Rozdział 1
advertisement
ZAKŁAD MIKROBIOLOGII FARMACEUTYCZNEJ I DIAGNOSTYKI MIKROBIOLOGICZNEJ Katedra Biologii i Biotechnologii Farmaceutycznej Wydziału Farmaceutycznego ĆWICZENIA Z MIKROBIOLOGII DLA STUDENTÓW PIELĘGNIARSTWA POD REDAKCJĄ ELIGII M. SZEWCZYK Łódź́ 2015 AUTORZY : Paweł Lisiecki Maria Sobiś-Glinkowska Marcin Ciszewski Eligia M. Szewczyk Wydanie pierwsze. ISBN: 978-83-939877-7-1 Spis treści Rozdział 1 Drobnoustroje i ich właściwości .......................................................... 3 Rozdział 2 Podstawy identyfikacji drobnoustrojów dla celów klinicznych...... 17 Rozdział 3 Mikrobiota człowieka a bakterie chorobotwórcze ........................... 29 Rozdział 4 Znaczenie badań mikrobiologicznych dla leczenia zakażeń ........... 41 Rozdział 5 Sterylizacja, dezynfekcja i antyseptyka ............................................ 61 1 2 Rozdział 1 Drobnoustroje i ich właściwości Część teoretyczna Drobnoustroje, którymi zajmuje się mikrobiologia to organizmy, które widoczne są pod mikroskopem. Zaliczamy do nich wirusy, bakterie, archeony, grzyby mikroskopowe, liczne glony i pierwotniaki. Pod względem taksonomicznym klasyfikowane są do różnych domen świata żywego. Bakterie należą do domeny Bacteria, archeony do domeny Archea a grzyby, glony i pierwotniaki do domeny Eukarya. W zależności od budowy komórki drobnoustroje dzielimy na: prokariotyczne, do których należą bakterie i archeony i eukariotyczne, do których zaliczamy grzyby, glony i pierwotniaki. Podziałom tym nie podlegają wirusy, które nie mają organizacji komórkowej. Wśród drobnoustrojów dużą, choć niedominującą grupę stanowią te, które związane są z człowiekiem i mogą wywoływać u niego choroby. 1.1. Elementy budowy komórek bakterii Strukturami anatomicznymi występującymi w każdej komórce bakteryjnej są nukleoid, rybosomy, cytoplazma i błona cytoplazmatyczna. Rybosomy bakterii to ośrodki syntezy białek. Wykazują stałą sedymentacji 70S i składają się z dwóch podjednostek 30S i 50S. Mechanizm działania wielu antybiotyków stosowanych w leczeniu infekcji u ludzi polega na wiązaniu się ich z odpowiednim miejscem receptorowym na rybosomie, co skutkuje hamowaniem syntezy białek bakteryjnych. Większość bakterii ma ścianę komórkową, która między innymi decyduje o kształcie komórki. Różnice w budowie tej struktury pozwalają podzielić bakterie na dwie grupy: bakterie gramdodatnie i bakterie gramujemne. Ściana komórkowa bakterii gramdodatnich jest gruba i względnie jednorodna, zaś gramujemnych cienka i wielowarstwowa. Wspólnym składnikiem ściany obu tych grup bakterii jest polimer – peptydoglikan (mureina), który 3 w większej ilości występuje u bakterii gramdodatnich. Mechanizm działania wielu antybiotyków polega właśnie na hamowaniu syntezy tej ważnej dla komórki bakteryjnej struktury. Polimerami związanymi ze ścianą komórkową tylko bakterii gramdodatnich są kwasy tejchojowe, a ze ścianą bakterii gramujemnych – lipopolisacharyd (LPS). LPS to niebiałkowa toksyna bakterii i ich ważny czynnik chorobotwórczości, uwalniany z komórki w trakcie jej rozpadu. Jego aktywność biologiczna nie jest niszczona w procesie sterylizacji (jest termooporny). Wykazuje on działanie pirogenne i powoduje wstrząs septyczny, który występuje w przebiegu sepsy. Różnice w budowie ściany komórkowej bakterii wpływają na różnice w ich wrażliwości na antybiotyki, środki dezynfekcyjne i zdolność do przeżywania i rozprzestrzeniania się bakterii w środowisku szpitala czy ambulatorium. Niektóre gatunki bakterii wytwarzają otoczki, przetrwalniki, ziarnistości zapasowe oraz rzęski lub włókno osiowe, które warunkują ruch komórek. Obecność tych struktur można także wykorzystać w identyfikacji bakterii. Tworzone przez niektóre bakterie otoczki to najczęściej polisacharydowe polimery wydzielane na zewnątrz ściany komórkowej. Są one istotnym czynnikiem zjadliwości bakterii, nadającym ich komórkom silniejsze właściwości adhezyjne i chroniącym je przed aktywnością układu immunologicznego gospodarza. Przetrwalniki w odróżnieniu od komórek wegetatywnych bakterii charakteryzują się uśpionym metabolizmem i większą opornością na czynniki fizyko-chemiczne. Przetrwalniki mogą być tworzone pod wpływem niesprzyjających warunków środowiskowych. Wytworzony przetrwalnik zachowuje swoją żywotność, czyli zdolność do przejścia w komórkę wegetatywną przez długi czas. Proces przekształcania komórki wegetatywnej w przetrwalnik określany jest jako sporulacja. Jedna komórka wytwarza jeden przetrwalnik. Przetrwalniki tworzone są przez bakterie gramdodatnie. Z klinicznego punktu widzenia ważne są przetrwalniki laseczek z rodzaju Bacillus i Clostridium. Oporność przetrwalników wynika z ich unikatowej budowy: obecności płaszcza zewnętrznego i wewnętrznego, które decydują o oporności na czynniki chemiczne i kory, która wpływa na oporność na wysoką temperaturę. Nieprawidłowo przeprowadzone procedury dezynfekcji 4 i sterylizacji w szpitalu lub ambulatorium mogą nie niszczyć form przetrwalnych bakterii co skutkuje skażeniem środowiska i stwarza zagrożenie dla pacjentów. Ziarnistości zapasowe gromadzone są w cytoplazmie komórek. Mają one charakter polimerów, które syntetyzowane są w komórce w czasie jej wzrostu w warunkach nadmiaru substancji odżywczych, a zużywane w warunkach głodu. Wśród bakterii związanych z człowiekiem, najważniejsze są ziarnistości polimetafosforanowe (wolutyna) występujące u bakterii z rodzaju Corynebacterium, których obecność ma istotne znaczenie w identyfikacji ich gatunków. Niektóre bakterie wykazują zdolność poruszania się w środowisku płynnym, półpłynnym a nawet w cienkiej warstwie płynu na podłożu stałym. Warunkowane jest to obecnością rzęsek, które mają budowę białkową. Różnice w strukturze białek tworzących rzęski wykorzystuje się w identyfikacji serologicznej pałeczek z rodzaju Salmonella wywołujących u ludzi dur brzuszny lub inwazyjne zatrucia pokarmowe (toksykoinfekcje). Z medycznego punktu widzenia szczególnie niebezpieczną cechą bakterii jest zdolność do tworzenia biofilmu czyli rodzaju społeczności drobnoustrojów. Biofilm to zespół wzajemnie komunikujących się w mechanizmie quorumsensing komórek osiadłych na określonym podłożu, przylegających do siebie i osłoniętych macierzą zewnątrzkomórkową zbudowaną głównie z polisacharydów i białek. Biofilm może być tworzony w organizmie człowieka na powierzchni błon śluzowych oraz powierzchni tworzyw sztucznych i metali, z których wykonane są protezy i implanty, sztuczne zastawki czy cewniki. Może on być także tworzony na kamieniach moczowych lub żółciowych. Bakterie żyjące w biofilmie, w porównaniu z bakteriami z nim niezwiązanymi, charakteryzują się większą opornością na antybiotyki i środki dezynfekcyjne. Stwarza to ogromne problemy w leczeniu infekcji powodowanych przez bakterie tworzące biofilm. Utrudnia to także eliminację tak żyjących bakterii ze środowiska szpitalnego. 5 1.2. Oglądanie komórek drobnoustrojów Bakterie wykazują znaczną rozpiętość wymiarów. Wymiar większości komórek bakteryjnych wynosi 1-10 μm. Przeciętna długość komórki bakteryjnej to 1-5 μm, a średnica 1-2 μm. Komórki grzybów są większe od komórek bakteryjnych (2-40 μm). Wielkość komórek drożdży i grzybów drożdżopodobnych waha się zależnie od gatunku i warunków hodowli, od 2 do 8 μm średnicy i od 1 do 8 μm długości. Średnica komórki strzępki grzybów nitkowatych wynosi od 1 do 1,5 μm. Wielokomórkowe strzępki mogą być różnej długości, zarówno krótkie jak i dochodzące do kilku metrów. Małe rozmiary komórek bakterii i grzybów chorobotwórczych sprawiają, że do ich obserwacji wykorzystuje się mikroskop. W rutynowej pracy laboratorium mikrobiologicznego sprawdza się mikroskop świetlny z jasnym polem widzenia, dla oglądania bakterii wyposażony w obiektyw immersyjny, którego soczewki powiększają 100-krotnie i okulary o soczewkach powiększających 10-krotnie. W ten sposób powiększenie takiego mikroskopu jest 1000-krotne. Promienie świetlne, po przejściu przez szkiełko, na którym znajduje się rozmaz z drobnoustrojów, wpadając do warstwy powietrza ulegają załamaniu i większość z nich omijałaby soczewkę obiektywu immersyjnego. Aby temu zapobiec przestrzeń pomiędzy preparatem a obiektywem wypełnia się olejkiem immersyjnym, którego współczynnik załamania światła jest zbliżony do współczynnika załamania światła szkła. Zdolność rozdzielcza mikroskopu świetlnego (czyli wielkość obiektów, które można rozpoznać) w zależności od zastosowanej długości fali świetlnej waha się w granicach od 0,1 do 0,2 μm. Komórki grzybów można oglądać pod mniejszym powiększeniem (100-400-krotnym), które nie wymaga zastosowania olejku immersyjnego. Wirusy, których wielkość waha się od 18 do 600 nm można obserwować tylko w mikroskopie elektronowym, w którym zamiast wiązki światła wykorzystuje się wiązkę elektronów. Bezbarwność komórek bakterii oraz mała zdolność do załamywania światła wynikająca z podobnej do wody gęstości optycznej cytoplazmy sprawia, że bakterie w mikroskopie świetlnym ogląda się najczęściej w preparatach barwionych. 6 W preparatach barwionych lepiej można ocenić cechy morfologiczne komórek, takie jak wymiar, kształt, sposób układania się komórek i nieliczne struktury anatomiczne. Barwienie pozwala także na różnicowanie bakterii między sobą i odróżnienie ich od składników otoczenia, w którym się znajdują. Kształt bakterii może być kulisty, cylindryczny lub spiralny. Bakterie kuliste, nazywane także ziarenkowcami, mogą być ułożone pojedynczo lub tworzyć charakterystyczne układy komórek. Powstanie układów związane jest z płaszczyzną i liczbą podziałów poprzecznych komórek w trakcie ich rozmnażania oraz brakiem ich rozdziału po podziale. Wśród bakterii kulistych wyróżnić można: dwoinki i paciorkowce (Streptococcus), gronkowce (Staphylococcus). Wśród form cylindrycznych spotykamy: pałeczki (Bacterium), laseczki (Bacillus), maczugowce (Corynebacterium), prątki (Mycobacterium), wrzecionowce (Fusobacterium). Do bakterii spiralnych zaliczamy: przecinkowce (Vibrio) z sierpowato zagiętą komórką, śrubowce (Spirillum), które tworzą pełną spiralę, krętki (Borrelia, Treponema, Leptospira), różniące się między sobą liczbą skrętów, grubością komórki i wyglądem jej biegunów. Komórki drożdży mogą mieć kształt: kulisty lub elipsoidalny. Ich kształt nie jest cechą diagnostyczną, bo zależy od wieku komórki i warunków hodowli. Drożdże mogą tworzyć łańcuszki powstałe w wyniku podziału komórek pączkowania. Komórki grzybów nitkowatych tworzą strzępki. W mikroskopie widoczne są one jako nitkowate, cylindryczne twory, proste lub rozgałęzione. U niektórych gatunków strzępki są jednokomórkowe, u innych poprzecznie porowate przegrody dzielą je na szereg komórek. Barwienie komórek bakterii metodą Grama jest metodą powszechnie wykorzystywaną w laboratoriach mikrobiologicznych. Jest to barwienie złożone, ponieważ wykorzystuje kilka barwników, jest też różnicujące, ponieważ pozwala dzielić bakterie na gramdodatnie i gramujemne, które w różny sposób reagują na barwniki wykorzystywane w tej metodzie. Komórki bakterii gramdodatnich barwią się na kolor fioletowy a komórki bakterii gramujemnych na kolor różowy. Do często używanych różnicujących bakterie metod barwienia należą także: metoda Ziehla-Neelsena pozwalającą barwić prątki (Mycobacterium), które są 7 kwasooalkoholooporne i metoda Neissera, uwidaczniająca polimetafosforanowe ziarnistości zapasowe maczugowców (Corynebacterium). Grzyby metodą Grama najczęściej barwią się na fioletowo, jednak metoda ta nie jest rekomendowana do wybarwiania ich komórek. W przypadku grzybów nitkowatych szerokie zastosowanie znajdują preparaty przyżyciowe w kropli spłaszczonej. Pozwalają one ocenić cechy mikroskopowe grzybni istotne z diagnostycznego punktu widzenia. 