EPR 129 Irena Boluch1, Jakub Knurek2, Monika Kurpas3 Rola miRNA w leczeniu chorób nowotworowych na przykładzie raka szyjki macicy 1. Wstęp Nowotwory należą do grupy chorób o wysokim priorytecie diagnostycznym, gdyż większość z nich jest śmiertelna. Nowotworzenie (kancerogeneza) jest skomplikowanym procesem, który zajmuje zwykle wiele lat. Większość nowotworów jest spowodowana działaniem czynnika zewnętrznego takiego jak infekcja wirusa, promieniowanie lub substancje chemiczne. Pozostałe przyczyny związane są z predyspozycjami dziedziczonymi od rodziców. Płaskonabłonkowy rak szyjki macicy jest trzecim najbardziej złośliwym nowotworem występującym u kobiet, dlatego istotne jest poszukiwanie skutecznych i szybkich metod, które umożliwią jego wykrywanie i będą wspierały wykorzystywane obecnie leczenie. Taką możliwość pokazały intensywne badania nad mikro RNA (miRNA). Są to jednoniciowe, krótkie, (ok. 20-nukleotydowe) cząsteczki RNA, które odpowiadają za regulację ekspresji genów biorących udział w apoptozie, podziale i różnicowaniu komórek oraz w wielu innych procesach istotnych dla przeżycia komórki. miRNA powstają na drodze transkrypcji przeprowadzanej przez polimerazę RNA II. W jej wyniku tworzone są primiRNA, które następnie są przycinane do struktury spinki do włosów przez jądrową RNAzę III (enzym Drosha) [1]. Wytworzone w nukleoplazmie pre-miRNA jest transportowane do cytoplazmy, gdzie enzym Dicer (o aktywności RNAzy), doprowadza je do formy natywnej. W cytoplazmie miRNA wiąże się z białkami Argonaute (Ago), TRBP oraz PACT tworząc stabilny kompleks miRISC.[2]. Głównymi sposobami ingerencji miRNA w cykl komórkowy powodującymi nowotwory jest oddziaływanie na protoonkogeny lub hamowanie genów supresorowych. miRNA mogą funkcjonować także jako „onkomiry”. Do onkomirów zaliczane są cząsteczki miRNA pełniące rolę negatywną dla organizmu w aspekcie 1 , Studenckie Koło Naukowe Mikrobiologów „Bakcyl”, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej 2 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Mikrobiologów „Bakcyl” oraz Studenckie Koło Naukowe Biochemików Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii CurieSkłodowskiej 3 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Mikrobiologów „Bakcyl”, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej 130 Rola miRNA w leczeniu chorób nowotworowych na przykładzie raka szyjki macicy rozwoju nowotworu. Badania krwi oraz płynów ustrojowych pacjentów chorych na nowotwór wykazały obecność w nich miRNA, z czego wynika, że mogą służyć jako biomarkery w wykrywaniu nowotworu [3]. Obecnie zidentyfikowano ponad 6000 miRNA u zwierząt, roślin, grzybów i wirusów, z czego ponad 1500 z nich należy do kwasów nukleinowych człowieka [4]. 2. Nowotwór szyjki macicy Nowotwór szyjki macicy (łac. carcinoma colli uteri) jest jednym z najczęstszych rodzajów nowotworów złośliwych dotykających kobiety. Szacuje się, że rocznie w Polsce ok. 3500 kobiet zapada na tę chorobę, a zachorowalność wzrasta wraz z wiekiem. Do trzydziestego roku życia najczęściej obserwowane są wczesne fazy nowotworu [5]. Główną przyczyną jest zakażenie onkogennym wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV). Za inne czynniki ryzyka uważane są wczesne rozpoczęcie życia płciowego, stosowanie antykoncepcji hormonalnej, palenie papierosów, złe warunki ekonomiczne, obniżenie odporności wywołane infekcjami bakteryjnymi oraz wirusowymi [6]. Kluczową rolę w zmniejszeniu zapadalności na nowotwór szyjki macicy odgrywają regularne badania ginekologiczne. Do wirusów HPV o największym potencjale onkogennym zaliczamy typy 16, 18 oraz 31. Wektory te przenoszone są wyłącznie drogą płciową. Z badań populacyjnych wynika, że około połowa kobiet aktywnych seksualnie jest narażona na kontakt przynajmniej z jednym typem HPV wywołującym zakażenia narządów płciowych. Wraz z wiekiem kobiety infekcje mogą przejść w fazę przewlekłą lub ulec transformacji nowotworowej. Kluczową rolę w przeciwdziałaniu nowotworowi szyjki macicy odgrywa profilaktyka. Regularne badania pozwalają wykryć wczesne fazy raka, co umożliwia leczenie. Rak szyjki macicy jest uleczalny. We wczesnych fazach choroby, u młodych kobiet stosuje się chirurgię laserową, kriochirurgię czy elektrokauteryzację. Większość przypadków nowotworu stanowi forma płaskonabłonkowa [5]. Oprócz niej występować mogą także gruczolakoraki, formy gruczołowo-płaskonabłonkowe, szklistokomórkowe, neuroendokrynne oraz drobnokomórkowe [6]. Pierwszym badaniem diagnostycznym pozwalającym na rozpoznanie nowotworu jest analiza próbki cytologicznej. Pozwala on na klasyfikację rozmazu pod względem jakości, charakterystyki (obraz prawidłowy lub nieprawidłowy) oraz obecności zmian nowotworowych. Część opisowa skupia się na zmianach nabłonka wielowarstwowego płaskiego (dysplazjach, zmianach atypowych), gruczołowego (nacieki) oraz komórek endometrium [8]. Do kolejnych istotnych badań diagnostycznych należą 131 Irena Boluch, Jakub Knurek, Monika Kurpas kolonoskopia oraz biopsja „podejrzanego” fragmentu szyjki macicy. W przypadku wykrycia nowotworu klasyfikuje się go na podstawie stopnia zaawansowania według FIGO (The International Federation of Ginecology and Obstetrics) [9]. W przypadku wczesnego rozpoznania możliwe jest zachowanie narządu rodnego kobiety. Szczególnie w przypadku młodych kobiet, u których zmiany ograniczyły się do dysplazji lub raka nienaciekającego, leczenie oszczędzające jest wysoce wskazane. Wśród technik pozwalających na taki zabieg znajdują się: chirurgia laserowa, metoda LEEP-LOOP (z użyciem pętli elektrycznej), kriochirurgia, czy elektrokauteryzacja [6]. W bardziej zaawansowanych stopniach nowotworu stosuje się radioterapię połączoną z chemioterapią lub zabiegiem operacyjnym. 3. Rola miRNA w nowotworzeniu miRNA działając na ekspresję genów wpływa w komórce na wzmocnienie lub osłabienie procesów odpowiedzialnych za wzrost, różnicowanie oraz podział [Rysunek 1]. Rysunek 1. Działanie miRNA w indukcji kancerogennej. Podwyższenie ekspresji miRNA może powodować wyciszenie ekspresji genu supresorowego, zaś obniżenie ekspresji innego miRNA – zwiększenie ekspresji onkogenu [10] 132 Rola miRNA w leczeniu chorób nowotworowych na przykładzie raka szyjki macicy miRNA jest w stanie wchodzić w interakcje z genami supresorowymi oraz protoonkogenami determinując ich ekspresję w komórce i propagując kancerogenezę. Prowadzi to do zahamowania apoptozy, skutkuje też nasiloną proliferacją, angiogenezą oraz nabyciem zdolności do tworzenia metastaz. Dzięki licznym badaniom zlokalizowano kilkanaście rodzajów miRNA, będących markerami nowotworowymi w przypadku raka szyjki macicy [Tabela 1]. Tabela 1.Wybrane miRNA propagujące nowotwór szyjki macicy miRNA miRNA-135 miRNA-145 miRNA-182 miRNA-196 miRNA-214 miRNA-218 miRNA-222 miRNA-494 miRNA-590 Wpływ Promocja angiogenezy i powstawania metastaz do wątroby Marker nowotworowy, zwiększa promienioczułość komórek nowotworu Marker nowotworowy Promocja proliferacji komórek Działa jako gen supresorowy, pośredniczy w różnicowaniu i starzeniu komórek szyjki macicy oraz replikacji wirusów Marker nowotworowy, jego ekspresja jest ograniczona przez wniknięcie wirusa HPV-16 Promocja proliferacji i migracji komórek Hamowanie tworzenia przerzutów Wzrost komórek nowotworu, inwazja na nowe komórki szyjki macicy Źródło [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] Obecnie jako biomarkery w diagnostyce raka szyjki macicy stosowane są antygeny komórek nowotworu płaskonabłonkowego (SCCA) oraz antygen karbohydrazy 125 (CA125) - są one jednak mało specyficzne i wykazują niewielką czułość. Alternatywą dla tych metod mogą się okazać właśnie cząsteczki miRNA. W badaniach chińskiego zespołu badawczego zauważono, że ekspresja mi-RNA u kobiet przed i po operacji usunięcia guza różni się w przypadku 291 na 338 różnych miRNA, które można zbadać w surowicy. Wskazuje to na możliwość wykorzystania tych cząsteczek jako elementu zarówno diagnostyki (przed rozpoczęciem leczenia), jak i monitoringu (już po usunięciu nowotworu). Badania wykazały, że ze względu na największe różnice w ekspresji miRNA, najskuteczniejszymi markerami byłyby MiR-646, miR-141 i miR-542-3p. Taka metoda diagnostyki jest dużo czulsza i bardziej specyficzna. Dodatkowo jest ona całkowicie nieinwazyjna dla pacjentek. 133 Irena Boluch, Jakub Knurek, Monika Kurpas Tabela 3. Ekspresja miRNA w nowotworze szyjki macicy po wprowadzeniu wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV) Obniżenie ekspresji miRNA-23b, miRNA-34a, miRNA-101, miRNA-143, miRNA-145, miRNA-218, miRNA-424 Podwyższenie ekspresji Źródło miRNA-15a, miRNA146a, miRNA-223, [20] miRNA-10b, miRNA-29a, miRNA-99a, miRNA-125b, miRNA-126, miRNA-218, miRNA-375, miRNA-424 miRNA-15b, miRNA-16, miRNA-17, miRNA-20a, miRNA-20b, miRNA-93, miRNA-106a, miRNA-155, miRNA-224 [21] miRNA-23b, miRNA-143, miRNA-196b miRNA-21 [22] miRNA-218, miRNA-433 miRNA-21, miRNA-124, miRNA-135b, miRNA-141, miRNA-223, miRNA-301b, miRNA-449a, miRNA-449b, miRNA-517a, miRNA-517c, miRNA-545 [23] miRNA-26a, miRNA-29a miRNA-143, miRNA-145, miRNA-99a,miRNA-199a, miRNA-203, miRNA- 513 miRNA-10a, miRNA-132, miRNA-148a, miRNA196a, miRNA-302b [24] miRNA-149, miRNA203 miRNA-9, miRNA-127, miRNA-199b, miRNA-199s, miRNA-214 [25] 4. Potencjalna rola miRNA-218 w leczeniu uzupełniającym raka szyjki macicy. miRNA-218 reguluje ekspresję genów supresorowych na zasadzie sprężenia zwrotnego. W indukcji raka szyjki macicy główną role odgrywa najczęściej wirus brodawczaka HPV 16 lub HPV 18. Wirus HPV przenosi do komórek geny kodujące białka E6 oraz E7. Białko E7 posiada zdolność wiązania się do białek TBP, kinazy H1 i cykliny E, dzięki czemu genom wirusa może wbudować się do genomu atakowanej przez niego komórki. Białko E7 posiada również zdolność tworzenia kompleksu z genem kodującym białko pRB oraz czynnikiem transkrypcyjnym E2F, w wyniku czego ulega ono ubikwitynacji a uwolniony czynnik transkrypcyjny E2F łączy się z promotorem genu C-Myb zmieniając jego ekspresje oraz zmniejsza ekspresje genu C-Myc, w wyniku czego regulacja ekspresji miRNA zależy od związania się C-Myb lub C-Myc z sekwencją promotorową klastru miRNA. W efekcie zwiększenie poziomu miR-15a/miR-16-1 134 Rola miRNA w leczeniu chorób nowotworowych na przykładzie raka szyjki macicy powoduje unieśmiertelnienie komórki oraz wzmożoną proliferację. [Rys.2] [27]. Natomiast białko E6 aktywuje ubikwitynację białka p53, fragmenty którego oddziałują z sekwencją promotorową klastru wybranych miRNA, których nadekspresja skutkuje z kolei zmianą poziomu cyklin odpowiedzialnych za regulację cyklu komórkowego. [Rys.2] [27] Rysunek 2. Inicjacja transformacji nowotworowej w komórkach nabłonkowych szyjki macicy poprzez czynniki białkowe E6 i E7 po zainfekowaniu wirusem HPV [27] Dla formy HPV 16 raka szyjki macicy właściwe jest obniżenie ekspresji miRNA-218 oraz genu SLIT2. W procesy te zaangażowane jest białko E6. Dodatkowo na zmniejszenie poziomu miRNA-218 na poziomie transkrypcyjnym może wpływać gen LAMB3. [16] Jak wykazują najnowsze badania dotyczące potencjalnego znaczenia miRNA w leczeniu raka szyjki macicy, w przypadku długotrwałej radioterapii i obniżenia jej skuteczności, cząsteczki miRNA-218 wykazują zdolność do ponownego zwiększenia podatności komórek rakowych na radioterapię. Aby to wykazać wykorzystano (jako linie starterowe) tkanki pobrane od pacjentów ze szpitala Affiliated Hospital of Jiangnan University (Wuxi , China). Część materiału pobranego od pacjentów chorych na raka szyjki macicy została przechowana w temperaturze -80◦C. Druga część tkanek została poddana pasażowaniu i hodowli na 96-dołkowej płytce 135 Irena Boluch, Jakub Knurek, Monika Kurpas w temperaturze 37◦C, a następnie została potraktowana promieniowaniem o określonej dawce. W badaniu zostały wykorzystane cztery linie komórkowe, między innymi linia HeLa. Stały poziom transkrypcji miRNA-218 w komórkach tej linii został uzyskany poprzez transfekcję plazmidu ekspresyjnego pGenesil-1-miR-218. Następnie wyizolowano miRNA-218. Analiza roli cząsteczek miRNA-218 w indukowaniu zmian poziomu apoptozy komórek nowotworowych została dokonana na hodowli komórkowej względem kontroli negatywnej. Po dokonaniu transfekcji miRNA-218 do komórek badanej linii i 24-godzinnej inkubacji zbadano poziom apoptozy [26]. W przypadku linii HeLa udało się zaobserwować znaczące zmniejszenie proliferacji komórek: Rysunek 3. Stopień przeżywalności komórek nowotworowych linii HeLa w zależności od dozy promieniotwórczej [26] Druga część badań polegała na sprawdzaniu skuteczności wyższego stężenia miRNA-218 in vivo. Do myszy zostały wprowadzone podskórnie komórki raka szyjki macicy, a miRNA-218 zostało wprowadzone na drodze mikroiniekcji do powstałego guza. Następnie myszy zostały podane radioterapii. 136 Rola miRNA w leczeniu chorób nowotworowych na przykładzie raka szyjki macicy Rysunek 4. Stopień proliferacji komórek guza myszy [2 Jak wynika z przytoczonych badań podwyższone stężenie miRNA-218 odgrywa znaczącą rolę w indukcji podatności komórek nowotworowych na działania promieni radiowych. [26] 5. Podsumowanie Badania przytoczone w artykule, wykazują że cząsteczki miRNA mogą w niedługim czasie stać się ważnymi elementami w leczeniu raka szyjki macicy, zwłaszcza w dziedzinie diagnostyki o raz monitoringu po wyleczeniu pacjentki. Może to istotnie wpłynąć na skuteczność terapii oraz znacznie na szybsze wykrywanie nawrotów choroby. Duża liczba cząsteczek miRNA które mogą być związane z rozwojem choroby wskazuje na nowe możliwości badań pozwalających na lepsze zrozumienie i szczegółowe wyjaśnienie mechanizmów nowotworzenia. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. Lee Y., Kim M., Han J., Yeom K.H., Lee S., Baek S.H., Kim V.N. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II, The EMBO Journal, 23 (2004), s. 4051-4060 Turchonovich A., Weiz L., Langheinz A., Burwinkel B. Charakterization of extracellular circulating microRNA, Nucleic Acids Research , 39 (2011), s. 7223-7233 Krutovskikh V.A., Herceg Z. Oncogenic microRNAs (OncomiRs) as a new class of cancer biomerkers, BioEssays, 32 (2010), s. 894-904 Camargo R.G., Teixeira H. Q., Geraldo M.V., Matos-Neto E., Neves R.X., Carnevali Jr. L.C. , Donatto F.F., Alcantara P.S.M., Ottoch J.P., Seelaender M. Cancer Cachexia and MicroRNAs, Madiators of Inflammation, Article ID 367561 Castanon A., Leung V.M.W., Landy R., Lim A.W.W., Sasieni P. Characteristics and screening history of women diagnosed with cervical cancer aged 20-29 years, British Journal of Cancer, 109 (2013), s. 35-41 137 Irena Boluch, Jakub Knurek, Monika Kurpas 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Jadon G., Joshi K.S., Cervical Cancer – A Review Article, Journal of Biomedical Pharmaceutical Research, 1 (2012), s. 1-4 Townsend J.S., Stormo A.R., Roland K., Buenoconsejo-Lum L., White S., Saraiya M. Current Cervical Cancer Screening Knowlegde, Awareness, and Practices Among U.S. Affiliated Pacific Island Providers: Opportunities and Challenges, The Oncologist, 19 (2014), s. 383-393 Prandi S., Beccati D., De Aloysio G., Fulgenzi P., Gabrielli M., Ghirardini C., Rivasi F. , Saragoni L., Sassoli de Bianchi P., Bucchi L. Applicability of the Bethesda System 2001 to a Public Health Setting, Cancer Cytopathilogy, 108 (2006), s. 271-276 Beddy P., O’Neill A.C., Yamamoto A.K., Addley H.C., Reinhold C., Sala E. FIGO staging system for endometrial cancer: added benefits of MR imaging, Radiographics, 32 (2012), s. 241-251 Majorek K., Krzyżtosiak W.J. Role of microRNA in pathogenesis, diagnostics and therapy of cancer, Współczesna Onkologia, 10 (2006), s. 359-366 Li Y., Xu D., Bao C., Zhang Y., Chen D., Zhao F., Ding J., Liang L., Wang Q., Liu L., Li J., Yao M., Huang S., He X. MicroRNA-135b, a HSF-1 target, promotes tumor invasion and metastasis by regulating RECK and EVI5 in hepatocellular carcinoma, Oncotarget, 6 (2014), s. 2421-2433 Ye C., Sun N., Ma Y., Zhao Q., Xu C., Wang S., Sun S., Wang F., Li W. MicroRNA-145 contributes to enhancing radiosensitivity of cervical cancer cells, FEBS Letters, 589 (2015), s. 702-709 Tang T., Wong H.K., Gu W., Yu M., To K.F., Wang C.C., Wong Y.F., Cheung T.H., Chung T.K.H., Choy K.W. MicroRNA-182 plays an oncomiRNA role in cervical cancer, Gynecologic Oncology, 129 (2013), 199-208 Hou T., Ou J., Zhao X., Huang X., Huang Y., Zhang Y. MicroRNA-196a promotes cervical cancer proliferation through the regulation of FOXO1 and p27Kip1, British Journal of Cancer, 110 (2014), 1260-1268 He H., Zhang H., Li Z., Wang R., Li N., Zhu L. miRNA-214: expression, therapeutic and diagnostic potential in cancer, Tumori., 12 (2015), doi: 10.5301/tj.5000318 Martinez I., Gardiner A.S., Board K.F., Monzon F.A., Edwards R.P., Khan S.A. Human papillomavirus type 16 reduces the expression of microRNA-218 in cervical carcinoma cells , Oncogene, 27 (2008): 2575-2582 Sun Y., Zhang B., Cheng J., Wu Y., Xing F., Wang Y., Wang Q., Qiu J. MicroRNA-222 promotes the proliferation and migration of cervical cancer cells, Clin Invest Med., 37 (2014), s. 131-141 Chen B., Hou Z., Li C., Tong Y. MiRNA-494 inhibits metastasis of cervical cancer through Pttg1, Tumour Biol., 2015, http://link.springer.com/article/10.1007/s13277-015-3440-0/fulltext.html Chu Y., Ouyang Y., Wang F., Zheng A., Bai L., Han L., Chen Y., Wang H. MicroRNA-590 Promotes Cervical Cancer Cell Growth and Invasion by Targeting CHL1, Journal of Cellular Biochemistry, 115 (2014), s. 847-853 Wang X., Tang S., Le S., Lu R., Rader J.S., Meyers C., Zheng Z.M. Aberrant Expression of Oncogenic and Tumor-Suppressive MicroRNAs in Cervical Cancer Is Required for Cancer Cell Growth, PLoS One, 3 (2008), Article ID e2557 138 Rola miRNA w leczeniu chorób nowotworowych na przykładzie raka szyjki macicy 21. Li Y., Wang F., Xu J., Ye F., Shen Y., Zhou J., Lu W., Wan X., Ma D., Xie X. Progressive miRNA expression profiles in cervical carcinogenesis and identification of HPV-related target genes for miR-29, Journal of Pathology, 224 (2011), s. 484-495 22. Lui W.-O., Pourmand N., Patterson B. K., Fire A., Patterns of known and novel small RNAs in human cervical cancer, Cancer Research, 67 (2007), s. 6031-6043 23. Gardiner A.S., McBee W.C., Edwards R.P., Austin M., Lesnock J.L., Bhargava R., Guido R., Khan S.A. MicroRNA analysis in human papillomavirus (HPV)-associated cervical neoplasia and cancer, Journal Carcinogene Mutagene, 5 (2010), Article A55 24. Pereira P.M., Marques J.P., Soares A.R., Carreto L., Santos M.A.S., Microrna expression variability in human cervical tissues, PLoS One, 5 (2010), Article ID e11780 25. Lee J.S., Choi Y.D., Lee J.H., Nam J.H., Choi C., Lee M.C., Park C.S., Kim H.S., Min K.W. Expression of PTEN in the progression of cervical neoplasia and its relation to tumor behavior and angiogenesis in invasive squamous cell carcinoma, Journal of Surgical Oncology, 93 (2006), s.. 233-240 26. Yuan W., Xiaoyun H., Haifeng O., Jing L., Weixu H., Ruofan D., Jinjin Y., Zongji S. MicroRNA-218 Enhances the Radiosensitivity of Human Cervical Cancer via Promoting Radiation Induced Apoptosis, International Journal of Medical Sciences, 11 (2014), s. 691-696 27. del Mar Díaz-González S., Deas J., Benítez-Boijseauneau O., Gómez-Cerón C., Bermúdez-Morales V. H., Rodríguez-Dorantes M., Pérez-Plasencia C., Peralta-Zaragoza O., Utility of MicroRNAs and siRNAs in Cervical Carcinogenesis, Hindawi Publishing Corporation BioMed Research International, Volume 2015, http://dx.doi.org/10.1155/2015/374924 28. Sui X., Wang X., , Han W., Li D., Xu Y., Lou F., , Zhou J., Gu X., Zhu J., Zhang Ch., Pan H. MicroRNAs-mediated cell fate in triple negative breast cancers, Cancer Letters 361 (2015) 8-12 29. Zhang W., Xu J., Shi Y., Sun Q., Zhang Q., Guan X., The novel role of miRNAs for tamoxifen resistance in human breast cancer Cell. Mol. Life Sci. DOI 10.1007/s00018-015-1887-1 139 Irena Boluch, Jakub Knurek, Monika Kurpas Rola miRNA w leczeniu chorób nowotworowych na przykładzie raka szyjki macicy Streszczenie Do grupy najczęściej występujących u kobiet nowotworów złośliwych możemy zaliczyć płaskonabłonkowego raka szyjki macicy. Badania wykazują, że największy wpływ na rozwój tego nowotworu ma przenoszony drogą płciową wirus brodawczaka ludzkiego, szczególnie HPV16 oraz HPV18. Wirus ten ma możliwość wprowadzania do komórek gospodarza genów dla białek E6 oraz E7 i to one mają główny wpływ na indukcję procesu nowotworzenia. Ze względu na wzrost liczby pacjentek chorych na ten typ nowotworu, coraz większą uwagę skupia się na poszukiwaniu skuteczniejszych i szybszych metod diagnostyki. Obecnie w tym celu wykorzystuje się badania cytologiczne, a przy podejrzeniu bardziej zaawansowanych faz choroby biopsję zmienionych fragmentów nabłonka. Czasami wykorzystuje się również (w roli biomarkerów) antygeny występujące na komórkach nowotworu płaskonabłonkowego (SCCA) lub antygen karbohydrazy 125 (CA125). Ostatnie badania wykazują, że alternatywą dla tych antygenów w roli biomarkerów mogą być cząsteczki miRNA. Wykazano, że u pacjentek przed i po leczeniu chirurgicznym występują różnice w stężeniu miRNA w przypadku 291 na 338 typów cząsteczek. Na szczególną uwagę zasługuje miRNA-218, która może spełniać istotną rolę nie tylko w diagnostyce, ale również w terapii. Badania in vivo na myszach wykazują, że miRNA-218 może zwiększać podatność komórek nowotworu na radioterapię, co jest szczególnie istotne przy terapii uwzględniającej długotrwałe naświetlania. Badania nad miRNA otwierają nowe możliwości w terapii raka szyjki macicy, szczególnie na etapie diagnostyki. 