Historia Zakładu Immunogenetyki Zwierząt
advertisement
Historia Zakładu Immunogenetyki Zwierząt Instytutu Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN Z inicjatywy prof. dr Mieczysława Czaji – pierwszego kierownika Zakładu Hodowli Doświadczalnej Zwierząt (ZHDZ) PAN – powołana została w 1955 roku Pracownia Grup Krwi Zwierząt, z której wywodzi się obecny Zakład Immunogenetyki Zwierząt. Intencją zainicjowania podjętych badań była nie tylko ich wartość poznawcza, lecz, co godne podkreślenia, presja praktyki, która potrzebowała obiektywnego, biologicznego wskaźnika, pomocnego w pracy hodowlanej. Ciężar zorganizowania od podstaw warsztatu pracy oraz wyboru odpowiedniej kadry powierzono prof. dr Antoniemu Spryszakowi. Ze względu na pogarszający się stan Jego zdrowia obowiązki te wkrótce przejął Maciej Żurkowski, późniejszy wieloletni kierownik Pracowni/Zakładu i Dyrektor Instytutu Genetyki i Hodowli Zwierzat (IGiHZ) PAN w Jastrzębcu. Rozpoczęto badania nad grupami krwi bydła, koni, świń, dzików i drobiu, a także analizy porównawcze podobieństw serologicznych czynników antygenowych erytrocytów bydła i żubrów. Pierwsza praca o charakterze eksperymentalnym z zakresu badań grup krwi zwierząt, autorstwa prof. Spryszaka, ukazała się w 1955 roku, a w latach 1959-1964 rezultatem badań grup krwi zwierząt prowadzonych w ZHDZ były cztery rozprawy doktorskie (Alfreda Wróblewskiego, Jolanty Gasparskiej, Macieja Żurkowskiego i Janusza Gasparskiego), które można określić mianem pionierskich w skali kraju. Badawczy entuzjazm, aktywność popularyzatorska, a wkrótce wymierny dorobek kadry naukowej Pracowni Grup Krwi Zwierząt, znacznie przyczyniły się do rozwoju tej problematyki w Polsce. W różnych krajowych ośrodkach zaczęły powstawać pracownie grup krwi, a przyjazne współzawodnictwo między immunogenetykami zaowocowało znaczącym rozwojem badań. W roku 1969 ZHDZ PAN przekształcono w Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt (IGiHZ) PAN, a szybko rozwijająca się Pracownia Grup Krwi Zwierząt uzyskała status Zakładu Immunogenetyki Zwierząt. Od samego początku badania miały ukierunkowany, aplikacyjny charakter. Zastosowane wówczas procedury optymalnego dobierania par dawca-biorca do celowych alloimmunizacji oraz techniki uzyskiwania i obróbki immunosurowic biorców zachowują aktualność do dnia dzisiejszego. Opanowanie tych procedur umożliwiło uzyskanie dużego zestawu monospecyficznych reagentów identyfikujących odpowiednie czynniki antygenowe erytrocytów. Rozwojowi badań sprzyjało utrzymywanie roboczych kontaktów z renomowanymi placówkami zagranicznymi, m.in. z laboratorium grup krwi zwierząt w Wageningen (Holandia), gdzie na długoterminowym stażu naukowym przebywał Maciej Żurkowski, który kierował Zakładem do roku 1997. Funkcję tę powierzono następnie Jolancie Kurył. Istotnym elementem determinującym późniejszy rozwój i kształt krajowych badań z dziedziny immunogenetyki zwierząt był fakt, że ZHDZ PAN (późniejszy IGiHZ PAN) był jednym z pierwszych członków instytucjonalnych międzynarodowego Towarzystwa Badań Grup Krwi Zwierząt (International Society for Animal Blood Group Research – ISABR). Fakt przynależności do Towarzystwa sprzyjał uczestnictwu m.in. w międzynarodowych testach porównawczych, których celem była weryfikacja na losowej próbie erytrocytów bydła różnych ras specyficzności uzyskiwanych immunoreagentów i ocena skuteczności stosowanych metod analitycznych. Współpraca i międzynarodowe robocze kontakty znalazły wyraz m.in. w zorganizowaniu w roku 1968 w Warszawie konferencji ISABR oraz organizacji w latach 1968 i 1979 w Polsce międzynarodowych testów porównawczych dla bydła i koni. Dzięki instytucjonalnemu uczestnictwu ZHDZ i później IGiHZ PAN w międzynarodowej wymianie naukowej, wielu pracowników Zakładu zostało później indywidualnymi członkami ISABR. Sprzyjało to rozszerzaniu formuły i obszaru ich zainteresowań badawczych, które również w Polsce stawały się coraz bardziej interdyscyplinarne. W całej biologii, a zwłaszcza w genetyce, zaczęły w coraz większym stopniu decydować techniki genetyki molekularnej. Ilustracją nowych wyzwań, które na początku lat 80-tych pojawiły się w genetyce cech jakościowych był m.in. fakt nadania ISABR szerszej formuły i jego przekształcenie w roku 1988 w Międzynarodowe Stowarzyszenie Genetyków Zwierząt (International Society for Animal Genetics – ISAG). W podobny sposób ewoluowała problematyka badawcza Zakładu. Na przełomie lat 1960/1961 wykonano pierwsze w Polsce ekspertyzy dotyczące wiarygodności danych rodowodowych bydła. Narastająca potrzeba rozwijania badań identyfikacyjnych miała związek z szerokim wprowadzaniem do hodowli bydła metody sztucznego unasieniania. Ta nowa wówczas biotechnika rozrodu umożliwiała osiąganie szybszego postępu hodowlanego, lecz 1 równocześnie sprzyjała powstawaniu pomyłek w zapisach dokumentacji hodowlanej. Jednym z obiektywnych czynników sprzyjających powstawaniu pomyłek jest występowanie rui u krów cielnych. Nie dysponowano wówczas metodą umożliwiającą ujawnianie takich przypadków. Brak dostatecznej wiedzy sprawiał, że wystąpienie rui u unasienionej krowy