1.3. Hodowla drobnoustrojów Wzrost i rozmnażanie drobnoustrojów w warunkach naturalnych i w warunkach laboratoryjnych zależą od tych samych czynników. Skład wykorzystywanych podłoży i warunki hodowli powinny być możliwie najbardziej zbliżone do warunków naturalnych, w których żyją drobnoustroje. Hodowla drobnoustrojów zapewniająca szybkie i efektywne ich mnożenie wymaga spełnienia kilku warunków: obecności substancji pokarmowych w podłożu spełniających zapotrzebowania pokarmowe namnażanych drobnoustrojów, odpowiedniej wilgotności, pH i ciśnienia osmotycznego podłoża, właściwego składu atmosfery gazowej hodowli i temperatury hodowli. Podłoża hodowlane wykorzystywane w laboratorium muszą być także jałowe (sterylne). Jałowość oznacza, że pożywka jest pozbawiona wszelkich żywych organizmów, form wegetatywnych i przetrwalnych. Najczęściej jałowość podłoża uzyskuje się poddając je autoklawowaniu – działaniu wysokiej temperatury w podwyższonym ciśnieniu. Warunki sterylizacji opisane są w rozdziale 5 tego skryptu. Bakterie różnią się wymaganiami pokarmowymi. Minimalne wymagania wzrostowe bakterii obejmują dostarczenie węgla, azotu, energii, wody oraz soli mineralnych. W zależności od potrzeb pokarmowych bakterii, związki chemiczne będące dla nich źródłem węgla, azotu i energii mogą mieć naturę organiczną lub nieorganiczną. Bakterie związane z ciałem człowieka i te powodujące infekcje, w sztucznej hodowli wymagają dostarczenia szeregu związków organicznych obecnych w składnikach podłoży, które stanowią ekstrakty mięsa czy drożdży. Najczęściej źródłem węgla i energii są dla nich 8 węglowodany, a źródłem azotu aminokwasy czy peptydy. Wiele z nich jest auksotrofami i wymaga dodatku witamin, surowicy lub bardziej złożonych związków. Wzrost drobnoustrojów zależny jest także od obecności soli mineralnych. Jony Mg2+, Fe2+, Ca2+, Mn2+, Zn2+ są aktywatorami niektórych reakcji enzymatycznych lub grupami prostetycznymi enzymów. Utrzymywanie odpowiedniego pH podłoża podczas hodowli drobnoustrojów ma także duże znaczenie. Dla rozwoju większości bakterii optymalne pH pożywki wynosi 7,2-7,4 czyli takie jak płynów ustrojowych człowieka - krwi i limfy. Niektóre bakterie ewolucyjnie przystosowały się do mnożenia w warunkach pH kwaśnego wynoszącego 4-5 co umożliwia im życie np. w żołądku lub pochwie. Komercyjnie dostępne są częściowo przygotowane pożywki w postaci odwodnionych granulatów ewentualnie proszków, z których należy przygotować pożywkę. Jednak nieliczne diagnostyczne laboratoria mikrobiologiczne przygotowują je we własnym zakresie. Gotowe jałowe podłoża mikrobiologiczne są przygotowywane przez wyspecjalizowane firmy. Każda seria pożywki zamawiana przez laboratorium posiada certyfikat, w którym wytwórca potwierdza jej jakość. Drobnoustroje w warunkach laboratoryjnych hodujemy na stałych lub w płynnych pożywkach, które umieszczone zostały w naczyniach hodowlanych (płytki Petriego, kolby Erlenmayera, probówki). Konsystencję stałą podłoża uzyskuje się przez dodanie agaru, który nie stanowi źródła pokarmu dla bakterii. Podłoża stałe, najczęściej w postaci płytek są częściej wykorzystywane w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej niż podłoża płynne. Z praktycznego punktu widzenia przydatny jest podział podłoży ze względu na ich zastosowanie. Pod tym względem podłoża dzielimy na: namnażające lub namnażająco-wybiórcze, wybiórcze (selektywne), diagnostyczne (różnicujące) i transportowe. Znajomość cech podłoży odpowiednich dla danych drobnoustrojów i umiejętność wyboru właściwych podłoży dla posiewu określonych materiałów klinicznych jest niezwykle ważna dla prawidłowego przeprowadzenia diagnostyki mikrobiologicznej. O niektórych związanych z nią aspektach będzie mowa w dalszych rozdziałach. 9 Temperatura hodowli to kolejny czynnik determinujący wzrost drobnoustrojów. Bakterie mogą namnażać się w szerokim zakresie temperatur. Dla pełnej aktywności enzymów biorących udział w procesach metabolicznych komórek wymagana jest ich optymalna temperatura wzrostu. Większość bakterii związanych z człowiekiem to mezofile (tabela 1.1). Tabela 1.1. Wpływ temperatury na wzrost bakterii Grupa Temperatura wzrostu bakterii Mezofile Rosną w zakresie temperatur 25° - 40°C. Optymalna temperatura wzrostu 37°C (temperatura ciała człowieka). Psychrofile Rosną dobrze w temperaturze 20°C, ale mogą namnażać się w temperaturze 0°C. Termofile Najlepiej rosną w temperaturze 55° - 80°C. Krótka charakterystyka Do tej grupy należy większość bakterii powodujących infekcje u ludzi. Rozwijają się w warunkach chłodniczych w nieprawidłowo przechowywanej żywności. Powodują jej psucie i mogą być przyczyną infekcji u ludzi. Żyją w glebie, w kompoście, nawozach organicznych, wodach termalnych. Enzymy niektórych gatunków są wykorzystywane w biologii molekularnej. Istotnym czynnikiem warunkującym rozwój bakterii jest też tlen. Pod względem zapotrzebowania na tlen bakterie związane z człowiekiem różnią się znacznie, ale większość z nich to względne beztlenowce lub mikroaerofile (tabela 1.2). Najwięcej problemów w warunkach laboratoryjnych stwarza hodowla bakterii bezwzględnie beztlenowych. Powszechnie wykorzystuje się słoje lub worki do hodowli bakterii beztlenowych, w których atmosferę wolną od tlenu uzyskuje się na drodze reakcji chemicznej wkładając do ich wnętrza specjalne saszetki inicjujące ten proces. 10 Tabela 1.2. Wymagania tlenowe bakterii Grupa bakterii Krótka charakterystyka Bezwzględne Mnożą się tylko w obecności tlenu. Wytwarzanie energii tlenowce u tej grupy bakterii zależne jest od tlenu cząsteczkowego, który jest końcowym akceptorem elektronów w łańcuchu oddechowym. Bezwzględne Nie mogą rosnąć w obecności tlenu. Nie mają katalazy, beztlenowce peroksydazy, dysmutazy nadtlenkowej lub wszystkich trzech enzymów. Niektóre bakterie z tej grupy mogą rosnąć w obecności tlenu tylko w warunkach obniżonego potencjału oksydacyjno-redukcyjnego. Względne Mnożą się zarówno w obecności tlenu jak i przy jego braku. beztlenowce Produkują energię w procesie oddychania tlenowego lub procesie fermentacji, który jest niezależny od tlenu. Mikroaerofile Mnożą się najlepiej w warunkach obniżonego stężenia tlenu (< 20%) Grzyby to heterotrofy wymagające do wzrostu związków organicznych. Podłoża wykorzystywane do ich hodowli zawierają duże stężenia węglowodanów, które są dobrze tolerowane przez ich komórki i mają niższe niż dla bakterii pH. Grzyby to mezofile, ale dla większości optymalną temperaturą wzrostu jest 25° - 30°C. Hodowle grzybów prowadzimy w warunkach tlenowych. Czas potrzebny na wyhodowanie bakterii na pożywce tak, aby ich wzrost był widoczny gołym okiem zależy od rodzaju podłoża wzrostowego oraz warunków hodowli. Dla większości bakterii chorobotwórczych wynosi on 1824 godziny, ale prątki gruźlicy wymagają hodowli przez kilka tygodni. Bakterie rosnące na pożywce stałej lub płynnej stanowią hodowlę. Na podłożach płynnych bakterie rosną najczęściej w postaci jednolitego zmętnienia. Bardzo częstym celem posiewu na podłoża stałe umieszczone w płytkach Petriego jest uzyskanie wzrostu w postaci pojedynczych kolonii. Kolonią nazywamy widoczne makroskopowo na powierzchni lub w głębi pożywki stałej skupisko bakterii wyrosłe z jednej komórki lub jednej jednostki wzrostowej (nierozłączonego po podziale skupiska lub przetrwalnika). 11 Kolonię uważa się zatem za odpowiednik jednej komórki bakterii lub jednostki wzrostowej i zasadę tę wykorzystuje się w określaniu ich liczby (np. w moczu). Mówimy wtedy o jednostkach tworzących kolonie – w skrócie jkt, czasem z angielskiego CFU – colony forming units. W stałych warunkach hodowli kolonie charakteryzują się względnie stałymi cechami: wymiarem, kształtem, zabarwieniem. W opisie morfologii kolonii zwracamy także uwagę na: brzeg kolonii, wzniesienie i powierzchnię kolonii a także zmiany wokół niej. Hodowla grzybów chorobotwórczych musi być prowadzona dla grzybów drożdżopodobnych przez 48-72 godziny, ale grzyby pleśniowe wymagają hodowli przez 1-2 tygodnie. Wirusy są bezwzględnymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi i nie można ich hodować na sztucznych pożywkach bezkomórkowych, a jedynie w żywych komórkach. Wirusy chorobotwórcze dla człowieka w warunkach laboratoryjnych namnaża się w komórkach specjalnie prowadzonych hodowli tkanek zwierzęcych lub nowotworowych. Metody Przygotowanie rozmazów do preparatów trwałych Rozmazy z bakterii wykonuje się na odtłuszczonych w płomieniu palnika szkiełkach podstawowych. Jeśli sporządza się rozmaz z bakterii zebranych z hodowli stałej, na szkiełko należy nanieść 1 oczko ezy wody, a następnie zawiesić w niej bardzo niewielką ilość zebranej ezą masy bakteryjnej. Powstała zawiesina powinna lekko opalizować. Nie może być ona zbyt gęsta, gdyż nie uzyskamy wtedy obrazu pojedynczych komórek, co jest warunkiem prawidłowej oceny ich morfologii. Przygotowane rozmazy suszy się w powietrzu lub w strumieniu ciepłego powietrza, trzymając szkiełko w palcach nad palnikiem. Utrwalenie preparatu osiąga się przez trzykrotne przeciągnięcie spodu szkiełka przez płomień palnika. Można też zalać szkiełko np. alkoholem metylowym i pozostawić do jego całkowitego odparowania. 12 W trakcie wykonywania rozmazu wszystkie czynności należy wykonywać w pobliżu palnika, pamiętając o opalaniu ezy i wylotów probówek w trakcie pobierania materiału. Barwienie metodą Grama Barwienie metodą Grama jest podstawowym barwieniem różnicującym stosowanym w mikrobiologii, dzielącym bakterie na dwie grupy: gramdodatnie i gramujemne. W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki: - barwnik podstawowy – fenolowy roztwór fioletu krystalicznego (gencjana); - zaprawę w postaci roztworu jodu w jodku potasu (płyn Lugola); - odbarwiacz – alkohol etylowy; - barwnik kontrastowy – alkoholowo-wodny roztwór fuksyny zasadowej (fuksyna 1:10) lub safranina. Wykonanie barwienia - Na utrwalony preparat należy nalać świeżo przesączony przez bibułę roztwór gencjany na 2 minuty; - preparat spłukać wodą; - nalać płyn Lugola na 1 minutę; - spłukać wodą; - odbarwiać alkoholem przez 15-20 sekund; - spłukać wodą; - dobarwić przez zalanie na 20 sekund roztworem fuksyny; - spłukać wodą; - osuszyć lekko odciskając w bibule. Wynik barwienia: Bakterie gramdodatnie – fioletowogranatowe, gramujemne - różowe. O wyniku barwienia w metodzie Grama decyduje grubość warstwy peptydoglikanu ściany komórkowej. Warstwa peptydoglikanu bakterii gramdodatnich jest grubsza niż u bakterii gramujemnych. Fiolet krystaliczny przedostaje się do wnętrza komórki i łącząc się z jodem tworzy nierozpuszczalny w wodzie kompleks, który zabarwia ją na kolor fioletowy. Alkohol stosowany jako odbarwiacz, rozpuszcza błonę cytoplazmatyczną 13 bakterii gramdodatnich oraz błonę cytoplazmatyczną i błonę zewnętrzną bakterii gramujemnych. Powoduje on również odwodnienie peptydoglikanu, uszczelniając w ten sposób ścianę komórkową. Grupa warstwa peptydoglikanu bakterii gramdodatnich skutecznie zatrzymuje barwny kompleks jodu z fioletem krystalicznym, który przez cienką warstwę peptydoglikanu bakterii gramujemnych wydostaje się na zewnątrz. Fuksyna jako barwnik kontrastowy zabarwia komórki bakterii gramujemnych na różowo. Mikroskopowanie preparatów barwionych Oglądanie bakterii w preparatach barwionych wymaga zastosowania obiektywu immersyjnego i olejku immersyjnego, w którym należy zanurzyć soczewkę obiektywu przed przystąpieniem do ich oglądania. Promienie świetlne po przejściu przez szkło preparatu, wpadając do warstwy powietrza, ulegają załamaniu i większość z nich omijałaby soczewkę obiektywu immersyjnego. Wykorzystanie olejku immersyjnego niweluje to niekorzystne zjawisko. Po zakończeniu mikroskopowania z obiektywu należy usunąć pozostałości olejku bawełnianą szmatką. W przypadku zaschnięcia olejku na obiektywie, co grozi jego uszkodzeniem, usuwamy olejek specjalnym zmywaczem. Na jakość obrazu, jaki uzyskujemy w mikroskopie istotny wpływ ma oświetlenie oglądanego preparatu. Posługując się światłem dziennym, należy zastosować lusterko płaskie, a przy świetle sztucznym lusterko wklęsłe. Preparaty trwałe należy oglądać przy maksymalnie podniesionym kondensorze. 14 Zadania do wykonania Zadanie 1. Przygotowanie i barwienie preparatów Otrzymujesz hodowlę stałą Pseudomonas aeruginosa lub Staphylococcus aureus na płytce Petriego. Bakterie posiane zostały w sposób pasmowy. - Wykonaj preparat z hodowli jednego z tych drobnoustrojów i zabarw go metodą Grama. - Nastaw i obejrzyj go pod mikroskopem wykorzystując obiektyw immersyjny. Narysuj obraz mikroskopowy. - Określ powiększenie oglądanego preparatu, kształt i sposób układania się komórek bakteryjnych. - Czy badane przez ciebie drobnoustroje to bakterie gramdodatnie czy gramujemne? 15 16 Rozdział 2 Podstawy identyfikacji drobnoustrojów dla celów klinicznych Część teoretyczna Materiał kliniczny, który trafia bo pracowni mikrobiologicznej laboratorium diagnostycznego może być badany różnymi technikami i dlatego niezwykle ważny jest opis w dokumentacji wskazujący oczekiwany, wynikający z obserwacji klinicznych kierunek badań. Ważny jest wiek pacjenta i informacja o przyjmowanych lekach przeciwdrobnoustrojowych. Badane materiały przesyłane są czasem w podłożu transportowym. Podłoża transportowe pozwalają na utrzymanie żywotności drobnoustrojów pobranych od pacjentów w szpitalu lub ambulatorium podczas ich transportu do laboratorium mikrobiologicznego. Nie zawierają one składników stymulujących wzrost drobnoustrojów. Niekiedy badane próbki (krew, płyn mózgowo-rdzeniowy) trafiają do laboratorium już w podłożu namnażającym o specjalnie dobranym składzie, które dostarczono wcześniej na oddział. Wybór podłoża posiewowego ma kluczowe znaczenie. Początkowym etapem identyfikacji bakterii podejrzanych o wywołanie infekcji, jest zwykle zbadanie cech morfologicznych komórek i ich zdolności do barwienia się metodą Grama. Determinuje to wybór podłoży hodowlanych, na które w następnym etapie badań posiane zostaną próbki (tabela 2.1). 