Praca doktorska Rozwój specjalizowanych układów

AKADEMIA GÓRNICZO-HUTNICZA IM. STANISŁAWA STASZICA W KRAKOWIE
Wydział Fizyki i Informatyki Stosowanej
Praca doktorska
mgr inż. Przemysław Rydygier
Rozwój specjalizowanych układów
scalonych oraz technik analizy danych do
badań żywych sieci neuronowych z
wykorzystaniem matryc mikroelektrod
Promotor: prof. dr hab. inż. Władysław Dąbrowski
Kraków 2014
2
Oświadczenie autora rozprawy:
Oświadczam, świadomy odpowiedzialności karnej za poświadczenie nieprawdy, że
niniejszą pracę doktorską wykonałem osobiście i samodzielnie i że nie korzystałem ze
źródeł innych niż wymienione w pracy.
data, podpis autora
Oświadczenie promotora rozprawy:
Niniejsza rozprawa jest gotowa do oceny przez recenzentów.
data, podpis promotora rozprawy
3
Rozprawa doktorska przygotowywana była w :
Zespół Elektroniki Jądrowej i Detekcji Promieniowania
Zakład Oddziaływań i Detekcji Cząstek
Wydział Fizyki i Informatyki Stosowanej AGH w Krakowie
The Santa Cruz Institute for Particle Physics
University of California, Santa Cruz
Podziękowania:
Pragnę złożyć podziękowania Polsko-Amerykańskiej Komisji Fulbrighta za przyznanie
stypendium wyjazdowego „Fulbright Junior Advanced Research Award”, które umożliwiło
mi uczestniczenie w eksperymentach badawczych w Stanach Zjednoczonych, bez których
ta praca doktorska nie mogłaby powstać, a także Ministerstwu Nauki i Szkolnictwa
Wyższego za finansowanie prac badawczych w ramach grantu Nr N N515 335736 „Rozwój
specjalizowanych układów scalonych o małym poborze mocy do wielokanałowej stymulacji
elektrycznej i rejestracji sygnałów z komórek nerwowych w eksperymentach in-vivo”
Pragnę podziękować wszystkim, bez których ta praca doktorska nie mogłaby powstać,
przede wszystkim mojemu promotorowi Panu Profesorowi Władysławowi
Dąbrowskiemu za ukierunkowanie naukowe pracy oraz udzieloną pomoc, oraz Panu
Profesorowi Alanowi Litke za wprowadzenie w zagadnienia badań neurobiologicznych
oraz opiekę naukową podczas stażu w Uniwersytecie Kalifornijskim w Santa Cruz.
Szczególne podziękowania dla mojej żony Marzeny za cierpliwość, pomoc oraz wsparcie.
4
SUMMARY
The main subjects of the Dissertation are: development of application specific
integrated circuits for simultaneous electrical stimulation and recording from neural
cells using microelectrode arrays and
development of methods for automated
recognition of functional connectivity in live neural networks.
First chapter describes biological and physical fundamentals of electrical
phenomena in neural systems: neuron structure, initiation and propagation of the
action potential, neuron types, synapse structure and its properties, electrical model of
the synapse. A brief review of mouse brain anatomy is presented, focusing on
hippocampal structure and propagation paths of neural activities.
Second chapter presents state-of-the-art techniques of neural signals recording
based on microelectrode arrays. Various types of microelectrodes, needles and silicon
probes in context of extracellular recording are presented. Description of
512 electrode system for recoding spontaneous and evoked activity in vitro is
presented. Although presented system, developed in Department of Particle
Interaction and Detection Techniques WFiIS AGH, has been used successfully for many
years in neurobiological experiments, it has some limitations, namely bandwidth of the
recording circuitry not does not cover the frequency spectrum of the Local Field
Potentials (LFPs). Requirements for a new recording/stimulating integrated circuit are
presented to overcome limitations of the currently used system.
A design of new integrated circuit comprising both, readout and electrical
stimulation functionality, is presented in third chapter. The chip comprises readout
front-end recording circuits, stimulation circuits with digital-to-analog converter, and
an analog multiplexer. Details of circuit architecture, advantages and limitations, as
well as electrical tests results are discussed. Presented chip is foreseen for both, in
vitro as well as in vivo systems, for recording neural signals.
Development of the recording techniques must be accompanied by data analysis.
An introduction to statistical analysis of spontaneous neural activity recorded during
long (over 10 hours) experiments on brain slices is presented in forth chapter.
Preparation techniques, various approaches to data analysis, direction-sensitive and
insensitive methods are discussed briefly. The main focus has been put on crosscorrelation of two neurons activity as the method allowing to extract maximum
information from recorded activity. Cross-correlation of activity of neuron pairs allows
us to detect functional connections between correlated neurons. It also carries
information about connection type, direction, synapse type and synapse dynamics.
Cross-correlation method has been employed as basis of the algorithm developed for
automated recognition of functional connections between pairs of neurons.
The algorithm of finding functional connectivity has been applied to data recorded
during 52 experiments on cultured brain slices, which took place in Santa Cruz
Institute for Particle Physics. The results are described and discussed in the last
5
chapter. The subject of the experiments was strain Black 6 mouse brain hippocampal
structure. Results of functional connectivity of excitatory and inhibitory connections,
superimposed on slices’ photographs are presented. Also a method based on wavelet
transform for gamma rhythm synchronized pairs of neurons detection is presented.
Regarding development of the electronic circuits the goal of this dissertation was
to design a an integrated circuit capable of recording wide spectrum of neurobiological
signals (Spike Potentials and Local Field Potentials) and stimulating single neurons. To
address the first issue, a recording electronics has been designed. Single channel
comprises a preamplifier, followed by two parallel band-pass filters (500 Hz - 2 kHz
band for Spikes and 1 Hz – 300 Hz for LFPs), and two output amplifiers. 64 channels
are integrated in a single chip including also an analog multiplexer. A novel
multiplexing scheme has been elaborated and implement in the design resulting in
reduction of the clocking signal feed-through and significant improvement of
multiplexing precision at multiplexing frequency of 2.5 MHz.
Low power, 20 kHz, 9-bit, digital to analogue converter (DAC) has been designed to
be employed as stimulation pulse generator. To achieve balance between many
contradictory requirements, successive charge sharing architecture has been chosen.
The DAC is equipped with analogue memory cell and voltage buffer, controlled by
digital circuit to minimize digital signals feed-through. Low Differential Non-Linearity
(below 0.5 LSB) and Integral Non-Linearity (below 2 LSB) makes the signal generator
suitable for the purpose of electrical stimulation of neurons.
A novel method for finding functional connectivity between pairs of neurons, many
times more computationally effective compared to currently used spike jittering has
been proposed. Wavelet transform has been employed to detect pairs of neurons
spiking synchronously with frequency in a range typical for gamma rhythm
(30 - 70 Hz). Recordings from 52 experiments on cultured hippocampal slices were
analyzed in search for excitatory, inhibitory and gamma rhythm. 18 out of 52 slices
were extracted from genetically altered Fragile X mice. No statistical differences in
terms of functional connectivity density between Wild-type and Fragile X have been
identified.
Neural connectivity maps with neurons’ locations and functional connections,
superimposed on Day In vitro 1 photographs show good coherence with data found in
the literature in terms of excitation propagation paths between different regions of the
hippocampal structure. Detailed analysis of cross correlograms’ shapes proves that it
is possible to extract information about synaptic dynamics and synapse type from
extracellular recordings.
6
SPIS TREŚCI
Wstęp ........................................................................................................................................................................ 10
1. Geneza potencjałów czynnościowych w komórkach nerwowych. Rozkład
potencjału wokół komórki nerwowej w ośrodkowym układzie nerwowym ssaków....... 12
1.1. Budowa i działanie komórki nerwowej.........................................................................................12
1.1.1. Budowa komórki nerwowej....................................................................................................... 12
1.1.2. Powstawanie i przewodzenie potencjału czynnościowego .......................................... 13
1.1.3. Propagacja potencjału czynnościowego wzdłuż aksonu ............................................... 15
1.2. Synapsa jako podstawowa jednostka organizacji żywych sieci neuronowych.............17
1.2.1. Budowa i rodzaje synaps ............................................................................................................. 17
1.2.2. Model elektryczny synapsy chemicznej ................................................................................ 19
1.3. Budowa mózgu myszy ze szczególnym uwzględnieniem hipokampa. .............................21
1.3.1. Budowa mózgu myszy .................................................................................................................. 21
1.3.2. Hipokamp – budowa morfologiczna i występujące w nim typy neuronów ........... 22
1.3.3. Interneurony i ich rola w działaniu hipokampa ................................................................ 24
1.3.4. Budowa hipokampa a połączenia funkcjonalne z innymi obszarami mózgu ........ 25
1.4. Obrazowanie elektrofizjologiczne, pole potencjału wokół komórki nerwowej. ..........26
2. Systemy do rejestracji aktywności elektrycznej kultur neuronowych
wykorzystujące matryce mikroelektrod .............................................................................................. 28
2.1. Rola matryc mikroelektrod w rejestracji aktywności komórek nerwowych.
Rejestracja wewnątrz i zewnątrzkomórkowa ............................................................................28
2.2. Sondy elektrodowe i mikroigły - najnowsze metody rejestracji potencjałów
zewnątrzkomórkowych .......................................................................................................................30
2.3. Budowa systemu 512-elektrodowego do rejestracji aktywności elektrycznej
żywych sieci neuronowych .................................................................................................................32
2.4. Wymagania projektowe dla nowego układu scalonego do równoczesnej
stymulacji i odczytu aktywności komórek nerwowych w eksperymentach
In-vitro oraz In-vivo...............................................................................................................................35
2.4.1. Dyskusja i założenia projektowe poszczególnych bloków funkcjonalnych ........... 35
1.1.1. Schemat blokowy układu scalonego NEUROSTIM. Odczyt / generowanie
sygnałów analogowych ................................................................................................................ 39
1.1.2. Interfejs komunikacyjny .............................................................................................................. 40
3. Projekt i testy wybranych bloków funkcjonalnych specjalizowanego układu
scalonego NEUROSTIM ................................................................................................................................ 41
3.1. Przetwornik cyfrowo-analogowy w układzie do stymulacji elektrycznej ......................41
3.1.1. Architektura przetwornika cyfrowo-analogowego.......................................................... 42
3.1.2. Ograniczenia architektury i źródła nieliniowości przetwornika................................ 43
7
3.1.3. Pamięć analogowa i układ redukcji pasożytniczego wstrzykiwania ładunku...... 46
3.1.4. Wyniki pomiarów przetwornika cyfrowo-analogowego .............................................. 48
3.2. Układ do rejestracji sygnałów neurobiologicznych ................................................................. 52
3.2.1. Filtr wejściowy i przedwzmacniacz ....................................................................................... 53
3.2.2. Filtry pasmowo-przepustowe .................................................................................................. 54
3.2.3. Wzmacniacze wyjściowe ............................................................................................................ 57
3.2.4. Wyniki pomiarów charakterystyk częstotliwościowych i liniowości ...................... 58
3.3. Multiplekser analogowy ...................................................................................................................... 59
3.3.1. Architektura i zasada działania multipleksera .................................................................. 59
3.3.2. Komórka pamięci i wzmacniacz operacyjny ...................................................................... 60
3.3.3. Rejestr przesuwny, blok logiki kontrolnej i 4 tryby pracy. .......................................... 63
4. Analiza statystyczna aktywności dużej liczby komórek nerwowych ...................................... 66
4.1. Preparatyka wycinków mózgu myszy, hodowanie kultur i rejestracja
aktywności elektrycznej neuronów hipokampa i kory mózgowej .................................... 66
4.2. Wstępna analiza danych – wykrywanie i sortowanie potencjałów
czynnościowych ...................................................................................................................................... 68
4.3. Metody poszukiwania połączeń funkcjonalnych pomiędzy neuronami ......................... 69
4.3.1. Metody bezkierunkowe – metoda informacji wzajemnej ............................................. 69
4.3.2. Metody kierunkowe - Entropia Przejściowa ...................................................................... 69
4.3.3. Korelacja wzajemna ...................................................................................................................... 70
4.4. Związek kształtu funkcji korelacji wzajemnej z typem połączenia
funkcjonalnego ........................................................................................................................................ 71
4.4.1. Geneza kształtu funkcji korelacji wzajemnej ..................................................................... 71
4.4.2. Model formalny neuronu całkuj i strzelaj, model synapsy pobudzającej i
hamującej .......................................................................................................................................... 72
4.4.3. Kształty wykresów funkcji korelacji wzajemnej oraz odpowiadające im
konfiguracje połączeń synaptycznych. ................................................................................. 77
4.4.4. Wykrywanie połączeń synaptycznych metodą drgań losowych. Wady i
ograniczenia metody. ................................................................................................................... 81
4.5. Wydajny obliczeniowo algorytm detekcji połączeń synaptycznych................................. 83
4.5.1. Zastąpienie drgań losowych filtracją dolnoprzepustową ............................................. 84
4.5.2 Wybór filtru cyfrowego ............................................................................................................... 85
4.5.3. Określenie istotności statystycznej korelacji wzajemnej .............................................. 89
4.5.4. Podsumowanie opracowanej metody i wnioski: .............................................................. 91
4.6. Sposoby określania rodzaju znalezionej komórki nerwowej .............................................. 93
4.6.1. Klastrowanie w przestrzeni częstotliwość - szerokość impulsu - średnia
z autokorelacji ................................................................................................................................. 94
8
4.6.2. Określenie typu komórki na podstawie korelacji wzajemnej ...................................... 95
5. Badanie połączeń funkcjonalnych w kulturach organotypowych mózgu myszy. ............... 97
5.1. Badanie połączeń pobudzających i hamujących, rozpoznawanie komórek
pobudzających i hamujących .............................................................................................................97
5.1.1. Mikrofotografie kultur organotypowych i ich rola w identyfikacji
aktywności elektrycznej poszczególnych struktur anatomicznych. ......................... 97
5.1.2. Mapy połączeń funkcjonalnych w kulturach organotypowych hipokampu
mózgu myszy ................................................................................................................................. 101
5.2. Identyfikacja połączeń zsynchronizowanych w rytmie gamma ...................................... 111
5.2.1. Geneza rytmów (fal) mózgowych. Hipotetyczny układ neuronów
generujący rytm gamma ........................................................................................................... 112
5.2.2. Wykorzystanie transformaty falkowej do automatycznego wykrywania
połączeń neuronów zsynchronizowanych........................................................................ 113
5.2.3. Półautomatyczna
metoda
poszukiwania
par
neuronów
zsynchronizowanych w rytmie gamma.............................................................................. 115
5.2.4. Wyniki półautomatycznej analizy poszukiwania par neuronów
zsynchronizowanych w zakresie rytmu fal mózgowych gamma ............................ 117
5.3. Analiza dynamiki synaptycznej połączeń pobudzających .................................................. 121
5.4. Podsumowanie wyników i wnioski.............................................................................................. 124
Podsumowanie ................................................................................................................................................... 128
Dodatek A: Sortowanie potencjałów czynnościowych ...................................................................... 130
Dodatek B: Własności transformaty falkowej i jej zastosowanie do wykrywania
kształtów na wykresach korelacji wzajemnej................................................................................. 133
Bibliografia........................................................................................................................................................... 136
Spis Rysunków ................................................................................................................................................... 141
Spis tabel ............................................................................................................................................................... 145
9
WSTĘP
Pierwsze techniki rejestracji aktywności elektrycznej komórek nerwowych
opracowane zostały już w XIX wieku. Juliusz Bernstein przeprowadził rejestrację
potencjału czynnościowego neuronu w roku 1868 [1]. Również koncepcja stymulacji
komórki nerwowej nie jest nowa. Pierwszą udaną próbę stymulacji przeprowadził i opisał
w roku 1933 Ralph Waldo Gerard [2]. Opisu zjawiska generacji potencjału
czynnościowego w komórkach nerwowych kałamarnicy na bazie zjawisk fizycznych
dokonali Alan Hodgkin oraz Andrew Huxley [3]. Był to pierwszy fizyczny model komórki
nerwowej odwzorowujący pracę kanałów jonowych, na którym opiera się większość
modeli stosowanych współcześnie. Wszystkie te przełomowe odkrycia bazowały na
badaniach prowadzonych przy użyciu pojedynczej elektrody, których przedmiotem była
pojedyncza komórka nerwowa. Dostępne techniki eksperymentalne pozwalały na
równoczesne badanie tylko kilku neuronów – ograniczenie stanowiła możliwość
fizycznego pozycjonowania dużej liczby elektrod. W roku 1972 po raz pierwszy
w badaniach neurobiologicznych zastosowano matrycę mikroelektrod [4]; było to
otwarcie nowego rozdziału w historii badań neurobiologicznych, związane z możliwością
równoczesnej rejestracji aktywności wielu neuronów.
W eksperymentach rejestracji potencjałów zewnątrzkomórkowych in vitro
wycinek tkanki nerwowej umieszczany jest na matrycy mikroelektrod. Każda elektroda
połączona jest z układem elektroniki odczytu, wzmacniającym i filtrującym sygnały.
Elektrody zewnątrzkomórkowe znajdują się w pewnej odległości od komórek nerwowych,
przez co wartości rejestrowanych potencjałów zewnątrzkomórkowych są dużo niższe od
potencjałów transbłonowych. Może to budzić wątpliwości, czy ta metoda pozwala badać te
same własności neuronów co elektrody wkłuwane? Należy jednak pamiętać, że wkłucie
dużej liczby elektrod szklanych może prowadzić do zniszczenia niektórych komórek
i zaburzenia dział ania sieci neuronowej jako całości. Zastosowanie matryc mikroelektrod
jest metodą bardzo mało inwazyjną i zasadniczo rozwiązuje wspomniany problem.
Matryce mikroelektrod stosowane są przez wiele grup naukowych badających
działanie żywych sieci neuronowych na różnych poziomach, od pojedynczych komórek,
skupiając się na zależnościach kształtu potencjału komórkowego od gęstości kanałów
jonowych [5] aż do relacji pomiędzy grupami neuronów w mózgach ssaków [6]. Badana
tkanka i neurony rozmieszczone są na matrycy w sposób losowy, konsekwencją czego jest
rejestracja potencjałów pochodzących z wielu komórek na pojedynczej elektrodzie,
i oczywiście rejestracja napięcia pochodzącego z jednej komórki na wielu elektrodach.
Takie nieuporządkowanie w rejestrowanych danych wymusza zastosowanie algorytmów
sortujących potencjały czynnościowe. Pozwalają one na identyfikację pojedynczych
neuronów na podstawie różnic kształtów zarejestrowanych potencjałów. Potencjały
czynnościowe można sprowadzić do zapisu binarnego o określonym interwale czasowym,
gdzie 0 oznacza brak potencjału, 1 – wystąpienie potencjału czynnościowego. Zapis
binarny może zostać użyty do poszukiwania połączeń funkcjonalnych na podstawie
statystyki aktywacji neuronów w czasie w zależności od aktywacji innych neuronów.
Poszukiwanie połączeń funkcjonalnych w dużych grupach neuronów jest podstawowym
celem analizy danych przeprowadzonej w niniejszej pracy doktorskiej.
Materiałem badawczym, który był wykorzystywany do pracy nad metodami
poszukiwań połączeń funkcjonalnych między neuronami były kultury organotypowe
z wycinków mózgu myszy. Techniki hodowania kultur organotypowych znane były już
10
w latach 80 XXw., jednak dopiero zastosowanie matryc mikroelektrod oraz dużej mocy
obliczeniowej dostępnej dzięki nowoczesnym komputerom umożliwiło badanie połączeń
funkcjonalnych między dużymi grupami komórek nerwowych (nawet do kilkuset) w
kulturach organotypowych. Przebieg typowego eksperymentu został przedstawiony
schematycznie na Rysunku i.1.
Rysunek i.1. Główne etapy eksperymentu mającego na celu sporządzenie mapy
połączeń funkcjonalnych w mózgu myszy: a) ekstrakcja plasterka mózgu,
b) hodowla kultury organotypowej, c) rejestracja aktywności spontanicznej,
d) wykrywanie i sortowanie potencjałów czynnościowych, e) binaryzacja,
f) analiza danych, g) mapa połączeń funkcjonalnych.
Skonstruowany w Katedrze Oddziaływań i Detekcji Cząstek WFiIS AGH system do
rejestracji oraz stymulacji elektrycznej komórek nerwowych, stosowany obecnie
w Instytucie Cząstek Elementarnych w Santa Cruz oraz Instytucie Salka w La Jola
(Kalifornia, USA) oparty jest na układach scalonych umożliwiających rejestrację
potencjałów czynnościowych. System ten wykorzystywany był także przez autora
niniejszej rozprawy do badań wycinków mózgu myszy. Nie umożliwia on jednak (lub
umożliwia w bardzo ograniczonym zakresie) rejestracji potencjałów polowych, sygnałów
w zakresie częstotliwości 0.1-10Hz. Ponieważ technika rejestracji oraz analizy
potencjałów czynnościowych została w wysokim stopniu opanowana i udoskonalona,
kolejnym krokiem na drodze poznawania praw rządzących działaniem żywych sieci
neuronowych jest umożliwienie rejestracji właśnie potencjałów polowych równolegle
z potencjałami czynnościowymi i poszukiwanie relacji pomiędzy tymi dwoma klasami
sygnałów. Aby umożliwić rozpoczęcie tego typu badań, konieczne jest zaprojektowanie
nowego układu scalonego, który umożliwi rejestrację potencjałów polowych oraz
czynnościowych, jak również stymulację elektryczną neuronów. W rozdziale 3.
przedstawiony zostanie projekt układu scalonego, który umożliwia rejestrację aktywności
potencjałów czynnościowych, potencjałów polowych jak również stymulację elektryczną
komórek nerwowych.
11
1. GENEZA
POTENCJAŁÓW CZYNNOŚCIOWYCH W KOMÓRKACH NERWOWYCH.
ROZKŁAD
POTENCJAŁU WOKÓŁ KOMÓRKI NERWOWEJ W OŚRODKOWYM UKŁADZIE NERWOWYM
SSAKÓW.
1.1. Budowa i działanie komórki nerwowej
1.1.1. Budowa komórki nerwowej
Podstawową jednostką czynnościową systemu nerwowego ssaków jest neuron.
Budowa typowej komórki nerwowej przedstawiona została na Rysunku 1-1.
Rysunek 1-1: Budowa komórki nerwowej [7].
Budowa morfologiczna neuronu jest złożona i można w nim wyróżnić 3 zasadnicze
elementy:
 drzewo dendrytów – jego zadaniem jest odbieranie sygnałów wejściowych
(impulsów z innych neuronów lub z komórek receptorowych np. komórek
czuciowych w skórze – ciałek dotykowych Meissnera)
 ciało komórki (soma) – w nim następuje sumowanie sygnałów wejściowych oraz
generacja potencjału czynnościowego, jeśli został przekroczony próg pobudzenia.
Ciało komórki nerwowej może mieć różnorodne kształty i wymiary od 4 µm do
150 µm. W tym miejscu zachodzą główne procesy metaboliczne i synteza
składników komórkowych.
 akson – długa, cylindryczna wypustka, poprzez którą potencjał czynnościowy jest
przesyłany do kolejnych komórek (innych neuronów lub komórek efektorowych).
Akson może się rozgałęziać w pobliżu ciała komórki lub osiągać długość do 1,2m,
średnica może dochodzić do 1mm. Włókno aksonu może być izolowane za pomocą
osłonki mielinowej. Długie aksony posiadają osłonkę mielinową, która nie jest
ciągła lecz posiada przerwy co ok. 1mm, tzw. przewężenia Ranviera.
Oprócz neuronów tkanki nerwowe zbudowane są z komórek glejowych. Kilkakrotnie
liczniejsze od komórek nerwowych, pełnią funkcje tkanki nośnej a także zaopatrującej
neurony w substancje metaboliczne. Do neurogleju zaliczamy: Oligodendrocyty
wytwarzające mielinę, spełniającą funkcję izolatora oddzielającego komórki przewodzące,
Astrocyty pośredniczące w wymianie substancji budulcowych i metabolicznych między
krwioobiegiem a neuronami oraz Komórki mikrogleju wykazujące właściwości żerne [8].
12
1.1.2. Powstawanie i przewodzenie potencjału czynnościowego
Neuron posiada dwa stany funkcjonalne:
A. Stan spoczynkowy
B. Stan przewodzenia.
W stanie spoczynkowym jak i przewodzenia, na poziomie molekularnym zachodzą
procesy wymagające dostarczenia energii w postaci wysokoenergetycznych wiązań
chemicznych w ATP (adenoz ynotrójfosforan) [8]. Oba stany funkcjonalne opierają się na
działaniu białek błonowych transportujących jony w poprzek błony komórkowej. Białka te
nazywane są napięciowo zależnymi kanałami jonowymi, ponieważ napięcie panujące na
błonie komórkowej decyduje o stanie czynnościowym, w jakim znajdują się w danej
chwili. Przejście ze stanu spoczynkowego do stanu przewodzenia odbywa się w wyniku
wystąpienia wystarczająco silnych bodźców pobudzających w drzewie dendrytów.
W wyniku czasoprzestrzennego sumowania sygnałów przez drzewo dendrytów,
w obrębie ciała neuronu dochodzi do wygenerowania pojedynczego impulsu nerwowego
(lub krótkiej serii kilku impulsów, ang. bursting), który propaguje się wzdłuż aksonu
komórki nerwowej. W organizmach żywych skutkiem powstania i propagacji impulsu
nerwowego jest dotarcie impulsu do innego neuronu lub do komórki efektorowej, dla
której impuls nerwowy jest sygnałem do modyfikacji jej metabolizmu (np. skurcz komórki
mięśniowej, uwolnienie do krwi hormonów przez komórki wydzielnicze itp.).
A) Stan spoczynkowy
Występuje, gdy komórka nie odbiera z zewnątrz żadnych bodźców lub
występujące bodźce nie są wystarczające, aby wywołać przejście do stanu przewodzenia.
Koncentracje poszczególnych jonów we wnętrzu i na zewnątrz komórki są różne, w stanie
spoczynkowym występuje równowaga pomiędzy siłami osmotycznymi (wynikającymi
z różnych stężeń jonów po obu stronach błony komórkowej) i siłami elektrycznymi, które
wynikają z gradientu gęstości ładunku elektrycznego. Najważniejszymi jonami, które
znajdują się w cytoplazmie neuronów i ich otoczeniu są: kation potasowy K+, kation
sodowy Na+, anion chlorkowy Cl-. Dla każdego z tych jonów występuje napięcie
równowagi, opisane równaniem Nernsta [9]. W praktyce, do utrzymania napięcia
spoczynkowego na stałym poziomie, komórka nerwowa wykorzystuje białka błonowe
transportujące jony.
B) Stan przewodzenia
Opis generacji i rozprzestrzeniania się potencjału czynnościowego wymaga
wyjaśnienia, w jaki sposób działają kanały jonowe w błonie komórkowej neuronu.
Wyróżnia się dwa rodzaje kanałów jonowych: kanały sodowe i kanały potasowe. Kanały te
różnią się budową i sposobem działania.
Napięciowo zależne kanały sodowe zbudowane są z dwóch podjednostek zwanych
bramką m i bramką h (Rysunek 1-2 po stronie lewej). W stanie spoczynkowym bramka m
pozostaje zamknięta, bramka h jest otwarta. Gdy potencjał błony komórkowej zmienia się
w wyniku depolaryzacji (potencjał po wewnętrznej stronie staje się mniej ujemny
w stosunku do środowiska zewnątrzkomórkowego, przyjmując wartość powyżej - 50mV),
kanał sodowy zostaje aktywowany. Reakcja bramek nie jest równoczesna, bramka m
reaguje natychmiast i otwiera się, podczas gdy bramka h zamyka się dopiero po 1 - 2ms
(Rysunek 1-2.B). Przez pewien czas (ok. 1ms), gdy bramka m jest już otwarta, a bramka h
jeszcze się nie zamknęła, kanał pozostaje otwarty dla przepływu jonów sodowych.
13
Rysunek 1-2: Sekwencja działania kanałów błonowych w kolejnych fazach generacji potencjału
czynnościowego. A – stan spoczynkowy. B – depolaryzacja błony i aktywacja
kanałów sodowych prowadząca do dalszego wzrostu napięcia. C – repolaryzacja –
dezaktywacja kanałów sodowych i otwarcie kanałów potasowych, napięcie
przyjmuje wartość poniżej wartości spoczynkowej (-70mV). D – hiperpolaryzacja
błony – kanały potasowe pozostają otwarte przez pewien czas po zaniknięciu
depolaryzacji [9].
Gdy polaryzacja elektryczna aktywująca białko zanika, bramki powracają do położenia
spoczynkowego w takiej samej kolejności – najpierw zamyka się bramka m, a następnie
otwiera się bramka h.
14
Aktywowany napięciem kanał potasowy zawiera tylko jedną bramkę –
w nomenklaturze neurobiologicznej nazywana jest bramką n. Bramka n w stanie
spoczynkowym pozostaje zamknięta. Gdy pojawia się wzrost wartości ujemnego
potencjału błonowego od -70mV do -50mV, bramka otwiera się z opóźnieniem podobnie
jak bramka h w kanale sodowym. Kanał potasowy pozostaje otwarty dopóki napięcie
błonowe nie powróci do wartości spoczynkowej. Schematyczną budowa i działanie kanału
potasowego przestawia Rysunek 1-2 (po stronie prawej).
W wyniku depolaryzacji błony komórkowej, pierwszym, natychmiastowym efektem
jest otwarcie bramek m w kanałach sodowych, zwiększenie przewodności błony
komórkowej dla sodu, napływ jonów sodowych do wnętrza komórki i zaburzenie stanu
równowagi jonowej. Układ dąży do wyrównania stężeń kationów sodowych po obu
stronach błony komórkowej. Wzrost potencjału po wewnętrznej stronie błony
komórkowej powoduje wypływ kationów potasowych K+ na zewnątrz komórki. Jeśli liczba
aktywowanych kanałów sodowych jest mała, to przewodność błony dla potasu może być
wyższa niż dla sodu i odkomórkowy prąd potasowy zrównoważy dokomórkowy prąd
sodowy. Wypadkowy potencjał błonowy nie ulegnie zmianie i nie wystąpi potencjał
czynnościowy.
Jeżeli ma miejsce silna depolaryzacja błony, szczególnie w miejscach o wysokim
zagęszczeniu kanałów sodowych (początkowy odcinek aksonu, tzw. wzgórek aksonu),
dochodzi do silnego napływu jonów sodowych do wnętrza komórki i odkomórkowy prąd
potasowy nie jest w stanie zrównoważyć zmian napięcia. Potencjał po wewnętrznej
stronie staje się coraz wyższy, na zasadzie dodatniego sprzężenia zwrotnego coraz więcej
kanałów sodowych zostaje otwartych aż do inicjacji potencjału czynnościowego.
W szczytowym momencie depolaryzacji polarność błony komórkowej ulega odwróceniu
i napięcie błonowe osiąga wartość +30mV. Przewodność kanałów sodowych jest w tym
momencie kilkadziesiąt razy większa niż kanałów potasowych. Kanały sodowe pozostają
otwarte przez 1-2ms, po czym bramka h zamyka się i kanał sodowy staje się
nieprzewodzący niezależnie od stanu bramki m. Przez ten czas błona komórkowa
pozostaje niewrażliwa na bodźce. Następnie ulegają otwarciu kanały potasowe, kationy
potasowe wypływają na zewnątrz komórki – błona komórkowa ulega repolaryzacji. W tym
etapie przewodność dla jonów potasowych jest maksymalna, powracając do polaryzacji
spoczynkowej, napięcie błonowe na okres ok. 35-40ms spada do wartości bardziej
ujemnej niż wartość spoczynkowa, czyli poniżej -70mV. Okres ten nazywany jest fazą
hiperpolaryzacji, w tym czasie komórka wykazuje zmniejszoną wrażliwość na pobudzenie
[8], [9].
1.1.3. Propagacja potencjału czynnościowego wzdłuż aksonu
Potencjał czynnościowy to depolaryzacja błony komórkowej (chwilowe odwrócenie
napięcia błonowego), która występuje po przekroczeniu na błonie komórkowej
napięcia -50mV. Depolaryzacja związana jest z lawinowym napływem kationów sodowych
do wnętrza komórki. Kationy mają tendencję do rozprzestrzeniania się na sąsiednie
fragmenty błony komórkowej. Jeżeli napięcie przekroczy wartość progową -50mV,
dochodzi do wygenerowania potencjału czynnościowego w sąsiednim, do tej pory
pozostającym w stanie spoczynku fragmencie błony. Potencjał czynnościowy jest swego
rodzaju „rozprzestrzeniającą się wzdłuż włókna nerwowego falą depolaryzacji”
(Rysunek 1-3). Cykliczna zmiana potencjału błonowego może przebyć drogę wzdłuż całej
długości włókna.
15
Rysunek 1-3: Propagacja potencjału czynnościowego: miejsce, do którego dociera potencjał
czynnościowy ulega depolaryzacji (napływ jonów Na+). Na podstawie [8], [9].
Równomierne rozmieszczenie kanałów błonowych pozwala na propagację
potencjału w obie strony aksonu, jednak najczęściej potencjał propaguje się tylko w
kierunku od ciała komórki do synapsy na zakończeniu aksonu (kierunek ortodromowy).
Dzieje się tak dlatego, że potencjał pierwotnie generowany jest w ciele komórki i zaczyna
się przemieszczać w kierunku synapsy – miejsca, które zostały zdepolaryzowane chwile
wcześniej, są niewrażliwe na pobudzenie, więc potencjał propaguje się tylko w jednym
kierunku. Przewodzenie w obu kierunkach może zostać sztucznie wywołane poprzez
stymulację środkowego fragmentu aksonu za pomocą na przykład stymulacji
zewnętrznym prądem lub napięciem doprowadzanym za pomocą elektrody wkłutej do
wnętrza komórki.
Szybkość propagacji potencjału czynnościowego zależy od rodzaju neuronu i waha
się w granicach od 0,1 do 100m/s. W głównej mierze szybkość przewodzenia jest
definiowana przez stosunek przewodności elektrycznej wnętrza aksonu σa do
przewodności błony komórkowej σb, (σa i σb są zdefiniowane jako przewodność na
jednostkę długości włókna). Im wyższy iloraz przewodności σa/σb, tym mniejszy przepływ
prądu sodowego na zewnątrz komórki. Depolaryzacja związana z generacją impulsu
w danym fragmencie błony propaguje się efektywniej na kolejne obszary, co zwiększa
szybkość przemieszczania się potencjału. Przewodność wnętrza aksonu σa jest
proporcjonalna do drugiej potęgi promienia aksonu, natomiast przewodność błony σb
zależy od promienia liniowo. Jeżeli szybkość propagacji zależy od stosunku σa/σb, to
w aksonach o większej grubości potencjał czynnościowy będzie się propagował szybciej,
niż w aksonach cienkich [9]. Największą prędkość przenoszenia potencjału posiadają
włókna otoczone osłonką mielinową (działającą jak izolator, Rysunek 1-1). W osłonce
mielinowej znajdują się regularnie występujące przerwy (przewężenia Ranviera).
Depolaryzacja w jednym węźle przemieszcza się wzdłuż wnętrza aksonu do następnego
węzła, z pominięciem fragmentu otoczonego osłonką mielinową. Jest to tzw.
przewodnictwo skokowe, znacznie szybsze w stosunku do przewodnictwa ciągłego nawet
w bardzo cienkich włóknach [8], [9].
16
1.2. Synapsa jako
neuronowych
podstawowa
jednostka
organizacji
żywych
sieci
Interakcje pomiędzy neuronami zachodzą dzięki połączeniom zwanym synapsami.
W najprostszy sposób synapsę można opisać jako połączenie, poprzez które wybrany
neuron może aktywować lub zahamować potencjał czynnościowy innego neuronu. Wiele
dowodów eksperymentalnych oraz modeli fizycznych synapsy wskazuje na to, że
transmisja synaptyczna odbywa się w sposób stochastyczny. Pobudzenie lub hamowanie
nie odbywa się ze 100% prawdopodobieństwem, również czas jaki upływa od wystąpienia
potencjału czynnościowego w neuronie pobudzającym i pobudzanym (hamującym
i hamowanym) podlega rozkładowi statystycznemu [10].
1.2.1. Budowa i rodzaje synaps
Ze względu na fizyczny sposób przesyłania pobudzenia (sygnału) synapsy dzielą się na
elektryczne i chemiczne.
Synapsa elektryczna to bezpośrednie połączenie powierzchni błon komórkowych
dwóch neuronów mające średnicę 3-4 nm. Kanały jonowe przeszywające obie błony
komórkowe umożliwiają przepływ jonów i bezpośrednie pobudzanie jednego neuronu
przez drugi. Synapsy elektryczne zazwyczaj działają dwukierunkowo, obecne są
najczęściej w systemach nerwowych wymagających najszybszego przesyłania sygnałów
(mechanizmy obronne). Ich liczebność jest znacznie niższa, a budowa znacznie prostsza
w porównaniu do synaps chemicznych.
