Biotechnologia chemiczna: leki i kosmetyki
advertisement
Laboratorium specjalistyczne – Biotransformacje Semestr VI WYKORZYSTANIE METOD BIOTECHNOLOGICZNYCH DO OTRZYMYWANIA OPTYCZNIE CZYNNYCH ALKOHOLI 1. Wstęp Problem otrzymywania czynnych optycznie enancjomerów ma podstawowe znaczenie w wielu gałęziach przemysłu chemicznego, np.: spożywczym, kosmetycznym, a szczególnie w przemyśle farmaceutycznym, gdzie czystość optyczna związku bardzo często decyduje o możliwości stosowania go jako leku. Dlatego opracowano wiele różnych metod otrzymywania czystych enancjomerów, ale uzyskiwane wyniki są bardzo różne, często niezadowalające ze względu na konieczność stosowania drogich odczynników i zbyt małą czystość optyczną produktów. Ogromny postęp w otrzymywaniu optycznie czynnych związków nastąpił po opracowaniu metod biotechnologicznych i reakcji biotransformacji. Pod pojęciem produkcji biotechnologicznej rozumie się procesy wykorzystujące metabolizm organizmów żywych, które z prostego źródła węgla (glukoza) i ewentualnie odpowiedniego prekursora w trakcie skomplikowanych przemian biochemicznych wytwarzają bardziej złożony związek chemiczny np. penicylinę G. Biotransformacje natomiast obejmują pojedyncze, konkretne przekształcenia chemiczne katalizowane najczęściej przez izolowane enzymy, preparaty enzymatyczne lub mikroorganizmy np. redukcja grupy karbonylowej ketonu. O dużej atrakcyjności metod „bio” decydują następujące zalety: Wysoka chemo-, regio-, stereo- i enancjoselektywność Efektywność katalizy – reakcje przebiegają 108-1015-razy szybciej, a wystarczy stężenie 10-3-10-4 %mol (chemiczne: 0,1-1%mol) Możliwość sterowania parametrami biokatalizatorów dzięki zastosowaniu narzędzi biologii molekularnej Reakcje przebiegają w łagodnych warunkach (temp. pokojowa, pH neutralne) Reakcje mogą przebiegać w wodzie, jak i w rozpuszczalnikach organicznych Nie zachodzą reakcje uboczne Biodegradowalność katalizatorów Kompatybilność – enzym jest wybiórczy w stosunku do danego substratu – synteza „onepot” Enzymy są katalizatorami produkowanymi przez organizmy żywe, wpływającymi na szybkość i specyficzność tysięcy reakcji chemicznych. Źródłem enzymów mogą być mikroorganizmy (bakterie, drożdże, grzyby makroskopowe), komórki roślinne i zwierzęce. Chociaż są syntetyzowane w komórkach, mogą także działać poza nimi. Wiele enzymów po wyekstrahowaniu zachowuje w pełni swoją aktywność, którą można jeszcze poprawić przez oczyszczanie, wysalanie, immobilizację czy modyfikację chemiczną lub metodami biologii molekularnej. Jak już wspomniano, enzymy są podstawowymi katalizatorami przemian chemicznych zachodzących w przyrodzie. Ich liczba jest ogromna, do tej pory sklasyfikowano kilka tysięcy różnych enzymów. Nazwy są tworzone przez dodanie końcówki –aza, np. ureaza, lipaza, kinaza. Najczęściej nazwa enzymu nawiązuje do przekształcanego substratu lub do typu reakcji, którą enzym katalizuje. Na przykład enzym rozkładający celulozę nazywa się celulazą. Bardzo często łączy się nazwę reakcji z nazwą substratu, np. dehydrogenaza alkoholowa, dekarboksylaza argininy, izomeraza retinalu. Niektóre enzymy posiadają tylko nazwy zwyczajowe, jak pepsyna (gr. pepsis – trawienie), papaina (izolowana z papai), bromelaina (izolowana z owoców ananasa). 