17 Tabela 2.1. Podstawowe podłoża hodowlane wykorzystywane w laboratoriach mikrobiologicznych Nazwa podłoża Typ podłoża Zastosowanie Podłoża stałe Podłoże ogólnego stosowania. Umożliwia Agar odżywczy Podłoże wzrost większości bakterii. namnażające Podłoże zawierające krew baranią. Agar z krwią Podłoże Najpowszechniej wykorzystywane podłoże namnażające i wzrostowe. Umożliwia wzrost większości diagnostyczne bakterii w tym tych o dużych wymaganiach Podłoże Chapmana Agar czekoladowy Podłoże diagnostycznowybiórcze Podłoże namnażające Podłoże MacConkey’a Podłoże diagnostycznowybiórcze Agarowe podłoże Muellera-Hinton Podłoże namnażające Agarowe podłoże Sabouraud Podłoże namnażające Bulion odżywczy Płynne podłoże Sabouraud Woda peptonowa z 1% dodatkiem cukru pokarmowych. Pozwala badać cechy hemolityczne bakterii. Podłoże dla bakterii z rodzaju Staphylococcus. Pozwala zbadać zdolność do rozkładu mannitolu. Podłoże zawierające termicznie zdenaturowaną krew baranią. Dedykowane szczególnie bakteriom z rodzaju Haemophilus i Neisseria, które charakteryzują się dużymi wymaganiami pokarmowymi. Służy do izolacji pałeczek gramujemnych szczególnie z rodziny Enterobacteriaceae. Pozwala badać ich zdolność do rozkładu laktozy. Powszechnie wykorzystywane do badania wrażliwości drobnoustrojów na antybiotyki i chemioterapeutyki metodą dyfuzyjnokrążkową. Podłoże dedykowane grzybom. Uzupełnienie podłoża antybiotykami przeciwbakteryjnymi i obniżenie pH czyni je wybiórczym dla grzybów. Podłoża płynne Podłoże ogólnego stosowania. Umożliwia Podłoże wzrost większości bakterii. namnażające Podłoże dedykowane grzybom. Podłoże namnażające Podłoże do badania zdolności rozkładu Podłoże cukrów przez bakterie o małych diagnostyczne wymaganiach pokarmowych. 18 Podstawą diagnostyki jest posiew na podłoża stałe w postaci płytek, na których można ocenić morfologię kolonii a tym samym różnorodność obecnych w materiale bakterii oraz zdecydować o dalszym postępowaniu. Techniką mikrobiologiczną pozwalająca uzyskać wzrost bakterii w postaci pojedynczych kolonii jest posiew redukcyjny. Hodowla na pierwszym podłożu, po posiewie materiałów pobranych z okolic ciała naturalnie skolonizowanych bakteriami (np. gardło, skóra) jest zazwyczaj hodowlą mieszaną i zawiera wiele różnych kolonii. Pomocne w ograniczeniu wzrostu na takich płytkach kolonii bakterii nie będących czynnikiem etiologicznym infekcji są podłoża diagnostyczno-wybiórcze lub wybiórcze. Posiew redukcyjny próbek na kolejne podłoża stałe pozwala uzyskać czystą hodowlę patogenu, co jest niezbędnym warunkiem zakończenia jego identyfikacji poprzez zbadanie jego właściwości biochemicznych i określenie wrażliwości na antybiotyki i chemioterapeutyki. W identyfikacji wielu gatunków bakterii istotne znaczenie mają ich własności hemolityczne, które można zauważyć już na wczesnym etapie diagnostyki po posiewie na podłoże diagnostyczno-namnażające jakim jest agar z krwią baranią i określić typ hemolizy α, β lub jej brak. Powszechnie w identyfikacji patogenów bakteryjnych bada się ich właściwości biochemiczne. Wykorzystuje się przede wszystkim reakcje kataboliczne zachodzące w komórkach, a więc zdolność rozkładu szeregu substratów, uzależnioną od obecności odpowiednich enzymów. Określamy w ten sposób charakterystyczny profil biochemiczny drobnoustroju. Różnice w aktywności enzymatycznej pozwalają na odróżnienie rodzajów, gatunków a nawet szczepów bakterii w obrębie gatunku. W praktyce określa się następujące właściwości biochemiczne bakterii: związane z metabolizmem azotowym (badanie zdolności rozkład białek i aminokwasów), związane z metabolizmem węglowodanowym (badanie zdolności rozkład cukrów i szlaków ich rozkładu), związane z metabolizmem lipidowym (badanie rozkładu lipidów) i związane z procesami oddechowymi komórki (wykrywanie enzymów redukująco-utleniających). Identyfikację biochemiczną prowadzi się w oparciu o wiele, zwykle kilkanaście prób, które dobrane zostały pod kątem identyfikacji określonych bakterii. Podłoża wykorzystywane w określaniu właściwości biochemicznych należą do grupy pożywek diagnostycznych. 19 W celu przyspieszenia procesu identyfikacji w laboratoriach mikrobiologicznych stosowane są gotowe, standaryzowane numeryczne zestawy testów biochemicznych. W Polsce i Europie powszechnie wykorzystywany jest francuski system API. Testy te mają postać paska z tworzywa sztucznego z przezroczystymi pojemniczkami wypełnionymi substratami dla enzymów i wskaźniki reakcji biochemicznej, których zestaw umożliwia identyfikację danej grupy bakterii. Po posianiu testu zawiesiną badanego szczepu i inkubacji, analizujemy zmianę barwy zawartości pojemniczków. Odnotowujemy je na numerycznej karcie odczytowej testu. Otrzymany w ten sposób numeryczny profil drobnoustroju porównujemy z numerycznymi profilami szczepów wzorcowych danego gatunku. Możemy tego dokonać przy użyciu książki kodów lub skorzystać z internetowych baz danych udostępnianych przez producenta testów. Stopień zgodności pomiędzy profilami zwykle umożliwia zidentyfikowanie badanego szczepu do poziomu gatunku. W niektórych przypadkach wykorzystanie podłoży chromogennych może przyspieszyć diagnostykę. Podłoża chromogenne pozwalają wykrywać aktywność enzymatyczną drobnoustrojów. W zależności od produkowanych enzymów drobnoustroje rosnące w płytkach z podłożem chromogennym rozkładają odpowiednie substraty chromogenne, co powoduje zabarwienie rosnących kolonii na odpowiednie kolory. Zastosowanie tej metody nie zwalnia jednak laboratorium z konieczności wykonania przynajmniej jednego testu diagnostycznego charakterystycznego dla zidentyfikowanego na podłożu chromogennym patogenu. Coraz większe zastosowanie w identyfikacji czynników etiologicznych infekcji u ludzi znajdują szybkie testy immunochromatograficzne. W Polsce ciągle jeszcze zbyt rzadko wykorzystywane. Mogą być one bezpośrednio wykonywane przy łóżku pacjenta przez lekarza lub personel pielęgniarski. Są one dobrym narzędziem wspomagającym szybkie postawienie diagnozy i wszczęcie właściwego leczenia. Można nimi diagnozować zakażenia bakteryjne, wirusowe i grzybowe. W testach immunochromatograficznych wykorzystywane są znakowane przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko specyficznym antygenom drobnoustrojów. Typowe, dostępne komercyjne testy mają najczęściej postać plastikowych kasetek. Na powierzchni kasetki znajduje się okienko do nanoszenia badanej próbki. Wewnątrz płytki znajduje się specjalna membrana i znakowane przeciwciała. 20 Zasada działania testu polega na przemieszczaniu się wykrywanego antygenu wzdłuż membrany. W czasie tej wędrówki tworzy się kompleks antygenu ze znakowanymi przeciwciałami. Wizualnym efektem powstania takiego kompleksu jest pojawienie się dwóch kolorowych kresek. Powstanie tylko jednej kreski świadczy o braku poszukiwanego antygenu. Test można wykonać korzystając z wymazów z gardła, z pochwy, z próbki kału, moczu czy płynów ustrojowych człowieka – krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego. Odczyny serologiczne to ważna grupa metod, które wykorzystuje się w identyfikacji czynników etiologicznych zakażeń u ludzi. Przy ich pomocy można stwierdzić obecność albo ocenić wzrost miana swoistych przeciwciał w surowicy pacjenta, które zostały wytworzone w odpowiedzi na kontakt układu immunologicznego z określonym patogenem. Wykorzystuje się je przede wszystkim do identyfikacji patogenów bakteryjnych, których hodowla w warunkach laboratoryjnych jest trudna albo niemożliwa, a także, szeroko, w diagnostyce wirusologicznej. W diagnostyce serologicznej infekcji najszersze zastosowanie znajduje odczyn immunoenzymatyczny (ELISA – ang. enzyme linked immunosorbent assay) wykorzystujący antygeny lub przeciwciała znakowane znacznikiem w postaci aktywnego enzymu. Enzymy te katalizują reakcje, których produkt, przy odpowiednim doborze substratu (zwanego chromogenem), jest barwny. Pozwala to zauważyć wiązanie przeciwciał z antygenami, a także określić ich ilość, gdyż natężenie barwy jest wprost proporcjonalne do stężenia enzymu. Odczyn jest bardzo czuły, pozwala na oznaczenia ilościowe, jest w pełni zautomatyzowany, co znacznie przyspiesza diagnostykę. Metodami serologicznymi możemy także wykrywać cechy antygenowe bakterii. Najszersze zastosowanie znajduje odczyn aglutynacji szkiełkowej wykorzystywany w identyfikacji bakterii z rodzaju Salmonella i Shigella. Antygenami w tym odczynie są całe komórki bakterii, które łączymy z surowicami zawierającymi specyficzne przeciwciała. O komplementarności antygenu z przeciwciałem świadczy zlepianie się komórek, co można łatwo zaobserwować gołym okiem. Testy lateksowe to także skuteczne narzędzie w procesie identyfikacji bakterii. Wykorzystujemy w nich cząsteczki lateksu, którymi opłaszczono przeciwciała monoklonalne, skierowane przeciwko specyficznym antygenom drobnoustrojów. W teście wykorzystuje się całe komórki bakterii lub roztwory 21 wyekstrahowanych wcześniej antygenów. Można też tą techniką poszukiwać rozpuszczalnych antygenów bakterii w hodowlach czy płynach ustrojowych (płyn mózgowo-rdzeniowy). Powstanie komplementarnego kompleksu antygen-przeciwciało manifestuje się zlepianiem cząstek lateksu, co można łatwo zaobserwować gołym okiem. W różnicowaniu drożdży i grzybów drożdżopodobnych wykorzystuje się przede wszystkim ich cechy metaboliczne: zdolność przyswajania węgla lub azotu z różnych źródeł. Dla zbadania tej cechy wykonuje się auksanogram. Wykorzystuje się też ich zdolność do fermentacji rożnych węglowodanów co badamy w teście określanym jako zymogram. W identyfikacji grzybów nitkowatych badanie ich właściwości metabolicznych nie ma większego znaczenia. Różnicuje się je na podstawie cech mikroskopowych grzybni oraz hodowli i ocenie wyglądu makroskopowego grzybni. Nową grupą metod pozwalającą identyfikować drobnoustroje są techniki oparte na identyfikacji kwasów nukleinowych. Znajdują one coraz szersze zastosowanie w rutynowej diagnostyce zakażeń bakteryjnych, grzybowych i wirusowych. Pozwalają identyfikować DNA patogenów bezpośrednio w materiale pobranym od pacjenta lub po ich namnożeniu. Dostępność wielu gotowych do zastosowania komercyjnych zestawów znacznie zwiększyła wykorzystanie tych metod. Najbardziej użyteczną metodą jest technika łańcuchowej reakcji polimerazy – PCR. Technika ta pozwala na powielenie (amplifikację) specyficznej dla danego patogenu sekwencji DNA, która znajduje się w jego genomie. W tym celu wykorzystuje się tak zwane startery, które są krótkimi jednoniciowymi fragmentami DNA, komplementarnym do sekwencji poszukiwanej. Po przyłączeniu się starterów, polimeraza DNA wydłuża każdy ze starterów dobudowując drugą nić DNA na nici matrycowej, do której dołączył się starter. Cały proces zachodzi w termocyklerze, w którym programuje się temperaturę i czas trwania poszczególnych etapów reakcji oraz liczbę cykli. Powielone w reakcji PCR fragmenty DNA analizuje się następnie rozdzielając je elektroforetycznie w żelu agarozowym. Takie techniki stają się już standardem w dobrych laboratoriach diagnostycznych. 