tłumaczono złą jakością zastosowanego nasienia i do ponownego zabiegu wykorzystywano nasienie innego reproduktora, któremu ostatecznie przypisywano ojcostwo urodzonego cielęcia. Pionierskie w kraju obserwacje na temat występowania i ujawnienia, poprzez badania grup krwi, przypadków występowania rui u krów cielnych, były przedmiotem rozprawy habilitacyjnej Macieja Żurkowskiego. Wykonywane w Zakładzie prace genetyczno-identyfikacyjne bydła oparte na serologii grupowej krwi i ich duża skuteczność w weryfikowaniu rzetelności zapisów rodowodowych (co było i jest niezwykle istotne m.in. dla prawidłowej wyceny wartości hodowlanej buhajów na podstawie oceny użytkowości potomstwa), znacznie wyprzedziły i w dużym stopniu stymulowały wejście w życie aktów normatywnych dotyczących kontroli pochodzenia męskiego materiału reprodukcyjnego, a także powołanie w roku 1969 krajowego systemu badania grup krwi zwierząt. System ten placówka w Jastrzębcu wspomagała swymi badaniami do początku lat 70-tych. Za całokształt badań określonych jako „Immunogenetyczna i biochemiczna identyfikacja antygenów krwinkowych i grup krwi u bydła”, ich realizatorzy otrzymali w roku 1971 nagrodę Sekretarza Naukowego PAN. Uzyskanie dużego zestawu immunoreagentów grupowych krwi, których monospecyficzność została zweryfikowana w testach międzynarodowych, umożliwiło podjęcie prac dotyczących charakterystyki struktury genetycznej populacji i rejestrowanie zmian związanych z procesem doskonalenia bydła. Był to nowy nurt badań, w których wykorzystano obiektywnie wykrywalne markery o dobrze zweryfikowanym modelu dziedziczenia. Wyniki badań dotyczące tej problematyki były przedmiotem rozpraw doktorskich Grzegorza Grzybowskiego i Wiesławy Michalak. Na metodologii wykorzystującej międzyosobnicze i międzyrasowe zróżnicowanie grup krwi, oparto później w kraju szereg rozpraw doktorskich i habilitacyjnych, w których potwierdzono przydatność analizy tych cech w szacowaniu skali zmian genetycznych w populacji spowodowanych selekcją. Wiedzę na temat genetycznych podstaw determinacji grup krwi oraz praktyczne doświadczenia w zakresie immunoserologicznych technik obiektywnej identyfikacji erytrocytarnych czynników antygenowych, wykorzystano w późniejszych badaniach Zakładu nad głównym kompleksem zgodności tkankowej – MHC – świń i bydła (kmpleksy SLA i BoLA). Uwzględnianie w pracach nad MHC elementów wiedzy z dziedziny immunoserologii grup krwi było konieczne ze względu na sprzężenie loci układów grupowych krwi świń J i C z SLA (wykazano później, że są one umiejscowione w autosomie 7), z racji faktu, że normalne przeciwciała występujące w surowicy krwi niektórych osobników identyfikujące antygen grupowy A są cytotoksyczne dla limfocytów, a także w świetle stwierdzenia, że loci układów grupowych krwi N i E stanowią u świń tzw. minor histocompatibility systems. Wkrótce okazało się, że także bydlęcy BoLA i locus układu grupowego krwi M są ze sobą sprzężone, a między niektórymi antygenami transplantacyjnymi BoLA i czynnikami grupowymi krwi (np. między antygenem BoLA-w16 i grupą krwi M’) zachodzi ścisła serologiczna współzależność. Poprzez alloimmunostymulacje z wykorzystaniem bydlęcych przeszczepów skórnych uzyskano w Zakładzie wiele reagentów o aktywności anty-BoLA-w16, które obok silnego działania limfocytotoksycznego, wykazywały wysoką aktywność hemolityczną anty- M’. Reagenty te wykorzystano w testowaniach grup krwi bydła w Polsce (Instytut Zootechniki), a także w laboratoriach we Francji, Niemczech, Czechach i na Słowacji. Niezależnie od badań MHC, wiedzę dotyczącą grup krwi i sposobów ich identyfikacji wykorzystano w późniejszych pracach Zakładu nad grupą sprzężonych loci powiązanych z podatnością stresową i jakością mięsa u świń (grupa ta obejmuje m.in. loci układów grupowych krwi A i H). W drugiej połowie lat 60-tych. podjęto badania biochemicznego polimorfizmu białek krwi różnych gatunków zwierząt gospodarskich i dzikich. Badania te nie miały w Polsce żadnej tradycji. Wyniki pierwszych prac opublikowano w roku 1966, a rok później Krystyna TomaszewskaGuszkiewicz przedstawiła rozprawę doktorską na temat występowania podfrakcji beta-globulin w surowicy krwi bydła różnych ras. Był to istotny moment w rozwoju krajowych badań biochemicznego polimorfizmu białek z wykorzystaniem technik elektroforetycznych. W krótkim czasie opanowano tę nową wówczas metodę, adaptując techniki separacji białek krwi do potrzeb analiz wariantów elektroforetycznych (genetycznych) występujących u bydła, świń, koni i kur. Scharakteryzowano rasy 2 hodowane w Polsce pod kątem widzenia częstości występowania wariantów w poszczególnych układach polimorficznych, identyfikując przy tym allele nie opisane wcześniej w literaturze światowej. Przeprowadzono m.in. szerokie badania polimorfizmu białek krwi dzików z populacji poznańskiej i mazurskiej, identyfikując w układzie transferyn surowicy krwi allel TFP, który wcześniej został wykryty jedynie u mieszańców świni domowej z dzikiem na terenie Austrii. Przebadano również polimorfizm białek krwi u koników polskich, utrzymywanych w warunkach rezerwatowych i stajennych