1 Laboratorium specjalistyczne – Biotransformacje Semestr VI Można także spotkać się z nazwami enzymów o końcówce –zym np. lizozym (powoduje lizę niektórych bakterii). W celu ujednolicenia nazewnictwa wprowadzono międzynarodowy system nomenklatury enzymów, który dzieli je na sześć klas w zależności od typu prowadzonej reakcji (tabela 3.1). Każdemu enzymowi przypisuje się numer EC składający się z czterech liczb. Przykładowo trypsyna sklasyfikowana jest jako 3.4.21.4, co oznacza: a) 3 – hydrolaza b) 4 – proteaza hydrolizująca wiązanie peptydowe c) 21 – proteaza serynowa (seryna jest głównym aminokwasem w centrum aktywnym) d) 4 – czwarty enzym przypisany do tej klasy Pod numerami EC bardzo rzadko występuje tylko jeden enzym. Najczęściej jest to grupa strukturalnie i funkcyjnie podobnych enzymów, które zostały wyizolowane z różnych organizmów lub nawet tkanek. W taki sposób trypsyna izolowana z trzustki człowieka pod względem sekwencji aminokwasowej, struktury przestrzennej i właściwości (punkt izoelektryczny, optymalne pH) może różnić się od trypsyny produkowanej przez np. tygrysa. Enzymy takie nazywane są izoenzymami, natomiast mechanizm działania i substrat jest ten sam. Tabela 1. System międzynarodowej klasyfikacji enzymów Klasa Nazwa Typ katalizowanej reakcji A- + B A + B- 1 Oksydoreduktazy Przenoszenie elektronów 2 Transferazy 3 Hydrolazy 4 Liazy 5 Izomerazy Przenoszenie grupy obrębie cząsteczki 6 Ligazy Tworzenie wiązań sprzężone A + B A-B z hydrolizą ATP Przenoszenie grup A-B + C A + B-C funkcyjnych Reakcje hydrolizy A-B + H2OA-H + B-OH Rozszczepienie wiązań C-C, C-O, C-N i innych, często tworzenie wiązania podwójnego w Przykład Dehydrogenaza mleczanowa glukokinaza α-chymotrypsyna dekarboksylaza argininy Izomeraza retinalu Karboksylaza 2oksoglutaranu Mechanizm działania enzymów polega na wiązaniu substratów w odpowiednim położeniu, które umożliwia zajście reakcji, a powstałe produkty są następnie uwalniane (rys. 1.). Należy zwrócić uwagę, że proces jest odwracalny, czyli enzymy mogą katalizować reakcje w obu kierunkach, w zależności od warunków. 2 Laboratorium specjalistyczne – Biotransformacje Semestr VI Rys.1. Reakcja katalizowana enzymatycznie (G.L. Patrick Chemia medyczna WNT 2003); Wiązanie substratów i właściwa reakcja następuje w specyficznej części cząsteczki enzymu. Fragment ten nazywany jest miejscem (centrum) aktywnym (rys. 2.). Mówiąc o części cząsteczki enzymu, mamy na myśli fragment jego struktury przestrzennej, a nie fragment łańcucha peptydowego. W rzeczywistości ze względu na pofałdowanie łańcucha białkowego, aminokwasy budujące centrum aktywne mogą być od siebie bardzo oddalone w sekwencji. Centrum katalityczne najczęściej znajduje się na powierzchni enzymu lub w jej pobliżu, tak aby substraty miały do niego łatwy dostęp, a produkty mogły być szybko usuwane. Może mieć ono kształt rowka lub zagłębienia. Rys. 2. Miejsce aktywne enzymu (G.L. Patrick Chemia medyczna WNT 2003); Niektóre z enzymów występujących w przyrodzie rozpoznaje i katalizuje przemianę tylko jednego, konkretnego substratu. Właściwość tą określa się mianem wąskiej specyficzności substratowej np. ureaza katalizuje rozkład mocznika, katalaza – nadtlenku wodoru. Jednakże zdecydowana większość enzymów toleruje szeroką grupę związków o podobnej budowie, w strukturze których występuje tylko charakterystyczny element lub wiązanie. Takimi enzymami są lipazy, które katalizują hydrolizę wiązań estrowych w różnych tłuszczach. O takich enzymach mówi się, że posiadają szeroką specyficzność substratową. Można także wyróżnić enzymy które przekształcają ten sam typ wiązania, ale w określonych przypadkach. Na rys. 3. przedstawiono dwa enzymy produkowane w trzustce, które hydrolizują wiązania peptydowe w białkach – trypsynę i α-chymotrypsynę. Największe zastosowanie w syntezie znajdują hydrolazy. Enzymy te nie wymagają współdziałania żadnych dodatkowych małocząsteczkowych związków tzw. kofaktorów, w związku z tym są bardzo proste w użyciu. Poza tym produkowane są na ogromną skalę jako dodatki do proszków do prania i innych produktów gospodarstwa, jako dodatki podnoszące walory smakowe żywności itd., dlatego są łatwo dostępne i względnie tanie. Dzieli się je na