22 Metody Posiewy na podłoża Posiewu na podłoża stałe w płytkach Petriego dokonuje się w różny sposób – zależnie od celu takiego posiewu. Ważnym, bardzo często stosowanym przy izolacji i identyfikacji bakterii sposobem, prowadzącym do otrzymania pojedynczych kolonii jest posiew redukcyjny. Posiew ten wykonujemy tak, aby w kolejnych sektorach na powierzchni płytki znajdowało się coraz mniej bakterii. W poszczególnych etapach posiewu raz naniesiony materiał jest rozprowadzany na kolejne sektory płytki. Każdorazowe opalanie ezy przed rozsianiem bakterii w kolejnych strefach powoduje redukcję ich liczby do takiej ilości, przy której w ostatniej strefie uzyskany zostanie wzrost w postaci pojedynczych kolonii (Ryc. 1). Czasem istnieje potrzeba zasiania całej powierzchni płytki i uzyskania wzrostu w postaci jednolitej murawy. Takiego posiewu można dokonać wacikiem (tzw. wymazówką). Inokulum (porcję zakażającą) stanowi zwykle próbka pobrana nim z podłoża płynnego, którą rozprowadza się równomiernie na powierzchni podłoża w płytce. Taki typ posiewu znajduje zastosowanie w badaniu wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki metodą dyfuzyjno-krążkową. Ryc. 1. Schemat wykonania posiewu redukcyjnego 23 Morfologia kolonii W opisie morfologii kolonii, który wykorzystywany jest do celów diagnostycznych należy wziąć pod uwagę następujące jej elementy: - wielkość - średnica (mm); - kształt - okrągła, owalna, nitkowata, rozgałęziona nieregularna, ..; - brzeg - równy, postrzępiony, falisty, ząbkowany, ... ; - powierzchnię - gładka, lśniąca, matowa, pomarszczona, grudkowata, ... ; - wzniesienie (profil kolonii) - płaska, wypukła, pępkowata, wrastająca w podłoże, ... ; - przejrzystość - przezroczysta, opalizująca, mętna, ... ; - barwę - biała, kremowa, szara, czerwona, ... ; - otoczenie kolonii - zabarwienie, zmiana cech podłoża. MORFOLOGIA KOLONII KSZTAŁT KOLONII okrągła nieregularna nitkowata rozgałęziona promienisty POWIERZCHNIA gładka nitkowata szorstka pofałdowana nieregularna PROFIL KOLONII wypukła płaska soczewkowata pępkowata wrastająca w podłoże Ryc. 2. Cechy morfologiczne kolonii bakteryjnych 24 Badanie właściwości biochemicznych bakterii Do grupy licznych enzymów, których obecność u bakterii ma istotne znaczenia diagnostyczne należą katalaza i oksydaza cytochromowa. Wykrywa się je w prosty sposób a wynik oznaczeń uzyskujemy w czasie krótszym niż 1 minuta. Katalaza to enzym szeroko rozpowszechniony wśród bakterii. Występuje ona u większości bakterii tlenowych i względnie beztlenowych i niektórych beztlenowców. Enzym ten rozkłada toksyczny dla bakterii nadtlenek wodoru (H2O2) do wody i tlenu. Badanie w kierunku obecności katalazy jest szczególnie przydatne w różnicowaniu ziarenkowców i pałeczek gramdodatnich. W rutynowej diagnostyce bardzo często obecność tego enzymu wykorzystuje się w odróżnianiu gronkowców (Staphylococcus) od paciorkowców (Streptococcus). Oksydaza cytochromowa to końcowy enzym łańcucha oddechowego u bakterii oddychających tlenowo. Przenosi ona elektrony na tlen atmosferyczny z wytworzeniem wody. Próba na obecność tego enzymu ma duże znaczenie w różnicowaniu wielu grup bakterii w tym z rodziny Enterobacteriaceae zwyczajowo określanych jako pałeczki jelitowe, które są oksydazoujemne. Zadania do wykonania Zadanie 1. Charakterystyka kolonii bakteryjnej - Obejrzyj płytkę z podłożem agarowym, na której wyrosły pojedyncze kolonie. Powstały one w wyniku rozmnożenia się komórek bakterii i przetrwalników, które opadły na podłoże (sedymentowały) z powietrza. - Wybierz jedną kolonię i opisz ją uwzględniając wszystkie jej cechy. Opis kolonii: 25 Zadanie 2. Posiew redukcyjny Otrzymujesz hodowlę stałą bakterii na płytce Petriego. Drobnoustrój posiany został w sposób pasmowy, w którym nie można zaobserwować pojedynczych kolonii i zbadać czystości badanej hodowli. - Materiał z otrzymanej hodowli posiej redukcyjnie na płytkę agarową. - Podpisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37°C, 24 godziny). - Obejrzyj posiew zwracając szczególną uwagę na pojedyncze kolonie w trzeciej i czwartej strefie posiewu. - Opisz każdy z widocznych rodzajów kolonii. - Oceń czy badana przez ciebie próbka bakterii była hodowlą czystą czy mieszaną. Opisy kolonii: 26 Zadanie 3. Wykrywanie obecności katalazy Otrzymujesz hodowlę stałą Staphylococcus epidermidis na płytce Petriego. Drobnoustrój posiany został w sposób pasmowy. - Na środek szkiełka podstawowego nanieś kroplę 3% wody utlenionej. - Za pomocą ezy zawieś badane bakterie w odczynniku. - Zaobserwuj wydzielanie się pęcherzyków tlenu, które świadczy o próbie dodatniej. Zadanie 4. Wykrywanie obecności oksydazy cytochromowej Otrzymujesz hodowlę stałą Pseudomonas aeruginosa na płytce Petriego. Drobnoustrój posiany został w sposób pasmowy. - Nalej na wyrosłe bakterie kroplę odczynnika – 1 % wodny roztwór chlorowodorku tertrametylo-p-fenylenodiaminy. - Pojawienie się w ciągu 1 minuty granatowego zabarwienia bakterii świadczy o obecności enzymu – powstaje błękit indolofenolowy. 27 28 Rozdział 3 Mikrobiota człowieka a bakterie chorobotwórcze Część teoretyczna 3.1. Bakterie zasiedlające ciało zdrowego człowieka Organizm człowieka zasiedlają bardzo liczne drobnoustroje. Ich liczba wielokrotnie przewyższa liczbę komórek ciała. Drobnoustroje normalnie kolonizujące organizm człowieka nazywane były do niedawna jego normalną lub fizjologiczną (mikro)florą. Ta zwyczajowa nazwa pochodzi jeszcze z czasów, gdy bakterie i grzyby zaliczane były do roślin. Obecnie drobnoustroje te określa się mianem mikrobiota, które powoli wypiera stare określenie „flora”. Bakterie na naszym ciele żyją tylko w niektórych jego rejonach, są obecne na skórze, w przewodzie pokarmowym, na błonach śluzowych jamy ustnej, górnych dróg oddechowych, narządów moczowo-płciowych i spojówkach. Zasiedlanie ciała człowieka przez drobnoustroje zaczyna się w chwili narodzin. Przewód pokarmowy Najwięcej drobnoustrojów kolonizuje błony śluzowe przewodu pokarmowego (do 1012 jtk/g treści jelitowej). Metodami genetycznymi zidentyfikowano wśród nich kilkaset gatunków, z których większości nie udało się wyhodować. W początkowych odcinkach przewodu pokarmowego – przełyku, żołądku, dwunastnicy i początkowym odcinku jelita cienkiego – panują warunki niesprzyjające bytowaniu bakterii: niskie pH, szybka perystaltyka jelit, obecność żółci i enzymów trzustkowych. Drobnoustroje zasiedlają dopiero końcowe odcinki przewodu pokarmowego, pojawiają się w końcowym odcinku jelita cienkiego, licznie występują w jelicie krętym i najliczniej w jelicie grubym. 29 Właściwy skład mikrobiota przewodu pokarmowego ma istotny wpływ na funkcjonowanie organizmu. Metabolity wydzielane przez bakterie hamują rozwój drobnoustrojów chorobotwórczych i uniemożliwiają im kolonizację jelit, enzymy bakterii wspomagają trawienie pokarmów. Bakterie zasiedlające jelita odgrywają też znaczącą rolę w krążeniu i biotransformacji kwasów żółciowych, mają również udział w syntezie witamin: z grupy B (B2, B6, B12), witaminy K, kwasu foliowego i niektórych aminokwasów. Dzięki syntezie kwasów organicznych (masłowego, octowego i propionowego) „wspomagają energetycznie” komórki nabłonka jelita grubego – kolonocyty. W wieku 7-10 lat ustala się skład mikrobiota jelit i pozostaje niezmienny do starości. Wśród bakterii jelita grubego zdecydowanie dominują bezwzględne beztlenowce (około 90% bakterii), a wśród nich rodzaje Bacteroides, Bifidobacterium, Clostridium. Pozostałe to bakterie względnie beztlenowe: pałeczki Enterobacteriaceae – rodzaje Escherichia (występuje u wszystkich zdrowych ludzi), Proteus, Enterobacter, Klebsiella i inne, paciorkowce kałowe (enterokoki) – Enterococcus i wiele innych rodzajów. W przewodzie pokarmowym mogą bytować, nieraz przez długie okresy czasu bez szkody dla gospodarza, ulokowane tam po przebyciu czerwonki czy duru brzusznego lub salmonelloz, chorobotwórcze pałeczki: Shigella lub Salmonella. Obecnie zdarza się to już bardzo rzadko. Zjawisko to nazywane jest nosicielstwem i podlega kontroli sanitarnej w przypadku osób zatrudnionych w służbie zdrowia czy gałęziach gospodarki związanej z żywnością. Skóra Skóra jest największym organem organizmu człowieka, bezpośrednio łączącym go z otoczeniem. Drobnoustroje, które zasiedlają ją stale, w sposób niemożliwy do usunięcia, nazywamy rezydentami. Pojawiają się też na skórze drobnoustroje pochodzące ze środowiska, od innych ludzi czy zwierząt, kolonizujące ją przejściowo. Można je usunąć stosując zabiegi higieniczne. Mikrobiota skóry jest mniej liczna niż przewodu pokarmowego - około 106 jtk/cm2 skóry, należących do 15-20 gatunków bakterii i grzybów. Warunki panujące na skórze determinują rodzaj żyjących tam drobnoustrojów. Mała wilgotność, kwaśny odczyn, duże stężenie soli, obecność kwasów tłuszczowych i substancji o działaniu przeciwdrobnoustrojowym 30 (np. bakteriocyny, lizozym), złuszczanie warstwy rogowej naskórka sprawiają, że wśród drobnoustrojów skóry dominują bakterie gramdodatnie łatwiej pokonujące niekorzystne warunki środowiska. One także decydują o tzw. odporności kolonizacyjnej chroniąc skórę przed osiedlaniem się bakterii chorobotwórczych. Największą populację bakterii skóry stanowią gronkowce – Staphylococcus zasiedlające suche miejsca, kolejna co do wielkości grupa to gramdodatnie pałeczki z rodzaju Corynebacterium występujące w miejscach bogatych w gruczoły potowe, trzecią grupę tworzą beztlenowe pałeczki Propionibacterium zasiedlające rejony skóry obfitujące w gruczoły łojowe. Zdecydowanie mniejsze populacje tworzą na skórze bakterie gramujemne czy grzyby. Górne drogi oddechowe Na mikrobiota jamy ustnej i gardła składa się kilkaset gatunków bakterii zidentyfikowanych metodami genetycznymi, wielu z nich nie udało się dotąd wyhodować. Ekosystem jamy ustnej i gardła ulega zmianom w czasie życia człowieka a jego skład zależy od diety, dbałości o higienę i wieku. W jamie ustnej i gardle występują paciorkowce z rodzaju Streptococcus, pałeczki Haemophilus, Lactobacillus, ziarenkowce Neisseria, Veillonella, Staphylococcus, beztlenowce Bacteroides, a także nieliczne grzyby z rodzaju Candida. Nos i jama nosowo-gardłowa zasiedlane są mniej licznie bakteriami z rodzaju Staphylococcus (S. epidermidis), Streptococcus, Moraxella, Haemophilus, Corynebacterium. W tych przestrzeniach także stosunkowo często spotkać można drobnoustroje w sposób długotrwały je kolonizujące bez szkody dla gospodarza choć uznawane są za chorobotwórcze. Zjawisko to nazywamy nosicielstwem i w tych przestrzeniach dotyczy takich bakterii jak: Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis – czy Corynebacterium diphtheriae. To nosicielstwo nie wymaga jednak rejestracji, więc nie podlega formalnej kontroli sanitarnej. W niższych odcinkach dróg oddechowych liczba drobnoustrojów jeszcze maleje – w tchawicy są bardzo nieliczne i występują sporadycznie, a oskrzela, oskrzeliki i pęcherzyki płucne u zdrowych ludzi są wolne od drobnoustrojów. 31 Pochwa Mikrobiota pochwy stanowią liczne drobnoustroje a jej skład zmienia się w ciągu życia kobiety i zależy głównie od aktywności estrogenów. Pochwę kobiety w wieku rozrodczym zasiedlają głównie (ok. 96%) pałeczki kwasu mlekowego z rodzaju Lactobacillus (pałeczki Doederleina) fermentujące glikogen komórek nabłonka. W wyniku fermentacji powstaje kwas mlekowy zakwaszający środowisko pochwy do pH 3,6-4,6. Zapobiega to osiedlaniu się i namnażaniu drobnoustrojów chorobotwórczych. Po menopauzie ekosystem pochwy jest podobny do ekosystemu dziewcząt przed okresem pokwitania i tworzą go Staphylococcus epidermidis oraz bakterie z rodzajów Enterococcus, Corynebacterium, Bacteroides, Gardnerella. 3.2. Patogeny oportunistyczne Obniżenie ogólnej lub miejscowej odporności gospodarza, uszkodzenie skóry czy błon śluzowych lub naruszenie równowagi zasiedlających organizm drobnoustrojów może prowadzić do kolonizacji gatunkami potencjalnie chorobotwórczymi lub do nadmiernego rozmnożenia się pojedynczych gatunków mikrobiota. Może to skutkować infekcjami oportunistycznymi. Drobnoustroje je wywołujące nazywamy patogenami oportunistycznymi. Szczególnie niebezpieczne są te z nich, które bytując w środowisku szpitalnym nabyły wielorakiej oporności na antybiotyki i środki antyseptyczne. Mają one duży udział w infekcjach pacjentów leczonych antybiotykami, obciążonych schorzeniami metabolicznymi (np. cukrzyca) lub immunologicznymi (np. leczonych osłabiającymi odporność steroidami), dzieci z niedojrzałym układem immunologicznym, osób starszych i innych pacjentów szpitalnych. Względem takich pacjentów szczególną ostrożność muszą zachować osoby, które są nosicielami na skórze czy błonach śluzowych nosa. Jeśli wśród personelu medycznego są nosiciele drobnoustrojów chorobotwórczych mogą, nie stosując szczególnie rygorystycznie zasad higieny i postępowania aseptycznego, być źródłem zakażeń u pacjentów. Oporne na wiele antybiotyków i środków antyseptycznych i dezynfekcyjnych patogeny oportunistyczne stanowią szczególne niebezpieczeństwo w szpitalach. Nazywane są patogenami alarmowymi (alertpatogenami) i jest 32 o nich mowa w dalszej części tego rozdziału. Drobnoustroje te w szybki sposób, w ciągu kilkudziesięciu godzin, mogą skolonizować pacjentów przyjętych do szpitala, zastępując ich naturalne mikrobiota. W oczywisty sposób kolonizują też ciało personelu. Tak długo, jak występują w naturalnych dla danego gatunku proporcjach z innymi drobnoustrojami, nie stanowią jednak zagrożenia dla zdrowej osoby. Są jednak śmiertelnym zagrożeniem dla osób z zaburzoną odpornością lub leczonych antybiotykami, szczególnie szerokowidmowymi. 