w Zakładzie Doświadczalnym w Popielnie (obecnie Stacja Badawcza Rolnictwa Ekologicznego i Hodowli Zachowawczej Zwierząt PAN) oraz w warunkach stajennych w Państwowej Stadninie Koni w Racocie. Zidentyfikowano warianty elektroforetyczne białek nie występujące u innych ras koni, co może świadczyć o genetycznej unikalności populacji koników polskich. W latach 1969-1982, pionierskie w kraju analizy prowadziła także Pracownia Immunogenetyki Drobiu, kierowana przez Jolantę Gasparską. Pracownia pozostawała w strukturze organizacyjnej Zakładu Immunogenetyki Zwierząt, lecz z uwagi na specyfikę obiektu badawczego dysponowała wyodrębnionym zespołem. Po zagranicznym stażu Jolanty Gasparskiej w USA, Pracownia jako jedna z pierwszych na świecie rozpoczęła badania nad grupami krwi kur. Po kilku latach żmudnych eksperymentów badań tych jednak zaniechano, koncentrując wysiłek na analizach polimorfizmu białek. Decyzję tę można obecnie rozważać jedynie w kategoriach niewykorzystanych szans zainicjowania w Polsce nowego nurtu interdyscyplinarnych badań genetycznych, fizjologicznych i medycznych. W tamtym czasie nie dostrzegano jeszcze szerszego kontekstu i dużych walorów poznawczych związanych z immunoserologią grupową krwi, a rozwijanie tych badań wyłącznie pod kątem widzenia zastosowania w kontroli pochodzenia kur, nie miało praktycznego uzasadnienia. Wkrótce okazało się, że najbardziej złożony układ grupowy krwi B, którego badania stawiały przez zespołem Pracowni gąszcz trudnych do rozwiązania problemów analitycznych, to kurzy kompleks zgodności tkankowej (MHC). Gallus gallus domesticus jest obecnie jednym z gatunków o podstawowym znaczeniu w biologii eksperymentalnej. Placówki, które mimo trudności kontynuowały badania związane z immunoserologią grupową krwi kur, stały się później światowymi pionierami nowego nurtu badań ukierunkowanych na rozpoznawanie genetycznych podstaw tzw. względnego ryzyka występowania chorób (zwłaszcza patologii na tle immunologicznym) u ludzi i zwierząt. Fundamentalnym odkryciem na tym polu było m.in. udokumentowanie niezwykle silnego związku między występowaniem antygenu grupowego krwi B27, a podatnością kur na wirus choroby Mareka. Jastrzębiecki zespół dysponował własną fermą kur, co pozwalało na programowanie celowych kojarzeń pod kątem potrzeb analiz polimorfizmu białek i dokonywanie obserwacji zmian fizjologicznych zachodzących w poszczególnych cyklach nieśności kur. W badaniach tych wykazano, że elektroforetyczny profil białek oraz aktywność niektórych enzymów obecnych w surowicy krwi zmieniają się nie tylko w związku z osiągnięciem dojrzałości płciowej i rozpoczęciem znoszenia jaj. Także sam proces formowania jaja, zwłaszcza skorupy, wpływa zarówno na obraz białek jak i na aktywność enzymów. Nadto stwierdzono, że aktywność niektórych enzymów w przewodzie jajowym, w wątrobie, nerce i szpiku kostnym zmienia się w zależności od stanu fizjologicznego kury oraz w zależności od stadium formującego się jaja Zidentyfikowano nowe warianty białek krwi i treści jaja kur, a informacje na ten temat znalazły się w międzynarodowej bazie danych, opracowanej przez badaczy kanadyjskich. Za „Badania polimorfizmu białek osocza kur”, ich realizatorzy uzyskali w roku 1972 nagrodę Sekretarza Naukowego PAN. Wyniki badań z zakresu polimorfizmu białek krwi u różnych gatunków zwierząt były w przedmiotem ośmiu rozpraw doktorskich pracowników Zakładu: Elżbiety Składanowskiej, Anny Madeyskiej-Lewandowskiej, Danuty Kierek-Jaszczuk, Jolanty Kurył, Zenona Jastrzębskiego, Stanisława Didkowskiego, Piotra Rybińskiego i Tadeusza Reklewskiego. Problematyka ta była także w latach 1971-1986 przedmiotem trzech rozpraw habilitacyjnych: Jolanty Gasparskiej, Krystyny Tomaszewskiej-Guszkiewicz i Jolanty Kurył. Na początku lat 80-tych istotnie zmodyfikowano w Zakładzie techniki elektroforetycznej analizy polimorfizmu białek. Zamiast hydrolizatu skrobi, jako podstawowe media rozdzielcze wprowadzono poliakryloamid i agarozę. Stworzyło to możliwość identyfikacji nie tylko nowych wariantów białek krwi, ale również opisanie nowych systemów polimorficznych. Wprowadzenie bardziej efektywnych procedur eksperymentalnych było istotne także dlatego, że zaczęto w tym czasie przeprowadzać osobnicze badania identyfikacyjne, będące podstawą do weryfikacji rodowodów koni arabskich czystej krwi, a więc materiału szczególnie istotnego dla polskiego eksportu. Wkrótce badania te 3 rozszerzono, obejmując nimi krajowe pogłowie koni pełnej krwi angielskiej. Taka formuła badań jest aktualna także w chwili obecnej, a wystawiane przez Zakład certyfikaty, które potwierdzają prawidłowość informacji zawartych w rodowodzie, są podstawą wpisu koni do Ksiąg Stadnych. Za „Opracowanie zasad prowadzenia kontroli pochodzenia koni w oparciu o badania grup krwi i genetycznego polimorfizmu białek”, realizatorzy tej problematyki uzyskali w roku 1989 Nagrodę II stopnia Ministra Rolnictwa i Gospodarki Żywnościowej. W tym samym okresie zainicjowano w Zakładzie następujące nowe kierunki badań, które w następnych latach podjęto także w innych polskich placówkach. – badania genetycznej i