podklasy w zależności od typu hydrolizowanego wiązania, najpopularniejsze to: 3 Laboratorium specjalistyczne – Biotransformacje Semestr VI Rys. 3. Specyficzność substratowa trypsyny i α-chymotrypsyny Proteazy (peptydazy) hydrolizujące wiązania amidowe w białkach – trypsyna, α-chymotrypsyna, papaina, subtilizyna, acylaza penicylanowa Esterazy hydrolizujące wiązania estrowe – acetylocholnoesteraza (AChE), esteraza z wątroby świńskiej (PLE) Lipazy hydrolizujące wiązania estrowe w tłuszczach – lipazy z Pseudomonas fluorescens (PFL), lipaza z Pseudomonas cepacia (PCL), lipaza B z Candida antarctica (CAL-B) Amylazy hydrolizujące wiązania glikozydowe w wielocukrach – α-amylaza, amylazy z kiełkującego jęczmienia Hydrolazy epoksydów hydrolizujące pierścień epoksydowy – EH z Aspergillus niger W syntezie optycznie czynnych alkoholi stosuje się najczęściej lipazy. Enzymy te ze względu na rolę fizjologiczną (hydroliza wiązań estrowych w tłuszczach) są naturalnie przystosowane do katalizowania reakcji nie tylko w wodzie, ale dobrze pracują także w obecności rozpuszczalników organicznych. Możliwe jest także prawie całkowite wyeliminowanie wody i zastąpienie jej niepolarnym rozpuszczalnikiem np. heksanem, eterem tert-butylo-metylowym. Niewielka ilość wody w układzie (1-2%) jest niezbędna aby enzym zachował właściwą strukturę przestrzenną, która warunkuje właściwości katalityczne. Polarne rozpuszczalniki organiczne można stosować jako dodatki poprawiające rozpuszczalność (do 10%, czasami w specyficznych przypadkach do 50% v/v) ponieważ dezaktywują enzymy (denaturują białko). Wyeliminowanie wody z układu reakcyjnego powoduje, że można prowadzić także reakcje estryfikacji i transestryfikacji. Poza tym dużo łatwiej jest wyizolować produkty z mieszaniny poreakcyjnej, ponieważ enzym w rozpuszczalniku organicznym nie rozpuszcza się i można go usunąć przez filtrację. Lipazy znajdują zastosowanie w następujących procesach: Hydroliza lub estryfikacja racemicznych lub prochiralnych substratów – estrów lub alkoholi Dyssymeryzacja mezo-estrów lub dioli Reakcje z udziałem związków racemicznych realizowane są na drodze rozdziałów kinetycznych czyli opierają się na różnej szybkości, z jaką enancjomery są przekształcane przez enzym. Różnica ta wynika z odmiennego dopasowania przestrzennego izomerów do centrum aktywnego, dzięki czemu reakcja przebiega szybciej w stosunku do jednego z enancjomerów (R), jednakże równocześnie drugi enancjomer (S), chociaż wolniej, także jest przekształcany (rys 4). 4 Laboratorium specjalistyczne – Biotransformacje Semestr VI Rys. 4. Rozdział kinetyczny racemicznych alkoholi Reakcje enzymatyczne są w większości procesami odwracalnymi. Jest to duży problem, ponieważ powstający produkt (R) jest także dobrym substratem dla enzymu a reakcja odwracalna prowadzi do znacznego obniżenia nadmiarów enancjomerycznych. Rozwiązaniem jest zapewnienie takich warunków, w których równowaga będzie przesunięta na korzyść produktów w takim stopniu, że reakcja stanie się praktycznie nieodwracalna lub pseudoniedwracalna. Najczęściej stosowanymi typami reakcji spełniającymi to założenie są reakcje hydrolizy (przebiegające w obecności znacznego nadmiaru wody) oraz reakcje transestryfikacji z zastosowaniem estrów enoli, estrów „aktywnych” i bezwodników kwasowych (rys.5). Rys. 5. Rozdział kinetyczny z zastosowaniem estrów enoli Wyrażenie efektywności rozdziału kinetycznego za pomocą stałych szybkości reakcji bywa problematyczne, ale można efektywność rozdziału matematycznie powiązać z stopniem konwersji (c) reakcji i nadmiarami enancjomerycznymi nieprzereagowanego substratu (ees) i produktu (eep). Stosunek enancjomeryczny E charakteryzuje selektywność reakcji enzymatycznej i wyraża się wzorami: Dla produktu; Dla substratu; Wartości E obliczone za pomocą dwóch powyższych równań nie są miarodajne w przypadku bardzo małych albo bardzo wysokich stopni konwersji (błędy wynikają z niedokładności pomiarów). Dlatego wygodniejsze jest użycie poniższego równania, w którym uwzględnia się tylko nadmiary enancjomeryczne. Zależność „absolutna” 5 Laboratorium specjalistyczne – Biotransformacje Semestr VI Na rys. 6 przedstawione są przykładowe wykresy zależności nadmiarów enancjomerycznych od konwersji dla reakcji o niskiej (E=8) i wysokiej (E=43) enancjoselektywności dla reakcji transestryfikacji alkoholi z udziałem octanu winylu. Rys.6. Zależności nadmiarów enancjomerycznych od konwersji w przypadku reakcji o niskiej i wysokiej enancjoselektywności Jak widać produkt (ester) o wysokiej czystości optycznej może być otrzymany, kiedy konwersja reakcji nie przekracza 50%, a enzym możne swobodnie wybierać enancjomer lepiej dopasowany do centrum aktywnego. Powyżej 50% przereagowania, kiedy stężenie szybciej reagującego izomeru jest już niewielkie, czystość optyczna estru maleje i zależy od szybkości, z jaką przekształcany jest drugi enancjomer. Analogiczna zależność występuje dla nieprzereagowanego substratu. Wysoką czystość optyczną można uzyskać, kiedy konwersja przekroczy 50%. Bardzo istotne jest więc ustalenie czasu, kiedy rozdział osiąga maksimum tzn. kiedy enancjomery posiadają najwyższą (w danym przypadku) czystość i wydajność. Bardzo dużo zależy od enzymu, który został użyty, od jego stereospecyficzności w stosunku do substratu, a także od warunków procesu (rozpuszczalnika, zawartości wody w medium, donora lub akceptora grupy acylowej, temperatury, pH itd.). Dąży się do tego, aby E wynosił co najmniej 15-20 – wtedy rozdział jest zadowalający, otrzymujemy produkty z dobrymi wydajnościami i czystościami optycznymi. Gdy E>100 jest to reakcja bardzo selektywna. Optycznie czynne enancjomery alkoholi drugorzędowych można otrzymać także na drodze redukcji grupy karbonylowej ketonów. Enzymami katalizującymi tą reakcje są dehydrogenazy należące do klasy oksydoreduktaz. Niestety mechanizm działania tych enzymów wymaga udziału kofaktorów, czyli niewielkich, w stosunku do enzymu, cząsteczek organicznych lub jonów metali. Kofaktory niekowalencyjnie związane z enzymem nazywane są koenzymami. Dehydrogenazy podczas redukcji grupy karbonylowej wymagają udziału dwunukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADH) lub jego fosforanu (NADPH) (rys. 7). Obecność NADH lub NADPH jest konieczna gdyż są one przenośnikami anionu wodorkowego, który atakuje węgiel grupy karbonylowej związku związanego w centrum aktywnym dehydrogenazy. Ogólny mechanizm reakcji katalizowanej przez dehydrogenzay jest następujący (rys. 8): 6 Laboratorium specjalistyczne – Biotransformacje Semestr VI Rys. 7. Struktura koenzymów NAD i NADP i ich form zredukowanych Rys. 8. Stereoselektywność reakcji katalizowanej przez ADH z drożdży piekarniczych Jak wynika z powyższych rysunków mechanizm przeniesienia anionu wodorkowego z kofaktora na substrat zapewnia stereoselektwność reakcji. Mechanizm ten został opisany przez Preloga, który badał reakcje redukcji z zastosowaniem drożdży piekarniczych Saccharomyces cerevisiae już w latach 60-tych ubiegłego wieku. Od jego nazwiska pochodzi nazwa reguły określającej stereoselektywność większości dehydrogenaz (z drożdży, Thermoanaerobium brockii, wątroby końskiej) – reguła Preloga – która mówi, że transfer anionu wodorkowego na atom węgla grupy karbonylowej zachodzi od strony re z wytworzeniem alkoholu o konfiguracji (S), oczywiście przy założeniu, że grupa „duża” jest starsza od „małej” zgodnie z zasadami określania starszeństwa podstawników Cahna-Ingolda-Preloga. Jednak jak