„Wykorzystanie metod biotechnologicznych do wytwarzania

Poszerzenie zmienności genetycznej u cebuli zwyczajnej (Allium cepa L.)
poprzez krzyżowania międzygatunkowe w rodzaju Allium
Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja w Krakowie
Katedra Genetyki, Hodowli i Nasiennictwa
Kierownik: dr hab. Adela Adamus, prof. UR
Badania nad mieszańami form oddalonych są trudne ze względu na bariery
krzyżowalności. Zastosowanie metod biotechnologicznych jest niezbędne dla otrzymywaniu
mieszańców oraz ich identyfikacji. Wyniki badań nad mieszańcami międzygatunkowymi w
rodzaju Allium wykazały, że rozwój zarodków mieszańcowych F1 A. galanthum x A. cepa
jest możliwy, lecz wydajność tego procesu jest bardzo niska zarówno w kulturach in vitro jak
i w przypadku wykształcania nasion. Z ok. 6 tys. eksplantatów wyłożonych na pożywki
rozwój podjęło tylko 58 szt., mimo zastosowania różnych pożywek dla ich kultur. Po
wykonaniu krzyżowań A. galanthum x A. cepa i pozostawieniu zalążni na roślinach
otrzymano 64 siewki F1
W celu potwierdzenia obecności sterylizującej cytoplazmy „galanthum” u roślin F1 (A.
galanthum x A. cepa) opracowano metodę molekularną opartą o technikę PCR, która
wykorzystuje polimorfizm chloroplastowego DNA.
Ocena morfologiczna pierwszych otrzymanych mieszańców F1 A. cepa x A. galanthum
wykazała, że były one podobne do formy matecznej pod względem liczby cebul
przybyszowych, liczby liści na łodydze, liczby oraz długości pędów kwiatostanowych, a do
formy ojcowskiej pod względem średnicy trzech pierwszych liści oraz średnicy łodygi
rzekomej. Natomiast większą niż u obojga rodziców miały długość liści i łodygi rzekomej.
Żywotność pyłku roślin F1 była bardzo obniżona i wynosiła od 0-46%.
Badania nad mieszańcami A. cepa i A. roylei w celu otrzymania pokoleń z krzyżowań
wstecznych ujawniły istnienie mocnych barier krzyżowalności i nie powiodły się próby
otrzymania w kulturach in vitro roślin BC1 i BC2 mimo wykonania licznych krzyżowań i
zastosowania techniki embryo rescue. W związku z powyższym opracowano metodykę
wizualizacji łagiewek pyłkowych w tkankach słupka po wykonaniu zapyleń A. cepa x A.
cepa. Technika ta zostanie wykorzystana w następnych latach do wyjaśnienia przyczyn braku
rozwoju zarodków w kombinacjach z zapyleń wstecznych.
Badania nad gametyczną embriogenezą u cebuli obejmowały ocenę molekularną roślin
wyjściowych oraz indukcję gynogenezy w kulturach pąków kwiatowych. Heterozygotyczność
roślin donorowych oznaczono metodą izoenzymatyczną. Test PGI wykonano u 189 roślin
cebuli pochodzących z 9 różnych obiektów. Heterozygot pod względem locus Pgi, które były
formami odpowiednimi do gynogenezy było 41%. Ocenę typu cytoplazmy przeprowadzono
przy pomocy markerów molekularnych, które wykorzystują polimorfizm mitochondrialnego
DNA. Analiza 78 roślin wykazała, że 58% roślin posiadało cytoplazmę płodną N. Cytoplazmę
sterylną typu T oznaczono u 30 roślin, a sterylną typu S u 3 roślin.
W celu indukcji gynogenezy wyłożono na pożywki 6375 pąków kwiatowych i otrzymano 125
gynogenicznych zarodków. Efektywność gynogenezy zależała od genetycznych właściwości
obiektów donorowych i wynosiła od 0 do 7,3%. Oznacza to, że wśród badanych obiektów
były tzw. genotypy oporne i obiekty embriogenne, czyli korzystnie reagujące na indukcję
gynogenezy. Zastosowane modyfikacje pożywek miały niewielki wpływ na liczbę
otrzymanych zarodków, ale dodatek poliamin wyraźnie zwiększył procent zarodków o
prawidłowej morfologii w porównaniu z kontrolą,.
Z otrzymanych gynogenicznych zarodków 54% było prawidłowych i miało wygląd typowy
dla małych roślinek cebuli. Natomiast pozostała część zarodków wykazywała anomalie
rozwojowe w postaci zeszklenia tkanek, zniekształceń pędu czy braku chlorofilu. Stosunek
zarodków prawidłowych do rozwijających się z anomaliami był różny i zależał od obiektu, a
także kombinacji pożywek.
Ogółem w wyniku indukcji gynogenezy otrzymano 114 roślin z 9 różnych genotypów. Do
dnia 1.12.2008 ocenie ploidalności poddano 79 roślin. Wśród roślin otrzymanych z zarodków
poddanych diploidyzacji we wczesnym stadium rozwoju (pożywka z APM) podwojonych
haploidów było 2,5 krotnie więcej niż w kontroli.
Wstępne badania nad zastosowaniem kultur in vitro do selekcji genotypów odpornych
na suszę prowadzono w kulturach in vitro z zastosowaniem pięciu różnych stężeń NaCl i
trzech PEG dodanych do pożywki MS. Najwyższe z zastosowanych stężeń NaCl (15 g/l)
powodowało zamarcie 45% siewek i hamowało wzrost korzeni o 50% długości w stosunku do
kontroli. Natomiast zastosowane stężenia PEG były mniej toksyczne dla siewek cebuli.