140 Karol Nowosad1, Piotr Stępień2, Paula Musiał3 Sekwencjonowanie DNA – przegląd metod 1. Wstęp Terminem sekwencjonowanie określa się ogół metod prowadzących do odczytania kolejności nukleotydów w cząsteczkach kwasów nukleinowych. Pierwsze próby zsekwencjonowania DNA były podejmowane w latach 70 wraz z pojawieniem się metody chemicznej degradacji łańcucha DNA i równoczesnym opracowaniem przez zespół Sangera metody terminacji łańcucha. Przełomem w rozwoju metod sekwencjonowania było wyizolowanie termostabilnej polimerazy z Thermus aquaticus oraz opracowanie techniki PCR, co znacznie zwiększyło wydajność procesu sekwencjonowania i skróciło czas analizy [1,2]. Wykorzystanie reakcji PCR ze znakowanymi fluorescencyjnie nukleotydami oraz zastąpienie klasycznych żeli poliakrylamidowych wykorzystywanych do rozdziału uzyskanych fragmentów DNA nowoczesnymi kapilarami stosowanymi do rozdziału umożliwiło zautomatyzowanie metody Sangera. Zautomatyzowane aparaty do sekwencjonowania zostały wykorzystane do analizy genomów większości organizmów modelowych oraz analizy genomu człowieka w projekcie HGP (ang. Human Genome Project), który zakończył się w 2003 roku [3,4,5]. Opracowanie metod NGS (ang. Next Generation Sequencing) na początku XXI wieku oraz rozwój w dziedzinie bioinformatyki umożliwiło zwiększenie przepustowości analizowanych danych, znaczne obniżenie kosztów oraz czasu prowadzonych badań [6]. Obecnie dostępnych jest wiele metod sekwencjonowania, jednakże ograniczenia oraz ciągle wysokie koszty analizy przyczyniają się do poszukiwania nowych rozwiązań umożliwiających opracowanie alternatywnych technik określania sekwencji nukleotydów. W niniejszej pracy przedstawiono charakterystykę najpopularniejszych metod sekwencjonowania. 1 [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, Wydział Biologii i Biotechnologii 2 [email protected], Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, Wydział Biologii i Biotechnologii 3 [email protected], Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Wydział Nauk o Zdrowiu, Katedra Fizjoterapii, Zakład Medycyny Sportowej i Fizjologii Wysiłku Fizycznego 141 Karol Nowosad, Piotr Stępień, Paula Musiał 2. Metody klasyczne 2.1. Metoda chemicznej degradacji DNA Metoda sekwencjonowania DNA oparta o chemiczną degradację łańcucha została opisana w 1977 roku przez dwóch naukowców Allana Maxama i Waltera Gilberta. W technice tej, fragmenty DNA z odpowiednio wyznakowanymi nukleotydami na końcach poddawane są przy użyciu specyficznych związków chemicznych losowemu rozszczepieniu w pozycji adeniny, guaniny, cytozyny oraz tyminy. Degradacja chemiczna oparta jest na 3 etapach: modyfikacji zasady azotowej; usunięciu zmodyfikowanej zasady azotowej; przecięciu nici DNA w miejscu apurynowym lub pirymidynowym. Metoda prowadzi do otrzymania zbioru cząsteczek DNA zakończonych określonym nukleotydem A, G, C lub T, różniących się długością o 1 nukleotyd [7]. To co wyróżnia tą technikę od metody Sangera jest to że w inny sposób uzyskuję się pulę tych cząsteczek. Materiałem wyjściowym jest dsDNA (ang. double-strand Deoxyribonucleic Acid), które przed rozpoczęciem degradacji chemicznej znakowane jest promieniotwórczą grupą fosforanową na końcu 5` nici. Wyznakowane radioaktywnie fragmenty DNA rozdziela się na 4 części umieszczając każdą do innej probówki. Przy użyciu odczynników chemicznych prowadzi się reakcje częściowego rozszczepienia w różnych częściach zasad. Przeprowadza się zwykle cztery równoczesne reakcje dla A+G, G, C, C+T. W reakcjach właściwych dla G oraz C związek chemiczny silniej oddziałuję na G niż A oraz C zamiast T. Odczynnik chemiczny w reakcjach G+A i C+T działa na pirymidyny i puryny z taką samą siłą. Ważnym detalem jest dodanie związku chemicznego w bardzo niewielkiej ilości. Odpowiednie dobranie warunków reakcji sprawia że tylko jedna zasada z danego fragmentu będzie zmodyfikowana. Modyfikacja zasady prowadzi do osłabienia wiązania między zasadą a dezoksyrybozą. Późniejsze dodanie piperydyny powoduje rozszczepienie wiązania glikozydowego w wyniku czego zasada azotowa ulega usunięciu. Odszczepieniu ulega dezoksyryboza i nić DNA zostaje w tym miejscu rozerwana [1]. Dla przykładu, dodanie ograniczonej ilości siarczanu dimetylu, sprawia że w poszczególnych cząsteczkach metylowana będzie całkowicie losowo tylko jedna guanina. Późniejsze dodanie piperydyny powoduje usunięcie zmetylowanej zasady G i przecięcie ssDNA (ang. single stranded Deoxyribonucleic Acid) przed miejscem w którym znajdowała się zasada G. W wyniku takich działań uzyskuje się zbiór cząsteczek wyznakowanych radioaktywną grupą fosforanową na końcu 5` i różniących się długością na końcu 3`. W momencie uzyskania zbioru cząsteczek dla wszystkich próbek, poddaje się go rozdziałowi elektroforetycznemu w żelu poliakrylamidowym. Wyznakowanie radioaktywną 142 Sekwencjonowanie DNA – przegląd metod grupą fosforanową na końcu 5` umożliwia wizualizację wyników przy użyciu autoradiografii [6]. Rys. 1. Autoradiogram [6- zmodyfikowano] Uzyskany autoradiogram (rys.1.) odczytuje się od dołu. Prążek znajdujący się najniżej odpowiada najmniejszej cząsteczce DNA. Prążek znajdujący się w ścieżce A+G i brak prążka w ścieżce G daje nam informacje że pierwszym nukleotydem w badanej sekwencji jest nukleotyd A. Kolejny nukleotyd to C ponieważ prążek występuje zarówno w ścieżce C jak C+T. W taki sposób przesuwając się w odczycie autoradiogramu w górę odczytujemy sekwencje badanej cząsteczki DNA [1]. Metoda chemicznej degradacji DNA jest metodą sprawiającą trudności, między innymi z powodu używania odczynników chemicznych dlatego naukowcy odeszli od jej używania. W 1977 roku powstała alternatywna metoda opracowana przez Fredericka Sangera[2,7] 143 Karol Nowosad, Piotr Stępień, Paula Musiał 2.2. Metoda terminacji syntezy łańcucha DNA Metoda terminacji syntezy łańcucha DNA nazywana metodą Sangera lub metodą dideoksy opiera się na podobnej zasadzie jak metoda MaxamGilberta tzn., na uzyskaniu zbioru cząsteczek DNA zakończonych konkretnym nukleotydem, różniących się długością o jeden nukleotyd [2]. Sposób w jaki uzyskuje się tą pulę cząsteczek jest podstawową różnicą między tymi dwoma metodami. Metoda Maxam-Gilberta oparta jest na degradacji cząsteczki DNA a metoda Sangera oparta jest na syntezie nowej nici DNA [1,2]. W klasycznej metodzie Sangera materiałem wyjściowym do sekwencjonowania jest ssDNA. W celu otrzymania ssDNA najpierw należy sklonować badaną cząsteczkę DNA w wektorze umożliwiającym uzyskanie jednoniciowych matryc. Do tego celu można użyć wektora fagowego M13 lub fagemidu [6]. Metoda dideoksy opiera się na syntezie cząsteczki DNA de novo. W klasycznej metodzie Sangera do syntezy nici DNA używa się fragmentu Klenowa polimerazy DNA I. Polimeraza ta pozbawiona jest fragmentu N-końcowej domeny w wyniku czego nie posiada właściwości 5`-3` egzonukleolitycznej. Fragment Klenowa cechuje się niską procesywnością. Oprócz zwykłych dNTP, potrzebne do tej reakcji są wyznakowane radioaktywnymi izotopami dNTP, umożliwiające wizualizację cząsteczki DNA na autoradiogramie. Ważnym elementem w tej metodyce jest dodanie w ograniczonej ilości trifosforanów dideoksynukleozydów (ddTTP, ddGTP, ddCTP i ddATP). Charakterystyczną cechą ddNTP jest brak na końcu 3` grupy hydroksylowej. Można określić ddNTP jako terminator syntezy DNA. W klasycznej metodzie Sangera przeprowadza się cztery reakcje w probówkach które zawierają wszystkie elementy potrzebne do przeprowadzenia syntezy de novo, różnią się jedynie tym że do każdej z nich dodawany jest inny dideoksynukleotyd. Rozpoczyna się synteza nici komplementarnych. Polimeraza dobudowuje nukleotydy na zasadzie komplementarności, zarówno zwykłe dNTP jak również wyznakowane dNTP radioaktywnymi izotopami. W momencie gdy polimeraza doda ddNTP dochodzi do zatrzymania syntezy nici DNA. W wyniku tego otrzymujemy zsyntetyzowaną nić DNA o której wiemy, że w danej probówce zakończona jest użytym ddNTP. Czas reakcji oraz stosunek stężenia dNTP do ddNTP dobrany jest w taki sposób, aby otrzymać w danej probówce zbiór fragmentów DNA różniących się długością o jeden nukleotyd zakończonych określonym ddNTP. Mieszaniny reakcyjne z czterech probówek poddaje się elektroforezie w żelu poliakrylamidowym [8,9]. Wyniki rozdziału elektroforetycznego wizualizowane są poprzez autoradiografię. Uzyskany autoradiogram analizowany jest od dołu, czyli od cząsteczki której synteza zakończyła się na pierwszym nukleotydzie od 144 Sekwencjonowanie DNA – przegląd metod startera. Po przeanalizowaniu całego autoradiogramu uzyskuje się sekwencje badanej cząsteczki DNA [2]. W klasycznej metodzie Sangera można odczytać kilkaset nukleotydów. Analiza sekwencji DNA klasyczną metodą Sangera jest bardzo pracochłonna. Przyczyniło się to do powstania metody sprawniejszej i mniej czasochłonnej [7]. 2.3. Sekwencjonowanie cykliczne Sekwencjonowanie cykliczne jest to zmodyfikowana postać metody Sangera. Idea tej metody jest podobna do metody dideoksy. W celu uzyskania puli fragmentów DNA różniących się długością o jeden nukleotyd, zakończonych zdefiniowanym nukleotydem wykorzystano rekcję PCR (ang. polymerase chain reaction). W reakcji PCR wykorzystywana jest zmodyfikowana, termostabilna polimeraza Taq, której powinowactwo do ddNTP jest takie samo jak do dNTP. Zastosowanie jednego rodzaju startera prowadzi do amplifikacji jednej nici DNA. Jest to modyfikacja klasycznej reakcji PCR nazywana asymetrycznym PCR. Dzięki zastosowaniu reakcji PCR materiałem wyjściowym może być ssDNA, jak również dsDNA. Jest to znacząca różnica pomiędzy sekwencjonowaniem cyklicznym, a metodą Sangera. Krokiem, który przyczynił się do zautomatyzowania sekwencjonowania DNA było zastosowanie odpowiednio wyznakowanych fluorescencyjnie ddNTP. Każdy rodzaj ddNTP został wyznakowany innym fluoroforem. Istotnym elementem, który podczas reakcji umożliwia uzyskanie odpowiedniej liczby fragmentów DNA o różnej długości jest dobranie odpowiedniego stężenia ddNTP w roztworze. Powinno być znacznie mniejsze od stężenia dNTP, co zmniejsza prawdopodobieństwo dobudowania dideoksynukleotydu na samym początku nowopowstającej nici DNA. Po zakończeniu reakcji uzyskany materiał poddaje się elektroforezie w żelu poliakrylamidowym lub elektroforezie kapilarnej. Sekwenatory wykorzystywane w tej technice wyposażone są w laser, który jest źródłem światła. Działanie lasera wzbudza znacznik fluorescencyjny, który powracając do stanu podstawowego emituje światło o określonej długości fali, rejestrowane przez detektor. W wyniku automatycznego sekwencjonowania uzyskujemy elektroferogram Analiza uzyskanych danych umożliwia określenie sekwencji nukleotydów w cząsteczce DNA [2,10]. 145 Karol Nowosad, Piotr Stępień, Paula Musiał 3. Metody NGS II generacji Nowe rozwiązania w sekwencjonowaniu DNA umożliwiły prowadzenie analizy milionów fragmentów DNA w jednym czasie i przy znacznie mniejszym nakładzie finansowym. Przy zastosowaniu NGS w ciągu jednej doby można uzyskać sekwencję kilku genomów bakterii [11]. 3.1. Pirosekwencjonowanie Pirosekwencjonowanie jest najstarszą metodą zaliczaną do metod nowej generacji. Wykorzystuje szereg reakcji enzymatycznych następujących jedna po drugiej umożliwiających analizę sekwencji DNA w czasie rzeczywistym. Możliwe jest to dzięki detekcji strumienia fotonów powstałego w wyniku przekształcenia pirofosforanu, uwolnionego podczas reakcji przyłączenia się określonego nukleotydu do nowopowstałej nici DNA. Jako matrycę stosuje się jednoniciową cząsteczkę DNA. Zaawansowana technologia stosowana w pirosekwencjonowaniu umożliwia analizowanie ponad miliona fragmentów DNA jednocześnie. Wykorzystywane są do tego celu mikropłytki posiadające do 1,5 mln studzienek o średnicy 0,44µm. Każda studzienka stanowi oddzielne środowisko reakcji, do którego dozowane są odpowiednie enzymy oraz substraty. Pierwszym etapem w sekwencjonowaniu jest reakcja polimeryzacji nici DNA katalizowana przez zmodyfikowaną polimerazę DNA I pozbawioną aktywności egzonukleolitycznej [12]. (DNA)n + dNTP -> (DNA)n+1 + PPi(polimeraza) W wyniku przyłączenia się pojedynczego nukleotydu do nici DNA uwalniana jest cząsteczka pirofosforanu (PPi), która następnie w obecności adenozynofosfosiarczanu (APS) przekształcana jest za pomocą sulfurylazy ATP do adenozynotrifosforanu (ATP).W reakcji niezbędne są jony Mg2+ będące kofaktorem sulfurylazy ATP. PPi + APS -> ATP + H2SO4 (sulfurylaza ATP, Mg2+) W następnych dwóch reakcjach, katalizowanych przez lucyferazę, powstały ATP wykorzystywany jest do przekształcenia lucyferyny do oksolucyferyny. Produkt pośredni pierwszej reakcji lucyferyno-AMP ulega utlenieniu do oksolucyferyny. W wyniku przejścia oksolucyferyny ze stanu wzbudzonego do stanu podstawowego wyemitowany zostaje strumień fotonów, który rejestrowany jest przez detektor zaopatrzony w matrycę CCD (ang. Charge Coupled Device). lucyferyna + ATP ->lucyferylo-AMP + PPi (lucyferaza) lucyferylo-AMP + O2 ->oksylucyferyna + AMP + hv (lucyferaza) 146 Sekwencjonowanie DNA – przegląd metod Emisja fotonów światła następuje jedynie w wyniku przyłączenia jednego z czterech nukleotydów (A,T,G,C). W przypadku, gdy wprowadzony nukleotyd nie jest komplementarny do matrycy następuje jego degradacja. Reakcja degradacji katalizowana przez apyrazę polega na odłączeniu reszt fosforanowych od nukleotydów, które nie zostały wbudowane do nici DNA. Defosforylacji ulega również niewykorzystane ATP [13, 14, 15, 16]. ATP -> AMP + 2Pi (apyraza) dNTP ->dNMP + 2Pi (apyraza) Przekształcenie wyżej wymienionych związków do monofosforanów zmniejsza tło reakcji. W pirosekwencjonowaniu do uzyskania odpowiednio dużej puli fragmentów DNA stosuje się emulsion PCR, który jest modyfikacją klasycznej reakcji PCR. Metoda ta umożliwia przeprowadzenie kilku milionów reakcji amplifikacji w jednym „naczyniu” reakcyjnym. Zastosowanie emulsji oraz dobór odpowiednich parametrów i proporcji składników roztworu: wody i oleju, umożliwia utworzenie milionów „mikrobioreaktorów”, w których przeprowadzane są równolegle reakcje amplifikacji. W każdym „mikrobioreaktorze” znajduje się jeden nośnik z naniesioną na powierzchni streptawidyną, do której za pomocą adapterów przyłączają się fragmenty DNA. Adaptery są krótkimi fragmentami DNA wyznakowanymi biotyną, które w reakcji ligacji łączą się z badanymi cząsteczkami DNA. Wysokie powinowactwo biotyny do streptawidyny umożliwia opłaszczanie nośnika fragmentami DNA [7, 17]. 3.2. Solexa/Illumina Firma Illumina w roku 2006 wprowadziła sekwenator nowej generacji wykorzystujący reakcję odwracalnej terminacji. Materiał do sekwencjonowania przygotowywany jest za pomocą polony PCR. DNA cięte jest na fragmenty, które poddawane są następnie reakcji ligacji z krótkimi oligoukleotydami (tzw., adapterami). Po przeprowadzeniu reakcji denaturacji uzyskane jednoniciowe fragmenty immobilizuje się na mikropłytce, która wykorzystywana jest w reakcji amplifikacji do namnożenia DNA. Miliony kopii fragmentów DNA poddawane są sekwencjonowaniu. Jeden sekwenator zdolny jest do sekwencjonowania 600 mln fragmentów DNA jednocześnie. Sekwencjonowanie rozpoczyna się od wprowadzenia do mieszaniny reakcyjnej wszystkich czterech nukleotydów wyznakowanych fluorescencyjnie, z których każdy wyznakowany jest innym barwnikiem. Specyficzne ulokowanie barwnika prowadzi do zablokowania miejsca tworzenia wiązania fosfodiestrowego. Reakcja zostaje zatrzymana poprzez przyłączenie nukleotydu komplementarnego do matrycy za pomocą 147 Karol Nowosad, Piotr Stępień, Paula Musiał polimerazy DNA do nowopowstałej nici. Substraty niewykorzystane w reakcji polimeryzacji zostają wymywane z mieszaniny, a sygnał z dobudowywanego nukleotydu rejestrowany jest przez detektor zaopatrzony w matrycę CCD. Następnie usuwany jest znacznik fluorescencyjny. Prowadzi to do odblokowania grupy hydroksylowej na końcu 3’, co umożliwia utworzenie nowego wiązania fosfodiestrowego. Cykl rozpoczynany jest od początku, dozowana jest nowa porcja substratów. System ten umożliwia jednorazowo zsekwencjonować fragment długości 30-42 bp. Natomiast wydajność jednego sekwenatora wynosi 25Mb/h [17, 18, 19]. 3.3. SOLID SOLID (ang. Sequencing by OligoLigation and Detection) jest to system oparty na reakcji ligacji. Wykorzystuje zestaw 8-nukleotydowych wyznakowanych sond oraz pięć różnych pod względem wielkości starterów. Każda sonda zawiera zdefiniowane pierwsze dwa nukleotydy występujące w czterech różnych kombinacjach, przypadających na jeden barwnik fluorescencyjny przyłączony do ostatniego nukleotydu. Pomiędzy piątym a szóstym nukleotydem znajduje się miejsce cięcia. W metodzie tej biblioteka DNA tworzona jest z zastosowaniem emulsion PCR. Zamplifikowane fragmenty DNA wraz z nośnikiem immobilizowane są na szklanej mikropłytce stosowanej do analizy sekwencji w systemie SOLID. Umożliwia to przeprowadzenie wielu reakcji sekwencjonowania jednocześnie. Reakcja sekwencjonowania rozpoczyna się od hybrydyzacji startera komplementarnego do adaptera łączącego jednoniciową matrycę z nośnikiem. Wolna grupa –OH znajdująca się na końcu 3’ startera umożliwia przeprowadzenie reakcji ligacji katalizowanej przez ligazę DNA. Następny cykl prowadzący do przyłączenia kolejnego oligonukleotydu poprzedzony jest odcięciem i wymyciem trzech ostatnich nukleotydów. Prowadzi to do uwolnienia grupy hydroksylowej znajdującej się na końcu 3’ niezbędnej do utworzenia wiązania fosfodiestrowego oraz odłączenia barwnika. Z wykorzystaniem jednego startera w wyniku przeprowadzenia siedmiu reakcji ligacji syntetyzowany jest 35-nukleotydowey fragment DNA. Przeprowadzenie pięciu „cykli” reakcji umożliwia uzyskanie pełnej sekwencji. W każdym następnym „cyklu” stosowany jest starter krótszy o jeden nukleotyd. Schemat reakcji przedstawia rys.2. 148 Sekwencjonowanie DNA – przegląd metod Rys. 2 Schemat reakcji zachodzącej w systemie SOLID. Szczegółowe objaśnienia w tekście. [20-zmodyfikowano]. Technologia ta umożliwia odczytanie 21-28Mb/h. Analiza wyników wymaga zastosowania odpowiedniego oprogramowania do analizy uzyskanych wyników [17, 18, 19, 21]. 4. Metody NGS III generacji Systemy trzeciej generacji umożliwiają sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek w czasie rzeczywistym bez uprzedniego przygotowania biblioteki DNA. Eliminuje to błędy powstające podczas reakcji amplifikacji oraz skraca czas sekwencjonowania. 