Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmów

Identyfikacja taksonomiczna
mikroorganizmów
Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmów
Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmu określenie przynależności badanego organizmu do
odpowiedniej jednostki taksonomicznej, najczęściej
gatunku
 Gatunek - populacja mikroorganizmów wykazujących
wysoki stopień podobieństwa w ściśle określonym
zakresie cech, a różniących się od innych gatunków tego
samego rodzaju
Identyfikacja taksonomiczna bakterii
 Szczep – grupa drobnoustrojów potomnych jednej komórki
 Szczep referencyjny – izolat danego gatunku opisany jako
pierwszy i najlepiej scharakteryzowany (wzorzec)
 Gatunek – wiele szczepów podobnych w ściśle określonym
zakresie cech
 Gatunek – grupa szczepów, w tym szczep referencyjny,
wykazujących co najmniej 70% homologii pełnego
genomowego DNA
Identyfikacja taksonomiczna bakterii
 Gatunek – grupa szczepów różniących się zawartością
G+C w genomowym DNA nie więcej niż o 3% molowe
nG + nC
% G+C =
x 100%
nA + nT + nC + nG
 W obrębie rodzaju różnice w %mol G+C nie mogą przekroczyć 10%
Cechy umożliwiające identyfikację bakterii
















morfologia
skład chemiczny ściany komórkowej
obecność inkluzji komórkowych i substancji zapasowych
zdolność do tworzenia pigmentów
sposób odżywiania
wymagania pokarmowe
źródła C, N, S
skład jakościowy i ilościowy produktów fermentacji
wymagania tlenowe
zakres temperatur i pH wzrostu
wrażliwość na antybiotyki
patogenność
zależności symbiotyczne z innymi organizmami
środowisko występowania
obecność określonych antygenów (charakterystyka immunologiczna)
sekwencja DNA genomowego
Metody identyfikacji mikroorganizmów
Podział metod identyfikacji mikroorganizmów:
a) biochemiczne
b) biofizyczne
c) biologii molekularnej
d) immunochemiczne
Metody biochemiczne
Polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów
do asymilacji, fermentacji lub rozkładu określonych
związków chemicznych
 cechy biochemiczne określa się na podstawie reakcji
chemicznych zachodzących w odpowiednio skomponowanych
pożywkach wzrostowych
 wyniki testów biochemicznych odczytuje się makroskopowo
• wzrost lub jego brak
• zmiana zabarwienia pożywki
• reakcja barwna po wprowadzeniu odczynnika reagującego z
wytwarzanym metabolitem
• wytworzenie gazu
Testy biochemiczne
Zawieszenie
Naniesienie
INKUBACJA
(18 – 48 h)
Interpretacja wyników w teście API (bioMerieux)
Metody biofizyczne
Umożliwiają identyfikację taksonomiczną
mikroorganizmów poprzez oznaczanie produktów ich
metabolizmu lub wybranych związków wchodzących w
skład struktur komórkowych
 Techniki elektroforetyczne
 Techniki oparte na chromatografii gazowej
Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą
technik elektroforetycznych
 Analiza profili białkowych
• skład ilościowy i jakościowy wszystkich białek
komórkowych
Sposób postępowania:




izolacja białek komórkowych
rozdział elektroforetyczny w żelu poliakrylamidowym
barwienie rozdzielonych białek
porównanie z profilami białkowymi bazy danych
Metoda pozwalająca określić
przynależność gatunkową mikroorganizmu
Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą
technik elektroforetycznych
Elektroforeza dwukierunkowa
Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o
chromatografię gazową
 Analiza profili kwasów tłuszczowych pochodzących
z lipidów ściany komórkowej
• skład kwasów tłuszczowych jest unikalny i charakterystyczny dla
każdego gatunku mikroorganizmu przy zachowaniu kontrolowanych
warunków hodowli
• zarówno ilościowy, jak i jakościowy skład ściany komórkowej bakterii
kodowany jest przez DNA genomowe i nie ma na niego wpływu
informacja genetyczna zawarta w plazmidach
 Analiza jakościowa – obecność specyficznych kwasów
tłuszczowych
 Analiza ilościowa – określenie zawartości poszczególnych
kwasów tłuszczowych
Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o
chromatografię gazową
Sposób postępowania:





saponifikacja i uwolnienie kwasów tłuszczowych
metylowanie
ekstrakcja z fazy wodnej
rozdział z zastosowaniem chromatografii gazowej
analiza wyników i porównanie z bazą danych
Metoda pozwalająca określić
przynależność gatunkową mikroorganizmu
Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o
chromatografię gazową
Microbial Identification System HP 5898 A firmy Hewlett Packard
Metody biologii molekularnej
Metody identyfikacji oparte na badaniu homologii
fragmentów kwasów nukleinowych
 Metody hybrydyzacyjne
 Metody oparte o technikę PCR
Metody hybrydyzacyjne
Polegają na zastosowaniu tzw. sond genetycznych
 sondy są to krótkie jednoniciowe fragmenty DNA,
zawierające sekwencje unikalne dla danego organizmu
 kwas nukleinowy pełniący rolę sondy genetycznej jest
znakowany
• radioaktywnym fosforem [32P] lub wodorem [3H]
• barwnikiem fluorescencyjnym
• enzymem
Metody hybrydyzacyjne
• Najpopularniejsze
systemy
detekcji
wykorzystują
sondy DNA komplementarne do charakterystycznych dla
identyfikowanego
mikroorganizmu
sekwencji
rybosomalnego RNA (rRNA)
• Wykorzystanie rRNA zwiększa czułość oznaczenia, gdyż
występuje on w komórce bakteryjnej w dużej liczbie kopii
(od 1 000 do 10 000)
• Inną zaletą tego rozwiązania jest dostępność
informacji odnośnie sekwencji rRNA pochodzących
od różnych, często bardzo blisko genetycznie
spokrewnionych
mikroorganizmów,
dzięki
czemu
możliwe jest otrzymywanie sond o bardzo wysokiej
specyficzności
Metody hybrydyzacyjne
Dot blot
Metody hybrydyzacyjne
Southern blotting
Metody hybrydyzacyjne
• homologia kwasów nukleinowych powyżej 60%
świadczy
o
przynależności
organizmu
do
określonego gatunku
• stopień hybrydyzacji powyżej 20% wskazuje na
zgodność identyfikowanego drobnoustroju z danym
rodzajem
• hybrydyzacja od 1 do 5% może zachodzić między
DNA lub RNA organizmów niespokrewnionych
FISH – hybrydyzacja fluorescencyjna in situ
Umożliwia identyfikację mikroorganizmów widzianych pod mikroskopem
FISH – hybrydyzacja fluorescencyjna in situ
Wynik FISH dla mieszaniny wybranych bakterii z rodzaju Bacillus,
Escherichia, Pseudomanas, Shigella
Metody wykorzystujące technikę PCR
Technika PCR (Polymerase Chain Reaction) enzymatyczna amplifikacja (zwielokrotnienie) in vitro
specyficznej sekwencji nukleotydów
 gen kodujący 16S rRNA mikroorganizmów prokariotycznych
 gen kodujący 18S rRNA mikroorganizmów eukariotycznych
Sposób postępowania:
 amplifikacja fragmentu DNA
 sekwencjonowanie
 porównanie wyników z danymi zamieszczonymi w banku genów
•
5% różnica w sekwencji wystarczy dla wyodrębnienia gatunku
Metody wykorzystujące technikę PCR
badanie mieszanej populacji mikroorganizmów
Metody wykorzystujące technikę PCR
 Geny kodujące białka bakteryjne
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
białko szoku termicznego Hsp 70
białko szoku termicznego Hsp 60
syntaza asparaginylo-tRNA
syntaza alanylo-tRNA
dehydrogenaza glutaminianowa
hydrolaza pirofosforanu
podjednostka β polimerazy RNA (RpoB)
podjednostka β’ polimerazy RNA (RpoC)
czynniki elongacyjne: EF 1α/Tu, EF-Tu, Ef-G/2
białka rybosomowe: L2, L5, L11, L14, L15, L22, L23, S5, S12
gyrazy
Metody immunochemiczne
Reakcja aglutynacji
Metody immunochemiczne
Test ELISA
Metody immunochemiczne
Test immunochromatograficzny