Sposób wytwarzania nowej cząsteczki wiążącej CD25

RZECZPO
SPO
LITAPO
LSKA
(12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11) 170321
(13) B1
(2 1 ) Num er zgłoszenia:
289436
(5 1) IntCl6:
C12N 5/24
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
(22) D ata zgłoszenia:
15.03.1991
)Sposób wytwarzania nowej cząsteczki wiążącej CD25
4
(5
(30)
Pierwszeństwo:
(73)
SAN DOZ A.G., Bazylea, CH
Royal Free Hospital School of Medicine,
Londyn, GB
16.03.1990, GB,9005962.7
(43)
Zgłoszenie ogłoszono:
24.02.1992 BUP 04/92
(45)
O udzieleniu patentu ogłoszono:
29.11.1996 WUP 11/96
Uprawniony z patentu:
(72)
Twórcy wynalazku:
Peter L. Amlot,
Arne N. Akbar,
Gunther Heinrich,
Salvatore Cammisuli,
7( 4)
Pełnomocnik:
Kossowska Janina, PATROL Spółka z o.o.
PL 170321 31
(57) 1. Sposób wytwarzania nowej cząsteczki wiążącej CD25 zawierającej co najmniej jedno
miejsce wiążące antygen, obejmujące
a) pierwszą domenę, która zawiera regiony nadzmienne w kolejności CDR1, CDR2 i
CDR3, przy czym region CDR1 ma sekwencję aminokwasów: Arg-Tyr-Trp-Met-His, region
CDR2: Ala-Iłe-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly, a region
CDR3: Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe lub ich bezpośrednich równoważników;
b) drugą domenę, która zawiera regiony nadzmienne w kolejności C D R 1', CDR2' i
CDR3' o następujących sekwencjach aminokwasów: CDR1' - Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-SerTyr-Met-Gln, CDR2' - Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser, CDR3' - His-Gln-Arg-Ser-Ser-TyrThr lub ich bezpośrednich równoważników, znam ienny tym , że prowadzi się hodowlę linii
komórkowej hybrydomy lub organizmu stransformowanych sekwencjami DNA kodującymi
określoną powyżej pierwszą i drugą domenę i z hodowli wydziela się cząsteczkę wiążącą
CD25.
Sposób wytwarzania nowej cząsteczki wiążącej CD25
Zast rzeżenia
p a t e n t o we
1. Sposób wytwarzania nowej cząsteczki wiążącej CD25 zawierającej co najmniej jedno
miejsce wiążące antygen, obejmujące
a) pierwszą domenę, która zawiera regiony nadzmienne w kolejności CDR1, CDR2 i
CDR3, przy czym region CDR1 ma sekwencję aminokwasów: Arg-Tyr-Trp-Met-His, region
CDR2: Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly, a region
CDR3: Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe lub ich bezpośrednich równoważników;
b) drugą domenę, która zawiera regiony nadzmienne w kolejności CD R 1', CDR2' i CDR3'
o następujących sekwencjach aminokwasów: CDR1' - Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ue-Ser-Tyr-MetGln, CDR2' - Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser, CDR3' - His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr-Thr lub ich
bezpośrednich równoważników, znam ienny tym, że prowadzi się hodowlę linii komórkowej
hybrydomy lub organizmu stransformowanych sekwencjami DNA kodującymi określoną powyżej pierwszą i drugą domenę i z hodowli wydziela się cząsteczkę wiążącą CD25.
2. Sposób według zastrz. 1, znam ienny tym , że wytwarza się cząsteczkę wiążącą CD25,
która zawiera co najmniej jedno miejsce wiążące antygen obejmujące domenę o sekwencji
aminokwasów zasadniczo identycznej jak następująca:
Glu Val Gin Leu Gin
5
Gin Ser Glu Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser val Lys Met Ser
21
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr Trp M et His Trp Ile
37
Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ee Gly Ala De Tyr Pro
53
Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Glu Gly Lys Ala Lys
69
Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser
85
Leu Thr His Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ser ARg Asp Tyr Gly
101
Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
117
i drugą domenę o sekwencji aminokwasów zasadniczo identycznej jak następująca:
Gin Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile
10
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
26
3
170 321
Ser Ser Ile Ser Tyr Met Gin Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Thr Ser
42
Pro Lys Arg Trp He Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Giy Val Pro
58
A la Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
74
Ser Ser M et Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gin Arg
90
Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Be Lys
104
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wytwarza się cząsteczkę wiążącą
CD25, która obejmuje co najmniej
a) jeden ciężki łańcuch immunoglobuliny lub jego fragment, która zawiera (i) zmienną
domenę obejmującą regiony nadziemne w kolejności CDR1, CDR2 i CDR3 o następujących
sekwencjach aminokwasów: CDR1 - Arg-Tyr-Trp-Met-His; CDR2 - Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-AsnSer-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly, CDR3 - Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe
lub ich bezpośrednich równoważników i (ii) stałą część lub jej fragment ludzkiego ciężkiego
łańcucha i
b) jeden lekki łańcuch immunoglobuliny lub jego fragment, który zawiera (i) zmienną
domenę obejmującą kolejno regiony nadziemne CDR1', CDR2' i CDR3' o następujących
sekwencjach aminokwasów: CDR1' - Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tyr-Met-Gln, CDR2' - AspThr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser, CDR3' - His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr-Thr lub ich bezpośrednich równoważników i (ii) stałą część lub jej fragment ludzkiego lekkiego łańcucha.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wytwarza się cząsteczkę wiążącą CD25,
która zawiera co najmniej
a) jeden ciężki łańcuch, który obejmuje zmienną domenę o sekwencji aminokwasów
zasadniczo identycznej jak następująca:
Glu Val Gin Leu Gin
5
Gin Ser Glu Thr Val Leu .Ala Arg Pro Gly Ala Ser val Lys Met Ser
21
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Ile
37
Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He Gly Ala De Tyr Pro
53
Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Glu Gly Lys Ala Lys
69
Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser
85
Leu Thr His Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ser ARg Asp Tyr Gly
101
Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
117
i stałą część ludzkiego ciężkiego łańcucha i
170 321
4
b)
jeden lekki łańcuch, który obejmuje zmienną domenę o sekwencji aminokwasów
zasadniczo identycznej jak następująca:
S
e
G
r
l n
P
I
r
l e
o
L
A
E
u
l a
T
I
h
l
r
e
G
1
l n
0
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
26
Ser Ser He Ser Tyr Met Gin Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Thr Ser
42
Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro
58
A la A rg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr He
74
Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gin Arg
90
Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu De Lys
104
i stałą część ludzkiego lekkiego łańcucha.
5.
Sposób według zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że wytwarza się cząsteczkę wiążącą
CD25, w której stała część lub jej fragment ludzkiego ciężkiego łańcucha jest typu γ1, a stała
część lub jej fragment ludzkiego lekkiego łańcucha jest typu K.
*
*
*
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowej cząsteczki wiążącej CD25, a
zwłaszcza monoklonalnych przeciwciał, które mają zastosowanie w immunosupresji.
W chirurgii przeszczepów organów, zwłaszcza nerek, wątroby, serca, płuc i szpiku
kostnego konieczne jest ograniczenie odpowiedzi immunologicznej u biorcy przeszczepu w celu
maksymalnego zmniejszenia prawdopodobieństwa odrzucenia przeszczepu po operacji. W tym
celu proponuje się różne środki immunosupresyjne, których użycie jednak musi być dokładnie
kontrolowane, ponieważ oprócz niepożądanych efektów ubocznych związanych ze stosowaniem
pewnych środków immunosupresyjnych, supresja odpowiedzi immunologicznej czyni biorcę
przeszczepu szczególnie podatnym na zakażenia bakteryjne i wirusowe, które byłyby kontrolowane przez normalnie działający układ odpornościowy. Środki immunosupresyjne, które z
powodzeniem stosuje się w praktyce klinicznej obejmują steroidy, azatioprynę i cyklosporynę
A. W praktyce klinicznej konieczne jest osiągnięcie równowagi pomiędzy stopniem immunosupresji niezbędnym do zapobieżenia odrzuceniu przeszczepu lub do leczenia objawów odrzucenia, a zachowaniem w pewnym stopniu funkcji układu odpornościowego biorcy tak, aby
zwalczał inne środki zakażające i równocześnie utrzymywał kontrolę nad możliwymi niepożądanymi efektami ubocznymi.
Należy też zwrócić uwagę na stosowanie pewnych monoklonalnych przeciwciał (MAb)
w celu supresji reakcji immunologicznych, zwłaszcza monoklonalnych przeciwciał, które rozpoznają różne antygeny powierzchniowe limfocytów T. Tutaj także napotyka się na problemy
w klinicznej praktyce, mianowicie znane dotychczas przeciwciała były albo zbyt silne, albo
niewystarczająco skuteczne, a czasem powodowały poważne skutki uboczne, takie jak wysoka
gorączka.
Takie przeciwciała oznacza się zwykle symbolem CD (Cluster-Determination) z liczbą
nadawaną kolejno przez Leucocyte Typing Workshope. Chociaż takim symbolem jak CD3
170 321
5
obecnie oznacza się często antygen powierzchniowy komórek, a MAb dla tego antygenu często
oznacza się jako "anty-CD3", w niniejszym opisie takie symbole jak CD3, CD25 itd. będą się
odnosiły do MAb, a odpowiednie antygeny powierzchniowe komórek będą oznaczane jako
"antygen CD3" itd.
Zwłaszcza monoklonalne przeciwciała dla antygenów błony obecnych na wszystkich
limfocytach T (zwanych także pan antygenami limfocytów T), takich jak antygen CD3, są bardzo
silnymi przeciwciałami ze względu na ogólną aktywność supresyjną wobec układu odpornościowego. Zatem organizm ludzki może być pozbawiony natychmiastowej odpowiedzi immunologicznej, zwykle za pośrednictwem limfocytów pamięci T, występującej po zakażeniu.
Jest to z pewnością niepożądane, gdy usiłuje się raczej zapobiegać niż leczyć objawy
odrzucenia przeszczepu. Działanie, które nadawałoby się do zastosowania w profilaktyce,
powinno być selektywne, tj. pula limfocytów pamięci T powinna być nienaruszona, podczas gdy
kategoria limfocytów T (aktywowane limfocyty T), które mogłyby być bezpośrednio włączone
w odrzucenie przeszczepu, powinna ulec inaktywacji.
