Ćwiczenie 3 - Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej

Ćwiczenie 3
Analiza działania interferencji RNA na przykładzie anty MnSOD siRNA
Zadanie 1
1. Sprawdź specyficzność zaprojektowanej sekwencji siRNA:
CGCGCAGATCATGCAGCTG, używając do tego celu narzędzia BLAST. Czy istnieje
niebezpieczeństwo wyciszenia ekspresji innego genu niż MnSOD ?
Zadanie 2
W udokumentowanym zdjęciami eksperymencie wprowadzano jednocześnie do komórek
następujące kostrukty DNA:
a. pTet-OFF – kodujący receptor tetracykliny regulujący pozytywnie ekspresję konstruktu
pSODex
b. pSODex – zawierający cDNA genu MnSOD przedzielony sekwencją IRES od sekwencji
genu EGFP
c. pSuper lub pSuper-SOD-RNAi– odpowiednio: pusty wektor do syntezy cząsteczek siRNA
lub wektor kodujący cząsteczki siRNA skierowane na MnSOD
1. W oparciu o zdjęcia pokazujące fluorescencję białka EGFP (zdjęcie dolne) oraz ilość
komórek widzialnych w jasnym polu (tj. całkowitą liczbę komórek, zdjęcie górne)
oblicz wydajność procesu wyciszania białka reporterowego techniką RNAi
a. oblicz procentowy udział komórek wykazujących sygnał EGFP w polu
widzenia mikroskopu dla eksperymentu: pTet-OFF + pSODex + pSuper
b. oblicz procentowy udział komórek wykazujących sygnał EGFP w polu
widzenia mikroskopu dla eksperymentu: pTet-OFF + pSODex + pSuper-SODRNAi
c. oblicz wydajność procesu wyciszania
Sprawozdanie:
1. Podaj symbole 3 genów, do których podana w zadaniu 1 sekwencja wykazuje
największe podobieństwo. Podaj procenty podobieństwa sekwencji.
2. Podaj wyniki obliczeń z Zadania 1:
a. procentowy udział komórek wykazujących sygnał EGFP w polu widzenia
mikroskopu dla eksperymentu: pTet-OFF + pSODex + pSuper
b. procentowy udział komórek wykazujących sygnał EGFP w polu widzenia
mikroskopu dla eksperymentu: pTet-OFF + pSODex + pSuper-SOD-RNAi
c. wydajność procesu wyciszania w wartościach procentowych
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej
Metody terapii genowej