3.3. Bezwzględne patogeny. Chorobotwórczość bakterii Chorobotwórczość bakterii określa się jako potencjalną zdolność do wywoływania choroby. Za miarę chorobotwórczości uważa się zjadliwość, którą określa liczba bakterii niezbędnych do wywołania określonej choroby. Chorobotwórczość jest cechą gatunku i wynika z jego zdolności do wytwarzania substancji (białek powierzchniowych, enzymów, toksyn) określanych jako czynniki chorobotwórczości. W obrębie jednego gatunku mogą występować szczepy różniące się zjadliwością i wytwarzaniem czynników chorobotwórczości. Najważniejsze, najczęściej występujące czynniki chorobotwórczości bakterii to: - adhezyny bakteryjne – struktury komórkowe umożliwiające bakteriom wiązanie się z odpowiednimi komórkami gospodarza i kolonizację; adhezyny pozwalają na późniejsze rozrastanie się tzw. biofilmów bakteryjnych – struktur zbudowanych z komórek i otaczających je glikoprotein, w których populacje bakterii (zarówno naturalnie zasiedlających ciało, jak i chorobotwórczych), bytują w organizmie. Była o nich mowa w rozdziale 1. - substancje warunkujące inwazyjność bakterii: enzymy odpowiedzialne za rozprzestrzenianie się bakterii w głąb tkanek – kolagenaza i inne proteazy, hialuronidaza; otoczki chroniące bakterie przed fagocytozą przez komórki układu immunologicznego gospodarza. - toksyny: niebiałkowe, jak lipopolisacharydy (LPS) stanowiące element ściany komórkowej bakterii gramujemnych uwalniane po rozpadzie komórki, które mają działanie pirogenne, powodują leukopenię, hipoglikemię, hipotensję i w odpowiedniej dawce powodują wstrząs endotoksyczny; białkowe, które ze względu na mechanizm działania można podzielić na: 33 enterotoksyny – działające na komórki nabłonka jelit, neurotoksyny – działające na komórki układu nerwowego, cytotoksyny – działające toksycznie na różne rodzaje komórek. Niektóre toksyny białkowe mają właściwości immunomodulujące – nieswoiście stymulują układ immunologiczny aktywując dużą liczbę limfocytów T co w konsekwencji prowadzi do wstrząsu. Nazywamy je toksynami immunomodulującymi lub superantygenami. 3.4. Systematyczny przegląd bakterii najważniejszych w patologii człowieka Bakteriologia szczegółowa to duży dział mikrobiologii. Liczba gatunków i różnorodność w świecie bakterii jest ogromna. Dotyczy to także tych, które blisko związane są z ciałem człowieka. Te z nich, które tworzą naturalne mikrobiota przedstawiono w rozdziale 3.1. Są bardzo ważne w sensie klinicznym, gdyż jak wspomniano, stanowią o chroniącej przed drobnoustrojami chorobotwórczymi odporności kolonizacyjnej, a świadomość ich obecności jest niezwykle ważna dla personelu medycznego. W poniższej tabeli zestawiono te spośród bakterii, które najczęściej są izolowane. O wywoływanych przez nie chorobach będzie mowa na wykładach. Należy jednak pamiętać o setkach innych gatunków, których tu nie wymieniono, a które też mogą wywoływać choroby. 34 Tabela 3.1. Wybrane bakterie najczęściej izolowane z materiałów klinicznych od ludzi Bakterie gramdodatnie Rodzaj Gatunek Występowanie Chorobotwórczość Staphylococcus Staphylococcus U chorych Chorobotwórczy aureus – (ropa, krew), gronkowiec złocisty u nosicieli na skórze, w środowisku (kurz, żywność) Streptococcus Staphylococcus epidermidis – gronkowiec naskórkowy Streptococcus pyogenes – paciorkowiec ropotwórczy Składnik mikrobiota skóry i błon śluzowych U chorych (gardło, krew), u nosicieli na błonach śluzowych nosogardzieli Patogen oportunistyczny Zakażenia szpitalne Streptococcus pneumoniae – paciorkowiec zapalenia płuc U chorych (gardło, płyn z BAL), u nosicieli na błonach śluzowych nosogardzieli Chorobotwórczy Streptococcus mitior – paciorkowiec jamy ustnej Składnik mikrobiota błon śluzowych jamy ustnej i układu oddechowego Patogen oportunistyczny Chorobotwórczy 35 Enterococcus Clostridium Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis – paciorkowce kałowe Clostridium botulinum – laseczka jadu kiełbasianego Jelito grube człowieka i zwierząt Gleba, przewód pokarmowy ludzi i zwierząt. Clostridium tetani – U chorych laseczka tężca (kał), chorobę powodują Clostridium difficile toksyny wydzielane – laseczka rzekomobłoniastego przez te poantybiotykowego laseczki. zapalenia jelit Patogeny oportunistyczne Chorobotwórcze Clostridium perfringens – laseczka zgorzeli gazowej Mycobacterium Mycobacterium tuberculosis subsp. tuberculosis – prątek gruźlicy ludzki U chorych (plwocina) Chorobotwórczy Mycobacterium bovis subsp. bovis – prątek gruźlicy bydlęcy U chorych (plwocina), chore bydło Chorobotwórczy Prątki mikobakterioz Zwierzęta, woda, gleba Patogeny oportunistyczne 36 Rodzaj Haemophilus Escherichia Bakterie gramujemne Gatunek Występowanie Haemophilus U chorych influenzae (gardło, popłuczyny), mikrobiota błon Haemophilus śluzowych parainfluenzae górnych dróg oddechowych ludzi Escherichia coli – Mikrobiota pałeczka okrężnicy jelit ludzi i zwierząt Proteus Proteus vulgaris Proteus mirabilis - pałeczki odmieńca Klebsiella Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae – pałeczka zapalenia płuc Salmonella Salmonella enterica Serowary: Salmonella Typhi Salmonella Typhimurium Salmonella Enteritidis Mikrobiota jelit ludzi i zwierząt, woda, gleba U chorych (gardło, płyn z BAL). Mikrobiota jelit ludzi i zwierząt U chorych (kał). Przewód pokarmowy nosicieli. Jedynym rezerwuarem jest człowiek. Kolonizują wiele zwierząt, kontaminują żywność (szczególnie drób i nabiał). Chorobotwórczość Szczepy otoczkowe głównie serotypu b – chorobotwórcze Patogeny oportunistyczne Patogen oportunistyczny. Chorobotwórcze serotypy. Patogeny oportunistyczne Zakażenia szpitalne Chorobotwórcza Zakażenia szpitalne Chorobotwórcze 37 Shigella Bacteroides Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei Bacteroides fragilis Pseudomonas Pseudomonas aeruginosa – pałeczka ropy błękitnej Acinetobacter Acinetobacter spp. Neisseria Neisseria meningitidis – dwoinka nagminnego zapalenia opon mózgowordzeniowych (meningokok) U chorych (kał). Jelito grube nosicieli Chorobotwórcze Mikrobiota, dominuje w jelicie grubym Przewód pokarmowy ludzi i zwierząt, gleba, woda, ścieki syfony umywalek, zlewy, natryski. Patogen oportunistyczny Przewód pokarmowy ludzi i zwierząt, gleba, woda, ścieki, syfony umywalek, zlewy, natryski. U chorych (płyn mózgowordzeniowy), u nosicieli na śluzówkach gardła Patogen oportunistyczny Zakażenia szpitalne Patogen oportunistyczny Zakażenia szpitalne Chorobotwórcze 38 Treponema Borrelia Neisseria gonorrhoeae – dwoinka rzeżączki (gonokok) Treponema pallidum subsp. pallidum – krętek kiły Borrelia burgdorferi – krętek boreliozy z Lyme U chorych (wydzielina) i zakażonych bezobjawowo U chorych (wydzielina z owrzodzeń) U chorych (bioptaty), w organizmach jeleni, gryzoni, kleszczy Chorobotwórczy Chorobotwórczy 39 40 Rozdział 4 Znaczenie badań mikrobiologicznych dla leczenia zakażeń Część teoretyczna Rozpoznawanie chorób infekcyjnych opiera się na wielu parametrach. Obok objawów klinicznych – szereg zakażeń tzw. swoistych ma charakterystyczny przebieg, najistotniejszym i przynoszącymi najdokładniejszą wiedzę są badania mikrobiologiczne (izolacja patogenu) i oznaczenia serologiczne (obecność i poziom przeciwciał). Podstawy identyfikacji drobnoustrojów oparte na tych technikach przedstawione zostały już w rozdziale 2. Badanie bakteriologiczne przynosi jednak szansę na poznanie, obok nazwy patogenu, także jego wrażliwości na antybiotyki, a tym samym zastosowanie tzw. antybiotykoterapii celowanej gwarantującej w największym stopniu skuteczne leczenie. Jego warunkiem jest jednak znalezienie tego patogenu, który jest rzeczywistym czynnikiem etiologicznym choroby. Nie jest to łatwe, gdyż jak to pokazano wcześniej, w organizmie bytuje wiele bakterii. Sukces w ogromnym stopniu zależy od prawidłowego pobrania i transportu próbki do laboratorium. W tym zadaniu kluczowy udział ma personel pielęgniarski. 4.1. Materiał do badań mikrobiologicznych Pobieranie Materiały do badań mikrobiologicznych, zależnie od ich rodzaju mogą być pobierane przez lekarza, pielęgniarkę, diagnostę laboratoryjnego lub samego pacjenta. Aby wynik badania był wiarygodny należy pobierać materiał odpowiedni do miejsca toczącej się infekcji i w odpowiednim czasie (np. materiał z układu oddechowego i moczowo-płciowego pobiera się zwykle rano, krew – kilka próbek w ciągu doby, często tuż przed szczytem gorączki). Niektóre materiały powinny być posiewane bezpośrednio przy łóżku chorego. Materiał należy pobrać przed zastosowaniem leków przeciwdrobnoustrojowych, a gdy to jest niemożliwe odnotować na 41 skierowaniu od kiedy i jakie leki przyjmuje pacjent. Ilość pobranego materiału musi wystarczyć do przeprowadzenia badania. Osoby pobierające materiał od pacjenta powinny stosować środki ochrony osobistej (fartuch, rękawiczki, okulary). Niektóre materiały kliniczne są pobierane wyłącznie przez lekarzy w trakcie wykonywania różnych procedur medycznych (np. nakłucia lędźwiowego). Personel pielęgniarski najczęściej pobiera samodzielnie krew i wymazy oraz towarzyszy lub instruuje pacjentów w kwestii pobierania materiałów takich jak mocz, kał czy plwocina. Transport Priorytetową zasadą musi być jak najszybsze dostarczenie pobranych materiałów klinicznych do laboratorium. Materiał musi być pobrany do odpowiednich, jałowych, szczelnie zamykanych pojemników, zestawów zawierających podłoża transportowe lub bezpośrednio do podłoży hodowlanych (np. krew). O podłożach tych była mowa w rozdziale 2. Czasami podłoża te powinny być uprzednio ogrzane. W temperaturze poniżej 30oC niektóre bakterie zginą (np. Neisseria meningitidis). Krew, płyn mózgowo-rdzeniowy czy materiały, w których możliwa jest obecność bakterii bardzo wrażliwych na czynniki fizykochemiczne (dwoinki rzeżączki, mikoplazmy, chlamydie, bakterie beztlenowe) muszą być dostarczone do laboratorium natychmiast. Niektóre materiały kierowane do diagnostyki bakteriologicznej (np. mocz) można przechować w lodówce, ale nigdy nie wolno ich zamrażać. Zamrażać można jednak materiały kierowane do diagnostyki wirusologicznej. Pozostawienie materiału w temperaturze pokojowej skutkuje namnożeniem się bakterii, a wtedy ocena ilościowa, bardzo istotna np. w badaniu moczu, jest niemożliwa, a namnożenie naturalnych mikrobiota może zagłuszyć wzrost patogenów. 42 Dokumentacja Do każdej oznakowanej próbki należy dołączyć dokumentację zawierającą dane: imię i nazwisko pacjenta, wiek, adres/oddział szpitalny i datę przyjęcia do szpitala, rodzaj materiału, rozpoznanie kliniczne, kierunek badań, datę pobrania materiału (gdy krew na posiew, to także godzinę), nazwisko i kontakt do lekarza kierującego. Dla każdego rodzaju próbek powinna być stosowana odpowiednia szczegółowa procedura. Pobieranie materiału do badania krwi • Krew do badań mikrobiologicznych należy pobierać z żyły pacjenta, nie wolno jej pobierać z założonego na stałe cewnika. • Bardzo ważne jest uniknięcie kontaminacji krwi bakteriami ze skóry, dlatego miejsce wkłucia należy odkazić 70% alkoholem etylowym lub izopropylowym, a po wyschnięciu np. 2% roztworem jodyny i ponownie zmyć 70% alkoholem. • Krew pobiera się używając specjalnych zestawów (system zamknięty) bezpośrednio do ogrzanych (35-37°C) odpowiednich podłoży hodowlanych po uprzednim odkażeniu gumowego korka 70% alkoholem. Najczęściej od dorosłych pobiera się około 10-15 mL krwi do standardowej butelki z podłożem. Pożywki należy natychmiast dokładnie wymieszać z krwią. • Pobrane próbki należy natychmiast dostarczyć w pojemniku termoizolacyjnym do laboratorium lub, jeśli to jest niemożliwe, umieścić w cieplarce. • W żadnym przypadku podłoży nie wolno wychładzać. Pobieranie wymazów, ropy, wydzielin Wymazy pobiera się jałowymi pałeczkami z końcówkami pokrytymi watą bawełnianą, wiskozową lub z włókien sztucznych: dakronu czy alginianu wapnia umieszczonymi w jałowych probówkach. Nazywamy je wymazówkami lub wacikami. Przed pobraniem z suchych miejsc należy je 43 zwilżyć przez zanurzenie w jałowym roztworze fizjologicznym NaCl. Przy pobieraniu ropy czy wydzielin należy zanurzyć wymazówkę w płynie w środkowej części zmiany oraz na drugą pobrać materiał z jej pogranicza. Gdy płynu jest dużo, lepiej pobrać go strzykawką do jałowego pojemnika. Materiał z ropni zamkniętych pobiera się zawsze przez ich nakłucie i przesyła w strzykawce. Materiał, gdy to możliwe, należy pobierać na dwie wymazówki (jedna służy do wykonania posiewu, druga do wykonania preparatu) i natychmiast wysłać do laboratorium, gdzie powinny być zbadane w ciągu 2 godzin. Jeśli nie można tego spełnić korzysta się z zestawów transportowych, w których wymazówkę umieszcza się w probówce wypełnionej odpowiednim podłożem transportowym. Pobieranie moczu Jeśli mocz jest pobierany samodzielnie przez pacjenta trzeba dokładnie zapoznać go z procedurą i zaopatrzyć w jałowy pojemnik. • • • • Mocz do badania mikrobiologicznego należy pobierać po nocnej przerwie lub 4 godzinach od ostatniego oddania, jeśli tylko to możliwe przed rozpoczęciem leczenia. Przed pobraniem należy dokładnie umyć wodą i mydłem ręce i okolice ujścia cewki moczowej. Materiał pobiera się do jałowego pojemnika ze środkowego strumienia swobodnie oddanego moczu co oznacza, że pierwszą porcję moczu należy oddać do toalety (około połowę zawartości pęcherza), a następnie pobrać mocz do pojemnika nie dotykając jego brzegów ani wewnętrznej powierzchni. Pojemnik należy natychmiast zamknąć i dostarczyć do laboratorium. Jeśli to jest niemożliwe można pojemnik z moczem przechować do 4 godzin w lodówce. Do badania wystarczy 3-5 mL moczu, jednak gdy chcemy wykryć prątki pobieramy 200 mL. Do badania można także pobrać mocz z cewnika (ale nie z worka) lub nakłucia nadłonowego pęcherza. 