4.1. HeliScope Dążenie do minimalizacji w skali nano i minimalnego użycia substratów w reakcji sekwencjonowania zostało osiągnięte poprzez bezpośrednie analizowanie sekwencji DNA pojedynczej cząsteczki bez konieczności jej amplifikacji. Taki sposób analizy wymaga użycia bardzo wrażliwego 149 Karol Nowosad, Piotr Stępień, Paula Musiał systemu detekcji i układu fizycznego zdolnego do rejestracji i identyfikacji sygnału świetlnego pochodzącego od pojedynczej cząsteczki barwnika fluorescencyjnego. Jedną z pierwszych technik sekwencjonowania pojedynczych cząsteczek DNA, została opisana przez zespół S.Quake’a i opatentowana przez firmę Helicos Biosciences. Helicos wprowadził na rynek pierwszy system sekwencjonowania oparty na pojedynczej cząsteczce DNA w 2007 roku. System ten zdolny jest do sekwencjonowania DNA, od kilku do kilku tysięcy nukleotydów. Optymalną długością do sekwencjonowania dla systemu Helicos są cząsteczki DNA o długości około 100-200 nukleotydów. Do pojedynczych cząsteczek dosyntetyzowany jest ogon poli-A z zastosowaniem polimerazy poliadenylowej. Dodatkowo każda nić na końcu 3` zawiera wyznakowaną fluorescencyjnie adenozynę. Próbki DNA poddawane są hybrydyzacji z im mobilizowanymi starterami w komorze przepływowej. Startery stosowane w tej metodyce to oligo(dt)50. Każda matryca DNA po hybrydyzacji do startera znajdującego się na mikropłytce w komorze przepływowej poddawana jest osobnej reakcji sekwencjonowania. Miejsca hybrydyzacji matryc DNA ze starterami określane są dzięki wyznakowanym adenozynom. Przed rozpoczęciem reakcji polimeryzacji wyznakowana adenozyna jest usuwana. Mieszanina reakcyjna, w której skład wchodzi polimeraza DNA oraz jeden z czterech nukleotydów wyznakowanych fluorescencyjnie dozowana jest do komory przepływowej. Swoiste umiejscowienie fluoroforu w nukleotydzie blokuje syntezę wiązania fosfodiestrowego. Przed wbudowaniem następnego nukleotydu do nowopowstającej nici DNA znacznik jest usuwany, co umożliwia przeprowadzenie dalszej reakcji. Każde jednorazowe wbudowanie nukleotydu poprzedzone jest wymyciem składników niewykorzystanych w poprzedniej reakcji oraz wprowadzenie nowej porcji mieszaniny reakcyjnej. Wydajność jednego sekwenatora wynosi 4150Mb/24h [18, 22, 23, 24]. 4.2. SMRT SMRT (ang. Single-Molecule Real-Time) jest to technika wykorzystująca sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek DNA w czasie rzeczywistym zastosowana w sekwenatorze PacBio RS, III generacji wprowadzonym przez firmę Pacific Bioscience. Metoda ta wykorzystuje pojedynczą cząsteczkę polimerazy DNA Φ29 o wysokiej procesywności (> 70 000 bs) zimmobilizowaną na powierzchni ZMWs (ang. zero-modewaveguides). ZMWs są to studzienki o średnicy 70nm oraz wysokości 100nm, w których zachodzi reakcja sekwencjonowania. Deoksyrybonukleotydy stosowane w tej technice wyznakowane są różnymi barwnikami fluorescencyjnymi przyłączonymi do grupy fosforanowej. Emisja strumienia fotonów z dołączonego nukleotydu rejestrowana jest w czasie rzeczywistym przez 150 Sekwencjonowanie DNA – przegląd metod detektor ZMW. Po wbudowywaniu nukleotydu polimeraza uwalnia fluorofor wraz z pirofosforanem i przyłącza następny nukleotyd. Wydajność sekwenatora wynosi około 40Mb na 40min [25]. 5. Podsumowanie W artykule przedstawiono przegląd najbardziej popularnych metod sekwencjonowania cząsteczek DNA. Pierwsze metody sekwencjonowania DNA pozwalały na poznanie małych genomów organizmów prokariotycznych i eukariotycznych. Połączenie modyfikacji reakcji PCR i metody dideoksy z wyznakowanymi fluorescencyjnie nukleotydami umożliwiło z automatyzowanie i zaprojektowanie pierwszego sekwenatora. Pełna automatyzacja procesu sekwencjonowania DNA i zmniejszenie kosztów związanych z prowadzeniem badań spowodowało rozpoczęcie i zakończenie wielu projektów poznania genomów w tym także genomu ludzkiego w 2003 roku. Postęp techniki oraz rozwój w dziedzinach inżynierii genetycznej, biologii molekularnej w przeciągu ostatnich 30 lat zaowocował powstaniem nowych metod NGS II i III generacji. Nowe podejście do analizy sekwencji DNA wpłynęło na zmniejszenie kosztów i czasu przeznaczanych na badania. Dzięki postępowi technicznemu co roku ilość zidentyfikowanych sekwencji DNA znacząco wzrasta. Poznanie sekwencji genomów umożliwiło lepsze zrozumienie procesów biologicznych zachodzących w żywych organizmach. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. Mullis KB, Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermstable enzyme, U.S. Patent 4, 1990, 965,188 Brown TA, Genomy, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2001, 36,60-70 Chain P.S, Grafham D.V, Fulton R.S, Fitzgerald M.G, Hostetler J, Muzny D, Ali J, Birren B, Bruce D.C, Buhay C, Cole J.R, Ding Y, Dugan S, Field D, Garrity G.M,Gibbs R, Graves T, Han C.S, Harrison S.H, Highlander S, Hugenholtz P, Khouri H.M, Kodira C.D, Kolker E, Kyrpides NC, Lang D, Lapidus A, Malfatti S.A, Markowitz V, Metha T, Nelson KE, Parkhill J, Pitluck S, Qin X, Read T.D, Schmutz J, Sozhamannan S, Sterk P, Strausberg Chien A, R.L, Sutton G, Thomson N.R, Tiedje J.M,Weinstock G, Wollam A, Detter J,C, Genomics. Genome project standards in a new era of sequencing, Science, 2009 Oct 9;326(5950):236-7 Maxam AM, Gilbert W, A new method for sequencing DNA, Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1977 Feb;74(2): 560-564 Sanger F, Nicklen S, Coulson AR., DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1977 Dec;74(12):5463-5467 Franca LT, Carrilho E, Kist TB, A review of DNA sequencing techniques, Quarterly Reviews of Biophysics, 2002 May;35(2):169-200 151 Karol Nowosad, Piotr Stępień, Paula Musiał 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. Pettersson E, Lundeberg J, Ahmadian A, Generations of sequencing technologies, Genomics, 2009 Feb;(2):105-111 Prober JM, Trainor GL, Dam RJ, Hobbs FW, Robertson CW, Zagursky RJ, Cocuzza AJ, Jensen MA, Baumeister K, A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxnucleotides, Science, 1987 Oct 16;238(4825)336-341 Roe BA, Johnston-Dow L, Mardis E, Use of a chemically modified T7 DNA polymerase for manual and automated sequencing of supercoiled DNA, Biotechniques, 1988 Jun;6(6);520 Ansorge WJ, Next-generation DNA sequencing techniques, New Biotechnology, 2009 Apr;25(4):195-203 Ahmadian A, Ehn M, Hober S, Pyrosequencing: history, biochemistry and future, Clinica Chimica Acta, 2006 Jan;363(1-2):83-94 Klenow H, Overgaard-Hansen K, Patkar SA, Proteolytic cleaage of native DNA polymerase into two different catalytic fragments. Influence of assay conditions on the change of exonuclease activity and polymerase activity accompanying cleavage, European Journal of Biochemistry, 1971;22:371-381 Segel IH, Renosto F, Seubert PA, Sulfate-activating enzymes, Methods in Enzymology, 1987;143:334-349 Deluca M, Firefly luciferase, Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology, 1976;44:37-68 Komoszyński M, Wojtczak A, Apyrases (ATP diphosphohydrolases, EC 3.6.1.5): function and relationship to ATPases, Biochimica et Biophysica Acta, 1996 Feb2;1310(2):233-241 Mardis ER, Next-generation DNA sequencing methods, Annual Review of Genomics and Human Genetics, 2008;9:387-402 Kircher M, Kelso J, High-throughput DNA sequencing-concepts and limitations, Bioessays, 2010 Jun;32(6):524-536 Mardis ER, The impact of next-generation sequencing technology on genetics, Trends in Genetics, 2008 Mar;24(3):133-141 Voelkerding KV, Dames są, Durtschi JD, Next-generation sequencing: from basic research to diagnostics, Clinical Chemistry, 2009 Apr;55(4):641-658 Hurd PJ, Nelson CJ, Advantages of next-generation sequencing versus the microarray in epigenetic research, Briefings in Functional Genomics, 2009 May;8(3):174-183 Zhu Z, Waggoner AS, Molecular mechanism controlling the incorporation of fluorescent nucleotides into DNA by PCR, Cytometry, 1997 Jul 1;28(3):206-211 Bowers J, Mitchell J, Beer E, Buzby PR, Causey M, Efcavitch JW, Jarosz M, Krzymanska-Olejnik E, Kung L, Lipson D, Lowman GM, Marappan S, Mclnerney P, Platt A, Roy A, Siddigi SM, Steinmann K, Thompson JF, Virtual terminator nucleotides for next-generation DNA sequencing, Nature Methods, 2009 Aug;6(8):593-595 Pushkarev D, Neff NF, Quake SR, Single-molecule sequencing of an individual human genome, Nature Biotechnology, 2009 Sep;27(9):847-850 Korlach J, Bjornson KP, Chaudhuri BP, Cicero RL, Flusberg BA, Gray JJ, Holden D, Saxena R, Wegener J, Turner SW, Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules, Methods in Enzymology, 2010;472:431-455 152 Sekwencjonowanie DNA – przegląd metod Sekwencjonowanie DNA- przegląd metod Streszczenie Pojęcie sekwencjonowanie DNA definiowane jest jako technika prowadząca do odczytania kolejności par nukleotydów w cząsteczkach kwasów nukleinowych. Opublikowane w 1977 roku dwóch różnych metod sekwencjonowania, umożliwiło poznanie pierwszych sekwencji DNA dając początek nowej dziedzinie zwanej genomiką strukturalną. Wspólną ideą obu metod jest uzyskanie zbioru fragmentów DNA zakończonych określonym nukleotydem, różniących się o jeden nukleotyd. Metoda Maxama-Gilberta oparta jest na chemicznej degradacji łańcucha, natomiast metoda Sangera opiera się na syntezie nowej nici DNA. Metodą obecnie najczęściej stosowaną jest metoda Sangera, która swą popularność zawdzięcza łatwemu zautomatyzowaniu. W kontekście uzyskiwania sekwencji całych genomów organizmów złożonych w jak najkrótszym czasie, dotychczasowe metody nie spełniały w pełni oczekiwań naukowców, co przyczyniło się do opracowania metod NGS II generacji (ang. New Generation Sequencing). Należy zwrócić uwagę że, uzyskane metody oprócz obniżenia długości czasu prowadzonych badań, znacznie obniżyły ich koszt. Atrakcyjność tych metoda przyczyniła się do wzrostu zainteresowania badaniem sekwencji DNA. Powstałe systemy trzeciej generacji umożliwiają sekwencjonowanie pojedynczych cząstek DNA, bez konieczności wcześniejszej reakcji PCR (ang. Polymerase Chain Reaction). Słowa kluczowe: sekwencjonowanie DNA, metoda Sangera, NGS II generacji, NGS III generacji 153 Maja Zakrzyk1, Karina Kocot, Rudolf Słota Właściwości ftalocyjaniny europu i iterbu w obecności akceptora elektronów 1. Wprowadzenie Ftalocyjaninyto grupa związków chemicznych należących do rodziny porfiryn. W przeciwieństwie do porfiryn nie występują one w przyrodzie, otrzymuje się je na drodze syntezy. Związki te po raz pierwszy zostały odkryte przypadkowo w roku 1907 podczas badań właściwości o-cyjanobenzamidu w etanolu. 20 lat później zostały otrzymane ich pierwsze połączenia z metalami. Natomiast intensywne badania nad ftalocyjaninami zostały zapoczątkowane dopiero w latach 30-tych XX wieku [1, 2]. Cząsteczka ftalocyjaniny zbudowana jest z czterech pierścieni benzopirolowych połączonych atomami azotu, tworząc 16-członowy makro pierścień tetraazaporfirynowy (rys.1). Utworzony w ten sposób układ chromoforowy zawiera 18-elektronowy system sprzężonych wiązań π, stanowiący rdzeń makropierścienia. Ftalocyjanina tworzy liczne kompleksy z metalami oraz niemetalami w wyniku oddziaływania z czterema wewnętrznymi atomami azotu makrocyklu [4]. (a) (b) N N H N HN NH N H N N N N N N Rysunek 1. Cząsteczka porfiryny i ftalocyjaniny 1 [email protected], Zakład Chemii Ogólnej, Wydział Chemii, Uniwersytet Opolski 154 Właściwości ftalocyjaniny europu i iterbu w obecności akceptora elektronów Ftalocyjaniny budzą ogromne zainteresowanie naukowców, ponieważ ulegają wielu typom przemian chemicznych a także wykazują wiele ciekawych właściwości, co umożliwia ich szerokie zastosowanie [5]. Początkowo ze względu na intensywną barwę i dużą trwałość ftalocyjaniny były stosowane głównie jako niebieskie i zielone barwniki oraz pigmenty w przemyśle papierniczym i tekstylnym [6]. Przewiduje się, że związki te znajdą niebawem zastosowanie również w innych gałęziach przemysłu z obszaru elektroniki (półprzewodniki), optoelektroniki (wyświetlacze, diody LED, lasery), fotowoltaiki (fotoogniwa, panele słoneczne) oraz katalizy (zwłaszcza w procesach utleniania lub też fotoutleniania). Ze względu na swoje właściwości fotochemiczne ftalocyjaniny badane są również pod kątem zastosowania w fotodynamicznej terapii antynowotworowej PDT. Prowadzi się również badania nad wykorzystaniem ciekłokrystalicznych ftalocyjanin jako aktywnych elementów w bio- i chemosensorach. Szczególnie interesujące właściwości wykazują kompleksy z metalami ziem rzadkich. Pierwsze takie połączenia zostały otrzymane na początku lat 60 tych [8÷11, 14]. Lantanowce, ze względu na duży promień jonów Ln3+ zdolne są do tworzenia z ftalocyjaniną kompleksów o strukturze sandwiczowej (LnPc2), gdzie jon metalu koordynowany jest przez dwa ligandy ftalocyjaninowe. Struktura taka, w zależności od warunków środowiska, charakteryzuje się stosunkowo dużą trwałością. Trójdodatni jon metalu może tworzyć również połączenie z jednym ligandem ftalocyjaninowym tworząc monoftalocyjaninę (LnPcX), (rys.2). Odmiana „ mono ” jest jednak niestabilna i łatwo ulega rozkładowi, dlatego też największym zainteresowaniem cieszą się kompleksy o strukturze sandwiczowej[1, 8, 13÷14]. Rysunek 2. Struktura sandwiczowa EuPc2 oraz struktura monoftalocyjaninyYbPcX Znane są różne sposoby otrzymywania ftalocyjanin lantanowców. Jednak najlepszą metodą, charakteryzującą się dużą wydajnością, jest metoda polegająca na spiekaniu stałych reagentów w zatopionej ampułce szklanej (rys.3). 155 Maja Zakrzyk, Karina Kocot, Rudolf Słota Rysunek 3. Schemat syntezy diftalocyjanin lantanowców Jako substratów używa się o – dicyjanobenzenu i octanu odpowiedniego lantanowca. Proces syntezy prowadzi się w temperaturze 290-360C, w zależności od kompleksu. Głównym produktem reakcji jest związek typu LnPc2, natomiast monoftalocyjanina LnPcX (X = AcO-) powstaje w mieszaninie reakcyjnej jako produkt uboczny. Surowy produkt poddaje się ekstrakcji dimetyloformamidem (DMF) a otrzymany ekstrakt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej na złożu z tlenku glinu. Mimo znacznej uciążliwości, proces chromatograficzny jest bardzo skuteczny. W ten sposób można nie tylko oddzielić formę sandwiczową od kompleksu „mono” ale możliwe jest otrzymanie końcowego produktu o dużej czystości. Jakość otrzymanych kompleksów określa się na podstawie ich widm UV–Vis oraz IR [14, 15]. Diftalocyjaniny lantanowców zostały uznane za jedne z najciekawszych materiałów molekularnych otrzymanych i badanych w XX w. Są to związki o intensywnej niebiesko zielonej barwie silnie absorbujące w zakresie UV-Vis. Charakteryzują się dużą trwałością w różnych środowiskach. W szczególności podkreśla się ich odporność na działanie wysokiej temperatury. W atmosferze beztlenowej ulegają rozkładowi powyżej 700C. Ponadto związki te wykazują aktywność katalityczną oraz mają interesujące właściwości optoelektroniczne, m.in. zdolność do zmiany barwy pod wpływem pola elektrycznego (elektrochromizm). Diftalocyjaniny lantanowców mają o kilka rzędów wyższe przewodnictwo (o charakterze półprzewodnikowym) od kompleksów metali bloku s, p i d. Związki te mają również właściwości paramagnetyczne, wynikające z obecności niesparowanych elektronów w podpowłoce 4f jonu centralnego (Ln3+) [14]. W widmach ftalocyjanin wyróżniamy dwa charakterystyczne i bardzo intensywne pasma związane z przejściami typu π → π* w układzie chromoforowymftalocyjaniny. Pasmo B (Soreta) leży w zakresie 300-400 nm natomiast pasmo Q leży pomiędzy 600 a 800 nm. Pasmo B powstaje w wyniku przejścia a1u → eg, natomiast pasmo Q związane jest z przejściem elektronowym a2u → eg. W przypadku sandwiczowych kompleksów lantanowców pasmo Q ulega rozszczepieniu na dwie składowe Qx i Qy na skutek wzajemnego oddziaływania (odpychania) układów elektronowych 156 Właściwości ftalocyjaniny europu i iterbu w obecności akceptora elektronów obydwu makropierścieni związanych poprzez jon lantanowca. Poza pasmami B i Q w obszarze Vis mogą pojawiać się również inne pasma w zakresie 450-600 nm typu charge transfer, które związane są z przeniesieniem ładunku od metalu do ligandu lub od ligandu do metalu [14, 16]. Przykładowe widmo kompleksów ftalocyjaniny z jonem Mg2+ oraz Yb3+ przedstawiono na rys. 4. 1.6 Absorbancja 1.2 a MgPc b b YbPc2 0.8 0.4 a 0 400 600 800 Długość fali [nm] Rysunek 4. Elektronowe widma absorpcyjne ftalocyjaniny Mg2+ oraz Yb3+ w DMF; źródło [badania własne] Makropierścień ftalocyjaninowy podatny jest na oddziaływania z molekułami o właściwościachelektronoakceptorowych. Są to niewielkich rozmiarów cząsteczki, które dość łatwo mogą zbliżyć się do mostkowych atomów azotu makrocyklu, a w przypadku kompleksów typu „mono” również do atomu centralnego. Akceptory te w różnym stopniu mogą wpływać na aktywność oraz na stabilność makropierścienia. Najczęściej badanymi akceptorami elektronów są jony H+ oraz cząsteczki takie jak NO2, SO2, BF3 itp. Tego rodzaju cząsteczki są stałymi elementami różnych środowisk. Powstają w różnych procesach chemicznych i biochemicznych, pełniąc w nich określoną rolę. Wykazują one przy tym zróżnicowaną aktywność, zależnie od budowy chemicznej i warunków środowiska [3, 10, 17]. 2. Cel badań Głównym celem przeprowadzonych badań było określenie wpływu akceptorów elektronów na fotostabilność kompleksów ftalocyjaniny z europem i iterbem . 157 Maja Zakrzyk, Karina Kocot, Rudolf Słota 3. Część eksperymentalna Ftalocyjaniny europu (EuPc2, EuPcX) oraz iterbu (YbPc2, YbPcX) zostały otrzymane wg metody opracowanej w Zakładzie Chemii Ogólnej, Wydział Chemii Uniwersytet Opolski [14]. Dimetyloformamid (DMF), 95% H2SO4 i BF3 zostały zakupione w Sigma Aldrich. W badaniach kinetyki procesu fotolizy wykorzystano metodę spektrofotometrii UV –Vis w zakresie 190-1100 nm; w badaniach wykorzystano spektrofotometr Jasco-670 a pomiary wykonywano w kuwetach kwarcowych o długości drogi optycznej 1,000 cm. 4. Wyniki badań 4.1. Widma UV – Vis w DMF Na rys. 5 przedstawiono widma badanych kompleksów ftalocyjaniny z europem oraz iterbem o strukturze sandwiczowej a także w postaci „mono” w roztworze DMF. W obu przypadkach można wyróżnić dwa podstawowe pasma: pasmo B leżące w zakresie około 350 nm oraz pasmo Q leżące w zakresie od 620 – 680 nm. Dla diftalocyjaniny lantanowców długość fali, przy której wartość absorbancji osiąga maksimum (λ max) wyraźnie zależy od koordynowanego metalu, natomiast dla odmiany „mono” nie ulega znacznemu przesunięciu przy zmianie atomu centralnego i wynosi około 670 nm. W kompleksach sandwiczowych można zauważyć przesunięcie pasma Q w stronę krótszych fal w miarę wzrostu liczby atomowej lantanowca (tzw. efekt hipsochromowy). W widmie diftalocyjaniny europu pasmo Q zawiera charakterystyczne ramię, które wskazuje na istnienie dodatkowego pasma w tym zakresie długości fali. W przypadku cięższego iterbu następuje wyraźne rozdzielenie obydwu pasm. EuPc2/ DMF 0.4 0 0.8 0.4 0 400 600 Długość fali [nm] 800 1.6 1.6 Absorbancja Absorbancja Absorbancja 0.8 YbPcX / DMF YbPc2 / DMF 1.2 Absorbancja EuPcX / DMF 1.2 1.2 0.8 0.4 400 600 800 0.8 0.4 0 0 Długość fali [nm] 1.2 400 600 Długość fali [nm] 800 200 400 600 800 Długość fali [nm] Rysunek 5. Widma badanych kompleksów ftalocyjanin w DMF 4.2. Wpływ promieniowania UV na kompleksy ftalocyjanin Proces fotolizy poszczególnych kompleksów badano w tych samych warunkach, tzn. reakcja prowadzona była w temperaturze 20C przy naświetlaniu promieniowaniem o długości fali 366 nm i natężeniu IUV = 500µW/cm2. Podczas fotolizy w obu przypadkach można zauważyć 158 Właściwości ftalocyjaniny europu i iterbu w obecności akceptora elektronów stopniowe zmniejszanie intensywności pasma Q oraz pasma B (rys. 6). Świadczy to o postępującej degradacji makropierścieniaftalocyjaninowego w wyniku rozerwania wiązań w pobliżu mostków azometinowych. Procesowi temu towarzyszy odbarwienie początkowo intensywnie niebieskich (LnPc2) lub zielonych (LnPcX) roztworów badanych kompleksów w DMF. Całkowita degradacja diftalocyjaniny europu następuje po upływie 75 minut natomiast kompleks „mono” uległ całkowitemu rozkładowi już po 30 minutach. W przypadku kompleksów z iterbem proces fotolizy przebiegał w bardzo podobny sposób. Całkowita degradacja ftalocyjaniny iterbu o strukturze sandwiczowej nastąpiła po 135 minutach natomiast jej odmiana mono zdegradowała po 110 minutach. (rys. 6). (b) 1.2 (a) 0.8 30 min 75 min 0.4 Absorbancja Absorbancja 1.2 0.8 30 min 0.4 0 0 400 600 800 400 Długość fali [nm] 600 (c) 1.6 (d) 1.2 1.2 0.8 135 min 0.4 Absorbancja Absorbancja 800 Długość fali [nm] 0.8 0.4 110 min 0 0 400 600 800 400 Długość fali [nm] 600 800 Długość fali [nm] Rysunek 6. Zmiany w widmie UV –Vis EuPc2, EuPcX, YbPc2, YbPcX w DMF pod wpływem promieniowania UV Na podstawie przebiegu zmian absorbancji (A) w czasie (t), wyrażonych poprzez krzywe kinetyczne A = f(t) można przyjąć, że badane procesy, niezależnie od użytej ftalocyjaniny mają charakter eksponencjalny, typowy dla kinetyki reakcji I rzędu. W każdym przypadku współczynnik korelacji R2 ≥ 0,98 (rys. 7). 