Taki cel można osiągnąć stosując przeciwciała dla aktywowanych limfocytów T. Komórki
te charakteryzują się obecnością na powierzchni błony receptora TL-2 o wysokim powinowactwie. Receptor EL-2 o wysokim powinowactwie składa się z co najmniej dwóch różnych
łańcuchów polipeptydowych, łańcucha a , znanego także jako antygen CD25 i łańcucha β . Na
pozostałych komórkach nie występuje taki receptor o wysokim powinowactwie, występują
natomiast receptory o niskim i pośrednim powinowactwie, które składają się z homodimerów
a i β. Przeciwciało CD25, które przeszkadza w wiązaniu IL-2 z jej receptorem o wysokim
powinowactwie, a zatem wywołuje selektywną supresję odpowiedzi immunologicznej, wybrano
do stosowania w profilaktyce odrzucania przeszczepów.
Naturalne immunoglobuliny lub przeciwciała stanowią zwykle multimerową cząsteczkę
w kształcie Y, która ma miejsce wiązania antygenu przy końcu każdego górnego ramienia.
Pozostała część struktury, zwłaszcza ogonek litery Y, pośredniczy w funkcjach efektorowych
związanych z immunoglobulinami. Ogólna struktura przeciwciała z klasy IgG jest przedstawiona
schematycznie na fig. 1A. Łańcuchy lekkie i ciężkie mają zmienną domenę i część stałą. Miejsce
wiązania antygenu składa się ze zmiennej domeny ciężkiego łańcucha związanej ze zmienną
domeną lekkiego łańcucha. Zmienne domeny ciężkich i lekkich łańcuchów mają taką samą
strukturę ogólną, która jest przedstawiona na fig. IB.
Bardziej szczegółowo, własności wiązania antygenu przez przeciwciało są zasadniczo
określone przez 3 swoiste regiony w zmiennej domenie ciężkich i lekkich łańcuchów, zwane
regionami nadzmiennymi lub regionami określającymi komplementarność (CDR). jak przedstawiono na fig. 1B, te 3 nadzmienne regiony leżą na przemian z 4 "szklieletami" (FR), ze
stosunkowo zachowanymi sekwencjami, które nie uczestniczą bezpośrednio w wiązaniu. Regiony CDR tworzą pętle i są utrzymywane blisko siebie przez szkielety, które w dużym stopniu
przyjmują konformację β-arkusza. Regiony CDR ciężkiego łańcucha wraz z regionami CDR
związanego lekkiego łańcucha zasadniczo tworzą miejsce wiązania antygenu w cząsteczce
przeciwciała.
Skład regionu FR i CDR zwykle określa się przez porównanie sekwencji aminokwasów
pewnej liczby przeciwciał powstających w tym samym gatunku. Ogólne zasady identyfikacji
regionów CDR i FR są przedstawione w tabeli I.
Poza tym, stwierdzono ostatnio, że udział zmiennej domeny lekkiego łańcucha w energetyce wiązania jest mały w porównaniu z udziałem domeny związanego ciężkiego łańcucha i że
wydzielone zmienne domeny ciężkiego łańcucha samodzielnie mają aktywność wiązania antygenu. Takie cząsteczki określa się teraz jako jednodomenowe przeciwciała.
Znanych jest już kilka mysich monoklonalnych przeciwciał CD25, które obejmują 33B3-1
(Immunotech-Merieux), BD α IL-2R (Becton-Dickinson), 2C8 (Amersham), Campath 6 (MRC,
Cambridge) i ATH207 (Free University, Berlin). Jednakże stwierdzono teraz, że nowe mysie
przeciwciało CD25 izotyp IgG2a, dalej określane jako RFT5-IgG2a ma lepsze właściwości niż
znane przeciwciała CD25, zwłaszcza pod względem powinowactwa wiązania oraz, że można
skonstruować inne cząsteczki wiążące CD25, zawierające takie same regiony nadzmienne jak
RFT5-IgG2a.
6
170 321
Sposobem według wynalazku wytwarza się cząsteczkę wiążącą CD25, która zawiera co
najmniej jedno miejsce wiążące antygen obejmujące a) pierwszą domenę, która zawiera regiony
nadzmienne w kolejności CDR1, CDR2 i CDR3 o następujących sekwencjach aminokwasów:
CDR1 - Arg Tyr-Trp-Met-His; CDR2 - A!a-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-AsnGln-Lys-Phe-Glu-Gly, CDR3 -Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe lub ich bezpośrednich
równoważników, i b) drugą domenę, która zawiera regiony nadzmienne w kolejności CDR1',
CDR2' i CDR3' o następujących sekwencjach aminokwasów: CDR1' - Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-IleSer-Tyr-Met-Gln, CDR2' - Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser, CDR3' -His-Gln-Arg-Ser-Ser-TyrThr lub ich bezpośrednie równoważniki.
Sposób według wynalazku polega na tym, że prowadzi się hodowlę linii komórkowej
hybrydomy lub organizmu stransformowanych sekwencjami DNA kodującymi określoną powyżej pierwszą i drugą domenę i z hodowli wydziela się cząsteczkę wiążącą CD25.
Jeśli nie zaznaczono inaczej, łańcuchy polipeptydowe opisywane w niniejszym opisie
zaczyna się od N-końca, a kończą się C-końcem.
Gdy miejsce wiążące antygen zawiera pierwszą i drugą domenę, mogą one być zlokalizowane na tej samej cząsteczce polipeptydu lub, korzystnie każda domena może być na innym
łańcuchu, pierwsza domena może być częścią ciężkiego łańcucha immunoglobuliny lub jego
fragmentu, a druga domena częścią lekkiego łańcucha immunoglobuliny lub jego fragmentu.
Przez "cząsteczkę wiążącą CD25" należy rozumieć cząsteczkę zdolną do przyłączania
antygenu CD25 samego lub związanego z innymi cząsteczkami i tworzącego receptory IL-2 o
wysokim powinowactwie. Reakcję wiązania można wykazać standardowymi metodami (próby
jakościowe), włącznie np. z biopróbą na określenie hamowania wiązania IL-2 z jej receptorem
lub dowolne próby na wiązanie z uwzględnieniem negatywnego testu kontrolnego, w którym
stosuje się przeciwciało o niespokrewnionej swoistości, np, przeciwciało dla lizozymu. Korzystnie, zdolność wiązania się cząsteczki wytwarzanej sposobem według wynalazku z antygenem
CD25 można wykazać w kompetytywnej próbie wiązania stosując przeciwciało AHT207,
BD α IL-2-R lub 33B3-1 jako kompetytory. Korzystnie jako kompetytory wybiera się przeciwciało AHT207 lub BD α IL-2-R. Przykład próby wiązania jest opisany poniżej.
Ludzkie komórki jednojądrzaste z krwi obwodowej hoduje się w podłożu RPMJ 1640
uzupełnionym 2mM L-glutaminy, 100 jednostkami/ml penicyliny, 100 μ g/ml streptomycyny,
25 mM wodorowęglanu sodu i 10% płodową surowicą cielęcą /FCS/. Do stymulacji HPBM
stosuje się 1 μg/ml fitohemaglutyniny /PHA/. Po 3 dniach wytwarza się zawiesinę komórek
blastycznych o stężeniu 3 10 /ml w solance buforowanej fosforanem, uzupełnionej 2% bydlęcą
albuminą surowiczą /B SA / i 2% azydkiem. 50 μl próbki tej zawiesiny inkubuje się w ciągu 10
min. w 20°C, w warunkach "non-capping", z przeciwciałem blokującym /kompetytorem/ o
stopniowanych stężeniach od 1 do 100 μg/ml. Następnie do komórek dodaje się 1 μg/ml
biotynylowanego przeciwciała wytworzonego sposobem według wynalazku i dalej inkubuje się
w ciągu 10 minut. Komórki przemywa się i dalej inkubuje się przez 10 minut ze streptawidyną
znakowaną fluoresceiną. Komórki znów się przemywa, utrwala się w formalinie i analizuje za
pomocą fluorocytometru, który wykrywa przyłączenie biotynylowanego przeciwciała. Równolegle prowadzi się doświadczenie z biotynylowanym przeciwciałem o niezwiązanej swoistości,
jako próbę kontrolną negatywną.
Przykłady cząsteczek wiążących antygen obejmują przeciwciała wytwarzane przez komórki B lub hybrydomy i chimeryczne lub humanizowane przeciwciała, lub ich fragmenty, np.
fragmenty F/ab'/2 i Fab j a k również przeciwciała o pojedynczym łańcuchu lub z jedną domeną.
Przeciwciała o pojedynczym łańcuchu składają się ze zmiennych domen ciężkich i lekkich
łańcuchów przeciwciała kowalencyjnie związanych przez peptydowy łącznik zwykle składający
się z 10 do 30, korzystnie 15 do 25 aminokwasów. Zatem taka struktura nie obejmuje stałej części
ciężkich i lekkich łańcuchów i uważa się, że mały peptydowy "spacer" powinien być mniej
antygenowy niż cała część stała. Przez "przeciwciało chimeryczne" należy rozumieć przeciwciało, w którym regiony stałe ciężkich lub lekkich łańcuchów lub obu łańcuchów są pochodzenia
ludzkiego, podczas gdy domeny zmienne w obu łańcuchach nie są pochodzenia ludzkiego /np.
mysiego/. Przez "humanizowane przeciwciało" należy rozumieć przeciwciało, w którym regiony
nadziemne /CDR/ nie są pochodzenia ludzkiego /np. mysiego/, podczas gdy zasadniczo wszy-
170 321
7
stkie inne części immunoglobuliny, np. stałe regiony i wysoce zachowawcze części zmiennych
domen, tj. regiony szkieletowe, są pochodzenia ludzkiego. Humanizowane przeciwciało może
jednak zachować kilka aminokwasów z mysiej sekwencji w częściach regionów szkieletowych
przylegających do regionów nadzmiennveh.
Nadzmienne regiony mogą być związane z regionami szkieletowymi dowolnego rodzaju,
korzystnie pochodzenia mysiego lub ludzkiego. Odpowiednie regiony szkieletowe są opisane
przez E.A. Kabata i wsp. w "Sequences of proteins of immunological interest", US departament
zdrowia i świadczeń społecznych, Publiczna służba zdrowia, Narodowy Instytut Zdrowia.