Budowa i mechanizm działania synapsy chemicznej przedstawione zostały na
Rysunku 1-4. W synapsie możemy wyróżnić błonę presynaptyczną i postsynaptyczną,
tworzące obszar aktywny. W przeciwieństwie do synapsy elektrycznej, synapsa chemiczna
Rysunek 1-4: Budowa i działanie synapsy. Transmitery i modulatory zostają uwolnione
z pęcherzyków synaptycznych do przestrzeni synaptycznej, wiążą się z receptorami
błony pre- i postsynaptycznej, następnie zostają przeniesione do wnętrza komórki.
Rysunek zaczerpnięty z [8].
17
działa w sposób jednokierunkowy. Wyróżnić można fazę presynaptyczną oraz
postsynaptyczną. Faza presynaptyczna polega na uwolnieniu neurotransmitera, który
oddziałuje na błonę postsynaptyczną.
Potencjał czynnościowy docierający do obszaru kolby synaptycznej powoduje fuzję
pęcherzyków zawierających neurotransmiter z błoną komórkową. Uwolniony
neurotransmiter przedostaje się do przestrzeni międzysynaptycznej. Tam jego część jest
wychwytywana zwrotnie (odzyskiwana) przez receptory białkowe na powierzchni błony
presynaptycznej. Pozostałe cząsteczki neurotransmitera wiążą się z receptorami
białkowymi w błonie postsynaptycznej i są transportowane do wnętrza neuronu
pobudzanego. Wzrost stężenia neurotransmitera w przestrzeni postsynaptycznej,
wywołuje kolejne efekty: w synapsie pobudzającej wzrost przewodności błony
komórkowej w rejonie kolby postsynaptycznej, uwolnienie przez receptory białkowe
jonów wapnia Ca2+ i powstanie potencjału czynnościowego w neuronie
postsynaptycznym. W przypadku synapsy hamującej, efektem jest wzrost depolaryzacji
błony komórkowej neuronu postsynaptycznego i zmniejszenie możliwości pobudzenia
komórki przez inne synapsy. Synapsy chemiczne możemy podzielić na synapsy
pobudzające i synapsy hamujące. Różnice między nimi zostały przedstawione na
Rysunku 1-5.


Synapsy pobudzające wykazują asymetrię w grubości błon pre- i postsynaptycznej,
mają również małe i okrągłe pęcherzyki zawierające neurotransmiter [10]. Jako
neurotransmitery najczęściej występują: acetylocholina, dopamina, noradrenalina,
serotonina, adenozyna aminokwasy pobudzające [8].
Synapsy hamujące mają błony pre- i postsynaptyczne podobnej grubości.
Pęcherzyki synaptyczne są spłaszczone lub bezkształtne, synapsa tego typu jest
synapsą hamującą [10]. Neurotransmiterem jest kwas gamma-aminomasłowy
(GABA), który utrzymuje błonę postsynaptyczną na niższym potencjale niż
potencjał spoczynkowy, przez co zmniejsza jej podatność na pobudzenie [8].
Rysunek 1-5: Dwa główne typy synaps chemicznych [10]
Na poziomie dużych grup neuronów synapsa pełni funkcję mikroukładu integrującego
działanie wielu neuronów. Rozmiary synaps są bardzo małe w porównaniu do rozmiarów
całego ośrodkowego układu nerwowego. Średnica obszaru kontaktu błon prei postsynaptycznej wynosi 0.5-2μm. Tak małe rozmiary pozwalają na gęste upakowanie
dużej liczby synaps w jednostkowej objętości tkanki mózgowej. Na przykład w korze
wzrokowej kota 1mm3 istoty szarej zawiera średnio 50,000 neuronów. Każdy z neuronów
posiada średnio 6000 synaps, co daje 300 milionów synaps w 1mm3 [11]. W korze
mózgowej myszy (która obok hipokampa była przedmiotem badań opisanych
w rozdziale 4 niniejszej pracy) znajduje się średnio 92,000 neuronów/mm3, i 720
milionów synaps/mm3 [12].
18
1.2.2. Model elektryczny synapsy chemicznej
W badaniach neurobiologicznych pierwszym etapem jest zawsze opis jakościowy
zjawisk, które odpowiadają za działanie sieci neuronowej. Następnie, zjawiska opisywane
są w sposób ilościowy oraz tworzone są modele matematyczno-fizyczne.
Rozprzestrzenienie się potencjału czynnościowego zostało opisane przez Hodgkina
i Huxleya w roku 1952 [3]. Model ten, przedstawiony na Rysunku 1-6, wyjaśnia zjawisko
rozprzestrzeniania się potencjału czynnościowego opisując błonę komórkową neuronu
jako równoległe połączenie pojemności (reprezentującej błonę komórkową Cm) oraz
trzech zmiennych konduktancji (GK, GNa, EL z szeregowo połączonymi źródłami
napięciowymi EK, ENa, EL), reprezentujących dynamiczną przewodność kanałów jonowych.
Model Hodgkina-Huxleya został przyjęty jako punkt startowy do rozwoju wielu innych,
zarówno uproszczonych modeli służących do symulacji zachowania setek neuronów [13]
jak i bardziej skomplikowanych, stosowanych w badaniach przebiegów napięć
w poszczególnych elementach neuronów [5].
Rysunek 1-6: Model elektryczny błony komórkowej wg. Hodgkina-Huxleya [5].
Mniejszą uwagę poświęcano stworzeniu modelu fizycznego synapsy chemicznej,
w większości analiz systemów nerwowych traktując je jako elementy przewodzące
pobudzenie nerwowe w sposób progowy. Jednak synapsy chemiczne nie są elementami
jednorodnymi i identycznymi. Poza podziałem na synapsy pobudzające i hamujące,
podzielić można je ze względu na rodzaj przekaźnika chemicznego, jaki uwalniany jest do
przestrzeni synaptycznej.
Niestety w literaturze brak spójnych danych na temat wpływu różnych
neuroprzekaźników na działanie synapsy i jej charakterystyki elektryczne. Najwięcej
danych literaturowych dostępnych jest na temat synapsy, w której neuroprzekaźnikiem
jest AMPA [14] [15] [16]. Przykładowy model fizyczny synapsy zaprezentowany został
przez Savtchenko w [17]. Elektryczny schemat zastępczy synapsy przedstawiony został na
Rysunku 1-7. Model uwzględnia pojemności błon komórkowych (Cm), przewodności
napięciowo zależnych kanałów jonowych (Gi,GS) oraz źródła napięciowe, przywracające
potencjał błonowy do stanu spoczynkowego (Ei). Zakłada się, że pierwotny transport
ładunku na drodze uwalniania neuroprzekaźników chemicznych modulowany jest
poprzez elektryczne sprzężenie zwrotne.
19
Rysunek 1-7: Model elektryczny synapsy chemicznej. Widoczne jest rozdzielenie części prei postsynaptycznej. Kolor szary oznacza akson, linie przerywane - kolbę synaptyczną
[17].
Innymi słowy, zmiany napięcia w danym fragmencie synapsy powodują modyfikację
działania kanałów jonowych we fragmentach, do których potencjał czynnościowy dotarł
wcześniej. Model ten zakłada więc przesyłanie sygnału na sposób chemiczny
modyfikowany elektrycznym sprzężeniem zwrotnym.
Model ten tłumaczy różnice pomiędzy kształtami przebiegów wewnątrz
i zewnątrzkomórkowych mierzonych na błonie komórkowej synaps jako wynik
elektrycznego sprzężenia zwrotnego pomiędzy ulegającymi sukcesywnej depolaryzacji
fragmentami błony komórkowej. Elektryczne sprzężenie zwrotne może też modyfikować
przewodność kanałów Ca2+, i wypływ jonów Ca2+ do przestrzeni międzysynaptycznej,
zwiększając prawdopodobieństwo wystąpienia wtórnego potencjału czynnościowego.
Akson, oznaczony kolorem szarym, zawiera napięciowo-zależną konduktancję Gia
i pojemność Cma, odseparowaną od właściwej synapsy rezystancją Ra. Część
presynaptyczna podzielona jest na 2 obszary: graniczny pomiędzy aksonem i kolbą
synaptyczną (Gi1, Ei1, Cm1) oraz reprezentujący błonę presynaptyczną (Gi2, Ei2, Cm2). Oba
obszary części presynaptycznej zawierają napięciowo zależne kanały jonowe
o charakterystycznych przewodnościach Gi i potencjałach spoczynkowych Ei. Indeks „i”
oznacza jony Na, K, Ca. W stanie spoczynkowym potencjał transbłonowy oraz pojemność
błony w obszarze przestrzeni synaptycznej różni się od potencjału i pojemności błony
komórkowej aksonu. Część postsynaptyczną można przedstawić jako fragment błony
komórkowej o całkowitej pojemności Cm3 wraz z przewodnością kanałów jonowych GS.
Zarówno błona presynaptyczna, jak i postsynaptyczna reprezentują pewien układ
równoległego połączenia rezystancji R i pojemności C, który charakteryzuje się wielkością
zwaną stałą czasową
.
20
1.3. Budowa mózgu myszy ze szczególnym uwzględnieniem hipokampa.
W części badawczej niniejszej rozprawy (rozdziały 4. i 5.) zaprezentowane zostały
metody oraz wyniki analizy połączeń funkcjonalnych wycinka mózgu mysz. Z tego
względu celowe jest omówienie budowy mózgu tego zwierzęcia, ze szczególnym
zwróceniem uwagi na budowę hipokampa.
Budowa anatomiczna i histologiczna hipokampa, struktura jego połączeń z innymi
częściami mózgu jest obecnie bardzo dobrze poznana [10]. Również preferowane kierunki
przesyłania potencjałów czynnościowych pomiędzy poszczególnymi obszarami zostały
szczegółowo zbadane dzięki eksperymentom z użyciem elektrod wkłuwanych. To czyni
hipokamp szczególnie interesującym obiektem ze względu na możliwość odniesienia
wyników z eksperymentów z użyciem matrycy mikroelektrod, pozwalających na
rejestrację aktywności dziesiątek, a nawet setek neuronów, do jego budowy anatomicznej.
Hipokamp stanowi też dobry punkt startowy dla badań tej struktury pod kątem
poszukiwania połączeń funkcjonalnych pomiędzy pojedynczymi neuronami, dzięki
znajomości
kierunków
przesyłania
potencjałów
czynnościowych
pomiędzy
poszczególnymi jego strukturami anatomicznymi. W badaniach połączeń funkcjonalnych
mózgu używany był szczep wsobny myszy o zabarwieniu czarnym C57bl/6 (ang. Black 6).
1.3.1. Budowa mózgu myszy
Schematyczny obraz mózgu myszy przedstawiony został na Rysunku 1-8. Ponieważ
badaniu aktywności elektrycznej poddawane były tylko hipokamp oraz kora mózgowa,
szczegółowe omówienie wszystkich elementów mózgu wykraczałoby poza ramy tej pracy.
Rysunek 1-8: Schemat mózgu myszy z przekrojem kory dla uwidocznienia położenia hipokampa
[10].
Hipokamp jest strukturą parzystą (występującą w lewej i w prawej półkuli)
stanowi część systemu limbicznego. Umiejscowiony jest pod korą mózgową i ma kształt
przypominający „rogal” (u człowieka kształt porównywany jest do konika morskiego).
W przekroju, hipokamp jest łatwo rozróżnialną strukturą zarówno na poziomie
obserwacji mikroskopowej wycinka, jak również obrazu histologicznego. Hipokamp ma
bardzo wyraźną, warstwową strukturę. Ciała neuronów oraz obszary połączeń
synaptycznych zorganizowane są w odrębnych warstwach. Hipokamp jest elementem
grupy struktur należących do układu limbicznego zwaną formacją hipokampa, na którą
składają się: zakręt zębaty (DG – Dentate Gyrus), hipokamp, podpora (Subiculum),
przedpodpora (Presubiculum), przypodpora (Parasubiculum), kora (stara) węchowa
(Entorhinal Cortex). Zakręt zębaty, hipokamp i podpora posiadają jedną warstwę
21
neuronów oraz ubogą w neurony lub bezkomórkową warstwę poniżej oraz powyżej
warstwy neuronów. Pozostałe elementy formacji hipokampa zbudowane są z kilku
warstw komórek.
1.3.2. Hipokamp – budowa morfologiczna i występujące w nim typy
neuronów
Rysunek 1-9 przedstawia przekrój poprzeczny hipokampa. Ciała komórek
nerwowych zabarwione zostały na czarno. Obszary niezabarwione zawierają dendryty
neuronów tworzących hipokamp oraz aksony wchodzące oraz wychodzące z omawianego
obszaru. Hipokamp dzieli się na trzy sekcje: CA1, CA2 i CA3. Budowa histologiczna
hipokampa ma charakter warstwowy. Wyróżnia się 3 warstwy; pierwsza tworzona przez
dendryty komórek piramidalnych zwana jest warstwą początkową (o – stratum oriens).
Drugą jest warstwa komórek piramidalnych (p – pyramidal cell layer), w której
zlokalizowane są ciała komórek piramidalnych. Ostatnią, trzecią, jest warstwa promienista
(r – stratum radiatum), w której znajdują się dendryty wierzchołkowe komórek
piramidalnych. Na Rysunku 1-9 zaznaczone zostały również podpora wzgórka
(S - subiculum), przedpodpora (PrS – Presubiculum), kora (stara) węchowa
(EC - Entorhinal Cortex). Głównym szlakiem włókien nerwowych jest strzępek hipokampa
(f – fimbria). Wiązka kątowa (ab – angular bundle) to obszar włókien nerwowych
perforujących, w którym włókna biegną od kory węchowej do różnych obszarów
hipokampa.
W obszarze zakrętu zębatego najważniejsze (i najgęściej występujące) są komórki
ziarniste, natomiast w obszarze hipokampa występują głównie neurony piramidalne.
Warstwa komórek piramidalnych podzielona została ze względu na rozmiary
i występowanie tego rodzaju komórek (CA1, CA2, CA3). Komórki ziarniste mają małe,
okrągłe ciała o średnicy ok. 10μm. W przekroju poprzecznym hipokampa zorganizowane
są po 4-6 ciał komórek w warstwie „g” (Rysunek 1-9). Dendryty komórek ziarnistych
ułożone są poprzecznie w stosunku do warstwy komórek „g”, swoje zakończenia mają
w warstwie molekularnej „m”, skąd odbierają impulsy nerwowe pochodzące z różnych
źródeł. Ponieważ dendryty komórek ziarnistych wyrastają tylko w kierunku od warstwy
„g” do „m”, komórki ziarniste uważane są za neurony jednokierunkowe. Aksony tych
komórek wyrastają w kierunku warstwy komórek polimorficznych. Komórki
polimorficzne, jak sama nazwa wskazuje, są komórkami różnych typów, ale impulsy
nerwowe przesyłają tylko do innych części zakrętu zębatego. Włókna mszyste (ang. mossy
fibers), czyli aksony komórek mszystych wychodzą z warstwy komórek polimorficznych
i łączą się z obszarem CA3. Rozłożenie przestrzenne dendrytów przedstawione zostało na
Rysunku 1-10.
22
Rysunek 1-9: Przekrój poprzeczny hipokampu myszy ukazujący warstwowe ułożenie komórek
(strona wewnętrzna z lewej, zewnętrzna z prawej, góra obrazka – kierunek „na
zewnątrz” czaszki). m – warstwa molekularna, g – komórki ziarniste , pl – komórki
polimorficzne, p – warstwa komórek piramidalnych, f – strzępek hipokampa, ab – wiązka
kątowa [18].
W warstwie komórek piramidalnych znaleźć można od 3 do 6 ciał komórek mszystych.
Neurony te wykształciły drzewa dendrytów prostopadłe do warstwy komórek w obu
kierunkach, stąd zwane są też komórkami dwukierunkowymi. Dendryty wyrastające ze
szczytów komórek są dłuższe niż wyrastające z podstaw komórek – szczyty skierowane są
w kierunku „do wewnątrz” hipokampu.
Rysunek 1-10: Rycina ukazująca kształt i ilość kluczowych neuronów w zakręcie zębatym (DG)
i hipokampie (CA3, CA1). Liczby oznaczają całkowitą długość dendrytów komórek
ziarnistych (w obszarze DG) oraz częściowe długości drzew dendrytów w poszczególnych
obszarach hipokampu. Wymiary podane w μm. [10].
Obszar CA1 odróżnia się od CA3 brakiem połączeń synaptycznych ze strony komórek
mszystych (z obszaru „pl”), w obszarze CA3 ciała komórek piramidalnych są większe niż
w CA1. Istnieje pewien wąski obszar pomiędzy CA1 i CA3, nazywany CA2, w którym
podobnie jak w CA1 nie występują połączenia z obszarem „pl”, ale rozmiary ciała
23
neuronów piramidalnych są stosunkowo duże (jak w CA3) [19]. Ze względu na fakt, że
obszar CA2 jest trudny do rozpoznania w obserwacji mikroskopem optycznym, jego
oznaczenie jest najczęściej pomijane.
Oprócz neuronów piramidalnych oraz ziarnistych ważną rolę pełnią też interneurony neurony pośredniczące (z ang. inteneurons). Interneuronami nazywa się neurony
o ograniczonym (lokalnym) zasięgu aksonów.
1.3.3. Interneurony i ich rola w działaniu hipokampa
W obrębie hipokampa wyróżnia się wiele podtypów interneuronów, jednak wszystkie
cechuje okrągłe ciało komórki, lokalny zasięg przesyłania sygnałów oraz transmisja
synaptyczna, w której przekaźnikiem chemicznym jest kwas gamma aminomasłowy
(GABA): interneurony są zatem komórkami o działaniu hamującym [20]. W zakręcie
hipokampa najczęściej występującym typem jest neuron piramidalny-koszyczkowy, ciała
tych neuronów zlokalizowane są na granicy warstwy komórek ziarnistych i warstwy
komórek polimorficznych. Aksony tych komórek unerwiają ciała komórek ziarnistych.
Wyróżnić można co najmniej 5 rodzajów interneuronów koszyczkowych.
Do interneuronów zaliczamy również neurony mszyste – w odróżnieniu od pozostałych,
są to neurony pobudzające. Ich aksony rozciągają się na długie odległości od warstwy
polimorficznej we wszystkich kierunkach hipokampa. Ze względu na sposób połączenia
synaptycznego z komórkami piramidalnymi można wyróżnić 3 klasy interneuronów [10]:
 Akso-aksonalny – synapsy jego aksonów zlokalizowane są w początkowych
odcinkach aksonów innych neuronów (głównie komórek piramidalnych).
 Neurony koszyczkowe – ich synapsy połączone są z ciałami komórek
piramidalnych. Zakończenia aksonów posiadają wiele synaps, które tworzą
„koszyczek” wokół ciała komórki piramidalnej.
 Neurony dwuwarstwowe – aksony tych komórek łączą się synaptycznie
z dendrytami komórek piramidalnych. Połączenia synaptyczne występują zarówno
na dendrytach od strony zewnętrznej, jak i wewnętrznej hipokampa.
W kolejnych rozdziałach przedstawiona zostanie analiza aktywności komórek
nerwowych hipokampa pozwalająca na zlokalizowanie interneuronów, jednak wskazanie
poszczególnych podtypów nie będzie możliwe. Z tego względu bardziej szczegółowy ich
podział nie zostanie przedstawiony.
W hipokampie interneurony stanowią tylko 10% populacji wszystkich komórek, co
może sugerować, że nie pełnią one znaczącej roli w działaniu sieci neuronowej.
W praktyce nie jest to prawdą. Na podstawie obserwacji mikroskopowych wiadomo, że
pojedyncza komórka piramidalna łączy się z 100 interneuronami, natomiast każdy
interneuron łączy się aż z 1000-3000 komórek piramidalnych. Komórki piramidalne
i ziarniste mają charakter pobudzający, natomiast interneurony hamujący. Wypływa stąd
wniosek, że pełnią one funkcję stabilizującą, komunikacyjną oraz ujemnego sprzężenia
zwrotnego. Hamowanie aktywności nerwowej poprzez ujemne sprzężenie zwrotne
odbywać się może szybciej niż trwa okres refrakcji komórek wzbudzających. Interneurony
wydają się też odgrywać krytyczną rolę we wzbudzaniu i utrzymywaniu oscylacji sieci
neuronowej w zakresie fal theta (10Hz), gamma (40-100Hz) i ultrawysokich
częstotliwości (200Hz) [20]. Rola interneuronów jako neuronów o działaniu hamującym w
utrzymywaniu oscylacji będzie w dalszej części pracy tematem szerszej dyskusji opartej
na wynikach zebranych przez autora rozprawy.
24
1.3.4. Budowa hipokampa a połączenia funkcjonalne z innymi obszarami
mózgu
Jeśli hipokamp potraktować jako sieć neuronową podzieloną na fragmenty zgodnie
z budową morfologiczną, można określić „preferowany” kierunek przewodzenia
nerwowego od jednego obszaru do drugiego. Schemat omawianych połączeń,
zaproponowany przez Andersena [21], przedstawiony został na Rysunku 1-11.
Dla przejrzystości, kora węchowa rozważana jest jako punkt startowy ze względu na
to, iż większość informacji „zmysłowych” ze świata zewnętrznego docierająca do
hipokampa przepływa właśnie przez korę węchową (starą). Impulsy nerwowe od
narządów zmysłów docierają do hipokampa poprzez dwa równoległe szlaki:
 korę przynosową (z ang. perirhinal cortex)
 korę zanosową (z ang. postrhinal cortex)
Te obszary mózgu uwalniają do kory węchowej informację wyższego rzędu, czyli
łączącą impulsy odbierane przez wiele zmysłów. Sygnały przesyłane do kory węchowej
mają charakter pobudzający [22]. Neurony zlokalizowane w II warstwie kory węchowej
przesyłają impulsy poprzez aksony perforujące (przechodzące bez połączeń
synaptycznych) przez podporę (S) i kończące się w zakręcie zębatym oraz obszarze CA3
hipokampa. Neurony zlokalizowane w warstwie III kory węchowej nie posiadają połączeń
Rysunek 1-11: Diagram połączeń formacji hipokampu mózgu oraz wybranych struktur kory
mózgowej rodziny myszowatych. Ukazane zostały równoległe i szeregowe szlaki
transmisji impulsów nerwowych. RSP Ctx – retrospinal cortex, Par/Oc Ctx. –
parietal/occipal cortices, pozostałe oznaczenia jak na Rysunku 1-9. [21].
synaptycznych z zakrętem zębatym ani obszarem CA3, występuje natomiast aktywność od
warstwy III do obszaru CA1 i podpory. Transfer impulsów (informacji) nie odbywa się
warstwowo, lecz zgodnie z podziałem morfologicznym. Zakręt hipokampa (DG) daje
początek komórkom mszystym, które poprzez aksony przesyłają impulsy nerwowe do
dendrytów komórek piramidalnych obszaru CA3. Komórki ziarniste zakrętu hipokampa
łączą się synaptycznie z neuronami warstwy polimorficznej – neuronami mszystymi, które
są połączone z innymi warstwami zakrętu zębatego. Komórki piramidalne obszaru CA3
przesyłają impulsy do pozostałych warstw w CA3 oraz do obszaru CA1. Komórki
piramidalne z obszaru CA1 mogą wzbudzać obszar podpory i głębokie warstwy kory
węchowej. Również neurony podpory mogą wzbudzać głębokie warstwy kory węchowej.
Głębokie warstwy kory węchowej mogą przesyłać impulsy w drugą stronę – do obszarów
25
kory, z których może pochodzić pierwotne pobudzenie. W ten sposób, informacja
wpływająca do kory węchowej z innego fragmentu kory może przepłynąć cały obszar
hipokampa przez wyżej opisane szlaki i ostatecznie wrócić do obszaru kory, z którego
pochodziła.
Przedstawiona w niniejszym podrozdziale jednokierunkowa transmisja impulsów
znana z eksperymentów wykonywanych techniką elektrod wkłuwanych będzie stanowić
referencję dla badań kierunku połączeń synaptycznych przedstawionych w rozdziale 4,
wykonywanych przy użyciu matrycy mikroelektrod.
1.4. Obrazowanie elektrofizjologiczne, pole potencjału wokół komórki
nerwowej.
Rejestracja zewnątrzkomórkowa potencjału czynnościowego stanowi współcześnie
jedną z podstawowych metod w badaniach aktywności elektrycznej żywego mózgu.
Zarejestrowane zmiany napięcia zewnątrzkomórkowego pozwalają na określenie, czy
w komórce wystąpił potencjał czynnościowy. Jeśli wartość napięcia przekroczyła pewien
próg, oznacza to wystąpienie potencjału czynnościowego. Zakłada się przy tym, że kształt
zarejestrowanego potencjału nie niesie ze sobą żadnej informacji. W przypadku
pojedynczego potencjału czynnościowego założenie to jest słuszne ze względu na niski
stosunek sygnału do szumu dla aparatury używanej podczas rejestracji. Uśrednienie wielu
zarejestrowanych przebiegów napięcia pozwala znacząco zredukować wpływ szumu na
zarejestrowany kształt. Jeśli rejestracja napięcia odbywa się z wystarczająco wysoką
rozdzielczością czasową (poniżej 1ms, np. 50us.), uśrednione przebiegi napięcia pozwalają
wyciągać wnioski na temat własności badanego neuronu. Charakterystyczne cechy
zarejestrowanego potencjału mogą być wykorzystane do rozróżniania różnych klas
neuronów [23] a także separowania poszczególnych neuronów należących do jednej klasy
[24]. Istnieje niewiele źródeł literaturowych, w których autorzy próbowali przypisać
znaczenie biologiczne kształtom uśrednionych przebiegów napięcia zarejestrowanego za
pomocą elektrod zewnątrzkomórkowych. Jedną z najciekawszych prac jest [5], w której
autorzy pokazali zgodność wyników eksperymentalnych z modelowaniem
komputerowym opartym o model Hodgkina-Huxley’a. Zapis aktywności elektrycznej
neuronów, uzyskany za pomocą 512-elektrodowego systemu do rejestracji potencjałów
zewnątrzkomórkowych (omówionego w rozdziale 2), umożliwia uzyskiwanie obrazów
elektrofizjologicznych, których precyzja pozwala na użycie ich w procesie rozróżniania
typów komórek nerwowych. Obrazy elektrofizjologiczne używane są również w procesie
usuwania duplikatów zidentyfikowanych neuronów (rozdział 4.2).
W
rejestracji
potencjałów
czynnościowych
za
pomocą
elektrod
zewnątrzkomórkowych istotne jest zrozumienie, jakie zjawiska zachodzą na drodze od
błony komórkowej do elektrody. Płyn zewnątrzkomórkowy otaczający neurony można
przybliżyć jako środowisko homogeniczne, w którym efekty pojemnościowe mogą zostać
pominięte w zakresie częstotliwości 1-3000Hz. Można zatem opisać środowisko
zewnątrzkomórkowe używając tylko przewodności omowej [25], a potencjał
w przestrzeni zewnątrzkomórkowej wyrazić równaniem Laplace’a:
(1-1)
gdzie oznacza potencjał zewnątrzkomórkowy.
Przyjmując granicę rozwiązania powyższego równania jako
26
( ⁄ )
(1-2)
gdzie Јm jest gęstością prądu transbłonowego a
jest rezystywnością ośrodka
otaczającego komórkę, dla źródła punktowego prądu o amplitudzie І w nieograniczonej
objętości, rozwiązanie równania (1-1) wynika wprost z prawa Coulomba:
⁄(
)
(1-3)
gdzie І to prąd ze źródła punktowego, r – odległość od źródła do miejsca pomiaru.
W rzeczywistych neuronach źródła prądu rozłożone są wzdłuż aksonu (dendrytu)
o kształcie zbliżonym do cylindra o wysokim stosunku długości do średnicy. Można
obliczyć superpozycję wielu źródeł, jednak w praktyce używa się przybliżenia źródła
liniowego (z ang. Line Source Approximation) [26]. Zakładając liniowy rozkład prądu
wzdłuż aksonu, równanie potencjału we współrzędnych sferycznych ma postać:
(
)
( ⁄
)∫
( ⁄
(
√
)
)
|[√
] ⁄[ √
gdzie r to promień, h – odległość od końca aksonu,
aksonu.
(1-4)
]|
to odległość od początku
Przybliżenie źródła liniowego jest poprawne poza obszarem bardzo blisko aksonu.
W przypadku eksperymentów z rejestracją zewnątrzkomórkową warunek ten jest
zazwyczaj spełniony, gdyż odległość elektrody od neuronu wynosi typowo co najmniej
kilkadziesiąt mikrometrów.
Model źródła liniowego zakłada, że płyn zewnątrzkomórkowy jest homogeniczny.
Jednak dokładne pomiary przedstawione w [27] wskazują, że w obszarze CA1 warstwa
komórek piramidalnych ma rezystancję dwukrotnie większą niż otaczające warstwa
promienista i warstwa początkowa (oporność właściwa odpowiednio
= 640, 260,
290 Ωcm). Co więcej, rezystywność może wzrosnąć o 50% w okresie wysokiej aktywności
neuronów. Dla rzeczywistego odwzorowania dynamicznych zmian napięcia w poprzek
błony komórkowej, modele symulacyjne bazujące na modelu Hodgkin-Huxley’a
uwzględniają kilkanaście rodzajów napięciowo-zależnych kanałów jonowych
transportujących jony Na+, K+, Ca2+. Kanały transportujące poszczególne jony dzielą się na
podklasy, które występują z różnym zagęszczeniem w różnych częściach neuronu.
Nierównomierny rozkład przestrzenny kanałów jonowych danego typu powoduje różnice
kształtów przebiegów napięć zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych w zależności od ich
lokalnego zagęszczenia.
27
2. SYSTEMY
DO
REJESTRACJI
AKTYWNOŚCI
ELEKTRYCZNEJ
KULTUR
NEURONOWYCH
WYKORZYSTUJĄCE MATRYCE MIKROELEKTROD
W tym rozdziale opisane zostaną systemy do rejestracji aktywności elektrycznej
kultur neuronowych oraz podstawy rejestracji napięć błonowych z użyciem elektrod
zewnątrzkomórkowych. Jako przykład posłuży system zbudowany w oparciu o układy
scalone zaprojektowane w Zakładzie Elektroniki Jądrowej Wydziału Fizyki i Informatyki
Stosowanej AGH w Krakowie (Obecnie Katedra Oddziaływań i Detekcji Cząstek). System
ten używany jest od 2008 roku przez grupę neurobiologów w Instytucie Fizyki Cząstek
Uniwersytetu Kalifornijskiego w Santa Cruz oraz Instytucie Salka w La Jola, Kalifornia, USA
do badań siatkówki oka, wycinków mózgu myszy bezpośrednio po ekstrakcji (ang. Accute
Slices), jak również po hodowli w inkubatorach (ang. Cultured Slices). Celem badań jest
rozwijanie technik rejestracji, preparatyki tkanek oraz poszukiwanie powtarzalnych
wzorców połączeń (ang. connectivity patterns) między neuronami. Oprócz układów
scalonych do odczytu aktywności i stymulacji elektrycznej neuronów, aby rejestracja była
możliwa, potrzebny jest interfejs pomiędzy elektroniką i komórkami nerwowymi. Tą rolę
pełnią różnego rodzaju matryce mikroelektrod i mikroigieł. W obecnie stosowanym
systemie jest to matryca 512 płaskich elektrod. Omówiona zostanie budowa, możliwości
oraz ograniczenia w. w. systemu a także specyfikacja, jaką powinien spełniać nowy,
obecnie rozwijany układ scalony, który zastąpić ma obecnie stosowane układy. Powinien
on posiadać rozszerzoną funkcjonalność, przede wszystkim poprzez poszerzenie pasma
częstotliwości, w której możliwa jest rejestracja oraz zwiększenie rozdzielczości
przetwornika cyfrowo-analogowego wykorzystywanego do generowania prądów (napięć)
stymulacyjnych. Przedstawiona zostanie dyskusja wymagań projektowych dla
poszczególnych modułów funkcjonalnych, których wykonane przez autora rozprawy
projekty i testy zostały przedstawione w rozdziale 3.
2.1. Rola matryc mikroelektrod w rejestracji aktywności komórek nerwowych.
Rejestracja wewnątrz i zewnątrzkomórkowa
Większość podręczników na temat neurobiologii opisuje przebiegi napięć na błonach
komórkowych neuronów z perspektywy rejestracji za pomocą elektrod
wewnątrzkomórkowych. Technika wkłuwania elektrod do wnętrza komórki (patch clamp)
stanowiła przez wiele dziesięcioleci podstawową metodę rejestracji aktywności
neuronów. Naukowcy zdawali sobie sprawę z konieczności rejestracji potencjałów z wielu
komórek, jednak główne ograniczenie stanowił brak elektroniki umożliwiającej
wzmacnianie oraz rejestrację sygnału pochodzącego z wielu źródeł jednocześnie. Jedyną
możliwością realizacji tego celu było używanie wielu elektrod szklanych wkłuwanych
w połączone ze sobą neurony i rejestracja za pomocą pojedynczych wzmacniaczy.
Konieczność zastosowania pomocniczego sprzętu pozycjonującego sprawia, że liczba
elektrod wkłuwanych stosowanych w eksperymencie jest bardzo ograniczona i zwykle nie
przekracza kilkunastu. Alternatywą jest rejestracja zewnątrzkomórkowa za pomocą tego
samego typu elektrod szklanych. Pozwala to jednak tylko na nieznaczny wzrost liczby
elektrod, wymuszając rejestrację potencjałów o niższych amplitudach.
Matrycy elektrod zewnątrzkomórkowych wytworzonej z niklu i złota na podłożu
szklanym po raz pierwszy użyto w 1972 roku [28]. Następnym etapem była matryca 16
elektrod na podłożu szklanym wykorzystująca napylane ścieżki tytanowe pokryte złotem
jako materiał przewodzący. Przełomem było wytworzenie metodą fotolitografii, matrycy
28
na podłożu krzemowym ze ścieżkami z tlenku indu i cyny [29]. Mikrofotografia
współcześnie stosowanej matrycy płaskiej 512 mikroelektrod o wysokiej gęstości
przedstawiona została na Rysunku 2-1. Matryca ta jest częścią systemu używanego przez
autora rozprawy do rejestracji aktywności wycinków mózgu myszy, których analiza
zostanie przedstawiona w Rozdziale 4.
Rysunek 2-1: Mikrofotografia matrycy 512 mikroelektrod o wymiarach ~1mm x 2mm, odległości
pomiędzy elektrodami wynoszą 60μm.
Elektroda zewnątrzkomórkowa może służyć do rejestracji zmian potencjałów
błonowych zarówno przyłożona bezpośrednio do ciała komórki (aksonu, dendrytu), jak
również znajdując się w pewnej odległości od niego. Jeżeli elektroda znajduje się
w odległości porównywalnej lub większej od rozmiarów komórki, mówimy o rejestracji
napięcia w polu dalekim. Źródło sygnału można wówczas utożsamić ze źródłem
punktowym znajdującym się wewnątrz komórki (patrz rozdział 1.4). Schemat zastępczy
interfejsu błony komórkowej z mikroelektrodą oraz elektroniką odczytu przedstawiony
został na Rysunku 2-2.
Rysunek 2-2: Schemat zastępczy dla wyznaczenia parametrów sygnału rejestrowanego przez
mikroelektrodę zewnątrzkomórkową: Ub – napięcie błonowe, Cm, Gm, - pojemność
i przewodność błony komórkowej, R1 – wartość rezystancji roztworu między komórką
a powierzchnią półsfery o promieniu równym odległości komórka-elektroda, R2 –
wartość rezystancji roztworu między powierzchnią półsfery a elektrodą referencyjną, Z el
-impedancja elektrody, Cwej, Rwej – pojemność i rezystancja wejściowa wzmacniacza.
Sygnał rejestrowany przez mikroelektrodę można przedstawić jako sygnał
pochodzący od źródła napięciowego Ub znajdującego się wewnątrz komórki. Elektryczne
własności błony komórkowej reprezentują dwa elementy: całkowita pojemność błony
komórkowej Cm oraz zmienna w czasie przewodność jonowa Gm. Wartość Cm w przypadku
komórek hipokampa myszy oszacować można na 100pF [30]. Przyjmując jednorodność
medium, w którym rozpływa się ładunek, można założyć, że ładunek ze źródła Ub
rozchodzi się równomiernie we wszystkich kierunkach. Wokół źródła napięcia pole
potencjału przyjmuje postać, w której powierzchnie ekwipotencjalne mają kształt
sferyczny. Niech r oznacza promień sfery równy odległości między źródłem potencjału Ub
i powierzchnią elektrody detekcyjnej - wówczas oporności R1 i R2 oznaczają rezystancje
płynu zewnątrzkomórkowego wewnątrz i na zewnątrz sfery o promieniu r. Potencjał
rejestrowany na elektrodzie jest równy spadkowi napięcia na rezystorze R2, przy
29
założeniu, że impedancja wejściowa wzmacniacza jest duża i przepływ prądu przez nią
jest pomijalnie mały. Wartość stałej czasowej błony komórkowej waha się w granicach
10-200ms – jest to wartość duża w odniesieniu do szybkości zmian napięcia błonowego
w okresie szybkiej depolaryzacji (200 mV/ms). W części reprezentującej błonę
komórkową element pojemnościowy jest dominujący - model elektryczny błony
wystarczy przedstawić za pomocą samej pojemności Cm, z pominięciem przewodności Gm.