159 Maja Zakrzyk, Karina Kocot, Rudolf Słota 1.2 YbPc2 Absorbancja EuPc2 YbPcX EuPcX 0.8 0.4 0 0 40 80 120 t [min] Rysunek 7. Krzywe kinetyczne procesu degradacji LnPc2 i LnPcX w DMF W związku z tym, stałe szybkości fotolizy dla badanych kompleksów zostały wyznaczone bezpośrednio z równania (1) 𝐴 = 𝐴0 𝑒 −𝑘𝑡 (1) gdzie A – absorbancja roztworu po czasie naświetlania t (min), A0 – absorbancja początkowa układu, k – stała szybkości fotolizy. Wartości tych parametrów zostały przedstawione w Tabeli 1. Tabela 1. Stałe szybkości fotolizy LnPc2 i LnPcX w DMF, k(min-1) EuPc2 EuPcX YbPc2 YbPcX 2,61 · 10-2 6,08 · 10-1 1,99 · 10-2 2,64 · 10-2 Wyznaczono również stopień degradacji kompleksu po 15 minutach naświetlania promieniowaniem UV co przedstawia rys. 8. 160 Właściwości ftalocyjaniny europu i iterbu w obecności akceptora elektronów Rysunek 8. Stopień degradacji (%) kompleksu podczas fotolizy w DMF Porównując czas przebiegu fotolizy, wartości stałych szybkości fotolizy oraz stopień degradacji kompleksu można stwierdzić, że w przypadku monoftalocyjanin degradacja cząsteczki zachodziła z dużo większą szybkością w porównaniu z kompleksami o strukturze sandwiczowej. Najmniej odporny na działanie promieniowania UV okazał się kompleks EuPcX, który po 15 minutach uległ rozkładowi w 99,5%. 4.3. Wpływ akceptora elektronów na kompleksy ftalocyjanin. 4.3.1. Wpływ jonów wodorowych na kompleksy LnPc2 i LnPcX Badania fotostabilnościftalocyjanin europu i iterbu w obecności akceptorów elektronowych wykonano w tych samych warunkach jak w przypadku wyżej opisanego procesu fotolizy. Wprowadzenie jonów wodorowych do roztworów EuPc2 i EuPcX powoduje znaczne zmiany w ich widmach UV–Vis. W przypadku EuPc2 w obecności jonów wodorowych tworzy się forma zielona kompleksu. Jest to zjawisko znane i opisane w literaturze. Zaobserwowano zmniejszenie się intensywności pasma B i Q oraz przesunięcie pasma Q (λmax = 625) w stronę dłuższych fal (λmax = 669 nm). Zanika charakterystyczne "ramię" pasma Q a jednocześnie tworzy się szerokie pasmo przy 459 nm pochodzące prawdopodobnie od przejść CT (charge transfer) (rys. 9a). Roztwór zmienia barwę z niebieskiej na zieloną. Obserwowane zjawisko związane jest z protonowaniem makropierścienia, co prowadzi do zmiany rozkładu gęstości elektronowej w rdzeniu makrocyklu a w konsekwencji do zmiany barwy układu. 161 Maja Zakrzyk, Karina Kocot, Rudolf Słota W widmie monoftalocyjaniny europu obecność akceptora elektronów również powoduje zmniejszenie intensywności pasm B i Q. Powstają dwa nowe pasma jedno przy 656 nm a drugie przy 688 nm (rys. 9b). Prawdopodobnie jest to związane z tworzeniem się adduktu, będącego produktem protonowania zewnętrznych atomów azotu makropierścienia. 1.2 (a) b Absorbancja (b) a 0.8 Absorbancja 1.2 a EuPc2 b EuPc2 + H+ 0.4 a 0.8 b 0.4 a EuPcX b EuPcX + H+ 0 0 400 600 400 800 600 800 Długość fali [nm] Długość fali [nm] Rysunek 9. Widma układów a) EuPc2 – H+ b) EuPcX – H+ Pod wpływem promieniowania UV λmax = 366 nmbadane kompleksy ulegają typowemu procesowi degradacji na co wskazuje zmniejszanie się intensywności pasma B oraz pasma Q. Całkowity rozkład kompleksu EuPc2 nastąpił po 15 minutach natomiast EuPcX uległ całkowitej degradacji w czasie 10 minut co przedstawia rys. 10. 1 0.6 (a) (b) 0.6 15 min 0.4 Absorbancja Absorbancja 0.8 0.4 10 min 0.2 0.2 0 0 400 600 800 400 Długość fali [nm] 600 800 Długość fali [nm] Rysunek 10. Zmiany w widmie UV – Vis układów a) EuPc2 – H+ b) EuPcX – H+, w DMF pod wpływem promieniowania UV Dla kompleksów z iterbem zmiany w widmach UV-Vis mają podobny charakter a przebieg fotolizy również wskazywał na fotodegradacjętych kompleksów. Całkowita degradacja diftalocyjaniny iterbu nastąpiła po 40 minutach natomiast monoftalocyjanina iterbu uległa rozkładowi w ciągu 30 minut. 162 Właściwości ftalocyjaniny europu i iterbu w obecności akceptora elektronów Analiza wyników zmian absorbancji (A) w czasie (t) podczas fotolizy badanych ftalocyjanin, wykazała, że wszystkie otrzymane krzywe kinetyczne A =f(t) mają przebieg eksponencjalny, typowy dla reakcji I rzędu. Stałe szybkości fotodegradacji dla poszczególnych kompleksów wyznaczono na podstawie równania (1), a wyniki przedstawiono w tabeli 2. Tabela 2. Stałe szybkości fotolizy dla układów LnPc2 – H+ i LnPcX – H+ w DMF, k (min-1) EuPc2 – H+ 1,67 · 10-1 EuPcX – H+ YbPc2 – H+ 9,0 · 10-2 1,47 YbPcX – H+ 9,87 · 10-2 Badania procesu fotolizy w DMF dla układów z jonami wodorowymi wykazały, że w obecności akceptora elektronów degradacja zachodziła znacznie szybciej niż w układach bez akceptora. Kompleksy o strukturze sandwiczowej ulegają degradacji wolniej niż ich odpowiedniki „mono”. 4.3.2. Wpływ BF3 na kompleksy LnPc2 oraz LnPcX Badania wykonano w tych samych warunkach jak te, które opisano wyżej. Stwierdzono, że obecność BF3 generuje duże zmiany w widmach absorpcyjnych badanych kompleksów, przy czym BF3 zachowuje się jak typowy akceptor elektronów. Dla układu YbPc2 z BF3 w DMF molekuła kompleksu ulega modyfikacji polegającej na przemianie z podstawowej formy niebieskiej w zieloną. Zaobserwowano przesunięcie pasma Q (λmax=617nm) w stronę dłuższych fal (λmax = 660nm). Podobnie jak w przypadku układów z jonami H+, zanika pasmo Q przy długości fali 693 nm, czemu towarzyszy powstawanie szerokiego pasma przy 459 nm. Jak sugerują źródła literaturowe, jest to prawdopodobnie pasmo typu CT, które pojawia się w widmie zielonej formy YbPc2 w wyniku oddziaływania makrocyklu z cząsteczkami BF3 i utworzenia połączenia o charakterze adduktu. Zaobserwowano również, że po dodaniu BF3 intensywność pasma B wzrosła (rys. 11a). W przypadku monoftalocyjaninyiterbu obecność akceptora elektronów powoduje zmniejszenie intensywności pasma B i pasma Q oraz utworzenie nowego pasma przy 711 nm (rys. 11b). 163 Maja Zakrzyk, Karina Kocot, Rudolf Słota 2.5 2.5 (a) a YbPc2 b YbPc2 + BF3 1.5 (b) b 2 a Absorbancja Absorbancja 2 b 1 0.5 a YbPcX b YbPcX + BF3 1.5 1 a 0.5 0 0 200 400 600 800 200 Długość fali [nm] 400 600 800 Długość fali [nm] Rysunek 11. Widma UV – Vis badanych układów a) YbPc2 – BF3 b) YbPcX – BF3 Naświetlanie badanych układów promieniami UV o długości fali 366 nm powoduje zmniejszanie intensywności pasm B i Q co związane jest z typowym procesem degradacji kompleksu. Diftalocyjaninaiterbu uległa rozkładowi w czasie 70 minut natomiast odmiana „mono” kompleksu z iterbem zdegradowała w czasie 40 minut (rys. 12). Fotoliza ftalocyjaninyeuropu miała przebieg podobny jak dla iterbu z tym, że diftalocyjaninaeuropu zdegradowała całkowicie w czasie 30 minut a monoftalocyjanina uległa degradacji już po 7 minutach. 2.5 (a) (b) 2 Absorbancja Absorbancja 2 1.5 1 1 70 min 0.5 20 min 0 0 200 400 600 800 Długość fali [nm] 200 400 600 800 Długość fali [nm] Rysunek 12. Zmiany w widmie UV – Vis układów a) YbPc2 – BF3 b) YbPcX – BF3, w DMF pod wpływem promieniowania UV Analiza wyników zmian absorbancji (A) w czasie (t) podczas fotolizy badanych ftalocyjanin, wykazała, że wszystkie otrzymane krzywe kinetyczne A = f(t) mają przebiegi eksponencjalne, charakterystyczne dla reakcji I rzędu. Stałe szybkości fotodegradacji badanych ftalocyjanin 164 Właściwości ftalocyjaniny europu i iterbu w obecności akceptora elektronów w obecności BF3 wyznaczono na podstawie równania (1), a wyniki przedstawiono w Tabeli 3. Tabela 3. Stałe szybkości fotolizy dla układów LnPc2 - BF3 i LnPcX – BF3 w DMF, k (min-1) EuPc2 – BF3 EuPcX – BF3 YbPc2 – BF3 YbPcX– BF3 1,19 · 10-1 5,21 · 10-1 3,96 · 10-2 8,83· 10-2 Wpływ obydwu akceptorów elektronów (jonów H+ i BF3) na fotostabilność badanych ftalocyjanin europu oraz iterbu można porównać na podstawie czasów połowicznego rozkładu (fotolizy) poszczególnych kompleksów, τ1/2, wyznaczonych na podstawie równania (1). Parametr τ1/2 określa czas, po którym 50% początkowej ilości kompleksu uległo fotodegradacji. Wyniki przedstawione na rys.13 pokazują, że dla danego jonu metalu forma sandwiczowa jest bardziej stabilna niż odmiana „ mono ”. Najbardziej trwałe są ftalocyjaniny zawierające jon Yb3+, niezależnie od badanego akceptora. Niewielka fotostabilnośćEuPcX jest typową cechą monoftalocyjanin jonów lekkich lantanowców, które w roztworze DMF ulegają fotolizie nawet pod wpływem rozproszonego światła dziennego. Stosunkowo trwałym układem okazał się kompleks YbPcX, który zarówno w obecności jonów H+ jak i BF3 znacznie wolniej ulegał rozkładowi niż sandwiczowy kompleks EuPc2, natomiast wobec braku akceptora jego fotostabilność była porównywalna do EuPc2. Wynika stąd, że jon Yb3+ wywiera znacznie silniejszy wpływ stabilizujący na makropierścień ftalocyjaninowy niż Eu3+. 1/2 [min] 30 20 YbPc2 10 YbPcX EuPc2 EuPcX 0 bez akceptora H+ BF3 Rysunek 13. Czas połowicznego rozpadu dla badanych kompleksów 165 Maja Zakrzyk, Karina Kocot, Rudolf Słota 5. Podsumowanie i wnioski Badane diftalocyjaniny, EuPc2 i YbPc2 są trwałe w roztworze DMF i nie są wrażliwe na działanie światła dziennego. Z kolei roztwory kompleksów typu „ mono ”, EuPcX i YbPcX, są trwałe dopóty, dopóki są przechowywane w warunkach bez dostępu światła. Dotyczy to zwłaszcza kompleksu EuPcX, który okazał się najmniej trwały spośród badanych ftalocyjanin, podczas gdy jego odpowiednik, YbPcX, był znacznie bardziej trwały chemicznie i odporniejszy na działanie promieniowania UV. W obecności akceptora elektronów degradacja badanych kompleksów zachodzi znacznie szybciej niż w układach bez akceptorów, zwłaszcza w środowisku jonów H+. Niezależnie od warunków, w których prowadzono badania, kompleks YbPc2 był zawsze trwalszy w porównaniu z EuPc2, co wskazuje na silniejszy wpływ stabilizujący jonu Yb3+ niż Eu3+ na układ chromoforowy w rdzeniu ftalocyjaniny. Znalazło to potwierdzenie również w wynikach otrzymanych dla odmian „ mono ”. Rezultaty badań przedstawione w niniejszej pracy mają duże znaczenie przy wyborze danego kompleksu np. jako składnika katalizatorów hybrydowych, aktywatora bądź fotosensybilizatora w różnych układach optoelektronicznych czy do zastosowań w fotodynamicznych terapiach medycznych. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Dyrda G., Słota R., Wacławek W., Ftalocyjaniny i ich makrocykliczne analogi,Chemia Dydaktyka Ekologia Metrologia, 7 (2002), s. 33-40 Phtalocyanines Properties and Applications, 1 st ed.; Leznoff C.C., Lever A.B.P., Eds.; VCH Publishers; New York, USA, 1989 -1993; Vol. 1-3; Willey – VCH: New York, USA, 1996; Vol. 4 Jianbo L., Yu Z., Fugan Z., Fushi Z., Yingwu T., Xingi S., Effect of protonation and deprotonation on phtalocyanine’s spectra, ActaPhysico – Chimica Silica, 12 (1996), s. 202-207 Słota R., Dyrda G., UV photostability of metal phtalocyanines in organic solvents, Inorganic Chemistry, 42 (2003), s. 5743-5750 Trytek M., Makarska M., Polska K., Radzik S., Fiedurek J., Porfiryny i ftalocyjaniny cz. I. Właściwościiniektórezastosowania, Biotechnologia, 71 (2005), s. 109-127 Wohrle D., Shnurpfal G., Practical aplications of phtalocyanines from Dyes and pigments to materials for optical, electronic devices, Macroheterocycles, 3 (20012), s. 191-202 Sakamoto K., Ohno – Okumura E., Synthesis and functional properties of phtalocyanines, Materials, 2 (2009), s. 1127-1179 Gerasymchuk Y., Tomachynski L., Tretyakova I., Hanuza J., Legendziewicz J., Axially substitued ytterbium (III) monophtalocyanine – Synthesis and their spectra properties in solid state, solution and in monolithic silica blocks, Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 214 (2010), s. 128-134 166 Właściwości ftalocyjaniny europu i iterbu w obecności akceptora elektronów 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Słota R.,Dyrda G., Hofer M., Mele G.,Bloise E., del Sole R., Novel liphophilic lanthanide bis – phtalocyanines functionalized by pentadecylphenoxygroups: synthesis, characterization and UV – photostabili, Molecules, 17 (2012), s. 10738-10753 Słota R.,Dyrda G.,Szczegot K., Sulfur dioxide oxidation catalyzed by photosensitized ytterbium diphtalocyanine, Catalysis Letters, 126 (2008), s. 247-252 Mendonca C.R, Gaffo L., Moreira W.C, Oliveira O.N.,Jr., S.C. Zilio, Optical properties of ytterbium bis – phtalocyanine solution, Synthetic Metals, 121 (2001), s. 1477-1478 Arici M., Bozoglu C., Erdogmus A., Ugur A.L., Koca A., Electrochemical and spectroelectrochemical properties of novel lutetium (III) mono- and bisphtalocyanines, ElectrochimicaActa, 113 (2013), s.668-678 de Saja J.A., Rodriguez – Mendez M.L., Sensors based on double decker rare earth phtalocyanines, Advances in Colloid and Interface Science, 116 (2005), s. 1-11 Słota R. Praca doktorska, Politechnika Warszawska, Warszawa 1995 Słota R., Wacławek W., Dyrda G., Synteza kompleksów ftalocyjaniny z metalami, Chemia Dydaktyka Ekologia Metrologia, 3 (1998), s. 51-58 Dyrda G., Słota R., Wacławek W., Fotochemiczna aktywność i stabilność metaloftalocyjanin w fazie ciekłej, Na pograniczu chemii i biologii, (2003), T. IX, H. Koroniak, J. Barciszewski (red.), Wydawnictwo Naukowe UAM, Poznań, s. 103-110 Słota R., Dyrda G.,Wacławek W., Investigation of phtalocyanine crystals exposed to NO2 ambient gas, Polyhedron, 21 (2002), s. 677-681 Właściwości ftalocyjanin europu i iterbu w obecności akceptorów elektronów Streszczenie Otrzymano kompleksy z Eu oraz Yb w wyniku ogrzewania mieszaniny octanu danego lantanowca z dicyjanobenzenem, odpowiednio w temperaturze 290 i 360ºC. Głównym produktem reakcji był sandwiczowy kompleks typu LnPc2, natomiast jako produkt uboczny powstaje monoftalocyjanina, LnPcX (Pc= C32H16N8, ligand ftalocyjaninowy; Ln = Eu, Yb; X = AcO−). Obydwa kompleksy otrzymano w czystej postaci metodą chromatografii typu „flash” na złożu Al2O3. Określono ich fotostabilność w warunkach naświetlania promieniowaniem UV o długości fali 366 nm. Badano wpływ akceptorów elektronów w postaci jonów H+ oraz BF3 na trwałość otrzymanych kompleksów w roztworze DMF a także analizowano zmiany w układzie, wywołane przez promienie UV. Stwierdzono, że zarówno pod wpływem H+ oraz BF3 początkowo niebieski roztwór LnPc2 w DMF zmienia zabarwienie na zielone. Podczas naświetlania tych roztworów promieniami UV zaobserwowano postępującą degradację badanych kompleksów. Badania pokazały, że fotostabilność kompleksu YbPc2 jest większa niż EuPc2, co wskazuje na silniejszy wpływ stabilizujący jonu Yb3+ niż Eu3+ na układ chromoforowyftalocyjaniny. Kompleksy EuPcX oraz YbPcX są znacznie mniej trwałe niż ich sandwiczowe odpowiedniki, niemniej jednak i w tym przypadku bardziej trwały chemicznie i odporniejszy na działanie promieni UV był kompleks z Yb. Słowa kluczowe: ftalocyjanina, kompleks sandwiczowy, lantanowce, akceptor elektronów, fotoliza 167 Karina Kocot1, Maja Zakrzyk1, Gabriela Dyrda1 Ftalocyjaniny w fotokatalizatorach hybrydowych MPc-TiO2 do degradacji 4-nitrofenolu w wodzie 1. Wstęp W obecnych czasach poważnym problemem są chemiczne zanieczyszczenia wód gruntowych i powierzchniowych. W głównej mierze są to zanieczyszczenia spowodowane nitrofenolami - pochodnymi fenolu, które są szeroko wykorzystywane jako herbicydy, materiały wybuchowe i odczynniki przemysłowe. Fenole te okazały się być toksyczne, mutagenne a także kancerogenne wobec organizmów żywych, dlatego też zostały wpisane na priorytetową listę zanieczyszczeń przez Amerykańską Agencję Ochrony Środowiska [1,2]. 4-nitrofenol (4NF) jest pochodną fenolu, zawierającą oprócz grupy hydroksylowej grupę nitrową w pozycji para(rys.1). OH NO 2 Rysunek 1.Cząsteczka 4-nitrofenolu Występuje w postaci krystalicznego ciała stałego. W kwaśnym roztworze wodnym jest bezbarwny, w obojętnym – żółty, a w zasadowym intensywnie żółty. Fenole to substancje o dużej fotostabilności, które ulegają rozkładowi pod wpływem światła dopiero w obecności katalizatorów. Prowadząc proces fotodegradacji 4-nitrofenolu w środowisku wodnym z udziałem TiO2 otrzymuje się produkty pośrednie w postaci hydrochinonu i 4-nitrokatecholu. Główną rolę w tej reakcji odgrywają utworzone w układzie rodniki hydroksylowe (HO•) oraz reaktywne cząsteczki tlenu, m.in. O2•- i tlen singletowy, 1O2(1Δg), generowane w wyniku 1 [email protected], Zakład Chemii Ogólnej, Wydział Chemii, Uniwersytet Opolski, www.uni.opole.pl 168 Ftalocyjaniny w fotokatalizatorach hybrydowych MPc-TiO2 do degradacji 4-nitrofenolu w wodzie oddziaływania wzbudzonej matrycy katalizatora półprzewodnikowego (np. TiO2) z obecnymi w środowisku cząsteczkami H2O oraz O2. W procesie fotodegradacji 4-nitrofenolu pod wpływem promieniowania UV, przy udziale polimorficznej odmiany TiO2, anatazu, początkowo powstaje 4-nitrokatechol oraz hydrochinon. W kolejnych etapach procesu, związki te reagują z rodnikami hydroksylowymi oraz aktywnymi formami tlenu, co prowadzi do rozpadu pierścienia benzenowego i utworzenia utlenionych związków alifatycznych. W końcowym etapie fotodegradacji powstaje woda i ditlenek węgla. Natomiast grupa nitrowa odrywa się od pierścienia i jako jon NO2-, utleniana jest przez rodniki hydroksylowe do jonu NO3- (rys.2)[3-5]. OH Produkt główny NO 2 4-nitrofenol (HO•), O2•-, 1O2(1Δg) OH OH OH Produkty przejściowe OH NO 2 hydrochinon 4-nitrokatechol (HO•), O2•-, 1O2(1Δg) Produkty końcowe CO2 H2 O Rysunek 2. Fotodegradacja 4-nitrofenolu 169 (NO3-) Karina Kocot, Maja Zakrzyk, Gabriela Dyrda Fotokataliza jest procesem, który zachodzi w obecności katalizatora absorbującego światło o określonej długości fali z zakresu UV, widzialnego lub podczerwieni. Pod wpływem promieniowania następuje aktywacja katalizatora, dzięki czemu możliwe jest zwiększenie szybkości reakcji chemicznych oraz ich wydajności[6]. Jednym z rodzajów fotokatalizy jest fotokataliza heterogeniczna zachodząca na granicy faz z wykorzystaniem odpowiednich półprzewodników, najczęściej tlenków i siarczków metali przejściowych. Jednym z najpopularniejszych półprzewodników jest TiO2. W latach 60 ubiegłego wieku, kiedy trwały prace badawcze nadultraczystymi proszkami do zastosowań jądrowych, zauważono nie pasujące odczyty dotyczące ditlenku tytanu. Okazało się, że błędne wyniki były spowodowane większą czułością TiO2 na światło dzienne. Dało to początek nowym kierunkom badań i zastosowań fotokatalizy z wykorzystaniem światłoczułych półprzewodników [7]. W 1791 roku, w Anglii, William Gregor w niedalekim sąsiedztwie swojego miejsca zamieszkania odkrył czarny proszek. Dużo czasu zajęły mu badania nad nieznaną substancją, która okazała się być nowym pierwiastkiem – tytanem. Nie był wtedy jednak w stanie otrzymać czystego pierwiastka, a jedynie tlenek – tlenek tytanu(IV). Ditlenek tytanu jest najtrwalszym związkiem tytanu stąd też jego liczne zastosowania. Oprócz fotokatalizatorów znajduje zastosowanie do produkcji barwników, tuszy drukarskich, w budownictwie, a w ostatnich latach do oczyszczania środowiska naturalnego. TiO2 występuje w trzech odmianach polimorficznych: anataz, rutyl i brukit (rys.3) [4,8]. Anataz Rutyl Brukit Rysunek 3. Odmiany polimorficzne tlenku tytanu(IV) [źródło: [7]] 170 Ftalocyjaniny w fotokatalizatorach hybrydowych MPc-TiO2 do degradacji 4-nitrofenolu w wodzie Najważniejszą odmianę stanowi rutyl. Rudy rutylu odkryto w Anglii w 1803 roku. Największe złoża znajdują się w Brazylii, Szwajcarii, USA, a także w niektórych krajach afrykańskich. Rutyl otrzymuje się poprzez działanie na brukit i anataz odpowiednio wysoką temperaturą. Czysty rutyl jest bezbarwnym ciałem stałym, jednak w zależności od stopnia i rodzaju zanieczyszczeń przyjmuje zabarwienie od czerwonobrązowego przez żółte po czerwone. Rutyl stanowi składnik skał metamerycznych i magmowych. Jest szeroko wykorzystywany w przemyśle chemicznym, szklarskim i metalurgicznym [7, 9, 10]. Kolejną odmianę stanowi brukit. Brukit odkryto w 1825 roku w Anglii. Największe złoża znajdują się w USA, Austrii, Szwajcarii i Rosji. Występuje w postaci kryształów, które przyjmują zabarwienie od ciemnobrązowego po zielonoczarne. W przyrodzie występuje bardzo rzadko. Otrzymywany jest głównie przez rozkład minerałów zawierających tytan. Brukit wykorzystuje się głównie do pozyskiwania tytanu [9, 10]. Na szczególną uwagę zasługuje anataz, który jest kruchym, przeźroczystym ciałem stałym. Największe złoża anatazu występują w Norwegii, Austrii, Szwajcarii i Brazylii. Podobnie jak rutyl, również anataz w zależności od rodzaju i stopnia zanieczyszczeń przyjmuje zabarwienie niebieskie, zielone, czarne. Główne zastosowanie anatazu to pozyskiwanie tytanu a także wykorzystanie w jubilerstwie [10, 11]. Aktywność fotokatalitycznaditlenku tytanu związana jest z absorpcją światła o długości fali λ < 400 nm. Światło o takiej długości fali powoduje w cząsteczkach TiO2 wybicie elektronów z pasma walencyjnego do pasma przewodnictwa, z utworzeniem par typu dziura-elektron, które są odpowiedzialne za aktywność takiego katalizatora. Ponieważ w układzie znajdują się cząsteczki wody i tlenu, mogą one zostać przekształcone w reaktywne formy tlenu, np. tlen singletowy, jonorodniki tlenkowe, rodniki wodorotlenowe. Powstałe na powierzchni ditlenku tytanu elektrony łączą się z tlenem z powietrza tworząc tlen aktywny, natomiast dziury elektronowe łączą się z otaczającą parą wodną tworząc rodniki wodorotlenowe. Uzyskane formy są bardzo silnymi utleniaczami i mogą utleniać różnego rodzaju związki organiczne (rys.4) [11, 12]. 