Jednak korzystnym regionem szkieletowym ciężkiego łańcucha jest region z RFT5-IgG2a, który
jest przedstawiony dalej w załączonej Identyfikacji Sekwencji nr 1 i składa się z regionów FR1,
FR2, FR3 i FR4 we wskazanej kolejności. Podobnie, w Identyfikacji Sekwencji nr 2 przedstawiony jest korzystny szkielet lekkiego łańcucha z RFT5-IgG2a, który składa się w następującej
kolejności z regionów F R 1', FR2', FR3' i FR4'.
Sposobem według wynalazku wytwarza się cząsteczkę wiążącą CD25, która zawiera co
najmniej jedno miejsce wiążące antygen obejmujące domenę o sekwencji aminokwasów zasadniczo identycznej jak następująca:
Glu Val Gin Leu Gin
5
Gin Ser Glu Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser val Lys Met Ser
21
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Ile
37
Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala De Tyr Pro
53
Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Glu Gly Lys Ala Lys
69
Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser
85
Leu Thr His Glu Asp Ser .Ala Val Tyr Tyr Cys Ser ARg Asp Tyr Gly
101
Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
117
i drugą domenę o sekwencji aminokwasów zasadniczo identycznej jak następująca:
Gin Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile
10
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
26
170 321
8
Ser Ser De Ser Tyr Met Gin Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Thr Ser
S
e
P
r
r
L
o
y
L
s
y
L
s
e
A
u
r
g
A
l
T
a
r
S
p
e
I
r
l
e
G
T
l y
y
r
V
A
a
l
s
p
P
42
r
T
o
h
5
r
8
A la A rg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr He
74
Ser Ser M et Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg
90
Ser Ser Tyr Thr Fhe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
104
M onoklonalne przeciwciało, które powstaje dla białka występującego naturalnie we
wszystkich organizmach ludzkich, musi być koniecznie hodowane w układzie innym niż ludzki,
np. w myszy. Ksenogeniczne przeciwciało wytworzone przez hydrydoma, jako bezpośrednia
tego konsekwencja, podane człowiekowi wywołuje niepożądaną odpowiedź immunologiczną,
głównie za pośrednictwem stałej części ksenogenicznej immunoglobuliny. To wyraźnie ogranicza użycie takich przeciwciał, ponieważ nie można ich podawać przez dłuższy czas. Zatem
szczególnie korzystne jest stosowanie chimerycznych lub humanizowanych przeciwciał z pojedynczym łańcuchem i jedną domeną, które, podane ludziom, prawdopodobnie nie wywołują
zasadniczej odpowiedzi allogenicznej.
W związku z powyższym, korzystniejsza jest cząsteczka wiążąca CD25 wybrana spośród
chimerycznego przeciwciała anty-CD25, która obejmuje co najmniej a) jeden ciężki łańcuch
immunoglobuliny lub jego fragment, który zawiera (i) zmienną domenę obejmującą regiony
nadzmienne w kolejności C D R 1, CDR2 i CDR3 o następujących sekwencjach aminokwasów:
C D Rl - Arg- Tyr-Trp-Met-His; CDR2 - Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-AsnGln-Lys-Phe-Glu-Gly, CDR3 - Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe lub ich bezpośrednich
równoważników i (ii) stałą część lub jej fragment ludzkiego ciężkiego łańcucha i
b) jeden lekki łańcuch immunoglobuliny lub jego fragment, który zawiera (i) zmienną
domenę obejmującą kolejno regiony nadzmienne C D R 1', CDR2' i CDR3' o następujących
sekwencjach aminokwasów: C D R 1' - Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tyr-Met-Gln, CDR2' - AspThr-Ser-LyS-Leu-Ala-Ser, CDR3' - His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr-Thr lub ich bezpośrednich równoważników i (ii) stałą część lub jej fragment ludzkiego lekkiego łańcucha.
Alternatywnie, sposobem według wynalazku, można wytwarzać cząsteczkę wiążącą
CD25, która ma jeden łańcuch zawierający miejsce wiążące antygen obejmujące a/ pierwszą
domenę zawierającą kolejno regiony nadzmienne C D R 1, CDr2 i CDR3 o sekwencjach aminokwasów przedstawionych w Identyfikacji Sekwencji nr 1, b/ drugą domenę zawierającą kolejno
regiony nadzmienne C D R 1', CDR2' i CDR3' o sekwencjach aminokwasów przedstawionych w
Identyfikacji Sekwencji nr 2 i c/ łącznik peptydowy, który jest związany z N-końcem pierwszej
domeny i z C-końcem drugiej domeny lub z C-końcem pierwszej domeny i z N-końcem drugiej
domeny i jej bezpośrednie równoważniki.
Jak dobrze wiadomo, małe zmiany jednego lub kilka aminokwasów, mogą prowadzić do
formy allelicznej białka pierwotnego o zasadniczo takich samych właściwościach. Zatem przez
termin "bezpośrednie równoważniki" należy rozumieć albo cząsteczkę wiążącą CD25 /cząsteczka X /z pojedynczą domeną, /i/ w której regiony nadzmienne C D R1, CDR2 i CDR3, rozważane
jako całość, są co najmniej w 80%, korzystnie w 90%, a bardziej korzystnie co najmniej w 95%
homologiczne z regionami nadzmiennymi przedstawionymi w Identyfikacji Sekwencji nr 1 oraz
/ii/, która jest zdolna do hamowania wiązania IL-2 z jej receptorem zasadniczo w takim samym
stopniu, jak odnośna cząsteczka zawierająca regiony szkieletowe identyczne jak regiony cząsteczki X ale z nadzmiennymi regionami CD R1, CDR2 i CDR3 identycznymi jak przedstawione
w Identyfikacji Sekwencji nr 1, albo należy rozumieć cząsteczkę wiążącą CD25 zawierającą co
najmniej dwie domeny na miejsce wiązania /cząsteczka X'/, /i/ w której nadzmienne regiony
C D R1, CDR2, CDR3, C D R 1', CDR2' i CDR3', jako całość, są co najmniej w 80%, korzystnie
170 321
9
w co najmniej 90%, bardziej korzystnie co najmniej w 95% homologiczne z regionami nadzmiennymi przedstawionymi w Identyfikacji Sekwencji nr 1 i 2, oraz /ii/ która jest zdolna do
hamowania wiązania IL-2 z jej receptorem zasadniczo w takim samym stopniu, jak odnośna
cząsteczka zawierająca regiony szkieletowe i części stałe identyczne jak regiony cząsteczki X'
ale z nadzmiennymi regionami*CDR1, CDR2, CDR3 i CDR1', CDR2' i CDR3' jak przedstawione
w Identyfikacji Sekwencji nr 1 i 2.
To ostatnie kryterium można dogodnie testować w różnych próbach, w tym także w reakcji
mieszanych limfocytów /MLR/, w biopróbie na swoistą odpowiedź HPBM na antygen i w
biopróbie na poliferację limfoblastów T zależnych od IL-2. Próby te opisane są dalej. Przez
termin "w tym samym zakresie" należy rozumieć, że dana cząsteczka i jej równoważnik
wykazują, statystycznie, zasadniczo takie same krzywe hamowania wiązania.
IL-2 w jednej z powyższych prób.
Najkorzystniej chimeryczne przeciwciało CD25 zawiera co najmniej
a)
jeden ciężki łańcuch, który obejmuje zmienną domenę o sekwencji aminokwasów
zasadniczo identycznej jak następująca:
Glu Val Gin Leu Gin
5
Gin Ser Glu Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser val Lys Met Ser
21
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr Trp M et His Trp Ile
37
Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly
53
Ala He Tyr Pro
Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Glu Gly Lys Ala Lys
69
Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met
85
Glu Leu Ser Ser
Leu Thr His Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ser ARg Asp Tyr Gly
101
Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
117
i stałą część ludzkiego ciężkiego łańcucha i
b)
jeden lekki łańcuch, który obejmuje zmienną domenę o sekwencji aminokwasów
zasadniczo identycznej jak następująca:
Gin Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
10
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr M et Thr Cys Ser Ala Ser
26
Ser Ser He Ser Tyr Met Gin Trp Tyr Gln Gin Lys Pro Gly Thr Ser
42
10
170 321
Pro Lys Arg Trp He Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro
58
Ala Ar g Fhe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Le uThr Ile
74
Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His GlnArg
90
Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
104
i stałą część ludzkiego lekkiego łańcucha.
Stała część ludzkiego ciężkiego łańcucha może być typu γ1, γ2 , γ3, γ4 , μ , α 1, α2, 8 lub e,
korzystnie typu y, bardziej korzystnie typu γi, podczas gdy stała część ludzkiego lekkiego
łańcucha może być typu K lub X, (który obejmuje podtypy λ1, λ2 i λ 3 ), ale korzystnie jest typu k .
Sekwencje aminokwasów tych wszystkich stałych części są podane przez Kabata i wsp. (jak
wyżej).
W zakres wynalazku wchodzą także koniugaty cząsteczek wiążących CD25 wytwarzanych
sposobem według wynalazku np. koniugaty z enzymem lub toksyną lub radioizotopem.
Sposobem według wynalazku cząsteczkę wiążącą CD25 wytwarza się metodą rekombinacji DNA. Konstruuje się jedną lub więcej cząsteczek DNA kodujących cząsteczkę wiążącą,
umieszcza się ją pod kontrolą odpowiednich sekwencji i przenosi się do odpowiedniego
organizmu gospodarza w celu przeprowadzenia ekspresji.
Wynalazek niniejszy dostarcza informacji odnośnie cząsteczek DNA kodujących cząsteczkę wiążącą CD25 z pojedynczą domeną, cząsteczkę wiążącą CD25 z pojedynczym łańcuchem,
łańcuch ciężki lub lekki lub fragmenty tych łańcuchów cząsteczki CD25 oraz odnośnie zastosowania tych cząsteczek DNA do wytwarzania cząsteczki wiążącej CD25 metodą rekombinacji.
