Farmakogenetyka gemetyka medyczna

2011-09-26
Farmakogenetyka
Podstawy farmakogenetyki
i farmakogenomiki
w praktyce klinicznej
- interdyscyplinarna dziedzina medycyny łącząca
farmakologię i genetykę
- badanie wpływu zmian w pojedynczym genie
na odpowiedź organizmu na lek
Jak leczyć skuteczniej i bardziej bezpiecznie
prof. Marek Mirowski
Pracownia Biologii Molekularnej i Farmakogenomiki
Zakład Biochemii Farmaceutycznej UM w Łodzi
bada skuteczność, bezpieczeństwo oraz interakcje między innymi
lekami
Farmakogenomika
Farmakogenetyka
badanie wpływu ekspresji wielu genów w komórkach
poszczególnych tkanek na uwarunkowane
dziedzicznie osobnicze róŜnice w reakcjach
organizmu na leki
ONE SIZE DOESN’T FIT ALL
Leczenie tym samym lekiem w tej samej dawce
róŜnych pacjentów moŜe spowodować róŜne efekty
Czynniki środowiskowe, dieta, wiek, styl Ŝycia, stan
zdrowia i przyjmowane leki wpływają na odpowiedź
organizmu na lek, jednak kluczowe dla stworzenia
bezpiecznej i skutecznej farmakoterapii jest
poznanie indywidualnych róŜnic w genotypie
pacjenta
Projekt Genomu Człowieka – róŜnice
międzyosobnicze 0,1% DNA
+ =☺
+ =
+ =
????
pacjent nie odpowiada na leczenie !!!
silna reakcja toksyczna !!!
☺
1
2011-09-26
Polimorfizm genetyczny – to regularne i jednoczesne
występowanie w tej samej populacji dwóch lub więcej
genotypów bez form przejściowych z częstością, która nie jest
wytłumaczalna powtarzającymi się mutacjami (a więc z
częstotliwością większą niŜ 1%).
Przyczyny odmiennego działania leków:
• przejściowe - hamowanie, indukcja
• stałe - polimorfizm, mutacje
Najczęstsze typy polimorfizmy:
SNP – (ang. single nucleotide polymorphism)
polimorfizm pojedynczych nukleotydów
D/I – (ang. deletion/insertion)
delecja-utrata/insercja-wtrącenie
VNTR – (ang. variable number of tandem repeats)
zmienna liczba tandemowych powtórzeń
Struktura genu kodującego białko
DNA zawiera ~ 1,000,000 SNPs
Konwencja zapisu polimorfizmu SNP
C3435T
w pozycji 3435 doszło do zamiany
cytozyny (C) na tyminę (T) w sekwencji
danego genu
– G85A
w pozycji 85 doszło do zamiany
guaniny (G) na adeninę (A) w
sekwencji promotorowej danego genu
Nadekspresja MDR1 genu kodującego
glikoproteinę-P
Haplotyp jest
kombinacją
SNPs
single-nucleotide
polymorphism
polimorfizm
pojedynczych
nukleotydów
2
2011-09-26
Nadekspresja MDR1 genu kodującego
glikoproteinę-P
Multidrug resistance of tumor cell
1.
2.
3.
4.
Genetic variants of drug transporters
Genetic variants of drug targets
Genetic variants of DNA reapring system enzymes
Genetic variants of apoptosis and cell cycle regulators
Metabolizm = biotransformacja
Metabolizm = biotransformacja
REAKCJE I FAZY – unieczynniają (lek) lub teŜ uczynniają (prolek)
wprowadzoną do organizmu substancję leczniczą.
Reakcje I fazy mają na celu taką zmianę struktury chemicznej związku
aby mogły zajść reakcje II fazy.
REAKCJE II FAZY – są to reakcja sprzęgania w wyniku których
powstają związki nieaktywne farmakologicznie, dobrze rozpuszczalne
w wodzie, a tym samym łatwo wydalane przez nerki wraz z moczem.