171 Karina Kocot, Maja Zakrzyk, Gabriela Dyrda Rysunek 4. Zasada działania fotokatalizatora hybrydowego TiO2-LnPc2 W tym celu wykorzystuje się anataz, który wykazuje lepsze właściwości niż rutyl i brukit. Aktywność anatazu zależy od rozmiaru ziaren oraz struktury i morfologii ich powierzchni. Wyróżnia się mikroanataz, którego średnica ziaren mieści się w przedziale od 200 do 500 nm, oraz nanoanataz, o średnicy ziaren od 10 do 90 nm. Uważa się, że odmiana nanoanatazu jest odmianą bardziej aktywną i lepiej sprawdza się jako katalizator, jednak w układach omówionych powyżej lepszym okazał się mikroanataz [4]. Okazało się, że właściwości katalityczne można polepszyć jeśli do układu wprowadzi się barwnik, który intensywnie absorbuje światło. Tworzy się wówczas układ hybrydowy, w którym ziarna TiO2 pokryte są warstwą barwnika. Skutecznymi barwnikami okazały się ftalocyjaniny. W układzie tym działają jednocześnie dwa współpracujące ze sobą układy. Jeden w matrycy TiO2, a drugi w układzie chromoforowym barwnika [4]. Proces ten można porównać do fotosyntezy, w której chlorofil absorbuje światło słoneczne, żeby w rezultacie z wody i ditlenku węgla wytworzyć glukozę i przy okazji tlen [11]. Porfiryny tworzą grupę naturalnie występujących w przyrodzie związków makrocyklicznych. Cząsteczkę porfiryny tworzą cztery pierścienie pirolowe połączone mostkami metinowymi (rys. 5). Syntetycznymi pochodnymi porfiryn są ftalocyjaniny, nie występujące w środowisku naturalnym. Na makrocząsteczkę ftalocyjaniny składają się cztery pierścienie izoindolowe połączone mostkami azometinowymi (rys. 6). Ftalocyjanina (H2Pc) może tworzyć liczne kompleksy z metalami (MPc) [4, 14, 15]. 172 Ftalocyjaniny w fotokatalizatorach hybrydowych MPc-TiO2 do degradacji 4-nitrofenolu w wodzie Rysunek 5. Makrocząsteczka porfiny Rysunek 6. Makrocząsteczka ftalocyjaniny Ftalocyjaninę otrzymano przez przypadek w 1907 roku. Dwie dekady później otrzymano jej kompleks z miedzią w postaci ciemnoniebieskiego proszku, nierozpuszczalnego w wodzie. W latach 30-tych XX w. rozpoczęto szczegółowe badania fizykochemiczne ftalocyjanin, dzięki którymustalono strukturę oraz właściwości optoelektronicznych tych substancji. Kompleksy ftalocyjaniny mogą tworzyć różne struktury przestrzenne, w których makropierścień może ulegać odkształceniu, w zależności od rodzaju jonu centralnego oraz ligandów aksjalnych. Podstawowe typy struktur to: Struktura płaska (rys. 7a), w której atom metalu znajduje się w tej samej płaszczyźnie co pierścień ftalocyjaniny. Struktury te najczęściej tworzone są przez dwudodatnie jony metali bloku s i d; Struktura wypukła-dwurdzeniowa (rys. 7b) charakterystyczna np. dla kompleksu z talem, w której dwa jony Tl+ umieszczone są w pozycji trans względem płaszczyzny makropierścienia ftalocyjaniny; 173 Karina Kocot, Maja Zakrzyk, Gabriela Dyrda Struktura wklęsła (rys. 7c) gdzie atom metalu jest wysunięty poza płaszczyznę makropierścienia ftalocyjaniny. Ten rodzaj struktury tworzą jony o dużej średnicy, które nie mieszczą się w makropierścieniu, np. Pb2+ Struktura sandwiczowa (rys. 7d), w której jon metalu umieszczony jest pomiędzy dwoma makropierścieniami ftalocyjaniny; jest ona charakterystyczna dla trójdodatnich jonów lantanowców (Ln3+) [4, 14, 15]. Rysunek 7. Przykładowe struktury kompleksów ftalocyjanin a) płaska, b)wypukła-dwurdzeniowa, c)wklęsła, d)sandwiczowa Zarówno ftalocyjaniny jak i metaloftalocyjaniny wykazują dużą stabilność termiczną i chemiczną. W temperaturze powyżej 300oC i atmosferze powietrza ulegają rozkładowi. Są również odporne na działanie mocnych kwasów i zasad [16]. Rozpad pierścienia do ftalimidu lub kwasu ftalowego powodują jedynie silne utleniacze jak np. HNO3, dichromiany, sole ceru. Podstawową metodą, stosowaną w badaniachftalocyjanin jest absorpcyjna spektroskopia elektronowa w zakresie UV-Vis. W widmach absorpcyjnych wyróżnia się dwa charakterystyczne pasma Q i B, których położenie i intensywność zależy od rodzaju koordynowanego atomu. Pasmo Q leży w zakresie 620-670 nm a pasmo B w zakresie 300-350 nm [15]. Ftalocyjaniny znalazły zastosowanie w wielu dziedzinach życia i nauki. Stosowane są w głównej mierze do produkcji półprzewodników, barwników i katalizatorów. Wykorzystywane są również jako odczynniki 174 Ftalocyjaniny w fotokatalizatorach hybrydowych MPc-TiO2 do degradacji 4-nitrofenolu w wodzie analityczne, w medycynie jako kontrast stosowany w rezonansie magnetycznym. Nowatorskim zastosowaniem jest wykrywaniei leczenie chorób nowotworowych, tzw. metoda fotodynamiczna (PDT) i diagnostyka fotodynamiczna (PDD). Związki te mają zdolność kumulowania się w tkankach nowotworowych, dlatego w metodzie PDT, w wyniku ich naświetlania zostaje zapoczątkowany szereg reakcji prowadzących do destrukcji komórek nowotworowych. W diagnostyce fotodynamicznej PDD wykorzystuje się zjawisko fluorescencji lub zjawisko fluorescencji indukowanej, w której udział biorą fotouczulacze czyli ftalocyjaniny, które są wzbudzane promieniem laserowym. Metoda ta pozwala w precyzyjny sposób określić zmiany nowotworowe i tym samym umożliwić ich precyzyjne naświetlanie [14]. Pierwsze udane syntezydiftalocyjanin lantanowców przeprowadzono na początku lat 60-tych XX w. Okazało się, że otrzymanekompleksy mają szereg innych, ciekawych właściwości, których nie stwierdzono w przypadku ftalocyjanin metali bloku d. Diftalocyjaniny lantanowców mają intensywną niebieskozielonąbarwę. Wewnętrzny układ sprzężonychwiązań π, zawierający 18 elektronów, powoduje, że ftalocyjaniny bardzo silnie absorbują fotony z zakresu bliskiego UV oraz czerwonej części widma. Widmo UV-Vis zawiera dwa charakterystyczne pasma, leżące w zakresie 640-690 nm i 320-350 nm. Otrzymano ftalocyjaniny ze wszystkimi lantanowcami (z wyjątkiem Pm) oraz ich wiele pochodnych, zawierających różne podstawniki peryferyjne, co sprawia, że zalicza się je do najbardziej atrakcyjnych materiałów molekularnych [17,18]. 2. Cel pracy Celem niniejszej pracy było zbadanie efektywnościfotokatalizatorów hybrydowych typu TiO2-MPc oraz TiO2-LnPc2(M - Zn, Ln - Gd, Yb) w procesie fotoutleniania 4-nitrofenolu w wodzie. 175 Karina Kocot, Maja Zakrzyk, Gabriela Dyrda 3. Materiały i metody 3.1. Materiały ZnPc GdPc2 YbPc2 Rysunek 8. Struktury ftalocyjanin W przeprowadzonych badaniach wykorzystano 100% mikroanataz (TioxideHuntsman, 8m2/gBET) [27]. Ftalocyjaniny lantanowców zsyntezowano i oczyszczono w Zakładzie Chemii Ogólnej UO. 4-nitrofenol oraz inne odczynniki wykorzystane w badaniach jak: dimetyloformamid (DMF), 95% H2SO4, 4M NaOH dostarczone zostały przez Sigma Aldrich. 3.2. Metody Strukturę powierzchni ditlenku tytanu scharakteryzowano wykorzystując metodę SEM (rys. 9). Badanie kinetyki procesu fotodegradacji pochodnej fenolu badano wykorzystując spektrofotometrię UV-Vis. Rysunek 9. Mikrofotografia SEM badanego proszku mikroanatazu 176 Ftalocyjaniny w fotokatalizatorach hybrydowych MPc-TiO2 do degradacji 4-nitrofenolu w wodzie 3.3. Wykonanie Proces fotodegradacji prowadzono w termostatowanym mikroreaktorze szklanym, zaopatrzonym w okienko ze szkła kwarcowego. Do reaktora wprowadzono roztwór 4-nitrofenolu o stężeniu 1,12 · 10-4 mol/dm3 oraz katalizator (w postaci stałej w ilości 0,006g) i umieszczono go na mieszadle magnetycznym pod lampą UV (λ=366 nm) o natężeniu I=1000µW/cm2. Reakcję prowadzono w roztworze wodnym w pH < 7 dla roztworu bez dodatku katalizatora oraz z dodatkiem TiO2, TiO2-ZnPc, TiO2-GdPc2, TiO2YbPc2. Czas prowadzenia procesu: 70 minut. 4. Analiza wyników 4.1. Wyniki Proces fotodegradacji 4-nitrofenolu uzależniony jest od warunków prowadzonego procesu, szczególnie od pH. W środowisku kwasowym 4-nitrofenol silnie absorbuje w zakresie 250-400 nm (rys. 10 a), co odpowiada jego formie niezdysocjowanej. Wraz ze zwiększeniem pH w widmie UV-Vis można zaobserwować przesuwanie pasm absorpcji w stronę dłuższych fal co związane jest ze zwiększającym się stopniem dysocjacji badanego związku. a b O OH + NO 2 H2O H3O + - + NO 2 pH<7 pH>7 (λmax=317 nm) (λmax=400nm) Rysunek 10a. Widma UV-Vis 4NF w zależności od pH, b. Dysocjacja 4NF w wodzie Prowadząc proces fotodegradacji 4-nitrofenolu w środowisku kwaśnym zbadano układ bez dodatku katalizatora. Po 70 minutach naświetlania ilość 4NF w badanym układzie uległa w nieznacznym stopniu zmniejszeniu (rys. 11a). Natomiast dodanie do układu katalizatora w postaci czystego TiO2 bądź TiO2 zaimpregnowanego odpowiednią ftalocyjaniną, powoduje znaczną degradację 4NF, co przedstawiono na rysunku 11b dla układu z katalizatorem TiO2-YbPc2. 177 Karina Kocot, Maja Zakrzyk, Gabriela Dyrda a b Rysunek 11a. Widma UV-Vis 4NF w czasie procesu fotodegradacji (t=70min) b. roztwór 4NF + TiO2-YbPc2 4.2. Kinetyka procesu degradacji 4-nitrofenolu Wyniki badań wykazały, że wyznaczone krzywe kinetyczne mają charakter eksponencjalny, co wskazuje na przebieg reakcji zgodnie z kinetyką procesu I rzędu, wyrażoną równaniem (1) 𝑨(𝒕) = 𝑨𝟎 ∙ 𝒆−𝒌𝟎𝒕 (1) gdzie: A(t) – absorbancja roztworu po czasie naświetlania t (min), A0 – absorbancja początkowa układu (t = 0), k0 – obserwowana stała szybkości fotolizy (min-1) Wyniki zebrano w Tab. 1. Współczynnik korelacji dla powyższych pomiarów wyniósł we wszystkich przypadkach≥ 0,98. Tabela 1 Efektywne stałe szybkości ko(min-1) procesu fotodegradacji 4-NF w wodzie z zastosowaniem fotokatalizatorów w pH<7 [źródło: opracowanie własne] Czysty roztwór 1,05 · 10-4 + TiO2 1,78 · 10-2 4-nitrofenol pH<7 + TiO2ZnPc 1,08 · 10-2 + TiO2GdPc2 + TiO2YbPc2 2,16 · 10-2 2,68 · 10-2 Z otrzymanych pomiarów absorbancji4-nitrofenolu w czasie obliczono stopień jego degradacji w zależności od rodzaju zastosowanego 178 Ftalocyjaniny w fotokatalizatorach hybrydowych MPc-TiO2 do degradacji 4-nitrofenolu w wodzie fotokatalizatora. Wyniki przedstawiono na rysunku 12.Ze wzoru (2) obliczono stopień degradacji 𝑨 𝜹% = 𝑨𝒌 ∙ 𝟏𝟎𝟎% (2) 𝟎 gdzie: Ak – absorbancja roztworu po 70 min naświetlania, A0– absorbancja początkowa układu (t = 0) Rysunek 12. Stopień degradacji 4NF w zależności od zastosowanego katalizatora Jak wynika z przeprowadzonych badań prowadzących do degradacji 4NF z udziałem lub bez udziału katalizatora, katalizatory typu TiO2-LnPc2, są bardziej skuteczne niż TiO2-ZnPc. Nawet czysty TiO2 okazuje się być nieco lepszym katalizatorem niż po zaimpregnowaniu ZnPc. Analiza stałych szybkości procesu degradacji (Tab. 1) jednoznacznie wskazuje, że dodanie do układu czystego TiO2 (mikroanataz) zwiększa efektywność procesu degradacji 4NF ponad 100-krotnie, natomiast skuteczność mikroanatazu można jeszcze poprawić impregnując go LnPc 2. Najlepszym katalizatorem okazał się katalizator typu TiO2-YbPc2, gdzie stopień degradacji 4NF w czasie 70 min prowadzenia procesu wyniósł 87%. 5. Wnioski Okazuje się, że zaimpregnowanie ditlenku tytanu odpowiednimi ftalocyjaninami lantanowców pozytywnie wpływa na efektywność prowadzenia procesu fotodegradacji 4-nitrofenolu w wodzie. Katalizatory typu TiO2-LnPc2znacznie przyspieszają degradację, w przeciwieństwie dokatalizatora typu TiO2-ZnPc, który okazał się nawet mniej skutecznym katalizatorem niż czysty TiO2. Katalizatory typu TiO2-GdPc2 i TiO2-YbPc2 mogą być w przyszłości z powodzeniem wykorzystywane w procesach oczyszczania ścieków z 4-nitrofenolu. 179 Karina Kocot, Maja Zakrzyk, Gabriela Dyrda Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Ahmed S., Rasul M.G., Martens W.N., Brown R., Hashib M.A., Heterogenousphotocatalytic degradation of phenols in wastewater: A review on current status and developmens, Desalination, 261 (2010), s. 3-18 San N., Hatipoǧlu A., Koçtürk G., Çınar Z., Photocatalytic degradation of 4-nitrophenol in aqueous TiO2 suspensions: Theoretical prediction of the intermidiates, Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 146, (2002), s. 189-197 Di Paola A., Augugliaro V., Palmisano L., Pantaleo G., Savinov E., Heterogenousphotocatalytic degradation of nitrophenols, Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 155, (2003), s. 207-214 Słota R., Dyrda G., Szczegot K., Mele G., Pio I., Photocatalytic activity of nano and microcrystalline TiO2 hybrid systems involving phthalocyanine or porphyrin sensitizers,Photochemical &Photobiological Sciences, 10, (2011), s. 361-366 Yu S., Hu J., Wang J., Gamma radiation-induced degradation of pnitrophenol (PNP) in the presence of hydrogen peroxide (H 2O2) in aqueous solution, Journal of Hazardous Materials, 177, (2010), s. 1061-1067 Strona internetowa http://goldbook.iupac.org/P04580.html(30.04.2015r.) Kasza T., Praca doktorska, Politechnika Krakowska, 2007 Kusiak-Nejman E.K., Praca doktorska, Zachodniopomorski Uniwersytet Techniczny w Szczecinie, 2012 Bielański A., Podstawy chemii nieorganicznej 2, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2002 Carp O., Huisman C.L., Reller A., Photoinduced reactivity of titanium dioxide, Progress in Solid State Chemistry, 32, (2004), s. 33-177 Tang H., Prasad K., Sanjinès R., Schmid P.E., Lévy F., Electrical and optical properties of TiO2anatase thin films, Journal of Applied Physics, 75, (1994), s. 2042-2047 Słota R., Dyrda G., Galbas M., Mele G., Fotokatalizatory hybrydowe z matrycą TiO2 aktywowaną ftalocyjaninami lantanowców,Chemik, 68, (2014), s. 385-390 Simon J., André J-J., Molecular Semiconductors, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 1985 Trytek M., Makarska M., Polska K., Radzki S., Fiedurek J., Porfiryny I ftalocyjaniny Cz. I. Właściwości i niektóre zastosowania,Biotechnologia, 71, (2005), s. 109-127 15. DyrdaG., SłotaR., WacławekW., Chemia Ftalocyjaniny i ich makrocykliczne analogi, Dydaktyka, Ekologia, Metrologia, 1-2, (2002), s.33-40 Słota R., Praca doktorska, Politechnika Warszawska, 1995 Słota R., Dyrda G., Hofer M., Mele G., Bloise E., del Sole R., Novel Lipophilic Lanthanide Bis-Phthalocyanines Functionalized by Pentadecylphenoxy Groups: Synthesis, Characterization and UVPhotostability,Molecules, 17, (2012), s. 10738-10753 180 Ftalocyjaniny w fotokatalizatorach hybrydowych MPc-TiO2 do degradacji 4-nitrofenolu w wodzie Ftalocyjaniny w fotokatalizatorach hybrydowych MPc-TiO2 do degradacji 4-nitrofenolu w wodzie Streszczenie Badano efektywność katalizatorów hybrydowych z matrycą mikrokrystalicznego TiO2 (anatazu) impregnowanego diftalocyjaninami Gd i Yb oraz kompleksem ftalocyjaniny z Zn, w reakcji fotoutleniania 4-nitrofenolu w roztworze wodnym. Bez fotokatalizatora 4-nitrofenol nie ulegał degradacji. Użycie czystego TiO2 znacznie przyspieszyło ten proces, natomiast rozkład fenolu zachodził najszybciej w obecności fotokatalizatorów hybrydowych zawierających GdPc2 lub YbPc2, z których ten ostatni okazał się bardziej skuteczny. Stwierdzono, że impregnacja anatazu kompleksem ZnPc nie polepsza aktywności układu TiO2-ZnPc i nie powoduje zwiększenie szybkości procesu fotooksydacji w porównaniu do czystego TiO2. 181 Kornelia Malarczyk1, Eugeniusz Milchert2 Techniczne znaczenie olejów roślinnych 1. Wprowadzenie Wykorzystanie odnawialnych surowców pochodzenia naturalnego do celów technicznych jest obecnie przedmiotem licznych prac naukowych. Kierunek prowadzonych badań jest uzasadniony przede wszystkim względami ekonomicznymi i środowiskowymi. Oleje roślinne są dostępnym, tanim i nietoksycznym surowcem, uznawanym za potencjalny zamiennik produktów pochodzenia petrochemicznego. W celu wykorzystania olejów roślinnych w syntezie polimerów konieczne jest wprowadzenie do ich struktury grup funkcyjnych, np. epoksydowych, hydroksylowych, co związane jest ze względnie niską reaktywnością chemiczną niemodyfikowanych olejów. Przeprowadza się również częściowe uwodornienie triglicerydów lub kwasów tłuszczowych, otrzymanych przez ich hydrolizę oraz hydrolizę olejów roślinnych i następnie estryfikację uzyskanych kwasów tłuszczowych [1]. Praca stanowi przegląd literatury, dotyczącej wykorzystania olejów roślinnych w celach technicznych. 2. Struktura chemiczna olejów Oleje roślinne wykazują cenne właściwości ze względu na charakterystyczny skład chemiczny. Głównym składnikiem olejów pochodzenia roślinnego są estry glicerolowe kwasów tłuszczowych, czyli triacyloglicerole, zwane również triglicerydami. Wzór ogólny triglicerydów przedstawiono na rysunku 1. H2C O CO R1 HC O CO R2 H2C O CO R3 Rysunek 1. Wzór ogólny triacylogliceroli (R1, R2, R3 - nasycone lub nienasycone łańcuchy alkilowe) 1 [email protected], Instytut Technologii Chemicznej Organicznej, Wydział Technologii i Inżynierii Chemicznej, Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie, www.zut.edu.pl 2 [email protected], Instytut Technologii Chemicznej Organicznej, Wydział Technologii i Inżynierii Chemicznej, Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie, www.zut.edu.pl 182 Techniczne znaczenie olejów roślinnych Skład kwasów tłuszczowych zależy od wielu czynników, przede wszystkim od gatunku i odmiany rośliny. Najczęściej występującymi w olejach roślinnych kwasami tłuszczowymi są kwasy: oleinowy, linolowy, linolenowy, stearynowy i palmitynowy. Ich ilość i rodzaj wpływa na właściwości oleju. Przykładową zawartość kwasów tłuszczowych w wybranych olejach przedstawiono w tabeli 1. Tabela 1. Skład kwasów tłuszczowych (%wag.) w najpopularniejszych olejach roślinnych Kwas tłuszczowy Kwas arachidowy Kwas erukowy Kwas gadoleinowy Kwas linolowy Kwas linolenowy Kwas mirystynowy Kwas oleinowy Kwas palmitynowy Kwas oleopalmitynowy Kwas stearynowy Olej palmowy Zawartość procentowa [%wag.] Olej Olej Olej słonecznikowy sojowy rzepakowy 0-1 0-1 - Śladowe ilości - Śladowe ilości 9-12 0-2 0-3 - 0-3 0-5 0-1 0-4 50-70 48-58 18-30 0-1 4-10 6-12 Śladowe ilości Śladowe ilości Śladowe ilości 38-44 20-40 22-34 50-66 36-48 3-10 7-20 2-6 - 0-1 Śladowe ilości 0-1 3-6 1-10 3-6 1-3 Źródło: [2,3] Chemiczne właściwości olejów określa się za pomocą liczb: jodowej, kwasowej, nadtlenowej i zmydlania. Z kolei właściwości fizyczne oleju określa się za pomocą takich parametrów jak barwa, gęstość, lepkość, współczynnik refrakcji. Oprócz triglicerydów kwasów tłuszczowych w olejach znajdują się substancje niezmydlające, czyli sterole, alkohole tłuszczowe, węglowodory parafinowe i oleinowe. Łączny udział tych związków w oleju wynosi około 1% [4, 5]. 