Obecny stan techniki pozwala fachowcom zsyntetyzować cząsteczki DNA na podstawie
informacji, których dostarcza wynalazek, tj. sekwencji aminokwasów regionów nadzmiennych
i kodujących je sekwencji DNA. Sposób konstruowania genu zmiennej domeny jest np. opisany
w europejskim zgłoszeniu patentowym 239 400 i krótko można go streścić następująco: Klonuje
się gen kodujący zmienną domenę MAb o każdej swoistości. Określa się segmenty DNA
kodujące szkielet i regiony nadzmienne i usuwa się segmenty DNA kodujące regiony nadzmienne, a segmenty DNA kodujące szkielet fuzjuje się razem z odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi w miejscach łączenia. Miejsca restrykcyjne można utworzyć w odpowiednich pozycjach
przez mutagenezę cząsteczki DNA standardowymi metodami. Dwuniciowe syntetyczne kasety
CDR wytwarza się na drodze syntezy DNA zgodnie z sekwencjami przedstawionymi w Identyfikacji Sekwencji nr 1 lub 2. Te kasety mają lepkie końce, tak że m ożna je zligować ze szkieletem.
Protokół wytwarzania cząsteczki DNA kodującej zmienną domenę immunoglobuliny jest przedstawiony na fig. 5.
Do skonstruowania DNA kodującego MAb nie jest konieczny dostęp do mRNA z
produkującej linii komórkowej hybrydomy. W zgłoszeniu PCT WO 90/07861 znajduje się pełna
instrukcja dotycząca wytwarzania MAb na drodze techniki rekombinacji DNA i podana jest
pisemna informacja o sekwencji nukleotydowej genu. Metoda obejmuje syntezę kilku oligonukleotydów, ich amplifikację metodą PCR i ich składanie do żądanej sekwencji DNA.
Wektory zawierające odpowiedni promotor lub geny kodujące stałe części ciężkiego i
lekkiego łańcucha są publicznie dostępne. Zatem skonstruowaną cząsteczką DNA można
dogodnie przenosić w odpowiednim wektorze. Cząsteczkę DNA kodującą przeciwciała z
pojedynczym łańcuchem można także wytwarzać standardowymi metodami, np. jak opisano w
Zgłoszeniu PCT W O 88/1649.
W związku z powyższym oraz ponieważ MAb pochodzenia mysiego jako naturalnie
wydzielane przez hybrydoma nie jest korzystnym typem MAb, uważa się, że depozyt hybrodoma
nie jest konieczny.
W konkretnym rozwiązaniu sposobu według wynalazku stosowane środki rekombinantowe
obejmują pierwszą i drugą konstrukcję DNA, opisane poniżej.
170 321
11
Pierwsza konstrukcja DNA koduje ciężki łańcuch lub jego fragment i obejmuje a/pierwszą
część, która koduje zmienną domenę obejmującą alternatywnie szkielet i regiony nadzmienne
w kolejności CDR1, CDR2 i CDR3, które mają sekwencje aminokwasów przedstawione w
Identyfikacji Sekwencji nr 1, przy czym ta pierwsza część zaczyna się od kodonu kodującego
pierwszy aminokwas zmiennej domeny i kończy się kodem kodującym ostatni aminokwas
zmiennej domeny i b/ drugą część, która koduje stałą część ciężkiego łańcucha lub jego fragment
i która zaczyna się od kodonu kodującego pierwszy aminokwas stałej części ciężkiego łańcucha,
a kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas stałej części lub jej fragmentu, po którym
następuje kodon nonsensowny.
Korzystnie, pierwsza część koduje zmienną domenę o sekwencji aminokwasów zasadniczo takiej samej jak przedstawiona w Identyfikacji Sekwencji nr 1 zaczynającej się od aminokwasu w pozycji 1 i kończącej się aminokwasem w pozycji 117. Bardziej korzystnie, pierwsza
część ma taką sekwencję nukleotydową jak przedstawiona w Identyfikacji Sekwencji nr 1
zaczynającą się od nukleotydu w pozycji 142 i kończącą się nukleotydem w pozycji 492. Druga
część, korzystnie, koduje stałą część ludzkiego ciężkiego łańcucha, b. korzystnie stałą część
ludzkiego łańcucha γ 1. Tą drugą częścią może być genomowy fragment DNA /zawierający
introny/ lub fragment cDNA /bez intronów/.
Druga konstrukcja DNA koduje lekki łańcuch lub jego fragment i obejmuje a/ pierwszą
część, która koduje zmienną domenę obejmującą alternatywnie szkielet i regiony nadzmienne
w kolejności CDR1', CDR2' i CDR3', w których sekwencje aminokwasów są przedstawione w
Identyfikacji Sekwencji nr 2, przy czym ta pierwsza część zaczyna się od kodonu kodującego
pierwszy aminokwas zmiennej domeny i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas
zmiennej domeny i b/drugą część kodującą stałą część lekkiego łańcucha lub jej fragment, która
zaczyna się od kodonu kodującego pierwszy aminokwas stałej części lekkiego łańcucha i kończy
się kodonem kodującym ostatni aminokwas stałej części lub jej fragment, po którym następuje
kodon nonsensowny.
Korzystnie, ta pierwsza część koduje zmienną domenę o sekwencji aminokwasów zasadniczo takiej samej jak sekwencja w Identyfikacji Sekwencji nr 2 zaczynająca się od aminokwasu
w pozycji 1 i kończąca się aminokwasem w pozycji 104. Bardziej korzystnie pierwsza część ma
sekwencję nukleotydową jak przedstawiona w Identyfikacji Sekwencji nr 2, zaczynającą się od
nukleotydu w pozycji 244 i kończą się nukleotydem w pozycji 555. Korzystnie druga część
koduje stałą część ludzkiego lekkiego łańcucha, bardziej korzystnie stałą część ludzkiego
łańcucha K.
W obu konstrukcjach DNA pierwsza i druga część jest rozdzielona intronem. Intron
umieszczony jest pomiędzy pierwszą i drugą częścią, a korzystnie wstawiony jest wzmacniacz.
Obecność tego elementu genetycznego, który ulega transkrypcji, ale nie ulega translacji, może
być potrzebna dla skutecznej transkrypcji drugiej części. Bardziej korzystnie obie konstrukcje
DNA zawierają wzmacniacz genu ciężkiego łańcucha, korzystnie pochodzenia ludzkiego.
Pierwsza lub druga konstrukcja DNA korzystnie zawiera trzecią część, która znajduje się
za pierwszą częścią i koduje część peptydu lidera; trzecia część zaczyna się od kodonu
kodującego pierwszy aminokwas peptydu lidera, a kończy się kodonem kodującym jego ostatni
aminokwas. Ten peptyd jest potrzebny, aby łańcuchy, których ekspresja nastąpiła w organizmie
gospodarza, zostały z niego wydalone. Korzystnie, trzecia część pierwszej konstrukcji DNA
koduje peptyd lidera o sekwencji aminokwasów zasadniczo takiej samej jak przedstawiona w
Identyfikacji Sekwencji nr 1, zaczynającej się aminokwasem w pozycji -19 i kończącej się
aminokwasem w pozycji -1. Korzystnie, trzecia część drugiej konstrukcji DNA koduje peptyd
lidera o sekwencji aminokwasów jak przedstawiona w Identyfikacji Sekwencji nr 2, zaczynającej
się od aminokwasu w pozycji -22 i kończącej się aminokwasem w pozycji -1.
Każda z konstrukcji DNA znajduje się pod kontrolą odpowiednich sekwencji kontrolujących, zwłaszcza pod kontrolą odpowiedniego promotora. Może być użyty dowolny promotor,
pod warunkiem, że będzie odpowiedni dla organizmu gospodarza, do którego będą wprowadzane
konstrukcje DNA w celu ekspresji. Gdy ekspresję przeprowadza się w komórkach ssaków,
szczególnie korzystny jest promotor genu immunoglobuliny.
12
170 321
Żądane przeciwciało może być wytworzone w hodowli komórek lub w organizmach
zwierząt transgenicznych. Odpowiednie zwierzę transgeniczne można uzyskać standardowymi
metodami, które obejmują mikrowstrzykiwanie pierwszej i drugiej konstrukcji DNA znajdującej
się pod kontrolą odpowiednich sekwencji do jaj, przeniesienia takich jaj do odpowiednich
osobników żeńskich pseudo-ciężarnych i wybór potomstwa, w którym przeprowadza się ekspresję żądanego przeciwciała.
Gdy łańcuchy przeciwciał mają być wytwarzane w hodowli komórek, konstrukcje DNA
muszą być najpierw wstawione do pojedynczego wektora lub do dwóch oddzielnych ale
zgodnych wektorów, przy czym ta druga możliwość jest korzystna.
Wektory ekspresji, które zawierają co najmniej jedną z opisanych powyżej konstrukcji
DNA, są zdolne do ekspresji w linii komórkowej prokariotycznej lub eukariotycznej.
Następnie każdy wektor zawierający konstrukcję DNA przenosi się do odpowiednich
organizmów gospodarzy. Gdy konstrukcje DNA są wstawione oddzielnie do dwóch wektorów,
mogą też być przeniesione oddzielnie, tj. jeden typ wektora na komórkę, lub mogą być
przeniesione razem i ta możliwość jest korzystna. Odpowiednim organizmem gospodarza może
być linia komórek bakterii, drożdży lub ssaków, przy czym korzystna jest linia komórkowa
ssaków. Bardziej korzystnie, linia komórkowa ssaków jest pochodzenia limfoidalnego, np.
komórki myeloma, hybrydoma lub normalne uśmiercone komórki B, komórki B, w których nie
zachodzi ekspresja ciężkiego lub lekkiego łańcucha endogennego przeciwciała.
Korzystnie, organizm gospodarza zawiera dużą liczbę kopii wektora na komórkę. Jeżeli
organizmem gospodarza jest linia komórkowa ssaków, żądany cel można osiągnąć przez
amplifikację kilku kopii standardowymi metodami. Metody amplifikacji zwykle polegają na
selekcji ze względu na zwiększoną oporność na lek, która jest kodowana przez wektor ekspresji.
Sposób wytwarzania wielołańcuchowej cząsteczki wiążącej CD25 polega na prowadzeniu
hodowli organizmu gospodarza stransformowanego pierwszą i drugą konstrukcją DNA i odzyskaniu z hodowli tej aktywnej cząsteczki.
Alternatywnie ciężkie i lekkie łańcuchy można odzyskać oddzielnie i zrekonstytuować je
w aktywną cząsteczkę wiążącą po złożeniu in vitro. Sposoby rekonstytuowania są dobrze znane
w technice. Przykłady takich metod są szczególnie opisane w EPA 120 674 lub EPA 125 023.
