MELOIDOGYNE JAVANICA

Ziemniak Polski 2013 nr 4
24
GUZAK JAWAJSKI (MELOIDOGYNE
JAVANICA) W DWU PRZESYŁKACH
ZIEMNIAKÓW JADALNYCH
IMPORTOWANYCH Z EGIPTU DO POLSKI
dr Witold Karnkowski, mgr Marta Saldat, mgr Agata Kaczmarek*
GIORiN, Centralne Laboratorium w Toruniu, ul. Żwirki i Wigury 73, 87-100 Toruń
e-mail: [email protected]
*obecny adres: The James Hutton Institute, Invergowrie, Dundee, DD2 5DA, Szkocja
G
uzaki (Meloidogyne spp.) są osiadłymi endopasożytami roślin wyższych. Osobniki młodociane (J2)
przenikają do korzeni roślin najczęściej
przez stożek wzrostu lub w jego bezpośred-
nim sąsiedztwie. W korzeniu osobniki młodociane samic stopniowo nieruchomieją i
powiększają objętość ciała. Dorosła samica
ma kształt kulisty lub butelkowaty i jest całkowicie nieruchoma.
Ziemniak Polski 2013 nr 4
Niektóre gatunki guzaków mogą także
rozwijać się w bulwach ziemniaka. Wśród
nich szczególne znaczenie mają dwa blisko
spokrewnione ze sobą gatunki: guzak amerykański (Meloidogyne chitwoodi Golden et
al.) i guzak holenderski (Meloidogyne fallax
Karssen), które mają status organizmów
kwarantannowych we wszystkich państwach
członkowskich Unii Europejskiej, a także w
innych krajach spoza UE. W Polsce nie notowano dotąd przypadku wystąpienia M.
chitwoodi lub M. fallax, jednak ze względu na
możliwość ich pojawienia się u nas pracownicy Wojewódzkich Inspektoratów Ochrony
Roślin i Nasiennictwa (WIORiN) prowadzą
poszukiwania obu tych gatunków nicieni zarówno w ziemniakach krajowych, jak i pochodzących z importu.
W kwietniu 2010 r. pracownicy WIORiN w
Łodzi pobrali w sklepie jednej z dużych sieci
handlowych próbkę ziemniaków jadalnych
A
25
pochodzących z Egiptu (próbka nr 1). W
trakcie badań w Laboratorium Wojewódzkim
WIORiN w Sieradzu nie stwierdzono żadnych widocznych zewnętrznych objawów
porażenia. Jednak po zdjęciu skórki stwierdzono w miąższu brązowe nekrotyczne
zmiany o średnicy ok. 0,5-1,0 mm, wskazujące na obecność samic guzaków (fot. 1B).
W kwietniu 2011 r. pracownicy WIORiN w
Kielcach pobrali, także w sklepie jednej z
sieci handlowych, próbkę ziemniaków również pochodzących z Egiptu (próbka nr 2) i
stwierdzili podobne objawy porażenia wewnętrznego przez guzaki, przy braku wyraźnych objawów zewnętrznych (fot. 1A). Laboratorium Wojewódzkie w Kielcach potwierdziło obecność w tej próbce samic guzaków
z rodzaju Meloidogyne.
Celem badań było jednoznaczne określenie przynależności gatunkowej nicieni znajdujących się w obu próbkach.
B
Fot. 1. Bulwa ziemniaka pochodząca z partii importowanej z Egiptu, porażona przez guzaki.
A – widoczne małe okrągławe zgrubienia na powierzchni; B – widoczne objawy porażenia
wewnętrznego – nekrotyczne plamki o średnicy 0,5-1,0 mm (fot. T. Konefał)
Materiał i metody
Szczegółowe badania dotyczące identyfikacji
nicieni prowadzono w Centralnym Laboratorium Głównego Inspektoratu Ochrony Roślin
i Nasiennictwa w Toruniu. Do ekstrakcji
osobników guzaków z miąższu bulw zastosowano metodę enzymatyczną rekomendowaną przez Europejską i Śródziemnomorską
Organizację
Ochrony
Roślin
EPPO
(OEPP/EPPO 2006, 2009). Samice guzaków
wyekstrahowane z bulw poddano w pierwszej kolejności analizom molekularnym w
celu potwierdzenia lub wykluczenia obecności gatunków kwarantannowych – M. chitwoodi i M. fallax.
Materiał pobrany do badań w 2010 r.
