Media:W_6_gen
advertisement
W6 Cosmid – DNA bakterii + dNA fagowe - ułatwia wprowadzenie do komórek obcego DNA - wektor Ti – plazmid bakteryjny, infekuje rośliny (brodawki korzeniowe) Agrobacterium tymefacieus- może koniugować z E.coli; można robić operacje na E. Coli - Adenowirus – najczęstszy wektor; wywołuje schorzenia płuc; onkogeniczny; do terapii genowej; leczenie SCIT; nie utrzymuje się samodzielenie zbyt długo w komórkach. VEGF – czynnik wzrostu nabłonka naczyń krwionośnych - Ligacja DNA – łączenie cząsteczek DNA za pomocą ligazy; łączenie szkieletów DNA, fragmenty zakończone lepkimi końcami Klonowanie cDNA- DNA komplementarny,synteza. Genów nieciągłych nie ma w bakteriach. Musimy użyć genu bezintronowego by ekspresja genu eukariotycznego mogła zajść w bakterii. Punkt wyjścia do syntezy genu kodującego białko w bakteriach. Kodowanie genu na hormon wzrostu (z przysadki) RNAcDNA szczepy bakteryjne produkujące hormon Biblioteka genów – zbiór wektorów z DNA; kolonie bakterii; wiele kopii np. plazmidu Hybrydyzacja łysinkowa lub kolonijna – 2 łańcuchy DNA chcemy wykryć gen, musimy znać sewencję tego genu; wybieramy fragment i znakujemy; sprawdzamy czy w bakterii znajdzie się DNA hybrydyzujące z sondą molekularną (znacznikiem) Komplementacja mutacji – odwrócenie mutacji pokarmowej - hybrydyzacja łysinkowa – fag lambda; nie mamy kolonii ale łysinki (te miejsce gdzie fag się namnożył i wygryzł bakterie) hybrydyzacja DNA z sondąklisza fotograficzna Jak poznać sekwencje DNA? - by hybrydyzacja zaszła musi być 20 nukleotydów komplemntarnych - informacja o sekwencji- znamy sekwencje homologiczne u innych organizmów.sondą jest gen ze spokrewnionego organizmu/ - znamy sekwencję białka to można odtworzyć sekwencję DNA bo kod genetyczny jest zdegenerowany.robimy zbór sond gdzie dodajemy- 2 warianty sond Hybrydyzacja Southern blot - podstawowa technika biologii molekularnej - E. Southern wymyślił przenoszenie DNA z żelu na filtr nitrocelulozowy (bibuła)na niej zatrzymuje się DNA a przechodzi rozwtór, w którym to DNA było; filtr kładzie się na żelu bibuła; ciężarek; u dołu bufor zasysany w bibułę i cząsteczki z żelu osadzają się w nitrocelulozie. - Przykładamy kliszę do filtrów i patrzymy, który DNA hybrydyzuje Hybrydyzacja northern - tak samo jak na southern tylko sondą jest DNA a hybrydyzuje RNA - w jakiej tkance funkcjonuje jakiś gen; izoluje się RNA z różnych tkanek i rozdziela się na żelu; sprawdza się ile tego RNA w tkankach Hybrydyzacja in situ - sprawdzić czy komplementarne DNAw postaci hybrydyzacji in situ. Celem takiego doświadczenia jest identyfikacja struktur anatomicznych, w których zachodzi ekspresja określonego genu. FISH - fluorescent in situ hybridisation - w którym miejscu na chromosomie jest dany gen- fluorescencja – sonda Western blot - rozdział białek na żelu, a pomocą sondy sprawdzamy gdzie cząsteczka się znajduje; sondą jest przeciwciało, które wiąże się na filtrze DNA chip - szkiełko na którym synteza łańcuchów DNA – 60 tys. Łańcuchów synteza oligo – DNA na chipachhybrydyzacja na wielu genach. Chip wsadzamy do roztworu RNA. RNA wyznakowany fluorescencyjnie; gdzie są hybrydyzujące Sekwencjonowanie DNA - na żelach wylewa się go między płyty szklane; nalewa się rozpuszczalny akrylamid elektroforeza na żeluzautomatyzowane sekwencjonowanie Ukierunkowana mutageneza - zmienić konkretny gen w konkretny sposób - enzymy o zmienionych właściwościach - zamieniamy jedną trójkę nukleotydów na inną, by zmienić aminokwas w białku. - Sprawdzić ,które sekwencje są konieczne do regulacji Gene disumption - mutowanie określonych genów - jeżeli chcemy by zmutował konkretny gen używamy genu homologicznego do sekwencji ale w środku ma jakiś inny fragment - podwójne crossing over – marker znajdzie się w środku - gen zniszczony; ramka odczytu zmieniona - by ustalić do czego służy dany gen - knock-out mutacje; do badania chorób The Yeast Two Hybrid System – czy są białka oddziałujące z jakimś białkiem X