Ostatecznie, impuls pochodzący ze źródła Ub zostaje przefiltrowany przez filtr
górnoprzepustowy (układ różniczkujący) o stałej czasowej:
(
)
2-1
Stała czasowa τ w praktyce przyjmuje wartości poniżej 6.4 µs [31]. Stąd wniosek, że
sygnał rejestrowany na elektrodzie zewnątrzkomórkowej będzie pierwszą pochodną
zmian napięcia błony komórkowej. Rejestrowane przebiegi napięcia na elektrodzie
zewnątrzkomórkowej dobrze pokrywają się z pierwszą pochodną napięcia
zarejestrowanego metodą pomiaru wewnątrzkomórkowego (Rysunek 2-3). Potencjał
czynnościowy rejestrowany elektrodami zewnątrzkomórkowymi posiadał będzie fazę
spadku napięcia, mimo wzrostu napięcia wewnątrz komórki.
Rysunek 2-3: Porównanie kształtów impulsu zarejestrowanego elektrodą wewnątrzkomórkową
(intra) i zewnątrzkomórkową (extra). 1st deriv(intra) - pierwsza pochodna sygnału
zarejestrowanego elektrodą wewnątrzkomórkową [32].
2.2. Sondy elektrodowe i mikroigły - najnowsze metody rejestracji potencjałów
zewnątrzkomórkowych
Oprócz płaskich matryc mikroelektrod coraz większą popularność, szczególnie
w badaniach in-vivo, zdobywają matryce mikroigieł [33](ang. Bed of nails) wkłuwane
w badaną tkankę jak również sondy mikroelektrodowe [34]. Przykładowa matryca
mikroigieł przedstawiona została na Rysunku 2-4. Tylko końcówki igieł mają własności
przewodzące, część igły aż do podstawy jest nieprzewodząca. W eksperymentach
z użyciem wycinków mózgu, matryca mikroigieł wkłuta „do wnętrza” tkanki pozwala na
rejestrację sygnałów z obszaru oddalonego od powierzchni cięcia, a więc nie narażonego
na zniszczenia naturalnej struktury połączeń neuronów. Umiejscowienie geometryczne
obszaru czynnego (końcówka igły) umożliwia rejestrację sygnałów dochodzących
z pełnego kąta bryłowego, a nie z połowy jak w przypadku matrycy płaskiej.
30
Rysunek 2-4: Matryca mikroigieł do rejestracji aktywności elektrycznej neuronów [33].
Sondy mikroelektrodowe mają podobne zalety co mikroigły w porównaniu do matryc
płaskich. Przykład płaskiej krzemowej sondy mikroelektrodowej przedstawiony został na
Rysunku 2-5A. Duży postęp w stosunku do matryc płaskich i mikroigieł stanowi
możliwość składania sond w zestawy i rejestracja aktywności elektrycznej za pomocą
określonej liczby elektrod rozłożonych w trzech wymiarach. Zwiększa to również objętość,
z której mogą być rejestrowane potencjały czynnościowe. Przykład zestawu 16 płaskich
sond mikroelektrod (112 elektrod każda) umieszczonych na płytce drukowanej
przedstawia Rysunek 2-5 B.
Mikroelektrodom w postaci płaskiej lub trójwymiarowej musi oczywiście towarzyszyć
elektronika odczytu. Przez lata rozwijania systemów, konstruktorzy wypracowali pewien
uniwersalny schemat elektroniki odczytu. Każdy kanał składa się z przedwzmacniacza,
filtrów pasmowo przepustowych oraz wyjściowego stopnia wzmacniającego. Sygnały
wyjściowe z kanałów są próbkowane z określoną częstotliwością i multipleksowane,
następnie przetwarzane na postać cyfrową. Systemy do rejestracji aktywności mózgu
wolno biegających zwierząt, wyposażane muszą być w systemy komunikacji
bezprzewodowej do transmisji rejestrowanych danych oraz odbierania komend
sterujących parametrami pracy układów elektronicznych [35].
A)
B)
Rysunek 2-5: A) sonda mikroelektrodowa wykonana w technologii CMOS wraz z systemem
odczytu [34] B) Fotografia trójwymiarowej macierzy sond. Każda sonda zawiera
112 niezależnych elektrod (w sumie 1792 elektrody) [34].
31
2.3. Budowa systemu 512-elektrodowego
elektrycznej żywych sieci neuronowych
do
rejestracji
aktywności
Prezentowany system, zaprojektowany w Katedrze Oddziaływań i Detekcji Cząstek we
współpracy z Instytutem Fizyki Cząstek w Santa Cruz posiada 512 kanałów
przeznaczonych do rejestracji oraz stymulacji elektrycznej aktywności komórek
nerwowych. Schemat blokowy systemu przedstawiony został na Rysunku 2-6.
Rysunek 2-6: Schemat blokowy 512-elektrodowego systemu do rejestracji aktywności komórek
nerwowych.
Rejestracja i stymulacja odbywa się za pośrednictwem 512-elektrodowej matrycy
mikroelektrod [36], która stanowi interfejs pomiędzy elektroniką stymulacji i odczytu
a fragmentem żywej tkanki. Rejestrowane napięcia są wzmacniane i filtrowane przez
układ scalony Neuroplat [37] [38]. Stymulacja elektryczna możliwa jest dzięki układowi
scalonemu Stimchip [39]. Rejestrowane napięcia zapisywane są w postaci cyfrowej na
dyskach twardych. Konwersja z sygnału analogowego na cyfrowy odbywa się za pomocą
dwóch kart z przetwornikami analogowo-cyfrowymi (National Instruments®). Trzecia
karta, posiadająca interfejs do dwukierunkowej komunikacji cyfrowej, używana jest do
sterowania pracą układów scalonych. Sygnały z 64 elektrod odczytywane są za pomocą
jednego 64-kanałowego układu scalonego, multipleksowane (aby zminimalizować liczbę
wyjściowych sygnałów analogowych) i w postaci analogowej wysyłane do pojedynczego
kanału w karcie z przetwornikami analogowo-cyfrowymi. Fotografia płytki drukowanej
przedstawiona została na Rysunku 2-7. Matryca zastosowana w omawianym systemie
zawiera 512 mikroelektrod rozmieszczonych w sposób heksagonalny (jest to matryca
przedstawiona na Rysunku 2-1). Odległość między elektrodami wynosi 60μm, średnica
elektrod wynosi 5μm.
Przed zastosowaniem w eksperymencie, elektrody są pokrywane platyną
w procesie galwanizacji, na przykład przy użyciu związku H 2PtCl6 w 0,025%
roztworze wodnym azotanu ołowiu [40]. Komorę wypełnia się roztworem zawierającym
platynę, ze źródła prądowego w układzie Neuroplat wymusza się przepływ prądu,
co powoduje osadzanie platyny na powierzchni elektrod. Typowo platynizacja trwa 15
sekund z użyciem prądu 80nA. Po platynizacji, przed umieszczeniem tkanki na matrycy,
komorę kilkukrotnie przepłukuje się wodą destylowaną w celu oczyszczenia jej. Matryce
tego typu były już z powodzeniem używane do rejestracji aktywności nerwowej siatkówki
[41] [42] oraz hodowanych kultur komórek nerwowych [43].
32
Komora z matrycą elektrod
Stimchip
Neuroplat
Rysunek 2-7: Fotografia płytki drukowanej – komora z matrycą mikroelektrod, osiem par
układów Stimchip i Neuroplat.
Układ scalony Stimchip zawiera 64 niezależne kanały stymulacyjne, układy generujące
napięcia polaryzujące oraz blok logiki ustawiający wartości przetworników DAC na
podstawie komend wysyłanych z komputera. Każdy kanał zawiera programowany
generator przebiegów prądowych o zadanym kształcie, konwerter prądowo – napięciowy
oraz układ redukcji artefaktów. Generator przebiegów prądowych składa się
z przetwornika cyfrowo-analogowego i bufora wyjściowego pozwalającego na wybranie
1 z 8 zakresów prądu, jaki ma być generowany, gdzie najniższy zakres wynosi
od 0 do 60nA, najwyższy – od 0 do 1mA. W badaniach prowadzonych na potrzeby
niniejszej pracy doktorskiej funkcjonalność układu Stimchip nie była wykorzystywana.
Dokładniejszy jego opis można znaleźć w [39].
Rysunek 2-8: Schemat blokowy układu scalonego Neuroplat. BIAS/CONTROL BLOCK – blok
układów polaryzacyjnych oraz logiki cyfrowej sterujące wszystkimi kanałami
i multiplekserem, EXT_CTR – zewnętrzne sygnały sterujące.
Schemat blokowy układu scalonego „Neuroplat” przedstawiony został na
Rysunku 2-8. Układ scalony Neuroplat zawiera 64 niezależne kanały odczytu napięcia
(CH0 – CH63), multiplekser analogowy, blok logiki kontrolnej i układów polaryzujących
(BIAS/CONTROL BLOCK) oraz bufor wyjściowy (OUTPUT BUFFER). Każdy kanał
rejestruje niezależnie napięcie z jednej elektrody względem napięcia elektrody
referencyjnej, która podczas eksperymentu zanurzona jest w roztworze. Działanie
i parametry pracy układu kontrolowane są poprzez dekoder komend, odbierający
33
komendy w postaci sygnałów cyfrowych. Dekoder komend pozwala ustawić parametry
pracy takie jak: częstotliwości graniczne filtrów lub wzmocnienie. Multiplekser analogowy
zawiera 64 komórki pamięci analogowej, co pozwala na zapamiętanie równocześnie
napięć na wyjściach wszystkich kanałów, a następnie ich odczyt. W istniejącym systemie
okres próbkowania wynosi 50 μs (co odpowiada częstotliwości 20 kHz). Napięcia na
wyjściach wszystkich kanałów zapamiętywane są równocześnie w fazie próbkowania,
która trwa 1 μs. Odczyt zapamiętanych w komórkach pamięci analogowej napięć polega na
cyklicznym łączeniu ich wyjść, jedno po drugim, z linią wyjściową multiplexera – czas
odczytu jednej komórki wynosi 195 ns (częstotliwość multiplexowania 5.12 MHz). Dzięki
multipleksowaniu możliwe jest ograniczenie liczby wyjść analogowych z 64 do 1. Ma to
ogromne znaczenie ze względu na drastyczną redukcję kosztów związaną z możliwością
użycia mniejszej liczby kart pomiarowych z przetwornikami analogowo-cyfrowymi. Aby
z odpowiednią prędkością wysterować obciążenie pojemnościowe, jakie stanowi ścieżka
na płytce PCB oraz kabel doprowadzający sygnał do karty z przetwornikiem ADC,
konieczne jest zastosowanie buforu wyjściowego (OUTPUT BUFFER).
Każdy kanał odczytowy układu „Neuroplat” składa się z układu sprzęgającego
(AC - odcinający składową stałą sygnału) na wejściu, niskoszumowego przedwzmacniacza,
filtru pasmowo-przepustowego oraz bufora wyjściowego. Schemat kanału przedstawia
Rysunek 2-9.
Rysunek 2-9: Schemat blokowy kanału odczytu układu “Neuroplat”, na podstawie [38]. Symbole
MC, MR oznaczają odpowiednio pojemność i rezystancję zrealizowaną w postaci
tranzystorów CMOS.
Elektroda referencyjna (REF) przenosi średnie napięcie panujące w roztworze na
wejście referencyjne kanału wzmacniacza. Ponieważ rejestrowane potencjały
czynnościowe, są zwykle niższe (50μV – 1mV) od składowej stałej napięcia na elektrodzie
(kilka miliwoltów, wynik lokalnej koncentracji jonów w roztworze) konieczne jest
zastosowanie układu odcinającego składową stałą (MC0, MR0). Pierwszym stopniem
łańcucha formującego sygnał jest przedwzmacniacz o niskim poziomie szumów. Filtr
pasmowo-przepustowy
zrealizowany
został
w
postaci
dwóch
filtrów:
górnoprzepustowego (MC1, MR1) i dolnoprzepustowego (MR2, C2), oddzielonych stopniem
wzmacniającym (K2). Pierwszy stopień filtru ma również za zadanie odcięcie składowej
stałej sygnału wyjściowego przedwzmacniacza. Tranzystory MR1 i MR2 pracujące
w konfiguracji rezystorów aktywnych, pozwalają na sterowanie częstotliwościami
granicznymi filtrów. Sygnał wejściowy podawany jest na źródło tranzystora, a przesunięty
o pewne napięcie stałe podawany jest również na bramkę tranzystora. Dzięki temu
rozwiązaniu napięcie bramka-źródło utrzymywane jest na stałym poziomie niezależnie od
poziomu sygnału wejściowego filtru, utrzymując również stałą rezystancję pomiędzy
drenem a źródłem [44]. Zakres sterowania dolnej częstotliwości granicznej filtru
34
pasmowo-przepustowego to 12 – 120Hz, górnej częstotliwości granicznej to
500Hz - 4.5kHz. Aby skutecznie przeładowywać pojemność pamiętającą w układzie
próbkująco-pamiętającym, konieczne jest zastosowanie bufora wyjściowego (BUF).
2.4. Wymagania projektowe dla nowego układu scalonego do równoczesnej
stymulacji i odczytu aktywności komórek nerwowych w eksperymentach
In-vitro oraz In-vivo
W ostatnich latach ukazało się wiele publikacji opisujących projekty układów
scalonych pozwalających na równoczesną rejestrację aktywności i stymulację elektryczną
z zastosowaniem matryc mikroelektrodowych. Prezentowane są różne architektury
układów, również podobne do prezentowanego w rozdziale 2.3 układu Neuroplat [45].
Czasami stosowane są nietypowe rozwiązania układowe, np. architektura pozbawiona
rezystorów w sprzężeniach zwrotnych [46]. Inne projekty specjalizowane są pod kątem
szczególnych aplikacji, jak wszczepianie bezpośrednio do ośrodkowego układu
nerwowego [47] lub zintegrowana funkcja bezprzewodowej transmisji danych [48].
Każdy z prezentowanych projektów cechuje się innowacyjnością i uzyskaniem bardzo
korzystnych wartości pewnych wybranych parametrów. Niestety spośród dostępnych
rozwiązań nie można wybrać takiego, które pozwalałoby na kompleksową rejestrację
wszystkich zjawisk zachodzących w żywych tkankach nerwowych. Należy przy tym
pamiętać, że współczesne badania neurobiologiczne nie ograniczają się do rejestracji
aktywności spontanicznej, lecz uwzględniają też rejestrację aktywności wywołanej przy
zastosowaniu stymulacji elektrycznej. Zastosowanie stymulacji elektrycznej wymusza
pewne wymagania projektowe dla elektroniki odczytu. Wstrzykiwanie prądów
stymulacyjnych poprzez elektrodę wywołuje powstawanie tzw. artefaktów
stymulacyjnych, pasożytniczych sygnałów o amplitudach wyższych od potencjałów
czynnościowych, uniemożliwiających ich rejestrację. Mimo, iż artefakty stymulacyjne mają
wyższe amplitudy i ich widmo częstotliwościowe pokrywa się z widmem potencjałów
czynnościowych, istnieje metoda separacji tych dwóch klas sygnałów. Podczas trwania
eksperymentu, rejestruje się przebiegi napięcia na elektrodach będące superpozycją
artefaktów stymulacyjnych i potencjałów czynnościowych. Po zakończeniu eksperymentu,
neurony zatruwa się przy użyciu TTX (tetrodotoksyny), co pozwala na rejestrację samych
artefaktów stymulacyjnych. W procesie analizy danych od zarejestrowanych potencjałów
wywołanych nałożonych na artefakty stymulacyjne, odejmuje się artefakty zarejestrowane
w końcowym etapie eksperymentu, już po „uśmierceniu” neuronów. W ten sposób można
odzyskać kształt potencjału czynnościowego nieobciążonego artefaktem [31].
2.4.1. Dyskusja i
funkcjonalnych
założenia
projektowe
poszczególnych
bloków
Jednym z kierunków badań w neurobiologii jest próba powiązania potencjałów
czynnościowych z potencjałami polowymi naturalnych sieci neuronowych. Powstawanie
potencjałów polowych wyjaśniane jest na różne sposoby: najnowsze badania i teorie
opisują zmienną, nierównomierną (ale nie stochastyczną) dystrybucję monopoli
elektrycznych (jonów) jako ich źródło [49]. Częściej spotykane w literaturze wyjaśnienie
to lokalny wzrost ogólnej aktywności elektrycznej i niezrównoważonych prądów
transbłonowych dużych grup neuronów [50] [51]. Najpopularniejszą techniką rejestracji
potencjałów polowych (sygnały o amplitudach rzędu kilku miliwoltów w zakresie
35
częstotliwości 0.1 Hz – 300 Hz) jest obrazowanie wapniowe [52]. Technika ta
wykorzystuje znaczniki chemiczne, dodawane do płynu fizjologicznego, w którym
zanurzona jest badana tkanka. Znaczniki te fosforyzują w wyniku wiązania jonów wapnia
Ca2+ wypływających z wnętrza neuronów podczas ich aktywacji.
Sygnały pochodzące z żywych sieci neuronowych można interpretować na różnych
poziomach: jako podstawowe „jednostki” sygnałów można wskazać potencjały
czynnościowe oraz potencjały polowe. W literaturze popularne jest stwierdzenie, że
neurony kodują sygnały na drodze częstotliwościowej. Na poparcie tej tezy autorzy
najczęściej powołują się na bardzo proste przykłady powstawania potencjałów
czynnościowych w wyniku pobudzenia jednego neuronu kilkoma potencjałami
pojawiającymi się w krótkich interwałach czasowych. W rzeczywistości, neurony generują
niekiedy bardzo skomplikowane lawiny wielu impulsów, powtarzające się w czasie. Innym
zjawiskiem obserwowanym podczas rejestracji aktywności żywych sieci neuronowych są
lawiny impulsów generowane przez całą sieć neuronową (ang. Network Bursting).
Przykłady tego typu aktywności zaprezentowane zostały na Rysunku 2-10. Możliwość
równoczesnej rejestracji potencjałów czynnościowych i potencjałów polowych
pozwoliłaby na przeprowadzenie eksperymentów mających na celu poznanie zależności
pomiędzy potencjałami czynnościowymi, aktywnością synchroniczną sieci i lokalnymi
potencjałami polowymi.
Rysunek 2-10: Przykładowy przebieg 700 s zarejestrowanej aktywności 76 neuronów. Widoczne są
zarówno powtarzające się sekwencje generowane przez pojedyncze neurony, jak
i zsynchronizowana aktywność dużej liczby komórek. Pojedynczy punkt oznacza jeden
potencjał czynnościowy. Rozdzielczość czasowa rejestracji wynosi 50μs.
Krytycznym parametrem pracy układów scalonych stosowanych w bezpośrednim
sąsiedztwie żywych tkanek jest pobór mocy. Prezentowany projekt z założenia ma być
trzonem systemów do rejestracji sygnałów biologicznych in vivo, jak również in vitro.
W zastosowaniach in vitro pobór mocy musi być ograniczony do poziomu pozwalającego
na pominięcie chłodzenia aktywnego w postaci radiatorów, wentylatorów itp. Chłodzenie
bierne musi pozwalać na odprowadzenie ciepła, które zapewni utrzymanie temperatury
chipu bliskiej (a na pewno nie przekraczającej) temperatury ciała zwierzęcia, od którego
pobrany został materiał do badań. W systemach do rejestracji aktywności elektrycznej
in vivo wymaganie ograniczonego poboru mocy wynika z zasilania układu ze źródła
bateryjnego. W tym przypadku, pojemność baterii warunkuje możliwy czas prowadzenia
eksperymentu.
36
Układ do rejestracji różnych klas sygnałów neurobiologicznych
Rejestracja wszystkich klas sygnałów neurobiologicznych wymaga zastosowania
odpowiednich zakresów filtrów pasmowo-przepustowych dla tłumienia sygnałów poza
interesującym spektrum i uzyskania jak najlepszego stosunku sygnału do szumu. Jedną
z możliwych konfiguracji układowych jest zastosowanie wspólnego przedwzmacniacza
oraz dwóch równoległych filtrów pasmowo-przepustowych; jeden selektywny dla
potencjałów czynnościowych, drugi dla potencjałów polowych. Konfiguracja taka została
zaimplementowana w projekcie przedstawionym w Rozdziale 3.
Z punktu widzenia przetwarzania analogowo-cyfrowego, optymalną sytuacją jest
dopasowanie zakresu dynamicznego wyjścia kanału filtrująco-wzmacniającego do zakresu
wejściowego przetwornika ADC, aby optymalnie wykorzystać cały jego zakres dynamiczny
i rozdzielczość. W tym celu układ do rejestracji powinien posiadać funkcję regulacji
wzmocnienia.
Różne zakresy występujących częstotliwości wymuszają pewne minimalne
częstotliwości próbkowania. Zgodnie z twierdzeniem Shannona częstotliwość
próbkowania powinna być 2 krotnie wyższa od najwyższej składowej rejestrowanego
sygnału. W praktyce, częstotliwość próbkowania sygnału wyjściowego z pojedynczego
kanału musi być co najmniej 10 krotnie wyższa od najwyższej harmonicznej. Wymaganie
to wynika z konieczności dokładnego odwzorowywania kształtów rejestrowanych
potencjałów czynnościowych, aby możliwe było przeprowadzenie operacji sortowania.
Sortowanie potencjałów czynnościowych jest konieczne ze względu na rejestrację na
pojedynczej elektrodzie sygnałów z więcej niż jednego neuronu (patrz Rozdział 4.2
i Dodatek A). Klasy sygnałów i parametry rejestracji zostały zestawione w tabeli 2.1.
Tabela 2.1 Parametry analogowego układu odczytu oraz rozdzielczość ADC wymagana
dla poszczególnych klas sygnałów występujących w eksperymentach z rejestracją
potencjałów zewnątrzkomórkowych
Klasa sygnału
Typowe amplitudy dla
rejestracji przy pomocy
elektrod
zewnątrzkomórkowych
Zakres
częstotliwości/
min. częst.
próbkowania
Wymagane
wzmocnienie
Wymagana
rozdzielczość/
szybkość ADC
Potencjały
czynnościowe
50-500μV
800 2000Hz/
20kHz
100 – 1000
[V/V]
12 bit/
1.28MHz
Potencjały
polowe
kilka mV - 10mV
1 – 300Hz/
3kHz
100 – 300
[V/V]
12 bit/
192kHz
Artefakty stymulacyjne z pot.
czynnościowymi
kilka mV, zależnie od
rodzaju elektrod
800 –
2000Hz/
20kHz
100 – 1000
[V/V]
12 bit/
1.28MHz
Potencjały
polowe +
potencjały
czynnościowe
<10mV
1 – 2000Hz
20kHz
100 – 1000
[V/V]
16 bit/
1.28MHz
Kolejnym ważnym parametrem jest niski poziom szumu kanału elektroniki odczytu.
Podczas sortowania potencjałów czynnościowych rejestrowanych na pojedynczych
elektrodach (Dodatek A) zwykle arbitralnie przyjmuje się, jaki stosunek sygnału do szumu
jest zadowalający, zatem im niższy poziom szumu, tym niższe amplitudy potencjałów
czynnościowych można uznać za wiarygodne i zdatne do ujęcia w dalszej analizie danych.
37
Układ do stymulacji elektrycznej komórek nerwowych
Funkcjonalność prezentowanego projektu nie ogranicza się do odczytu sygnałów, ale
ma również umożliwiać elektryczną stymulację komórek nerwowych. Skuteczna
stymulacja neuronu zależy od wielu czynników: odległości neuronu od elektrody, rodzaju
komórki, oraz natężenia prądu stymulacyjnego. Na pierwsze dwa czynniki prowadzący
eksperymenty nie mają wpływu, natomiast natężeniem prądu stymulacyjnego można
sterować dzięki zastosowaniu przetwornika cyfrowo-analogowego.
W eksperymentach wykorzystujących zjawisko aktywacji neuronów pod wpływem
zewnętrznego prądu wyzwanie stanowi selektywna stymulacja pojedynczych komórek.
Stymulacja neuronu jest skuteczna tylko w pewnym zakresie natężenia prądu. Użycie zbyt
niskiego (podprogowego) prądu nie spowoduje wygenerowania potencjału
czynnościowego. Prąd o zbyt wysokim natężeniu wbrew pozorom nie doprowadza do
aktywacji, a w skrajnych przypadkach prowadzi nawet do biologicznej śmierci neuronu.
Wysoka rozdzielczość przetwornika DAC pozwala na znalezienie precyzyjnej progowej
wartości prądu stymulacyjnego, przy której aktywowany jest wybrany neuron docelowy,
natomiast neurony sąsiadujące pozostają w stanie spoczynkowym. Poprzednia generacja
układu scalonego opracowana w Katedrze Oddziaływań i Detekcji Cząstek WFiIS
pozwoliła na przeprowadzenie eksperymentów polegających na selektywnej stymulacji
neuronów siatkówki oka [53]. Z przeprowadzanych dotychczas badań wynika, iż dalszy
rozwój technik stymulacji wymaga zwiększenia dotychczasowej rozdzielczości
z 7 do 9 bitów. Zagadnienia związane z bezpieczną i skuteczną stymulacją neuronów
omówione są szczegółowo w pracy [31].
Multiplekser analogowy
Prezentowany układ scalony w założeniu ma zawierać w swojej strukturze 64 kanały.
Każdy kanał posiadać ma 2 wyjścia: jedno dla podkanału do rejestracji potencjałów
czynnościowych, drugie dla podkanału do rejestracji potencjałów polowych.
Z oczywistych względów wyprowadzanie z układu scalonego 128 wyjść (czyli również 128
przewodów) jest rozwiązaniem mało praktycznym. Aby zredukować liczbę sygnałów
wyjściowych, wyjścia kanałów zostaną zmultipleksowane, czyli równocześnie
próbkowane i sekwencyjnie wyprowadzane na pojedynczą linię wyjściową. Ponieważ
chcemy próbkować rejestrowane sygnały z częstotliwością 20 kHz (Tabela 2.1),
częstotliwość multipleksowania musi wynosić:
2-2
Jest to częstotliwość dwukrotnie większa w porównaniu do układu NEUROPLAT. Oprócz
odpowiedniej częstotliwości multipleksowania, jednym z celów nowego projektu jest
zredukowanie poboru mocy. Konieczna jest także minimalizacja przesłuchów od sygnałów
cyfrowych na analogowej linii wyjściowej. W wielu projektach multiplekserów
analogowych, aby zrealizować sekwencyjny odczyt sygnałów zapamiętanych przez
komórki pamięci, stosowany jest rejestr przesuwny z wędrującą jedynką, czyli połączone
szeregowo przerzutniki typu D. Zaletami tego rozwiązania są prostota i niezawodność,
jednak nieunikniona jest obecność zakłóceń, spowodowanych wstrzykiwaniem ładunku
od sygnału zegarowego w połowie okresu multipleksowania pojedynczego kanału.
Poglądowy przebieg napięcia na wyjściu multipleksera z rejestrem przesuwnym
z wędrującą jedynką, zastosowanego w układzie Neuroplat, przedstawiony został na
38
Rysunku 2-11. Pożądane jest zatem opracowanie nowych rozwiązań, które pozwolą
wyeliminować ten efekt, tym samym poprawiając precyzję rejestracji napięcia.
Rysunek 2-11: Pasożytniczy przesłuch sygnału zegarowego (CLK) powodujący zakłócenia
w trakcie próbkowania przetwornikiem ADC.
1.1.1. Schemat
blokowy
układu
scalonego
Odczyt / generowanie sygnałów analogowych
NEUROSTIM.
Na Rysunku 2-12 przedstawiony został schemat blokowy układu scalonego do
równoczesnej stymulacji i rejestracji aktywności elektrycznej tkanek nerwowych. Część
analogowa składa się z 64 kanałów stymulacyjnych (STIM 0 – STIM 63) oraz 64 kanałów
elektroniki odczytu (REC CH 0 – REC CH 63).
Rysunek 2-12: Schemat blokowy układu scalonego NEUROSTIM.
Pary kanałów stymulacyjnych i odczytu wykorzystują pojedyncze, dwukierunkowe
terminale (IN 0 – IN 63). Terminale te przeznaczone są do połączenia z elektrodami
matrycy lub sondy krzemowej. W trybie odczytu połączone są z wysokoimpedancyjnymi
wejściami układów REC CH 0-63, w trybie stymulacji z układami STIM 0 - 63,
39
generującymi prądy/napięcia stymulacyjne. Wyjścia kanałów odczytu (po 2 wyjścia na
1 kanał, Hf i Lf) połączone są z multiplekserem analogowym. Wyjście multipleksera
połączone jest z buforem (OUTPUT BUFFER), który pełni funkcję wzmacniacza mocy. Jego
zadaniem jest
wysterowanie małej impedancji obciążenia w postaci np. kabla
koncentrycznego prowadzącego do zewnętrznego układu ADC. Bufor ten konwertuje
również sygnał unipolarny na sygnał różnicowy (MUX out +, MUX out -).
Do sterowania parametrami pracy układów analogowych służy blok przetworników
cyfrowo-analogowych (BIASING/CONTROL DACs).
1.1.2. Interfejs komunikacyjny
Komunikacja odbywa się poprzez cztery pady sygnałowe (CLK – sygnał zegarowy,
InputData, StartFrame, resetB). Sterowanie pracą układu odbywa się poprzez dekoder
komend (COMMAND DECODER).
Idea działania prezentowanego układu scalonego zakłada możliwość jednoczesnej
stymulacji oraz odczytu aktywności elektrycznej komórek nerwowych. Ze względu na
dużą liczbę parametrów pracy układu a także danych, które trzeba wysyłać w trybie
stymulacji, komunikacja z układem scalonym odbywa się poprzez interfejs szeregowy,
pracujący z nominalną prędkością zegara 20MHz. Budowa systemu, który łączy te dwie
funkcje za pomocą tylko dwóch linii sygnałowych (InputData i StartFrame) stanowi duże
wyzwanie. Komunikacja cyfrowa ma charakter jednokierunkowy – od generatora
sygnałów do układu scalonego NEUROSTIM. Wysyłane komendy dzielą się na 2 klasy:
A) Komendy ustawiające parametry pracy – domyślnie wysyłane raz przed
uruchomieniem układu. Mogą być wysyłane w dowolnej chwili, o ile nie kolidują
z transmisją danych do pamięci przetworników DAC w układzie stymulacyjnym.
Komendy te służą do ustawiania wartości napięć i prądów polaryzacyjnych
(BIASING/
CONTROL
DACs),
trybów
pracy
układu
stymulacji
(prądowy/napięciowy), konfiguracji multipleksera analogowego, ustawienia
wzmocnienia układu rejestracji, częstotliwości granicznych filtrów pasmowoprzepustowych.
B) Dane czasu rzeczywistego zawierające wartości prądów/napięć stymulacyjnych.
Wysyłane do wszystkich kanałów w postaci szeregowego ciągu 900 bitów,
cyklicznie co 50 ms. Dane te ustawiają wartość przetwornika DAC w kanale
stymulacji oraz ustawienia kluczy układu rozładowywania artefaktów
stymulacyjnych.
Dekoderowi komend towarzyszy blok resetowania (RESET BLOCK), który przywraca
domyślne ustawienia przetworników cyfrowo-analogowych, tryb pracy multipleksera,
ustawienia kluczy w układzie stymulacji, rozładowuje także kondensatory w układach
próbkująco-pamiętających multipleksera.
W systemie do rejestracji i stymulacji aktywności elektrycznej wykorzystanych może
być więcej niż 1 układ scalony. W takim przypadku konieczne jest adresowanie
poszczególnych układów za pomocą statycznych sygnałów logicznych Addr <2:0>.
Ustalony indywidualnie dla każdego spośród maksymalnie 8 układów adres dodawany
jest w nagłówku komendy wysyłanej na wspólnej dla wszystkich układów magistrali,
w ten sposób można wysłać komendę do jednego, wybranego układu scalonego.
40
3. PROJEKT I
TESTY WYBRANYCH BLOKÓW FUNKCJONALNYCH SPECJALIZOWANEGO UKŁADU
SCALONEGO NEUROSTIM
W toku prac prowadzonych w celu zaprojektowania układu scalonego NEUROSTIM,
powstały dwa układy prototypowe o roboczych nazwach NEURO2 oraz NEURO_DAC.
Niektóre elementy z układów prototypowych zostały przeniesione bezpośrednio, inne
zostały udoskonalone, aby spełnić postawione wymagania projektowe. Układ scalony
NEURO2 zawierał dwie koncepcje kanału elektroniki odczytu, po 8 kanałów każda:
 opartą na architekturze prezentowanej w rozdziale 2.3, opisaną w publikacji
[54], która nie została zaadaptowana do układu NEUROSTIM,
 składającą się z przedwzmacniacza i dwóch podkanałów, odpowiednio do
rejestracji potencjałów czynnościowych i potencjałów polowych. Architektura
ta została zastosowana po modyfikacjach w układzie NEUROSTIM.
W układzie NEURO2 zrealizowany został również multiplekser analogowy.
Układ scalony NEURO_DAC zawierał 16 kanałów stymulacyjnych, w każdym
przetwornik cyfrowo-analogowy wraz z układem buforującym. Projekt układu stymulacji
został udoskonalony i przeniesiony do układu NEUROSTIM
W rozdziale 3 przedstawione zostaną projekty oraz wyniki testów tych modułów,
w których wkład autora pracy był najbardziej znaczący. Na Rysunku 3-1 zaznaczone
zostały moduły, które zostały opisane w rozdziale 3. Wszystkie projekty były
przygotowywane w technologii CMOS firmy Austria Microsystems C35B4, z minimalną
długością bramki tranzystora 350nm. Technologia ta umożliwia wykorzystanie 4 warstw
ścieżek metalicznych oraz kondensatorów i rezystorów pasywnych.
Rysunek 3-1: Moduły układów scalonych NEURO2, NEURO_DAC oraz NEUROSTIM opisane
w rozdziale 3.
3.1. Przetwornik cyfrowo-analogowy w układzie do stymulacji elektrycznej
W poprzedniej generacji układu scalonego do stymulacji elektrycznej komórek
nerwowych, zaprojektowanego w KOiDC WFiIS AGH (oznaczonego nazwą Stimchip),
zastosowano przetwornik cyfrowo-analogowy (DAC) w architekturze skalowalnych źródeł
prądowych [31] [55]. Wadą tej architektury jest wrażliwość na rozrzuty statystyczne
parametrów pracy tranzystorów. Rozrzuty statystyczne są odwrotnie proporcjonalne do
pierwiastka z powierzchni bramki tranzystora, zatem aby je zminimalizować, konieczne
jest użycie dużych tranzystorów. Wspomniany przetwornik o rozdzielczości 7 bitów
umożliwił prace nad opanowaniem technik skutecznej i bezpiecznej stymulacji
41
elektrycznej komórek zwojowych siatkówki oka. Dalszy rozwój technik stymulacji
elektrycznej wymaga zwiększenia rozdzielczości przetwornika, przy czym spełnione
muszą być też wymagania niskiego poboru mocy, wysokiej liniowości.
3.1.1. Architektura przetwornika cyfrowo-analogowego
Pierwszym krokiem w projektowaniu przetwornika cyfrowo-analogowego jest wybór
takiej architektury, która umożliwi spełnienie postawionych wymagań projektowych.
Należy wziąć pod uwagę fakt, że projektowany przetwornik w układzie scalonym zostanie
zastosowany w każdym z 64 kanałów z osobna. Niezbędne jest zatem ograniczenie
powierzchni krzemu wymaganej na jego realizację. W przypadku architektury
skalowalnych źródeł prądowych, zwiększenie rozdzielczości o jeden bit oznacza
konieczność dodania tranzystora dwukrotnie większego od największego zastosowanego
dla liczby bitów o jeden niższej, co skutkuje prawie podwojeniem powierzchni
przetwornika. Konieczne było zatem znalezienie innego rozwiązania.
W roku 1975 po
raz pierwszy opisana została architektura przetwornika
cyfrowo-analogowego działającego na zasadzie sukcesywnego dzielenia ładunku na
dwóch bliźniaczych kondensatorach [56]. W porównaniu do architektury skalowalnych
źródeł prądowych, przetwornik z sukcesywnym dzieleniem ładunku może być
zrealizowany na znacznie mniejszej powierzchni. Pod względem funkcjonalnym jest on
nieco bardziej skomplikowany, ponieważ proces dzielenia ładunku wymaga zastosowania
układu logiki sekwencyjnej. Schemat koncepcyjny przetwornika z sukcesywnym
dzieleniem ładunku został przedstawiony na Rysunku 3-2.
Rysunek 3-2: Przetwornik cyfrowo-analogowy z sukcesywną redystrybucją ładunku, schemat
koncepcyjny. VH ,VL – napięcia referencyjne, sw1 – sw4 – klucze, VOUT – napięcie
wyjściowe.
