Biotechnologia roślin a postęp biologiczny
advertisement
Pośrednia embriogeneza somatyczna 1. Zarodki somatyczne formują się z komórek kalusa, który powstaje na eksplantatach roślinnych. 2. Żywe komórki eksplantatu pod wpływem czynników kultury ulęgają odróżnicowaniu (dedyferencjacji) do stanu merystematycznego, następnie w wyniku podziałów wytwarzają kalus embriogenny. 3. W obrębie kalusa powstają indukowane embriogenicznie zdeterminowane komórki – IEDCs (ang. Induced embryogenic determined cells). 4. IEDCs - komórki małe o stosunkowo gęstej cytoplazmie, słabo zwakualizowane, mające duże jądro z wyraźnymi jąderkami i plastydy zawierające ziarna skrobi. 5. Komórki te po kolejnych podziałach nie rozłączają się i w efekcie doprowadzają do powstania PEM-u, a z niej do formowania jednego lub kilku zarodków. Pośrednia embriogeneza somatyczna Czynnikiem indukującym proces pośredniej embriogenezy somatycznej jest auksyna zawarta w pożywce. Eksplantat Kalus (zawiera IEDCs) PEM Zarodek lub zarodki Prawidłowy przebieg ES w warunkach in vitro zależy od spełnienia dwóch warunków: 1. Do zapoczątkowania procesu niezbędna jest w pożywce obecność auksyny lub substancji auksynopochodnej. Dlaczego? • Stymuluje podziały i wzrost komórek oraz powoduje rozdzielanie się komórek potomnych po podziale. • Zwiększa się zagęszczenie komórek. • Dochodzi do powstania IEDCs a następnie PEM-u. Prawidłowy przebieg ES w warunkach in vitro zależy od spełnienia dwóch warunków: Z chwilą rozpoczęcia embriogenezy konieczne jest obniżenie stężenia lub całkowite usunięcie auksyny z pożywki, gdyż hamuje ona rozwój zarodków. Dlaczego? • Z chwilą powstania PEM-u następuje zmiana reakcji komórek na auksynę. • Auksyna powoduje zwiększenie kwasowości ściany komórkowej, przez co staje się ona bardziej rozciągliwa, wskutek czego komórka może rosnąć (kwasowa teoria wzrostu). • Auksyna hamuje wnikanie jonów wapnia do komórek PEM-u, co ogranicza prawidłową ekspresję genów i tworzenie struktur biegunowych. 2. Przebieg somatycznej embriogenezy in vitro INDUKCJA Indukcja kalusa Indukcja embriogeniczności IEDCs NAMNAŻANIE Proliferacja agregatów PEM Indukcja embriogeniczności RÓŻNICOWANIE Inicjacja różnicowania Rozwój somatycznych zarodków DOJRZEWANIE Indukcja tolerancji na desykację Spoczynek zarodków Pożywka stała z 2,4-D i kinetyną Pożywka płynna z 2,4-D i NAA Pożywka stała bez fitohormonów Pożywka stała z ABA Zarodki somatyczne powstające z mikrospor Kiełkowanie i konwersja zarodków zygotycznych i somatycznych Sztuczne nasionko Zarodek somatyczny Membrana hydrofobowa Sztuczne bielmo Otoczkowane zarodki somatyczne Organogeneza Powstawanie przybyszowych struktur jednobiegunowych, tj. pędów, korzeni, kwiatów. • W zależności od eksplantatu zawiązki nowych organów powstają z różnych warstw komórek, np. w eksplantatach łodygowych lub liściowych z epidermy lub warstw subepidermalnych, w eksplantatach korzeniowych z merystemów wtórnych, z kory pierwotnej lub okolic protoksylemu. Organogeneza bezpośrednia • Tworzenie zawiązków jednobiegunowych organów przybyszowych bezpośrednio z komórek pobranych z rośliny dawcy. • Kompetentnymi do organogenezy bezpośredniej w obrębie eksplantatu mogą być: – Pojedyncze komórki – Niewielkie skupiska komórek Organogeneza bezpośrednia Eksplantat (komórka / komórki kompetentne → organ Organogeneza bezpośrednia pojedyncze komórki kompetentne • Postępujące po sobie podziały doprowadzają do wytworzenia grupy kilku lub kilkunastu komórek merystematycznych, tworzących