Utworzenie grup funkcyjnych w reakcjach I fazy metabolizmu:
• utworzenie grupy –OH (reakcja hydroksylacji):
Najczęstszymi substratami do reakcje sprzęgania są:
• kwas glukuronowy (UDP-glukuronylotransferaza (UGT))
• kwas siarkowy
• glicyna
• glutation (transferaza S-glutationowa (GST))
Rodzina genów Cytochromu P450
Nazewnictwo:
Rodzina
>40% homolgii
w sekwencji
Człowiek 14+
Mięczaki 1
Owady 3
Grzyby 11
Izoenzym
Allel
Podrodzina
>55% homologii
w sekwencji
CYP 2D6*1A
CYP 2D6*1B
CYP450
Rośliny 22
CYP 3 A 4 *15 A-B
Bakterie 18
DroŜdŜe 2
Nicienie 3
CYP 2D6*2A
CYP 2D6*2B
3
2011-09-26
Spektrum substratowe CYP 450
Specyficzność substratowa izoform CYP450
werapamil, imipramina, amitryptilina, kofeina
CYP 1A2
CYP 2A6
nikotyna
CYP 2B6
cyklofosfamid
CYP 2C9
diklofenak, naproksen, warfaryna
CYP 2C19
diazepam, omeprazol, propranolol
CYP 2D6
amitryptilina, captopril, kodeina,
mianseryna, chlorpromazina
CYP 3A4
alprazolam
CYP 2E1
etanol, halotan, paracetamol
na podstawie http://medicine.iupui.edu/flockhart/
Cytochrom P-450 2D6
(CYP 2D6)
homozygota zmutowana
heterozygota
homozygota „dzika”
zwielokrotnienie liczby alleli
katalizuje oksydację 40 klinicznie waŜnych leków
(leki nasercowe, psychotropowe, pochodne morfiny i inne)
w obrębie genu kodującego CYP 2D6 zidentyfikowano 48 mutacji
punktowych (SNP)
16 genotypów prowadzi do fenotypu „słabo metabolizującego”
(poor metabolizer), dla rasy białej fenotyp ten występuje
z częstością 7%
zwielokrotnienie liczby funkcjonalnych genów CYP 2D6 prowadzi
do fenotypu „ultraszybko metabolizującego” (ultrarapid metabolizer)
CYP2D6 polimorfizm i fenotyp
6-Merkaptopuryny
6-merkaptopuryna
azatiopryna (Imuran®)
tioguanina
są stosowane w leczeniu ostrych (AML) i przewlekłych białaczek
(CML) oraz chłoniakach oraz jako leki immunosupresyjne
Mario Stefanovic, Univ. Hosp. Clincal Institue of Chemistry, Hr
4
2011-09-26
S-metylotransferaza tiopurynowa
(TPMT)
TPMT bierze udział w metabolizmie tiopuryn: 6-merkaptopuryna,
azatiopryna, tioguanina, które są stosowane w leczeniu raka,
białaczki limfoblastycznej i jako leki immunosupresyjne.
S-metylotransferaza tiopurynowa
(TPMT)
Częstość występowania reakcji toksycznych po zastosowaniu tiopuryn:
MT
TP
cięŜka supresja szpiku
6-MP – 6-merkaptopuryna
6-TGN – nukleotyd 6-tioguaniny
6-MMP – 6-metylomerkaptopuryna
S-metylotransferaza tiopurynowa
(TPMT)
EM (efficient metabolizer) – osoba prawidłowo metabolizująca
PM (poor metabolizer) – osoba powoli metabolizująca
Glukuronylotransferaza-UDP (UGT)
Zapobieganie skutkom nieprawidłowego metabolizmu tiopuryn:
• u osób szybko metabolizujących (UM) naleŜy zwiększyć dawkę
standardową
w
celu
uzyskania
poŜądanych
efektów
terapeutycznych (szczególnie u dzieci z ALL i u osób po
przeszczepach narządowych)
• u osób wolno metabolizujących (PM) naleŜy zmniejszyć dawkę
standardową w celu uniknięcia wystąpienia cięŜkiej supresji szpiku,
wystarczy 10-15% standardowej dawki terapeutycznej
UGT bierze udział w sprzęganiu bilirubiny, steroidów, hormonów
tarczycy oraz pochodnych fenoli z resztą kwasu glukuronowego.