w każdej regule zdarzają się wyjątki i otrzymujemy produkt o przeciwnej konfiguracji. Przykładem niespełniającym tej reguły jest α-chloroacetofenon – redukcja tego związku prowadzi do otrzymania (R)-2-chloro-1fenyloetanolu. Reguła ta nie sprawdza się dla związków, w których różnica pomiędzy wielkością podstawników po obu stronach grupy karbonylowej jest nieduża. Wadą stosowania izolowanych dehydrogenaz w reakcjach redukcji jest to, że konieczne jest dostarczenie zredukowanego kofaktora (NADH lub NADPH) w ilości równomolowej molowej lub zapewnienie wydajnego systemu ich regeneracji. Mimo, że opracowano kilka świetnych sposobów regeneracji kofaktorów, to metodą najwygodniejszą jest zastosowanie całych komórek mikroorganizmów, które będą regenerowały NADH lub NADPH w procesach metabolicznych. Podczas reakcji redukcji mikroorganizmami do układu reakcyjnego dodaje się etanol lub 7 Laboratorium specjalistyczne – Biotransformacje Semestr VI izopropanol, który powoduje regenerację kofaktora. Najczęściej stosowanymi i najtańszymi mikroorganizmami są drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae. Ich dodatkową zaletą jest fakt, że w formie preparatów np. liofilizowanych, mogą pracować w rozpuszczalnikach organicznych zawierających tylko kilka procent wody niezbędnej do zachowania aktywności metabolicznej. Oczywiście metody biotechnologiczne mają także wady, jedną z najważniejszych jest wrażliwość biokatalizatorów na zmiany warunków reakcji. Związane jest to zazwyczaj z niestabilnością preparatów enzymatycznych, niską produktywnością, wrażliwością na rozpuszczalniki organiczne i ograniczeniem do prowadzenia reakcji w roztworach wodnych. Czasami nawet niewielkie zmiany temperatury czy pH mogą znacznie zmniejszyć aktywność enzymów. Problemy te mogą zostać rozwiązane przez stosowanie preparatów immobilizowanych. Enzymy można osadzać na różnych nośnikach, zamykać wewnątrz polimerów, sieciować. Dzięki procesowi immobilizacji rozpuszczalny, homogeniczny biokatalizator przekształcony zostaje w katalizator heterogeniczny. Pozwala to na stosowanie procesów ciągłych i ułatwia izolowanie produktów. Bardzo często rośnie także jego stabilność, maleje wrażliwości na zmiany pH i temperatury (wysoka aktywność nawet w 80oC). Immobilizacja powoduje też podwyższenie selektywności w porównaniu z enzymem natywnym. Najczęstsze metody immobilizacji zostały przedstawione na rys.9. Rys. 9. Metody immobilizacji enzymów Pojęcia dodatkowe: Nadmiar enancjomeryczny (ee, enantiomeric excess) – miara czystości optycznej związku wyrażona w procentach. Wielkość określająca nadmiar (ilościowy) jednego enancjomeru w 8 Laboratorium specjalistyczne – Biotransformacje Semestr VI stosunku do drugiego. Przyjmuje się, że ma zawsze wartość dodatnią i definiuje się jako stosunek różnicy zawartości poszczególnych enancjomerów do ich sumy. [ R] [ S ] [ S ] [ R] ee R 100% ee S 100% [ R] [ S ] [ R] [ S ] Nadmiar enancjomeryczny może być wyznaczony następującymi metodami: 1) porównanie wartości skręcalności właściwych, jednak konieczna jest znajomość wartości skręcalności właściwej dla czystych enancjomerów: D [ ]bad 41 100% np. jeżeli []Dlit=-47o dla (S), a []Dbad=-41o, to ee S 100% 87,2% D 47 [ ]lit 2) spektrometria 1HNMR z dodatkiem odczynnika przesunięcia chemicznego np. kompleksu europu, który powoduje tworzenie diastereoizomerycznych kompleksów z enancjomerami, a tym samym różnicowanie sygnałów protonów pochodzących od poszczególnych izomerów. ee 3) chromatografia cieczowa HPLC lub gazowa na kolumnach z chiralnym wypełnieniem, które różnie oddziaływuje z enancjomerami i powoduje różnicowanie ich czasów retencji. 