Analiza i ocena metod badania adhezji bakterii do powierzchni

Analiza i ocena metod badania adhezji bakterii do
powierzchni metalowych o różnym składzie
pierwiastkowych
Żywicka A., Fijałkowski K., Nawrotek P.
Studenckie Koło Naukowe Mikrobiologów, Katedra Immunologii, Mikrobiologii i Chemii Fizjologicznej, Zachodniopomorski Uniwersytet
Technologiczny w Szczecinie, Szczecin
Wstęp
Materiały i metody
Wiele drobnoustrojów posiada zdolność do adhezji do powierzchni metalowych. We
współczesnej inżynierii materiałowej coraz częściej poszukuje się stopów metali,
które wykazują właściwości antyadhezyjne wobec mikroorganizmów. Jednakże,
badania adhezji na powierzchniach metalowych, ze względu na ich właściwości
fizykochemiczne są często utrudnione.
Materiał do badań stanowiło 12 płytek metalowych o różnym składzie
pierwiastkowym (Tab.1). Adhezja oceniana była po inkubacji bakterii
(Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, i Acinetobacter
baumannii) z badanymi próbami metali. Do oceny stopnia adhezji wykorzystano
następujące metody: test redukcji MTT, test AlamarBlue (test bezpośredni i
pośredni), barwienie safraniną oraz posiewy powierzchniowe po inkubacji prób
badanych w roztworze saponiny. Ponadto, ocenę liczebności bakterii na
powierzchni prób dokonano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.
Cel
Celem niniejszej pracy była ocena stopnia adhezji bakterii do metalowych
powierzchni o różnym składzie pierwiastkowym.
Tab.1. Skład pierwiastkowy prób
Wyniki
Ryc.1. Próba ślepa z AlamarBlue. Intensywność koloru różowego jest
proporcjonalna do ilości żywych komórek w zawiesinie.
Badania wykazały, że pierwiastki wchodzące w skład powierzchni metalowych
mogą reagować ze składnikami testów AlamarBlue i MTT dając reakcję podobną
bądź taką sama jak żywe komórki bakterii. Największą reaktywnością
charakteryzowały się próby, w których skład wchodził cynk - próby 1, 2, 3 (dołki 1A,
1B, 1C).
A
C
B
D
Lp.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Powłoka próby
Ocynk ogniowy, cynkowanie w temperaturze otoczenia
Ocynk galwaniczny
o
Ocynk ogniowy, cynkowanie w temperaturze 250 C
Fe/Ni5sCu10Nib10Crr
Fe/Ni5sCu
Fe/Ni 5sCuNi20dCrr
Fe/Cu
Fe/Ni10bCrr
Fe/Ni20bCrr
Fe/Ni5Cu10Nib10
Mosiądz manganowy MM59, (CuZn40Mn)
Miedzionikiel MN25, (CuNi25)
Gdzie: 20 – minimalna grubość powłoki niklowej (10m), d – jednowarstwowa
powłoka niklowa o grubości minimum 10m, Crr – powłoka chromowa zwykła o
minimalnej grubości 0,3m, s – powłoka jednowarstwowa niklowa matowa, 5s –
minimalna grubość powłoki niklowej 5m, Cu10 – minimalna grubość powłoki
miedzianej 10m. W dalszej części prezentowanej pracy kolejność prób została
zachowana jak w tabeli 1.
A
B
Ryc. 2. Testy pośrednie i bezpośrednie dla MTT (A, B) i Alamar blue (C, D).
W płytce 96-dołkowej widoczne są 3 kolejne powtórzenia każdej z 12 prób. Testy
MTT i AlamarBlue dawały prawidłowe wyniki tylko w przypadku wykonywania testu
pośredniego. Pomimo braku żywych komórek w testach bezpośrednich uzyskiwano
pozytywne wyniki.
A
B
100
80
60
40
20
0
Test pośredni AlamarBlue
40
% kontroli
% kontroli
Test pośredni MTT
1
2
3
4
5
6
7
8
Ryc. 5. Metoda posiewów
dziesiętnych. Rozcieńczenie
10-4 dla Acinetobacter
baumannii
30
20
10
0
9 10 11 12
1
Numer próby
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12
Numer próby
Test bezpośredni, barwienie safraniną
C
% kontroli
80
60
40
20
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Ryc.6. Badanie właściwości bakteriostatycznych.
(A) zahamowany wzrost bakterii, (B) brak właściwości
bakteriostatycznych.
W metodzie posiewów dziesiętnych wyniki były zadowalające, jednak trudność
stanowił dobór odpowiedniego rozcieńczenia. Przy dużej liczbie prób, ze względu
na czasochłonność test może być mniej użyteczny.
W dalszych badaniach wykazano właściwości bakteriostatyczne prób 1, 2 i 3, co
przy metodzie posiewów powierzchniowych mogło wpływać na zafałszowanie
wyników.
10 11 12
Numer próby
Ryc.3. Ocena stopnia adhezji do powierzchni metalowych na przykładzie
Acinetobacter baumannii. Test pośredni dla MTT (A) i AlamarBlue (B) oraz test
bezpośredni dla testu barwienia safraniną.
A
B
Ryc. 4. Barwienie safraniną 0,1%.
Próby w skład, których wchodził cynk (1,2 i 3) cechowały się wysoką reaktywnością z
kwasem octowym 30% wykorzystywanym w teście barwienia safraniną (A). Reakcja
ta spowodowała zniszczenie powłoki cynkowej prób. W przypadku pozostałych prób
nie zaobserwowano takiej reakcji (B).
Ryc.7. Obraz z mikroskopu
fluorescencyjnego, próba nr 1.
Ryc.8. Obraz z mikroskopu
fluorescencyjnego, próba nr 6.
Przy zastosowaniu mikroskopu fluorescencyjnego nie było możliwe oznaczenie
stopnia adhezji w próbach o zróżnicowanej powierzchni (Ryc.7). Tylko w
przypadku prób o gładkiej i jasnej powierzchni było to możliwe (Ryc. 8).
Wnioski
Na podstawie badań można stwierdzić, że przy doborze metody badania adhezji do powierzchni metalowych należy kierować się ich składem, strukturą, zabarwieniem,
stopniem utlenialności, wrażliwością na zmiany pH, a także reaktywnością z poszczególnymi składnikami wykorzystywanych w badaniach testów. Porównywalne wyniki
uzyskano dla wszystkich wykorzystanych w doświadczeniu bakterii.