serologicznej organizacji głównego kompleksu zgodności tkankowej MHC u świń (układ SLA), bydła (układ BoLA) i owiec (układ OLA), a także wpływ kompleksu MHC na reprodukcję; – badania grupy sprzężonych loci chromosomu 6 u świń, obejmujących podatność stresową oraz związanych z wydajnością rzeźną i z syndromem obniżonej jakości mięsa wieprzowego (PSE). W badaniach MHC, które początkowo prowadzono we współpracy z naukowcami z Francji, zastosowano niestosowane jeszcze wówczas w kraju metodyki izolacji i standaryzacji różnych elementów morfotycznych krwi, immunostymulacji poprzez przeszczepy skórne, procedury nowych testów limfocytotoksycznych i metody wykrywania naturalnych immunizacji ciążowych u samic zwierząt gospodarskich. Wyniki badań nad MHC świń (kompleks SLA), były w roku 1984 przedmiotem rozprawy habilitacyjnej Grzegorza Grzybowskiego. Przedstawiono w niej nowe informacje o cechach somatycznych występujących u gatunku Sus scrofa. Zidentyfikowano nowy czynnik zgodności tkankowej klasy I, który oznaczono jako SLA 26. Stwierdzono, że jest on pierwszym markerem nieznanego haplotypu, który grupuje loci świńskiego MHC i wykazuje ścisłą serologiczną współzależność z antygenami transplantacyjnymi SLA12 i SLA6. Wykazano, że cytotoksyczne przeciwciała identyfikujące produkty MHC klasy I u świń mogą utrzymywać się w surowicy krwi biorców przez co najmniej 4 miesiące przy zachowaniu miana umożliwiającego opracowanie silnie działających reagentów. Uzyskano także przeciwciała identyfikujące produkty nieznanego układu alloantygenowego świń. Techniki z zakresu wykrywania antygenów transplantacyjnych SLA zaadaptowano następnie do badań bydlęcego kompleksu zgodności tkankowej BoLA. W badaniach realizowanych w ramach grantu KBN, zidentyfikowano i zmapowano na chromosomie 23 nowy locus genomu bydła domowego oznaczony jako JACSAL (JA=Jastrzębiec, C=cattle, S=serum, A=allotype, L=locus). We współpracy z naukowcami z Instytutu Zootechniki wykazano, że JACSAL kontroluje allotypy BA6+ i BA6- występujące we frakcji α-globulin surowicy krwi bydła. Ponadto stwierdzono, że allele BA6+ i BA6-, oraz alele BoLA pozostają w stanie silnego sprzężenia niezrównoważonego (linkage disequilibrium), co może być wynikiem presji selekcji naturalnej. Po alloprzeszczepach skórnych u bydła uzyskano monospecyficzne reagenty grupowe krwi: anty-S1, anty-A2 i anty-M’ Były to na świecie pierwsze przypadki tego rodzaju i zarazem bezpośredni, eksperymentalny dowód, że loci grup krwi bydła A i S mają charakter tzw. minor histocompatibility systems, gdyż czynniki grupowe z tych układów zaangażowane są w reakcje immunologiczne występujące przy allotransplantacjach. Wykazano, że u ciężarnych krów występować mogą silne immunizacje płodowymi antygenami transplantacyjnymi, co może być istotne w rozrodzie prowadzonym metodą MOET (multiple ovulation and embryo transfer). W rozrodzie bydła prowadzonym tą metodą, między cielną krową a genetycznie obcym cielęciem zachodzi sytuacja somatycznego niedopasowania nie pod względem jednego, lecz obu haplotypów BoLA, a wygenerowane przeciwciała mogą się utrzymywać w surowicy biorczyń zarodków nawet przez kilka lat. Opisano zjawiska nieznane w reprodukcji bydła, mające charakter konfliktu serologicznego. Konflikt może występować wtedy, gdy w immunostymulacji cielnej krowy zaangażowany jest antygen transplantacyjny obecny u płodu, wykazujący pokrewieństwo z substancją grupową występującą na erytrocytach. Takimi cechami charakteryzuje się antygen transplantacyjny BoLA-w16 i grupa krwi M’. W badaniach związanych z immunologią reprodukcji wykazano, że po powtarzanych stymulacjach hormonalnych z użyciem pFSH dla wywołania superowulacji u krów i owiec, wzbudzana jest odpowiedź immunologiczna anty-pFSH, co może prowadzić do obniżenia skuteczności superowulacji w następnych cyklach. Wyniki badań w problemie „Genetyczna i serologiczna organizacja głównego kompleksu zgodności tkankowej (BoLA) u bydła oraz odpowiedź 4 immunologiczna na skutek niedopasowania w antygenach transplantacyjnych”, zostały wyróżnione nagrodą Sekretarza Naukowego PAN. Programując w roku 1980 długofalowy rozwój badań nad genomem świń założono, że „najbardziej perspektywiczne będą zapewne badania nad formą przejawiania się stanów fizjologicznych lub chorobowych, w stosunku do których można by udowodnić bezpośredni lub pośredni związek genów lub genotypów determinujących polimorfizm białek”. Przykładem tego typu związków mogą być pierwsze informacje o ścisłej współzależności między wrażliwością świń na tzw. stres halotanowy (syndrom malignant hyperhermia) a genotypami w loci PHI i 6-PGD. Problematykę tę wprowadzono w roku 1986 do badań statutowych IGiHZ PAN jako temat “Zależność między locus wrażliwości halotanowej u świń a cechami użytkowymi”. Uzyskane wyniki przyniosły istotne informacje z zakresu wspomnianego przejawiania się stanów fizjologicznych/chorobowych oraz możliwości ich monitorowania poprzez analizy grup krwi oraz obserwacje segregacji alleli z uładów polimorficznych białek. Wyniki tych badań zostały uhonorowane w roku 1990 Nagrodą Zespołową Polskiej Akademii Nauk