(próbka nr 1) analizowano w pierwszej kolejności z zastosowaniem testu PCR-ITS pozwalającego na stwierdzenie, czy nicienie
należą do rodzaju Meloidogyne, a następnie
z zastosowaniem metody RFLP-PCR
(OEPP/EPPO 2009). Badania na materiale
pobranym w 2011 r. (próbka nr 2) przeprowadzono z zastosowaniem rekomendowa-
26
Ziemniak Polski 2013 nr 4
nych przez EPPO metod PCR-JMV, PCRSCAR, PCR-ITS i RFLP-PCR (OEPP /EPPO
2009).
Wobec negatywnych wyników testów molekularnych przeprowadzonych na materiale
wyizolowanym z obu próbek (wykryto gatunki Meloidogyne spp. inne niż kwarantannowe), dalszą identyfikację nicieni prowadzono
na podstawie budowy morfologicznej
uprzednio spreparowanych samic i osobników młodocianych, na podstawie publikacji
Karssena (1999) oraz materiałów odniesienia.
Wyniki
Testy molekularne ujawniły obecność w obu
próbkach ziemniaków osobników z rodzaju
Meloidogyne (fot. 4, 7, 8) należących do jednego z gatunków Meloidogyne incognita
(Kofoid et White 1919) (Chitwood 1949) lub
M. javanica (Treub 1885) (Chitwood 1949).
Wykluczono przynależność do kwarantannowych gatunków Meloidogyne chitwoodi i
M. fallax (fot. 5, 6). W wyniku obserwacji
cech morfologicznych samic i osobników
młodocianych (obecności samców nie
stwierdzono) oraz ich pomiarów (tab. 1)
zidentyfikowano nicienie występujące w obu
próbach jako należące do gatunku M. javanica (fot. 2).
Tabela 1
Cechy morfologiczne oraz średnie wymiary samic i osobników młodocianych J2
stwierdzonych w obu próbkach ziemniaków
Samice
kształt regionu
Próbka
perinealnego
i punktowanie oskórka
(tak/nie)
Ziemniaki region perinealny z silnie
pobrane rozwiniętymi liniami boczw 2010 r. nymi, które wyraźnie oddzielają jej część grzbietową i brzuszną (fot. 2);
brak punktowania oskórka
w okolicy odbytu
Ziemniaki region perinealny z silnie
pobrane rozwiniętymi liniami boczw 2011 r. nymi, które wyraźnie
oddzielają jej część
grzbietową i brzuszną;
brak punktowania oskórka
w okolicy odbytu (fot. 2)
Osobniki młodociane J2
długość sztyletu
dlugość ogona
L
( µ m), szerokość
i przezroczystej
( µ m) i kształt
( µ m)
części ogona ( µ m)
jego guzików
oraz kształt ogona
sztylet = 14,25
ogon = 55
szerokość
przezroczysta część
guzików = 2,0
ogona = 17
475 guziki sztyletu
ogon stożkowaty,
poprzecznie
zaokrąglony
wydłużone,
na końcu (fot. 3)
zaokrąglone
sztylet = 14,50
ogon = 53,75
szerokość
przezroczysta część
guzików = 1,63
ogona = 11,75
450 guziki sztyletu
ogon stożkowaty,
poprzecznie
zaokrąglony na końcu
wydłużone,
(fot. 3)
zaokrąglone
pozycja
hemizonidu
na wysokości
kanalika
wydalniczego
na wysokości
kanalika
wydalniczego
Ziemniak Polski 2013 nr 4
27
Fot. 2. Płytki perinealne Meloidogyne javanica.
Strzałkami zaznaczono wyraźnie widoczne linie boczne (fot. W. Karnkowski)
Fot. 3. Ogon osobnika Meloidogyne javanica (fot. W. Karnkowski)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Fot. 4. Rozkład produktów PCR w żelu agarozowym po analizie RFLP (próbka nr 1, 2010 r.) 1, 9, 17 –
marker DNA (100 bp DNA ladder, Fermentas); 2-4 – Meloidogyne spp., traw. RsaI (~900, 760 bp), 5 –
Meloidogyne fallax, traw. RsaI (~630, 130 bp), 6 – Meloidogyne chitwoodi, traw. RsaI (~760 bp), 6 –
Meloidogyne hapla, traw. RsaI (brak produktu, oczekiwany produkt dla M. hapla ~620, 140 bp); 10-12
– Meloidogyne spp., traw. DraI (~500, 400, 220, 200, 180 bp), 13 – Meloidogyne fallax, traw. DraI
(~650, 110 bp), 14 – Meloidogyne chitwoodi, traw. DraI (~660, 100 bp), 15 – Meloidogyne hapla, traw.