44 Pobieranie kału Jeśli kał jest pobierany samodzielnie przez pacjenta trzeba dokładnie zapoznać go z procedurą i zaopatrzyć w jałowy pojemnik. • • • • Przed oddaniem kału pacjent powinien całkowicie opróżnić pęcherz moczowy. Kał powinien być oddany do wyparzonego naczynia, skąd z zachowaniem aseptyki należy pobrać grudkę o objętości ok. 1cm3 do specjalnego, zaopatrzonego w łopatkę jałowego pojemnika lub też pobrać próbkę zanurzając wymazówkę zestawu transportowego w kilku miejscach kału (szczególnie takich, gdzie występuje śluz, krew, ropa). Gdy nie można pobrać kału, lub w badaniach przesiewowych, należy wykonać wymaz z odbytu wymazówką wsuniętą około 5 cm poza zwieracz odbytu. Wymazówkę następnie umieszcza się w jałowej probówce zawierającej bufor fosforanowy z glicerolem. W ciągu 2 godzin materiał powinien być dostarczony do laboratorium. Pobieranie plwociny • • Plwocinę (kilka mL) pacjent powinien odkrztusić (niekiedy wymaga to stymulacji środkami wykrztuśnymi) na czczo, po uprzednim wypłukaniu jamy ustnej wodą w celu usunięcia śliny, do jałowego pojemnika z szerokim otworem. Po pobraniu naczynie trzeba natychmiast zamknąć nie dotykając brzegów ani wewnętrznej części nakrętki. Analizą próbek, identyfikacją drobnoustrojów i oceną antybiotykowrażliwości zajmują się diagności laboratoryjni w pracowni mikrobiologicznej laboratorium analitycznego. Najlepiej jeśli pracownia taka znajduje się blisko ambulatorium lub na terenie szpitala, z którego pochodzą materiały do badania i jest utrzymywany bliski kontakt między jej pracownikami i personelem oddziału. 45 4.2. Wybór antybiotyków do terapii przeciwdrobnoustrojowej W leczeniu zakażeń bakteryjnych często sięga się po antybiotyki. Decyzja taka powinna jednak być przemyślana i oparta na zasadach tzw. racjonalnej antybiotykoterapii. Najlepszy skutek osiąga się stosując terapię celowaną, to znaczy taką, w której po wcześniejszym wyizolowaniu bakterii stanowiących czynnik etiologiczny choroby oznaczono ich wrażliwość na antybiotyki poprzez wykonanie antybiogramu albo, lepiej, określono najmniejsze stężenie właściwego antybiotyku zdolne zahamować wzrost tych bakterii (MIC – ang. minimal inhibitory concentration). Niekiedy jednak terapię, w oczekiwaniu na wynik badania lub gdy nie jest możliwe jego wykonanie, prowadzi się jako antybiotykoterapię empiryczną, to znaczy dobiera się antybiotyk szacując, jakie drobnoustroje mogą być odpowiedzialne za chorobę i teoretycznie, jakie antybiotyki mogą być przydatne w ich niszczeniu. Ten sposób nie uwzględnia jednak nabytej oporności bakterii i taka terapia może okazać się nieskuteczna. Leki przeciwbakteryjne mogą powstrzymywać mnożenie się bakterii, ale nie powodować ich śmierci (działać bakteriostatycznie). Zwykle pozwala to układowi odpornościowemu skutecznie zwalczyć infekcję. Niektóre z nich działają bakteriobójczo, powodując śmierć bakterii, ale tym samym powodując ich rozpad i uwolnienie toksycznych elementów komórek. Leki przeciwbakteryjne wykazują różny zakres, czyli spektrum działania. Antybiotyk nazwiemy szerokowidmowym, gdy działa na wiele grup bakterii, w tym gramdodatnie i gramujemne lub wąskowidmowym - działającym na wąską grupę, jak tylko na gramujemne pałeczki albo prątki. Spośród wymienionych w poniższej tabeli, do ważnych terapeutycznie, szerokowidmowych leków należą niektóre penicyliny półsyntetyczne (amoksycylina i ampicylina), cefalosporyny, tetracykliny i karbapenemy. Węższe spektrum mają aminoglikozydy i makrolidy. Wąskowidmowe są penicyliny naturalne (penicylina G) i kloksacylina, monobaktamy, metronidazol, a także glikopeptydy. W tabeli 4.2. wymieniono najważniejsze grupy, ale tylko niektóre preparaty. Przytoczone nazwy są nazwami międzynarodowymi, nazwy handlowe są bardzo różne i zależą od firm farmaceutycznych, które jednak mają obowiązek umieszczać na opakowaniach i w ulotkach także nazwy międzynarodowe. Optymalne z punktu widzenia dobra pacjenta, skuteczności leczenia i racjonalnej terapii jest stosowanie terapii celowanej najlepiej antybiotykiem wąskowidmowym, gdyż niszczy się wtedy bakterie 46 patogenne, a minimalizuje się niekorzystne działanie niszczące naturalne mikrobiota tak potrzebne dla zachowania zdrowia. Tabela 4.1. Antybiotyki i chemioterapeutyki najczęściej stosowane w lecznictwie Grupa Wybrane Spektrum (zakres) działania preparaty Penicylina G G(+) i nieliczne G(-) I generacja Cefalosporyny β-laktamy Penicyliny II generacja III generacja IV generacja Monobaktamy Karbapenemy Glikopeptydy Kloksacylina Amoksycylina Ampicylina Ko-amoksiklav (amoksycylina + kwas klawulanowy) Tikarcylina Piperacylina Cefradyna Cefaklor Cefazolina Cefuroksym Cefoksytyna G(+) G(+) i wiele (G-) G(+) i wiele (G-) oraz bakterie wytwarzające β-laktamazy G(-), słabiej na G(+) G(+) , G(-), tlenowe i beztlenowe silniej G(+), słabiej G(-) silniej G(-), słabiej G(+) Ceftazydym Cefotaksym Ceftriakson Cefepim G(+) i G(-) Aztreonam Imipenem Meropenem Wankomycyna Teikoplanina G(-) G(+) i G(-) G(+) i G(-) (najszersze spektrum ) G(+) 47 Aminoglikozydy Nitroimidazole Rifamycyny Gentamicyna Amikacyna Netilmycyna Tobramycyna Streptomycyna Erytromycyna Klaritromycyna Azitromycyna Oksytetracyklina Doksycyklina Klindamycyna Linezolid Ciprofloksacyna Ofloksacyna Gatifloksacyna Moksifloksacyna Metronidazol Rifampicyna Sulfonamidy Trimetoprim Nitrofurany Sulfametoksazol Trimetoprim Furagina Makrolidy Tetracykliny Linkozamidy Oksazolidynony Fluorochinolony G(-), słabiej na G(+) G(+), słabo G(-), aktywne wobec chlamydii, mikoplazm i bakterii wewnątrzkomórkowych G(+) i G(-), chlamydie, riketsje i krętki G(+) i beztlenowe G(-) G(+), niektóre beztlenowce G(-), aktywne wobec Chlamydia, Mycoplasma, Legionella, Mycobacterium tuberculosis beztlenowce G(+), Mycobacterium tuberculosis G(+) i G(-) G(+) i G(-) G(+) i G(-) 4.3. Zakażenia szpitalne U osób hospitalizowanych, ale także przebywających w innych zakładach opieki zdrowotnej mogą rozwinąć się zakażenia określane jako zakażenia szpitalne. Wg właściwej ustawy określane są one jako „zakażenie, które wystąpiło w związku z udzieleniem świadczeń zdrowotnych, w przypadku gdy choroba: a) nie pozostawała w momencie udzielania świadczeń zdrowotnych w okresie wylęgania albo b) wystąpiła po udzieleniu świadczeń zdrowotnych, w okresie nie dłuższym niż najdłuższy okres jej wylegania.” Ta urzędowa definicja wskazuje problem, który jest jednak w leczeniu szpitalnym nieunikniony, gdyż zakażenia takie zdarzają się we wszystkich szpitalach i wynikają, paradoksalnie, w dużej mierze, z ryzyka zabiegów najnowszej medycyny. Ważne jest jednak, żeby nie były efektem zaniedbań w postępowaniu aseptycznym. Jakość tego postępowania zależy 48 w największym stopniu od personelu pielęgniarskiego, on też jest kluczowym strażnikiem odpowiednich procedur w tej dziedzinie. Najtrudniejsze w opanowaniu są te zakażenia szpitalne, w których czynnikiem etiologicznym są patogeny alarmowe (tabela 4.2). Są to szczepy bakterii, które nabywszy geny wielooporności selekcjonują się i przeżywają w środowisku szpitala stanowiąc śmiertelne zagrożenie dla pacjentów, ale także i personelu. Także bowiem i jego mogą dotyczyć zakażenia szpitalne. Tabela 4.2. Patogeny alarmowe wg rozporządzenia Ministra Zdrowia z dn. 23.12.2011 r. Drobnoustrój Cechy Fenotyp oporności Staphylococcus aureus – MRSA – szczepy oporne na wszystkie gronkowiec złocisty oporne na meticylinę antybiotyki βlaktamowe; często również na antybiotyki z innych grup VISA – szczepy o obniżona wrażliwość na obniżonej wrażliwości wankomycynę na wankomycynę VRSA – szczepy oporne na wankomycynę oporne na wankomycynę szczepy oporne na oksazolidynony Streptococcus pneumoniae – dwoinka zapalenia płuc PRSP – oporne na penicylinę szczepy Streptococcus pneumoniae oporne na penicyliny i cefalosporyny III generacji Enterococcus spp. – paciorkowce kałowe VRE – szczepy oporne na wankomycynę oporne na wankomycynę 49 Enterobacteriaceae ESBL – β-laktamazy o rozszerzonym spektrum AMPc – cefalosporynazy KPC – karbapenemazy Pseudomonas aeruginosa – pałeczka ropy błękitnej MBL – metalo-βlaktamazy Acinetobacter spp. MBL – metalo-βlaktamazy Clostridium difficile – laseczka rzekomobłoniastego poantybiotykowego zapalenia jelit Clostridium perfringens – laseczka zgorzeli gazowej Candida spp. toksyny A i B oporne na antybiotyki βlaktamowe z wyjątkiem karbapenemów oporne na penicyliny, cefalosporynę (z wyjątkiem IV generacji) i aztreonam oporne na antybiotyki β-laktamowe także karbapenemy oporne na antybiotyki β-laktamowe także karbapenemy oporne na antybiotyki β-laktamowe także karbapenemy toksyny oporne na flukonazol lub inne leki z grupy azoli lub kandyn Aspergillus spp. Wirusy: rotawirus, norowirus, RSV, HBV, HCV, HIV W każdym szpitalu zakażenia szpitalne muszą być rejestrowane, przez specjalny zespół ds. zakażeń szpitalnych, który pełni nadzór nad zapobieganiem, ustalaniem przyczyn i likwidowaniem ich skutków. W skład tego zespołu wchodzić musi osoba ze specjalizacją w dziedzinie pielęgniarstwa epidemiologicznego (Dz.U.2010, nr 107, poz.706). 50 Metody Do izolacji gronkowców z materiału klinicznego używa się między innymi wybiórczego podłoża Chapmana. W tym podłożu jest duże stężenie NaCl (7,5%) tolerowane przez gronkowce, a hamujące wzrost licznych bakterii, głównie gramujemnych. Rozkład zawartego w pożywce mannitolu pozwala na różnicowanie gatunków rodzaju Staphylococcus. Gatunki rozkładające mannitol (np. S. aureus) rosną w postaci żółtych kolonii i zabarwiają na żółto wyjściowo różowe podłoże. Jednym z podłóż do izolacji pałeczek gramujemnych jest podłoże MacConkey’a. Bakterie gramdodatnie na nim nie rosną. Podłoże zawiera laktozę i wskaźnik, co pozwala różnicować bakterie laktozododatnie z tymi, które nie rozkładają laktozy. Kolonie bakterii rozkładających laktozę zabarwiają się na różowo. Oznaczanie wrażliwości na antybiotyki: antybiogram Badanie wykonuje się w ściśle standaryzowanych warunkach, używając atestowanych krążków bibułowych nasączonych antybiotykami. Na wynik antybiogramu, obok wrażliwości bakterii, ma wpływ szereg czynników związanych z jego wykonaniem. Wykonanie: • Należy zebrać 1-3 takich samych kolonii z płytki ze świeżą czystą hodowlą wcześniej zidentyfikowanego szczepu izolowanego od pacjenta i przygotować zawiesinę w fizjologicznym roztworze NaCl o gęstości odpowiadającej wzorcowi nr 0,5 wg skali McFarlanda (tj. 1,5x 108CFU/mL); • zawiesinę posiać wacikiem na powierzchnię płytki z podłożem Muellera-Hinton (w postaci jednolitej murawy); • wybrać odpowiednie krążki z lekami (korzystając z instrukcji Ośrodka Referencyjnego) i ułożyć je na płytce, używając jałowej pęsety lub dyspensera (na płytce 90 mm nie więcej niż 5–6 krążków); • płytki umieścić w ciągu 15 minut w cieplarce w temperaturze 37°C i inkubować przez 20 godzin; 51 • a po inkubacji zmierzyć przezroczystą linijką strefy zahamowania wzrostu wokół krążków (mm); mierząc poprzez krążek od jednej do drugiej krawędzi koła tej strefy i sprawdzić w tabeli stopień wrażliwości. Oznaczanie MIC metodą rozcieńczeniową Oznaczenie to najczęściej przeprowadza się na podłożu płynnym w probówkach lub dołkach płytki titracyjnej. Przygotowuje się stanowiącą inokulum zawiesinę badanego szczepu bakterii w roztworze fizjologicznym NaCl o gęstości odpowiadającej nr 0,5 wg skali McFarlanda tj. 1,5x 108 CFU/mL i rozcieńcza się ją w pożywce 102 razy. Wykonanie: • Należy przygotować szereg kolejnych dwukrotnych rozcieńczeń antybiotyku w pożywce płynnej, ostatnia probówka (dołek) szeregu stanowi kontrolę wzrostu badanego szczepu, więc nie dodajemy do niej antybiotyku; • do tych rozcieńczeń i probówki kontrolnej dodaje się po 50 μL wcześniej przygotowanego inokulum bakterii; • po inkubacji w cieplarce 37°C 20 godzin ocenia się makroskopowo wzrost bakterii lub odczytuje zmętnienie w odpowiednim czytniku. Stężenie antybiotyku w ostatniej probówce (dołku), w której brak jest wzrostu bakterii określa wartość MIC. Oznaczenie MIC metodą E-testu E-test jest paskiem nasączonym antybiotykiem. W pasku tym utworzono gradient jego stężeń; ich wartości opisane są liczbowo na jego powierzchni. Paski układa się na odpowiednim podłożu zasianym standaryzowaną zawiesiną badanego szczepu podobnie, jak krążki w antybiogramie. Podczas inkubacji w cieplarce (37°C 20 godzin) antybiotyk, dyfundując z paska do podłoża, spowoduje zahamowanie wzrostu bakterii. Strefa zahamowania wzrostu jest coraz węższa wraz ze zmniejszaniem się stężenia antybiotyku, aż wreszcie dotyka krawędzi paska wskazując wartość MIC. Przy niższych wartościach (stężeniach antybiotyku) wzrost bakterii dotyka już do paska. 