Sposób może zatem także obejmować prowadzenie hodowli pierwszego organizmu, który
jest stransformowany pierwszą konstrukcją DNA i odzyskiwanie z hodowli ciężkiego łańcucha
lub jego fragmentu i b/ prowadzenie hodowli drugiego organizmu, stransformowanego drugą
konstrukcją DNA i odzyskiwanie lekkiego łańcucha lub jego fragmentów i c/ rekonstytuowanie
in vitro aktywnej cząsteczki wiążącej CD25 z ciężkiego łańcucha lub jego fragmentu otrzymanego w a/ i lekkiego łańcucha lub jego fragmentu otrzymanego w b/.
Podobnie wytwarza się także cząsteczkę wiążącą CD25 z pojedynczym łańcuchem lub
pojedynczą domeną, przez prowadzenie hodowli organizmu stransformowanego konstrukcją
DNA, która koduje odpowiednio cząsteczkę wiążącą CD25 o pojedynczym łańcuchu lub z jedną
domeną, i odzyskanie z hodowli takiej cząsteczki.
Cząsteczka wiążąca CD25, wytwarzana sposobem według wynalazku, wykazuje bardzo
dobrą aktywność immunomodulatorową, jak przedstawiono np. w próbie z reakcją mieszanych
limfocytów /MLR/ /Akbar i wsp., J. Immunol., 140, 2171-8/. Uważa się, że MLR in vitro jest
równoważne allogenicznej odpowiedzi na przeszczep, która prowadzi do odrzucenia przeszczepu in vivo.
1. Hamowanie MLR
Z preparatu HPBM od pierwszego dawcy pobiera się 100 μl próbki, zawierające 105
HPBM, do których dodaje się cząsteczkę wytwarzaną sposobem według wynalazku w różnych
stężeniach od 0 do 300 μ l /ml /z włączeniem tych granicznych wartości/. Następnie każdą próbkę
miesza się ze 100 μl próbki zawierającej 105 HPBM niezgodnych z HLA napromienionych
promieniami X od drugiego dawcy lub komórki T z wyczerpanych HPBM. Mieszaninę inkubuje
się przez 6 dni w 37°C, po czym dodaje się 1 μCi 3H tymidyny metylu /3H-Tdr/ w objętości 10 μl.
Po 6 godzinach mierzy się proliferację komórek wykorzystując radioaktywne znakowanie.
170 321
13
W tej próbie cząsteczki wykazują aktywność immunomodulatorową in vitro w stężeniach
od 0,3 (ig/ml jak to przedstawiono na fig. 6. Przy stężeniu około 3 μg/ml zahamowany jest wzrost
komórek w 50%.
Aktywność immunomodulatorową cząsteczek wytwarzanych sposobem według wynalazku można także ocenić mierząc stopień hamowania swoistej odpowiedzi HPBM na antygen
lub hamowania proliferencji limfoblastów T zależnej od IL-2, w następujący sposób:
2. Hamowanie swoistej odpowiedzi HPBM na antygen
Cząsteczki wytwarzane sposobem według wynalazku skutecznie hamują powstawanie
odpowiedzi ograniczonych komórek T HLA klasa II, swoistej dlaPPD /tuberkulina/, co wskazuje
na ich zdolność do hamowania wiązania endogennie wytworzonej IL-2 z jej receptorem. Uważa
się, że te swoiste odpowiedzi na antygen in vivo odgrywają zasadniczą rolę w zapoczątkowaniu
autoimmunizacji i odrzuceniu przeszczepu.
Z preparatów HPBM pobiera się 100 μl próbki zawierające 10 HPBM, do których dodaje
się cząsteczkę wytworzoną sposobem według wynalazku w różnych stężeniach od 0 do 300 μg/ml
/z włączeniem tych granicznych wartości/ i tuberkulinę /PPD/ w ilości, która daje stężenie
końcowe 30 μg/ml. Próbki inkubuje się przez 6 dni w 37°C, po czym dodaje się 1 μCi
3H-tymidyny metylu w objętości 10 μl . Po 6 godzinach inkubacji mierzy się proliferację komórek
przez wbudowywanie radioaktywnych znaczników.
W tej próbie cząsteczki wytwarzane sposobem według wynalazku wykazują aktywność
immunomodulacyjną w stężeniach od około 10 μg/ml jak przedstawiono na fig. 7. Przy około
50 μg/ml zahamowany jest wzrost komórek w 50%.
3. Hamowanie proliferacji limfoblastów T zależnych od IL-2.
Cząsteczki wytwarzane sposobem według wynalazku skutecznie hamują wzrost blastów
ludzkich komórek T zależnych od IL-2 wywołany przez stymulację MLR lub PPD. Uważa się,
że komórki te odgrywają główną rolę w chronicznej autoimmunizacji i epizodach odrzucenia.
Potrójne hodowle zawierające 20 x 10 5-dniowych HPBM stymulowanych PPD lub MLR
w objętości końcowej 200 μl inkubuje się przez 48 godzin w 37°C w obecności 5, 10 lub 20 μg/ml
rekombinantowej IL-2 i cząsteczki wytwarzanej sposobem według wynalazku w różnych
stężeniach w zakresie od 0 do 10 μg/ml /z włączeniem tych granicznych wartości/. Następnie
dodaje się H-Tdr. Po 6 godzinach mierzy się proliferację komórek przez wbudowanie radioaktywnych znaczników. W tej próbie cząsteczki wytwarzane sposobem według wynalazku
wykazują aktywność immunomodulacyjną w stężeniach od 0,1 μl/ml jak przedstaw iono na
fig. 8A i B, 8C i 8D.
Wynalazek zatem umożliwia zastosowanie cząsteczki wiążącej CD25 do immunosupresji
ludzkiego układu immunologicznego, przez podawanie skutecznej ilości takiej cząsteczki wymagającym takiego leczenia pacjentom.
Cząsteczka wiążąca CD25, wytwarzana sposobem według wynalazku, nadaje się do
wytwarzania środków framaceutycznych wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub
rozcieńczalnikiem.
Szczególnie cząsteczka taka nadaje się do zapobiegania odrzuceniu przeszczepu lub do
leczenia objawów odrzucenia.
Dla tych wskazań odpowiednia dawka będzie oczywiście zmieniać się w zależności od np.
konkretnej stosowanej cząsteczki, gospodarza, sposobu podawania oraz charakteru i powagi
stanu, który ma być leczony. W profilaktyce zadowalające wyniki uzyskuje się zwykle przy
dziennej dawce od około 0,1 mg do około 1 mg na kg ciężaru ciała. Dawkę tę można zwiększyć
4-krotnie w przypadku objawów odrzucenia przeszczepu. Cząsteczkę wytwarzaną sposobem
według wynalazku dogodnie podaje się pozajelitowo, zwykle dożylnie, np. do żyły przedłokciowej lub do innej żyły obwodowej. Profilaktycznie typowo podaje się raz dziennie do raz
tygodniowo przez 2 do 4 tygodni, zaczynając w dniu transplantacji, korzystnie na kilka godzin
przed transplantacją.
Cząsteczki wytwarzane sposobem według wynalazku mogą być także użyteczne do
leczenia zjadliwości komórek wytwarzających antygen CD25, np. do leczenia białaczki T-komórkowej i pewnych innych typów białaczki i chłoniaków. W tym celu cząsteczkę wiążącą
14
170 321
CD25 można stosować w postaci radiokoniugatu, w którym cząsteczka jest sprzężona z emitującym promienie a radionuklidem.
Cząsteczki wytwarzane sposobem według wynalazku nadają się także do leczenia lub
profilaktyki infekcji HIV.
W ydaje się, że wirus HIV do mnożenia się wymaga proliferacji komórek T, zatem
zahamowanie tej proliferacji przez blokowanie antygenu CD25 powinno także hamować mnożenie się wirusa.
Środki farmaceutyczne można wytwarzać konwencjonalnym sposobem. Korzystnie wytwarza się je w postaci zliofilizowanej. Do bezpośredniego podawania rozpuszcza się je w
odpowiednim wodnym nośniku, np. w jałowej wodzie do iniekcji lub w jałowej buforowanej
soli fizjologicznej. Jeśli potrzebny jest roztwór o większej objętości do podawania przez infuzję,
korzystnie do soli podczas wytwarzania dodaje się ludzką albuminę surowiczą lub heparynizowaną własną krew pacjenta. Nadmiar takiego fizjologicznie obojętnego białka zapobiega stracie
monoklonalnego przeciwciała przez adsorpcję na ścianach pojemnika i próbówek stosowanych
z roztworem infuzyjnym. Jeżeli stosuje się albuminę, odpowiednie jej stężenie jest w zakresie
od 0,5 do 4,5% wagowych roztworu soli.
Okazało się, że szczególnie dobre wyniki można uzyskać stosując w kombinacji co
najmniej dwie cząsteczki wiążące antygen aktywowanych komórek T, przy czym cząsteczki te
rozpoznają co najmniej dwa różne antygeny charakterystyczne dla aktywowanych komórek T.
Korzystnie stosuje się kombinację dwóch różnych cząsteczek wiążących antygen, z
których każda rozpoznaje inny antygen. Tak więc chociaż obydwie cząsteczki wiążące antygen
rozpoznają powierzchniowe antygeny komórek T, nie zachodzi między nimi konkurencja wobec
samego miejsca wiązania na aktywowanych komórkach T:
Korzystnie jedną cząsteczkę wiążącą antygen jest cząsteczka wiążąca CD25.
Środek immunosupersyjny zawiera mieszaninę co najmniej jednej cząsteczki wiążącej
CD25 i co najmniej jeden antygen inny niż CD25, który jest charakterystyczny dla aktywowanych komórek T.
Do immunosupresji układu ssaków nadaje się kombinacja co najmniej dwóch cząsteczek
wiążących antygen aktywowanych komórek T z jedną inną cząsteczką, przy czym cząsteczki
wiążące antygen rozpoznają co najmniej dwa różne antygeny charakterystyczne aktywowanych
komórek T, z których jednym jest antygen CD25.
Przez "cząsteczkę wiążącą antygen aktywowanych komórek T" należy rozumieć cząsteczkę wiążącą, która mocno reaguje z aktywowanymi komórkami T, natomiast słabo reaguje lub
wcale nie reaguje z komórkami spoczynkowymi T. Korzystnie cząsteczkami wiążącymi antygen
są kompletne cząsteczki immunoglobuliny, bardziej korzystnie mysie, chimeryczne lub humanizowane monoklonalne przeciwciała, zwłaszcza chimeryczne monoklonalne przeciwciała.