i dały początek badaniom mającym na celu poszukiwanie innych loci o znaczącym udziale w determinowaniu cech istotnych gospodarczo (QTL – quantitative trait loci), genów głównych itp. Problematyka ta rozwinęła się w Polsce i na świecie w szeroki nurt badań nad genomem świń. Podjęcie przez Zakład zagadnień dotyczących locus wrażliwości halotanowej i jego związku z cechami użytkowymi miało ścisły związek z ówczesną sytuacją w hodowli świń, zwłaszcza w krajach Europy Zachodniej. W związku z ukierunkowaniem hodowli trzody chlewnej na zwiększanie mięsności tuszy, pojawiła się, najpierw w ograniczonym stopniu, a później w wymiarze znaczącym ekonomicznie, wada genetyczna znana pod nazwą PSS (porcine stress syndrome – świński syndrom stresowy) lub MHS (malignant hyperthermia syndrome – syndrom gorączki złośliwej). Wobec faktu, że u niektórych osobników można było wywołać gorączkę złośliwą poddając je narkozie wziewnej z użyciem halotanu, przyjęto roboczą nazwę syndromu „wrażliwość halotanowa”, a locus kontolujący ten stan nazwano HAL (obecnie wiadomo, że gorączkę złośliwą kontroluje locus RYR1 – receptor ryanodiny). Zwierzęta wrażliwe na halotan wykazywały po uboju mięso blade, miękkie i wodniste, określane mianem PSE (pale, soft, exudative). W Polsce problem ten ujawnił się wraz z wprowadzeniem do programów hodowlanych świń rasy landrace, najpierw linii belgijskiej, a następnie niemieckiej, co spowodowało, zwłaszcza u świń rasy landrace, stały wzrost udziału mięsa o cechach PSE. Dwa pierwsze w Polsce opracowania genetyczne dotyczące grupy sprzężeniowej wrażliwości na halotan u świń, wykonano w Zakładzie we współpracy z Instytutem Fizjologii i Genetyki Zwierząt Czeskiej Akademii Nauk w Libechov, gdzie nieco wcześniej podjęto tę problematykę, a wyniki zaprezentowano w roku 1986 na zjeździe Polskiego Towarzystwa Genetycznego w Gdańsku. Praca: „Dowody genetyczne uszeregowania markerów grupy sprzężeniowej wrażliwości na halotan u świń” została na zjeździe wyróżniona. Loci grupy sprzężeniowej uszeregowano wówczas w porządku (licząc od centromeru w prawo): S-Phi-HAL-HPo2-Pgd, co w generaliach zachowuje aktualność do dnia dzisiejszego. Uszeregowanie loci dało początek tzw. haplotypowaniu, które umożliwiało odróżnianie już we wczesnym okresie chowu osobników genetycznie wrażliwych na czynniki stresowe (homozygot recesywnych). W ten sposób przeprowadzanie kojarzeń testowych w zakresie ujawniania się wrażliwości halotanowej stawało się zbędne, a pojawiła się możliwość prowadzenia selekcji pośredniej w odniesieniu do wrażliwości stresowej i związanego z tym syndromu obniżonej jakości mięsa PSE. Rozpoznanie skali problemu wrażliwości halotanowej w polskiej hodowli świń landrace było przedmiotem rozprawy doktorskiej Tomasza Wróblewskiego. Badania dotyczące tej problematyki są w Zakładzie kontynuowane i koncentrują się obecnie na identyfikacji metodami molekularnymi nosicieli zmutowanego genu u knurów w stadach zarodowych. Na początku lat 90-tych podstawowymi narzędziami badań w Zakładzie stały się techniki molekularne Przestawianiu warsztatu pracy na badania polimorfizmu DNA sprzyjał fakt współpracy z krajowymi placówkami medycznymi, w których badania polimorfizmu DNA były już zaawansowane, a także przeszkolenie pracowników w renomowanych laboratoriach za granicą. Umożliwiło to jednoczesne zainicjowanie badań polimorfizmu DNA u bydła, świń i koni. W światowej hodowli bydła zwrócono w tym czasie uwagę na fakt, że ostrej selekcji na cechy użytkowe towarzyszyć może niezamierzone rozpowszechnianie mutacji, które wpływają ujemnie na zdrowie i zdolność zwierząt do rozrodu. Z zakresu tej problematyki realizowano w Zakładzie dwa projekty badawcze finansowane przez KBN. Kategoria zmian czynnościowych wywołanych zmianami w sekwencji DNA określana 5 jest mianem „defektów” (chorób) genetycznych. Niezależnie od możliwości wystąpienia silnego związku danego defektu z priorytetem selekcji hodowlanej, gromadzeniu zmian DNA w puli genów populacji sprzyja ich z zasady recesywny charakter, a więc nieujawnianie się biologicznych skutków defektu w genotypach heterozygotycznych. Takie mutacje trwają w populacji w formie nosicielstwa, a fakt, że zwierzę ma w genomie jakiś defekt, jest w praktyce trudny lub wręcz niemożliwy do wykrycia. W światowej hodowli mlecznego bydła hf szczególnie istotną gospodarczo stała się mutacja punktowa A/G w genie CD18 (oznaczana jako D128G). Normalny allel tego genu oznaczany jest jako TL, a zmutowana forma jako allel BL. Mutacja D128G odpowiedzialna jest za występowanie wrodzonego niedoboru leukocytarnych cząsteczek adhezyjnych (bovine leukocyte adhesion deficiency – BLAD). U homozygot recesywnych (genotyp BL/BL), leukocytarne receptory Leu-Cam niezbędne w procesie zwalczania infekcji zatracają swą biologiczną funkcję, a normalnie działający nadzór immunologiczny w organizmie zostaje pozbawiony istotnego mechanizmu efektorowego. Takie zwierzęta padają lub są eliminowane z hodowli we wczesnym okresie odchowu. Natomiast nosiciele zmutowanego genu (genotyp TL/BL) nie odbiegają w sprawności immunologicznej od zwierząt normalnych, a