3. Biopaliwa na bazie olejów roślinnych Wysokie tempo zużywania się surowców kopalnych oraz potrzeby ochrony środowiska przyczyniają się do zastępowania paliw płynnych z ropy naftowej przez paliwa otrzymywane głównie z olejów roślinnych 183 Kornelia Malarczyk, Eugeniusz Milchert i tłuszczy zwierzęcych. Na etapie badań jako surowce do produkcji biodiesla wykorzystywane są także odpady kuchenne, grzyby, algi i inne. Biodiesel jest mieszaniną estrów alkilowych kwasów tłuszczowych, uzyskiwaną w wyniku transestryfikacji triacylogliceroli alkoholami C1-C4. Proces przeprowadza się najczęściej w obecności katalizatorów zasadowych. Główną przemianą jest: Trigliceryd + Alkohol = Biodiesel + Glicerol. Wolne kwasy tłuszczowe są produktem procesów utleniania łańcuchów węglowych, zachodzących na przykład w trakcie ogrzewania tłuszczu. Z uwagi na właściwości higroskopijne są one podatne na pochłanianie wody. W przypadku wysokiej zawartości wolnych kwasów tłuszczowych oraz wody w oleju, będących przyczyną spadku wydajności otrzymywania paliw, jednoetapowa przemiana oleju do biodiesla jest niewystarczająca (zachodzi ze zbyt niską wydajnością). Dodatkowo przeprowadza się estryfikację metanolem w obecności kwasu siarkowego. Ponadto konieczne jest oczyszczanie w celu usunięcia różnego rodzaju zanieczyszczeń mogących utrudniać bądź obniżać jakość produkcji biodiesla [6÷9]. Do produkcji biodiesla w Polsce (podobnie jak w całej Europie) wykorzystuje się głównie olej rzepakowy, w Stanach Zjednoczonych olej sojowy, a w Azji olej palmowy. Wybór surowca zależy przede wszystkim od jego dostępności oraz kosztów produkcji. Rafinowane oleje roślinne charakteryzują się niską zawartością wolnych kwasów tłuszczowych (<0,05%), stąd są lepszym surowcem do produkcji biodiesla w porównaniu do olejów posmażalniczych czy tłuszczy zwierzęcych, w których zawartość wolnych kwasów tłuszczowych może wynosić nawet 30% [9]. Ograniczeniem w stosowaniu olejów roślinnych jest ich wysoka lepkość, powodująca powstawanie osadów na wtryskach i ścianach komór spalania. Lepkość dynamiczna jest miarą oporu przepływu lub deformacji cieczy i wpływa na opór przepływu paliwa w układzie zasilania. Poza oddziaływaniem na przebieg wtrysku, rozpylanie i zasięg strugi paliwa w komorze spalania silnika, wpływa ona również na własności smarne, co jest bardzo istotne w przypadku silników wyposażonych w układy z elementami smarowanymi olejem napędowym, np. rotacyjne pompy wtryskowe [10]. Największą lepkością charakteryzują się oleje posiadające w swoim składzie reszty kwasów tłuszczowych o długich łańcuchach węglowych i jednocześnie małej zawartości wiązań nienasyconych. Wcisło [10] wykazał, że wzrost temperatury oraz prędkości ścinania może przyczyniać się do znacznego wzrostu lepkości dynamicznej biopaliwa. Przeprowadzenie transestryfikacji olejów redukuje ich lepkość, do tego stopnia, że lepkość biopaliwa jest porównywalna z lepkością oleju napędowego [11]. Na system wtryskiwania paliwa oraz poziom emisji spalin wpływa również gęstość paliwa, która w przypadku biodiesla zależy od ilości 184 Techniczne znaczenie olejów roślinnych wiązań nienasyconych w łańcuchach węglowych. Obecność estrów metylowych kwasów tłuszczowych z więcej niż jednym wiązaniem podwójnym przyczynia się do wzrostu gęstości. Jednak wraz ze wzrostem stopnia nienasycenia kwasów tłuszczowych maleje wartość energetyczna (opałowa) paliwa, stąd paliwa o większej gęstości mają większą wartość energetyczną [9]. Biodiesel cechuje się gorszymi właściwościami niskotemperaturowymi w porównaniu do oleju napędowego, czego efektem jest ograniczenie możliwości ich stosowania w warunkach niskich temperatur. Estry metylowe kwasów tłuszczowych oraz mieszanki z olejem napędowym o zawartości ponad 5% wykazują w niskich temperaturach skłonność do wzrostu lepkości i tym samym tracą zdolność płynięcia. Poza tym może dojść do sedymentacji kryształów wosków oraz lodu i w efekcie blokady przewodów i filtra paliwa. Im wyższy jest stopień nasycenia oleju tym gorsze są właściwości niskotemperaturowe. Do głównych związków zapychających filtr paliwa należą estry metylowe kwasu palmitynowego i stearynowego. Do modyfikowania właściwości niskotemperaturowych olejów stosuje się depresatory, czyli związki obniżające temperaturę krzepnięcia [12]. Biopaliwa charakteryzują się wysokimi temperaturami zapłonu (>100ºC). Niższe temperatury zapłonu mają oleje o wysokiej zawartości estrów metylowych zawierających krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe. Wskaźnikiem zdolności paliwa do samozapłonu jest liczba cetanowa. Jej wartość rośnie wraz ze wzrostem długości łańcuchów, stopnia rozgałęzienia oraz nasycenia łańcuchów węglowych kwasów tłuszczowych. Spośród olejów roślinnych najwyższą liczbą cetanową charakteryzuje się olej palmowy [9]. Ważnym zagadnieniem w przypadku biopaliw jest ich odporność na utlenianie, która maleje wraz ze wzrostem stopnia nienasycenia kwasów tłuszczowych. Stabilność oksydacyjna zależy od warunków przechowywania biopaliw, m. in. od temperatury, dostępności wilgoci, światła i tlenu. Skutkiem zachodzenia procesów utleniania biopaliw jest przede wszystkim wzrost liczby kwasowej i nadtlenkowej, obniżenie liczby jodowej, a także podwyższenie temperatury zapłonu, lepkości kinematycznej oraz zawartości żywic. Aby temu zapobiec wprowadza się do biopaliw dodatki uszlachetniające typu pirogalol, BHA (tert-butylohydroksyanizol), BHT (tert-butylohydroksytoluen) [13]. 185 Kornelia Malarczyk, Eugeniusz Milchert 4. Środki smarowe W przemyśle środków smarowych dąży się do uzyskania produktów, które charakteryzowałby się wysoką jakością pod względem eksploatacyjnym oraz ekologicznym. Do produkcji smarów głównie wykorzystuje się oleje mineralne, ale również oleje syntetyczne, oleje białe (głęboko rafinowane oleje), estry, silikony, tłuszcze zwierzęce lub oleje roślinne [14]. Oleje pochodzenia naturalnego mają przewagę nad olejami mineralnymi pod względem biodegradacji w naturalnym środowisku. Poza tym są nietoksyczne i w wybranych zastosowaniach odznaczają się korzystniejszymi cechami eksploatacyjnymi [15, 16]. Wadą niemodyfikowanych olejów roślinnych jest ich mała odporność termiczna, hydrolityczna, oksydacyjna. W celu poprawy stabilności olejów roślinnych poddaje się je różnym modyfikacjom. Najczęściej przeprowadza się procesy transestryfikacji oraz epoksydacji. Poprawę odporności olejów roślinnych przynosi również wprowadzenie do wyjściowego oleju odpowiednio dobranych przeciwutleniaczy oraz utlenianie tlenem lub powietrzem [17]. Inhibitory utleniania pogarszają biodegradowalność materiału oraz zwiększają jego toksyczność. Wpływ utleniania syntetycznych estrów oleju rzepakowego na ich właściwości użytkowe badali Nowicki i wsp. [18]. Wykazali oni, że modyfikacja estrów kwasów tłuszczowych czynnikami utleniającymi poprawia ich lepkość, stabilność termiczną oraz właściwości przeciwzatarciowe. Procesy te negatywnie wpływały jednak na temperatury płynięcia i krzepnięcia, co może niekorzystnie oddziaływać na niektóre kierunki zastosowań. Iłowska i wsp. [17] wykazali, że dodatek przeciwutleniaczy i zastosowanie przedmuchiwania gazem inertnym produktów oksypolimeryzacji oleju rzepakowego powoduje poprawę ich odporności na utlenianie. Uzyskanie istotnego wzrostu stabilności oksydacyjnej w stosunku do wyjściowego oleju poprawia właściwości fizykochemiczne i smarne modyfikowanych olejów roślinnych oraz stwarza perspektywy uzyskania coraz lepszych technologii ich otrzymywania. Siwiec i wsp. [19] wykazali, że na właściwości fizykochemiczne i smarne oleju słonecznikowego duży wpływ ma temperatura, w której równocześnie prowadzone są procesy hydrolizy i utleniania. Wzrost temperatury do 80ºC spowodował wyraźny wzrost lepkości i liczby kwasowej oleju oraz zmianę wszystkich parametrów charakteryzujących smarność oleju, co związane było przede wszystkim z przyrostem zawartości związków tlenoorganicznych, głównie kwasów tłuszczowych. Zmiany te przyczyniły się do wzrostu właściwości przeciwzatarciowych i wzrostu a następnie obniżenia właściwości przeciwzużyciowych oleju słonecznikowego. Aby dany olej mógł być zastosowany jako środek smarowy musi wykazywać przede wszystkim dobre właściwości lepkościowo- 186 Techniczne znaczenie olejów roślinnych temperaturowe oraz smarne. Olej rzepakowy jest jednym z najpopularniejszych olejów roślinnych wykorzystywanych jako baza środków smarujących, jego właściwości użytkowe, chemiczne i fizyczne zostały udowodnione w wielu badaniach [20÷22]. Epoksydowane oleje: rzepakowy i sojowy w aspekcie ich wykorzystania jako środków smarowych badali między innymi Fiszer i wsp. [23]. Oleje uzyskiwano w procesie epoksydacji prowadzonej za pomocą kwasu nadoctowego otrzymanego in situ w reakcji lodowatego kwasu octowego z wodnym roztworem nadtlenku wodoru. Najlepsze wyniki uzyskano prowadząc proces w obecności kwaśnej żywicy jonowymiennej Amberlyst – 15 jako katalizator – oraz w roztworze benzenu w następujących warunkach: temperatura - 75°C; czas reakcji - 6h; ilość moli H2O2 (50-proc) – 0,229; katalizator – 3% m/m. W uzyskanych produktach epoksydacji oznaczano właściwości lepkościowo-temperaturowe, smarnościowe i stabilność oksydacyjną. Oleje pochodzenia roślinnego oraz produkty ich epoksydacji charakteryzowały się wyższymi wartościami wskaźnika lepkości w porównaniu do olejów mineralnych, przy czym najwyższe wartości wykazywały niemodyfikowane oleje. Z kolei temperatury krzepnięcia epoksydowanych olejów oraz oleju mineralnego były zbliżone, np. epoksydowany olej rzepakowy krzepł w -10°C a olej mineralny w -12°C. Proces epoksydacji przyczynił się do wzrostu wartości takich parametrów jak: obciążenie niezacierające, obciążenie zespawania, wskaźnik zużycia obciążeniem, graniczne obciążenie zużycia w porównaniu do właściwości wyjściowych olejów. Kilkakrotny wzrost granicznego nacisku zatarcia epoksydowanych olejów uzyskano przez wprowadzenie dodatków smarnościowych np. tiolanu R-10 (siarkowanego oleju rzepakowego o zawartości siarki 10%). Proces epoksydacji spowodował również wzrost stabilności oksydacyjnej olejów roślinnych. Jeszcze wyższą stabilność uzyskano dodając do epoksydowanego produktu inhibitor reakcji utleniania olejów mineralnych, czyli butyrohydroksytoluen (BHT), który przyczyniał się do ograniczenia powstawania kwasowych związków tlenowych, co skutkowało obniżeniem wartości liczby kwasowej. Wadą epoksydowanych olejów okazała się ich ograniczona zdolność mieszania się z olejami mineralnymi, przez co nie mogą być bezpośrednio stosowane jako komponenty półsyntetycznych olejów. Dopiero przeprowadzenie transestryfikacji epoksydowanych olejów wyższymi alkoholem tłuszczowym umożliwia ich wykorzystanie jako komponentów olejów półsyntetycznych z olejami mineralnymi. 187 Kornelia Malarczyk, Eugeniusz Milchert 5. Biopoliuretany W literaturze można znaleźć informacje na temat stosowania olejów roślinnych do otrzymywania polioli, z których następnie wytwarza się poliuretany. Prowadzono między innymi badania nad otrzymywaniem polioli z olejów: palmowego, rzepakowego, rycynowego i sojowego [24÷27]. Poliole z olejów roślinnych uzyskuje się przez wprowadzenie grup hydroksylowych w miejsce wiązań nienasyconych. W tym celu przeprowadza się m. in. procesy epoksydacji, hydroksylacji, hydrolizy, uwodornienia, hydroformylowania, metanolizy, halogenownia i in. [28÷30]. Zaletami uzyskanych z nich tworzyw są dobre właściwości fizyczne i mechaniczne, a także zdolność do częściowej biodegradacji. Elastyczne pianki poliuretanowe dzieli się ze względu na ich sprężystość na tworzywa wysokoelastyczne, produkty o typowej sprężystości oraz produkty wiskoelastyczne charakteryzujące się małą sprężystością i powolnym powrotem do pierwotnego kształtu po odkształceniu [31]. Rojek i wsp. [31] otrzymywali poliole z oleju rzepakowego metodą dwuetapową: utlenianie wiązań nienasyconych nadkwasem octowym i następnie otwieranie pierścieni epoksydowych glikolem dietylenowym i rezorcyną (rys. 2) a) b) Rysunek 2. Otrzymywanie polioli z oleju rzepakowego: a) utlenianie oleju rzepakowego za pomocą nadkwasu octowego, b) otwieranie pierścieni oksiranowych glikolem dietylenowym (DEG) i rezorcyną (REZ) w epoksydowanym oleju rzepakowym; R’, R” - reszty kwasów tłuszczowych [31] 188 Techniczne znaczenie olejów roślinnych Uzyskane poliole zastosowano do produkcji poliuretanów. Wykazano, między innymi, że zastąpienie petrochemicznego poliolu do 40% mas. przez poliole powstałe przez otwarcie pierścieniu oksiranowych glikolem dietylenowym pozwala uzyskać dobrej jakości pianki wiskoelastyczne. Obecność polioli powstałych przez otwarcie pierścieni oksiranowych rezorcyną powyżej 15% mas. sprzyja szybkiemu odkształcaniu pianki po naprężeniu i wzrost sprężystości. Materiał taki jest jednak zbyt twardy. Arniza i wsp. [32] otrzymali z oleiny palmowej transestryfikowane poliole. Na początku przeprowadzili transestryfikację oleiny palmowej, następnie epoksydację i reakcję otwierania pierścienia epoksydowego. Uzyskane poliole z powodzeniem zastosowano do otrzymania sztywnych pianek poliuretanowych. Zwiększenie ilości polioli na bazie oleiny palmowej w produkcie powodowało spadek wytrzymałości na ściskanie i jednocześnie poprawę właściwości izolacyjnych pianek. Wcześniej w podobny sposób poliole otrzymywali Tanaka i współpr. [33] Badacze przeprowadzili konwersję oleju palmowego do polioli poprzez jego glicerolizę, uzyskując monoglicerydy z wydajnością 70% mas. W procesie stosowali glicerol, NaOH jako katalizator oraz alkohol t-butylowy jako rozpuszczalnik. Na bazie uzyskanych polioli z powodzeniem uzyskano pianki poliuretanowe. W literaturze można znaleźć wiele informacji na temat wykorzystania w syntezie poliuretanów polioli pochodzących z oleju sojowego [34÷36]. Monteavaro i wsp. [35] uzyskali poliuretany z wykorzystaniem poliolu sojowego, który poddawali kolejno epoksydacji i hydroksylacji w celu otwarcia pierścieni epoksydowych. Javni i wsp. [34] otrzymywali poliole z epoksydowanego oleju sojowego w reakcjach halogenowania, uwodornienia i metoksylowania. Inni badacze [37] syntezowali poliuretany akrylowe z użyciem składnika poliolowego, uprzednio modyfikowanego za pomocą poliestrów olejem sojowym. Poprawę właściwości poliuretanów osiągnięto przez naświetlanie poliolu promieniami UV. 6. Podsumowanie Zwiększenie użycia olejów roślinnych w produkcji paliw, środków smarowych oraz poliuretanów z całą pewnością przyczyni się do obniżenia zużycia olejów uzyskiwanych z ropy naftowej, której zasoby są ograniczone. Aby do tego doszło potrzebne są nie tylko odpowiednie instrumenty prawne i wsparcie badawcze, ale przede wszystkim technologie powalające w sposób ekonomiczny i przyjazny środowisku uzyskiwać wysokiej jakości biopaliwa, smary oraz polimery. 189 Kornelia Malarczyk, Eugeniusz Milchert Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Szałajko U., Fiszer S., Modyfikacja chemiczna olejów roślinnych w aspekcie ich wykorzystania w produkcji paliw silnikowych i środków smarowych, Przemysł Chemiczny., 82 (2003), s. 18-21 Walisiewicz-Niedbalska W., Kijeński J., Lipkowski A. W., Różycki K., Postępy w rozwoju badań nad otrzymywaniem biodiesla, Przemysł Chemiczny., 85 (2006), s. 1586-1591 Chowdhury K., Banu L.A., Khan S., Latif A., Studies on the Fatty Acid Composition of Edible Oil, Bangladesh Journal of Scientific and Industrial Research., 42 (2007), s. 311-316 Zadernowski R., Nowak-Polakowska H., Pieńkowska H., Czaplicki S., Wpływ sposobu wydobywania tłuszczu z nasion wiesiołka i ogórecznika na wybrane cechy fizykochemiczne oraz stabilność olejów, Rośliny Oleiste., 23 (2002), s. 471-480 Żbikowska A., Oleiste dobro narodowe, Przegląd Gastronomiczny., 3 (2010), s. 10-11 Knothe G., Gerpen J.V., Krahl J., The Biodiesel Handbook, AOCS Press, Urbana 2005. Meher L.C., Sagar D.V., Naik S.N., Technical aspects of biodiesel production by transesterification - a review, Renewable & Sustainable Energy Reviews., 10 (2006), s. 248-268 Karmakar A., Karmakar S., Mukherjee S., Properties of various plants and animals feedstocks for biodiesel production, Bioresource Technology., 101 (2010), s. 7201–7210 Myczko A., Golimowska R., Porównanie właściwości estrów metylowych w zależności od pochodzenia surowca, Journal of Research and Applications in Agricultural Engineering., 56 (2011), s. 111-117 Wcisło G., Określenie własności reologicznych oleju napędowego oraz biopaliw uzyskanych z lnianki, Inżynieria Rolnicza., 5 (2009), s. 295-301 Idzior M., Karpiuk W., Borowczyk T., Analiza wpływu temperatury biopaliw na makro- i mikrostrukturę rozpylanych strug, Postępy Nauki i Techniki., 15 (2012), s. 54-64 Wolszczak J., Jakubiec J., Właściwości fizykochemiczne i użytkowe biopaliw B50 skomponowanych w wersji letniej i zimowej przeznaczonych do zasilania pojazdów rolniczych, Inżynieria Rolnicza., 5 (2010), s. 299-309 Molenda J., Świgoń K., Urzędowska W., Sacha D., Korelacja wyników badań stabilności oksydacyjnej biopaliw silnikowych uzyskanych za pomocą testu Rancimat oraz Petrooxy, Nafta - Gaz.,10 (2010), s. 922-926 Poprawski W., Biodegradowalne smary w zastosowaniu do węzłów łożyskowych elementów wykonawczych maszyn roboczych, Inżynieria Maszyn., 19 (2014), s. 99-107 Fiscaro G., Fattori S., Use of a non-conventional synthetic basestock in the formulation of high-quality engine oils, Journal of Synthetic Lubrication., 10 (1993), s. 237-246 190 Techniczne znaczenie olejów roślinnych 16. Kržan B., Vižintin J., Ester Based Lubricants Diriwed From Renewable Resources, Tribology in Industry., 26 (2004), s. 58-62 17. Iłowska J., Gniady J., Kozupa M., Drabik J., Stabilizacja ekologicznych środków smarowych otrzymywanych na bazie oleju rzepakowego, Przemysł Chemiczny., 90 (2011), s. 1818-1822 18. Nowicki J., Mosio-Mosiewski J., Robaszkiewicz A., Wpływ oksydacyjnej modyfikacji syntetycznych estrów oleju rzepakowego na ich wybrane właściwości użytkowe, Przemysł Chemiczny., 90 (2011), s. 1249-1253 19. Siwiec E., Grądkowski M., Wpływ utleniania i hydrolizy na właściwości smarne oleju słonecznikowego, Tribologia., 5 (2003), s. 307-316 20. Arnsek A., Vizintin J., Lubrication properties of rapeseed-based oils, Lubrication Science., 16 (2000), s. 281-296 21. Wu X., Zhang X., Yang S., Chen H., Wang D., The study of epoxidized rapeseed oil used as a potential biodegradable lubricant, Journal of the American Oil Chemists’ Society., 77 (2000), s. 561-563 22. Uosukainen E., Linko Y., Lӓmsӓ M., Tervakangas T., Linko P., Transesterification of trimethylolpropane and rapeseed oil methyl ester to environmentally acceptable lubricants, Journal of the American Oil Chemists’ Society., 75 (1998), s. 1557-1563 23. Fiszer S., Szałajko U., Szeja W., Niemiec P., Epoksydowane oleje roślinne jako środki smarowe, Przemysł Chemiczny., 82 (2003), s. 1016-1019 24. Pawlik H., Prociak A., Pielichowski J., Synteza polioli z oleju palmowego przeznaczonych do otrzymywania elastycznych pianek poliuretanowych, Czasopismo Techniczne., 1 (2009), s. 111-117 25. Hill K., Fats and oils as oleochemical raw materials, Pure and Applied Chemistry., 72 (2000), s. 1255 26. Ionescu M., Chemistry and Technology of Polyols for Polyurethanes, Rapra Technology Limited, United Kingdam 2005 27. Petrović Z., Polyurethanes from Vegetable Oils, Polymer Reviews., 48 (2008) s.109-155 28. Javni I., Guo A., The study of oxazolidone formation from 9,10epoxyoctadecane and phenylisocyanate, Journal of the American Oil Chemists’ Society., 80 (2003), s. 595-600 29. Monteavaro L.L., Edurado O.D., Anapaula O.C., Dimitrios S., Annelise E.G., Cesar L.P., Polyurethane networks from formiated soy polyols: Synthesis and mechanical characterization, Journal of the American Oil Chemists’ Society., 82 (2005), s. 365-371 30. Stirna U., Sevastyanova I., Misane M., Cabulis U., Beverte I., Structure and properties of polyurethane foams obtained from rapeseed oil polyols, Proceedings of the Estonian Academy of Sciences Chemistry., 55 (2006), s. 101-110 31. Rojek P., Pawlik H., Prociak A., Wpływ budowy chemicznej bio-polioli z oleju rzepakowego na właściwości wiskoelastycznych pianek poliuretanowych, Czasopismo Techniczne., 1 (2010), s. 277-284 32. Arniza M.Z., Hoong S.S., Idris Z., Yeong S.K., Hassan H.A., Din A.K., Choo Y.M., Synthesis of Transesterified Palm Olein-Based Polyol and Rigid 191 Kornelia Malarczyk, Eugeniusz Milchert 33. 34. 35. 36. 