WyróŜniono dwie rodziny tych enzymów: UGT1 (znacznie kliniczne)
UGT2
• u osób z brakiem aktywnej TPMT stosowanie azatiopryny, która
jest prolekiem, nie daje Ŝadnych efektów terapeutycznych
niezaleŜnie od zastosowanej dawki
Irinotecan (CPT-11) (Campto®)
Irinotecan (CPT-11)
półsyntetycznym analogiem naturalnego
alkaloidu kamptotecyny
leczenie zaawansowanych stadiów raka jelita grubego
najczęstszą przyczyna ograniczenia w stosowaniu
maksymalnych dawek jest pojawiająca się neutropenia
(3 i 4 stopnia) oraz odległe w czasie cięŜkie biegunki
w zaleŜności od schematu dawkowania zwykle blisko 1/3
wszystkich pacjentów wykazuje działania niepoŜądane
APC (7-etylo-10-[4-N-(5-aminopentanowy kwas)-1-piperydyno]karbonyloksykamtotecyna),
NPC (7-etylo-10-(4-amino-1-piperydyno)karbonyloksykamptotecyna),
SN-38 (7-etylo-10-hydroksykamptotecyna),
CE (carboksyloesterase), UGT1A1 (glukuronylotransferaza-UDP1A1)
5
2011-09-26
Glucuronylotranspherase-UDP (UGT)
Glucuronylotranspherase-UDP (UGT)
Enzym UGT1A1 odpowiada za sprzęganie bilirubiny, estradiolu,
estriolu oraz czynnego metabolitu Irinotecanu w wątrobie.
UGT1A1 activity
Dependence between activity of liver UGT1A1
and type of promotor genotype for gene
UGT1A1
-T-A-T-A-T-A -T-A-T-A-T-A-T-A-.........
7 i więcej powtórzeń
!
spadek poziomu enzymu
• w raku jelita grubego, cięŜka toksyczność po podaniu
Irinotecanu (Camptosar®)
• zespół Gilberta (hiperbilirubinemia prowadząca do łagodnej Ŝółtaczki)
• estrogenne efekty uboczne po zastosowaniu środków antykoncepcyjnych
Glucuronylotranspherase-UDP (UGT)
Nagromadzenie w wątrobie aktywnego metabolitu
Irinotecanu SN-38, powoduje wystąpienie cięŜkich
biegunek trudnych do opanowania
severe
diarrhea
genotype of promotor
Cetuksimab (Erbitux®)
cetuksimab jest rekombinowanym, humanizowanym
przeciwciałem monoklonalnym klasy IgG1 skierowanym
przeciwko EGFR (receptor naskórkowego czynnika
wzrostu)
!