W pierwszej kolejności przetwarzany jest najmłodszy bit (LSB). Kondensator C1
ładowany jest do napięcia referencyjnego VH lub VL przy odpowiednio zamkniętym kluczu
sw2 lub sw3. Kondensator C2 może być połączony z C1 poprzez klucz sw1, połączony
z potencjałem VL (który możemy na początek przyjąć równy potencjałowi masy), lub
naładowany do napięcia VH.
W stanie początkowym klucze sw3 i sw4 są zamknięte, aby rozładować kondensatory
C1 i C2, klucz sw2 pozostaje otwarty. Jeżeli przyjmiemy, że najmłodszy bit d1 będzie
logiczną „1”, wówczas cykl przetwarzania rozpocznie się od naładowania kondensatora C1
do napięcia VH przy pozostałych kluczach otwartych. Klucz sw2 zmienia stan na otwarty,
momentalnie zamykany jest klucz sw1 i następuje dzielenie ładunku zgromadzonego na
C1, a napięcie na kondensatorach C1 i C2 wynosi:
( )
( )
3-1
Gdy klucz sw1 jest otwierany, kondensatory zostają rozłączone – napięcie zostaje
zapamiętane na C2. Ładowany jest kolejny bit d2 poprzez naładowanie C1 odpowiednio do
42
napięcia VH (d2 = 1) lub VL (d2 = 0). Klucze sw2 (sw3) są rozłączane i ponownie oba
kondensatory zostają połączone w celu podzielenia ładunku i wyrównania napięcia, które
po drugim cyklu wynosi:
( )
( )
(
)
3-2
gdzie V1, V2 – napięcie odpowiednio na kondensatorach C1 i C2.
Sekwencja ładowania C1 napięciem referencyjnym i wyrównywania ładunku jest
kontynuowana tyle razy, ile bitów rozdzielczości chcemy uzyskać. Ostatecznie, napięcie
wyjściowe przetwornika o K bitach (d1, d2, d3 … dK) wynosi:
( )
( )
∑
3-3
Przebieg napięcia na kondensatorach dla przykładowego cyklu 4 bitów 1101
przedstawia Rysunek 3-3.
Rysunek 3-3: Ilustracja przebiegu napięć na pojemnościach sekwencyjnego przetwornika
cyfrowo-analogowego. Cyfry czerwone oznaczają stan logiczny, odpowiadający za
ładowanie pojemności C1 do napięcia VH (1) lub VL(0).
3.1.2. Ograniczenia architektury i źródła nieliniowości przetwornika
Zaletą omawianego przetwornika jest możliwość, przynajmniej teoretycznie,
uzyskania dowolnie dużej rozdzielczości przy użyciu tylko dwóch kondensatorów.
W praktyce, klucze łączące kondensatory C1 i C2 realizowane są jako klucze
komplementarne CMOS, czyli równolegle połączone tranzystory NMOS i PMOS.
Rzeczywista struktura tranzystorów polowych zawiera elementy pasożytnicze, między
innymi rezystancje upływu i pojemności pomiędzy bramką i drenem oraz bramką
i źródłem [55]. Elementy te powodują wstrzykiwanie ładunku, czyli przepływ przez
rezystancje upływu i indukowanie ładunku na pojemnościach pasożytniczych podczas
przełączania napięcia bramki (włączania/wyłączania klucza). Wstrzykiwanie lub
wyciąganie ładunku powoduje nadmiar lub brak ładunku na kondensatorze C2 po
każdorazowej sekwencji przełączania kluczy, zatem napięcie wyjściowe jest różne od
napięcia oczekiwanego i wynosi:
43
( )
( )
3-4
gdzie V(K) jest napięciem oczekiwanym określonym wzorem (3-3), a oznacza
napięcie błędu.
Wielkość napięcia błędu ładunku zależy od napięcia przesłuchu (VF), napięcia
wynikającego ze statystycznych różnic w pojemnościach kondensatorów C1 i C2 (Vm),
współczynników temperaturowych i napięciowych pojemności (VT i VV ), oraz związanego
z prądami upływu (VL). Aby nieliniowość nie przekroczyła wymaganej wartości
maksymalnej, należy zapewnić takie warunki pracy układu, aby napięcie błędu
3-5
nie przekroczyło określonego kryterium, np. wartości równej połowie najmłodszego bitu:
m | |
3-6
gdzie K oznacza liczbę bitów przetwornika.
Niedopasowanie pojemności
W układach scalonych parametry elementów (tranzystorów, rezystorów i również
kondensatorów) podlegają rozrzutom statystycznym odwrotnie proporcjonalnym do
pierwiastka z powierzchni czynnej elementu. W przetworniku cyfrowo-analogowym użyte
zostały kondensatory z polikrzemu, dla których odchylenie standardowe pojemności
wynosi:
(
)
3-7
√
gdzie C –pojemność kondensatorów C1 i C2 nominalnie identycznych,
,
AC - parametr technologiczny, W, L – szerokość i długość powierzchni czynnej
kondensatora.
Oznacza to, że pojemność dwóch kondensatorów o pojemności 5 pF i wymiarach
W=120μm, L=48μm, z prawdopodobieństwem 68% będzie się zawierać w granicach
. Użycie dużych kondensatorów jest pożądane dla osiągnięcia dobrego
dopasowania pojemności C1 i C2. Napięcie błędu wynikające z niedopasowania pojemności
zależy od całkowitej ilości bitów (rozdzielczości) oraz numeru bitu aktualnie
przetwarzanego.
∑
(
)
3-8
K – ilość bitów rozdzielczości przetwornika, i – numer wybranego bitu, di – wartość
bitu (0/1).
Z powyższego wzoru wynika, że maksymalny błąd napięcia niedopasowania
występuje dla przejścia w połowie zakresu przetwornika, czyli z wartości 0111…11 na
1000…00.
Przesłuch przez pojemności pasożytnicze
Dla przykładu można rozpatrzyć wpływ pojemności pasożytniczych tranzystora
łączącego kondensatory C1 i C2 podczas wyrównywania ładunku.
44
Rysunek 3-4: Schemat połączenia kondensatorów przetwornika uwzględniający pojemności
pasożytnicze klucza.
Podczas włączenia klucza, pojemności pasożytnicze są ładowane do napięcia VG – VC1,
(VC1=VC2). Oba kondensatory pasożytnicze, pomiędzy bramką i drenem (CGD) oraz bramką
i źródłem (CGS) w chwili włączenia klucza sw1 można przedstawić jako jedną pojemność
C0. Źródłem ładunku indukowanego na „dolnej” okładce kondensatora pasożytniczego jest
oczywiście ładunek zgromadzony przed włączeniem klucza sw1 na kondensatorach C1 i C2.
Powoduje to zaburzenie w pracy przetwornika, ponieważ pojemność bramki tranzystora
jest zależna od napięcia bramki względem pozostałych terminali tranzystora. Zakładając,
że pojemności pasożytnicze są niezależne od napięcia, napięcie błędu spowodowane
wstrzykiwaniem ładunku jest proporcjonalne do ilorazu:
(
)
3-9
Jeżeli pojemności C1 i C2 będą miały wartości małe w porównaniu do pojemności
pasożytniczych kluczy, wpływ ładunku pasożytniczego wstrzykiwanego podczas
przełączania nie będzie pomijalny. Z tego powodu należy dążyć do maksymalizacji
stosunku pojemności kondensatorów do wymiarów kluczy, aby ładunek pasożytniczy
stanowił jak najmniejszą część ładunku gromadzonego na kondensatorach C1 i C2.
Prądy upływu
Tranzystory w układach scalonych obciążone są rezystancjami upływu. Ma to dwa
negatywne skutki w działaniu omawianego przetwornika: pierwszy to wpływ prądów
upływu na nieliniowość, drugi to konieczność odświeżania wartości napięcia wyjściowego
przetwornika. Raz ustalone napięcie wyjściowe będzie malało ze stałą czasową równą
iloczynowi pojemności C2 i sumie rezystancji upływu. Upływność przez rezystancje
pasożytnicze kondensatorów jest pomijalnie mała, jednak rezystancje upływu kluczy
w stanie zamknięcia muszą zostać uwzględnione w projekcie.
Wynik symulacji przebiegu napięcia na kondensatorach ładowanych ze źródeł
referencyjnych został przedstawiony na Rysunku 3-5. Stała czasowa ładowania pojemności
zależy od rezystancji klucza RON w stanie włączenia i pojemności kondensatora C1.
Napięcie na kondensatorze C1 musi osiągnąć wartość ustaloną przed rozpoczęciem fazy
dzielenia ładunku. Jeżeli rezystancja klucza lub pojemność C1 będzie zbyt wysoka, długa
stała czasowa
spowoduje, iż napięcie nie osiągnie wartości ustalonej. Dlatego
wartości pojemności C1 i C2 dzielnika ładunkowego oraz wymiary kluczy sw1-sw4 muszą
stanowić kompromis pomiędzy wymaganiami ograniczenia przesłuchów i minimalizacji
nieliniowości a szybkością działania przetwornika.
Najwięcej argumentów przemawia za użyciem jak najmniejszych tranzystorów jako
kluczy oraz jak największych kondensatorów jako dzielnika ładunku. Rezystancja
tranzystora pracującego w układzie klucza jest odwrotnie proporcjonalna do stosunku
szerokości do długości kanału. Tranzystor o wymiarach minimalnych powoduje mały
45
przesłuch, ale ma stosunkowo dużą rezystancję. Niestety minimalizacja kluczy
i zwiększanie kondensatorów nie może odbywać się w nieskończoność, ponieważ duża
rezystancja kluczy i duża pojemność narzuca ograniczenie na szybkość działania
przetwornika.
Rysunek 3-5: Przebieg napięcia na wyjściu sekwencyjnego przetwornika cyfrowo-analogowego
dla przykładowego słowa: 110010101.
3.1.3. Pamięć analogowa i układ redukcji pasożytniczego wstrzykiwania
ładunku
Planowana częstotliwość odświeżania prezentowanego przetwornika cyfrowoanalogowego wynosi 20kHz, co odpowiada okresowi 50μs. Częstotliwość zegara
systemowego używanego do przełączania kluczy w przetworniku wynosi 20MHz (okres
50ns), więc całkowity czas potrzebny na przetworzenie słowa cyfrowego na napięcie
analogowe równy 10 okresom zegara, wynosi 500ns.
Przetwornik w postaci przedstawionej na Rysunku 3-2 wymaga zastosowania układu
buforującego oraz przetwornika napięciowo-prądowego (stymulacja prądowa jest
wykorzystywana częściej niż napięciowa). Zastosowanie prostego wtórnika napięciowego
jako pierwszego stopnia bufora, skutkowałoby szybkimi zmianami napięcia podczas cyklu
przetwarzania (trwającego 500ns, czyli 1/100 okresu odświeżania przetwornika). Takie
zjawisko jest oczywiście bardzo niepożądane, ponieważ zmianie ulegałby całkowity
ładunek wstrzykiwany podczas stymulacji elektrycznej. Aby w pełnym okresie pracy
przetwornika utrzymać stałe napięcie, jako układ buforujący zastosowana została
komórka pamięci analogowej. Architektura komórki pamięci analogowej oraz dwa tryby
pracy zostały przedstawione na Rysunku 3-6.
W trybie próbkowania (SAMPLE) napięcie z wyjścia przetwornika jest podawane
przez zamknięty klucz na dodatnie wejście wzmacniacza operacyjnego, który pracuje
w układzie wtórnika napięciowego, ładując pojemność pamiętającą CH = 5pF. Rezystancja
wyjściowa wzmacniacza operacyjnego wynosi 50Ω, co daje stałą czasową narastania
napięcia na wyjściu 0.25ns . Przy tak krótkiej stałej czasowej wystarczające jest ładowanie
pojemności pamiętającej przez czas wynoszący 1 okres zegara systemowego (50ns).
Kondensator CH ładowany jest względem napięcia referencyjnego przetwornika REF_low.
Następnie, w trybie HOLD, sprzężenie zwrotne wzmacniacza operacyjnego jest rozłączane,
46
Rysunek 3-6: Układ próbkująco-pamiętający zastosowany jako bufor sekwencyjnego
przetwornika cyfrowo-analogowego: a) SAMPLE (próbkowanie) i b) HOLD
(zapamiętanie).
a dolna okładka pojemności pamiętającej CH jest łączona z ujemnym wejściem
wzmacniacza operacyjnego. Włączenie kondensatora CH w sprzężenie zwrotne przy
sterowaniu dodatniego wejścia napięciem referencyjnym REF_low powoduje wymuszenie
na wyjściu wzmacniacza napięcia zapamiętanego na pojemności CH.
Wyniki pomiarów układu prototypowego NEURO_DAC pozwoliły zidentyfikować
niepożądany efekt wzrostu napięcia na wyjściu przetwornika podczas próbkowania
napięcia przez układ próbkująco-pamiętający. Problem ten nie został zauważony na etapie
projektu prototypu, jednak wyniki symulacji (Rysunek 3-8A) wyraźnie pokazują, że jest to
efekt zauważalny przy odpowiednio wysokiej rozdzielczości czasowej symulacji. Nagłe
wzrosty napięcia („szpilki”) są skutkiem pasożytniczego wstrzykiwania ładunku podczas
przełączania kluczy w układzie próbkująco-pamiętającym. Tego typu krótkie,
niekontrolowane wzrosty napięcia podczas stymulacji komórki nerwowej są niepożądane.
Aby pozbyć się tego pasożytniczego efektu, układ próbkująco-pamiętający uzupełniony
został o dodatkowy kondensator pamiętający, dzięki któremu na wyjściu przetwornika
można zminimalizować przesłuchy pasożytnicze. Pełny schemat przetwornika wraz
z układem próbkująco-pamiętającym, blokiem logiki sterującej i układem redukcji
artefaktów przedstawiony został na Rysunku 3-7. Każdy kanał przetwornika wyposażony
jest w układ logiki sekwencyjnej sterujący pracą kluczy. Do układu logiki doprowadzony
jest sygnał zegarowy clk, dane z rejestru przechowującego wysłaną wartość data<8:0>
oraz sygnał wyzwalania trig, którego zbocze narastające powoduje uruchomienie
sekwencji działania kluczy (patrz Rysunek 3-5).
Rysunek 3-7: Schemat przetwornika cyfrowo-analogowego z układem próbkującopamiętającym i układem redukcji artefaktów.
Kondensator pamiętający w układzie redukcji artefaktów jest odcinany od komórki
próbkująco-pamiętającej kluczem swDG jeden cykl zegarowy przed rozpoczęciem procesu
47
zapamiętywania nowej wartości. Następnie zostaje z nim połączony po przejściu komórki
pamiętającej do stanu HOLD. Przebiegi napięć na wyjściu przetwornika bez układu
redukcji artefaktów i z jego zastosowaniem oraz diagram stanów działania
poszczególnych elementów przetwornika przedstawia Rysunek 3-8.
C
Rysunek 3-8: Przebiegi napięć wyjściowych dla przetwornika cyfrowo-analogowego: A) tylko
z komórką pamiętającą, B) uzupełniony o układ redukcji przesłuchów, C) Diagram stanów
działania przetwornika.
Wyjście przetwornika połączone jest z układem buforującym, który zawiera konwerter
napięciowo-prądowy oraz bufory pozwalające generować prądy bipolarne z
rozdzielczością 9 bitów w zakresach ±1μA ± μA ± μA
ięci w
resach ±0.1V
i ±0.5V. Układ buforujący nie był projektowany przez autora pracy, zatem omawianie
zagadnień związanych z tą częścią wykraczałoby poza ramy tej pracy.
3.1.4. Wyniki pomiarów przetwornika cyfrowo-analogowego
Przedstawiony powyżej projekt przetwornika zastosowany został w 64-kanałowym
układzie scalonym NEUROSTIM. Fotografia układu NEUROSTIM zamontowanego na
testowej płytce z obwodami drukowanymi przedstawiona została na Rysunku 3-9. Poniżej
przedstawione zostały wyniki pomiarów liniowości we wszystkich kanałach w trybie
prądowym oraz napięciowym.
48
Rysunek 3-9: Fotografia układu scalonego NEUROSTIM umieszczonego na płytce testowej.
Wymiary układu to 5 mm ⨯ 7 mm.
Tryb prądowy
Rysunek 3-10 przedstawia przykładowe przebiegi wyjściowe przetwornika w trybie
prądowym dla trzech zakresów 1μA μA
μA
b ic
ą ie i i w ść óż ic
wą
(DNL)
c
wą ( NL)
Rysunek 3-10: Wartości prądu wyjściowego oraz nieliniowości różniczkowa (DNL) i całkowa
(INL) dla trzech zakresów prądowych: ±1μA, ±5μA i ±25μA.
Dla pierwszych kilku wartości przetwornika, napięcie (prąd) wyjściowy utrzymuje się
blisko wartości 0. Efekt ten jest spowodowany niedopasowaniem pojemności
kondensatorów dzielących ładunek (patrz rozdział 3.1.2). Dla obliczeń nieliniowości 10
pierwszych kodów uznane zostało za „stracone” i nie jest uwzględniane
w prezentowanych wynikach pomiarów.
49
Rysunek 3-11: Wykres maksymalnych (niebieskie) i minimalnych (czerwone) wartości
nieliniowości różniczkowej (DNL) oraz całkowej (INL) dla 64 kanałów przy
zakresach prądów wyjściowych ±1, ±5 i ±25μA.
Na Rysunku 3-11 przedstawione zostały maksymalne (niebieskie) oraz minimalne
(czerwone) wartości nieliniowości różniczkowej i całkowej, występujące dla danego
kanału. Jak widać, nieliniowość różniczkowa nie przekracza ±0.5 lsb, a nieliniowość
całkowa ±1.5 lsb dla większości kanałów we wszystkich zakresach prądów wyjściowych.
Najbardziej krytyczny parametr, czyli nieliniowość różniczkowa, spełnia postawione
wymaganie projektowe. Rysunek 3-12 przedstawia zbiorczy wykres wartości prądów
zmierzonych dla wszystkich 64 kanałów przy ustawieniu kolejno trzech zakresów
prądów.
Rysunek 3-12: Wykres zbiorczy prądów wyjściowych
±1μA(niebieski), ±5μA(czerwony) i ±25μA(zielony).
50
przetwornika
DAC
dla
zakresu
Obok nieliniowości istotnym parametrem przetwornika cyfrowo-analogowego jest
wzmocnienie, jego rozrzut w funkcji kanału oraz różnica wzmocnienia dla polarności
dodatniej i ujemnej. Jak zostało opisane w wymaganiach projektowych na początku
rozdziału 2, celem eksperymentów związanych ze stymulacją elektryczną jest zwykle
znalezienie takiej wartości prądu, która pobudza jedną komórkę, nie wpływając na
komórki sąsiadujące. Ze względu na stosowanie w eksperymentach impulsów
bipolarnych [31]. Bardziej istotne od rozrzutu wartości bezwzględnej wzmocnienia jest
utrzymanie tej samej wartości dla obu polarności w pojedynczym kanale.
Rysunek 3-13: Wykres wartości wzmocnienia DACa przy polarności ujemnej (kolor czarny)
i dodatniej (kolor różowy) dla trzech zakresów prądów (1μA, 5μA i 25μA). Poniżej różnice
wzmocnienia dla polarności dodatniej i ujemnej.
Tryb napięciowy
Wykres pomiaru liniowości przetwornika w trybie napięciowym dla zakresów
±100mV oraz ±500mV przedstawia Rysunek 3-14.
Rysunek 3-14: Wykres napięć wyjściowych dla 64 kanałów przetwornika, tryb napięciowy
w zakresie ±100mV (kolor niebieski) i ±500mV (kolor czerwony)
Sygnały stymulacyjne w trybie napięciowym generowane są przy użyciu przetwornika
DAC o wyjściu prądowym i wzmacniacza transimpedancyjnego z rezystorem 100kΩ.
Konwerter prądowo-napięciowy może stanowić dodatkowe źródło nieliniowości.
51
Rysunek 3-15: Nieliniowość różniczkowa (DNL) i całkowa (INL), zakres ±100mV i ±500mV.
W prezentowanym układzie konwerter nie pogarsza nieliniowości samego przetwornika
(Rysunek 3-15).
Dla większości kanałów w trybie napięciowym nieliniowość różniczkowa (DNL) nie
przekracza ±0.5 lsb, nieliniowość całkowa (INL) dla większości kanałów nie przekracza
±2 lsb. Wyniki te są zadowalające i można uznać, że zastosowanie praktyczne
prezentowanego projektu umożliwi postępy w eksperymentach opartych na stymulacji
elektrycznej. Uzyskane wyniki rozrzutu wzmocnienia między kanałami są stosunkowo
duże, jednak nie powinno mieć to praktycznego wpływu na prowadzenie i wyniki
eksperymentów. Całkowity pobór mocy przetwornika nie przekracza 300 µW.
3.2. Układ do rejestracji sygnałów neurobiologicznych
Aby umożliwić rejestrację sygnałów w zakresach częstotliwości odpowiadających
potencjałom polowym (1Hz-100Hz) oraz potencjałom czynnościowym (400Hz – 4kHz),
opracowany został kanał odczytu sygnałów zawierający wejściowy filtr CR,
przedwzmacniacz, równoległe filtry pasmowo-przepustowe oraz wzmacniacze wyjściowe.
Schemat blokowy wzmacniacza przedstawiony został na Rysunku 3-16.
Rysunek 3-16: Schemat blokowy kanału odczytu.
52
3.2.1. Filtr wejściowy i przedwzmacniacz
Procesy elektrochemiczne zachodzące na granicy elektrody i roztworu soli
fizjologicznej powodują powstawanie pewnego stałego napięcia, którego wartość może
dochodzić do kilkuset miliwoltów, wielokrotnie przewyższając napięcie wywoływane
przez potencjały polowe lub czynnościowe. Aby uniknąć nasycenia układu
wzmacniającego, konieczne jest zastosowanie wejściowego filtru górnoprzepustowego,
który pozwala na odcięcie składowej stałej (DC). Częstotliwość graniczna tego układu
musi być dopasowana do widma sygnałów, które mają być rejestrowane, dlatego nie może
ona być wyższa niż 1 Hz.
Schemat przedwzmacniacza wraz z filtrem CR (zrealizowanym w postaci tranzystorów
MC i MR) zaprezentowany został na Rysunku 3-17. Przedwzmacniacz został zrealizowany
w architekturze wzmacniacza różnicowego z parą różnicową tranzystorów pmos (M1,
M2). Wyjścia przedwzmacniacza obciążone są sprzężeniem zwrotnym w postaci rezystora
240 kΩ i kondensatora o pojemności 24 pF. Kondensator został zrealizowany jako matryca
32 tranzystorów PMOS – rozwiązanie to pozwala uzyskać wymaganą pojemność przy
wykorzystaniu mniejszej powierzchni krzemu w porównaniu do kondensatora
metalicznego lub z polikrzemu. Wzmocnienie może być sterowane w zakresie
28 dB - 34 dB poprzez regulację prądu wpływającego do pary różnicowej ze źródła
prądowego (M5, M6) w zakresie 20 μA – 50 μA. Ponieważ rezystancja wyjściowa
przedwzmacniacza jest stosunkowo wysoka, niezbędne jest zbuforowanie wyjścia
wtórnikiem napięciowym. Pozwala to wysterować dwa filtry pasmowo-przepustowe
w kolejnym stopniu o rezystancji wejściowej 45 kΩ ż .
Przedwzmacniacz został zoptymalizowany pod kątem niskiego szumu. Głównym
źródłem szumu są tranzystory M1 i M2, a ponieważ moc szumu typu 1/f, który dominuje
w zakresie niskich częstotliwości jest odwrotnie proporcjonalna do powierzchni bramki
tranzystorów, zastosowano tranzystory o stosunkowo dużych wymiarach
W1/L1 = 1000μm / 2μm.
Rysunek 3-17:
Schemat układu przedwzmacniacza: wejściowy filtr CR (MC, MR),
przedwzmacniacz różnicowy (M1-M6), wtórnik napięciowy o całkowitym poborze prądu
20μA.
Rozrzut napięć progowych jest odwrotnie proporcjonalny do pierwiastka
z powierzchni bramki tranzystora, a więc stosunkowo duże wymiary tranzystorów M1
i M2 pozwalają zredukować różnicę napięć progowych do wartości 0.33mV (1σ rozrzutu
standardowego). Omawiany układ scalony, składający się z 64 kanałów odczytu, wymaga
53
opracowania architektury, dzięki której kalibracja napięć niezrównoważenia w każdym
kanale z osobna nie będzie konieczna. Najprostszą metodą na eliminowanie napięć
niezrównoważenia jest zastosowanie sprzężenia CR, czyli filtra górnoprzepustowego
pomiędzy kolejnymi stopniami układu odczytu. Niestety zakres częstotliwości, w którym
występują sygnały biologiczne zaczyna się już od częstotliwości 1Hz. Zrealizowanie filtru
górnoprzepustowego o częstotliwości granicznej niższej (0.1Hz, czyli stałej czasowej 10s)
wymagałoby użycia kondensatorów o dużej pojemności, znacząco zwiększając
powierzchnię układu scalonego. Ponadto, w przypadku wystąpienia zakłócenia o wysokiej
amplitudzie, przesterowania filtru i naładowania kondensatora do napięcia
przekraczającego zakres dynamiczny pracy układu, filtr (i tym samym cały kanał odczytu)
na rozładowanie zgromadzonego ładunku potrzebował będzie czasu wielokrotnie
dłuższego od stałej czasowej. Kolejny stopień kanału musi zostać zatem opracowany
w taki sposób, aby działał niezależnie od poziomu napięcia stałego na wyjściu
przedwzmacniacza.
3.2.2. Filtry pasmowo-przepustowe
Architektura filtrów pasmowo-przepustowych opiera się na koncepcji stosowanej
w poprzednich generacjach układów scalonych [57]. Koncepcja działania przedstawiona
została na Rysunku 3-18. Filtr pasmowo-przepustowy składa się z dwóch filtrów
dolnoprzepustowych (Rhf, Chf oraz Rlf, Clf) połączonych z wejściami wzmacniacza
różnicowego. Sygnały podawane przez filtr odpowiadający za niższą częstotliwość
graniczną (Rlf, Clf) są odejmowane od sygnałów podawanych na wejście nieodwracające.
W ten sposób, sygnały o częstotliwościach
Rysunek 3-18: Schemat ilustrujący koncepcję działania filtru pasmowo-przepustowego.
poniżej dolnej częstotliwości granicznej podawane są na oba wejścia wzmacniacza
różnicowego, czyli jako sygnał wspólny, który nie jest wzmacniany przez wzmacniacz
różnicowy. Wynika stąd ważny wniosek - aby uzyskać dobre tłumienie w zakresie poniżej
dolnej częstotliwości granicznej wzmacniacz różnicowy musi cechować się wysokim
współczynnikiem tłumienia sygnału wspólnego (Common Mode Rejection Ratio - CMMR).
Sygnały pomiędzy dolną i górną częstotliwością graniczną są podawane na dodatnie
wejście wzmacniacza, tłumione są przez filtr połączony z wejściem ujemnym, zatem w tym
zakresie częstotliwości sygnały są wzmacniane jako sygnał różnicowy. Powyżej górnej
częstotliwości granicznej tłumią oba filtry RhfChf i RlfClf, sygnały nie będą zatem
przenoszone przez wzmacniacz. Wypadkowa charakterystyka jest charakterystyką filtru
pasmowo-przepustowego.
Schemat elektryczny filtru pasmowo przepustowego przedstawia Rysunek 3-19.
Funkcję wzmacniacza różnicowego pełni wzmacniacz z parą tranzystorów różnicowych
54
pmos (M7-M12). Filtry dolnoprzepustowe zbudowane zostały z tranzystorów (M13, M14)
i kondensatorów z polikrzemu (C1, C2). Sygnał wejściowy (LF_INPUT) podawany jest na
źródła tranzystorów M13 i M14, dreny tych tranzystorów połączone są z okładkami
kondensatorów i wysokoimpedancyjnymi wejściami wzmacniacza (bramki tranzystorów
M7, M8). Ten sposób połączenia sprawia, że przez tranzystory M13, M14 prąd drenu nie
płynie, więc utrzymywane są one w liniowym zakresie pracy. Wzmacniacz operacyjny
w układzie odejmującym (z oznaczonym poborem mocy 10µA) pozwala podać sygnał
wejściowy przesunięty o wartość napięcia kontrolnego LF_CTR na bramki tranzystorów
M13, M14. Utrzymywanie stałego napięcia LF_CTR pomiędzy źródłem a bramką
tranzystorów M13, M14 pozwala zachować liniowość, a zmiana napięcia LF_CTR
umożliwia sterowanie stałą czasową filtrów poprzez zmianę rezystancji RDS (miedzy
drenem a źródłem) tranzystorów M13, M14.
Rysunek 3-19: Filtr pasmowo przepustowy: M7-M12 – wzmacniacz różnicowy, M13,C1 – filtr na
wejściu odwracającym, M14,C2 – filtr na wejściu nieodwracającym, wzmacniacz
operacyjny w układzie odejmującym pełni rolę przesuwnika napięcia dla sterowania
pasmem przenoszenia.
Schemat małosygnałowy filtru przedstawiony został na Rysunku 3-20.
Rysunek 3-20: Schemat małosygnałowy filtru pasmowo przepustowego.
Tranzystory M13 i M14 zastąpione zostały rezystancjami dren-źródło rds13 i rds14.
Transmitancja filtru może zostać zapisana jako:
55
( )
(
⁄
)
(
(
)
)(
(
⁄
))
3-10
gdzie gm – transkonduktancja odpowiedniego tranzystora, rds – rezystancja dren-źródło.
Dolna częstotliwość graniczna wynosi:
3-11
Pojemność C2 jest mnożona przez wzmocnienie wzmacniacza gm8RL dzięki efektowi Millera
[58]. Mnożenie pojemności umożliwia uzyskanie odpowiedniej stałej czasowej filtru przy
użyciu mniejszego kondensatora, co pozwala zmniejszyć powierzchnię układu scalonego.
Górna częstotliwość graniczna opisana jest wzorem:
(
⁄
)
3-12
Jeżeli bieguny różnią się przynajmniej o rząd wielkości, czyli spełniony jest warunek:
⁄
(
)
3-13
Wzmocnienie w zakresie pomiędzy dolną i górną częstotliwością graniczną wynosi:
(
)
3-14
Z tego właśnie powodu, oba rezystory M13 i M14 kontrolowane są tym samym napięciem
LF_CTR. Zapewnia to utrzymanie stałej wartości
, dzięki czemu wzmocnienie
pozostaje stałe niezależnie od częstotliwości granicznych. Równoległe sterowanie
rezystancjami M13 i M14 powoduje też, że częstotliwości odcięcia przesuwają się
proporcjonalnie w skali logarytmicznej, tzn. szerokość pasma przenoszenia pozostaje
stała, natomiast częstotliwości graniczne zmieniają się o ten sam wykładnik.
Rysunek 3-21: Filtr pasmowo przepustowy – kanał dla częstotliwości od kilkuset do kilku tysięcy
Hz.
Filtr pasmowo przepustowy dla zakresu częstotliwości odpowiadających potencjałom
czynnościowym zaprezentowany został na Rysunku 3-21. Zastosowana architektura jest
podobna do filtru przeznaczonego do rejestracji potencjałów polowych. Różnica polega na
zastosowaniu wzmacniacza różnicowego obciążonego diodami (M17, M18) zamiast
56
lustrem prądowym (M9, M10, Rysunek 3-19). Po modyfikacji schematu małosygnałowego
i przekształceniu wzoru 3-10, otrzymujemy wyrażenia na dolną:
(
⁄
)
3-15
⁄
)
3-16
i górną częstotliwość graniczną omawianego filtru:
(
Z powyższych wzorów wynika, że wartości obu kondensatorów C3 i C4 są mnożone
w wyniku efektu Millera przez wzmocnienie różnicowe wzmacniacza. Zastosowane
zostały pojemności C3 = 0.8 pF i C4 = 2 pF.
3.2.3. Wzmacniacze wyjściowe
Schemat blokowy wzmacniacza wyjściowego przedstawiony został na Rysunku 3-22.
Wzmacniacz zawiera dwa wtórniki napięciowe separujące właściwy wzmacniacz od
poprzedniego stopnia, filtru pasmowo-przepustowego. Część wzmacniająca została
zrealizowana jako wzmacniacz różnicowy z przełączanymi rezystancjami w sprzężeniu
zwrotnym (klucze sw1, sw1’, sw2, sw2’). Aby móc ładować w odpowiednio krótkim czasie
kondensator pamiętający w komórkach próbkująco-pamiętających multipleksera,
zastosowany został bufor wyjściowy o poborze prądu 15µA.
Rysunek 3-22:
Schemat blokowy wzmacniacza wyjściowego. Na każdym wzmacniaczu
operacyjnym podano całkowity pobór prądu.
Fotografia układu scalonego NEURO2 została przedstawiona na Rysunku 3-23.
Wymiary pojedynczego kanału odczytu to 80 µm ⨯ 1900 µm. Pobór prądu wynosi 240 µA,
przy zasilaniu napięciem 3.3 V pobór mocy wynosi 790 µW na kanał.
Rysunek 3-23: Fotografia układu NEURO2. Wymiary układu scalonego 1700 µm ⨯ 2600 µm.
57
3.2.4. Wyniki pomiarów charakterystyk częstotliwościowych i liniowości
Na Rysunku 3-24 przedstawione zostały charakterystyki częstotliwościowe filtrów
pasmowo przepustowych (Rysunki 3-19 i 3-21). Częstotliwości graniczne mogą być
sterowane napięciami LF_CTR w zakresie 1,5 dekady dla filtru niskich częstotliwości oraz
napięciem HF_CTR w zakresie 2,5 dekady, przy zachowaniu szerokości pasma w skali
logarytmicznej.
Rysunek 3-24: Charakterystyki częstotliwościowe filtrów pasmowo przepustowych. Legenda
oznacza różne napięcia kontrolne LF_CTR i HF_CTR
Aby oszacować liniowość układu odczytu przeprowadzone zostały testy polegające na
stopniowym zwiększaniu amplitudy sygnału sinusoidalnego na wejściu i pomiarze
wartości międzyszczytowej napięcia wyjściowego. Wyniki pomiarów oraz błąd
nieliniowości przedstawione zostały na Rysunku 3-25.
Rysunek 3-25: Napięcia wyjściowe w funkcji napięcia wejściowego (wartość międzyszczytowa
napięcia
sinusoidalnego)
i
nieliniowość
całkowa
dla
kanału
nisko
i wysokoczęstotliwościowego.
58
3.3. Multiplekser analogowy
W podrozdziale 2.4.1 omówione zostały problemy przesłuchu sygnału zegarowego,
wymaganie minimalizacji poboru mocy oraz konieczność multipleksowania sygnałów
o różnych pasmach częstotliwości. Spełnienie tych założeń wymaga opracowania nowej
sekwencji pracy komórek pamięci, jak również optymalizacji parametrów analogowych
pod kątem minimalizacji poboru mocy przy zachowaniu liniowości.
3.3.1. Architektura i zasada działania multipleksera
Schemat blokowy 64 kanałowego multipleksera analogowego został przedstawiony na
Rysunku 3-26.
Rysunek 3-26: Schemat blokowy multipleksera analogowego.
Multiplekser analogowy składa się z trzech głównych bloków funkcjonalnych:
A) Blok 64 komórek próbkująco-pamiętających (S&H), każda z dwoma wejściami,
odpowiednio dla kanału przenoszącego niskie (IN_LOW) oraz wysokie
częstotliwości (IN_HIGH). Multiplekser posiada łącznie 128 wejść analogowych.
B) Rejestr przesuwny – podzielony jest na 8 bloków shift_register_block<0:7>.
Podział rejestru przesuwnego na 8 bloków związany jest z pracą w trybie 64H+8L,
czyli odczytem 64 kanałów wysokoczęstotliwościowych i sekwencyjnym odczycie
kanałów niskoczęstotliwościowych po 8 w pojedynczej sekwencji odczytowej.
C) Moduł kontrolny MUX_INIT – rozpoczyna sekwencję odczytu inicjalizowany
sygnałem HOLD_EXT. Generuje sygnały kontrolne dla pozostałych bloków,
resetuje
rejestr
przesuwny,
kontroluje
kolejność
odczytu
kanałów
niskoczęstotliwościowych uporządkowanych w 8 elementowe grupy.
59
Sygnały HOLD_L i HOLD_H odpowiadają za połączenie kondensatorów pamiętających
z wyjściami odpowiednio kanałów nisko i wysokoczęstotliwościowych, czyli zapamiętanie
napięć wyjściowych z kanałów. Sygnały cyfrowe sterujące odczytem napięć z komórek
próbkująco-pamiętających generowane są w rejestrze przesuwnym. Rejestr składa się
z 8 bloków – każdy z bloków shift register block kontroluje odczyt zapamiętanego
napięcia z 8 układów S&H. Kombinacja wartości sygnałów mode0 i mode1 pozwala
wybrać tryb pracy multipleksera.