37. Polyurethanes from this Polyol, Journal of the American Oil Chemists’ Society., 92 (2015), s. 243-255 Tanka R., Hirose S., Hatakeyama H., Preparation and characterization of polyurethane foams using a palm oil-based polyol, Bioresource Technology., 99 (2008), s. 3810-3816 Javni I., Guo A., Petrovic Z.S., The Study of Oxazolidone Formation from 9,10-Epoxyoctadecane and Phenylisocyanate, Journal of the American Oil Chemists’ Society., 80 (2003), s. 595-600 Monteavaro L., da Silva E.O., Costa A.P.O., Samios D., Gerbase A.E., Petzhold C.L., Polyurethane networks from formiated soy polyols: Synthesis and mechanical characterization, Journal of the American Oil Chemists’ Society., 82 (2005), s. 365-371 Dwan'Isa J.P.L., Mohanty A.K., Misra M., Drzal L.T., Kazemizadeh M., Novel Biobased Polyurethanes Synthesized from Soybean Phosphate Ester Polyols: Thermomechanical Properties Evaluations, Novel Biobased Polyurethanes Synthesized from Soybean Phosphate Ester Polyols: Thermomechanical Properties Evaluations, Journal of Polymers and the Environment., 11 (2003), s. 161-168 Dzunuzovic E., Tasic S., Bozic B., Babic D., Dunjic B., UV-curable hyperbranched urethane acrylate oligomers containing soybean fatty acids, Progress in Organic Coatings., 52 (2005), s. 136-143 Techniczne znaczenie olejów roślinnych Streszczenie Oleje roślinne są dostępnym, tanim i nietoksycznym surowcem, uznawanym za potencjalny zamiennik produktów pochodzenia petrochemicznego. W literaturze dostępne są wyniki badań na temat wykorzystania olejów pochodzenia naturalnego w produkcji biopaliw i polimerów. Najczęściej bada się oleje palmowy, sojowy i rzepakowy. W pracy przedstawiono budowę i właściwości najpopularniejszych olejów roślinnych. Dokonano przeglądu literatury dotyczącej wykorzystania olejów roślinnych do otrzymywania biopaliw, środków smarowych oraz poliuretanów. Przedstawiono ich metody otrzymywania oraz właściwości. Wykorzystanie olejów roślinnych w przemyśle nabiera coraz większego znaczenia. Odpowiednie instrumenty prawne, wsparcie badawcze, ale przede wszystkim technologie z całą pewnością pozwolą w sposób ekonomiczny i przyjazny środowisku uzyskiwać wysokiej jakości biopaliwa, środki smarowe oraz biopolimery. Słowa kluczowe: biopaliwa, środki smarowe, biopoliuretany 192 Grzegorz Babiarz1, Konrad Terpiłowski2, Lucyna Hołysz3 Swobodna energia powierzchniowa szkieł stosowanych w rolnictwie 1. Wstęp Szkło jest wykorzystywane w wielu dziedzinach życia codziennego, wbudownictwie, architekturze, rolnictwie czy przemyśle. Jest materiałem odpornym na działanie czynników chemicznych i atmosferycznych. W celu poprawy właściwości optycznych szkła rozwijane są technologie mające na celu zarówno trawienie, jak i pokrywanie powierzchni różnego rodzaju warstwami zmieniającymi ich właściwości . W ostatnich latach popularnością cieszy się tzw. szkło dyfuzyjne, które ma możliwość sterowania intensywnością rozpraszania światła proporcjonalnie do intensywności oświetlenia. Jest to szczególnie istotne w szklarniach, ponieważ tego typu szkła umożliwiają dostosowanie stopnia dyfuzji światła i cienia do potrzeb poszczególnych gatunków roślin i do różnych stref klimatycznych. Z kolei nakładanie warstwy antyrefleksyjnej na powierzchnię szkła powoduje zminimalizowanie natężenia światła odbitego i zwiększenie natężenia światła przechodzącego w wyniku odpowiedniego dobrania współczynnika załamania światła warstwy powłoki tak, aby współczynnik odbicia był jak najmniejszy. Szkło dyfuzyjno-antyrefleksyjne łączy właściwości rozpraszające i wysoką transmitancję światła, co jest najbardziej wydajnym rodzajem pokrycia szklarni i przynosi wiele korzyści: równomierną dystrybucję światła na wszystkich wysokościach pędów roślin, obniżenie temperatury w szklarni, a tym samym wzrost wydajności zbiorów ok. 10-15%. Zwilżalność to proces, w którym granica faz ciało stałe-gaz jest zastępowana granicą faz ciało stałe-ciecz. Zjawiska zwilżalności odgrywają znaczącą rolę wprzyrodzie, życiu codziennym i przemyśle. Proces zwilżania zachodzi w układach trójfazowych. Charakterystyka zwilżalności powierzchni ciał stałych ma olbrzymie znaczenie dla zrozumienia wielu procesów zachodzących na granicach różnych faz [1, 2]. 1 Grzegorz Babiarz, [email protected], D.A. GLASS, ul. Warszawska 55, 35-205, Rzeszów 2 Konrad Terpiłowski,[email protected], Zakład Zjawisk Międzyfazowych, Katedra Chemii Fizycznej UMCS, http://www.umcs.pl/pl/ 3 Lucyna Hołysz, [email protected], Zakład Zjawisk Międzyfazowych, Katedra Chemii Fizycznej UMCS, http://www.umcs.pl/pl/ 193 Grzegorz Babiarz , Konrad Terpiłowski , Lucyna Hołysz Ciecz może się mniej lub bardziej rozpływać na powierzchni ciała stałego lub cieczy. Jest to zależne od sił międzycząsteczkowych występujących wciele stałym i cieczy. Im silniej cząsteczki cieczy są przyciągane przez cząsteczki ciała stałego, tym kropla bardziej będzie się rozpływać po powierzchni i wówczas obserwowana jest większa zwilżalność. Jeśli natomiast cząsteczki ciała stałego słabo przyciągają cząsteczki wody, to kropla nie rozpływa się, ale zachowuje owalny kształt. Mamy wówczas do czynienia z częściowym zwilżaniem lub brakiem zwilżania [3, 4]. Miarą zwilżalności ciała stałego przez ciecz jest kąt zwilżania, który determinowany jest przez wielkość swobodnej energii powierzchniowej ciała stałego i cieczy [1]. Kąt zwilżania jest to kąt zawarty pomiędzy płaszczyzną ciała stałego astyczną do powierzchni kropli cieczy w punkcie trójfazowego kontaktu. Na wielkość kąta zwilżania wpływa budowa chemiczna powierzchni ciała stałego (hydrofilowość lub hydrofobowość), czas kontaktu oraz heterogeniczność warstwy powierzchniowej. Im niższa jest wartość kąta zwilżania, tym wyższa jest hydrofilowość powierzchni [1]. Kąt zwilżania może być zawarty w przedziale od 0° do 180° (Rys.1). A) B) Rys. 1. Kąt zwilżania wody A) powierzchnia hydrofilowa B) powierzchnia superhydrofobowa [opracowanie własne] 194 Swobodna energia powierzchniowa szkieł stosowanych w rolnictwie Gdy kąt zwilżania ma wartość ok. 0 mamy do czynienia z materiałami silnie hydrofilowymi o bardzo dużej wartości swobodnej energii powierzchniowej, natomiast gdy wartość kąta zwilżania jest bliska 180°, wtedy dana powierzchnia jest całkowicie hydrofobowa-superhydrofobowa [5÷7]. Dla tej samej powierzchni ciała stałego i dla tej samej cieczy istnieją dwa kąty zwilżania. Kątem wstępującym (ang. advancingangleθa) nazywa się kąt zwilżania zmierzony dla kropli cieczy postawionej na powierzchni ciała stałego, natomiast cofającym kątem zwilżania (ang. recedingangleθr) po zmniejszeniu objętości tej kropli. Wstępujący i cofający kąt zwilżania stanowią maksymalny i minimalny kąt wśród określanych metastabilnych kątów zwilżania [8]. Charakterystyka właściwości powierzchniowych awszczególności wielkość swobodnej energii powierzchniowej ciała stałego jest kluczem do zrozumienia wielu zjawisk międzyfazowych, takich jak zwilżanie, adsorpcja czy adhezja [9, 10]. Niestety, wartość swobodnej energii powierzchniowej nie może być zmierzona bezpośrednio. Dla ciał stałych o niskiej energii takich jak większość polimerów, wartość swobodnej energii powierzchniowej oblicza z pomiarów kąta zwilżania kropli cieczy postawionej na powierzchni [11], ponieważ zaniedbuje się obecność filmu cieczy poza jej kropelką. Podobne założenie przyjmuje się również dla innych ciał stałych. Wyznaczanie swobodnej energii powierzchniowej poprzez pomiar kąta zwilżania, nawet przy użyciu czystych cieczy nie jest proste i występuje wiele problemów takich jak: parowanie kropli, porowatość ciała stałego czy oddziaływania między cieczą a ciałem stałym. Równanie Younga znane jest od około 200 lat [12], a jego matematyczna postać można przedstawić następująco: γS=γSL+γL∙cosθ (1) gdzie: γS – swobodna energia powierzchniowa ciała stałego, γSL – swobodna energia międzyfazowa na granicy faz ciało stałe/ciecz, γL –napięcie powierzchniowe cieczy, θ – kąt zwilżania. Chibowski [12, 13–15] stwierdził, że wokół kropli powstaje film cieczy po cofnięciu linii trójfazowego kontaktu. Obecność takiego filmu wyjaśnia występowanie histerezy kąta zwilżania. Wynikiem tych założeń jest równanie, które pozwala obliczyć swobodną energię powierzchniową wiążąc wstępujący (θa) i cofający (θr) kąta zwilżania ze napięciem powierzchniowym cieczy: 𝛾 (1+𝑐𝑜𝑠 𝜃𝑎 )2 𝑟 +𝑐𝑜𝑠 𝜃𝑎 𝐿 𝛾𝑆 = 2+𝑐𝑜𝑠 𝜃 (2) Van Oss i współ. [16] wyróżnili oddziaływania Lifshitza-van der Waalsa (γSLW) i kwasowo-zasadowe Lewisa (γSAB), których suma stanowi swobodna energię powierzchniową. Oddziaływania kwasowo-zasadowe 195 Grzegorz Babiarz , Konrad Terpiłowski , Lucyna Hołysz Lewisa stanowią średnią geometryczną oddziaływań akceptorowych (γS+) i elektrono-donorowych (γS-). elektrono- 𝛾𝑆 = 𝛾𝑆𝐿𝑊 + 𝛾𝑆𝐴𝐵 = 𝛾𝑆𝐿𝑊 + 2(𝛾𝑆+ 𝛾𝑆− )1/2 (3) Praca adhezji Wa cieczy na powierzchni ciała stałego jest wyrażona wzorem: 𝑊𝐴 = 𝛾𝐿 1 + 𝑐𝑜𝑠𝜃 = 2(𝛾𝑆𝐿𝑊 𝛾𝐿𝐿𝑊 )1/2 + 2(𝛾𝑆+ 𝛾𝐿− )1/2 + 2(𝛾𝐿+ 𝛾𝑆− )1/2 (4) Indeksy „s” i „l” oznaczają odpowiednio: ciało stałe, ciecz, a θ to wstępujący kąt zwilżania cieczy. Jeżeli kąt zwilżania jest mierzony dla trzech różnych cieczy (np. dijodometan, woda, formamid), których składowe są znane, wtedy można rozwiązać układ trzech równań (4) i obliczyć scałkowitą swobodną energię powierzchniową ciała stałego. Tab. 1.Fizykochemiczne właściwości cieczy próbnych: napięcie powierzchniowe apolarna l LW donorowa l ld , składowa elektronowo akceptorowa , składowa polarna kwasowo zasadowa Ciecz Woda Formamid Dijodometan l 72,8 58,0 50,8 lLW(ld) 21,8 39,0 50,8 AB l l+ 25,5 2,28 0 l , l , składowa składowa elektronowo [mJ/m2] [15-16]. l25,5 39,6 0 lAB 51,0 19,0 0,0 2. Cel pracy Celem pracy było scharakteryzowanie zwilżalności oraz wyznaczenie swobodnej energii powierzchniowej szkieł użytkowych otrzymanych z firmy D.A. Glass(DAG) Rzeszów oraz szkła sodowo-wapniowego (szkiełka mikroskopowe). 3. Materiały i metody 3.1. Przygotowanie płytek Płytki badanych szkieł umieszczono w metanolu i poddano działaniu ultradźwięków przez 15 min w celu odtłuszczenia powierzchni. Następnie umieszczono w suszarce próżniowej w temperaturze 50oC w celu wysuszenia powierzchni. 196 Swobodna energia powierzchniowa szkieł stosowanych w rolnictwie 3.2. Pomiar kątów zwilżania Dla wszystkich rodzajów szkieł przeprowadzono pomiary wstępujących icofających kątów zwilżania trzech cieczy próbnych: wody (Milli-Q 185), formamidu (98% Aldrich) i dijodometanu (99% Aldrich). Pomiary kątów zwilżania realizowano za pomocą przyrządu pomiarowego Contact Angle Meter, firmy GBX (Francja) sprzężonego z komputerem, wyposażony wkamerę oraz oprogramowanie WinDrop++ do wyznaczania kątów zwilżania z kształtu osadzonej kropli. Pomiar wstępującego kąta zwilżania przeprowadzano stawiając na powierzchni płytki, za pomocą mikrostrzykawki, kropelkę cieczy próbnej o objętości 6 μl. Kąt cofający mierzono po odciągnięciu z postawionej kropli 2 μl cieczy. 3.3. Szkła użyte do badań Szkiełka mikroskopowe–szkło sodowo-wapniowe, Comex, Wrocław; RegularFloat–szkło sodowe charakteryzujące się zielonkawym zabarwieniem, wytwarzane tzw. metodą float, czyli wylewania masy szklanej na płynną cynę; Low Iron Glass (LIG) – szkło wytwarzane metodą float i oczyszczane z tlenków żelaza, co zwiększa jego przepuszczalność; Low Iron Glass Ar DAG I (LIG Ar DAG I) szkło niskożelazowe z powłoką antyrefleksyjną, która załamuje światło wchodzące i wychodzące w taki sposób, że nie daje refleksów.W porównaniu ze szkłem tradycyjnym przepuszcza o około 8% energii świetlnej więcej; Low Iron Glass Ar DAG II (LIG Ar DAG II) – szkło niskożelazowe z powłoką antyrefleksyjną o najlepszych parametrach optycznych (tzn. najlepszej transmitancji bezpośredniej i hemisferycznej); Low Iron Glass Ar Mat DAG (LIG Ar Mat DAG) − szkło dyfuzyjnoantyrefleksyjne z powłoką matową, rozpraszającą światło równomiernie we wszystkich kierunkach; Low Iron Glass Ar SU (LIG Ar SU) – szkło antyrefleksyjne opracowane w innej firmie. Warstwa antyrefleksyjna uzyskiwana poprzez wypłukanie alkaliów z powierzchni szkła w kąpieli o składzie: kwas heksafluorokrzemowy, kwas borowy oraz krzemionka; Low Iron Glass Ar Mat SU (LIG Ar Mat SU) − szkło antyrefleksyjne z powłoką matową; Low Iron Glass Ar STRIPES (LIG Ar STRIPES) – szkło dyfuzyjne z nierównościami na powierzchni w postaci pasków, pokryte warstwą antyrefleksyjną. 197 Grzegorz Babiarz , Konrad Terpiłowski , Lucyna Hołysz Na podstawie zmierzonych katów zwilżania obliczono całkowitą swobodną energię powierzchniową w oparciu o podejście Chibowskiego (CAH) ikwasowo-zasadowe (LWAB) van Ossa i współ. (LWAB). W celu obrazowania i charakteryzowania powierzchni badanych szkieł wykorzystano ponadto profilometr (Contour GT, Veeco)optyczny, którego działanie oparte jest na zjawisku interferencji światła – (obrazowanie prążków interferencyjnych). 4. Omówienie i dyskusja wyników 4.1. Kąty zwilżania Średnia wartość wstępujących kątów zwilżania kropelek wody na powierzchni szkiełek mikroskopowych wynosi 35,02,9o, natomiast cofających 29,34,1o. W przypadku formamidu powtarzalność pomiarów kątów zwilżania nie jest do końca zadowalająca ze względu na odchylenie standardowe wynoszące ok. 5o, co może świadczyć o pewnej niejednorodności energetycznej powierzchni. Średnie wartości wstępujących i cofających kątów zwilżania są nieco niższe niż dla wody i wynoszą odpowiednio 29,35o oraz 28,45,4o. W przypadku formamidu oddziaływania elektronodonorowe wynoszą 39,6 mN/m i są zbliżone do oddziaływań apolarnych, które wynoszą 39 mN/m. Rodzaj i wielkość oddziaływań przez granicę faz ciało stałe−ciecz w przypadku polarnej wody iformamidu różnią się od niepolarnego dijodometanu, który przez granicę faz oddziałuje głównie siłami dyspersyjnymi Londona. Tak więc wstępujące i cofające kąty zwilżania dijodometanu, odzwierciedlające oddziaływania apolarne powierzchni szkła, są wyższe niż cieczy polarnych i wynoszą odpowiednio 45,81,8o oraz 42,92,2o. 60 60 Kąt wstępujący 50 50 45 45 40 35 30 25 20 15 Kąt wstępujący 55 Kąt cofający Kąt zwilżania [stopień] Kąt zwilżania [stopień] 55 40 35 30 25 20 15 10 10 5 5 0 Kąt cofający 0 woda dijodometan woda formamid dijodometan formamid Szkło sodowo-wapniowe Szkło sodowe Rys. 2. Wartości wstępujących i cofających kątów zwilżania wody, dijodometanu i formamidu na szkle sodowo-wapniowym: szkiełka mikroskopowe i szkle sodowym (Regularfloat) [opracowanie własne] 198 Swobodna energia powierzchniowa szkieł stosowanych w rolnictwie W przypadku szkła sodowego stwierdzono wzrost wstępujących icofających kątów zwilżania wody i dijodometanu w porównaniu ze szkłem sodowowapniowym, co świadczy o wzroście hydrofobowości jego powierzchni. W celu zwiększenia przepuszczalności światła (szczególnie wzakresie podczerwieni) szkło wytwarzane metodą float oczyszcza się od tlenków żelaza. Powoduje to wzrost transmisji bezpośredniej światła do 91% ihemisferycznej do 84% oraz zmiany zwilżalności, co uwidacznia obniżenie wstępujących kątów zwilżania wody z 48,81,9o do 43,74,1o idijodometanu z 56,71,8o do 31,52,3o (rys. 2 i 3). 60 Kąt wstępujący 55 Kąt cofający 50 Kąt zwilżania [stopień] 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 woda dijodometan formamid Rys. 3.Wartości wstępujących i cofających kątów zwilżania wody, dijodometanu i formamidu na szkle sodowym z niską zawartością żelaza (Low Iron Glass – LIG) [opracowanie własne] Na rys. 5 zamieszczono wstępujące i cofające kąty zwilżania trzech cieczy próbnych na powierzchni dwóch próbek szkła niskożelazowego pokrytych warstwą antyrefleksyjną przez firmę D.A. Glass (DAG) (LIG Ar DAG), zktórych jedna wykazuje bardzo dobre parametry optyczne. Na obu próbkach nie udało się zmierzyć kątów zwilżania wody, ponieważ kropelka postawiona na ich powierzchni rozpływała się (rys. 4). 25 25 Kąt wstępujący Kąt wstępujący Kąt cofający Kąt cofający 20 Kąt zwilżania [stopień] Kąt zwilżania [stopień] 20 15 10 5 próbka o najlepszych parametrach optycznych 15 10 5 0 0 woda dijodometan woda formamid dijodometan formamid LIG Ar DAG I LIG Ar DAG II Rys. 4. Wartości wstępujących i cofających kątów zwilżania wody, dijodometanu i formamidu na szkle niskożelazowym z warstwą antyrefleksyjną (Low Iron Glass Ar DAG I) i szkle (Low Iron Glass Ar DAG II) [opracowanie własne] 199 Grzegorz Babiarz , Konrad Terpiłowski , Lucyna Hołysz Oba szkła z powłoką antyrefleksyjną wykazują silne właściwości hydrofilowe. Widoczny jest wyraźny spadek kątów zwilżania (wstępującego icofającego) dijodometanu i formamidu w odniesieniu do szkła niskożelazowego, przy czym na szkle o lepszych parametrach optycznych kąty zwilżania obu cieczy są niższe niż na szkle LIG Ar DAG I. Wprzypadku dijodometanu wstępujący kąt zwilżania ulega obniżeniu z31,52,3o na szkle o niskiej zawartości żelaza do 18,83,9o i 12,90,7o na szkle LIG z warstewką antyrefleksyjną zwykłą i o najlepszych parametrach optycznych (rys. 4). Dla formamidu wstępujący kąt zwilżania maleje z27,14° na szkle niskożelazowym (rys. 4) do 123,4° i 9,12,3o na obu szkłach LIG pokrytych warstwą antyrefleksyjną (rys. 4). Kolejna próbka szkła antyrefleksyjnego (LIG Ar SU) była opracowana przez inną firmę wwyniku wypłukiwania alkaliów z powierzchni szkła za pomocą kąpieli kwasu heksafluorokrzemowego, kwasu borowego i krzemionki. Wyniki pomiarów kątów zwilżania cieczy próbnych na szkle LIG Ar SU przedstawiono na rys. 5. Z zamieszczonych danych wynika, że jest to szkło o innych właściwościach zwilżających niż szkło LIG Ar DAG. Kąty zwilżania wszystkich cieczy próbnych są wyższe niż na szkle z warstewkami Ar firmy D.A. Glass, ale niższe niż na szkle niskożelazowym LIG (rys. 4). 60 Kąt wstępujący 55 Kąt cofający 50 Kąt zwilżania [stopień] 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 woda dijodometan formamid Rys. 5. Wartości wstępujących i cofających kątów zwilżania wody, dijodometanu i formamidu na szkle z warstwą antyrefleksyjną (LIG Ar SU) [opracowanie własne] Dalsze pomiary kątów zwilżania przeprowadzono na powierzchni szkła dyfuzyjnego rozpraszającego światło równomiernie we wszystkich kierunkach, którego powierzchnię poddano procesowi matowienia w kąpieli matującej, wskład której wchodzi kwaśny fluorek amonu (roztwór przesycony) oraz siarczan baru jako wypełniacz (rys.6.). Na szkło po zmatowieniu została nałożona warstewka antyrefleksyjna.Szkła zmatowione z powłokami antyrefleksyjnymi LIG Ar Mat DAG i LIG Ar Mat SU różnią się nieco właściwościami zwilżającymi. W przypadku szkła 200 Swobodna energia powierzchniowa szkieł stosowanych w rolnictwie LIG Ar Mat SU kąty zwilżania wszystkich cieczy próbnych są wyższe niż na powierzchni szkła LIG Ar Mat DAG co oznacza, że oddziałują one słabiej z jego powierzchnią (rys. 6). 60 60 Kąt wstępujący 50 50 45 45 40 35 30 25 20 15 Kąt wstępujący 55 Kąt cofający Kąt zwilżania [stopień] Kąt zwilżania [stopień] 55 Kąt cofający 40 35 30 25 20 15 10 10 5 5 0 0 woda dijodometan formamid woda dijodometan formamid LIGAr Mat DAG LIGAr Mat SU Rys. 6. Zmiany wstępujących i cofających kątów zwilżania wody, dijodometanu iformamidu na szkle zmatowionego szkła dyfuzyjno-antyrefleksyjnego (LIG Ar Mat DAG) i (LIG Ar Mat SU) [opracowanie własne] Na rys. 7. przedstawiono kąty zwilżania wody, formamidu i dijodometanu na powierzchni szkła dyfuzyjnego prążkowanego (rozpraszające światło kierunkowo) pokrytego dodatkowo warstwą antyrefleksyjną (LIG Ar STRIPES). Analizując wartości kątów zwilżania można zauważyć, że pod względem zwilżalności wykazuje ono podobne właściwości jak szkło LIG Ar Mat DAG (rys. 6). 60 Kąt wstępujący 55 Kąt cofający 50 Kąt zwilżania [stopień] 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 woda dijodometan formamid Rys. 7. Zmiany wstępujących i cofających kątów zwilżania wody, dijodometanu i formamidu na szkle dyfuzyjnym rozpraszającym kierunkowo światło (szkło prążkowane) dodatkowo pokrytym warstwą antyrefleksyjną (LIG Ar STRIPES) [opracowanie własne] Można stwierdzić, że obróbka powierzchni szkła w celu poprawy właściwości optycznych wpływa na zmiany jego właściwości powierz- 201 Grzegorz Babiarz , Konrad Terpiłowski , Lucyna Hołysz chniowych, co objawia się również zmianami wstępujących i cofających kątów zwilżania badanych cieczy próbnych. We wszystkich przypadkach następuje obniżenie kątów zwilżania cieczy testowych, co może wskazywać na wzrost właściwości hydrofilowych badanych szkieł. Szczególnie istotne są tu wartości cofających kątów zwilżania wody, z tego względu, że badane szkła są usytuowane pod określonym kątem wszklarniach czy systemach solarnych i często mają kontakt z wodą wczasie opadów. 4.2. Swobodna energia powierzchniowa szkieł 70 CAH 2 Swobodna energia powierzchniowa [mJ/m ] Całkowitą swobodną energię powierzchniową badanych szkieł obliczano na podstawie składowych swobodnej energii powierzchniowej wyznaczonych z podejścia kwasowo-zasadowego van Ossa i współ. (LWAB) [15, 16] oraz w oparciu o histerezę kątów zwilżania cieczy testowych (CAH) [12, 13−15]. W pierwszej metodzie stosuje się wstępujące kąty zwilżania (4), natomiast w drugiej wstępujące i cofające kąty zwilżania (2). LWAB 60 50 40 30 20 10 0 Szkło sodowowapniowe Szkło niskożelazowe Szkło sodowe Rys. 8. Całkowita swobodna energia powierzchniowa trzech szkieł obliczona w oparciu opodejście Chibowskiego (CAH) i van Ossa (LWAB) [opracowanie własne] Wartości swobodnej energii powierzchniowej szkła sodowo-wapniowego, sodowego iniskożelazowego zamieszczono na rys. 8. Jak można zauważyć wartości całkowitej swobodnej energii powierzchniowej (𝛾𝑆 ) badanych szkieł wyznaczone w oparciu o podejście CAH i LWAB są bardzo zbliżone. Wartości energii obliczone z CAH są uśrednione zwartości wyznaczonych oddzielnie z histerezy kątów zwilżania wody, formamidu idijodometanu. Odchylenie standardowe od wartości średniej jest znaczne, ze względu na silne oddziaływania cieczy polarnych, tj. wody iformamidu na polarnej powierzchni ciała stałego, gdzie oddziaływania polarne 𝛾𝑆+ i 𝛾𝑆− 202 Swobodna energia powierzchniowa szkieł stosowanych w rolnictwie 70 CAH LWAB 2 Swobodna energia powierzchniowa [mJ/m ] są silniejsze. Nieco wyższe wartości 𝛾𝑆 szkła sodowo-wapniowego iniskożelazowego obliczone z CAH mogą wynikać z uwzględnienia cofających kątów zwilżania badanych cieczy, chociaż w przypadku wartości wyznaczonych z obu podejść dla szkła sodowego są praktycznie takie same. Porównując wartości 𝛾𝑆 obliczone z CAH widać, że szkło sodowo-wapniowe wykazuje najwyższą wartość energii (57,9 mJ/m2), natomiast najniższą szkło sodowe (50 mJ/m2). W przypadku szkła niskożelazowego zpowłoką antyrefleksyjną LIG Ar DAG nie udało się zmierzyć kątów zwilżania wody, ze względu na obserwowany efekt rozpływania się ciczy po powierzchni szkła. Niemniej jednak, wartość 𝛾𝑆 wyznaczona z histerezy kątów zwilżania formamidu dla próbki LIG Ar DAG I wynosi 57,2 mJ/m2, natomiast dla próbki LIG Ar DAG II 57,5 mJ/m2, orazdladijodometanu odpowiednio 49 i 50 mJ/m2. 