Korzystne są te monoklonalne przeciwciała CD25, które zawierają CDR o sekwencjach aminokwasów opisanych powyżej.
Korzystnie powyższe środki farmaceutyczne mogą także zawierać lub mogą być stosowane w kombinacji z lekami immunosupresyjnymi, takimi jak cyklosporyna A.
Korzystnymi monoklonalnymi przeciwciałami dla antygenów aktywowanych komórek T
innymi niż CD25 są typowo przeciwciała zaklasyfikowane do grupy CD7, opisane przez
Reinherza, Haynesa, Nadlera i Bersteina w "Leucocyte Typing II, vol. I human T lymphocytes",
Springer Verlag, 1985. Antygen CD7 powstaje heterogenicznie na około 80% spoczynkowych
komórek T. Jednak ekspresja znacznie zwiększa aktywację /2-3-krotny wzrost intensywności/.
Korzystną kombinacją przeciwciał jest zatem kombinacja przeciwciała CD7 z CD25.
Środek farmaceutyczny korzystnie zawiera mieszaninę co najmniej jednego przeciwciała CD25
z co najmniej jednym przeciwciałem CD7, bardziej korzystnie jednego przeciwciała CD25 z
jednym przeciwciałem CD7. Korzystnie oba przeciwciała są izotypu IgG.
Dwa przeciwciała, ewentualnie razem z lekiem immunosupresyjnym, mogą być stosowane
w praktyce klinicznej w różny sposób. Korzystnie miesza się je razem i pacjentowi podaje się
ich fizyczną mieszaninę. Alternatywnie można podawać przeciwciała i ewentualnie lek immunosupresyjny z oddzielnych zbiorników w dowolnej kolejności, ale w tym samym czasie. Środek
można wytwarzać i podawać pozajelitowo, jak opisano powyżej w odniesieniu do pojedynczego
170 321
15
przeciwciała CD25. Alternatywnie leki immunosupresyjne podaje się doustnie, a monoklonalne
przeciwciała podaje się pozajelitowo, oddzielnie lub w postaci mieszaniny.
Środek farmaceutyczny może zawierać monoklonalne przeciwciała i ewentualnie lek
immunosupresyjny, zapakowane oddzielnie, w tym samym pojemniku, z instrukcją polecającą
zmieszanie lub równoczesne podawanie. Takie zestawy obejmują np. wielocyiindrową strzykawkę lub podwójne opakowanie zawierające oddzielnie dawkę jednostkową co najmniej dwóch
przeciwciał dla aktywowanych komórek T, rozpoznających co najmniej dwa różne antygeny
charakterystyczne dla aktywowanych komórek T, z których jednym jest antygen CD25.
Dotychczasowe badania wskazują, że podawanie przeciwciał w kombinacji z jednym
innym przeciwciałem i ewentualnie z lekiem immunosupresyjnym nie wywołuje niedopuszczalnych efektów ubocznych przy stosowanych poziomach dawek oraz że nie zachodzi synergizm
efektów ubocznych, które obserwuje się podczas stosowania indywidualnych przeciwciał. W
celach profilaktycznych odpowiednia dawka zwykle zawiera 0,05 - 0,5 mg pierwszego przeciwciała /takiego jak przeciwciało CD25/ na kg ciężaru ciała pacjenta i 0,05 - 0,5 mg drugiego
przeciwciała /takiego jak CD7/ na kg ciężaru ciała.
Gdy jako lek immunosupresyjny stosuje się cyklosporynę, zaleca się stosować 2 - 5 mg/kg
ciężaru ciała przy podawaniu pozajelitowym i 10 - 15 mg/kg ciężaru ciała przy podawaniu
doustnym. Środek taki może być podawany codziennie lub co tydzień, korzystnie co tydzień.
Chociaż środek taki jest szczególnie przeznaczony do stosowania w profilaktyce odrzucania przeszczepu, można go także stosować do leczenia symptomów odrzucenia, które aktualnie
występują. W tym przypadku dawkę należy zwiększyć 4-krotnie.
Nadające się do zastosowania mysie monoklonalne przeciwciała są znane per se. Wiele
monoklonalnych przeciwciał dla antygenów powierzchniowych aktywowanych komórek T jest
dostępnych z Kolekcji Kultur w różnych krajach świata, a zwłaszcza American Type Culture
Collection of Rockville, Maryland, USA może dostarczyć odpowiednie monoklonalne przeciwciała lub hybridoma wydzielające takie przeciwciała. Przykładem takiej hybridoma wydzielającej monoklonalne przeciwciało CD7, która jest dostępna z ATCC, jest T3-3 A 1. Inne przeciwciała
CD7 to RFT-2 i CHH 380 /chimeryczne przeciwciało/. Przeciwciała CD25 obejmują oprócz
korzystnego RFT-5 i jego chimerycznej pochodnej, opisanej powyżej, M7/2 /Gaulton i wsp.,
Clin. Immunol, and Immunopath. /1985/, 36, 18/, przeciwciało anty-tac /Uchiyama i in., J.
Immunol. /1981 /, 126, /4/, 1393/ i monoklonalne przeciwciało Campath 6 .
Synergistyczne działanie kombinacji monoklonalnych przeciwciał CD25 i CD7 jest widoczne in vitro w opisanej powyżej biopróbie MLR, a także w testach klinicznych in vivo
przeprowadzonych na ludziach.
W biopróbie MLR obserwuje się hamowanie poboru 3H-TdR w hodowli, do której
pojedynczo dodaje się monoklonalne przeciwciało CD7/RFT2/ lub CD25/RFT5/. Zasadniczo
większy stopień hamowania jest przy stosowaniu tych przeciwciał razem w tym samym stężeniu
całkowitym.-MLR in vitro jest równoważna allogenicznej odpowiedzi transplantacyjnej, która
prowadzi do odrzucenia in vivo, podczas gdy opisane powyżej hamowanie odpowiada immunosupresji in vivo.
W MLR, do której dodaje się cyklosporynę w zakresie dawkowania od 10 μg/ml do 100 μg/ml
w obecności CD7 lub CD25 jest większe hamowanie 3H-TdR w porównaniu z samą cyklosporyną przez cały zakres dawkowania. Kombinacja CD7, CD25 i cyklosporyny wykazuje większy
efekt hamujący niż inna kombinacja.
Do testów klinicznych w zakresie profilaktyki wybiera się pacjentów poddawanych
transplantacji nerki, wątroby lub serca. W dniu transplantacji na 2 goaz. przed operacją przeprowadza się pierwszą dożylną infuzję chimerycznego przeciwciała z przykładu V, razem z
chimerycznym przeciwciałem CD7 /CHH 380/, w dawce 0,2 mg każdego przeciwciała/kg
ciężaru ciała. W dwa dni po operacji podaje się identyczną infuzję dwóch przeciwciał, w dawce
0 ,4 mg/kg ciężaru ciała, następnie powtarza się przez 1 miesiąc co tydzień.
Dożylnie infuzję przygotowuje się w następujący sposób: liofilizowane przeciwciała
miesza się razem i dysperguje się w 100 ml jałowej buforowanej soli zawierającej 4,5%
wagowego ludzkiej albuminy. Taką dyspersję w soli podaje się pacjentom w ciągu 30 minut.
16
170321
Pacjenci poddawani są także standardowej terapii cyklosporyną. U żadnego z pacjentów nie
wystąpiły objawy odrzucenia w ciągu 1 miesiąca terapii.
Krótki opis rysunków
N a fig . 1 A p rz e d s ta w io n o s c h e m a ty c z n ie s tru k tu rę c z ą s te c z k i Ig G ja k ró w n ie ż g e n y
kodujące ciężkie i lekkie łańcuchy. Fig. 1B przedstawia schematycznie zestawienie zmiennych
domen ciężkiego lub lekkiego łańcucha w szkielety /FR/ i regiony nadzmienne /CDR/.
Na fig. 2A i 2B przedstawiono analizę genomowego DNA trawionego za pomocą EcoRI
z mysich hybridoma RFT5 - IgG2a / 1/, RTF5 - IgG 121, RFT4 /3/ i NS-1 /4/ metodą Southema,
stosując sondę DNA znakowaną P, kodującego mysi wzmacniacz ciężkiego łańcucha /fig. 2A/
lub kodującego mysi k, oraz pięciu segmentów genu Jk /fig. 2B/. 10 μg genomowego DNA
trawi się EcoRI i poddaje się frakcjonowaniu ze względu na wielkość w 0,8% żelu agarozowym.
Następnie fragmenty przenosi się na filtr nitrocelulozowy i hybrydyzuje się z sondą. Po
przemyciu błonę poddaje się naświetlaniu przez noc na kliszy Kodak X -0 Mat.
Na fig. 3A i 3B przedstawione są wektory macierzyste pSV2-neo-huCyl i pSV2-DHF
R -E μ-H u C k . Obydwa plazmidy zawierają gen oporności na ampicylinę /ampR/ i sekwencję
początku replikacji pB
32
R
i SV40 /pBR322ori i SV40 ori/.
pSV2-neo-huCyl charakteryzuje obecność genu oporności na neomycynę /neoR/ i genu
kodującego ludzką stałą część γ1 /huC γ1/, natomiast w wektorze pSV2-DHFR-E μ.-huCK jest
wstawiony gen reduktazy dihydrofolanowej /DHFR/ /oporność na metotrexat/ i gen kodujący
ludzką stałą część K /huCtc/- Końcowe wektory, w których zachodzi ekspresja chimerycznego
ciężkiego i lekkiego łańcucha wytwarza się odpowiednio przez wstawienie do pSV2-neo-hCyl
fragmentu DNA kodującego peptyd liderowy FU i zmienną domenę /VDJ 2/ ciężkiego łańcucha
RFT-IgG2a razem ze wzmacniaczem ludzkiego ciężkiego łańcucha oraz przez wstawienie do
pSV2-DHFR-E μ-huCK fragmentu DNA kodującego peptyd liderowy /L / i zmienną domenę
/VJ2/ lekkiego łańcucha RFT5-IgG2a.