Multiplekser działa na zasadzie „Czytaj próbki na żądanie”, gdzie „Żądanie”
oznacza wysoki stan sygnału HOLD_EXT trwający minimum 5 cykli zegara. Jeżeli chcemy
próbkować z częstotliwością np. 20kHz, sygnał HOLD_EXT musi być cyklicznie wysyłany
do układu MUX_INIT co 50ms. Po zakończonej sekwencji odczytowej multiplekser
przechodzi automatycznie do stanu zresetowania w celu rozładowania napięć
resztkowych na kondensatorach pamiętających. Resetowanie może zostać wymuszone
zewnętrznym sygnałem RESETN (w logice negatywnej).
3.3.2. Komórka pamięci i wzmacniacz operacyjny
Komórka pamięci analogowej musi spełniać wymagania precyzji odtwarzania
napięcia, liniowości, niskiego poboru mocy. Istnieje wiele rozwiązań układów próbkującopamiętających opisanych w literaturze [55], jednak układy te nie umożliwiają spełnienia
wymagań, jakie zostały postawione dla tego projektu. Przedstawiany układ próbkującopamiętający zaprojektowany został jako 2-komórkowa pamięć analogowa z buforem
w postaci wzmacniacza operacyjnego. Układ zbudowany jest z dwóch kondensatorów
pamiętających CL, i CH, na których zatrzaskiwane są napięcia odpowiednio na wejściach
IN_LOW i IN_HIGH, wzmacniacza operacyjnego i 10 kluczy komplementarnych CMOS.
Schemat komórki pamięci przedstawiony został na Rysunku 3-27.
Rysunek 3-27: Komórka pamięci analogowej z dwoma kondensatorami pamiętającymi – 4 tryby
pracy: Resetowania (RESET), oczekiwania (IDLE), zapamiętywania (HOLD) i odczytu (READ).
60
Komórka pamięci posiada 4 tryby pracy:
 RESET – wzmacniacz operacyjny pracuje w trybie wtórnika napięciowego, klucz B
jest zamknięty, zamykając pętlę ujemnego sprzężenia zwrotnego i jednocześnie
zwierając okładki kondensatorów pamiętających. Pozwala to na rozładowanie
napięć resztkowych przed przejściem w tryb zapamiętywania (HOLD)
 HOLD – klucze Hold_L i Hold_H zostają zamknięte i naładowane do napięcia
wyjściowego w kanałach. Wzmacniacz operacyjny pracuje w układzie wtórnika.
 IDLE – tryb oczekiwania. Napięcie, do którego kondensatory zostały naładowane
w trybie HOLD pozostaje „zapamiętane” w oczekiwaniu na odczyt (READ).
 READ – tryb odczytu, odpowiedni kondensator CL lub CH zostaje włączony w pętlę
sprzężenia zwrotnego wzmacniacza operacyjnego, co powoduje ustalenie się na
jego wyjściu napięcia równego napięciu na kondensatorze CL lub CH. wyjście
wzmacniacza zostaje połączone z linią wyjściową multipleksera poprzez klucz C.
Podczas multipleksowania, kolejne komórki pamiętające muszą przeładowywać linię
wyjściową (MUX_OUT, Rysunek 3-26) napięciem z zakresu +/-1.5V (zakres dynamiczny
pracy kanału odczytu) w ciągu połowy okresu multipleksowania (czyli 100ns). Pojemność
pasożytnicza linii wyjściowej według danych technologicznych oszacowana została na
3pF. Oznacza to, że wzmacniacz operacyjny musi być w stanie przeładować pojemność
3pF w czasie poniżej 100ns o wartość napięcia 3.0 V, jeśli w sąsiadujących kanałach
wystąpiły napięcia na dolnej i górnej granicy zakresu dynamicznego. Oprócz odpowiednio
szerokiego pasma przenoszenia, wzmacniacz musi cechować się dużą szybkością
narastania sygnału wyjściowego (ang. Slew Rate). Aby spełnić te wymagania nie
powodując wzrostu poboru mocy, wybrana została architektura wzmacniacza
operacyjnego klasy AB. Wzmacniacz tego typu jest w stanie wysterować duże obciążenia
pojemnościowe na wyjściu, dynamicznie zwiększając pobór mocy tylko w trakcie zmian
napięcia, zachowując minimalny pobór mocy w stanie spoczynkowym. Wybrana
architektura została zaprezentowana na Rysunku 3-28.
Rysunek 3-28: Wzmacniacz operacyjny z pływającym źródłem prądowym.
Szeroki zakres napięć wejściowych uzyskany został dzięki zastosowaniu
komplementarnej pary wzmacniaczy wejściowych (NMOS INPUT i PMOS INPUT). Są
to konwencjonalne wzmacniacze z parami tranzystorów wejściowych typu n i p,
61
z obciążeniem w postaci lustra prądowego, każdy o poborze mocy 20 µA [59]. Wadą
zastosowania wejściowej pary wzmacniaczy komplementarnych jest zmienna
transkonduktancja stopnia wejściowego, zależna od poziomu napięcia wspólnego, która
spada o ok. połowę w zakresie napięć bliskich napięciom zasilania [60]. W praktyce, jak
pokazuje Rysunek 3-25, dynamiczny zakres napięć wyjściowych kanału wzmacniacza
nie przekracza +/-1.5 V (przy napięciu zasilania +/-1.65 V). Ponadto, wzmacniacz
pracuje tylko w układzie wtórnika napięciowego, więc wpływ zmiennej
transkonduktancji jest zminimalizowany poprzez ujemne sprzężenie zwrotne.
Stopień wyjściowy to wzmacniacz klasy AB z tranzystorami wyjściowymi M7 i M8,
które są sterowane przez wyjścia wzmacniaczy pierwszego stopnia. Tranzystory M3
i M6 tworzą tzw. pływające źródło prądowe. Pary tranzystorów M1, M2 oraz M4, M5
ustalają napięcia polaryzacyjne odpowiednio dla tranzystorów M3 i M6. Prąd
spoczynkowy tranzystorów wyjściowych M7 i M8 ustalany jest poprzez pętle prądowe
M1,M2, M3, M7 oraz M4, M5, M6, M8. Prąd referencyjny Ib, zależy od wymiarów
diód M1 i M4, spoczynkowy prąd wyjściowy Iout wynosi:
( ⁄ )
( ⁄ )
( ⁄ )
( ⁄ )
3-17
Wymiary tranzystorów M2 i M3 zostały ustalone na W/L=4µm/0.4µm, tranzystorów
M5 i M6 na W/L=2.5 µm / 0.5 µm.
Stabilność częstotliwościową wzmacniacza zapewnia kompensacja za pomocą
kondensatorów C1 i C2 (których pojemność mnożona jest dzięki efektowi Millera [60]
przez czynnik równy wzmocnieniu stopnia wyjściowego), szeregowo połączonych
z rezystorami R1 i R2. Szybkość narastania napięcia w odpowiedzi na sygnał duży (Slew
Rate) zależy od prądu wyjściowego pierwszego stopnia wzmacniacza, którego wartość
20µA przy obciążeniu wyjścia pojemnością 4pF zapewnia szybkość narastania 25V/µs.
Przebiegi napięć wyjściowych multipleksera, dla napięć +1.30V i -1.30V
zarejestrowane oscyloskopem cyfrowym zaprezentowane zostały na Rysunku 3-29.
Przebiegi te odzwierciedlają parametry elektryczne wzmacniacza operacyjnego
zaprojektowanego dla komórki pamięci analogowej.
Rysunek 3-29: Napięcie wyjściowe multipleksera podczas odczytu z komórek, w których
zapamiętane zostały napięcia +1.3V (po lewej) i -1.3V (po prawej).
62
3.3.3. Rejestr przesuwny, blok logiki kontrolnej i 4 tryby pracy.
W rozdziale 2.4.1 przedstawiony został problem pasożytniczego wstrzykiwania
ładunku poprzez rejestr przesuwny podczas zmiany stanu logicznego zegara. Aby
rozwiązać ten problem, opracowana została nowa koncepcja rejestru przesuwnego.
Zaproponowana architektura rejestru przesuwnego opiera się na podobnej koncepcji,
co transfer danych cyfrowych w standardzie DDR (ang. Double Data Rate), czyli
wyzwalaniu pewnej akcji w wyniku pojawienia się zarówno narastającego jak
i opadającego zbocza zegarowego. Jeżeli nominalna częstotliwość multipleksowania ma
wynosić 5MHz, to częstotliwość zegara powinna być równa 2.5 MHz. Przebieg sygnałów
cyfrowych wyzwalających odczyt w kolejnych komórkach pamięci multipleksera oraz
fragment schematu rejestru przesuwnego przedstawiony został na Rysunku 3-30.
Szeregowo połączone przerzutniki Flip-Flop zostały uzupełnione o bramki AND. Trzy
wejścia bramek połączone są z naprzemiennymi wyjściami przerzutników oraz sygnałem
zegarowym, prostym (CLK) oraz odwróconym (NCLK). W ten sposób wędrująca „1”,
pojawia się na wyjściach kolejnych bramek AND przy każdej zmianie stanu logicznego
zegara CLK. Wybrany sposób połączeń logicznych uniemożliwia pojawienie się „1”
w sąsiadujących kanałach jednocześnie, co zapobiega równoczesnemu połączeniu wyjścia
dwóch układów próbkująco-pamiętających z linią wyjściową multipleksera.
Rysunek 3-30: Przebiegi napięć wyjściowych rejestru przesuwnego
koncepcyjny rejestru przesuwnego z „wędrującą jedynką”.
oraz
schemat
Zaproponowana architektura rozwiązuje problem pasożytniczego przesłuchu zegara
multipleksera (Rysunek 2-11), jednak wyjście multipleksera połączone musi być
z zewnętrznym układem ADC, który potrzebuje sygnału wyzwalającego rozpoczęcie
próbkowania i przetwarzania wartości analogowej na cyfrową. Sygnał ten wygenerowany
musi być przez generator zewnętrzny, zsynchronizowany z sygnałem HOLD. Przesłuchy
tego i innych sygnałów cyfrowych mogą jednak zostać zminimalizowane poprzez
staranne zaprojektowanie masek topologicznych układu scalonego.
W założeniu, multiplekser powinien umożliwiać zapamiętywanie i odczyt napięć
z kanałów nisko i wysokoczęstotliwościowych na 4 sposoby w zależności od typu
planowanego eksperymentu. Tabela 3.1 przedstawia zestawienie dostępnych trybów
pracy:
63
Tabela 3.1 Tryby pracy multipleksera oraz wartości logiczne sygnałów mode0 i mode1
Symbol trybu pracy
mode1
mode0
Odczytywane kanały
64H+64L
0
1
64 IN_HIGH, 64IN_LOW
64H
0
0
64 IN_HIGH
64L
1
0
64 IN_LOW
64H+8L
1
1
64 IN_HIGH, 8/64 IN_LOW
Działanie multipleksera, sterowane modułem MUX_INIT (Rysunek 3-26), przedstawione
zostało w postaci diagramu stanów na Rysunku 3-31. Po rozpoczęciu pracy układu
(START, resetowanie po włączeniu zasilania) układ przechodzi do stanu bezczynności
(IDLE) i oczekiwania na pojawienie się sygnału hold. Zbocze narastające hold powoduje
rozpoczęcie ładowania kondensatorów w układach próbkująco-pamiętających, zbocze
opadające odłącza kondensatory pamiętające. W zależności od wartości sygnałów mode0
i mode1 (oznaczonych jako mode) ładowane są kondensatory w kanałach
wysokoczęstotliwościowych (64H), niskoczęstotliwościowych (64L), lub obu jednocześnie
(64H + 64L). Układ MUX_INIT generuje sygnał READ_IN, który rozpoczyna sekwencję
multipleksowania – w zależności od wybranego trybu, jest to odczyt kanałów 64H, 64L,
64H+64L lub 64H+8/64L. W trybie 64H+8/64L, moduł MUX_INIT uruchamia licznik
3-bitowy, inkrementowany po każdym cyklu multipleksowania (pojawieniu się zbocza
narastającego sygnału MUX_SEQ_END). Wartość tego licznika wystawiana jest na
magistralę CODE<2:0>. Rejestr przesuwny, podzielony jest na sekcje po 8 kanałów. Każda
sekcja posiada detektor 3-bitowej wartości odczytywanej z magistrali CODE<2:0>.
Rysunek 3-31:
Graf stanów multipleksera analogowego. Ze stanu bezczynności (IDLE)
multiplekser rozpoczyna próbkowanie (HOLD) i odczyt wybranego zestawu kanałów.
64
W zależności od wartości „n”, bezpośrednio po zakończeniu multipleksowania kanałów
64H, spośród kanałów 64 IN_LOW multipleksowane są kanały o numerach od (n-1)*8 do
n*8-1. We wszystkich trybach, po zakończeniu multipleksowania, przez jeden okres
zegara sygnał MUX_SEQ_END przyjmuje wartość wysoką. W trybach pracy 64H, 64L,
64H+64L multiplekser przechodzi do stanu „RESET 64H+64L”, co oznacza, że
wzmacniacze operacyjne w komórkach próbkująco-pamiętających przełączane są w tryb
wtórników napięciowych, a wszystkie kondensatory są rozładowywane. Przejście do
trybu RESET 64H oznacza, że resetowane są tylko kondensatory pamiętające w kanałach
wysokoczęstotliwościowych.
65
4. ANALIZA STATYSTYCZNA AKTYWNOŚCI DUŻEJ LICZBY KOMÓREK NERWOWYCH
W rozdziale 4. opisane zostaną metody poszukiwania połączeń funkcjonalnych na
podstawie zapisu aktywności elektrycznej neuronów. W ciągu kilku dziesięcioleci
rozwijania metod rejestracji równolegle opracowywane były metody poszukiwania
zależności i związków przyczynowo-skutkowych w rejestrowanych ciągach potencjałów
czynnościowych. Rozwijana od lat 80 XX w. technologia matryc mikroelektrod umożliwia
równoczesną rejestrację aktywności nawet kilkuset neuronów, stawiając przed badaczami
nowe wyzwania w dziedzinie analizy danych. Transformacja informacji z postaci
aktywności elektrycznej na strukturę sieci neuronów wraz z połączeniami funkcjonalnymi
nie jest zadaniem trywialnym. Istnieje wiele metod poszukiwania połączeń funkcjonalnych
pomiędzy neuronami. Każda z nich pozwala uzyskiwać informacje o nieco innym
charakterze. Metody poszukiwania połączeń funkcjonalnych podzielić można na
bezkierunkowe oraz kierunkowe.
W części eksperymentalnej, jako narzędzie rejestracji sygnałów z komórek
nerwowych, wykorzystywany był system 512 elektrodowy opisany w rozdziale 2.3. Celem
prowadzonych przez autora rozprawy prac było uzyskanie jak największej ilości
informacji na temat topologii połączeń występujących w badanych kulturach
organotypowych hipokampa mózgu myszy. Metoda korelacji wzajemnej (ang. CrossCorrelation) została wybrana jako punkt wyjściowy do bardziej złożonej analizy. Pozwala
ona wyekstrahować informacje dotyczące istnienia połączeń funkcjonalnych, ich typu
i kierunku. Pozwala też uzyskać informacje na temat dynamiki połączeń synaptycznych.
Odtworzone z rejestracji elektrycznej mapy połączeń funkcjonalnych do pewnego stopnia
mogą też zostać użyte w celu określenia typu wykrytej komórki nerwowej.
4.1. Preparatyka wycinków mózgu myszy, hodowanie kultur i rejestracja
aktywności elektrycznej neuronów hipokampa i kory mózgowej
Przygotowanie preparatu – wycinka mózgu przeznaczonego do badań, wymaga
uśmiercenia myszy. Czynność ta musi być wykonana zgodnie z obowiązującymi we
współczesnej nauce standardami etycznymi. Pierwszym etapem jest uspokojenie myszy.
Zwierzę umieszcza się plastikowym kontenerze, do którego wkłada się wacik nasączony
halotanem. Zapobiega to stresowi i tzw. „drgawkom pośmiertnym” w czasie czynności
chirurgicznych. Silny stres wywołany gwałtownym traktowaniem (łapanie, długotrwałe
uśmiercanie) spowodowałby uwolnienie do krwi dużej ilości hormonów stresu
(adrenaliny, noradrenaliny i innych), które mają bezpośredni wpływ na działanie
ośrodkowego układu nerwowego. Do pojemnika pompowany jest czysty tlen wraz ze
środkiem usypiającym (Izofluran w stężeniu >5%), co trwa zwykle kilka minut. Zejście
śmiertelne ocenia się poprzez obserwację braku ruchów klatki piersiowej.
Następnie mysz umieszczana jest na stole chirurgicznym. Wycięcie mózgu rozpoczyna
się od odcięcia głowy za pomocą nożyczek chirurgicznych. Na odciętej głowie myszy
wykonuje się nacięcie skóry wzdłuż płaszczyzny strzałkowej od centralnej części szyi
symetrycznie w kierunku nosa, rozciętą symetrycznie skórę odchyla się na boki.
Za pomocą nożyczek chirurgicznych przecina się czaszkę – również symetrycznie
w płaszczyźnie strzałkowej od strony szyi w kierunku nosa. Po rozcięciu czaszki podobnie
postępujemy z oponami mózgowymi, mającymi postać cienkich, białych błon. Mózg
wyjmujemy delikatnie za pomocą małej łyżeczki, umieszczamy na krystalizatorze
66
w pozycji anatomicznej. Za pomocą skalpela odcinamy móżdżek, trzymając skalpel
pochylony pod kątem 30 stopni do podłoża. Mózg rozcinamy na dwie półkule. Wybraną
półkulę przyklejamy do statywu mikrowibrotomu za pomocą kleju cyjanoakrylowego do
zastosowań laboratoryjnych, półkula przyklejona jest płaszczyzną powstałą po odciętym
móżdżku. Mózg cięty jest za pomocą mikrowibrotomu na plasterki grubości 400μm,
bezpośrednio po cięciu plasterki wpadają do natlenianego roztworu 252 mM cukrozy, 2.5
mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 1.25mM NaH2PO4 i 10mM glukozy.
Techniki preparatyki kultur organotypowych oraz dobór składu roztworów do tego celu
stosowanych stanowią szeroką gałąź badań w neurobiologii [61].
Wycinki mózgu myszy hodowane były na krystalizatorach, umieszczanych
w inkubatorze zapewniającym stałe warunki temperatury i atmosfery (95% O2, 5% CO2).
Wnętrze inkubatora musi być sterylnie czyste, ponadto do roztworu który przykrywa
skrawki dodaje się antybiotyk (penicylina), aby zapobiec rozwojowi bakterii mogących
doprowadzić do rozkładu tkanki.
Poważnym problemem jest uzasadnienie stosowania kultur hodowanych z wycinków
mózgu w badaniach neurobiologicznych [62]. Wielu badaczy uważa wycinki hodowane
in vitro za zbyt odbiegające od rzeczywistych układów biologicznych. W procesie cięcia
plasterków następuje zniszczenie granicznej warstwy neuronów. W czasie hodowania
tkanek następuje rozkład i „oczyszczenie” martwej warstwy komórek. Nie jest
jednoznaczne, czy w ciągu kilku dni hodowli struktura połączeń synaptycznych lub
samych neuronów nie ulegnie modyfikacji w efekcie czego badany materiał będzie bardzo
mocno różnił się od skrawka w chwili pobrania.
Eksperymenty z użyciem pierwszych modeli matryc mikroelektrod, prowadzone były
na przykład w roku 1998 w Instytucie Nauk Przyrodniczych i Medycznych Uniwersytetu
Reutlingen w Niemczech [63]. Fotografie na Rysunku 4-1 przedstawiają przebieg hodowli
kultury organotypowej wycinka hipokampu. Pomimo zatarcia się wyraźnych struktur
warstwowych, obserwacja neuronów wybarwionych błękitem toluidynowym świadczy
o zachowaniu ich struktury i położenia po hodowli. Również w pracy [64] kultury
organotypowe przedstawione zostały jako wiarygodna technika pozyskiwania informacji
o działaniu żywych sieci neuronowych ze względu na zachowanie podstawowej struktury
komórek i organizacji połączeń ekstrahowanej tkanki.
Innym potencjalnym problemem jest przeżywalność neuronów. Komórki martwe
można wykryć w obrazie mikroskopowym za pomocą barwienia znacznikiem
fluorescencyjnym
DAPI
(4',6-diamidyno-2-fenyloindol), który wykazuje silne
powinowactwo do DNA, ale nie przenika łatwo przez błony komórkowe. Barwienie
fluorescencyjne martwych neuronów po 10 dniach hodowli prowadzi do znalezienia
pomijalnej frakcji martwych neuronów [63]. Umieralność neuronów można również
zminimalizować stosując odpowiednie techniki preparatyki kultur, w szczególności
poprzez użycie w procesie hodowli roztworów zawierających magnez
i potas
w odpowiednich stężeniach [65].
67
Rysunek 4-1: Hodowla kultury organotypowej hipokampu na matrycy mikroelektrod (mysz
6-dniowa). a) początek inkubacji, wyraźnie widoczne struktury warstwowe, b) neurony
wybarwione chemicznie błękitem toluidynowym 10 dni od rozpoczęcia inkubacji,
c) powiększenie wybarwionych komórek 23 dni od rozpoczęcia inkubacji. Szerokości
znaczników skali rysunku: a) 800μm, b) 300μm, c) 100μm [63].
4.2. Wstępna analiza danych – wykrywanie i sortowanie potencjałów
czynnościowych
Aktywność elektryczna neuronów rejestrowana jest w postaci wartości napięcia
próbkowanego na elektrodach. Na każdej elektrodzie może zostać zarejestrowana
aktywność wielu neuronów, jak również pojedynczy neuron może pobudzać kilka
elektrod. Rozróżnienie aktywności pojedynczych neuronów dokonywane jest na
podstawie charakterystycznego kształtu potencjału czynnościowego pochodzącego od
danego neuronu. Pierwszym krokiem jest identyfikacja momentów czasowych, w których
wystąpiły potencjały czynnościowe. Znajdywane są punkty, w których amplituda
przekroczyła, a następnie opadła poniżej pewnego progu (zazwyczaj 60μV) napięcia. Do
kolejnych etapów analizy używa się tylko danych od 0.5ms przed przekroczeniem progu
do 0.8ms po przekroczeniu progu, eliminując okresy rejestracji, podczas których nie
wykryto aktywności.
Automatyczne sortowanie potencjałów czynnościowych wykonywane było za pomocą
oprogramowania rozwijanego od kilku lat przez zespół z Santa Cruz. Podstawą jego
działania jest Analiza Głównych Składowych. Dla celów poszukiwania połączeń
funkcjonalnych, potencjały czynnościowe sprowadza się do postaci szeregów czasowych
oznaczających momenty ich wystąpienia, pomijając kształt zarejestrowanych przebiegów
napięcia. Szczegółowy opis algorytmu sortowania potencjałów czynnościowych opisany
został w Dodatku A.
68
4.3.
Metody poszukiwania połączeń funkcjonalnych pomiędzy neuronami
Po rozwiązaniu kwestii obrazowania aktywności elektrycznej, przygotowania kultur,
wykonaniu eksperymentu, sortowaniu potencjałów czynnościowych i wyodrębnieniu
aktywności pojedynczych neuronów, pojawia się pytanie – co zrobić z uzyskanymi
danymi? W jaki sposób stwierdzić, że pomiędzy wybraną parą neuronów występuje jakieś
oddziaływanie?
Na pytania dotyczące połączeń funkcjonalnych pomiędzy neuronami próbuje się
odpowiedzieć przy użyciu metod obliczeniowych stosowanych w neurobiologii, które
mają na celu detekcję połączeń funkcjonalnych pomiędzy neuronami. Podstawowy podział
tych metod to podział na metody bezkierunkowe i kierunkowe. Metody bezkierunkowe
dostarczają informacji o związku aktywności jednego neuronu z aktywnością drugiego,
metody kierunkowe dostarczają również szczegółów na temat kierunku, charakterze oraz
dynamice połączenia. W dalszej części przeprowadzona zostanie dokładna analiza metody
opartej na funkcji korelacji wzajemnej, wybranej przez autora pracy do zastosowania
w analizie danych z eksperymentów prowadzonych na Uniwersytecie Kalifornijskim
w Santa Cruz.
4.3.1. Metody bezkierunkowe – metoda informacji wzajemnej
Jedną z metod określania istnienia połączeń funkcjonalnych jest metoda informacji
wzajemnej (ang. Mutual Information) [66]. Informacja wzajemna dla pary neuronów jest
obliczana na podstawie prawdopodobieństwa koincydencji potencjałów oraz
prawdopodobieństwa wystąpienia potencjałów czynnościowych poszczególnych
neuronów jako:
( )
( )
∑∑ ( )
(
)
4-1
( ) ( )
gdzie x, y reprezentują liczbę pojedynczych potencjałów czynnościowych w określonym
oknie czasowym, p(x,y) oznacza prawdopodobieństwo wystąpienia x aktywacji neuronu X
i y aktywacji neuronu Y w określonym oknie czasowym, p(x) i p(y) wyrażają
prawdopodobieństwa aktywacji neuronów X lub Y, niezależnie od drugiego neuronu.
Poprawne określenie powyższych prawdopodobieństw wymaga odpowiednio dużej
liczby zarejestrowanych potencjałów. Równanie Informacji Wzajemnej jest symetryczne
względem zmiennych X i Y, przez co nie dostarcza informacji na temat kierunku ani tego,
który neuron generował, a który odbierał potencjał czynnościowy. Metoda Informacji
Wzajemnej, podobnie jak inne metody bezkierunkowe, np. Metoda Największego
Prawdopodobieństwa (z ang. Most Likelihood Method), reprezentują spojrzenie na analizę
danych w sposób statystyczny, badając wystąpienie zdarzeń z pominięciem procesów
fizycznych, jakie są ich przyczyną [67] [68].
4.3.2. Metody kierunkowe - Entropia Przejściowa
Przykładem metody, która ocenia zarówno siłę połączenia, jak i jego kierunek, jest
entropia przejściowa. Entropia przejściowa jest techniką obliczeniową z dziedziny teorii
informacji. Zastosowanie tej metody ma na celu znalezienie zależności w aktywności par
neuronów. W przeciwieństwie do informacji wzajemnej, entropia przejściowa uwzględnia
kierunek oddziaływania rozróżniając, który neuron spowodował aktywację
(presynaptyczny), a który był aktywowany (postsynaptyczny). Bierze również pod uwagę
69
historię aktywności neuronów, jest wrażliwa na interakcje między neuronami
o charakterze liniowym, jak i nieliniowym [69].
Jeśli oznaczymy przez xt liczbę potencjałów czynnościowych (w serii zarejestrowanych
potencjałów neuronu X) przypadających na wybrane okno czasowe, wówczas możemy
zdefiniować wektor liczby aktywacji w poprzednich m oknach czasowych:
(
)
4-2
Biorąc pod uwagę drugi przebieg czasowy aktywacji neuronu Y i wektor zliczeń
potencjałów czynnościowych w kolejnych przedziałach czasowych , funkcję entropii
przejściowej możemy zdefiniować następująco [70]:
|
(
)
∑
(
) (
)
4-3
| )
(
gdzie
(
) oznacza prawdopodobieństwo wystąpienia potencjału
czynnościowego neuronu X w oknie czasowym następującym po oknie, w którym
wystąpiła aktywacja neuronów X i Y, (
|
) - prawdopodobieństwo wystąpienia
potencjału czynnościowego neuronu X pod warunkiem wystąpienia potencjału neuronów
X lub Y, (
| ) – prawdopodobieństwo wystąpienia potencjału czynnościowego
neuronu X pod warunkiem wystąpienia potencjału neuronu X w poprzedzającym oknie
czasowym.
Niska wartość funkcji TE oznacza, że aktywność neuronu Y reprezentowana przez
wektor
nie ma związku z aktywnością neuronu X. Wysoka wartość funkcji TE świadczy
o istnieniu zależności pomiędzy aktywnością neuronów X i Y.
4.3.3. Korelacja wzajemna
Oprócz dwóch wspomnianych powyżej, stosowanych jest jeszcze wiele innych metod
obliczeniowych, które mają na celu poszukiwanie połączeń funkcjonalnych między
neuronami [67]. Niektóre z tych metod opisane są skomplikowanymi formułami
matematycznymi, najczęściej jednak nie jest możliwe powiązanie ich z modelami
fizycznymi mikroukładów, które istnieją w naturalnych sieciach neuronowych. Z tego
powodu, dla celów analizy danych eksperymentalnych przeprowadzanej w ramach
niniejszej rozprawy, jako podstawa dla stworzenia algorytmu poszukiwania połączeń
funkcjonalnych wybrana została korelacja wzajemna (ang. cross-correlation).
Niech xi oznacza funkcję opisującą szereg czasowy opisujący wartości potencjałów
{
} oraz analogiczny szereg czasowy yj
czynnościowych dla neuronu X:
{
}. Korelację wzajemną dla
opisujący wartości potencjału neuronu Y:
dwóch funkcji zmiennych dyskretnych (szeregów czasowych) definiujemy jako:
(
)[ ]
∑
()
(
)
4-4
gdzie oznacza szereg czasowy zespolony sprzężony, t – czas, T – przesunięcie
czasowe pomiędzy szeregiem referencyjnym a szeregiem , sumowanie czasu do
nieskończoności oznacza w praktyce sumowanie po całym czasie eksperymentu.
Matematycznie korelacja wzajemna jest funkcją analogiczną do splotu funkcji.
Znaczenie korelacji wzajemnej sprowadza się do obliczenia prawdopodobieństwa, z jakim
wystąpi po danym czasie potencjał czynnościowy w neuronie Y, jeżeli w czasie „0”
70
neuron X wygenerował potencjał czynnościowy. Korelacja wzajemna pozwala na
uzyskanie informacji o typie połączenia synaptycznego występującego między neuronami
lub braku tego połączenia. Im dłuższy jest czas rejestracji aktywności elektrycznej
neuronów, tym więcej potencjałów czynnościowych udaje się zarejestrować uzyskując
lepszą statystykę aktywności neuronów.
4.4. Związek kształtu funkcji korelacji wzajemnej z typem połączenia
funkcjonalnego
Po obliczeniu funkcji korelacji wzajemnej, należy przypisać określonym kształtom
funkcji odpowiedni rodzaj połączenia funkcjonalnego pomiędzy neuronami. W tym celu
niezbędne jest zrozumienie, jakie zjawiska zachodzące na poziomie komórkowym
wpływają na kształt funkcji. Do zrealizowania tego celu konieczne jest zastosowanie
modeli fizycznych neuronu. Modelowanie aksonów lub dendrytów nie jest w tym
przypadku krytyczne, ponieważ te części neuronu można potraktować jak przewodzące
kable, lub bardziej jako falowody o określonym czasie propagacji. Najważniejsze jest
zastosowanie modelu synaps oraz własności częstotliwościowych neuronu.
4.4.1. Geneza kształtu funkcji korelacji wzajemnej
Analizę zależności kształtu funkcji korelacji wzajemnej należy zacząć od przypadku
idealnego. Rozważmy dwa najprostsze mikroukłady, występujące w żywych sieciach
neuronowych:
 neuron A oraz pobudzany przez niego neuron B,
 neuron A hamujący działanie neuronu B.
Przyjmujemy założenie, że posiadamy dane w postaci szeregów czasowych
uzyskanych po wstępnej obróbce danych zarejestrowanych w postaci napięcia
zewnątrzkomórkowego, jak opisano w rozdziale 4.2. Jeżeli w sieci neuronowej nie
występuje oddziaływanie (połączenie) między neuronami A i B, wówczas funkcja korelacji
wzajemnej ma w przybliżeniu płaski przebieg niezależnie od argumentu T. Jest to tzw.
aktywność „tła” (Rysunek 4-2 A).
A
B
C
Rysunek 4-2: Teoretyczne, uproszczone kształty funkcji korelacji wzajemnej (CC) dla
braku połączenia synaptycznego, synapsy wzbudzającej (czerwona) oraz
hamującej (czarna).
71
W przypadku połączenia pobudzającego, jeśli neuron A wygeneruje potencjał
czynnościowy, oczekujemy dużej liczby aktywacji neuronu B opóźnionych w stosunku do
neuronu A. Na wykresie widoczne jest maksimum oddalone o pewien interwał czasowy
równy czasowi propagacji potencjału czynnościowego wzdłuż aksonu oraz synapsy
(Rysunek 4-2 B).
Dla połączenia hamującego oczekujemy minimum potencjałów czynnościowych
neuronu B w pewnym przedziale czasowym po wystąpieniu potencjału czynnościowego
neuronu A. Połączenie poprzez synapsę hamującą widoczne jest w postaci ujemnego piku
funkcji korelacji wzajemnej poniżej poziomu tła (Rysunek 4-2 C) [71].
W rzeczywistych układach biologicznych, sytuacja jest nieco bardziej skomplikowana
i kształty funkcji korelacji wzajemnej nie ograniczają się do ostrego maksimum lub
minimum w jednym punkcie. Zjawiska zachodzące na poziomie komórkowym, takie jak
ilość uwalnianego do przestrzeni synaptycznej neurotransmitera, mają charakter losowy.
Powoduje to pewne „rozmycie” w kształtach funkcji korelacji wzajemnej uzyskiwanych
z danych eksperymentalnych.
Rysunek 4-3 przedstawia dwa kształty funkcji korelacji wzajemnej, występujące często
w danych z 52 eksperymentów rejestracji aktywności kultur organotypowych,
przeprowadzonych w Santa Cruz. Te same kształty można spotkać w literaturze już z lat
70’ i 80’ XX wieku. Analiza i interpretacja kształtów funkcji korelacji wzajemnej
prowadzona była na poziomie symulacji komputerowych z wykorzystaniem pierwszych
komputerów już w latach 70’ [71] [72] [73]. Wyniki symulacji komputerowych były
używane do interpretacji danych uzyskiwanych z eksperymentów z użyciem techniki
elektrod wkłuwanych (patch-clamp) [74] [75]. Przekształcenie szeregów czasowych
aktywności dużych grup neuronów na mapę połączeń funkcjonalnych wymaga analizy
i zrozumienia zjawisk fizycznych odpowiadających za konkretne kształty funkcji.
Rysunek 4-3: Przykładowe wykresy funkcji korelacji wzajemnej; z lewej strony oddziaływania
wzbudzające, z prawej hamujące. Dane pochodzą z eksperymentu 2011-06-28.
4.4.2. Model formalny neuronu
pobudzającej i hamującej
całkuj i strzelaj,
model
synapsy
Aby badać wpływ różnych czynników biofizycznych na kształt i amplitudę funkcji
korelacji wzajemnej szeregów czasowych dwóch neuronów, można użyć modelu neuronu
całkuj i strzelaj. Przytoczony model zwany jest także modelem Lapicque’a, choć nie jest
72
oczywiste, że to właśnie francuskiemu neurobiologowi Louisowi Lapicque powinno być
przypisywane jego autorstwo. Lapicque opublikował wyniki swoich prac już w 1907 r,
jednak użyteczny opis modelu pojawił się w latach późniejszych [76]. Model
całkuj i strzelaj przedstawiony został symbolicznie na Rysunku 4-4 [77].
Rysunek 4-4: Schemat modelu neuronu całkuj i strzelaj. I(t) – prąd pobudzający, C – pojemność
symbolizująca pojemność błony komórkowej neuron, tref – sygnał czasowy sterujący
kluczem, zamykający klucz i rozładowujący pojemność w momencie wygenerowania
potencjału (ciemno-szara strzałka symbolizująca sprzężenie zwrotne), ∑ (
)–
szereg czasowy opisujący przekroczenia progu napięcia Vth (komparator). Rysunek
zaczerpnięty z [77].
Model ten opisuje potencjały czynnościowe w odpowiedzi na prąd pobudzający I(t). Prąd
opisany jest równaniem:
()
4-5
gdzie I(t) oznacza prąd pobudzający, C – pojemność, V – napięcie, t – czas.
Jest to oczywiście doskonale znane z fizyki i elektroniki równanie opisujące zależność
natężenia i napięcia na kondensatorze. Dla kompletności modelu równanie (4-5) musi
zostać uzupełnione warunkiem kasowania potencjału do Vres , kiedy potencjał V
przekroczy wartość progową Vth (4-6), oraz równaniem napięcia, które obowiązuje do
momentu przekroczenia wartości Vth (4-7).
( )
{
4-6
|
()
( )
∫ ()
4-7
Aby nieco urealnić omawiany model, można go przedstawić w nieco bardziej
rozbudowanej postaci, dodając rezystancję, przez którą przepływa prąd, rozładowując
pojemność błonową. Schemat modelu tzw. przeciekający neuron całkuj i strzelaj został
przedstawiony na Rysunku 4-5:
Rysunek 4-5: Schemat modelu neuronu przeciekający całkuj i strzelaj. I(t) – prąd pobudzający,
C - pojemność błony komórkowej neuron, R – rezystancja rozładowująca pojemność C,
tref - sygnał czasowy sterujący kluczem, zamykający klucz i rozładowujący pojemność
w momencie wygenerowania potencjału, ∑ (
) – szereg czasowy opisujący
przekroczenia progu napięcia Vth (komparator). Rysunek zaczerpnięty z [77].