52 Zadania do wykonania Zadanie 1. Wykonanie i badanie wymazu z nosa -Jałowy wacik (wymazówkę) zwilż w jałowym roztworze NaCl. -Wykonaj wymaz pocierając watką o ściany przedsionka nosa. -Posiej pobrany materiał z wacika na agar z krwią metodą redukcyjną. -Płytkę inkubuj w cieplarce w 37°C przez około 20 godzin. Opisz kolonie wyrosłe na płytce: - Jaki rodzaj hemolizy wytwarzają (α, β): - Które z nich wytwarzają katalazę? 53 Zadanie 2. Wykonanie i badanie wymazu z jamy ustnej (badanie śliny) -Jałową wymazówkę zwilż obficie w ślinie, potrzyj nią powierzchnię języka, dziąseł i błony śluzowej policzków. -Posiej pobrany materiał z wacika na agar z krwią metodą redukcyjną. -Płytkę inkubuj w cieplarce w 37°C przez około 20 godzin. Opisz kolonie wyrosłe na płytce: -Jaki rodzaj hemolizy wytwarzają (α, β): -Które z nich wytwarzają katalazę? 54 Zadanie 3. Wykonanie odcisku skóry dłoni - Opuszki palców prawej dłoni odciśnij lekko na powierzchni agaru z krwią. Płytkę inkubuj w cieplarce w 37°C przez około 20 godzin. Opisz kolonie wyrosłe na płytce: -Jaki rodzaj hemolizy wytwarzają (α, β): -Które z nich wytwarzają katalazę? Zadanie 4. Oznaczanie MIC antybiotyków - Odczytaj wynik gotowego oznaczenia MIC, wykonanego wcześniej metodą rozcieńczeń w pożywce płynnej. Zaznacz w poniższej tabeli, w których probówkach wystąpił wzrost. - Uwzględniając wyjściowe stężenie antybiotyku i rozcieńczenia w kolejnych probówkach (dołkach) wylicz jakie było stężenie antybiotyków w kolejnych probówkach. - Czy wynik kontroli jest prawidłowy? 55 - Wskaż (obwiedź kółkiem) wartości MIC gentamicyny i tetracykliny dla badanego szczepu E. coli. Nr probówki 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Kontrola wzrostu bez GENTAMICYNA antybiotyku Wzrost szczepu badanego Rozcieńczenie 1:2 antybiotyku Stężenie gentamicyny (µg/mL) Kontrola wzrostu bez TETRACYKLINA antybiotyku Wzrost szczepu badanego Rozcieńczenie 1:2 antybiotyku Stężenie tetracykliny (µg/mL) Zadanie 5. Odczytanie i interpretacja antybiogramów demonstracyjnych. Ocena spektrum działania antybiotyków Przygotowano antybiogramy dla szczepów wzorcowych, czyli takich, które wykazują naturalną wrażliwość i nie zawierają genów oporności nabytej. - Zmierz średnice stref zahamowania wzrostu wokół krążków ułożonych na płytce. - Oceń działanie antybiotyków względem badanych szczepów. Zapisz w tabeli. 56 Antybiotyk S. aureus (strefa mm) E. coli (strefa mm) Ocena wrażliwości (wg tabeli rekomendacji) 57 Te antybiogramy, ponieważ zostały wykonane dla szczepów wzorcowych, pozwalają ocenić spektrum antybiotyków. Wąskowidmowe antybiotyki to: Szerokowidmowe antybiotyki to: Do badania wrażliwości gronkowców nie należy używać krążków z: gdyż bakterie te naturalnie są na nie oporne. Leczenie tymi antybiotykami zawsze będzie nieskuteczne. Do badania wrażliwości pałeczki okrężnicy nie należy używać krążków z: gdyż bakterie te naturalnie są na nie oporne. Leczenie tymi antybiotykami zawsze będzie nieskuteczne. 58 59 60 Rozdział 5 Sterylizacja, dezynfekcja i antyseptyka Część teoretyczna 5.1. Drobnoustroje w otoczeniu i zagrożenia wynikające z ich obecności Drobnoustroje występują powszechnie, zarówno w środowisku (glebie, powietrzu, wodzie), jak i na skórze oraz błonach śluzowych człowieka. Dotąd nie udało się opisać wszystkich występujących na Ziemi bakterii, uważa się również że jedynie ok. 10% spośród poznanych gatunków bakterii nauczono się hodować w warunkach laboratoryjnych. Poza bakteriami, istotne znaczenie w patologii człowieka mają również grzyby, a także liczne wirusy. Dla zdrowego człowieka zdecydowana większość bakterii nie jest zagrożeniem, część z nich stanowi wręcz fizjologiczną mikrobiota (np. skóry czy przewodu pokarmowego) i wywiera pozytywny wpływ na funkcjonowanie ludzkiego organizmu. Jednak nawet te bakterie mogą wywołać zakażenie o ciężkim przebiegu jeśli przedostaną się do płynów ustrojowych (m.in. krew, mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy) lub jam ciała (m.in. dolne drogi oddechowe, jamy serca, jama otrzewnej, jama opłucnej), które w naturalnych warunkach są jałowe. Wywołują wówczas inwazyjne zakażenia, mogąc rozprzestrzeniać się w organizmie człowieka, a także intensywną odpowiedź immunologiczną, mogącą prowadzić do wstrząsu septycznego. Ryzyko zakażeń inwazyjnych wzrasta również u pacjentów z upośledzonym układem odpornościowym (np. chorych na AIDS) lub stosujących leki immunosupresyjne (np. zapobiegające odrzuceniu przeszczepu). Dlatego też niezmiernie ważna jest eliminacja drobnoustrojów przed wszelkimi zabiegami, nawet drobnymi (założenie wkłucia naczyniowego, wykonanie iniekcji etc.), podczas których naruszana jest ciągłość tkanek pacjenta. Eliminacja drobnoustrojów dotyczy personelu, powierzchni i powietrza w salach operacyjnych oraz narzędzi chirurgicznych i innych, które mają styczność z ciałem pacjenta. Całość działań zapobiegających zakażeniu nazywamy postępowaniem aseptycznym. 61 W wyniku tego postępowania trzeba wyraźnie zmniejszyć liczbę lub całkowicie wyeliminować drobnoustroje. Najłatwiej zniszczyć formy wegetatywne większości bakterii, wyjątek stanowią tu prątki gruźlicy. Bardzo trudno jest wyeliminować przetrwalniki bakterii i spory grzybów. Wśród wirusów metodami chemicznymi łatwiej zniszczyć wirusy osłonkowe np. wirusy zapalenia wątroby B i C i HIV a znacznie trudniej bezosłonkowe: np. wirusy zapalenia wątroby typu A czy Polio. Wirusy zapalenia wątroby typu B są wyjątkowo oporne na działanie wysokiej temperatury. Postępowanie aseptyczne rozpoczyna mycie za pomocą odpowiednich środków określane jako sanityzacja. Jest ono niezbędnym elementem poprzedzającym dezynfekcję lub sterylizację, ale także antyseptykę; obecność materii organicznej (brudu, płynów ustrojowych) zdecydowanie zmniejsza skuteczność wszystkich tych procesów. Podstawowe pojęcia używane w tym rozdziale to: Sterylizacja – inaczej wyjaławianie, proces, którego skutkiem jest uwolnienie wyjaławianego materiału od form życia w każdej postaci (wszystkie drobnoustroje i ich formy). Dezynfekcja – proces usuwania drobnoustrojów ze środowiska i powierzchni przedmiotów. Zakłada się, że w procesie dezynfekcji giną formy wegetatywne bakterii i grzybów chorobotwórczych, a ilość pozostałych drobnoustrojów ulega maksymalnemu zmniejszeniu. Antyseptyka – proces polegający na eliminacji lub hamowaniu rozwoju drobnoustrojów na żywych tkankach – skórze i błonach śluzowych. Sanityzacja – polega na zmniejszeniu liczby drobnoustrojów na przedmiotach, sprzętach czy podłodze i skórze za pomocą środków myjących i czyszczących. Aseptyka – zgodne z określonymi procedurami postępowanie, które ma na celu zapobieganie zakażeniu. W pracy aseptycznej wykorzystuje się procesy sanityzacji, dezynfekcji, antyseptyki i sterylizacji. 62 5.2. Sterylizacja fizyczna stosowana w nowoczesnym szpitalu i ambulatorium Podstawowe techniki sterylizacji powierzchni, powietrza, a także narzędzi i materiałów stosowanych w lecznictwie szpitalnym oraz ambulatoryjnym zaliczamy do metod fizycznych. Należą do nich: wysoka temperatura, sterylizacja gazowa tlenkiem etylenu, a także sterylizacja radiacyjna i plazmowa. Do podstawowych technik fizycznej sterylizacji narzędzi chirurgicznych, naczyń i innych materiałów stosowane jest wyjaławianie z użyciem wysokiej temperatury. Procedura taka może odbywać się w dwóch zasadniczych odmianach: • sterylizacja parą wodną pod ciśnieniem – w autoklawach. Zastosowanie nadciśnienia 1 atm pozwala na uzyskanie pary wodnej o temperaturze ok. 121 °C, a nadciśnienia 2 atm – ok. 134 °C. Para wodna wykazuje bardzo dobrą penetrację do wyjaławianego materiału, dzięki czemu proces sterylizacji zostaje skrócony do ok. 15 minut (121°C) lub ok. 5 minut (134°C). Metoda ta uważana jest obecnie za złoty standard procesów sterylizacji. Sterylizowane tą metodą są też niektóre pożywki bakteriologiczne, o których była mowa w rozdziale 2 i sprzęt używany w pracowniach mikrobiologicznych. • sterylizacja suchym gorącym powietrzem – w suszarkach, w temperaturze 180°C przez 30 minut lub 160°C przez 120 minut. Tę technikę stosuje się najczęściej do narzędzi chirurgicznych i innych materiałów niewrażliwych na wysoką temperaturę. Jest to technika czasochłonna i energochłonna, przez co w wielu krajach odchodzi się od jej stosowania. Nowe odmiany autoklawów wykorzystują promieniowanie mikrofalowe zamiast grzałek elektrycznych, pozwalając w ten sposób jeszcze bardziej skrócić procedurę sterylizacji. Ich zastosowanie jest jednak jeszcze ograniczone. W praktyce mikrobiologicznej wykorzystuje się jako element zapewnienia sterylności płomień palnika: do wyżarzania metalowej ezy służącej 63 przenoszeniu masy bakteryjnej, czy opalania wylotów naczyń. Ta prosta i stosowana od lat metoda jest nieustannie bardzo skuteczna. Odrębną techniką wyjaławiania jest sterylizacja gazowa. Wykorzystywana jest w dużych sterylizatorniach szpitalnych obok wysokowydajnych autoklawów parowych, a także na skalę przemysłową do sterylizowania wyrobów medycznych jednorazowego użytku. Najczęściej wykorzystywanym gazem jest tlenek etylenu. Wyjaławianie prowadzi się w szczelnie zamkniętych komorach z ciągłą kontrolą temperatury, wilgotności oraz stężenia gazu. Czas sterylizacji zależy od parametrów procesu. Zastosowanie względnie niskiej temperatury (30-65°C) pozwala na wyjaławianie materiałów wrażliwych na wysoką temperaturę. W warunkach przemysłowych bywa stosowana również sterylizacja radiacyjna lub plazmowa, umożliwiają one masową sterylizację produktów wrażliwych na wysoką temperaturę, wykorzystując promieniowanie gamma emitowane przez izotopy promieniotwórcze lub zimną plazmę (zjonizowany w silnym polu magnetycznym gaz). Sterylizacja plazmowa jest również wykorzystywana przez duże sterylizatornie szpitalne. 5.3. Kontrola skuteczności procesu sterylizacji Każde urządzenie sterylizujące wymaga okresowej kontroli skuteczności przeprowadzanych w nim procesów sterylizacji, gdyż bardzo często nawet drobna, niedostrzegalna awaria skutkująca niepełnym wyjałowieniem narzędzi lub materiałów przekłada się na zagrożenie dla zdrowia i życia pacjenta. Częstość przeprowadzania kontroli każdego wykorzystywanego w medycynie urządzenia sterylizującego regulują przepisy prawa. Skuteczność procesu sterylizacji ocenia się przy użyciu tzw. wskaźników biologicznych, dostępnych na rynku np. pod nazwami Sporal S (do kontroli suszarek) i Sporal A (do kontroli autoklawów). Testy te zawierają odpowiednie przetrwalniki bakterii (najtrudniejszą do eliminacji postać drobnoustrojów). Po umieszczeniu w urządzeniu sterylizującym i przeprowadzeniu procesu sterylizacji, testy takie oddaje się do laboratorium mikrobiologicznego, gdzie umieszczane są w bulionie odżywczym 64 i inkubowane przez okres 7 dni. Brak wzrostu drobnoustrojów świadczy o pełnej skuteczności procesu sterylizacji. Śledzeniu przebiegu procesu sterylizacji służą także wskaźniki fizyczne (np. temperatura, ciśnienie, stężenie gazu – w zależności od stosowanej metody sterylizacji), zaś osiągnięcie przez urządzenie prawidłowych parametrów sterylizacji może być obserwowane za pomocą wskaźników chemicznych umieszczanych w komorze urządzenia (następuje np. zmiana barwy wskaźnika). Należy jednak pamiętać, że standardem w badaniach prawidłowości procesu sterylizacji są opisane powyżej wskaźniki biologiczne. 5.4. Odkażanie powierzchni i powietrza Odkażanie powierzchni (nazywane mylnie, lecz niestety powszechnie ich sterylizacją) odbywa się najczęściej z wykorzystaniem lamp (promienników UV) umieszczanych w pomieszczeniach lub bezpośrednio nad odkażaną powierzchnią (np. stołem operacyjnym). Najlepsze właściwości bakterioi grzybobójcze ma promieniowanie UV-C o zakresie długości 280 nm - 100 nm. Najsilniejsze działanie bójcze wykazuje promieniowanie o długości fali około 260 nm. Ze względu na ryzyko oparzeń skóry oraz zapalenia spojówek lampy te uruchamia się przed planowanym wykorzystywaniem pomieszczenia (pomieszczenie puste) zazwyczaj na 20-30 minut między zabiegami lub 2-8 godzin jeśli pomieszczenie przez dłuższy czas nie było odkażane. Przy bezpośrednim działaniu na bakterie skuteczność promieniowania UV jest bardzo duża, jednak jego wadą jest niska przenikalność przez wszelkie materiały znajdujące się w pomieszczeniu (meble, szkło, a nawet papier). Przeszkodą są też nawet niewielkie nierówności powierzchni. Zatem dla zapewnienia maksymalnej skuteczności procesu lampa UV musi być skierowana bezpośrednio na odkażaną powierzchnię co zresztą i tak nie zapewni jej całkowitej sterylności. Jest to przyczyną, dla której w kontekście promieniowania UV możemy mówić tylko o dezynfekcji, lecz nie o sterylizacji. W procesie odkażania powietrza wykorzystywane są zazwyczaj tzw. przepływowe lampy UV. Emitują one również promieniowanie UV-C jednak ich komora jest zamknięta i przepływa przez nią powietrze pobierane 65 z pomieszczenia przez wentylator. Taka konstrukcja pozwala na ciągłą pracę i odkażanie powietrza w obecności pacjentów i personelu w pomieszczeniu. Od niedawna w dezynfekcji powietrza wykorzystywane są urządzenia pracujące analogicznie do przepływowych lamp UV, jednak wykorzystujące zamiast promieniowania UV, zimną plazmę. Wykazuje ona większą skuteczność i szybkość dezynfekcji, jednak ze względu na wysokie koszty, stosowanie tych urządzeń nie jest jeszcze rozpowszechnione. W zakresie odkażania powietrza należy również wspomnieć o umieszczanych w systemach wentylacyjnych filtrach HEPA, które dzięki zastosowaniu włókien szklanych o bardzo niewielkich porach zatrzymują wszystkie formy drobnoustrojów ze skutecznością sięgającą 99,999%. Wykorzystywane są w pomieszczeniach, gdzie wymagany jest nawiew świeżego odkażonego powietrza. 