razem jeden zawiązek organu (inicjał). Organogeneza bezpośrednia – skupisko komórek kompetentnych 1. Utworzenie przez dzielące się komórki jednego zawiązka; 2. Powstawanie tylu zawiązków ile było komórek kompetentnych. Organogeneza pośrednia • Proces formowania de novo zawiązków organów przybyszowych z komórek kalusa powstającego wtórnie na eksplantacie roślinnym. • Żywe komórki wyizolowane z rośliny dawcy, a nie mające kompetencji morfogenetycznych, pod wpływem czynników kultury in vitro podlegają odróżnicowaniu (dedyferencjacji) do stanu merystematycznego. • Komórki te poprzez szybkie i wielokrotne podziały doprowadzają do wytworzenia kalusa. • W niektórych jego komórkach dochodzi do indukcji kompetencji i w wyniku zmiany ekspresji określonych genów rozpoczyna się proces powtórnego różnicowania się (redyferencjacji) w wybranym kierunku. Organogeneza pośrednia Eksplantat kalus (komórka / komórki o indukowanej kompetencji) organ Organogeneza in vitro przez fazę kalusa Kultury in vitro merystemów i fragmentów pędów Multiplikacja na pożywce z cytokininą Merystemy wierzchołkowe lub kątowe sterylizacja Inicjacja kultury in vitro Ukorzenianie in vitro Po uprzedniej sterylizacji na pożywkę wykładane są młode pąki Kultura in vitro niedojrzałych zarodków mieszańcowych • Otrzymywanie mieszańców wewnątrz- i międzygatunkowych Krzyżowanie oddalone - kultura in vitro niedojrzałych zarodków mieszańcowych Roślina ojcowska Roślina mateczna Izolacja niedojrzałych zarodków Kultura in vitro niedojrzałych zarodków Aborcja zarodków Regeneracja roślin Bariery krzyżowalności gatunków • Bariery izolacyjne: – oddalenie geograficzne – różne okresy kwitnienia • Bariery prezygotyczne • Bariery postzygotyczne ZAPYLENIE - Bariery prezygotyczne Rozmnażanie roślin kwiatowych Ziarna pyłkowe różnych gatunków Proces zapylenia Proces zapylenia Bariery prezygotyczne • Brak lub bardzo słabe kiełkowanie ziaren pyłkowych na obcym znamieniu • Niemożność wniknięcia łagiewek pyłkowych do szyjki słupka • Słaby wzrost łagiewek pyłkowych i ich zatrzymanie w szyjce słupka • Brak wnikania łagiewek pyłkowych do zalążków pomimo ich obecności w zalążni Bariery postzygotyczne • Brak rozwoju zarodka • Nietypowy rozwój zarodka wskutek pojedynczego zapłodnienia: – Obumieranie zarodka we wczesnej fazie rozwoju – Powstanie nietypowych nasion • Sterylność roślin mieszańcowych • Wadliwy wzrost i rozwój roślin mieszańcowych Kultura in vitro izolowanych niedojrzałych zarodków Kultura in vitro niedojrzałych zarodków mieszańcowych Hybrydyzacja somatyczna Krzyżowanie oddalone- izolacja protoplastów Zawiesina protoplastów Tkanka parenchymatyczna Trawienie ścian komórkowych Enzymy pektolityczne Substancje stabilizujące Krzyżowanie oddalone- fuzja protoplastów Mieszanina protoplastów Fuzja Hybrydy somatyczne Podział haploidów wg. Kimber i Riley (1962) HAPLOIDY EUHAPLOIDY MONOPLOIDY POLIHAPLOIDY ANEUHAPLOIDY disomiczne nullisomiczne ALLOPOLIHAPLOIDY addycyjne AUTOPOLIHAPLOIDY substytucyjne nieregularne H ap loid yzacja In d uk owana ap om ik sja p arten ogen eza h ap loidalna in d uk owana ch em iczn ie fizyczn ie k rzyżow an ie od d alone ap ogam ia sem igam ia an d rogen eza p oliem b rionia rzek om a elim inacja ch rom osom ów z zarodk a m ieszańcow ego (m etod a bu lb osow a) ch em iczn ie (P F P, C IP C) S p ontaniczna an d rogen eza in vitro izolowan e m ik rosp ory z p reku lturą w pylniku b ez p reku ltu ry p ylniki p ojed yn cze k wiaty gyn ogen eza in vitro zalążn ie zalążk i