73
Rezystancja połączona równolegle reprezentuje rezystancje kanałów błonowych,
przez które ładunek przepływa w sposób bierny, bez transportu aktywnego. Przebieg
napięcia opisany jest wzorem (4-8):
( )
()
()
4-8
gdzie potencjał błonowy V(t) jest określany względem potencjału spoczynkowego
błony komórkowej, Cm jest pojemnością błony komórkowej, gm jest przewodnością błony
(
),
( ) jest prądem wywołującym potencjał czynnościowy ( ( ) – funkcja
opisująca zmiany napięcia, jej postać zależy od wariantu modelu), Isyn jest sumarycznym
prądem transbłonowym wywoływanym przez synapsy. Typowe wartości parametrów
przewodności i pojemności błony to gm= 25 nS i Cm= 250 pF [78].
Istnieją różne wariacje modelu całkuj i strzelaj. W podstawowym modelu przeciekający
( )
całkuj i strzelaj funkcja
.
W pewnej wariacji tego modelu, zwanej
eksponencjalnym całkuj i strzelaj, potencjał czynnościowy jest generowany, gdy napięcie
błonowe przekroczy pewien ustalony próg, a funkcja opisująca zmiany napięcia ma
charakter eksponencjalny:
( )
e
(
)
4-9
gdzie
– parametr określający ilościowo szybkość narastania potencjału błonowego.
Gdy potencjał przekroczy napięcie progowe VT, wartość funkcji ( ) dąży do
nieskończoności w skończonym czasie. Nagły wzrost wartości funkcji reprezentuje
zainicjowanie potencjału czynnościowego. Po przekroczeniu wartości progowej, napięcie
powraca do wartości początkowej.
Użytecznym parametrem jest efektywny potencjał spoczynkowy:
μ
,
4-10
który odzwierciedla wartość potencjału, jaki ustaliłby się przy stałym prądzie
pobudzającym
, przy braku napięcia progowego i braku mechanizmu
inicjującego potencjał czynnościowy. W celu wyznaczenia funkcji korelacji wzajemnej
potrzebujemy zapisu aktywności neuronów w postaci szeregu czasowego:
()
∑ (
)
4-11
gdzie j=1,…p jest szeregiem od 1 do p momentów czasu tj z przedziału [0; T].
W pracach symulacyjnych, na których opiera się stosowana w niniejszej pracy
doktorskiej interpretacja kształtów korelacji wzajemnej, stosowana jest transformata
Fouriera w celu przekształcenia szeregu czasowego (4-11) do dziedziny częstotliwości.
W dziedzinie częstotliwości szereg czasowy ma postać:
̃( )
∑e
4-12
gdzie oznacza częstość kołową, i – jednostkę urojoną.
Chwilowa częstość aktywacji potencjałów czynnościowych definiowana jest jako:
( ) ⟨ ( )⟩
4-13
74
gdzie nawiasy trójkątne oznaczają uśrednianie po przedziałach czasowych.
()
Jeżeli częstotliwość generacji potencjałów jest stała, wówczas
dla
dowolnego czasu t. Dla neuronów generujących potencjały czynnościowe ze stałą
częstością, używa się współczynnika kowariancji CV:
√̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅
̅̅̅̅)
(
4-14
̅̅̅̅
Znormalizowana funkcja korelacji wzajemnej dla dwóch neuronów reprezentowanych
przez szeregi czasowe ( ) ( ) i ( ) ( ) ma postać:
()
( ) ( )
∫ ⟨(
( )
( )
( )
( )
)(
(
)
( )
)⟩
4-15
Wartość C(t) reprezentuje zmienność częstotliwości neuronu 2 pod warunkiem, że
neuron 1 był aktywny t milisekund wcześniej. Po transformacie Fouriera, w dziedzinie
częstotliwości, funkcja C(t) ma postać:
( ̃ ( )( ) ̃ ( )(
( ) ( )
(
)̃( )
(
))
)
( ) ( )
4-16
( ) (
)
Uzupełniając model o model synapsy nerwowej, możliwe jest analityczne obliczenie
funkcji ̃ ( ) a następnie funkcji C(t) z ̃ ( )poprzez odwrotną transformatę Fouriera.
Powyższe założenia stanowią punkt startowy do obliczeń teoretycznych
przeprowadzonych n.p. przez S. Ostojicia i współpracowników [79]. Dla zrozumienia
genezy kształtów funkcji korelacji wzajemnej niezbędne jest przytoczenie modelu
dynamiki synapsy nerwowej. Przewodzenie synaptyczne związane jest z uwalnianiem
neurotransmitera oraz aktywowaniem (lub blokowaniem) kanałów jonowych w wyniku
jego wychwycenia przez błonę postsynaptyczną [9] [80]. Synapsę opisuje się jako zmienną
konduktancję, która przyjmuje wartość wyższą od zera (otwiera się) gdy występuje
potencjał czynnościowy neuronu presynaptycznego. Prąd synapsy zależy od
wypadkowego potencjału U:
()
( )(
)
4-17
Parametry Esyn i
( ) używane są do określenia charakterystyki różnych typów
( ) wyrażana jest poprzez superpozycję funkcji
synaps. Przewodność
eksponencjalnych, Esyn opisuje hamujący potencjał jonów potasu (-75mV) [81].
Przewodnictwo synaptyczne przekładać się będzie na prawdopodobieństwo pobudzenia
neuronu postsynaptycznego – gdy przewodność synapsy jest najwyższa, również
najwyższe będzie prawdopodobieństwo wystąpienia potencjału czynnościowego. Gdy
przewodność spada, prawdopodobieństwo aktywacji potencjału czynnościowego
w neuronie postsynaptycznym również jest niższe.
Model synapsy pobudzającej, dla przewodności związanej z danym rodzajem
receptorów może zostać opisany równaniem:
()
()
(
)
(
)
()
() ̅
N [e (
)
) e (
)] (
4-18
75
gdzie ̅ - amplituda przewodności, N – czynnik normalizujący wyrażenie w nawiasie
kwadratowym do jedności, – stała czasowa spadku przewodności synapsy, - stała
()
czasowa wzrostu przewodności synapsy, (
) - funkcja Heaviside’a (skok
jednostkowy).
Równania opisujące dynamikę synaptyczną różnych rodzajów receptorów różnią się
tylko wartościami współczynników, stałym elementem jest różnica dwóch funkcji
eksponencjalnych [80]. Model synapsy hamującej można opisać równaniem zmiany
konduktancji synapsy, mającym postać przebiegu eksponencjalnego:
()
()
̅
e
(
()
)
4-19
gdzie ̅ oznacza amplitudę przewodności, ( ) - moment czasowy, w którym
rozpoczyna się działanie synapsy, - stała czasowa synapsy.
Dla lepszego zobrazowania modelu synapsy pobudzającej i hamującej, Rysunek 4-6
przedstawia przebieg funkcji (4-18) i (4-19) w czasie. Jeśli pominąć wartość względnego
przesunięcia funkcji w osi pionowej, ich kształty dobrze przybliżają wykresy uzyskane
z danych eksperymentalnych (porównaj Rysunek 4-3). Do obliczenia teoretycznych
wartości przebiegów czasowych synapsy pobudzającej AMPA zastosowano wartości
parametrów:
m
m , czynnik normalizujący N=1.27 [82]. Dla
synapsy hamującej stała czasowa τ=5 ms [80]. Wątpliwości może budzić niezgodność
polarności wykresu przewodności synapsy hamującej (Rysunek 4-6 na dole) z wykresem
korelacji wzajemnej, który w poprzednim paragrafie zinterpretowany został jako efekt
istnienia połączenia tego typu (Rysunek 4-3, po prawej). Jeżeli uwzględnimy, że wzrost
przewodności synapsy hamującej skutkuje spadkiem prawdopodobieństwa aktywacji
neuronu postsynaptycznego, logicznym jest, że wykres korelacji wzajemnej będzie
odwrócony w stosunku do wykresu przewodności synapsy.
Rysunek 4-6: Wykres przewodności synapsy: na górze – wykres dwóch składowych
eksponencjalnych oraz wykres różnicy eksponent (niebieski) dla modelu synapsy
pobudzającej, na dole – synapsy hamującej.
76
4.4.3. Kształty wykresów funkcji korelacji wzajemnej oraz odpowiadające
im konfiguracje połączeń synaptycznych
W rozdziale 1.2.1 opisane zostały dwa rodzaje synaps, pobudzająca oraz hamująca.
Poprzez rozmaite konfiguracje połączeń, kilka neuronów może tworzyć powtarzalne
mikroukłady [10] [83] [84]. Posiadając dane w postaci szeregów czasowych, stosując
metodę korelacji wzajemnej par szeregów czasowych aktywności neuronów,
podstawowym celem jest poszukiwanie trzech najprostszych mikroukładów:
A) Para neuronów, w której jeden neuron jest połączony synapsą pobudzającą
z drugim,
B) Para neuronów, w której jeden neuron jest połączony synapsą hamującą z drugim,
C) Trzy neurony, pierwszy neuron pobudza neurony drugi i trzeci.
Interesujące jest również poszukiwanie zespołów układów elementarnych, czyli:
D) Kombinacja dwóch różnych typów połączeń spośród A, B i C.
Jak zostało wykazane w pracy [79], możliwe jest obliczenie funkcji korelacji wzajemnej za
pomocą równań analitycznych spójnych z wynikami eksperymentalnymi.
A) Synapsa pobudzająca
Równanie analityczne opisujące funkcję korelacji wzajemnej ma postać różnicy dwóch
funkcji eksponencjalnych:
()
(
)
[e
(
)
e
(
)]
4-20
gdzie oraz oznaczają odpowiednio czas trwania przewodzenia oraz stałą czasową
opóźnienia synapsy, jest stałą czasową eksponenty dominującej wyznaczoną dla
zadanych parametrów symulacji.
Parametr zastępuje stałą czasową dominującej składowej w modelu synapsy
pobudzającej (równanie (4-18)). Przybliżenie modelu za pomocą eksponenty dominującej
jest poprawne ze względu na uniwersalny charakter modelu – każdy model synapsy
pobudzającej, niezależnie od neurotransmitera, na który synapsa selektywnie reaguje,
można przybliżyć funkcją eksponencjalną [79]. C0 oznacza parametr skalujący amplitudę.
Wykresy funkcji (4-20) przedstawione zostały na Rysunku 4-7.
Rysunek 4-7: Funkcja korelacji wzajemnej odpowiadająca pojedynczej synapsie pobudzającej.
- odchylenie standardowe częstotliwości potencjałów czynnościowych neuronu
presynaptycznego, CV – współczynnik wariancji neuronu presynaptycznego (zgodnie
z (4-14)). Rysunek z [79], zmodyfikowany.
77
Przytoczony na Rysunku 4-7 parametr
oznacza odchylenie standardowe
częstotliwości występowania potencjału czynnościowego neuronu presynaptycznego.
Wielkość ta, obok współczynnika wariancji CV, jest wskaźnikiem „szumu” synaptycznego,
czyli wysokiej aktywności neuronów otaczających dwa neurony połączone synapsą. Niska
wartość obu tych parametrów oznacza niską aktywność, wysoka wartość oznacza wysoką
aktywności neuronów tła. Na Rysunku 4-7a) przedstawiony został wykres funkcji (4-20)
dla trzech przypadków szumu: niskiego (
), średniego
(
) oraz wysokiego (
). Przy niskim poziomie szumu
występuje maksimum w centralnej części wykresu oraz dwa maksima lokalne.
Przedstawiony wynik symulacji otrzymany został przy stacjonarnej generacji potencjału
czynnościowego neuronu presynaptycznego o okresie 30ms. Dwa maksima wartości
funkcji dla czasów -25 ms i +35ms związane są z tym właśnie okresem generacji
potencjału.
Rysunek 4-7b) przedstawia przebieg funkcji korelacji wzajemnej dla średniego
poziomu szumu i różnych częstotliwości średnich aktywacji neuronu presynaptycznego
(
i
). Wraz ze wzrostem częstotliwości aktywacji neuronu
presynaptycznego, amplituda korelacji wzajemnej znormalizowanej maleje, jednak kształt
krzywej nie zmienia się w sposób drastyczny.
Z punktu widzenia automatycznej detekcji kształtu, odpowiadającego pojedynczemu
połączeniu synaptycznemu, można zauważyć pewną szczególną cechę, mianowicie
występowanie wzrostu wartości funkcji o wysokiej amplitudzie i niesymetrycznym
kształcie. Istotne jest również położenie maksimum względem środka układu
współrzędnych. Niezależnie od poziomu szumu leży w prawej połowie układu
współrzędnych on (t > 0). Jest to pierwszy ważny wniosek : tworząc algorytm
automatycznej detekcji połączeń synaptycznych, należy szukać niesymetrycznego maksimum
dla czasu t>0. Warto również porównać wzory (4-18) oraz (4-20). Jak widać postać
analityczna funkcji korelacji wzajemnej wynika bezpośrednio z modelu opisującego
synapsę pobudzającą. To drugi ważny wniosek wynikający z powyższych rozważań –
empirycznie uzyskane wykresy korelacji wzajemnej pozwalają uzyskać informacje na temat
dynamiki połączeń synaptycznych.
B) Synapsa hamująca
Także w przypadku dwóch neuronów połączonych pojedynczą synapsą hamującą,
możliwe jest wyprowadzenie równania analitycznego, opartego na modelu neuronu
całkuj i strzelaj oraz modelu synapsy, które opisuje kształt funkcji korelacji wzajemnej:
()
(
)
[e
(
)
e
(
)]
4-21
Funkcja korelacji wzajemnej odpowiada (4-20), jednak ze znakiem przeciwnym. Na
wykresie korelacji wzajemnej połączenie tego typu ma postać spadku wartości w prawej
połowie układu współrzędnych (t > 0, Rysunek 4-8).
Powyższe równanie oraz przebieg funkcji pozwalają na wyciągnięcie wniosku
dotyczącego automatycznej detekcji połączeń o charakterze hamującym: spadek wartości
funkcji korelacji wzajemnej o niesymetrycznym charakterze względem minimum dla czasu
t>0, oznacza obecność synapsy hamującej.
78
Rysunek 4-8: Wykres funkcji analitycznej odpowiadającej korelacji wzajemnej neuronów
połączonych synapsą hamującą [79].
C) Dwa neurony pobudzane ze wspólnego źródła
Korelacja wzajemna może wskazywać na istnienie związku aktywności dwóch
neuronów, nawet jeśli nie ma pomiędzy nimi bezpośredniego połączenia synaptycznego
[73] [85] [86]. Zakładając, że dwa neurony A i B oprócz impulsów odbieranych niezależnie
pobudzane są równocześnie przez wspólny neuron, można opisać funkcję korelacji
wzajemnej następującym równaniem:
||
||
()
[ e (
e (
)
)]
4-22
gdzie oraz oznaczają odpowiednio czas trwania przewodzenia oraz stałą czasową
opóźnienia synapsy, jest stałą czasową eksponenty dominującej w modelu synapsy.
Moduł z wartości czasu we wzorze (4-22) wskazuje na symetrię funkcji korelacji
wzajemnej względem czasu t=0. Wykresy funkcji korelacji wzajemnej dla omawianego
typu połączenia przedstawia Rysunek 4-9. Jak widać, różnica częstotliwości występowania
potencjałów czynnościowych dwóch neuronów nie wpływa silnie na kształt funkcji.
Rysunek 4-9: Funkcja korelacji wzajemnej neuronów A i B będąca wynikiem ich wzbudzenia przez
trzeci neuron. Rysunek pokazuje wpływ różnicy średniej częstotliwości aktywacji:
neuron A jest aktywowany z częstotliwością 10Hz, neuron B odpowiednio
z częstotliwością 10, 30, 100Hz [79].
79
D) Kombinacje różnych typów połączeń, superpozycja funkcji.
W naturalnych sieciach neuronowych połączenia synaptyczne nie ograniczają się do
najprostszych układów, przedstawionych w punktach A – C. W zestawach danych
eksperymentalnych analizowanych przez autora pracy obecne były również bardziej
skomplikowane kształty. Interpretacja kształtów korelacji wzajemnej jest uważana za
zadanie o bardzo wysokim stopniu trudności [87] [88]. Niemniej jednak, nawet ze
złożonych kształtów funkcji można wydobyć pewne informacje. Kluczową właściwością
ułatwiającą zadanie interpretacji kształtów jest liniowa addytywność funkcji
odpowiadających połączeniom elementarnym [79]. W przypadku dwóch neuronów A i B
oddziałujących wzajemnie poprzez synapsy pobudzające funkcja korelacji wzajemnej jest
sumą funkcji poszczególnych oddziaływań synaptycznych:
()
()
()
4-23
( ) jest korelacją wzajemną połączenia synaptycznego od neuronu A do B,
gdzie
( ) - od neuronu B do A.
Wykres funkcji C(t) stanowi superpozycję funkcji przedstawionej na Rysunku 4-7 oraz
funkcji do niej komplementarnej, symetrycznej względem czasu t=0, obrazującej
oddziaływanie synaptyczne w przeciwnym kierunku.
Rysunek 4-10: Funkcja korelacji wzajemnej dla dwóch wzbudzających się neuronów. Rysunek
zaczerpnięty z [79], zmodyfikowany.
Warto zauważyć, iż tego typu połączenie w nomenklaturze elektronicznej można
zinterpretować jako oscylator – element generujący (samopodtrzymujący) oscylację.
Kwestią dyskusyjną pozostaje, czy tak prosty jak przedstawiany powyżej układ może
pełnić w żywych sieciach neuronowych funkcję generatora częstotliwości, gdyż układy
opisywane w literaturze jak generatory rytmu mają nieco bardziej skomplikowaną
budowę, zawierającą także neurony hamujące [10].
Rysunek 4-11: Funkcja korelacji wzajemnej dla ujemnego sprzężenia zwrotnego; dwa
neurony wzbudzane przez wspólne źródło oraz połączone synapsą hamującą [79].
80
Innym przykładem kombinacji dwóch niezależnych oddziaływań synaptycznych jest
pobudzenie neuronów A i B przez wspólne źródło oraz wzajemne połączenie synapsą
hamującą. Funkcja wynikowa oraz jej składowe przedstawione zostały na Rysunku 4-11.
Takie połączenie można interpretować jako rodzaj ujemnego sprzężenia zwrotnego,
w którym wzbudzenie dwóch neuronów powoduje zahamowanie aktywności jednego
z nich.
4.4.4. Wykrywanie połączeń synaptycznych metodą drgań losowych.
Wady i ograniczenia metody.
Liczba zidentyfikowanych neuronów w wynikach eksperymentów analizowanych
przez autora waha się w granicach od ok. 70 do 300. Biorąc pod uwagę zagęszczenie
synaps obserwowane w obrazach mikroskopowych (patrz rozdział 1.2.1), należy zbadać
połączenia nie tylko pomiędzy neuronami sąsiadującymi w sensie geometrycznym, ale
wszystkimi, jakie zostały zlokalizowane. Liczba korelacji wzajemnych, jakie trzeba
obliczyć i przeanalizować dla N neuronów wynosi N(N-1), czyli odpowiednio od 70 do 300
neuronów wymaga obliczenia od 4830 do 89700 przebiegów funkcji (N-1 wynika
z wykluczenia autokorelacji). Zadanie to można oczywiście wykonać ręcznie poprzez
rozpoznawanie kształtów i przypisywanie im odpowiedniego typu połączenia na przykład
według zestawionych przykładów z rozdziału 0. Ten sposób podejścia do analizy jest
niestety obarczony dużym błędem związanym z subiektywną oceną istotności
analizowanego przypadku w stosunku do pozostałych przebiegów, co wynika z dużej
zmienności wyników. Na Rysunku 4-12 przedstawione zostało 5 przykładowych
wykresów korelacji wzajemnej.
Przyglądając się wykresom A-E każdemu z osobna, można zauważyć pojedyncze
maksimum zlokalizowane dla czasu t > 0 lub t < 0. Można zinterpretować je jako
połączenia jednokierunkowe poprzez synapsę pobudzającą. Jednak przeglądając dużą
liczbę tego typu wykresów, obserwator skazany jest na subiektywną ocenę danego
wykresu względem kilku (lub kilkunastu) poprzednio analizowanych.
Rysunek 4-12: Pięć przykładów korelacji wzajemnej obrazujących względność oceny manualnej.
Wykres C ma inny charakter porównywany do A i B, niż do C i D. Dane z 2012-04-16-1.
81
Jeżeli kilka poprzednich wykresów było podobnych do A lub B, wówczas C wydaje się mieć
wyraźny kształt odpowiadający połączeniu pobudzającemu (Rysunek 4-7a). Jeśli
zaobserwujemy kilka wykresów zbliżonych wizualnie do D i E, wówczas wykres C wydaje
się mieć względnie niską amplitudę i wysoki poziom szumu, skutkiem czego może zostać
uznany za statystycznie nieznaczącą fluktuację. Do obiektywnej oceny, czy dany pik jest
statystycznie znaczący, potrzebna jest automatyczna metoda analizy kształtów funkcji
korelacji wzajemnej.
Wielu badaczy rozwiązuje powyższy problem subiektywnej klasyfikacji połączeń
poprzez użycie metody drgań losowych (ang. Spike Jittering Method). Metoda drgań
losowych korelacji wzajemnej dla dowolnych neuronów A i B, których aktywność jest
zapisana w postaci szeregów czasowych nA(t) i nB(t), polega na następujących działaniach:
1. Wygenerowanie wektora losowych wartości czasu J(t). Liczba elementów wektora
musi być równa liczbie elementów szeregu czasowego jednego z neuronów (np. A),
wartości losowe muszą podlegać rozkładowi normalnemu i mieścić się w zadanym
arbitralnie przedziale czasowym:
()
∑
(
)
4-24
NA – liczba zarejestrowanych potencjałów czynnościowych neuronu A, Ti – wybrana
granica przedziału czasowego, rand – funkcja generująca wartości losowe.
2. Obliczenie korelacji wzajemnej szeregu czasowego neuronu A (nA(t)) z szeregiem
czasowym neuronu B (nB(t)), przy czym wszystkie wartości szeregu nA(t) podlegają
przesunięciu o losową wartość (drganie) z wektora J(t). Innymi słowy zamiast szeregu
nA(t) używamy sumy odpowiadających elementów wektorów nA(t) i J(t):
((
)
)[ ]
∑(
)()
(
)
4-25
3. Kroki 1. i 2. powtarzane są zwykle 1000 razy [89] dla uzyskania odpowiednio wysokiej
statystyki, zawsze ze zmianą wartości wektora drgań losowych J(t). Każdy wynik
obliczenia korelacji wzajemnej jest zapisywany (linie koloru szarego, Rysunek 4-13).
4. Następnie używając wszystkich obliczonych korelacji z drganiami wyznacza się dwie
krzywe obliczane punkt po punkcie: pierwsza krzywa składa się z punktów, które
odcinają 1% najwyższych wartości zbioru punktów korelacji dla każdego punktu na
osi czasu (linia czerwona ciągła), druga odcina 1% najniższych wartości zbioru
punktów korelacji z drganiami dla każdego punktu na osi czasu (linia zielona ciągła).
5. Z krzywej odcinającej 1% najwyższych wartości korelacji z drganiami losowymi
wybierana jest wartość maksymalna, która używana jest jako wartość progowa JMAX
(linia czerwona przerywana). Jeżeli oryginalna korelacja wzajemna szeregów nA(t)
i nB(t) przekracza wartość JMAX po stronie czasu ujemnego lub dodatniego, połączenie
klasyfikowane jest jako połączenie wzbudzające. Podobnie z krzywej odcinającej 1%
najniższych wartości korelacji z drganiami znajdywana jest wartość najniższa JMIN,
która służy jako wartość progowa przy poszukiwaniu połączeń hamujących (linia
zielona przerywana).
Przykład podany na Rysunku 4-13 pozwala na zidentyfikowanie dwóch połączeń
synaptycznych – pobudzającego od neuronu B w kierunku neuronu A (ponieważ pik
ponad czerwoną linią przerywaną wystąpił dla czasu t<0) oraz połączenia hamującego od
82
Rysunek 4-13: Detekcja pojedynczych połączeń synaptycznych metodą drgań losowych. A –
Oryginalny przebieg funkcji korelacji wzajemnej i 1000 korelacji z jednym neuronem
„zaszumionym” drganiami losowymi. B – MAX 1% to obwiednia odcinająca 1%
maksymalnych wartości, Min 1% odcina 1% najniższych wartości korelacji z drganiami,
JMAX i JMIN służą jako wartości progowe. Dane z eksperymentu 2012-04-16-1.
neuronu A w kierunku neuronu B (część korelacji wzajemnej poniżej przerywanej linii
zielonej dla t>0).
Przedstawiony sposób wyznaczania połączeń synaptycznych, choć powszechnie
stosowany, nie jest pozbawiony wad. W opinii autora największą wadą metody drgań
losowych jest ograniczona liczba konfiguracji synaptycznych, które można za jej pomocą
wykryć. Jeżeli ograniczamy się do rozpoznawania połączeń synaptycznych pobudzających
i hamujących, tracimy informację o istnieniu neuronów pobudzających równocześnie dwa
badane neurony (symetryczne maksima na wykresach korelacji wzajemnej, Rysunek 4-9
i 4-11). Ponadto, konieczne jest wykonanie obliczeń: tysiąckrotne generowanie wektora
wartości drgań losowych i każdorazowe obliczanie korelacji wzajemnej. Całkowity czas
obliczania korelacji wzajemnych zależy od liczby zidentyfikowanych neuronów
i zarejestrowanych potencjałów czynnościowych. W jednym z eksperymentów, średnia
liczba zarejestrowanych potencjałów czynnościowych wyniosła 8,800 w ciągu 6 godzin
trwania eksperymentu (eksperyment nr 2012-04-16-1, zidentyfikowanych 106
neuronów). Średni czas obliczenia 1000 korelacji wzajemnych z drganiami losowymi tylko
dla jednej pary neuronów wynosi 91.035s (komputer osobisty z procesorem taktowanym
zegarem 2.2GHz). Jeżeli ten czas pomnożymy przez całkowitą liczbę par, jakie tworzą
neurony, otrzymujemy 91.035*(106*(106-1)) = 1,023,960s, czyli ponad 11 dni, przy
obliczaniu korelacji wzajemnej w przedziale -40:40ms z rozdzielczością 0.5ms.
4.5. Wydajny obliczeniowo algorytm detekcji połączeń synaptycznych
Jednym z celów prowadzonych prac było opracowanie algorytmu do automatycznej
detekcji połączeń synaptycznych, spełniającego następujące kryteria:
 spójność z dotychczas stosowanymi metodami, uznawanymi przez środowisko
naukowe za niezawodne
 wydajność obliczeniowa – skrócenie czasu oczekiwania na wyniki z kilkunastu dni
do kilku godzin
 możliwość znajdywania połączeń typu pobudzającego, hamującego oraz
wspólnego pobudzenia
 możliwość ekstrakcji parametrów fizycznych połączenia synaptycznego, czyli
stałych czasowych funkcji synaptycznych (równania (4-18) do (4-20)).
83
Podstawową metodą, na której opiera się opracowany algorytm jest korelacja
wzajemna aktywności par neuronów. Zmienione zostało podejście do wyznaczenia
progów, których przekroczenie traktowane jest jako sygnalizacja istnienia połączenia
funkcjonalnego (patrz Rysunek 4-13, wartości JMIN i JMAX).
4.5.1. Zastąpienie drgań losowych filtracją dolnoprzepustową
Fundamentalne znaczenie w prezentowanej metodzie ma zastosowanie pewnej
własności drgań losowych: obliczenie średniego przebiegu z dużej liczby korelacji
wzajemnych obciążonych drganiami losowymi jest bliskie pojedynczej funkcji korelacji
wzajemnej nie zmodyfikowanej drganiami, ale przekształconej filtrem cyfrowym
całkującym. Własność ta została opisana wiele lat temu w kontekście rozważań nad
obróbką danych z rejestracji potencjałów wywołanych EEG (Elektroencefalografia) [90].
Aby obliczyć przebieg korelacji wzajemnej filtrowanej filtrem całkującym, odpowiadający
uśrednieniu wielu korelacji wzajemnych obciążonych drganiami losowymi, konieczne jest
oszacowanie parametrów filtru, w szczególności częstotliwości odcięcia (spadek
amplitudy o 3dB) dla obu metod. Odpowiedź częstotliwościową filtracji metodą drgań
losowych Z(f) [90] można wyrazić równaniem:
() e ( (
) )
4-26
gdzie f – częstotliwość [Hz], σ – odchylenie standardowe rozkładu drgań losowych
(wektora J(t), równanie (4-24)).
Odpowiedź funkcji Z(f) zależy od odchylenia standardowego, które dla rozkładu
normalnego (Gaussa) zmiennej losowej dyskretnej xi określone jest wzorem:
√∑
(
μ)
4-27
gdzie μ – w naszym przypadku wartość średnia (oczekiwana) odchyleń z wektora J(t)
dodawanych do szeregu czasowego, n – liczebność próby, liczba drgań losowych równa
liczbie punktów tworzących wynik obliczenia korelacji wzajemnej.
W przypadku obliczeń komputerowych, wiele pakietów oprogramowania pozwala na
generację liczb losowych z rozkładem jednorodnym. Wówczas odchylenie standardowe
można przedstawić wzorem [91]:
(b
√
)
4-28
gdzie b i a oznaczają odpowiednio koniec i początek zakresu rozkładu jednorodnego.
Dla rozkładu jednorodnego drgań losowych czasu od –T do T, odchylenie standardowe
wyniesie:
(
√
(
))
√
| |
√
4-29
Rysunek 4-14 przedstawia porównanie charakterystyk filtracji dolnoprzepustowej dla
rozkładu normalnego i rozkładu jednorodnego. W zakresie do ok. -5dB charakterystyki
pokrywają się, zatem częstotliwość graniczna filtru prawie nie zależy od rodzaju rozkładu
drgań losowych.
84
Rysunek 4-14: Charakterystyki częstotliwościowe filtracji metodą drgań losowych, a – rozkład
normalny, b – rozkład jednorodny. Rysunek zaczerpnięto z [90].
Powyżej częstotliwości granicznej charakterystyki ulegają separacji: charakterystyka
dla rozkładu jednorodnego jest bardziej stroma niż dla rozkładu normalnego. Czynnik ten
powinien zostać uwzględniony w procesie znajdywania ekwiwalentnego do drgań
losowych sposobu filtracji. Najprostszą metodą zwiększenia nachylenia jest oczywiście
zwiększenie stopnia filtru, dla filtracji cyfrowej iteracyjne przekształcenie danych
wejściowych za pomocą tego samego filtru. Kryterium porównania dwóch metod filtracji
jest porównanie kształtu charakterystyk i częstotliwości granicznych (przy której
amplituda spada o 3dB). Dla filtracji metodą drgań losowych częstotliwość odcięcia filtru
można obliczyć bezpośrednio z wzoru (4-26). Jeżeli przyrównamy odpowiedź
częstotliwościową Z(f) do liczby ⁄ , po prostych przekształceniach:
√
e
(
(
(
) )
)
√
( )
4-30
4-31
otrzymujemy prostą formułę na obliczenie częstotliwości granicznej, jaką musi mieć
filtr całkujący odpowiadający operacji drgań losowych:
√ ( )
4-32
4.5.2 Wybór filtru cyfrowego
Kolejnym krokiem jest wybór filtru całkującego, jakim ma zostać zastąpiona metoda
drgań losowych. Mimo że środowisko MATLAB oferuje bogaty pakiet oprogramowania do
projektowania filtrów cyfrowych, najbardziej wydajny obliczeniowo okazał się filtr
uśredniający, napisany przy użyciu funkcji podstawowych języka MATLAB.
Działanie filtru uśredniającego polega na obliczeniu nowej wartości sygnału jako
średniej ważonej z wartości oryginalnej i wartości sąsiadujących. Jeżeli dany szereg,
reprezentujący funkcję korelacji wzajemnej w przedziale [-T, T] oznaczymy zgodnie
z poprzednimi równaniami jako C(t), wówczas dowolny wyraz szeregu po filtracji dla
wybranego czasu t obliczamy jako:
85
c
∑ wc
4-33
gdzie ct+i oznacza wyraz szeregu pierwotnego przesunięty względem czasu t o „i”
interwałów, wi dla i=-n, (-n+1), (-n+2), … 0,1 … n są wagami uśredniania z wagą centralną
w0, c jest wyrazem szeregu CF(t) po filtracji.
Wagi uśredniania dobiera się w taki sposób, aby ich suma była znormalizowana do
jedności, dzięki czemu średnia szeregu po filtracji jest równa średniej szeregu
oryginalnego. Rozkład współczynników filtru może być symetryczny lub niesymetryczny.
Dla symetrycznego rozkładu odpowiedź częstotliwościową filtru ma postać [92]:
()
w
∑w c (
)
4-34
gdzie U(f) oznacza odpowiedź częstotliwościową, w0 – środkową wagę uśredniania,
wk - kolejny współczynnik wagowy o numerze k, f – częstotliwość, t – interwał czasowy
pomiędzy punktami w szeregu C(t), n – liczba współczynników wagowych filtru
symetrycznego, liczona w jedną stronę od w0.
Wartości wszystkich współczynników wk mogą być sobie równe, wówczas filtr
cyfrowy nazywamy filtrem pudełkowym. Wadą filtru pudełkowego są stosunkowo
wysokie dudnienia przy wysokich częstotliwościach [93]. Niższe dudnienia uzyskuje się
dla filtru o współczynnikach rosnących i opadających liniowo względem współczynnika
środkowego w0, tworzących na wykresie kształt trójkąta. Charakterystykę najbliższą
idealnej uzyskuje się dla filtru, którego współczynniki leżą na krzywej Gaussa, jednak
w praktyce nie udało się zanotować różnic pomiędzy filtrem trójkątnym i filtrem
o współczynnikach Gaussa, co wynika bezpośrednio z twierdzenia Shannona. Stosowane
interwały czasowe pomiędzy wartościami funkcji korelacji wzajemnej są rzędu 0.05 –
0.5ms, zatem graniczna wartość składowej częstotliwościowej wynosi odpowiednio
20kHz i 2kHz. Występujące dla wysokich częstotliwości dudnienia nie mają wpływu na
przebieg sygnału wyjściowego, ponieważ składowe wysokich częstotliwości nie występują
w danych wejściowych. Jak wynika z wzoru (4-34), częstotliwość graniczna filtru
uśredniającego zależy od wartości współczynników wk oraz od ich liczebności.
Rysunek 4-15 prezentuje charakterystyki częstotliwościowe czterech filtrów trójkątnych
oraz odpowiadające im zestawy współczynników, we wszystkich przypadkach
znormalizowane do jedności.
Rodzina przedstawionych charakterystyk pokazuje, że częstotliwość graniczna maleje
wraz ze wzrostem liczby punktów, które wliczane są do średniej ważonej. Nie bez
znaczenia jest fakt, że spadek częstotliwości granicznej wraz ze wzrostem liczby
uśrednianych punktów nie jest zależnością liniową. Jak zostało wcześniej wspomniane,
należy też porównać nachylenie charakterystyk filtracji drgań losowych oraz filtracji
filtrem uśredniającym.
86
Rysunek 4-15: Przykładowe charakterystyki częstotliwościowe filtru uśredniającego z wagami
malejącymi liniowo względem wartości centralnej. Dobór współczynników wpływa na
częstość odcięcia filtru. Kolory znaczników odpowiadają kolorom charakterystyk
częstotliwościowych. Interwał czasowy ustawiony został na 0.5ms.
Porównanie działania filtracji drgań losowych oraz filtracji uśredniania w kontekście
obliczania progów do wykrywania oddziaływań synaptycznych w korelacji wzajemnej
przedstawiają Rysunki 4-16 oraz 4-17. Na Rysunku 4-16a przedstawione zostało 1000
korelacji wzajemnych obciążonych drganiami losowymi przy szerokości okna drgań
+/-20ms oraz krzywe odcinające 1% najwyższych wartości dla danego czasu (czerwona)
i 1% najniższych wartości (zielona). Krzywe te, wyznaczone po dość długich obliczeniach
(trwających ok. 20minut), można wyznaczyć w znacznie krótszym czasie (ok. 3s),
korzystając z równoważności metod filtracji za pomocą drgań losowych i filtru
uśredniającego. Jeżeli wyznaczymy parametry filtracji uśredniającej, które pozwolą na
otrzymanie charakterystyki filtru uśredniającego tożsamej (lub bardzo bliskiej)
z charakterystyką filtru drgań losowych, możemy oczekiwać, że średnia z obliczonych
korelacji wzajemnych z drganiami (Rysunek 4-16a, rodzina krzywych koloru szarego)
będzie równoważna oryginalnej korelacji wzajemnej po filtracji filtrem uśredniającym
(Rysunek 4-16b krzywa czarna). W analizowanym przypadku wymagane było
zastosowanie filtra uśredniającego trójkątnego o 29 współczynnikach, 5 rzędu. Rząd filtru
rozumieć należy jako liczbę iteracji filtru. Charakterystyki częstotliwościowe filtracji
metodą drgań losowych z oknem +/-20ms oraz filtru uśredniającego trójkątnego o 58
współczynnikach, 5 rzędu przedstawione zostały na Rysunku 4-17.