5.5. Środki chemiczne: skuteczność i zastosowanie Dezynfekcja środkami chemicznymi wykorzystywana jest przede wszystkim do odkażania powierzchni, a także skóry pacjenta (mówimy wówczas o antyseptyce). Tylko część środków dezynfekcyjnych może być antyseptykami, są to te, które są bezpieczne dla tkanek pacjenta. Do najczęściej stosowanych środków chemicznych używanych w medycynie (podano tu także przykładowe nazwy handlowe) należą: • alkohole – etanol, izopropanol (Kenosept® G) - zwykle 70% roztwory wodne, stosowane do dezynfekcji i również jako antyseptyki, skuteczne wobec bakterii, wirusów i grzybów ale nieskuteczne w stosunku do prątków gruźlicy • aldehydy – glutarowy (Aerodesin 2000®), ortoftalowy (Cidex® OPA) – stosowane do sterylizacji i dezynfekcji endoskopów i innych narzędzi używanych w medycynie i kosmetyce, skuteczne wobec bakterii, prątków gruźlicy, wirusów i grzybów, aldehyd mrówkowy ze względu na toksyczne i mutagenne działanie ma ograniczone stosowanie, • kwasy organiczne i ich pochodne – kwas salicylowy i borowy (Borasol®) – stosowane jako antyseptyki; skuteczne wobec bakterii, 66 • • • • • • wirusów i grzybów; w produktach farmaceutycznych również kwas undecylenowy jako składnik przeciwgrzybiczy, pochodne biguanidyny – chlorheksydyna (CITROclorex® 2% MD, Manusan®), aleksydyna (RevitaLens®) – stosowane głównie jako antyseptyki, skuteczne wobec bakterii, wirusów i grzybów ale nieskuteczne w stosunku do prątków gruźlicy, chlorowce – chlor (w postaci skroplonej lub jako składnik związków chemicznych: podchlorynu sodu, chloraminy, halazonu); jod (w postaci roztworu alkoholo-wodnego – jodyny, a także jodoforów zawierających jod związany przez polimerowe nośniki organiczne) – stosowane jako środki dezynfekcyjne, niektóre także jako antyseptyki; to związki o bardzo dobrej skuteczności, działające na bakterie (też przetrwalniki), wirusy i grzyby pochodne fenolu – m.in. chlorokrezol (Helipur®) i para-chlorometaksylenol – stosowane głównie jako środki dezynfekcyjne; fenol ze względu na znaczną toksyczność nie jest już stosowany, skuteczne wobec bakterii, prątków gruźlicy, wirusów i grzybów, środki utleniające – nadtlenek wodoru (3% roztwór wodny – woda utleniona) jako środek antyseptyczny; bardziej stężone roztwory nadtlenku wodoru, a także szeroko działający kwas nadoctowy jako środki dezynfekcyjne, stosowane m.in. do dezynfekcji i sterylizacji endoskopów i urządzeń do dializ, skuteczne wobec bakterii, wirusów i grzybów, związki powierzchniowo czynne – m.in. chlorek benzalkoniowy, bromek benzalkoniowy, cetrimid – stosowane jako środki dezynfekcyjne i antyseptyczne, skuteczne wobec bakterii, wirusów i grzybów ale nieskuteczne w stosunku do prątków gruźlicy, inne – np. dichlorowodorek oktenidyny (Octenisept®, Octenidol®) – stosowany powszechnie w medycynie jako środek antyseptyczny do odkażania skóry pacjenta, skuteczny wobec bakterii, wirusów i grzybów ale nieskuteczny w stosunku do prątków gruźlicy. Znaczna część środków dezynfekcyjnych dostępna jest na rynku w postaci koncentratów do rozcieńczania tuż przed użyciem. Należy pamiętać, że po sporządzeniu roztwór roboczy środka dezynfekcyjnego jest przeznaczony do całkowitego zużycia w okresie wskazanym na ulotce (zwykle do 7 dni). W odróżnieniu od koncentratów, roztworu takiego nie wolno przechowywać, 67 gdyż traci z czasem swoje właściwości. Zdecydowaną większość dostępnych na rynku preparatów dezynfekcyjnych stanowią odpowiednio dobrane mieszaniny wymienionych powyżej substancji. 5.6. Aseptyka: mycie i odkażanie rąk, stosowanie rękawiczek jednorazowych Do postępowania aseptycznego, zmierzającego do zapobiegnięcia zakażeniu zaliczamy wymienione powyżej metody sterylizacji powierzchni, powietrza, narzędzi oraz materiałów stosowanych w medycynie. Wszystkie te procedury nie zapewnią jednak jałowości, jeżeli personel medyczny nie będzie stosował zasad aseptyki, przenosząc na pacjenta drobnoustroje skóry i błon śluzowych: własne, i pochodzące od innych pacjentów, a także ze środowiska, za pośrednictwem rąk lub narzędzi. Podstawowymi elementami postępowania aseptycznego są prawidłowe mycie i dezynfekcja rąk. Przedstawione na kolejnych stronach schematy prawidłowego mycia i dezynfekcji rąk pochodzą z dokumentu „Wytyczne WHO dotyczące higieny rąk w opiece zdrowotnej” World Health Organization 2009. Zasady te dotyczą całego personelu medycznego, w szczególności lekarzy i pielęgniarek mających bezpośredni kontakt z pacjentami i powinny być rygorystycznie przestrzegane. Osoby te nie powinny w czasie wykonywania pracy nosić biżuterii (w szczególności pierścionków i bransoletek), które stanowią niebezpieczny rezerwuar drobnoustrojów i mogą wręcz pośredniczyć w „wynoszeniu” niebezpiecznych szczepów szpitalnych poza jego obręb. 68 Socjalne mycie rąk - technika higieny rąk przy użyciu mydła i wody Celem socjalnego mycia rąk jest usunięcie zabrudzeń (organicznych i nieorganicznych) i zredukowanie bakterii, które zatrzymały się na nich po kontakcie ze środowiskiem, czyli przejściowej mikrobiota skóry. 69 Higieniczne mycie rąk - dezynfekcja rąk poprzedzona myciem przy użyciu mydła i wody Celem higienicznego mycia rąk jest usunięcie przejściowej mikrobiota skóry oraz chemiczne odkażenie rąk. Chirurgiczne mycie rąk Celem chirurgicznego mycia rąk jest usunięcie przejściowej mikrobiota skóry oraz obniżenie do minimum koncentracji stałej (rezydenckiej) mikrobiota skóry. Schemat przedstawiono na kolejnych stronach. 70 71 72 Większość procedur medycznych wykonywana jest w rękawiczkach jednorazowych. Mają one na celu zarówno ochronić pacjenta przed zakażeniem drobnoustrojami obecnymi na skórze personelu medycznego, ale również ochronić personel medyczny przed bezpośrednim kontaktem z krwią i innymi płynami ustrojowymi pacjenta, a tym samym przed zakażeniem bakteryjnym lub wirusowym. Ich używanie nie zwalnia jednak od stosowania odpowiednio często procedury mycia rąk. Częstym błędem jest nieprawidłowe zakładanie i zdejmowanie rękawiczek jednorazowych, które stwarza zagrożenie zakażeniem zarówno po stronie pacjenta jak i personelu, zaprzeczającym tym samym całkowicie idei ich stosowania. Poniżej przedstawiono zalecenia dotyczące prawidłowego zakładania i zdejmowania rękawiczek. Technika zakładania jałowych rękawiczek jednorazowych 73 Technika zdejmowania jałowych rękawiczek jednorazowych 74 Metody Wykrywanie bakterii w otoczeniu i ich liczenie Do podstawowych metod wykrywania bakterii w otoczeniu zaliczane są: • metoda posiewu na podłoże stałe – w przypadku badania czystości mikrobiologicznej powietrza – bakterie grawitacyjnie osiadają na powierzchni podłoża stałego lub są na nie nadmuchiwane w specjalnych aparatach, • metoda płytek odciskowych – w przypadku badania czystości mikrobiologicznej powierzchni. W wyniku zastosowania tych technik na użytych podłożach stałych wyrasta określona liczba kolonii bakteryjnych. Do zliczenia otrzymanych kolonii wykorzystywane są najczęściej automatyczne lub półautomatyczne liczniki kolonii. Możliwe jest również liczenie ręczne z wykorzystaniem szkła powiększającego. Liczba powstających kolonii odpowiada liczbie żywych komórek lub dokładniej - liczbie jednostek tworzących kolonie (jtk; CFU – ang. colony forming units). W przypadku badania czystości mikrobiologicznej powietrza, dokonujemy przeliczenia liczby CFU na liczbę drobnoustrojów w m3 powietrza według wzoru (Zadanie 1.). W przypadku płytek odciskowych (zazwyczaj o powierzchni 25 cm2) dokonujemy przeliczenia liczby kolonii na 100 cm2 powierzchni. Normy czystości mikrobiologicznej powietrza i powierzchni zależą od przeznaczenia badanego pomieszczenia i są dostępne w odpowiednich publikacjach. Szczegółowe wytyczne mogą dotyczyć konkretnych gatunków drobnoustrojów lub ogólnie grupy drobnoustrojów patogennych (oznacza to zwykle ich liczbę na określonej powierzchni lub objętości np. nie więcej niż 0 CFU/m3 oznacza, że w jednym metrze sześciennym nie może znaleźć się ani jedna jednostka tworząca kolonię – komórka lub jednostka wzrostowa np. przetrwalnik. Przykładowo: • dla pomieszczeń chronionych o I kl. czystości powietrza (np. sale operacyjne wysokoaseptyczne w których przeprowadza się transplantacje, 75 operacje serca, mózgu czy leczy ciężkie poparzenia); norma czystości powietrza dopuszcza minimalną liczbę bakterii, ale nie więcej niż 10 CFU/m3, • dla powierzchni o wysokim ryzyku zakażenia (sprzęt kontaktujący się z uszkodzoną skórą, błonami śluzowymi lub wprowadzany do jałowych obszarów ciała); norma mówi o 0 CFU/cm2 co oznacza, że muszą one być jałowe. Zadania do wykonania Zadanie 1. Badanie bakteryjnego zanieczyszczenia powietrza metodą sedymentacji - Ustaw otwartą płytkę agarową w wybranym miejscu i pozostaw przez 30 minut. - Zamknij płytkę i umieść w cieplarce o temperaturze 37°C na 24 godziny. - Po inkubacji policz wyrosłe na płytce kolonie i określ liczbę drobnoustrojów w 1 m3 powietrza podstawiając dane do wzoru: gdzie: x – liczba kolonii na płytce r – promień płytki [cm] t – czas ekspozycji [min] Zadanie 2. Kontrola bakteryjnego zanieczyszczenia powierzchni metodą odcisków - Płytkę odciskową przyłóż agarem do suchej kontrolowanej powierzchni na czas 10 sekund (nacisk 500 g). - Zamkniętą płytkę umieść w cieplarce o temperaturze 37°C i inkubuj 72 godziny, gdy chcesz wyhodować grzyby przedłuż inkubację do 7 dni. - Po inkubacji policz kolonie wyrosłe na płytce i podaj wynik z postaci liczby CFU/100 cm2 badanej powierzchni (powierzchnia płytki wynosi 25 cm2). 76 Zadanie 3. Określanie skuteczności działania środka antyseptycznego w stosunku do flory bakteryjnej skóry dłoni Badanie działania środka antyseptycznego i kontrola liczby bakterii na skórze nieodkażanej musi być wykonane przez jedną osobę (ilość bakterii na skórze jest cechą osobniczą zależną od wielu czynników i może wahać się w znacznym stopniu). Zatem jedna osoba bada kolejno lewą i prawą rękę. Ocena liczby bakterii na skórze nieodkażanej: - Wlej 10 mL bulionu do jałowej płytki Petriego, płucz w nim opuszki palców jednej ręki przez 1 minutę. - Policz żywe bakterie uwolnione ze skóry do bulionu metodą posiewu powierzchniowego przenosząc 0,1 mL bulionu na płytkę krwawą i równomiernie rozprowadź zagiętą ezą. Ocena liczby bakterii na skórze dłoni po zastosowaniu środka antyseptycznego (np. 0,5% Abacilu w etanolu, 2% Chloraminy lub Skinmanu i mydła). - Wlej 10 mL środka antyseptycznego do jałowej płytki Petriego. - Wlej 10 mL bulionu do drugiej płytki. - Płucz w środku antyseptycznym opuszki palców nie badanej wcześniej ręki przez 1 minutę. - Opłucz palce polewając je jałową wodą i wysusz w jałowym powietrzu (w pobliżu zapalonego palnika). - Zanurz opuszki palców w płytce z bulionem i płucz je przez 1 minutę. - Policz żywe bakterie uwolnione do tego bulionu metodą posiewu powierzchniowego tak jak poprzednio. - Opróżnij płytki z płynów a pożywki z posiewami umieść w cieplarce (37°C, 24 godziny). - Po inkubacji policz wszystkie kolonie wyrosłe na obu płytkach - Porównaj liczbę bakterii przed i po działaniu środka antyseptycznego. - Oceń jego skuteczność: 77 Zadanie 4. Wpływ promieniowania UV na bakterie W tym doświadczeniu bakterie (Escherichia coli) będą eksponowane na działanie promieniowania UV przez okres 1 minuty i przez 30 minut. - Opisz dwie płytki agarowe (nazwa bakterii, 1 min., 30 min., czas naświetlania) - Zanurz waciki w hodowli płynnej Escherichia coli, odciśnij nadmiar płynu o ścianki probówki i zasiej nimi gęsto całą powierzchnię płytek agarowych. - Przykryj część posianej powierzchni płytki układając na niej jałową pęsetą papierowy szablon. - Naświetlaj pod lampą UV powierzchnię otwartych płytek: jednej przez 1 minutę drugiej przez 30 minut. - Po naświetlaniu zdejmij jałową pęsetą szablony i wrzuć je do słoja z chloraminą. - Umieść płytki w cieplarce (37oC na 24 godzin). - Po inkubacji oceń działanie promieniowania UV na Escherichia coli po różnym czasie ekspozycji. Jaki czas naświetlania jest konieczny do zabicia bakterii? 78 Notatki 79 80 81 82