cetuksimab (Erbitux®)
Cetuksimab
(Erbitux®)
Cetuksimab (Erbitux®) przypadek kliniczny
52-letnia biała kobieta
IV stadium
(T4+N1+M1)
zaawansowania
raka
jelita
grubego
Cetuksimab
po resekcji chirurgicznej guza zastosowano terapię trzema
cytostatykami: 5-FU+LV+Irinotecan
pomimo terapii choroba nowotworowa uległa dalszej
progresji
zdecydowano się na
Irinotecan+Cetuksimab
terapię
II
rzutu schematem
progresja nowotworu
6
2011-09-26
Cetuksimab (Erbitux®) przypadek kliniczny
Cetuksimab (Erbitux®) przypadek kliniczny
Immunohistochemiczne ustalenie stopnia ekspresji EGFR u pacjenta
FDA zaleca do
identyfikacji
pacjentów z rakiem
jelita
grubego
oznaczenie
IHC
obecności ekspresji
EGFR
przed
podjęciem leczenia
cetuksimabem
u pacjentki wykonano za pomocą zestawu EGFR
PharmDx® (DAKOcytomation) test IHC
wykazano wysoki poziom ekspresji receptora EGFR
wdroŜono leczenie schematem Irinotecan+Cetuksimab
Badania IHC wskazują, Ŝe około 70% przypadków
raka jelita grubego wykazuje ekspresję EGFR
EGFR PharmDx®
(DAKOcytomation)
Podział genów kodujących transportery ABC według
nowego nazewnictwa HUGO Genome Nomenclature Committee
Rodziny białek biorących udział
w transporcie leków (drug transporters)
Podrodzina
Dawna
nazwa
Nowe
nazewnictwo
Liczba
genów
podrodzina A
ABC1
ABCA
12 genów
podrodzina B
MDR/TAP
ABCB
11 genów
podrodzina C
CFTR
ABCC
12 genów
ALD
ABCD
4 geny
podrodzina E
OABP
ABCE
1 gen
podrodzina F
GCN20
ABCF
3 geny
podrodzina G
WHITE
ABCG
5 genów
Geny
związane z
opornością
MDR1 (ABCB1)
rodzina ABC (ATP-binding cassette family)
rodzina OAT (organic anion transporter family)
MRP
rodzina OCT (organic cation transporter family)
rodzina OATP (organic anion transporting polypeptide family)
rodzina PepT (peptide transporter family)
Schemat budowy transporterów ABC
}
podrodzina D
TAP1 (ABCB2)
TAP2 (ABCB3)
MRP1 (ABCC1)
MRP2 (ABCC2)
MRP4 (ABCC4)
MRP5 (ABCC5)
BCRP (ABCG2)
Wybrane cytostatyki będące substratami dla P-gp
Alkaloidy Vinca:
Epipodofyloksyny:
- winblastyna
- winkrystyna
- windezyna
- etopozyd
- tenipozyd
Antracykliny i pochodne:
Inne:
- doksorubicyna
- daunorubicyna
- mitoksantron
- amsakryna
- mitomycyna C
- mitramycyna
- aktynomycyna D
- kolchicyna
- tamoksifen
- puromycyna
Kampotecyny:
- topotekan
- irinotekan
7
2011-09-26
Classification of genes encoding ABC transporters
according to HUGO Genome Nomenclature Committee
Subfamily
Previous
name
New
Nomenclature
The number of
genes
subfamily A
ABC1
ABCA
12 genes
subfamily B
MDR/TAP
ABCB
11 genes
subfamily C
CFTR
ABCC
12 genes
Glycoprotein P (ABCB1/MDR1)
Genes
associated with
drug resistance
environment
MDR1 (ABCB1)
TAP1 (ABCB2)
TAP2 (ABCB3)
MRP1 (ABCC1)
MRP2 (ABCC2)
MRP4 (ABCC4)
MRP5 (ABCC5)
MRP
subfamily D
ALD
ABCD
subfamily E
OABP
ABCE
1 gene
subfamily F
GCN20
ABCF
3 genes
subfamily G
WHITE
ABCG
5 genes
membrane
cytoplasmatic
4 genes
cytoplasm
BCRP (ABCG2)
nucleus
Glycoproteine-P structure
P-gp mechanisms of work
molecular vacuum
P-gp in pharmacotherapy
and cancerogenesis
P-gp
drug
ABCB1 transports various substrates across the cell membrane
include:
-Drugs such as colchicine and tacrolimus
-Chemotherapeutic agents such as etoposide, doxorubicin and
vinblastine
-Lipids
-Steroids
-Xenobiotics
-Peptides
-Bilirubin
-Cardiac glycosides like digoxin
-Immunosuppressive agents
-Glucocorticoids like dexamethasone
-HIV-type 1 antiretroviral therapy agents like protease inhibitors and nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors.