w zakresie użytkowości mlecznej nawet je przewyższają. Wyeliminowanie allelu BL z populacji przy wykorzystaniu konwencjonalnych metod selekcji nie jest więc możliwe. Stwierdzono, że krowy-nosicielki wyprodukowały o 218 kg mleka oraz 7,3 kg więcej białka niż ich półsiostry o genotypie normalnym. Wyniki te wskazują, że allel BL wiąże się w jakiś sposób ze zwiększoną produkcyjnością krów. Występowanie i znaczenie mutacji D128G w polskiej hodowli bydła było przedmiotem rozprawy doktorskiej Krzysztofa Lubienieckiego. W polskiej populacji bydła cb występują trzy główne linie obciążone mutacją D128G, wywodzące się od buhajów holsztyńskofryzyjskich. Wykazano, że około 50% buhajów rasy hf importowanych do Polski do 1992 r. znajdowało się w tzw. grupie ryzyka BLAD. Dla potrzeb monitorowania allelu BL w puli genowej polskiej populacji bydła opracowano procedury dwóch testów PCR-RFLP oraz procedurę automatycznej analizy sekwencji genu CD18 w rejonie występowania mutacji D128G. Zidentyfikowano pełną sekwencję DNA w eksonie 5 genu CD18 u bydła, tzn. w rejonie asocjacji podjednostek w receptorach Leu-Cam, gdzie występuje mutacja D128G. Informacje na ten temat weszły do światowej bazy danych GenBank. Od 1995 roku badania z zakresu monitorowania mutacji BLAD w puli genowej bydła są uwzględniane w krajowym programie hodowlanym, a od 1999 diagnostyka tej mutacji jest także obowiązkowym elementem polskiego nadzoru weterynaryjnego. W bezpośrednim związku z występowaniem syndromu BLAD pozostaje wada genetyczna bydła określana mianem CVM (complex vertebral malformation – zespół zniekształceń kręgosłupa), zidentyfikowana w roku 2000 u bydła hf w Danii. CVM jest jednogenową, autosomalną wadą recesywną przenoszoną przez nosicieli (gen normalny oznacza się umownie jako TV, a jego zmutowaną postać jako allel CV). Około 80% homozygotycznych genotypów CV/CV podlega eliminacji już we wczesnym stadium rozwoju prenatalnego. W badaniach Zakładu wyodrębniono grupę potencjalnych nosicieli CVM oraz określono stopień zagrożenia tym defektem polskiej hodowli bydła cb. Wykazano, że w polskim rejestrze buhajów reprodukcyjnych występuje około 300 wnuków światowego protoplasty CVM. Stwierdzono także, że genom głównego światowego protoplasty CVM jest obciążony także mutacją D128G (allelem BL), co wskazuje na ścisły związek między występowaniem obu syndromów. Ponieważ jednak allel CV oraz allel BL segregują niezależnie, prowadzenie selekcji negatywnej na allel BL, co ma miejsce także w Polsce, nie eliminuje z puli genowej populacji allelu CV. Rezultatem prac Zakładu nad mutacjami genomu bydła istotnymi gospodarczo jest także molekularna procedura PCR-RFLP przystosowana do badań rutynowych, umożliwiająca monitorowanie w genomie bydła mutacji DUMPS (niedobór syntazy urydynomonofosforanowej – deficiency of uridine monophosphate syntase) wpływającej na obumieranie zarodków w okresie ich implantacji w macicy. Opracowano także procedurę automatycznego sekwencjonowania genu UMPS, która może być wykorzystana w różnicowej analizie etiologii zaburzeń niepłodności u krów. Jak już wspomniano, genetyczna podatność świń na stres (tzw. wrażliwość halotanowa), objawiająca się po uboju występowaniem mięsa o cechach PSE wystąpiła również w hodowli polskiej, zwłaszcza u świń rasy landrace. Zakład dysponuje obecnie skutecznym testem molekularnym, umożliwiającym zidentyfikowanie nosicieli zmutowanego genu. Test wykorzystuje się obecnie w programie oceny męskiego materiału hodowlanego, co umożliwia jego odpowiednią selekcję. 6 Od 10 lat realizowane są w Zakładzie badania zmierzające do identyfikacji innych genów, których udział w kształtowaniu tuszy świń jest znaczący. W tym obszarze we współpracy z Instytutem Zootechniki, AR w Poznaniu i AT-R w Bydgoszczy realizowano dwa projekty finansowane przez KBN. Dla potrzeb prowadzenia badań, utworzono rodzinę referencyjną z wykorzystaniem loch rasy wbp i knurów rodzimej rasy złotnickiej pstrej (złp). Obok tzw. klasycznych markerów genetycznych, a więc grup krwi i polimorficznych białek krwi (określnych mianem markerów klasy I) wprowadzono do analiz mikrosatelitarne sekwencje DNA (zwane markerami klasy II). W analizach molekularnostatystycznych, jakimi objęto także wyniki kontroli użytkowości rzeźnej materiału ze wspomnianej rodziny referencyjnej, zidentyfikowano u świń rejon chromsomu 12, który prawdopodonie zawiera gen lub geny istotnie wpływające na zawartość sadła w tuszy. Ponadto wytypowano kilka innych rejonów genomu, w których – jak się wydaje – mogą być umiejscowione geny wpływające na grubość słoniny i zawartość mięsa w poszczególnych wyrębach. Na uwagę zasługuje tu m.in. wykazanie, że z punktu widzenia zawartości mięsa w szynce niektóre warianty (allele) analizowanych genów występujące u świń rasy złp są korzystniejsze niż występujące w rasie wbp. Wynik ten należy uznać za wysoce zaskakujący, gdyż świnia złotnicka pstra jest powszechnie uważana jest za rasę o gorszych parametrach pod względem mięsności niż rasa wbp. Wyniki badań nad poszukiwaniem w genomie świń rejonów występowania genu lub genów wpływających na parametry jakości tuszy