DraI (brak produktu, oczekiwany produkt dla M. hapla ~360, 380 bp); 8, 16 – kontrola negatywna trawienia (fot. A. Kaczmarek)
Ziemniak Polski 2013 nr 4
28
1 2
3
4
5
6
7
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Fot. 5. Rozkład produktów PCR JMV w żelu agarozowym (próbka nr 2, 2011 r.) 1, 28 – marker DNA
(100 bp DNA Ladder, Invitrogen); 2-21 – materiał z próbki nr 2, 22, 23 – Meloidogyne fallax (~670 bp);
24, 25 – Meloidogyne chitwoodi (~540 bp); 26 – kontrola negatywna PCR; 27 – kontrola negatywna
elektroforezy (fot. M. Saldat)
1 2
3
4
5
6
7
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Fot. 6. Rozkład produktów PCR SCAR w żelu agarozowym (próbka nr 2, 2011 r.); 1, 28 – marker DNA
(100 bp DNA Ladder, Invitrogen); 2-21 – materiał z próbki nr 2, 22, 23 –Meloidogyne fallax (~515 bp);
24, 25 – Meloidogyne chitwoodi (~800 bp); 26 – kontrola negatywna PCR; 27 – kontrola negatywna
elektroforezy (fot. M. Saldat)
1 2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
Fot. 7. Rozkład produktów RFLP w żelu agarozowym (próbka nr 2, 2011 r.) (trawienie DraI); 1, 27 –
marker DNA (100 bp DNA Ladder, Invitrogen); 2-21 – materiał z próbki nr 2; 22, 23 –Meloidogyne
fallax (~650, 110 bp); 24, 25 – Meloidogyne chitwoodi (~660, 100 bp); 26 – kontrola negatywna PCR;
27 – kontrola negatywna trawienia (fot. M. Saldat)
Ziemniak Polski 2013 nr 4
1 2
3
4
5
6
7
8
29
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
Fot. 8. Rozkład produktów RFLP w żelu agarozowym (próbka nr 2, 2011 r.) (trawienie RsaI); 1, 27 –
marker DNA (100 bp DNA Ladder, Invitrogen); 2-21 – materiał z próbki nr 2; 22, 23 –Meloidogyne
fallax (~630, 130 bp); 24, 25 – Meloidogyne chitwoodi (~760 bp); 26 – kontrola negatywna trawienia
(fot. M. Saldat)
Dyskusja
Guzak jawajski jest gatunkiem notowanym w
uprawach gruntowych wyłącznie w strefie
klimatu ciepłego. W czasie badań ziemniaków pochodzących z porażonej uprawy na
Malcie (Vovlas i in. 2005) stwierdzono bardzo silne objawy porażenia w postaci niewielkich płaskich wyrośli powodujących silną
deformację bulw, pod skórką zaś – nekrotyczne plamki o średnicy ok. 0,5-1,0 mm,
które były miejscami występowania samic
guzaków, podobnymi do zaobserwowanych
później w próbkach badanych w Polsce.
Wnioski
Wyniki badań wskazują, że guzaki (Meloidogyne spp.) mogą być przenoszone wraz z
bulwami i mogą być obecne w ziemniakach
jadalnych znajdujących się w handlu. Guzak
jawajski jest notowany w Polsce wyłącznie w
szklarniach, głównie na ogórkach i pomidorach. Mógłby rozwijać się także na ziemniakach, lecz uprawianych w zasadzie też tylko
w szklarniach.
Rozwój szkodnika na ziemniakach uprawianych w gruncie jest możliwy, zwłaszcza w
przypadku wysadzenia porażonego materiału sadzeniakowego, jednak gatunek ten nie
jest w stanie przezimować w gruncie w naszych warunkach klimatycznych, gdyż niskie
temperatury zimą doprowadziłyby do likwidacji powstałych ognisk szkodnika. Znacznie
większy problem mogłoby spowodować pojawienie się na ziemniakach importowanych
do Polski guzaków Meloidogyne chitwoodi i
M. fallax. Są to gatunki kwarantannowe, stąd
ich obecność pociągnęłaby konieczność
podjęcia urzędowych zabiegów zwalczania.
Literatura
1. Karssen G. 1999. The plant-parasitic nematode
genus Meloidogyne Goldi 1892 (Tylenchida) in Europe.
PH.D. Thesis, Ghent University: 160 pp; 2. OEPP/
EPPO 2006. EPPO Standards. PM 3/69 Meloidogyne
chitwoodi and M. fallax: Sampling potato tubers for
detection. – Bull. OEPP 36: 421-422; 3. OEPP/EPPO
2009. EPPO Standards. PM 7/41 (2) Meloidogyne
chitwoodi and M. fallax. – Bull. OEPP 39: 5-17; 4. Vovlas N. M., Mifsud D., Landa B. B., Castillo P. 2005.
Pathogenicity of the root-knot nematode Meloidogyne
javanica on potato. – Plant Path. 54: 657-664