87
a) Metoda drgań losowych
b) Filtracja uśredniająca
Rysunek 4-16: Porównanie wartości progowych uzyskanych metodą drgań losowych z szerokością
okna czasowego +/-20ms (a) i metodą filtru uśredniającego (b). Te same wartości progów
można otrzymać przesuwając odfiltrowaną korelację wzajemną o wartość 3 odchyleń
standardowych szumu powyżej (czerwona krzywa) i poniżej (zielona krzywa).
Rysunek 4-17: Porównanie charakterystyk: filtr uśredniający 5-rzędu o 29 współczynnikach
(zielona krzywa z diamentami), charakterystyka odpowiadająca filtracji wynikającej
z wprowadzenia drgań losowych +/-20ms (czerwona krzywa).
Jak widać na powyższym przykładzie, zastosowanie odpowiednich parametrów filtru
uśredniającego umożliwia filtrację sygnału równoważną z zastosowaniem metody drgań
losowych. Okno drgań losowych dobierane jest empirycznie, zależnie od dynamiki
synaptycznej badanej tkanki nerwowej w zakresie od kilku do kilkudziesięciu milisekund.
Często spotykaną wartością drgań w badaniach mózgu myszy jest +/-5ms [89] [94], co
odpowiada częstotliwości granicznej 45 Hz. Dla danych eksperymentalnych
prezentowanych w niniejszej rozprawie optymalne okazało się użycie filtru
o częstotliwości 11 Hz (odpowiednik okna drgań losowych +/-20 ms)
88
4.5.3. Określenie istotności statystycznej korelacji wzajemnej
Każdy wynik obliczenia funkcji korelacji wzajemnej możemy potraktować jako
złożenie trzech składowych:
 komponentu stałego o pewnej wartości, w elektronice zwanego składową stałą,
 szumu o charakterze losowym, który przyjmuje wartości dodatnie lub ujemne
względem poziomu stałego,
 sygnału będącego pochodną istnienia oddziaływań synaptycznych.
Przykład korelacji wzajemnej dla pary neuronów oraz jego trzy składowe zostały
przedstawione na Rysunku 4-18.
Rysunek 4-18: Przykład separacji funkcji korelacji wzajemnej na trzy składowe: składową
stałą, sygnał i szum.
Oczywiście nie zawsze można wyróżnić powyższe 3 składowe. Jeżeli nie istnieje
połączenie synaptyczne pomiędzy neuronami, korelacja wzajemna będzie się składać
tylko z poziomu stałego oraz szumu. W skrajnych przypadkach, jeżeli częstość
występowania potencjałów czynnościowych obu neuronów była bardzo niska, korelacja
wzajemna składa się tylko z kilku punktów powyżej zera i miarodajna analiza statystyczna
nie jest możliwa.
W metodzie drgań losowych kryterium oceny istotności statystycznej jest wykrycie
wzrostu (lub spadku) wartości funkcji korelacji wzajemnej ponad wyznaczonym limitem
(JMAX, JMIN, Rysunek 4-13). Jest to dość konserwatywne i zachowawcze kryterium, ponieważ
nie uwzględnia niskoczęstotliwościowej składowej funkcji korelacji wzajemnej, która na
wykresie objawiać się może jako bardzo wolna fluktuacja, wybrzuszenie lub wklęśnięcie
wykresu. Ta niskoczęstotliwościowa składowa, będąca wynikiem aktywności tła, nie
będzie wpływać na wynik klasyfikacji połączeń, jeżeli jako próg istotności statystycznej
uznamy korelację wzajemną po filtracji, przesuniętą o odpowiednią wielokrotność
odchylenia standardowego szumu (jak zaprezentowano na Rysunku 4-16b). W praktyce,
progi statystyczne odcinające 1% najwyższych i 1% najniższych wartości zostały
zastąpione korelacją wzajemną po działaniu filtru o odpowiedniej stałej czasowej
przesuniętej o 3 odchylenia standardowe szumu w kierunku wartości wyższych i niższych.
Aby „uodpornić” metodę na lokalne zmiany poziomu stałego, zamiast jednej wartości
89
progu, obliczanej jako maksimum (minimum) JMAX (JMIN) z krzywych odcinających 1%
wartości maksymalnych i minimalnych, obliczamy progi jako maksima, ale osobno dla
czasów t < 0 i t > 0. W ten sposób, jeśli mamy do czynienia z korelacją wzajemną
o kształcie jak na Rysunku 4-10, przy czym pik z jednej strony od t=0 będzie miał wyraźnie
mniejszą amplitudę niż po stronie przeciwnej, oba zostaną zakwalifikowane jako synapsy
pobudzające.
Rysunek 4-19: Przykładowe wykresy funkcji korelacji wzajemnej bez oznak połączeń
synaptycznych (a,b) oraz bardzo niskiej liczbie koincydencji (c,d). Dane pochodzą z
eksperymentu 2011-06-29-0.
Obliczenie poziomu szumu może zostać wykonane względem składowej
niskoczęstotliwościowej zamiast składowej stałej. Zastąpienie składowej stałej składową
sygnału o częstotliwościach poniżej 11 Hz wydaje się trafniejsze niż obliczanie poziomu
stałego np. jako średniej, ponieważ brak wystarczających argumentów na to, aby
składowej o niskich częstotliwościach przypisać znaczenie fizyczne lub biologiczne [95].
Jeżeli składowa stała sygnału zostanie zastąpiona składową o niskich
częstotliwościach, otwartym pozostaje pytanie o sposób obliczenia poziomu szumu. Wadą
przytoczonej w rozdziale 4.4.4 metody drgań losowych jest uwzględnianie interesującego
sygnału w procesie obliczania wartości progowej szumu. Powoduje to pewną niespójność,
ponieważ poziom sygnału wpływa na wartości progowe decydujące o jego wykryciu.
Poziom szumu jako odchylenie standardowe od średniej, potrzebny jest w celu
wyznaczenia progu istotności statystycznej. Jeżeli składowe z najniższego zakresu
częstotliwości są uznane za poziom stały, konsekwentnie należy obliczać wartość szumu
względem tej krzywej. Można wykorzystać fakt, że składowe sygnału pochodzące od
oddziaływań synaptycznych w praktyce występują tylko w zakresie -40 ms od +40 ms. W
pierwszym kroku należy wyodrębnić składowe niskich częstotliwości, następnie traktując
je jako poziom stały, obliczyć względem tej krzywej odchylenie standardowe wartości
korelacji wzajemnej, w przedziałach [-T:-40] ms i [40:T] ms z wykluczeniem środka okna
czasowego (przedziału [-40:+40] ms) zgodnie z równaniem (4-35):
90
μ
√
∑
( ()
( ))
∑
(
( ))⁄
( ()
( ))
4-35
gdzie μRMS oznacza wartość średniokwadratową szumu, [-T ; T] – okno czasowe
korelacji wzajemnej, t – interwał czasowy (rozdzielczość) korelacji wzajemnej,
C(t) - funkcja korelacji wzajemnej, CDC(t) - składowa niskiej częstotliwości, korelacja
wzajemna po filtracji filtrem o niskiej częstotliwości odcięcia, typowo 11Hz.
Filtrowanie niskoczęstotliwościowe korelacji oraz zakresy obliczania szumu
przedstawia Rysunek 4-20.
Rysunek 4-20: Przykładowe wykresy korelacji wzajemnych, CDC(t) – korelacje po filtracji filtrem
o częstotliwości granicznej 10Hz, kolorem ciemnoniebieskim zaznaczono obszary, w których
obliczony zostanie poziom szumu względem poziomu C DC(t).
4.5.4. Podsumowanie opracowanej metody i wnioski:
Metoda obliczeniowa, która ma za zadanie zastąpić metodę drgań losowych, została
w sposób systematyczny opisana poniżej:
1) Obliczenie funkcji korelacji wzajemnej szeregów czasowych par neuronów.
Korzystając z własności symetrii korelacji wzajemnej ( )
()
,
obliczane są tylko korelacje dla par A→B. Wnioski na temat kierunku połączenia
synaptycznego wyciągnąć można na podstawie lokalizacji maksimum/minimum
względem czasu t = 0. Używane okno czasowe to +/-80 ms, rozdzielczość 0.2 ms.
2) Odrzucenie korelacji wzajemnych o zbyt niskiej statystyce. Kryterium
dyskryminacji jest średnia wartość funkcji C(t) w całym oknie korelacji
[-80:+80] ms. Jeżeli w żadnym przedziale o szerokości 1 ms wartość funkcji
korelacji wzajemnej nie przekroczy 4 zliczenia/1 ms (wartość ustalona
empirycznie), przypadek nie jest analizowany.
3) Wyznaczenie składowej stałej CDC(t) (de facto niskoczęstotliwościowej)
z obliczonych funkcji przy zastosowaniu filtru uśredniającego, częstotliwość
graniczna filtru 11Hz (szerokość filtru 58 próbek, 5 rząd). Obliczanie odchylenia
standardowego szumu korelacji wzajemnej μRMS względem poziomu CDC(t)
w przedziałach [-80ms :-40ms] oraz [40ms : 80ms] wg. wzoru (4-35).
91
4) Odchylenie standardowe szumu zostaje użyte do obliczenia krzywych CDC(t) oraz
przesuniętych o 3-krotną wartość odchylenia standardowego -3μRMS i +3μRMS
(odpowiednio ciągła linia zielona i czerwona na Rysunku 4-21). Minimum krzywej
CDC(t) - 3μRMS stanowić będzie dolny próg istotności statystycznej, odrębnie dla
czasu t<0 i t >0 (JINH, ang. Inhibitory, przerywana linia zielona na Rysunku 4-21).
Maksimum krzywej CDC(t) + 3μRMS odrębnie dla t<0 i t >0 użyte zostanie jako górny
próg istotności statystycznej (JEXC, ang. Excitatory, przerywana linia czerwona).
Rysunek 4-21: Wykrycie zakresów korelacji wzajemnej wykraczających poza granice
istotności statystycznej. Zakres na osi czasu został zawężony w stosunku do
poprzedniego rysunku dla przejrzystości. Dane z eksperymentu 2011-06-28-1.
92
5) Dyskryminacja funkcji korelacji wzajemnej. Wysoki poziom szumu w zakresie
funkcji, gdzie nastąpiło przekroczenie progu świadczące o aktywności
synaptycznej może powodować nieciągłość korelacji wzajemnej w zakresie, gdzie
został przekroczony próg. Aby zmniejszyć wpływ szumu, dyskryminacji
poddawana jest funkcja korelacji wzajemnej po filtracji dolnoprzepustowej
(Rysunek 4-21, krzywa fioletowa C(t) odszumiony). Częstotliwość graniczna filtru
wynosi 300 Hz, wartość ta pozwala na zachowanie składowych
częstotliwościowych związanych z dynamiką synaps. Typowa wartość stałej
czasowej funkcji eksponencjalnej opisującej dynamikę synapsy wynosi 1.5 ms
(rozdział 4.4.2 oraz [80]).
6) Wyznaczanie przedziałów przekraczających progi istotności statystycznej.
Pierwszym kryterium oceny jest szerokość – jeżeli znaleziony przedział
w przypadku wartości „nad progiem” jest węższy niż 1ms (6 sąsiadujących
punktów przy rozdzielczości czasowej 0.2 ms), przypadek jest odrzucany jako
szum o bardzo wysokim poziomie. Gdyby jednak był to pik wynikający
z połączenia synaptycznego, można uznać go za mało znaczący gdyż w takim
przypadku nie będzie możliwe wyznaczenie bardziej szczegółowych parametrów
kształtu w kolejnym etapie analizy. Dla przedziałów poniżej krzywej JINH
odrzucane są przedziały o szerokości poniżej 2ms, ze względu na dłuższe stałe
czasowe w funkcjach dynamiki synaptycznej tych połączeń (wzór (4-21),
parametry τl i τs). Współrzędne punktów znajdujących się powyżej krzywej JEXC
(kolor pomarańczowy) oraz poniżej krzywej JINH (kolor jasnoniebieski) są
zapisywane dla dalszych etapów analizy.
7) Jeżeli znaleziony przedział wartości funkcji spełnia powyższe kryteria,
analizowane jest położenie punktów początkowego i końcowego przedziału. Jeżeli
odcięte (współrzędne czasu) są tego samego znaku, oznacza to, że znalezione
zostało połączenie monosynaptyczne: jeżeli przedział jest nad progiem JEXC, jest to
połączenie pobudzające, jeżeli pod progiem JINH – połączenie hamujące. Jeżeli
odcięte punktów skrajnych przedziału powyżej JEXC mają różne znaki, czyli
przedział znajduje się po obu stronach wykresu względem czasu t=0, świadczy to
o istnieniu połączenia typu „wspólne źródło” (dla porównania Rysunek 4-9
i Rysunek 4-11).
Na podstawie powyższego algorytmu można wnioskować, że korelacje wzajemne
z Rysunku 4-21 odzwierciedlają połączenie typu wspólne źródło z wzajemnym
połączeniem hamującym (Rysunek 4-21 po lewej) oraz monosynaptyczne połączenie
pobudzające (Rysunek 4-21po prawej).
4.6. Sposoby określania rodzaju znalezionej komórki nerwowej
Dla uzyskania pełniejszego obrazu sieci neuronowej rozkład połączeń funkcjonalnych
warto uzupełnić klasyfikacją komórek nerwowych. Znajomość typu neuronu może mieć
kluczowe znaczenie w interpretacji uzyskanych wyników.
W podrozdziale 4.6
przedstawione zostaną dwa sposoby identyfikacji rodzaju neuronu.
93
4.6.1. Klastrowanie w przestrzeni częstotliwość - szerokość impulsu średnia z autokorelacji
Dla rozróżnienia rodzaju komórki (komórka piramidalna czy interneuron)
wykorzystać można trzy kryteria: częstotliwość potencjałów czynnościowych, czas
trwania potencjałów czynnościowych oraz funkcję autokorelacji. Wspomniany sposób
separacji komórek przedstawiony został w pracy [96], której autorzy dokonali podziału
kilkuset komórek. Typowa częstotliwość aktywacji komórek piramidalnych to
1.4±0.01 Hz, niższa od interneuronów warstwie komórek piramidalnych 14.1±1.43 Hz
(patrz rozdział 1.3.2) oraz 13.0±1.62 dla neuronów z Koryta Hipokampa (łac. Alveus
Hippocampus) i Warstwy Początkowej (łac. Stratum Oriens). Niemniej jednak mogą
zdarzać się wyjątki.
Czas trwania potencjału czynnościowego został zdefiniowany jako szerokość
potencjału w 25% jego maksymalnej wysokości. Średni czas trwania potencjałów dla
komórek piramidalnych wyniósł 0.44±0.005ms, interneuronów w warstwie komórek
piramidalnych 0.22±0.007ms, dla interneuronów w obszarze Koryta Hipokampa
0.24±0.01ms. Również to kryterium nie zapewnia klarownej separacji, ponieważ niektóre
neurony piramidalne i inteneurony wykazują czas trwania impulsu charakterystyczny dla
drugiej grupy komórek.
Dynamika generacji potencjałów czynnościowych również wykazuje pewne różnice.
Komórki piramidalne sporadycznie wykazują generację potencjałów w postaci salw po 5-7
potencjałów z interwałami 3-5ms. Salwy potencjałów czynnościowych widoczne są na
wykresach autokorelacji w postaci kilku pików, w odległościach kilku milisekund.
Rysunek 4-22: Określenie typu komórki w obszarze hipokampa na podstawie danych z rejestracji
zewnątrzkomórkowej. Trzy niezależne parametry potencjałów czynnościowych
wykreślone zostały w przestrzeni 3-wymiarowej. Częstotliwość (frequency), czas trwania
impulsu w 25% amplitudy (duration) oraz średnia wartość pierwszego maksimum na
wykresie autokorelacji mean of ac (ms). Poszczególne neurony sklasyfikowane jako
komórki piramidalne (pyr), interneurony w warstwie kom. piramidalnych int(pyr),
interneurony w Korycie Hipokampa int(a/o) [96].
Interneurony natomiast wykazują dłuższe interwały pomiędzy pojedynczymi
potencjałami w salwie: interneurony w warstwie piramidalnej 7.1±0.12 ms, w Korytarzu
Hipokampa najdłuższe interwały czasowe 12.0±0.17 ms. Dopiero kombinacja trzech
własności: częstotliwości, czasu trwania potencjału czynnościowego oraz wykresu
autokorelacji pozwala na wyróżnienie dwóch klastrów, reprezentujących neurony
piramidalne oraz interneurony [96].
94
4.6.2. Określenie typu komórki na podstawie korelacji wzajemnej
Metoda klasyfikacji przedstawiona w poprzednim paragrafie może się wydawać
imponująco precyzyjna. W eksperymencie na bazie kultur organotypowych, które są
przedmiotem tej rozprawy, częstotliwość rejestrowanych potencjałów czynnościowych
przyjmuje dla danego neuronu wartości z bardzo szerokiego zakresu (np. eksperyment
2011-06-27-0, zakres średniej częstotliwości neuronów w oknie 100 sekund zmieniał się
od 0,0097Hz do 1,75Hz). Wyznaczenie czasu trwania (szerokości) potencjału
czynnościowego będzie obarczone dużą niepewnością. Alternatywą dla wnioskowania na
temat rodzaju neuronu na podstawie parametrów obrazu elektrofizjologicznego jest
klasyfikacja komórek na podstawie znalezionych połączeń monosynaptycznych [97].
Określenie komórki nerwowej jako pobudzającej lub hamującej na podstawie połączeń
monosynaptycznych ma jednak pewną wadę: aby jednoznacznie przypisać znalezioną
komórkę do jednej z dwóch klas, neuron presynaptyczny musi być źródłem tylko jednego
rodzaju połączeń synaptycznych. W praktyce, metoda korelacji wzajemnej pozwala na
znalezienie połączeń funkcjonalnych, które nie zawsze odpowiadają pojedynczym
połączeniom synaptycznym. Kształt funkcji korelacji wzajemnej zbliżony do kształtu
typowego dla połączeń pobudzających, ale przesunięty na osi czasu w kierunku wyższych
wartości, może być spowodowany istnieniem neuronu pośredniczącego, podobnie jak
przesunięty na osi czasu spadek eksponencjalny [73].
Czasami metoda automatycznej detekcji połączeń funkcjonalnych prowadzi do
jednoczesnego wykrycia połączenia pobudzającego i hamującego, mających swoje źródło
w jednym z neuronów. Przypadek ten został przedstawiony na Rysunku 4-23, nie należy
go mylić z połączeniem typu ujemnego sprzężenia zwrotnego, w którym neuron
A wzbudza B, a neuron B hamuje A. Dopasowanie danych do funkcji opisującej dynamikę
synaptyczną (4-20) pozwala wyznaczyć wartości współczynników funkcji
eksponencjalnych. Dla danych z Rysunku 4-23 równanie synapsy pobudzającej przybiera
postać:
m
m
()
) e (
)]
[e (
4-36
m
m
natomiast równanie (4-21) opisujące dynamikę synapsy hamującej:
()
[e
(
m
)
m
e
(
m
)]
m
4-37
Parametry te zostały wyznaczone przy narzuconym warunku wartości opóźnienia
synapsy S = 1.35. Parametr ten został przyjęty jako najbliższy od t=0 punkt, w którym
przekroczony został próg istotności statystycznej. Funkcja CEXC(t) oznaczona została
kolorem żółtym, funkcja CINH(t) kolorem różowym, suma tych funkcji CEXC(t) + CINH(t)
ciemnoczerwonym. Suma składowych korelacji wzajemnych wyznaczonych analitycznie
z dopasowania krzywych, wykazuje bardzo dobrą zgodność z kształtem korelacji
wzajemnej obliczonej z danych eksperymentalnych. Niewielkie różnice mają swoje źródło
w szumie oraz niepewności parametru S = 1.35, narzuconego arbitralnie dla obu
połączeń. Postawiona przez autora teza, iż jeden neuron łączy się z drugim poprzez
równoległe oddziaływanie pobudzające i hamujące, kłóci się z ogólnie przyjętą
w literaturze prawidłowością przypisującą danemu typowi neuronów jedynie funkcję
pobudzającą lub hamującą [10]. Kształt funkcji korelacji wzajemnej może mieć swoje
95
źródło w aktywności więcej niż dwóch neuronów, dla których obliczana jest korelacja
wzajemna [73] [79].
Rysunek 4-23: Połączenie dwóch neuronów poprzez dwa połączenia monosynaptyczne: opadająca
część charakterystyki jest wynikiem dominacji połączenia hamującego w zakresie od -15
do -5ms, od -5ms do 0ms dominuje połączenie pobudzające. Kształt korelacji wzajemnej
jest wynikiem sumowania się składowej od połączenia pobudzającego (żółta krzywa)
oraz składowej od połączenia hamującego (krzywa różowa). Oznaczenia na lewym
rysunku analogiczne do Rysunku 4-21.
W omawianym przypadku, ze względu na krótki czas opóźnienia połączenia
pobudzającego, najbardziej prawdopodobna konfiguracja połączeń synaptycznych
przedstawiona została na Rysunku 4-24.
Rysunek 4-24: Połączenia synaptyczne 3 neuronów: neuron A pobudza synaptycznie (synapsa
czerwona) neuron C, ale również neuron B, który działa na C synapsą hamującą (synapsa
czarna).
Na podstawie przytoczonego przykładu, odrzucanie neuronów, które działają na
sąsiadujące zarówno w sposób hamujący, jak i pobudzający nie zawsze musi być
uzasadnione. Klasyfikując neurony jako pobudzające lub hamujące na podstawie połączeń
funkcjonalnych, decydującym czynnikiem jest liczebność danego rodzaju połączeń. Jeżeli
dominują połączenia hamujące neuron jest klasyfikowany jako interneuron, jeśli
większość połączeń to połączenia pobudzające – jako komórka piramidalna.
96
5. BADANIE
POŁĄCZEŃ FUNKCJONALNYCH W KULTURACH ORGANOTYPOWYCH MÓZGU
MYSZY
W tym rozdziale przedstawiona zostanie szczegółowa analiza aktywności
spontanicznej 52 kultur organotypowych pozyskanych z mózgu myszy, ukierunkowana na
obszar hipokampa. Zaprezentowane zostanie użycie metod poszukiwania połączeń
funkcjonalnych opisanych w rozdziale 4. Wykonane przed hodowlą i podczas
eksperymentu zdjęcia badanych kultur wykorzystane zostały do precyzyjnej lokalizacji
zidentyfikowanych neuronów względem obszarów anatomicznych. Fotografie oraz
automatyczna analiza oparta na metodzie korelacji wzajemnej posłużą do sporządzenia
map połączeń funkcjonalnych pobudzających i hamujących. 18 spośród 52 badanych
kultur pochodziły od myszy cierpiących na Syndrom Łamliwego Chromosomu X
(ang. Fragile X Syndrome [98]). Celem takiego doboru osobników było zbadanie, czy
Syndrom Łamliwego Chromosomu X wpływa na gęstość połączeń funkcjonalnych.
W drugiej części rozdziału opisana zostanie metoda automatycznej detekcji par
neuronów, które aktywowane są naprzemiennie z częstotliwością charakterystyczną dla
rytmu fal mózgowych gamma. Przebiegi funkcji korelacji wzajemnej odpowiadające
połączeniom pobudzającym zostaną poddane szczegółowej analizie polegającej na
dopasowaniu funkcji eksponencjalnej do fazy narastania i opadania. Uzyskane
z dopasowania stałe czasowe pozwolą na przedstawienie pewnych prawidłowości
statystycznych dla stałych czasowych synaps, które powtarzają się we wszystkich
badanych kulturach organotypowych.
5.1.
Badanie połączeń pobudzających i hamujących,
komórek pobudzających i hamujących
rozpoznawanie
Do znajdywania połączeń funkcjonalnych między parami neuronów wykorzystana
zostanie metoda przedstawiona w rozdziale 4.5. Naniesienie znalezionych połączeń
funkcjonalnych na mapę lokalizacji neuronów pozwala uzyskać rozkład przestrzenny
danego rodzaju połączeń funkcjonalnych lub mikroobwodów, co samo w sobie może być
interesujące z punktu widzenia teorii przesyłania informacji między komórkami
nerwowymi. Można na tej podstawie wnioskować o gęstości połączeń w całej kulturze
oraz ich rozkładzie przestrzennym. Najprostszym i jednocześnie efektywnym sposobem
na połączenie informacji o budowie morfologicznej z mapą połączeń funkcjonalnych jest
wykonanie zdjęć kultur organotypowych wysokiej rozdzielczości (przy użyciu mikroskopu
optycznego) i naniesienie lokalizacji neuronów oraz połączeń funkcjonalnych.
5.1.1. Mikrofotografie kultur organotypowych i ich rola w identyfikacji
aktywności elektrycznej poszczególnych struktur anatomicznych
Proces przygotowania kultury organotypowej do eksperymentu składa się z kilku faz,
opisanych w rozdziale 4.1. Rozkład zniszczonej warstwy komórek powoduje zanik
widoczności wyraźnej struktury warstwowej formacji hipokampa, którą doskonale widać
w świeżo uciętych plasterkach (ang. Accute Slices).
97
a)
c)
b)
d)
Rysunek 5-1: Fotografie mikroskopowe kultur organotypowych: a), b) – fotografie plasterków
zawierających hipokamp, c), d) – fotografie tych samych fragmentów tkanki po trzech
tygodniach hodowli w inkubatorze. Na zdjęciach zachowana została orientacja kultur
organotypowych. Zdjęcia kultur użytych do eksperymentów 2011-06-24-1(a i c) oraz
2011-06-29-0 (b i d).
Fotografie a) i b) na Rysunku 5-1wykonane zostały bezpośrednio po cięciu mózgu na
plasterki grubości 400μm. W obu przypadkach widać wyraźną, warstwową strukturę
anatomiczną hipokampa (porównaj z Rysunkiem 1-9 oraz 1-10). Fotografie c) i d)
wykonane zostały po 3 tygodniach hodowli w inkubatorze. Skutkiem hodowli jest
wyraźny zanik granic pomiędzy strukturami anatomicznymi. Problem z rejestracją
aktywności w interesującym eksperymentatora obszarze anatomicznym spowodowany
jest słabą widocznością struktur anatomicznych w momencie pozycjonowania kultury
organotypowej na matrycy mikroelektrod. Kultury organotypowe po kilku tygodniach
hodowli wyglądają zupełnie inaczej, niż w dniu przygotowania. Obserwacja aktywności
neuronów oraz analiza wykrytych połączeń funkcjonalnych ma największą wartość, jeżeli
odniesiona zostanie do struktur anatomicznych. Najczęściej wycinek po hodowli
umieszczany jest na matrycy w wysokim stopniu losowy i rzadko udaje się przeprowadzić
rejestrację dokładnie z interesującego regionu tkanki. Niemniej jednak przedstawiona
poniżej procedura nakładania zdjęć przed i po hodowli pozwala nanieść mapę neuronów
i połączeń funkcjonalnych na fotografię struktur anatomicznych.
98
a)
b)
Rysunek 5-2: Zdjęcia kultur organotypowych wykonane po umieszczeniu na matrycy
mikroelektrod; zdjęcia odpowiadają kulturom z Rysunku 5-1: 2011-06-24-1(a) oraz
2011-06-29-0 (b). Wymiary matrycy – 1 x 2mm.
W jaki sposób można powiązać struktury anatomiczne z lokalizacjami neuronów
zidentyfikowanych w wyniku rejestracji aktywności elektrycznej? Rysunek 5-2
przedstawia dwie fotografie kultur organotypowych na matrycy 512 mikroelektrod.
Na matrycy umiejscowiony jest fragment, którego zarys przypomina hipokamp, jednak
wskazanie lokalizacji wybranej struktury (CA1, CA3, DG) używając tylko zdjęcia na
matrycy, nie jest oczywiste. Aby poprawić dokładność lokalizacji struktur anatomicznych,
dokonuje się manualnego nałożenia fotografii wykonanych bezpośrednio po
przygotowaniu kultur do hodowli (DIV1, ang. Day In Vitro 1) na fotografie kultur
umieszczonych na matrycy podczas eksperymentu. Jedno ze zdjęć poddane zostało
korekcie polegającej na dostosowaniu kąta obrotu, przesunięcia i powiększenia jednego
obrazu względem drugiego z wykorzystaniem szczególnych punktów widocznych na obu
zdjęciach. W ten sposób można wyznaczyć położenie struktur anatomicznych względem
matrycy. Proces nakładania zdjęć ilustruje na Rysunek 5-3.
Lokalizacja (współrzędne) neuronów na matrycy mikroelektrod wyznaczane są
z dokładnością większą niż rozdzielczość matrycy, która w przypadku używanej
w omawianych eksperymentach wynosiła 60μm. Zjawisko pobudzania wielu elektrod
przez jeden neuron, nastręczające wielu problemów w procesie sortowania potencjałów
czynnościowych, działa na korzyść podczas ustalania położenia neuronów. Amplitudy
zarejestrowanych potencjałów czynnościowych pochodzące z kilku sąsiadujących elektrod
wykorzystywane są do znalezienia punktu najbardziej prawdopodobnego położenia ciała
neuronu. W tym celu wykorzystywane jest dopasowanie dwuwymiarowej funkcji Gaussa
[42]. Zdjęcie kultury organotypowej na matrycy uzupełnione o lokalizacje neuronów
przedstawione zostało na Rysunku 5-4. Dla lepszej przejrzystości rysunku pozycje
elektrod zostały oznaczone jasnymi punktami, neurony widoczne są jako niebieskie
trójkąty. Niektóre neurony znajdują się poza matrycą mikroelektrod – jest to wynik
dopasowania dwuwymiarową funkcją Gaussa. Większość zidentyfikowanych neuronów
znajduje się w obszarze hipokampa. Kilka neuronów w lewym górnym rogu i przy prawej
krawędzi matrycy to neurony kory mózgowej.
99
a)
c)
b)
d)
Rysunek 5-3: Rozpoznawanie struktur anatomicznych: a) pierwszy dzień hodowli, b) zdjęcie
kultury na matrycy podczas eksperymentu, c) nałożone obrazy a i c, zmodyfikowano
wzajemne położenie w celu dopasowania przestrzennego, d) zdjęcie wyostrzone,
oznaczone struktury hipokampa: CA1, CA3, DG i S. Większość obszaru CA3 znalazła się
poza obszarem matrycy elektrod.
Rysunek 5-4: Fotografia kultury organotypowej na matrycy nałożona na fotografię
z pierwszego dnia hodowli (DIV1). Białymi punktami oznaczono lokalizacje
elektrod, niebieskie trójkąty symbolizują neurony.
100
5.1.2. Mapy połączeń funkcjonalnych
hipokampu mózgu myszy
w
kulturach
organotypowych
Wykorzystując techniki poszukiwania połączeń pobudzających i hamujących,
Rysunek 5-4 można uzupełnić połączeniami pobudzającymi i hamującymi w postaci linii
gradientowych. Pozwala to na stworzenie pełnej mapy neuronów i występujących między
nimi połączeń funkcjonalnych. Dodatkowo, mapę można uzupełnić o informacje na temat
prawdopodobnego typu znalezionego neuronu. Określenie „prawdopodobnego” oznacza,
że przypisanie komórki do danej klasy nie opiera się na metodzie pozwalającej ze 100%
pewnością stwierdzić, z jaką komórką mamy do czynienia. Metodą taką jest n.p. barwienie
immunologiczne barwnikami fluorescencyjnymi (ang. Immunostaining) [98], jednak
zastosowana klasyfikacja opiera się na liczbie połączeń dominującego typu.
Dla przejrzystości, połączenia typu pobudzającego i hamującego przedstawione zostały na
oddzielnych rysunkach (Rysunek 5-5, Rysunek 5-6).
Rysunek 5-5: Mapa połączeń funkcjonalnych uzyskana z eksperymentu 2011-06-26-2
prezentująca połączenia pobudzające oraz podział neuronów na pobudzające (komórki
piramidalne, niebieskie trójkąty), hamujące (interneurony, zielone okręgi) oraz neurony
nieokreślonego typu (czarne kwadraty).
Na pierwszych zaprezentowanych mapach połączeń funkcjonalnych przedstawiony
został podział neuronów na pobudzające, oznaczane na omawianych rysunkach
i wszystkich następnych jako niebieskie trójkąty, hamujące (zielone okręgi) oraz
niezidentyfikowane (czarne kwadraty). Na pierwszy rzut oka widać, że spośród
znalezionych 79 neuronów, tylko 4 zidentyfikowane zostały jako neurony hamujące, 45
jako neurony pobudzające, w przypadku pozostałych 30 neuronów nie można określić
typu ponieważ albo są to tylko neurony postsynaptyczne (nie będące źródłem
oddziaływania), albo nie uczestniczą w sieci połączeń funkcjonalnych.
101
Rysunek 5-6: Mapa połączeń funkcjonalnych uzyskana z eksperymentu 2011-06-26-2
prezentująca połączenia hamujące oraz podział neuronów na pobudzające (komórki
piramidalne, niebieskie trójkąty), hamujące (interneurony, zielone okręgi) oraz neurony
nieokreślonego typu (czarne kwadraty).
Często stosowanym parametrem określającym własności sieci neuronowej jest gęstość
połączeń funkcjonalnych. Jeżeli jako N oznaczymy liczbę zidentyfikowanych neuronów,
a jako CE liczbę znalezionych połączeń pobudzających, gęstość połączeń DE wyrazimy
wzorem:
D
N(N
)
5-1
Mianownik powyższego wyrażenia oznacza liczbę potencjalnie możliwych połączeń.
Gęstość połączeń pobudzających na Rysunku 5-5 wynosi 0.0209, gęstość połączeń
hamujących na Rysunku 5-6 wynosi 0.0039. Jak widać, zarówno liczba neuronów
hamujących jak i połączeń hamujących jest mniejsza niż neuronów i połączeń
pobudzających. Wniosek ten, wyciągnięty na podstawie pierwszego zestawu wyników
eksperymentalnych pozostaje w zgodzie z obserwacjami mikroskopowymi oraz
eksperymentami prowadzonymi techniką elektrod wkłuwanych (rozdział 1.3.2 oraz [10]
i [99]).
Poniżej przedstawionych zostanie kilka przykładów map neuronów wraz
z połączeniami funkcjonalnymi uzyskanymi z danych eksperymentalnych:
A) Eksperyment 2011-06-28-1
Interesujący wynik uzyskany został w eksperymencie 2011-06-28-1, który pozwolił
zarejestrować aktywność neuronów hipokampa oraz neuronów kory. Według danych
literaturowych, preferowanym kierunkiem transmisji potencjałów czynnościowych jest od
obszaru CA3 do CA1 oraz od kory do CA1 lub CA3. Dokładna analiza połączeń pozwala
dojść do wniosku, że faktycznie kierunki te można określić jako „preferowane”. Oznacza
to, że nie wszystkie, ale większość połączeń funkcjonalnych ukierunkowana jest właśnie
w taki sposób, choć zidentyfikowane zostały też połączenia w kierunkach przeciwnych.
102
Analizując rozkład gęstości połączeń w badanym skrawku, można wyróżnić dwa duże
obszary zagęszczenia połączeń pobudzających: pierwszy to obszar hipokampa, drugi to
znajdujący się na matrycy rejon kory. Gęstość połączeń pomiędzy tymi obszarami jest
bardzo niska (jest to tylko 13 połączeń). Mapa neuronów nałożona na zdjęcie pierwszego
dnia hodowli przedstawiona została na Rysunku 5-7.
Rysunek 5-7: Mapa neuronów, eksperyment 2011-06-28-1. Zaznaczone zostały obszary
hipokampa CA1, CA3, DG. Oprócz neuronów hipokampa, zarejestrowana została
aktywność neuronów kory.
Mapa połączeń pobudzających przedstawiona została na Rysunku 5-8. Podział
połączeń funkcjonalnych w obszarze hipokampa i kory widoczny jest doskonale na mapie
połączeń pobudzających.
Rysunek 5-8: Mapa połączeń pobudzających, eksperyment 2011-06-28-1. Zaznaczone zostały
obszary hipokampa CA1, CA3.
Również w przypadku mapy połączeń hamujących (Rysunek 5-9) widoczny jest
podział na dwie strefy aktywności: hipokamp i korę. Gęstość połączeń hamujących wynosi
0.0071 i jest niższa od gęstości połączeń pobudzających równej 0.0162.
103
Rysunek 5-9: Mapa połączeń hamujących, eksperyment 2011-06-28-1. Znaleziono tylko jedno
połączenie w kierunku od hipokampa do kory.
B) Eksperyment 2012-04-17-1
W zależności od pozycjonowania kultury organotypowej na matrycy, zauważyć można
różne charakterystyki połączeń. W eksperymencie 2012-04-17-1, zidentyfikowanych
zostało 151 neuronów, z czego większość w obszarze hipokampa. Rozkład neuronów
przedstawia Rysunek 5-10.
Rysunek 5-10: Mapa neuronów, eksperyment 2012-04-17-1. Zaznaczone zostały obszary
hipokampa CA1, CA3, DG. 113 z 151 neuronów znajduje się w obszarze hipokampa.