były przedmiotem rozpraw doktorskich Iwony Cymerowskiej-Prokopczyk, Agnieszki Kossakowskiej i Mariusza Pierzchały. Za badania „Mapowanie genów wpływających na jakość tuszy świń”, ich realizatorzy uzyskali w roku 1999 Nagrodę Zespołową Wydziału Nauk Rolniczych, Leśnych i Weterynaryjnych PAN. Pracownicy Zakładu kontynuowali te prace uczestnicząc w projekcie finansowanym przez UE, koordynowanym przez prof. H. Geldermanna z Uniwersytetu Hohenheim w Stuttgarcie (Niemcy). W chromosomach 15, 16 i 17 zlokalizowali loci cech ilościowych (QTL) istotnie wpływające na wartość niektórych cech jakości tuszy i mięsa świń. Wyniki te, wraz z rezultatami uzyskanymi przez innych realizatorów projektu, opublikowano w roku 2003 w numerze specjalnym Journal of Animal Breeding and Genetics. W drugiej połowie lat 90-tych omawiane badania przybrały w Zakładzie formę analiz polimorfizmu wybranych genów (tzw. genów kandydujących), istotnych dla jakości tuszy oraz reprodukcji. Badania te podjęto we współpracy z Instytutem Zootechniki oraz Katedrą Hodowli Trzody Chlewnej AT-R w Bydgoszczy, w ramach trzech projektów finansowanych przez KBN. Natomiast równolegle zainicjowane badania polimorfizmu genów kandydujących w odniesieniu do jakości mięsa, realizowane są we współpracy z Katedrą Hodowli Trzody Chlewnej i Jakości Mięsa Akademii Podlaskiej w Siedlcach. Problematyka dotycząca analizy polimorfizmu genów z rodziny MyoD i jego wpływu na cechy jakości tuszy była przedmiotem rozprawy doktorskiej Danuty Cieślak. Szersze opracowania tych zagadnień są obecnie przygotowywane w formie rozpraw habilitacyjnych Agnieszki Kossakowskiej (geny kandydujące w reprodukcji świń ) i Mariusza Pierzchały (polimorfizm genów czynników wzrostowych i ich receptorów oraz genu czynnika transkrypcyjnego Pit1 i jego oddziaływanie na tempo wzrostu i cechy mięsności tuszy świń). W najnowszych badaniach nad genomem świń zwraca uwagę fakt zidentyfikowania nowych mutacji SNPs (single nucleotide polymorphism) w genach z rodziny MyoD. Ponadto zsekwencjonowano gen MYF6 należący do tej rodziny, którego struktura nie była dotychczas poznana. Nowe SNP, jak i opracowaną sekwencję genu MYF6 przyjęto do międzynarodowej bazy danych GenBank. Wykazano istotne zależności między występowaniem niektórych wykrytych mutacji genów z rodziny MyoD a tempem przyrostu masy ciała i zawartością mięsa w tuszy świń. Badania te zostały wykonane w ramach grantu zamawianego finansowanego przez KBN, jako jeden z 11 podtematów realizowanych w pięciu placówkach naukowych w Polsce, a ich wyniki były przedmiotem rozpraw doktorskich Joanny Wyszyńskiej-Koko i Pawła Urbańskiego. Zespół za badania polimorfizmu i identyfikację genów markerów związanych z użytkowością świń w 2005 roku otrzymał dyplom uznania Wydziału Nauk Rolniczych, Leśnych i Weterynaryjnych Polskiej Akademii Nauk. Udomowienie i hodowla w różnych środowiskach doprowadziły do powstania około 4500 ras wytworzonych z około 40 dziko żyjących gatunków zwierząt. Jednak w ostatnich dziesięcioleciach nastąpiło znaczne ograniczenie zmienności genetycznej w populacjach hodowlanych, a ostra selekcja na wysoką produkcję doprowadziła do poważnego naruszenia i osłabienia właściwości adaptacyjnych zwierząt – np. odporności na choroby czy plenności. Pod auspicjami FAO zapoczątkowano w roku 1995 światowy program, którego integralną częścią jest rozpoznawanie i ochrona zasobów 7 genetycznych zwierząt gospodarskich. Zasadniczy postęp w rozwoju tej problematyki stał się możliwy dzięki opanowaniu metody enzymatycznego sekwencjonowania DNA. Natomiast technologicznym przełomem stało się wprowadzenie do laboratoriów aparatów nowej generacji, zwanych sekwenatorami DNA, co umożliwiło zautomatyzowanie technik analitycznych i prowadzenie badań na dużą skalę. W Zakładzie podjęto badania z tego zakresu nad bydłem i końmi. Szczególnie skutecznym narzędziem w analizach genomu okazały się wysoce polimorficzne sekwencje „samolubnego DNA”, tworzące tandemowe bloki o różnej długości, określane mianem mikrosatelitów DNA. Badania nad bydłem przeprowadzono w ramach europejskiego programu, zmierzającego do charakterystyki zróżnicowania genetycznego ras na podstawie zunifikowanego zestawu 30 loci. W testowaniach wykorzystano opracowane i zoptymalizowane w Zakładzie multipleksy reakcji PCR. Multipleksy to kolejny etap w automatyzacji genetycznych analiz DNA, a ich stosowanie jest szczególnie istotne w badaniach prowadzonych na szeroka skalę, gdyż dysponując próbką DNA można w niej zamplifikować (a zatem wykryć) jednocześnie kilka lub kilkanaście alleli różnych loci. Największy multipleks opracowany dotąd w Zakładzie umożliwia jednoczesne zidentyfikowanie w jednej reakcji PCR 12 alleli mikrosatelitów z sześciu loci, a nadto pozwala na zidentyfikowanie płci zwierzęcia, od którego pochodzi analizowany DNA. Problematyka ta była przedmiotem rozprawy doktorskiej Joanny Lubienieckiej. Uzyskano m.in. nowe informacje na temat rodzimego bydła rasy polskiej czerwonej z hodowli zachowawczej. Na tle porównań z innymi rasami europejskimi charakteryzuje się ono wysoką zmiennością genetyczną (He=0,703; Ho=0,695; średnia