Na fig. 4A i 4B przedstawiono produktywność puli pojedynczych komórek hodowanych
w obecności metotrexatu /M TX/ o wzrastającym stężeniu, zgodnie z procedurą A i B opisaną w
przykładzie V. Na osi Y podano ilość wytworzonego monoklonalnego przeciwciała w mg/10 9
komórek w ciągu 72 godzin.
Na fig. 5 przedstawiono protokół dla przeprowadzenia insercji kaset CDR do wektora
zawierającego 4 regiony zrębu sfuzowane razem.
Na fig .6 przedstawiono hamowanie MLR przez /x/RFT 5 -IgG 2 a/γ2a, k / i /o/ chimeryczne
Mab mysz x człowiek, wytwarzane sposobem według wynalazku/ γ1, k/. Obydwa Mab zawierają
zmienne domeny jak przedstawione w Identyfikacji Sekwencji nr 1 i 2.
N a fig. 7 przedstaw iono ham ow anie odpow iedzi HPBM sw oistej dla PPD przez
/x/ RFT5-IgG2a i /o/ takiego samego chimerycznego Mab mysz-człowiek.
Na fig. 8 przedstawiono działanie RFT5-IgG2a i takiego samego chimerycznego Mab
mysz - człowiek na proliferację PPD limfoblastów T /fig. 8 A i 8 B/ i na proliferację MLR
limfoblastów T /fig. 8 C i 8 D / przy stężeniu IL-2 5 ng/ml /o/, 10 ng/ml / · / i / 20 ng/ml /x/.
Sposób według wynalazku wytwarzania chimerycznego przeciwciała CD25 jest zilustrowany następującymi przykładami.
P r z y k ł a d I. Klonowanie genu kodującego zmienną domenę ciężkiego łańcucha
RFT5-IgG2a.
Wydziela się genomowy DNA z komórek hybridoma RFT5-IgG2a /CD25; γ2a, k/,
RFT5-IgGl /CD25; γ1; k/ i RFT4 /CD4; γ1; k/ i z hybrydoma macierzystej linii komórek
szpiczaku, mianowicie z NS-1 i trawi się EcoRI. Następnie każdy trawiony DNA frakcjonuje
się na takim samym żelu agarozowym. Po migracji żel agarozowy analizuje się metodą Southema
stosując jako sondę znakowany P fragment DNA Xbal-EcoRI o długości 0,7 kz, który koduje
mysi wzmacniacz ciężkiego łańcucha /Heinrich i wsp., J. of Immunol. /1989/ 143, 3589/. Na
żelu po hybrydyzacji widoczne są 3 typy pasm, jak przedstawiono na fig. 2. Fragment EcoRI o
długości 6,5 kz jest obecny w produktach trawienia DNA z wszystkich linii komórkowych, w
tym NS-1, macierzystej linii komórek szpiczaku, a zatem nie jest interesujący. Natomiast
fragment EcoRI o długości 2,9 kz wykryto tylko w produktach trawienia DNA z hybridoma
RFT5-IgG1, prawdopodobnie w wyniku nienormalnego przegrupowania genów. Zatem wybra-
170 321
17
nym fragmentem jest fragment EcoRI o długości 6 ,8 kz, który nie występuje w produktach
trawienia DNA z macierzystej linii komórkowej i ten fragment konsekwentnie oczyszcza się
dalej na drodze preparatywnej elektroforezy na żelu agarozowym.
Fragmenty DNA o długości w przybliżeniu 5-7 kz klonuje się w miejsce restrykcyjnę
EcoRI bakteriofaga ZAP /Stratagene/. Stosując opisaną powyżej sondę selekcjonuje się 6 x 1 0 6
zrekombinowanych fagów i wybiera się do hybrydyzacji 11 klonów. Inserty DNA z 11 klonów
amplifikuje się na lizacie faga na płytce metodą PCR stosując jako primer pierwszy oligonukleotyd kodujący mysi gen Jz i drugi oligonukleotyd kodujący początek ciężkiego łańcucha RFT5
do 7-go aminokwasu /sekwencję określono uprzednio/.
Drugi primer jest zaprojektowany z uwzględnieniem najczęściej stosowanych kodonów
genu. Fragmenty DNA otrzymane z każdego z 11 klonów poddaje się analizie Southema stosując
jako sondę oligonukleotyd kodujący sekwencję aminokwasów od aminokwasu 20 do 27 ciężkiego łańcucha RFT5, który jest także zaprojektowany z użyciem najczęściej stosowanych
kodonów. Stosując tę sondę wykryto 9 identycznych klonów fagowych. Część insertu DNA,
która koduje zmienną domenę, sekwencjonuje się metodą zakończenia dideoksy, co jest widoczne w Identyfikacji Sekwencji nr 1
P r z y k ł a d II. Konstrukcja chimerycznego genu ciężkiego łańcucha RFT5
Fragment DNA o długości 6 kz otrzymany przez trawienie za pomocą EcoRI DNA jednego
z 9 klonów fagowych i zawierający gen zmiennej domeny ciężkiego łańcucha RFT5 /obejmujący
promotor i wzmacniacz/ klonuje się w miejsce restrykcyjne Eco RI w stałej części eukariotycznego wektora ekspresji pSV2 neohuman γ1/Heinrich i wsp., j.w ./ja k przedstawiono na fig. 3A.
Następnie ponownie określa się sekwencję nukleotydów genu kodującego zmienną domenę
ciężkiego łańcucha RFT5, aby wykluczyć możliwość mutacji genu podczas propacji plazmidu.
P r z y k ł a d HI. Klonowanie genu kodującego zmienną domenę lekkiego łańcucha RFT5.
Wydziela się genomowy DNA z hybridoma RFT5, RFT5X i RFT4 i z linii komórek
macierzystych NS-1 i trawi się EcoRI. Następnie każdy trawiony DNA frakcjonuje się w tym
samym żelu agarozowym. Po migracji analizuje się żel agarozowy metodą Southema stosując
jako sondę fragment DNA znakowany P, zawierający 5 mysich genów J k i gen mysi C k .
Na żelu po hybrydyzacji widoczne są 3 główne typy pasm odpowiadających fragmentom
o długości w przybliżeniu 12, 16 i 18 kz, jak przedstawiono na fig. 2B. Największe fragmenty
są tylko specyficzne dla hybridoma RFT5. Frakcjonowane fragmenty EcoRI o długości w
przybliżeniu 18 kz klonuje się w fagu EMBL4 /Stratagene/. 7 x 1 0 3 zrekombinowanych klonów
fagowych poddaje się selekcji za pomocą opisanej powyżej sondy i do hybrydyzacji wybiera się
dwa klony, z których każdy zawiera identyczne inserty o długości 18 kz. Przedstawiony jest
podfragment EcoRI - Xbal o długości 4,4 kz, który zawiera pełny gen kodujący zmienną domenę
lekkiego łańcucha RFT5 i który jest klonowany do plazmidu pGEM4 /Stratagene/. Określa się
sekwencję fragmentu o długości 4,4 kz. Sekwencjonuje się część insertu DNA 4,4 kz, która
koduje zmienną domenę. Sekwencja jest przedstawiona w Identyfikacji Sekwencji nr 2.
P r z y k ł a d IV. Konstrukcja genu chimerycznego lekkiego łańcucha RFT5.
Fragment Xbal - Xbal o długości 1,1 kz kodujący mysi wzmacniacz ciężkiego łańcucha
/Heinrich i wsp., j.w ./ razem z fragmentem H indlll - SphI kodującym ludzką stałą część K
subklonuje się w fagu m p 18 /Stratagene/. Po rozerwaniu miejsc restrykcji przez mutagenezę
wypełniony w EcoRI - HindIII fragment, zawierający sekwencję kodującą mysi wzmacniacz
ciężkiego łańcucha /R μ/ i ludzką stałą część K /huCk/ klonuje się w wypełnionym w miejscu
EcoRI - BamHI plazmidzie pSV2 - DHFR. pSV2 - DHFR wytwarza się przez zastąpienie
fragmentu BamHI - HindIII w plazmidzie pSV2-neo fragmentem BamHI - HindIII kodującym
gen DHFR.
Następnie do pSV2-DHFR-E μ-huCK wstawia się fragment EcoRI-XbaI o długości 4,4 kz
z przykładu III.
P r z y k ł a d V. Ekspresja chimerycznego przeciwciała RFT5.
Mysią linię komórkową szpiczaku SP2/0 /ATCC C R L 1581/ kotransfekuje się plazmidami
wytworzonymi jak w przykładach II i IV, metodą elektroporacji aparat "pulser genowy" firmy
Biorad. Jest to znana metoda wytwarzania trwałych transfektantów przy wysokiej częstotliwości.
18
170 321
Linia komórkowa S P 2/0 nie wytwarza endogennych ciężkich i lekkich łańcuchów i jest
wrażliwa na genetycynę /G-418/ o stężeniu 0,8 mg/l.
Prowadzi się hodowlę komórek SP2/O w zwykłej pożywce hodowlanej RPMI, 10% FCS,
5 x 1 0 -5 ß-merkaptoetanolu/, w fazie logarytmicznej wzrostu zbiera się i przemywa buforem
elektroporacji /Bio-Rad/. Stężenie komórek doprowadza się do wartości 2 x 1 0 7 komórek/ml.
Do 0,8 ml zawiesiny komórek dodaje się 15 - 20 μg każdego plazmidu. Mieszaninę umieszcza
się na lodzie i pozostawia do odstania na 10 minut. Następnie komórki poddaje się działaniu
impulsu elektrycznego /280 V; 25 uF/ i znów pozostawia się do odstania na 15 minut. Komórki
przenosi się do zwykłej pożywki hodowlanej i inkubuje się w 37°C w inkubatorze w atmosferze
CO 2 .
Po 3 dniach inkubacji zaczyna się przeprowadzać selekcję ze względu na oporność na
G 418. Komórki zawiesza się w świeżej pożywce zawierającej 1,4 mg/ml G 418. Określa się
wydajność wzrostu komórek po 10 -14 dniach inkubacji w obecności G 418. Po 2 tygodniach
inkubacji supernatanty ze zlewających się hodowli bada się na ekspresję ludzkiej IgG w układzie
typu "sandwich" ELISA /anty-ludzki lekki łańcuch k /supernatant/koniugat anty-ludzka IgG-alkaliczna fosfataza/.
Ten test wykazuje, że we wszystkich hodowlach wydzielana jest kompletna cząsteczka
przeciwciała w zmiennych stężeniach w zakresie 50 - 500 ng/ml.