P-gp
↓ risk of
cancerogenesis
↓efectivness of
pharmacotheraphy
flipase
nucleus
carinogen
8
2011-09-26
Causes that can modify ABCB1
expression
Polymorphisms (SNPs) of ABCB1 gene
environmental:
exon
- cytostatics
- thermic shock
- heavy metals
- UV and X rays
nucleotide
amino acid
molecular:
- methylation in promotor region
- genetic polymorphism
?
SNP – (ang. single nucleotide polymorphism)
Polymorphic sites in sequence of ABCB1
Localisation
Exon 1a
Exon 1b
Exon 2
Exon 5
Exon 7
Exon 11
Exon 12
Exon 13
Exon 21
Exon 21
Position
Exon 1a/–145
Exon 1b/–129
Exon 2/61
Exon 5/307
Exon 7/548
Exon 11/1199
Exon 12/1236
Exon 13/1474
Exon 21/2650
Exon 21/2677
Exon 24
Exon 24
Exon 26
Exon 26
Exon 26
Exon 26
Exon 28
Exon 28
Exon 24/2956
Exon 24/2995
Exon 26/3320
Exon 26/3396
Exon 26/3421
Exon 26/3435
Exon 28/4030
Exon 28/4036
Polymorphism
C/G
T/C
A/G
T/C
A/G
G/A
C/T
C/T
C/T
G/T
G/A
A/G
G/A
A/C
C/T
T/A
C/T
G/C
A/G
Efect
non coding
non coding
Asn21Asp
Phe103Leu
Asn183Ser
Ser400Asn
Silent
Arg492Cys
silent
Ala893Ser
Ala893Thr
Met986Val
Ala999Thr
Gln1107Pro
silent
Ser1141Thr
Silent
Polymorphic sites in sequence of ABCB1
that can change amino acids sequence
environment
membrane
cytosol
Consequences of functional
polymorphism of ABCB1 in position
G2677T/A
pharmacokinetics of fexofenadine
Wskazania do badania profilu
farmakogenetyczego
•
•
•
•
•
•
•
Polimorficzny metabolizm leku
Długotrwałe leczenie
Mały współczynnik terapeutyczny
Objawy toksyczne
Niespodziewany wynik leczenia
Zbyt niskie lub wysokie stęŜenie leku w surowicy
Interakcja leków
time
9
2011-09-26
Problemy w farmakogenetyce
1. DuŜa liczba wariantów allelicznych
2. Wiele nieznanych enzymów i polimorfizmów
3. DuŜa ilość informacji trudnych do interpretacji
4. Konieczność potwierdzenia wyników
laboratoryjnych klinicznie
Czy farmakogenetyka
jest juŜ stosowana w praktyce?