liczba alleli w locus = 7,4). Wyniki szacowania genetycznego dystansu Dps. oparte na obecności w genomie tzw. alleli specyficznych dla rasy dowodzą, że 80% osobników badanej stawki bydła rasy pc tworzy odrębną i unikalna grupę rasową. W badaniach mikrosatelitów DNA u koni, Zakład wykorzystuje komercyjny zestaw kilkunastu loci mikrosatelitarnych. Dotychczas scharakteryzowano pod tym względem polskie populacje koni arabskich czystej krwi oraz koni pełnej krwi angielskiej. Wyniki tych badań były przedmiotem prac doktorskich Barbary Gralak i Cezarego Niemczewskiego. Aktualnie analizy mikrosatelitów DNA wykorzystuje się także w kontroli rodowodów koni obu ras. Najnowszym nurtem badawczym Zakładu jest filogenetyka molekularna, z wykorzystaniem polimorfizmu mitochondrialnego DNA. Podstawowym elementem analiz z tego zakresu jest rozpoznawanie pochodzenia anonimowych śladów biologicznych (identyfikacja gatunków) oraz określanie genetycznych współzależności między taksonami. W dotychczas wykonanych analizach określono stopień niezawodności odróżnienia anonimowych śladów biologicznych ludzi i zwierząt, oraz określono siłę dyskryminacji układu cytb mtDNA przy identyfikacji anonimowych śladów pochodzących od gatunków ewolucyjnie pokrewnych (np. od bizonów, żubrów lub bydła domowego). Rozróżnienie tego rodzaju jest ważne w ochronie przyrody, w nadzorze sanitarno-weterynaryjnym nad produktami pochodzenia zwierzęcego, medycynie sądowej itp. Dotychczas zidentyfikowano sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe obejmujące rejon genomu mtDNA 14897-15170, które są charakterystyczne dla 14 gatunków zwierząt gospodarskich i wybranych gatunków zwierząt dzikich. Uzyskane wyniki zostały wprowadzone do światowej bazy danych danych GenBank. Stwierdzono, że sekwencja człowieka różni się od sekwencji pozostałych gatunków co najmniej 70 podstawieniami nukleotydowymi, co dowodzi, że prawdopodobieństwo trafnego rozróżnienia śladów ludzkich od zwierzęcych na podstawie analizy sekwencji genu cytb mtDNA jest tożsame z pewnością, a siła dyskryminacji tego układu przy rozpoznawaniu próbek uzyskanych od zwierząt należących nawet do pokrewnych grup taksonomicznych jest bardzo wysoka. Nadto wykazano, że polimorfizm sekwencji genu cytb mtDNA jest modelem biologicznym dobrze odwzorowującym historię specjacji różnych taksonów, zwłaszcza gatunków z rodziny Bovidae. Zagadnienia te były tematem rozprawy doktorskiej Beaty Prusak i są kontynuowane we współpracy z krajowymi placówkami zaangażowanymi w ochronę przyrody. W okresie 50-letniej działalności Instytutu, jego 23 pracowników zajmujących się immunogenetyką uzyskało stopień doktora nauk rolniczych, pięć stopień doktora habilitowanego, a czworgu nadano tytuł naukowy profesora. Dane te nie obejmują osób spoza Instytutu, które uzyskały stopnie naukowe współpracując z Zakładem lub będąc pod jego merytoryczną opieką. Niemal wszystkie nowe kierunki badań Zakładu (poza analizami grup krwi u kur), stały się inspiracją podjęcia podobnej problematyki w innych polskich placówkach, często przez pracowników, którzy odbyli naukowe staże w Zakładzie. Szczególnie owocne w tym względzie były lata 1986-1990, kiedy to w ramach problemu centralnego 05.05 „Genetyczne i fizjologiczne podstawy wzrostu produkcji zwierząt 8 gospodarskich z wykorzystaniem biotechnik” Zakład Immunogenetyki Zwierząt sprawował merytoryczny nadzór i kierował grupą tematyczną „Immunogenetyczne i immunologiczne markery sprawności biologicznej organizmu”, w ramach której realizowano w Polsce 16 tematów badawczych. Od początku zainicjowania w Polsce badań z dziedziny immunogenetyki zwierząt, problematyka badawcza Zakładu związana jest z genetyką cech jakościowych i dotyczy układów wpływających na zdolności adaptacyjne i zdrowie zwierząt oraz identyfikacji markerów przydatnych w selekcji i chowie zwierząt gospodarskich. Zakład Immonegentyki Zwierząt jest najstarszą i jedyną jednostką Instytutu, która (poza likwidacją Pracowni Immunogenetyki Drobiu) nie przechodziła przeobrażeń organizacyjnych, zachowując własny i oryginalny kierunek badań. Techniki badawczoidentyfikacyjne przeszły w tym okresie znaczącą ewolucję - od badań definiujących genetyczne podstawy występowania grup krwi u zwierząt, poprzez interdyscyplinarne badania nad markerami cech fizjologicznych, do badań molekularnych mających na celu identyfikację genów i ich wariantów warunkujących produkcyjność zwierząt oraz zdrowotność i bioróżnorodność gatunków i ras. W problematyce badawczej Zakładu w minionym 50-leciu, obok walorów poznawczych, uwagę zwraca praktyczna użyteczność wyników badań. W kolekcji licznych indywidualnych nagród pracowników Zakładu, znajduje się również odznaka “Zasłużony dla Kółek Rolniczych” co, jak się wydaje, dobrze charakteryzuje aplikacyjne walory badań. Wiele z pionierskich zagadnień podjętych w Zakładzie w mijającym półwieczu stanowi modelowe przykłady, jak zainicjowane ab ovo badania podstawowe mogą podlegać korzystnym zmianom i stopniowo przeobrażać się w badania podstawowo-stosowane, by wreszcie stać się trwałym elementem praktyki hodowlanej. 9