60 50 40 30 20 10 0 LIG Ar SU LIG Ar Mat DAG LIG Ar Mat SU LIG Ar STRIPES Rys. 9. Zmiany całkowitej swobodnej energii powierzchniowej modyfikowanych powierzchniowo szkieł obliczone w oparciu z podejścia Chibowskiego (CAH) i van Ossa i współ. (LWAB) [opracowanie własne] Zmiany swobodnej energii powierzchniowej modyfikowanych powierzchniowo szkieł (LIG Ar SU, LIG Ar Mat SU, LIG Ar Mat DAG, LIG Ar STRIPES) zamieszczone na rys. 9 wskazują, że ich całkowita swobodna energia powierzchniowa nieznacznie wzrasta w porównaniu do szkła niskożelazowego (rys. 8). Więcej informacji o charakterze hydrofilowo-hydrofobowym badanych szkieł można uzyskać na podstawie wielkości składowych swobodnej energii powierzchniowej. W przypadku szkła sodowo-wapniowego, niskożelazowego isodowego pomimo, iż wartości 𝛾𝑆 obliczone z podejścia LWAB są zbliżone, to występują znaczące różnice w wartościach poszczególnych składowych swobodnej energii powierzchniowej. Najbardziej zasadowy charakter wykazuje szkło sodowo-wapniowe, ponieważ oddziaływania 𝛾𝑠−są najwyższe i wynoszą 41,61 mJ/m2, natomiast najniższe wartości zostały 203 Grzegorz Babiarz , Konrad Terpiłowski , Lucyna Hołysz odnotowane dla szkła sodowego, gdzie parametr elektrono-donorowy wynosi się 23,21 mJ/m2(rys.10). W przypadku tego szkła stwierdzono znaczący wzrost oddziaływań o charakterze elektrono-akceptorowym (𝛾𝑠+ =4,5 mJ/m2). Istotne różnice występują również w przypadku oddziaływań apolarnych Lifshitza-van der Waalsa. Największe oddziaływania dyspersyjne można przypisać w tym przypadku powierzchni szkła niskożelazowego (43,6 mJ/m2), natomiast najniższe szkłom sodowym (30,5 mJ/m2). 50 45 LW S - S + S Składowe swobodnej energii 2 powierzchniowej [mJ/m ] 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Szkło sodowowapniowe Szkło niskożelazowe Szkło sodowe Rys. 10. Zmiany składowych swobodnej energii powierzchniowej szkieł obliczone w oparciu opodejście LWAB [opracowanie własne] Analizując wartości składowych swobodnej energii powierzchniowej LIG Ar SU, LIG Ar Mat SU, LIG Ar Mat DAG, LIG Ar STRIPES zamieszczone na rys. 11 widać, że modyfikacja powierzchni szkła niskożelazowego przez naniesienie powłoki antyrefleksyjnej, zmatowienie powierzchni czy nacięcie prążków znacząco wpływa na zmiany oddziaływań polarnych, czyli parametru elektrono-donorowego. Dla wszystkich czterech szkieł wielkość parametru elektrono-donorowego jest praktycznie taka sama, niemniej jednak stwierdzono jego wzrost o ok. 40% w porównaniu do 𝛾𝑠− szkła wyjściowego, czyli niskożelazowego LIG. (rys. 10 i 11). Z wyjątkiem szkła LIG Ar Mat SU oddziaływania apolarne po modyfikacji powierzchni nie ulegają zmianie. 204 Swobodna energia powierzchniowa szkieł stosowanych w rolnictwie 55 50 LW S - S + S Składowe swobodnej energii 2 powierzchniowej [mJ/m ] 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 LIG Ar SU LIG Ar Mat DAG LIG Ar Mat SU LIG Ar STRIPES Rys. 11. Zmiany składowych swobodnej energii powierzchniowej szkieł obliczone w oparciu opodejście LWAB [opracowanie własne] 4.3. Analiza chropowatości powierzchni przy wykorzystaniu profilometru optycznego W tabeli 2 zamieszczono obrazy powierzchni badanych szkieł owymiarach 156 m × 117 m wraz z wartościami parametrów chropowatości. Z uzyskanych danych wynika, że najbardziej gładką powierzchnię posiada szkło sodowo-wapniowe (płytki mikroskopowe), dla którego średnia chropowatość Rawynosi 0,4 nm, a Rq=0,51 nm. Wprzypadku szkła sodowego stwierdzono ponad dwukrotny wzrost chropowatości powierzchni (Ra=0,9 nm) oraz trzykrotny RMS(ang. Root MeanSquare) w porównaniu do szkła sodowo-wapniowego. Oczyszczenie szkła sodowego z tlenków żelaza, w celu zwiększenia jego przepuszczalności wpływa na 8−krotny wzrost średniej chropowatości powierzchni oraz 10−krotny RMS. Znacząco wzrosła również wysokość od najwyższego wzniesienia do najniższego wgłębienia Rt (ok. 14 razy). Obecność warstwy antyrefleksyjnej na powierzchni szkła niskożelazowego LIG Ar DAG próbka I i II wpływa na dalszy wzrost chropowatości powierzchni, przy czym powierzchnia szkła olepszych parametrach optycznych (II) jest bardziej chropowata w porównaniu do próbki I. Zmatowienie powierzchni szkła dyfuzyjnego w celu równomiernego rozpraszania światła we wszystkich kierunkach powoduje powstanie nierówności, których wymiary wzrastają do ok. 1 µm, a wysokość od najwyższego wzniesienia do najniższego wgłębienia do ok. 9 µm. Wzrost chropowatości powierzchni modyfikowanych szkieł jest związane ze wzrostem hydrofilowości ich powierzchni, badane ciecze mają lepszy dostęp do polarnych miejsc aktywnych. 205 Grzegorz Babiarz , Konrad Terpiłowski , Lucyna Hołysz Tab.2. Parametry chropowatości powierzchni badanych szkieł dla próbek o wymiarach odwzorowań156 m × 117 m. Nazwa Ra[m] Rq[m] Rt[m] 0,51 8,9 Szkło sodowo- 0,4 wapniowe 0,9 1,46 182,0 Szkło sodowe 8,0 15,6 2550 LIG 20,47 43,5 4400 LIG Ar DAG I 96,9 252,6 6830 LIG Ar DAG II 6,0 7,6 83,6 LIG Ar SU 890 1120 8970 LIG Ar Mat DAG 1100 1370 8550 LIG Ar Mat SU 349 421 5200 LIG Ar Stripes Ra – średnia chropowatość Rq – (ang. Root MeanSquare – RMS) odchylenie standardowe od wartości średniej wertykalnej współrzędnych punktów pomiarowych Rt – wysokość od najwyższego wzniesienia do najniższego wgłębienia 5. Wnioski Szkło sodowe charakteryzuje się wzrostem hydrofobowości powierzchni wporównaniu do szkła sodowo-wapniowego i niskożelazowego (LIG) zuwagi na wzrost wstępujących i cofających kątów zwilżania cieczy próbnych. Szkło z niską zawartością żelaza (LIG) cechuje się niższymi kątami zwilżania niż szkło sodowe, co prawdopodobnie wynika ze zmiany składu szkła w wyniku oczyszczenia masy szklanej z tlenków żelaza i świadczy o nieznacznym wzroście hydrofilowości tej powierzchni. Pokrycie szkła niskożelazowego warstwą antyrefleksyjną wpływa na zmianę właściwości powierzchniowych szkieł, co wynika z różnic wstępujących icofających kątów zwilżania. Obniżenie kątów zwilżania wskazuje na wzrost właściwości hydrofilowych powierzchni, o czym świadczy również całkowite rozpływanie się kropelek wody na powierzchni szkła LIG Ar DAG I i II. W przypadku szkła LIG Ar SU obecność warstwy antyrefleksyjnej w mniejszym stopniu wpływa na zmiany właściwości powierzchniowych szkła, ponieważ kąty zwilżania wszystkich cieczy próbnych są wyższe niż na powierzchni szkła LIG Ar DAG I i II, co oznacza, że oddziałują one słabiej z jego powierzchnią, która wykazuje nieco mniej hydrofilowy charakter. Obecność powłoki matującej z warstwą antyrefleksyjną skutkuje słabymioddziaływaniami cieczy polarnych (woda, formamid) z powierzchnią ciała stałego w stosunku do 206 Swobodna energia powierzchniowa szkieł stosowanych w rolnictwie szkieł zpowierzchniami antyrefleksyjnymi (LIG Ar DAG I i II), co widoczne jest zwyższych wartości wstępujących i cofających kątów zwilżania. Natomiast w porównaniu ze szkłem sodowo-wapniowym i sodowym widać obniżenie kątów zwilżania, a tym samym niewielki wzrost hydrofilowości tej powierzchni. W przypadku szkła matowego (LIG Ar Mat SU), którego powierzchnia pokryta była w innej firmie, zauważa się różnice wzwilżalności tej powierzchni w stosunku do szkła matowego modyfikowanego przez firmę D.A. Glass (LIG Ar Mat DAG). Wyższe wartości kątów zwilżania w stosunku do LIG Ar Mat DAG, świadczą onieco mniej hydrofilowym charakterze tej powierzchni. Powierzchnia szkła dyfuzyjnego prążkowanego z powłoką antyrefleksyjną (LIG Ar STRIPES) wykazuje podobne właściwości jak powierzchnia szkła LIG Ar Mat DAG, co widać ze zbliżonych wartości kątów zwilżania. Wartości swobodnej energii powierzchniowej obliczone z dwóch podejść Chibowskiego (CAH) ivan Ossa (LWAB) [12-16] są w większości przypadków zbliżone, co świadczy okomplementarności obu podejść. Najniższą wartość swobodnej energii powierzchniowej wykazuje szkło sodowe (RegularFloat), co jest związane znajwyższymi wartościami kątów zwilżania. Największy udział mają oddziaływania kwasowe: elektronoakceptorowe, co świadczy o nieco bardziej kwasowym charakterze tej powierzchni. Modyfikacja powierzchni szkła niskożelazowego przez obecność powłoki antyrefleksyjnej, zmatowienia powierzchni czy nacięcia prążków wpływa znacząco na zmiany oddziaływań polarnych, czyli parametru elektrono-donorowego oraz wpływa na wzrost swobodnej energii powierzchniowej. Dla wszystkich czterech szkieł (LIG Ar SU, LIG Ar Mat SU, LIG Ar Mat DAG, LIG Ar STRIPES) wielkość parametru elektrono-donorowego jest praktycznie taka sama, niemniej jednak stwierdzono jego wzrost w porównaniu do szkła niskożelazowego (LIG). Wyjątek stanowi szkło LIG Ar Mat SU, którego oddziaływania apolarne po modyfikacji powierzchni nie ulegają zmianie, na co prawdopodobnie ma wpływ stosowanie innych składników do modyfikacji powierzchni niż w firmie D.A. Glass. Najbardziej gładką powierzchnią charakteryzuje się szkło sodowo-wapniowe a najbardziej chropowatą powierzchnią charakteryzują się szkła pokryte powłokami matowymi, co obserwowane jest w różnicach wartości średniej chropowatości Ra. Modyfikacja powierzchni szkła niskożelazowego przez obecność powłoki antyrefleksyjnej i matowej powoduje wzrost chropowatości powierzchni. Wzrost chropowatości powierzchni powoduje wzrost jej hydrofilowości, dzięki temu ciecze mają łatwiejszy dostęp do polarnych miejsc aktywnych na zmodyfikowanej powierzchni szkła. 207 Grzegorz Babiarz , Konrad Terpiłowski , Lucyna Hołysz Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Sobolewska E., Frączak B., Błażewicz S., Seńko K., Lipski M., Porównanie kąta zwilżalności podstawowych materiałów protetycznych stosowanych w wykonawstwie protez ruchomych w badaniach in vitro, Protetyka Stomatologiczna., LIX, 6 (2009), s. 401-406 Marmur A., Measures of wettability of solid surfaces, The European Physical Journal, 197 (2011), s.193-198 Dutkiewicz E. T., Fizykochemia powierzchni, Wydawnictwo Naukowo Techniczne, Warszawa, (1998) http://www.attension.com/?id=1092&cid Adamczyk E., Gawor E., Gładkowski J., Spiechowicz E., ,Kliniczne implikacje gładkości powierzchni i wolnej energii powierzchniowej, materiałów używanych w wykonawstwie uzupełnień stałych, na odkładanie się i mikrobiologię płytki nad i pod dziąsłowej.Protetyka Stomatologiczna, XLV, 4(1995), s. 185-187 Adamczyk Sosińska E., Spiechowicz E., Machnikowski J., Odkładanie płytki nazębnej na podstawowych materiałach protetycznych używanych w wykonawstwie protez stałych,Protetyka Stomatologiczna., XXXVIII, 5 (1988), s. 228-238 Suliborski S., Sokołowski J., Górecka W., Zjawisko adhezji, Magazyn Stomatologiczny, 2(1998), s. 14-17 Long J., Hyder M. N., Huang R. Y. M., Chen P., Thermodynamic modeling of contact angles on rough, heterogeneous surfaces, Advances in Colloid and Interface Science, 118 (2005), s.173-190 Choi W., Tuteja A., Mabry J. M., Cohen R. E., McKinley G. H., A modified Cassie–Baxter relationship to explain contact angle hysteresis and anisotropy on non-wetting textured surfaces, Journal of Colloid and Interface Science, 339, (2009) s. 208-216 P. Velasquez, O. Skurtys, J. Enrione, F. Osorio, Evaluation of Surface Free Energy of Various Fruit Epicarps Using AcidBase and Zisman Approaches, Food Biophysics, 6 (2011), s. 349-358 Courard L ., Michel F., Martin M., The evaluation of the surface free energy of liquids and solids in concrete technology, Construction and Building Materials, 25, (2011), s. 260-266 Chibowski E., OntiverosOrtega A., PereaCarpioR., On the interpretation of contact angle hysteresis, Journal of Adhesion Science and Technology, 16, 10 (2002), s. 1367-1404 Chibowski E., Contact angle hysteresis due to a film present behind the drop, Contact Angle, Wettability and Adhesion. K.L. Mittal (Ed.), CRC Press, Boca Raton, FL,2 (2002), s. 265-288 Chibowski E., Surface free energy of a solid from contact angle hysteresis, Advances in Colloid and Interface Science, 103 (2003), s. 149-172 van OssC. J., GoodR. J., ChaudhuryM. K., The role of van der Waals forces and hydrogen bonds in “hydrophobic interactions” between biopolymers and low energy surfaces, Journal of Colloid and Interface Science 111 (1986), s. 378-390 van Oss C., Interfacial Forces in Aqueous Media, 2nd edn., Taylor & Francis, New York (2006) 208 Swobodna energia powierzchniowa szkieł stosowanych w rolnictwie Swobodna energia powierzchniowa szkieł stosowanych w rolnictwie Streszczenie Szkło jest wykorzystywane w wielu dziedzinach życia codziennego, w budownictwie, architekturze, rolnictwie czy przemyśle. Jest materiałem odpornym na działanie czynników chemicznych i atmosferycznych. W celu poprawy właściwości optycznych szkła rozwijane są technologie mające na celu zarówno trawienie, jak i pokrywanie powierzchni różnymi rodzaju warstwami. Szkło dyfuzyjnoantyrefleksyjne łączy właściwości rozpraszające i wysoką transmitancję światła, co jest najbardziej wydajnym rodzajem pokrycia szklarni i przynosi wiele korzyści. W pracy badano właściwości powierzchniowe szkieł stosowanych w rolnictwie otrzymanych z zastosowaniem zróżnicowanych technologii modyfikacji warstwy wierzchniej. Badania oparto o pomiar kątów zwilżania cieczy próbnych takich jak woda, formamid i dijodometan techniką siedzącej kropli. Na badanych powierzchniach mierzono zarówno wstępujące jak i cofające kąty zwilżania. Wartości zmierzonych katów zwilżania posłużyły do oszacowania swobodnej energii powierzchniowej. Energię oszacowano w oparciu o dwa podejścia teoretyczne: podejście kwasowo zasadowe opracowane przez van Ossa, Gooda i Chaudchurego oraz podejście oparte na histerezie kąta zwilżania opracowanego przez Chibowskiego. Ponadto z podejścia kwasowo zasadowego wyznaczono składową dyspersyjna swobodnej energii powierzchniowej oraz parametry elektronowo – donorowy i elektronowo akceptorowy. Topografia płytek szklanych zbadana została z zastosowaniem profilometrii optycznej. Szkło sodowe charakteryzuje się wzrostem hydrofobowości powierzchni w porównaniu do szkła sodowowapniowego i niskożelazowego z uwagi na wzrost wstępujących i cofających kątów zwilżania cieczy próbnych. Szkło z niską zawartością żelaza cechuje się niższymi kątami zwilżania niż szkło sodowe, co prawdopodobnie wynika ze zmiany składu szkła w wyniku oczyszczenia masy szklanej z tlenków żelaza. Pokrycie szkła niskożelazowego warstwą antyrefleksyjną wpływa na zmianę właściwości powierzchniowych szkieł, co wynika z różnic wstępujących i cofających kątów zwilżania. Obniżenie kątów zwilżania wskazuje na wzrost właściwości hydrofilowych powierzchni, o czym świadczy również całkowite rozpływanie się kropelek wody na powierzchni szkła tego typu. Obecność powłoki matującej z warstwą antyrefleksyjną skutkuje słabymi oddziaływanieami cieczy polarnych (woda, formamid) z powierzchnią ciała stałego w stosunku do szkieł z powierzchniami antyrefleksyjnymi. Wartości swobodnej energii powierzchniowej obliczone z dwóch podejść (CAH) i (LWAB) są w większości przypadków zbliżone co, świadczy o komplementarności obu podejść. Najniższą wartość swobodnej energii powierzchniowej wykazuje szkło sodowe, co jest związane z najwyższymi wartościami kątów. Największy udział mają oddziaływania kwasowe: elektrono-akceptorowe, co świadczy o nieco bardziej kwasowym charakterze tej powierzchni. Modyfikacja powierzchni szkła niskożelazowego przez obecność powłoki antyrefleksyjnej, zmatowienia powierzchni czy nacięcia prążków wpływa znacząco na zmiany oddziaływań polarnych, czyli parametru elektronodonorowego oraz wpływa na wzrost swobodnej energii powierzchniowej. Wzrost chropowatości powierzchni powoduje wzrost jej hydrofilowości, dzięki temu ciecze mają łatwiejszy dostęp do polarnych miejsc aktywnych na zmodyfikowanej powierzchni szkła. Słowa kluczowe: szkło antyrefleksyjne, kąt zwilżania, swobodna energia powierzchniowa 209 Indeks autorów Babiarz G. ........................................................................................................... 193 Barchiewicz K. .............................................................................................98, 112 Boluch I. .............................................................................................................. 130 Dyrda G. ........................................................................................................98, 168 Hołysz L. ............................................................................................................. 193 Jakubczyk K..................................................................................................98, 112 Kareńko A. ............................................................................................................ 70 Knapik A. ........................................................................................................ 28, 39 Knurek J. ............................................................................................................. 130 Kocot k. ............................................................................................................... 168 Kocot K. .............................................................................................................. 154 Kurpas M. ........................................................................................................... 130 Macheta A. ..................................................................................................7, 17, 49 Malarczyk K. ...................................................................................................... 182 Michalik M. .................................................................................................... 28, 39 Milchert E. .......................................................................................................... 182 Misiorek M. .......................................................................................................... 82 Musiał P. ............................................................................................................. 141 Nowosad K. ........................................................................................................ 141 Owsiak A. ............................................................................................................. 82 Podhorecka M. ................................................................................................ 17, 49 Słota R. ........................................................................................................112, 154 Stępień P. ............................................................................................................ 141 Sztandera M. ....................................................................................................... 112 Szymczyk A. ........................................................................................ 7, 17, 49, 59 Terpiłowski K. .................................................................................................... 193 Trawicka A. .......................................................................................................... 59 Wieczerzak E. ....................................................................................................... 59 Zakrzyk M...................................................................................................154, 168 210