w ograniczonym zakresie
• badania wariantów polimorficznych enzymów
cytochromu P450 przed zastosowaniem leczenia
• polimorfizm metylotransferazy tiopuryny w leczeniu
białaczek u dzieci
• Badanie polimorfizmu syntazy leukotrienu C4 u
chorych z nadwraŜliwością na NLPZ
Cele farmakogenetyki
• stworzenie skutecznej i bezpiecznej farmakoterapii
• zdobycie wiedzy umoŜliwiającej przewidzenie
indywidualnej odpowiedzi na leki
• właściwe dobranie leków
• indywidualizacja terapii - leki „na miarę”
• obniŜenie kosztów leczenia
Oporność bakterii
Znaczenie farmakogenetyki
Firm farmaceutycznych - badania populacji
Geny oporności mogą być zlokalizowane w:
- tworzenie nowych leków o najmniejszych efektach
uboczny i najlepszych efektach terapeutycznych
1. chromosomach
- poznanie moŜliwych skutków ubocznych działania leku
2. plazmidach
Lekarza - moŜliwość właściwego wyboru leku
3. transpozonach
Społeczeństwa - ograniczenie uŜywania „złych” leków
4. integronach
Pacjenta - właściwa terapia
Cel końcowy - stworzenie genetycznego profilu metabolizmu
leków, indywidualnie dla kaŜdego pacjenta
10
2011-09-26
Oporność bakterii
Oporność bakterii
Oporność chromosomowa
Oporność plazmidowa
najbardziej istotna z punktu widzenia medycyny
powstaje na skutek mutacji spontanicznych albo
indukowanych mutagenami (UV, promienie X, azotyny)
istotna dla transferu pionowego
plazmid niekoniugacyjny moŜe zostać ‘przemycony’
razem z koniugacyjnym lub ulec z nim rekombinacji
Przykłady:
E. coli – na chromosomie wykryto geny: eryC (oporność
na erytromycynę), linB (na linkomycynę)
pewne plazmidy nie mogą współistnieć w jednej
komórce i na tej podstawie zalicza się je do tzw. grup
niezgodności (transfer horyzontalny)
Gronkowiec złocisty – gen bla (na penicylinę)
wiele kopii jednego plazmidu w jednej komórce moŜe
determinować stopień oporności na dany antybiotyk
Oporność bakterii
Oporność bakterii
Oporność warunkowana przez transpozony – mobilne
fragmenty DNA
transpozaza
oporność - Amp
transpozaza
oporność - Tet
Integrony– mobilne fragmenty DNA
podobnie jak transpozony są mobilne
stanowią naturalne systemy klonowania i ekspresji
kaset genowych
występują w chromosomach, plazmidach i
transpozonach
super-integrony i integrony oporności wielorakiej –
zawierają kilka kaset
zdolności mutagenne (integracja do chromosomu lub
plazmidu)
waŜne źródło zmienności i nabywania oporności w tym
oporności wielolekowej
Oporność bakterii
Oporność bakterii
Kasety genowe występujące najczęściej:
kaseta
oporność
PODSTAWOWE MECHANIZMY OPORNOŚCI:
aktywność (enzym)
blaP1, P2, P3
oxa1, oxa2 itd.
β-laktamy
β-laktamaza
1.
aadA 1a, 1b
aadA2
aadB
aacA1
aacA4
aacC
aminoglikozydy
adenylotransferaza
aminoglikozydowa
2.
inaktywacja enzymatyczna leku, np. β-laktamaza w β-laktamowych, acetylo-,
adenylo- i fosfotransferazy w aminoglikozydach, esteraza w erytromycynie
acetylotransferaza
aminoglikozydowa
3.
catB2, B3, B5
clmA
chloramfenikol
acetylotransferaza
chloramfenikolowa
hamowanie transportu do komórki, np. zmiany w budowie błony, pogrubienie
mureiny
dfrA1, A5, A7....
dfrB1, B2, B3
trimetoprim
redukataza
dihydrofolianowa
4.
wytwarzanie alternatywnego metabolizmu omijającego hamowany przez
antybiotyk proces
sat
streptotrycyna
acetylotransferaza
streptotrycynowa
5.
zwiększenie stęŜenia enzymu hamowanego przez lek, np. reduktaza
dihydrofolianowa
6.
pompy aktywnie usuwające leki z komórki
7.
zmniejszenie aktywności enzymu przeprowadzającego aktywację leku
β-laktamaza (penicylinaza) – rozkłada wiązania β-laktamowe penicylin
acetylotransferaza aminoglikozydowa (AAC) – modyfikacja grupy aminowej
adenylotransferaza aminoglikozydowa (ANT) – modyfikacja grupy hydroksylowej
fosfotransferaza aminoglikozydowa (APH) – modyfikacja grupy hydroksylowej
modyfikacja miejsca działania (uchwytu), np. zmiana w białkach rybosomalnych,
prekursorach mureiny, gyrazie)
11
2011-09-26
12