Selekcję komórek, w których został zamplifikowany gen DHFR, a więc wydzielających
dużą ilość żądanego przeciwciała przeprowadza się według dwóch procedur wykorzystując
oporność na Metotreksat /MTX/, j ak opisano poniżej. W tym celu każdą z pul komórek opornych
na G 418 dzieli się i amplifikuje według procedury A /współczynnik wzrostu ilości MTX 2 lub
2,5/ lub procedury B /współczynnik wzrostu MTX 5/.
Procedura A
|
100 nM M TX
|
250 nM M TX
Procedura B
|
200 nM MTX
|
1 μM MTX
500 nM M TX
5 μM MTX
1 μM M TX
25 μM MTX
μM M TX
5 μM M TX
1 0 μM M TX
25 μM M TX
100 μM M TX
100 μM MTX
2,5
Każdy etap amplifikacji obejmuje zaszczepianie komórek z gęstością 2 x 10 5 komórek/ml
w zwykłej pożywce uzupełnionej G 418 w ilości 1,4 mg/ml i MTX w wybranym stężeniu. Po
72 godzinach inkubacji rozdziela się komórki i supernatant. Wydzielanie przeciwciała rejestruje
się metodą ELISA albo HPLC stosując kolumnę z białkiem A.
Na fig. 4A i 4B przedstawiono produktywność niektórych stransfekowanych puli w
wytwarzaniu przeciwciała. Większość osiąga maksymalną produkcję specyficznego przeciwciała przy pewnych stężeniach MTX. Najlepsze pule klonuje się przez ograniczające rozcieńczenie.
Z kilkuset analizowanych klonów wybiera się 15 najlepszych pod względem produkcji przeciwciała. Produktywność klonów jest w zakresie od 30 do 50 mg MAb/10 9 komórek w ciągu 72
godzin.
Przeciwciało wydziela się z supernatantu przez elucję na kolumnie powinowactwa z
białkiem A.
Identyfikacja Sekwencji nr 1
Podmiot:
Zmienna domena ciężkiego łańcucha immunoglobuliny przeciwciała
RFT5
Typ sekwencji: Sekwencja nukleotydów i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasów
Typ cząsteczki: Genomowy DNA
170 321
19
Długość:
492 nukleotydy
Pochodzenie:
hybridoma mysia
Cechy sekwencji nukleotydów:
Intron jest zlokalizowany od nukleotydu 47 do 130
V segment genu od nukleotydu 142 do 435
D segment genu od nukleotydu 436 do 447
J segment genu od nukleotydu 448 do 492
Cechy sekwencji aminokwasu:
Peptyd liderowy: od aminokwasu /a.k./ -19 do -1
FR1: od a.k. 1 do 30
CD R 1: od a.k. 31 do 35
FR2: od a.k. 36 do 49
CDR2: od a.k. 50 do 66
FR3: od a.k. 67 do 98
CDR3: od a.k. 99 do 106
FR4: od a.k. 107 do 117.
ATG GAA TGT AAC TGG ATA GTTCCT TTT
Mot G lu
Cys Asn Trp I l e Leu
ATT CTG TCG GTA ATT TCA G
P ro Phe I l e
-1 5
46
Leu S e r V al I l e S e r
-1 0
-5
GTAAGGGGCT CACCAGTTCC ATATCTGAAA GAGGATACAG GGTCTGAAGT GACAATGACA
106
TCTACTCTGC TGTTCTCTCC ACAG
156
GG GTC TAC TCA GAG GTT CAG CTC CAG
G ly V a l T yr
S e r G lu V a l G in Leu G in
- 1 1
5
CAG TCT GGG ACT GTG CTG GCT AGG
CCT GGG GCT TCC GTG AAG ATG TCC
Gl n S e r G lu Thr V al Leu A la Arg
P ro Gly A la S e r V al Lys Met S e r
10
15
20
TGC AAG GCT TCT GGC TAC AGC TTT
ACC AGG TAC TGG ATG CAC TGG ATA
Cys L ys A la S e r G ly T yr S e r Phe
T hr Arg T yr Trp Met H is Trp I l e
25
30
40
B lu Trp I l e
50
GGA AAT AGT GAT ACT AGT TAC AAC CAG AAG TTC GAG GGC AAG GCC AAA
55
65
CTG ACT
GCA GTCACA TCC GCCAGC ACT GCC TAC ATG GAG CTC AGC AGC
Leu Thr
A la Val Thr S e r
A la S e r Thr
A la
75
80
85
CAT GAG GAC TCT GCGGTC TAT TAC TGT TCA AGA GAC TAC GGC
Leu Thr
H is Glu Asp S e r
A la V al T yr
90
Tyr
105
Phe
95
Trp
Gly
110
444
Cys S e r Arg Asp Tyr Gly
100
TAC TACTTT GAC TTC TGG GGC CAAGGC ACC ACT CTC ACA
Phe Asp
396
Tyr Met G lu Leu S e r S e r
CTG ACA
Tyr T yr
348
G in L ys Phe G lu G ly L ys A la Lys
60
70
300
Gly A la I l e T yr Pro
45
Gly A sn S e r Asp Thr S e r T yr A sn
252
35
AAA CAG AGG CCT GGA CAG GGT CTA GAA TGG ATT GGT GCT ATT TAT CCT
Lys G in Arg Pro G ly G in Gly Leu
204
Gl n G ly Thr
Thr
GTC TCC TCA
Leu
115
492
Thr V al S e r S er
20
170 321
Identyfikacja Sekwencji nr 2
Zmienna domena lekkiego łańcucha immunoglobuliny przeciwciała
RFT5
Typ sekwencji: Sekwencja nukleotydów i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasów
Typ cząsteczki: Genomowy DNA
Długość:
455 nukleotydów
Pochodzenie:
Hybridoma mysia
Cechy sekwencji nukleotydów:
Intron jest zlokalizowany od nukleotydu 50 do 226
V segment genu: od nukleotydu 244 do 510
J 2 segment genu: od nukleotydu 520 do 555
Cechy sekwencji aminokwasów:
Peptyd liderowy: od aminokwasu /a.k./-22 do -1
FR1': od a.k. 1 do 23
C D R 1': od a.k. 24 do 33
FR2': od a.k. 34 do 48
CDR2': od a.k. 49 do 55
FR3': od a.k. 56 do 87
CDR3': od a.k. 88 do 94
RF4': od a.k. 95 do 104.
Podmiot:
ATG GAT
TTT CAGGTG CAG
ATT TTC AGC TTC CTG CTA ATCAGT GCC TCA G
Met A sp
P h e Gl n V a l Gl n
I l e Phe S e r Phe Leu Leu I l e
-2 0
-1 5
49
S e r A la S e r
-1 0
GTAACAGAGG GCAGGGAATT TGAGATCAGA ATCCAACCAA AATTATTTTC CCTGGGGAAT
109
TTGAGTCTAA AATACAGTTT TTTTTTCTTT TTCTTCATCT GAATGTTGGG TGGTATAAAA
16 9
TTATTTTTGT TTCTCTATTT CTACTAATCC CTTTCTCTCT ATTTTGCTTT TTTCTAG
226
TC ATA
V al I le
CTG TCCAGA GGA
CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCTCCA GCA ATC
Leu S e r Arg Gly
Gl n I l e V al Leu Thr Gl n S e r
-5
- 1
1
P ro A la I l e
5
10
ATG TCT GCA TCT CCA GGGGAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC
Met S e r A la S e r P ro Gly G lu Lys
V al Thr
15
20
S e r T yr Met G in Trp
30
25
40
CCC AAA
AGA TGGATT TAT
GAC ACA TCC AAA CTG GCT TCT GGA CTC CCT
P ro L ys
Arg T rp I l e Tyr
Asp Thr S e r Lys Leu A la S e r
50
55
65
70
AGC AGC ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAT CAG CGG
S e r S e r Met G lu A la G lu Asp A la A la Thr Tyr Tyr Cys H is Gl n Arg
80
85
AGT AGT TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAA CTG GAA ATA AAA
S e r S e r Tyr Thr Phe G ly G ly Gly Thr Lys Leu Glu I l e L ys
95
465
S e r Gly S e r Gly Thr S e r Tyr S e r Leu Thr I l e
60
75
417
Gly V al P ro
GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAT TCT CTC ACA ATC
A la Arg Phe S e r G ly
369
Tyr Gl n Gl n Lys P ro Gly Thr S e r
35
45
32 1
Met Thr Cys S e r A la S e r
TCA AGT ATA AGT TAC ATGCAG TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGC ACC TCC
S e r S er I le
273
100
513
90
555
170 321
21
Tabela
Region
FR1
C D R1
FR2
CDR2
FR3
CDR3
FR4
Lokalizacja w ciężkim łańcuchu
Lokalizacja w lekkim łańcuchu
aminokwas 1 do 30/czasem z resztą w pozycji 0/
aminokwas 31 do 35/ z możliwymi insertami
oznaczonymi jako 35A, 35B/
aminokwas 36 do 49
aminokwas 50 do 65 /z możliwymi insertami
oznaczonymi jako 52A, B i C/
aminokwas 66 do 94 / z możliwymi
insertami oznaczonymi jako 82A, B i C/
aminokwas 95 do 102 /z możliwymi
insertami oznaczonymi jako 100A, B, D, E,
F, G, H, I, J i K/
aminokwas 103 do 113
aminokwas 1 do 23 /czasem z resztą w pozycji 0 i 2 i delecją w 10 w łańcuchach/
aminokwas 24 do 34 /z możliwymi insertami
oznaczonymi jako 27A, B, C, D, E i F/
aminokwas 35 do 49
aminokwas 50 do 56
aminokwas 57 do 88
aminokwas 89 do 97 /z możliwymi insertami
oznaczonymi jako 95A, B, D, E i F/
aminokwas 98 do 107 / z możliwymi
insertami oznaczonymi jako 106A/
170321
Fig. 2A
Fig. 2B
170 321
Fig. 3A
Fig. 3B
170 321
Fig. 4 A
Fig. 4 B
170 321
F ig u r a 5
170 321
Fig. 6
Fig. 7
170 321
Fig. 8 A
Fig. 8 C
Fig. 8 B
Fig. 8 D
170 321
Fig. 1A
fig. 1B
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.
Cena 4,00 zł