9 Laboratorium specjalistyczne – Biotransformacje Semestr VI Celem ćwiczenia będzie zapoznanie się z metodą kinetycznego rozdziału racemicznego 1-fenyloetanolu metodą katalizowanej enzymatycznie transestryfikacji octanem winylu. Jako katalizatory zastosowane zostaną różne preparaty enzymatyczne np.: lipaza z Pseudomonas fluorescens (Amano AK) i immobilizowana lipaza B z Candida antarctica (Novozym sp 435). 2. Część doświadczalna a) Transestryfikacja octanem winylu Odczynniki: 1-fenyloetanol; octan winylu; eter t-butylowo-metylowy (TBME); lipaza; żel krzemionkowy 230-460 mesh; heksan; octan etylu, 2M NaOH, metanol, chlorek metylenu. O OH O + Amano AK O OH O + TBME (S) + OH (R) NaOH H2O/MeOH O H OH (R) Wykonanie: Do kolby stożkowej o poj. 100 ml odważyć 1,22g (10 mmol) racemicznego 1-fenyloetanolu i dodać 10 ml eteru t-butylowo-metylowego (TBME), następnie dodać 1,80g (21 mmol) octanu winylu i 0,20g lipazy natywnej lub 0,10g lipazy immobilizowanej, a ścianki opłukać 15 ml TBME. Kolbę umieścić na wytrząsarce (amplituda 3; 180obr/min; temp. pokojowa) na 7 dni. Odsączyć enzym na sączku karbowanym i przemyć go 10 ml TBME. Pobrać próbkę (1ml), która posłuży do oszacowania stopnia konwersji. Pozostały przesącz odparować pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymany olej nanieść na kolumnę chromatograficzną napełnioną żelem krzemionkowym zawieszonym w heksanie. Rozdział prowadzić stosując jako eluent mieszaninę heksan:octan etylu 10:1 (dla estru), następnie zmienić na heksan:octan etylu 5:1(dla alkoholu). Poszczególne frakcje połączyć i zatężyć na wyparce. Ester rozpuścić w 10 ml metanolu i dodać 10 ml 2M NaOH. Ogrzewać w 45oC przez ok. 1 godz. Otrzymany w wyniku hydrolizy alkohol ekstrahować chlorkiem metylenu (3x15 ml) 10 Laboratorium specjalistyczne – Biotransformacje Semestr VI połączone fazy organiczne wysuszyć siarczanem (VI) sodu, po odsączeniu środka suszącego odparować rozpuszczalnik. b) Estryfikacja bezwodnikiem bursztynowym O OH OH O + O Amano AK O OH + TBME O O (S) (R) NaOH/H2O OH (R) Odczynniki: 1-fenyloetanol; bezwodnik bursztynowy; eter t-butylowo-metylowy (TBME); lipaza; nasycony roztwór wodorowęglanu sodu; eter dietylowy; chlorek metylenu; wodorotlenek sodu. Wykonanie: Do kolby stożkowej o poj. 100 ml odważyć 1,22g (10 mmol) racemicznego 1-fenyloetanolu i dodać 10 ml eteru t-butylowo-metylowego. Osobno odważyć 1,20g (12 mmol) roztartego w moździerzu bezwodnika bursztynowego i 0,20g lipazy i dodać do kolby, a następnie ścianki opłukać 15 ml TBME. Kolbę umieścić na wytrząsarce (amplituda 3; 180obr/min; temp. pokojowa) na 24h. Odsączyć enzym na sączku karbowanym i przemyć go 10 ml TBME. Pobrać próbkę (2ml), która posłuży do oszacowania stopnia konwersji za pomocą 1HNMR. Otrzymany przesącz ekstrahować trzykrotnie 100 ml nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu. Fazę wodną przemyć 25ml TBME, a następnie połączone fazy organiczne przemyć dodatkowo 20ml wody. Fazę eterową wysuszyć bezwodnym siarczanem sodu i odparować na wyparce otrzymując nieprzereagowany enancjomer (S). Fazę wodną przenieść do kolby zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne, dodać 20g wodorotlenku sodu i mieszać przez 3h w temperaturze pokojowej. Następnie roztwór przenieść do rozdzielacza i ekstrahować trzykrotnie 30 ml chlorku metylenu. Fazę organiczną zawierającą enancjomer (R) wysuszyć siarczanem sodu i odparować rozpuszczalnik. 3. Opracowanie wyników 1. Na podstawie widm 1HNMR i chromatogramu GC obliczyć stopnie przereagowania poszczególnych mieszanin. 2. Zmierzyć skręcalność właściwą otrzymanych związków i wyznaczyć ich nadmiary enancjomeryczne w odniesieniu do danych literaturowych. 3. Wyznaczyć nadmiary enancjomeryczne produktów za pomocą HPLC. 4. Wyznaczyć stosunek enancjomeryczny (E). 5. Przedstawić wady i zalety obu metod rozdziału. 11