Przedstawiony przypadek jest szczególny pod względem bardzo równomiernego
rozkładu neuronów w obszarach DG, CA1 i CA3. Obszar hipokampa dokładnie pokrywa
matrycę mikroelektrod, choć takie ułożenie najczęściej jest dziełem przypadku. Znalezione
zostały neurony pobudzające, jak również hamujące we wszystkich obszarach hipokampa,
niestety ciężko wyróżnić warstwową strukturę rozkładu komórek. Podobnie w przypadku
połączeń funkcjonalnych pobudzających i hamujących, rozkład wydaje się być
„homogeniczny”. Najprawdopodobniej jest to spowodowane wykryciem aktywności
wielu komórek poprzez rejestrację sygnałów z aksonów lub dendrytów, a nie z ciała
104
neuronu. Gęstość połączeń pobudzających wynosi 0.0080131, połączeń hamujących
0.0011166.
Rysunek 5-11: Mapa połączeń pobudzających, eksperyment 2012-04-17-1. Zaznaczone zostały
obszary hipokampa CA1, CA3.
Rysunek 5-12: Mapa połączeń hamujących, eksperyment 2011-04-17-1.
C) Eksperyment 2012-04-19-0
Rozkład zidentyfikowanych neuronów w eksperymentach z użyciem kultur
organotypowych nie zawsze jest jednorodny, jak w poprzednim przykładzie. Eksperyment
2012-04-19-0 pozwolił na rejestrację aktywności 109 neuronów (Rysunek 5-13), z czego
99 w obszarze hipokampa. Zdecydowanie najwięcej komórek znalezionych zostało
w obszarze CA1.
Gęstość połączeń funkcjonalnych rozkłada się proporcjonalnie do gęstości neuronów.
W obszarze CA1 gęstość połączeń pobudzających jest najwyższa. Interesujący jest fakt
znalezienia połączeń z obszaru CA3 w kierunku CA1, zgodnie z przewidywaniami
wynikającymi z danych literaturowych (patrz rozdział 1.3.4), choć liczba połączeń
w obszarze CA3 jest bardzo niska. Podobnie w przypadku połączeń hamujących,
najwyższa gęstość występuje w obszarze CA1.
105
Rysunek 5-13: Mapa neuronów, eksperyment 2012-04-19-0. Zaznaczone zostały obszary
hipokampa CA1, CA3, DG. 99 z 109 neuronów znajduje się w obszarze hipokampa.
Rysunek 5-14: Mapa połączeń pobudzających, eksperyment 2012-04-19-0. Zaznaczone zostały
obszary hipokampa CA1, CA3.
Rysunek 5-15: Mapa połączeń hamujących, eksperyment 2011-04-19-0.
106
Gęstość połączeń pobudzających wynosi 0.008641, gęstość połączeń hamujących
0.003968. Stosunek gęstości połączeń pobudzających do hamujących równy 2,17 jest
bardzo niski w porównaniu do innych wykonanych eksperymentów.
D) Eksperyment 2012-05-21-0
Rysunek 5-16: Mapa neuronów, eksperyment 2012-05-21-0. Zaznaczone zostały obszary
hipokampa CA1, CA3, DG. 97 z 165 neuronów znajduje się w obszarze hipokampa.
W przeciwieństwie do eksperymentu 2011-04-19-0, w którym większość aktywności
skupiona była w obszarze CA1, w kulturze organotypowej 2012-05-21-0 liczba
zidentyfikowanych połączeń funkcjonalnych w obszarze C1 jest bardzo niska, natomiast
w CA3 jest bardzo wysoka. Co ciekawe, w obszarze CA1 udało się zidentyfikować znaczącą
liczbę neuronów, które są zgrupowane warstwowo na poziomie warstwy komórek
piramidalnych.
Rysunek 5-17: Mapa połączeń pobudzających, eksperyment 2012-05-21-0. W obszarze CA1
wyznaczona gęstość połączeń jest bardzo niska, w przeciwieństwie do wysokiej gęstości
połączeń w obszarze CA3.
107
Również zidentyfikowana liczba połączeń hamujących jest bardzo mała. W lewym
górnym rogu matrycy oraz na jej górnej krawędzi zarejestrowano aktywność neuronów
kory, pomiędzy którymi znaleziono połączenia funkcjonalne pobudzające i hamujące.
Neurony kory tworzą jednak oddzielną grupę funkcjonalną nie połączoną z neuronami
hipokampa. Gęstość znalezionych połączeń pobudzających w eksperymencie
2012-05-21-0 wynosi 0.009239, połączeń hamujących 0.001737.
Rysunek 5-18: Mapa połączeń hamujących, eksperyment 2011-05-21-0. Neurony kory tworzą
oddzielną grupę funkcjonalną od neuronów hipokampa.
E) Eksperyment 2012-05-22-1
W eksperymencie 2012-05-22-1 wykrytych zostało 289 neuronów, co jest jedną
z najwyższych liczb spośród wszystkich przeprowadzonych eksperymentów. Neurony
zlokalizowane zostały na całej powierzchni matrycy we wszystkich strukturach
hipokampa, jak również w obszarze kory. Na Rysunku 5-19 widoczna jest duża grupa
neuronów blisko prawej krawędzi matrycy, która nie została sklasyfikowana jako neurony
pobudzające ani hamujące.
Rysunek 5-19: Mapa neuronów, eksperyment 2012-05-22-1. Zaznaczone zostały obszary
hipokampa CA1, CA3, DG. 171 z 289 neuronów znajduje się w obszarze hipokampa.
108
Jest to wynikiem braku znalezionych połączeń funkcjonalnych wewnątrz tego obszaru
(podpory wzgórka, S - Subiculum), jak również połączeń funkcjonalnych tego obszaru
z pozostałymi. Gęstość połączeń pobudzających wynosi 0.003785, hamujących 0.001130.
Rysunek 5-20: Mapa połączeń pobudzających, eksperyment 2012-05-22-1. W obszarze CA1
występuje wysoka gęstość neuronów, wysoka gęstość połączeń oraz duża liczba połączeń
z innymi obszarami, również z korą. Obszar S wykazuje dużą gęstość neuronów przy
braku połączeń funkcjonalnych.
Rysunek 5-21: Mapa połączeń hamujących, eksperyment 2011-05-22-1.
F) Eksperyment 2011-06-27-1
Eksperyment 2011-06-27-1 jest kolejnym, w którym pozycjonowanie kultury
pozwoliło na rejestrację aktywności prawie całego hipokampa. Zidentyfikowanych
zostało 98 neuronów, wszystkie jako neurony hipokampa. Gęstość neuronów nie jest
homogeniczna, widoczna jest wyraźna, ciągła warstwa neuronów, głównie w obszarze
CA1, najniższa gęstość neuronów występuje w obszarze CA3. Obszar oznaczony jako CA3
może w rzeczywistości być już obszarem CA2, jednak tak dokładne pozycjonowanie nie
jest możliwe bez wybarwiania pojedynczych komórek.
109
Rysunek 5-22: Mapa neuronów, eksperyment 2011-06-27-1. Zaznaczone zostały obszary
hipokampa CA1, CA3, DG. 171 z 289 neuronów znajduje się w obszarze hipokampa
Na Rysunku 5-23 przedstawione zostały połączenia pobudzające. Większość połączeń
pomiędzy obszarem CA3 a CA1 jest zorientowana w kierunku od CA3 do CA1, brakuje
natomiast klarownej polaryzacji kierunku pomiędzy DG - CA1 oraz DG - CA3.
Rysunek 5-23: Mapa połączeń pobudzających, eksperyment 2011-06-27-1. W tym eksperymencie
zachowana została wyraźna warstwowa struktura neuronów w obszarach CA1 i CA3.
W przypadku połączeń hamujących, widać wyraźny podział na 3 obszary – pierwszy to
grupa połączeń w DG, drugi w CA3 i trzeci w CA1 z dużym prawdopodobieństwem
zazębiający się z CA2. Na Rysunku 5-24 widoczna jest jeszcze jedna cecha odróżniająca
połączenia funkcjonalne hamujące od pobudzających, która nie została podkreślona
w opisach poprzednich wyników, mianowicie zasięg oddziaływania. W przypadku
oddziaływań hamujących średni zasięg połączenia jest krótszy niż dla połączeń
pobudzających. Jest to cecha, którą spodziewalibyśmy się znaleźć jeżeli w kulturach
organotypowych nie zaszłyby patologiczne zmiany. Warto przypomnieć, iż jedną z cech
interneuronów, inaczej zwanych neuronami hamującymi, jest krótki zasięg aksonów.
Gęstość połączeń pobudzających wynosi 0.01778, połączeń hamujących wynosi 0.004103.
110
Rysunek 5-24: Mapa połączeń hamujących, eksperyment 2011-06-27-1. Powyższa mapa połączeń
jest przykładem krótkiego zasięgu połączeń hamujących.
5.2.
Identyfikacja połączeń zsynchronizowanych w rytmie gamma
Oprócz znajdywania połączeń funkcjonalnych typu pobudzającego, hamującego lub
wspólnego źródła, funkcja korelacji wzajemnej może być podstawą do znajdywania
jeszcze jednej charakterystycznej interakcji pomiędzy parą neuronów. Niektóre
z obliczanych korelacji wzajemnych przedstawione na wykresie mają kształt, któremu
ciężko przypisać konkretny obiekt opisywalny za pomocą funkcji analitycznej mającej
znaczenie fizyczne, tak jak to miało miejsce w przypadku połączeń pobudzających lub
hamujących. Kształt ten podobny jest do funkcji Gabora - przedstawiony został na
Rysunku 5-25.
Rysunek 5-25: Przykładowy wykresy funkcji korelacji wzajemnej: maksimum centralne
i maksima boczne dla czasu dodatniego i ujemnego w równej odległości 20 ms od
maksimum centralnego.
Wskazanie na podstawie kształtu korelacji wzajemnej, jak topologia połączeń
funkcjonalnych oraz dynamika synaps przekłada się na kształt zbliżony do funkcji Gabora
jest zadaniem bardzo skomplikowanym.
111
5.2.1. Geneza rytmów (fal) mózgowych. Hipotetyczny układ neuronów
generujący rytm gamma
Uważa się, że oscylacje w strukturach mózgu pełnią funkcję synchronizowania
w czasie działania grup neuronów w procesach reprezentacji, przetwarzania,
zachowywania i odtwarzania informacji [100]. Spośród kilku rodzajów oscylacji
mózgowych, falom gamma poświęca się szczególną uwagę ze względu na przypuszczalnie
dużą rolę w odbieraniu bodźców zmysłowych, pamięci, koncentracji [101]. Niektóre
śmiałe hipotezy wiążą nawet rytm gamma z doświadczaniem świadomości [102].
W obszarach kory mózgowej odpowiedzialnych za odbieranie bodźców, rytm gamma jest
zsynchronizowany z docierającymi do tych obszarów bodźcami [103]. W hipokampie,
dokładne źródło powstawania oscylacji gamma nie jest dokładnie poznane.
Jedna z hipotez na temat powstawania rytmu gamma w hipokampie, poparta danymi
eksperymentalnymi przedstawiona została w pracy [104]. Proponowany model zakłada,
że rytm gamma jest rezultatem oddziaływania neuronów piramidalnych z obszaru CA3
i interneuronów. Wspólna aktywność grup komórek jest odpowiedzialna za powstawanie
zewnątrzkomórkowych oscylacji w zakresie rytmu gamma. Zakłada się, że rytm gamma
generowany w CA3 ma być źródłem oscylacji w CA1. Dowodem popierającym taki wniosek
jest między innymi wyprzedzanie w fazie uśrednionego sygnału w CA3 w stosunku do
CA1. Brak zdolności do generacji rymu w CA1 tłumaczy się brakiem równoległego układu
samowzbudzania, który jest cechą szczególną CA3 (porównaj schemat na Rysunku 1-11,
tylko CA3 generuje sygnały skierowane zwrotnie do tego samego obszaru). Co więcej,
komórki koszyczkowe w CA1 są wzbudzane przez znacznie większą liczbę synaps
neuronów piramidalnych z obszaru CA3 niż neuronów piramidalnych z CA1.
Najważniejsze cechy mechanizmu generacji rytmu gamma w hipokampie według [104]
przedstawione zostały na Rysunku 5-26.
Rysunek 5-26: Mechanizm powstawania oscylacji typu gamma w hipokampie według [104]. A) Źródłem
oscylacji w hipokampie może być kora nosowa (EC), lub CA3. Oscylacje propagują się
w kierunku DG→CA3→CA1. B) Przesunięcia fazy pomiędzy sygnałem zewnątrzkomórkowym
w różnych obszarach wskazują na kierunek propagacji oscylacji. C) Mechanizm generacji
oscylacji obejmujący liczne komórki piramidalne i pojedyncze interneurony. D) Uśrednione
przebiegi w poszczególnych warstwach komórek.
Dwa główne źródła oscylacji stanowią: generator oscylacji w zakręcie zębatym (DG)
wzbudzany przez korę nosową i generator w obszarze CA3 stanowiący wewnątrzhipokampalne źródło oscylacji. Występowanie rytmu gamma w obszarze CA1 zależy od
sygnałów pochodzących z CA3. Generatory w DG i CA3 są ze sobą słabo sprzężone.
Bezpośredni wpływ kory węchowej EC na oscylacje w obszarze CA3 nie został
zarejestrowany. Rysunek 5-26 B) przedstawia uśrednione przebiegi napięcia
112
zarejestrowane w warstwach komórek piramidalnych CA1 i CA3 oraz GC (warstwa
komórek ziarnistych, ang. Granulae Cells). Miejsca rejestracji sygnału i przebiegi napięcia
zostały oznaczone odpowiednimi kolorami. Pomarańczowa i czerwona krzywa oznaczają
przebiegi w obszarze CA1. Jak widać przesunięcie w fazie zwiększa się stopniowo
w kierunku DG, CA3, CA1. Rysunek 5-26 C prezentuje hipotetyczny schemat generatora
rytmu: aktywowane neurony piramidalne (niebieskie) w obszarze CA3 wzbudzają się
wzajemnie oraz wzbudzają interneurony (czerwone) zarówno w regionie CA1 i CA3.
Sprzężenie zwrotne hamuje aktywację komórek piramidalnych w obszarze CA1.
Rysunek 5-26 D prezentuje uśrednione przebiegi aktywności w CA1 w warstwie komórek
piramidalnych i warstwie promienistej (dwa górne przebiegi) oraz w CA3 w warstwie
promienistej oraz komórek piramidalnych (dwa dolne przebiegi).
5.2.2. Wykorzystanie transformaty falkowej do automatycznego wykrywania
połączeń neuronów zsynchronizowanych
Zarejestrowane dane zostały przeanalizowane również pod kątem poszukiwania par
neuronów zsynchronizowanych w rytmie gamma Transformata falkowa jest popularną
metodą analizy zmienności mocy sygnału w szeregach czasowych. Poprzez rozkład
szeregu czasowego do przestrzeni czasu i częstotliwości można określić dominujące
składowe częstotliwościowe oraz ich zmienność w czasie. Na metodzie tej oprzeć można
algorytmy wykrywania kształtów na wykresach [106], na przykład do wykrywania
kształtów wykresów funkcji korelacji wzajemnej związanych z synchroniczną aktywacją
par neuronów. Transformacie falkowej można poddać szereg czasowy, ale również wynik
obliczenia korelacji krzyżowej. Czas zastąpiony jest przesunięciem czasu w funkcji
korelacji wzajemnej, czyli przedział [-80ms; 80ms].
Rysunek 5-27 Wykres względnej mocy widmowej dla
korelacji wzajemnej połączenia synaptycznego
o charakterze pobudzającym.
Rysunek 5-28: Wykres względnej mocy widmowej dla
pary
neuronów,
których
aktywność
jest
zsynchronizowana z częstotliwością ok. 45Hz.
113
Rysunek 5-29: Wykres względnej mocy widmowej
połączenia funkcjonalnego w którym wyróżnić
można 2 maksima odpowiadające różnym
oddziaływaniom.
Rysunek 5-30: A) wykres korelacji wzajemnej
zawierający częstotliwości harmoniczne poniżej
50Hz pozwala wnioskować o synchronizacji
aktywności neuronów, B) Wykres składowych
powyżej
50Hz
świadczy
o
połączeniu
mieszanym pobudzająco-hamującym.
Falka Morleta została wybrana jako funkcja najbardziej podobna do poszukiwanego
kształtu. Aby porównywać wyniki mocy widmowych korelacji wzajemnych w sposób
miarodajny, konieczna jest normalizacja względem szumu białego wyznaczonego dla
danej korelacji wzajemnej. Wprowadzenie matematyczne oraz szczegóły obliczeń opisane
zostały w DODATEK B: WŁASNOŚCI TRANSFORMATY FALKOWEJ I JEJ ZASTOSOWANIE DO WYKRYWANIA
KSZTAŁTÓW NA WYKRESACH KORELACJI WZAJEMNEJ
Przykładowe wykresy rozkładu względnej mocy widmowej korelacji wzajemnych
przedstawione zostały na Rysunkach 5.27 - 5.30. Można dokonywać ręcznego
przeglądania wykresów mocy widmowej, jednak nieuniknione jest napotkanie tych
samych problemów, które wspomniane zostały przy omawianiu poszukiwania połączeń
synaptycznych, mianowicie względność oceny oraz duża liczba przypadków do
przeanalizowania. Aby usprawnić proces poszukiwania połączeń neuronów
zsynchronizowanych, należy z wykresu mocy widmowej wyekstrahować taką cechę, która
świadczyć może o występowaniu na wykresie korelacji wzajemnej charakterystycznego
kształtu.
114
5.2.3. Półautomatyczna
metoda
poszukiwania
zsynchronizowanych w rytmie gamma
par
neuronów
Analiza Rysunków 5-27 – 5-30 prowadzi do wniosku, że cechą odróżniającą korelację
wzajemną pary neuronów połączonych synapsą pobudzającą od korelacji pary neuronów
aktywowanych synchronicznie są współrzędne maksimum na wykresie mocy widmowej
w funkcji czasu i częstotliwości. Na Rysunku 5-27, na wykresie funkcji korelacji
wzajemnej, widoczne jest maksimum dla czasu t<0, które jest wskaźnikiem istnienia
połączenia monosynaptycznego pobudzającego. Wykres względnej mocy widmowej
dostarcza dodatkowo informacji o składowych częstotliwościowych obecnych w danym
punkcie korelacji wzajemnej. Wysoka wartość względnej mocy widmowej dla
częstotliwości ~200 Hz wynika ze skupienia mocy sygnału w tym właśnie punkcie
(t=-2 ms, f=200 Hz). Drugi zaprezentowany przykład to typowa korelacja wzajemna
neuronów aktywowanych synchronicznie (Rysunek 5-29). W przypadku połączenia
synchronicznego, maksymalna moc widmowa skupiona jest wokół częstotliwości 50 Hz.
Oprócz przedstawionych, prostych oddziaływań mogą wystąpić przypadki nieco bardziej
skomplikowane, polegające na złożeniu dwóch zjawisk – na przykład aktywacji
synchronicznej i jakiegoś rodzaju połączenia synaptycznego. Taki przykład przedstawiony
został na Rysunku 5-30. Manualna ocena bez dokładnej analizy numerycznej
prawdopodobnie prowadziłaby do zakwalifikowania tego przypadku jedynie jako
połączenia pobudzająco-hamującego. Na wykresie względnej mocy widmowej widoczne są
dwa maksima lokalne – jedno odpowiada częstotliwości ok. 100 Hz, drugie 50 Hz1.
Istnienie dwóch maksimów mocy widmowej daje się łatwo wyjaśnić, rozkładając wykres
korelacji wzajemnej na dwa zakresy częstotliwościowe. Rysunek 5-31A) przedstawia
korelację wzajemną z Rysunku 5-30 po filtracji filtrem dolnoprzepustowym
o częstotliwości granicznej 40 Hz: odfiltrowanie składowych sygnału, w zakresie których
występują połączenia monosynaptyczne pozwala uzyskać „czysty” kształt typowy dla
oddziaływań synchronicznych. Odfiltrowanie składowych częstotliwościowych poniżej
50Hz prowadzi zgodnie z oczekiwaniem do uzyskania kształtu typowego dla
oddziaływania monosynaptycznego pobudzająco-hamującego. Dwa maksima lokalne na
rozkładzie widmowym transformaty falkowej, występujące dla różnych częstotliwości są
zatem wskaźnikiem istnienia złożenia oddziaływań pomiędzy parą neuronów.
Częstotliwość, dla której występuje dane maksimum pozwala rozróżnić pomiędzy
oddziaływaniem synchronicznym w zakresie rytmu fal mózgowych gamma
(30 Hz - 70 Hz) a połączeniem synaptycznym (100 Hz - 300 Hz).
Zaproponowana metoda wykorzystuje różnicę częstotliwości, dla której wystąpiło
maksimum mocy widmowej przekraczające pewną wartość progową. Częstotliwości
głównej składowej sinusoidalnej korelacji wzajemnych połączeń monosynaptycznych
mieszczą się w zakresie 100-300Hz, wyjątek stanowią nieliczne połączenia hamujące,
których maksimum widma częstotliwościowego może osiągać wartości nawet 50Hz.
Częstotliwości typowe dla rytmu gamma to 30-70Hz. Pierwszym etapem analizy jest
obliczenie względnej mocy widmowej przy użyciu transformaty Falkowej dla zakresu
Powoływanie się na związek częstotliwości 50Hz w badaniach opartych na metodach
pomiarów elektrycznych z jakąś wielkością fizyczną/ biologiczną może budzić wątpliwości w
związku z podejrzeniem przesłuchu z sieci energetycznej. Należy pamiętać, że prezentowane
wyniki pochodzą z eksperymentów wykonywanych w Stanach Zjednoczonych, gdzie częstotliwość
napięcia sieci energetycznej wynosi 60Hz. Ponadto częstotliwości synchronizacji neuronów w
innych eksperymentach prezentowane w dalszej części pracy różnią się od omawianego przykładu.
1
115
czynnika skalującego „s” falki Morleta odpowiadającego częstotliwościom od 10 do
2000Hz. Maksima znajdywane są w sposób automatyczny z przy użyciu algorytmu
wykorzystywanego również w procesach przetwarzania obrazów do wykrycia
najjaśniejszego punktu [107]. Z każdego wykresu mocy widmowej wybierane są
3 najwyższe maksima lokalne o wartościach powyżej 50% zakresu względnej mocy
widmowej, jeżeli powyżej 50% mocy występuje mniejsza liczba, wybierane jest
odpowiednio 2 lub 1 maksimum lokalne. Wszystkie znalezione w ten sposób maksima
prezentowane są w przestrzeni częstotliwość/względna moc widmowa. Przykład wykresu
punktów reprezentujących maksima mocy widmowej przedstawiony został na Rysunku
5-31. Jeżeli duża liczba korelacji wzajemnych posiada kształty charakterystyczne dla
połączeń zsynchronizowanych, na wykresie zbiorczym widoczny będzie klaster w zakresie
odpowiadającym częstotliwości synchronizacji. Przytoczone przykłady prezentują
wykresy, które posiadają klastry (zagęszczenia) punktów w zakresie częstotliwości
powyżej 30 Hz. Ze względu na dużą nieregularność kształtów uzyskiwanych klastrów,
selekcja punktów wykonywana jest ręcznie poprzez zaznaczenie obszaru uważanego za
punkty odpowiadające maksimom na wykresach względnej mocy widmowej.
Rysunek 5-31: Wykresy zbiorcze maksimów mocy widmowej – maksimum względnej mocy
widmowej w funkcji częstotliwości. W eksperymencie 2011-07-01-0 (z lewej) widoczny
jest wyraźny klaster pomiędzy częstotliwością 30 i 40Hz, w eksperymencie 2011-06-27-0
(z prawej) klaster w zakresie 30Hz-40Hz.
W analizowanych danych eksperymentalnych nie wszystkie wykresy posiadają wyraźne
klastry punktów. Na Rysunku 5-32 przedstawione zostały dwa przykłady, w których nie
występują pary neuronów o aktywności zsynchronizowanej. Na rysunku po lewej stronie
można wyróżnić dość rozproszony klaster dla niskich częstotliwości, jednak centrum tego
klastra jest poniżej 30 Hz, czyli poza zakresem 30 -70 Hz. Można jedynie wybrać nieliczne
punkty powyżej częstotliwości 30 Hz. W przypadkach wątpliwych, po dokonaniu
manualnej selekcji punktów potencjalnie reprezentujących połączenia zsynchronizowane,
możliwe jest przeglądnięcie wizualne odpowiadających tym punktom wykresów korelacji
wzajemnej. W prezentowanym przypadku, wszystkie maksima mocy widmowej
odpowiadały kształtom, które nie są podobne do funkcji Gabora, nie ma zatem podstaw
aby mówić o znalezieniu połączeń zsynchronizowanych. Manualna ocena kilkunastu lub
kilkudziesięciu wykresów korelacji wzajemnej sklasyfikowanych jako potencjalni
kandydaci za pomocą metody przedstawionej powyżej jest już zadaniem stosunkowo
prostym i nie wymagającym dużego nakładu czasu, jednocześnie pozwala uniknąć
błędnego sklasyfikowania przypadkowych punktów reprezentujących maksima mocy
widmowej jako oznaki występowania aktywności synchronicznej neuronów.
116
Rysunek 5-32: Wykresy zbiorcze maksimów mocy widmowej. Przytoczone przykłady, mimo
stosunkowo dużej liczby punktów w zakresie fal gamma, nie posiadają par neuronów
zsynchronizowanych. Wykres po lewej stronie przedstawia klaster, jednak jego średnia
jest poniżej 30Hz, co nie mieści się w przyjętym przedziale częstotliwości rytmu gamma.
Na rysunku z prawej strony widoczny jest klaster dla częstotliwości 140Hz,
reprezentujący połączenia monosynaptyczne.
5.2.4. Wyniki półautomatycznej analizy poszukiwania par neuronów
zsynchronizowanych w zakresie rytmu fal mózgowych gamma
Przedstawiona metoda opiera się na rozróżnieniu pomiędzy przypadkami wyraźnego
klastra punktów w przestrzeni moc widmowa/częstotliwość, świadczącego o istnieniu
dużej liczby par neuronów zsynchronizowanych, lub nieregularnie rozłożonymi punktami
w zakresie 30-70Hz, które nie reprezentują par neuronów zsynchronizowanych.
W badanych wycinkach rytm gamma pojawiał się z pewną minimalną gęstością połączeń,
lub nie pojawiał się w ogóle. Gęstość połączeń oraz średnia częstotliwość występująca
w danej kulturze zestawione zostały w Tabeli 5.1.
Tabela 5.1 Gęstość połączeń zsynchronizowanych oraz średnie częstotliwości synchronizacji
Identyfikator
Gęstość
połączeń
[%]
Średnia
częstotliwość
[Hz]
Identyfikator
Gęstość
połączeń
[%]
Średnia
częstotliwość
[Hz]
2011-06-24-1
2011-06-26-2
2011-06-27-0
2011-06-27-1
2011-06-28-0
2011-06-28-1
2011-06-29-0
2011-06-30-0
2011-07-01-0
2012-04-15-0
2012-04-16-0
2012-04-16-1
2012-04-16-2
2012-04-16-3
2012-04-17-0
2012-04-17-1
2012-04-17-2
2012-04-17-3
2012-04-18-0
2.6297
9.5978
14.1775
0.9371
1.6758
0.3008
0.2313
1.5955
1.3169
0.0445
0.1550
1.7574
1.0829
0.0620
2.7463
0.6105
-
38.3475
43.0308
43.0308
43.5836
46.7309
51.9190
27.4554
42.6544
38.2750
44.4416
47.2266
37.2028
39.2293
40.6449
41.8189
67.7407
-
2012-05-21-1
2012-05-21-2
2012-05-22-0
2012-05-22-1
2012-05-22-2
2012-05-22-3
2012-05-23-0
2012-05-23-1
2012-05-23-2
2012-05-23-3
2012-05-24-0
2012-05-24-1
2012-05-24-2
2012-05-25-0
2012-05-25-1
2012-05-25-2
2012-05-25-3
2012-05-26-0
2012-05-27-0
1.8789
1.7473
0.3227
0.4638
1.0263
0.0328
0.4324
0.1698
0.4784
0.9983
0.1087
0.0665
-
37.7338
32.9918
36.8034
33.2432
45.4995
52.9006
44.3933
54.4963
35.3859
44.9094
41.6883
58.5121
-
117
2012-04-18-1
2012-04-18-2
2012-04-18-3
2012-04-19-0
2012-04-19-1
2012-04-19-2
2012-05-21-0
0.1010
4.0700
0.1302
0.0685
-
44.0170
48.3563
43.0017
45.5802
-
2012-05-27-1
2012-05-27-2
2012-05-28-0
2012-05-28-1
2012-05-28-2
2012-05-29-0
2012-05-29-2
2.7212
0.6445
2.3822
-
32.5859
37.7617
45.3507
-
Częstotliwości, z jakimi aktywowane były naprzemiennie pary neuronów
w poszczególnych kulturach organotypowych mózgu myszy przedstawione zostały
w postaci histogramu na Rysunku 5-33. Wartości częstotliwości obliczone zostały jako
średnie ze wszystkich zidentyfikowanych przy użyciu analizy falkowej przypadków.
Rysunek 5-33: Histogram średnich częstotliwości synchronizacji aktywności par neuronów.
Najczęściej występująca wartość średniej częstotliwości synchronizacji wśród
badanych kultur to 44 Hz. Niemniej jednak najniższa spośród wyznaczonych
częstotliwości średnich wynosi 27.45 Hz, a najwyższa 67.74 Hz. Wśród 52 zbadanych
kultur występują przypadki w całym zakresie częstotliwości przyjętych jako zakres rytmu
gamma.
Ciekawym zagadnieniem jest rozkład przestrzenny połączeń par neuronów
aktywowanych synchronicznie. Warto porównać, czy topologia połączeń jest w jakiś
sposób zbliżona do modeli opracowanych na podstawie danych eksperymentalnych przez
grupę G.Bouzsakyego [105], przytoczonych w rozdziale 5.2.1. W przypadku par neuronów
zsynchronizowanych można sporządzić analogiczne mapy połączeń jak dla połączeń
monosynaptycznych (paragraf 5.1.2). Na Rysunkach 5-34 - 5-37 przedstawione zostały
rozkłady przestrzenne połączeń neuronów zsynchronizowanych. Na zaprezentowanych
przykładach uwidaczniają się pewne cechy topologii połączeń, w szczególności
nierównomierny ich rozkład. Aktywność niektórych neuronów jest zsynchronizowana ze
względnie dużą liczbą, nawet kilkudziesięcioma innymi neuronami, stanowiąc swoiste
„centra” synchronizacji. Inne neurony posiadają tylko kilka połączeń, a niektóre nie
posiadają połączeń synchronicznych w ogóle.
118
Rysunek 5-34: Mapa połączeń neuronów zsynchronizowanych w rytmie gamma, kultura
2012-05-23-0. W centralnej części rysunku widoczny neuron hamujący (zielone
kółeczko) zsynchronizowany z bardzo dużą liczbą neuronów.
Rysunek 5-35: Mapa połączeń neuronów zsynchronizowanych w rytmie gamma, kultura
2011-06-28-1. Odcienie koloru czerwonego zostały dodane dla przejrzystości.
Pary neuronów aktywowane synchronicznie z częstotliwością odpowiadającą rytmowi
gamma występowały tylko w wybranych kulturach organotypowych. W procesie cięcia
plasterków mózgu odcinanych jest większość istniejących w warunkach naturalnych
połączeń. Za generację rytmów mózgowych odpowiadają określone mikroobwody
(układy) komórek nerwowych. Badane plasterki po kilku tygodniach hodowli mają
grubość poniżej 400µm.
119
Rysunek 5-36: Mapa połączeń neuronów zsynchronizowanych w rytmie gamma, kultura
2012-05-21-1. Szczególnie widoczne jest nierównomierne rozłożenie ilości połączeń
przypadających na 1 neuron.
Rysunek 5-37: Mapa połączeń neuronów zsynchronizowanych w rytmie gamma, kultura
2011-06-26-2.
Z powodu uszkodzeń połączeń oraz małej grubości badanej kultury organotypowej, w
przypadku niektórych plasterków w procesie cięcia zniszczona zostać mogła struktura
odpowiedzialna za generację rytmu gamma. W pewien sposób wnioskowanie to
potwierdza tezę, iż rytmy mózgowe nie są cechą pojedynczych neuronów, lecz wynikają z
istnienia pewnej określonej struktury, obejmującej różne obszary, odpowiedzialnej za ich
generowanie.
120
5.3.
Analiza dynamiki synaptycznej połączeń pobudzających
Analizę danych pochodzących z eksperymentów neurobiologicznych można
przeprowadzać na różnych poziomach. Wykrycie połączenia pobudzającego może
stanowić podstawę do dalszej pracy, na przykład dokładnej analizy kształtów wykresów
korelacji wzajemnej, które reprezentują ten typ połączenia. Wielkości fizyczne, które
można wyznaczyć z funkcji korelacji wzajemnej to stała czasowa narastania i stała
czasowa opadania maksimum na wykresie (znaczenie fizyczne opisane zostało w rozdziale
4). Wielkości te zależne są od indywidualnych cech danego połączenia synaptycznego,
jednak ciekawe wyniki uzyskuje się obliczając stosunek czasu narastania piku do czasu
opadania (Rysunek 5-38) dla wszystkich znalezionych połączeń pobudzających.
Rysunek 5-38: Ilustracja czasu narastania i opadania na wykresie korelacji wzajemnej aktywności
pary neuronów połączonych połączeniem pobudzającym, z którym związane są stałe
czasowe w modelu synapsy pobudzającej.
Stałe czasowe narastania i opadania wyznacza się z tych korelacji wzajemnych,
w których znaleziono maksimum powyżej poziomu szumu. Na podstawie części wykresu
powyżej odfiltrowanej korelacji wzajemnej (CDC(t) na Rysunku 5-38, wyznaczona zgodnie
z metodologią przedstawioną w rozdziale 4) metodą dopasowania funkcji eksponencjalnej
wyznaczane są wartości stałych czasowych τR i τD.
Połączenie typu wspólne źródło prowadzi do uzyskania funkcji korelacji wzajemnej
z symetrycznym maksimum powyżej obwiedni szumu, które w pierwszym podejściu może
być odróżnione od połączenia pobudzającego na podstawie położenia względem czasu
t=0. Jeżeli maksimum zlokalizowane jest tylko na dodatniej lub ujemnej połowie układu
współrzędnych, wówczas można przyjąć założenie, że jest to połączenie pobudzające.
W praktyce mogą wystąpić (i w prezentowanych danych występowały) przypadki
połączeń typu wspólne źródło, gdzie jeden z pobudzanych neuronów jest znacząco
oddalony od drugiego, lub pobudzany jest poprzez neuron pośredniczący. W takim
przypadku, jedyną metodą na klasyfikację takiego kształtu jako wspólnego źródła jest
właśnie obliczenie stosunku dopasowanych funkcji eksponencjalnych. Asymetria połączeń
pobudzających wynika bezpośrednio z dynamiki synapsy, opisanej w rozdziale 1.
121
Dla każdego zidentyfikowanego maksimum powyżej poziomu 3σ szumu wyznaczony
został współczynnik Γ , zdefiniowany jako:
(5-2)
gdzie τR – stała czasowa narastania przewodności synapsy, τD – stała czasowa
opadania przewodności synapsy, wartości te są tożsame z użytymi na Rysunku 5-38.
Rysunek 5-39: Histogramy ilorazów stałych czasowych. Charakterystyczną cechą jest bardzo
wyraźne oddzielenie piku dla wartości Γτ = 1, który oznacza zbiór krzywych
symetrycznych. Pozostałe wartości oznaczają połączenia pobudzające.
Jak zostało pokazane na konkretnych przykładach, możliwe jest klarowne odróżnienie
maksimów symetrycznych od niesymetrycznych na podstawie ilorazu Γτ stałej czasowej
narastania do stałej czasowej opadania. Rysunek 5-39 prezentuje 6 przykładowych
histogramów wartości ilorazu Γτ.
122
Pewne cechy histogramów są powtarzalne dla wszystkich przeprowadzonych
eksperymentów:
1) Współczynniki Γτ dzielą się na dwie główne grupy – jedna grupa to współczynniki
bliskie jedności, mieszczące się w przedziale [0.99 : 1.01]. Przynależność do tego
przedziału oznacza, że analizowany pik jest symetryczny i reprezentuje połączenie
typu wspólne źródło. Druga grupa to pozostałe współczynniki z zakresu 0 – 0.99,
oznaczające połączenia pobudzające o różnych stosunkach czasu narastania do
opadania.
2) Grupa współczynników Γτ ≈1 jest odseparowana od pozostałych współczynników.
3) Pewne wartości współczynników występują z wyższym prawdopodobieństwem
niż inne.
Oczywiście przedstawienie 6 przykładowych histogramów nie pokazuje w pełni
opisanych powyżej własności. Dla pełniejszego zobrazowania poczynionych obserwacji,
na Rysunku 5-40 przedstawiony został przestrzenny wykres zbiorczy (znormalizowany)
wszystkich 52 histogramów obliczonych dla wszystkich 52 analizowanych
eksperymentów:
Rysunek 5-40: Wykres zbiorczy znormalizowanych histogramów ilorazu stałych czasowych Γ τ .
Wszystkie histogramy posiadają maksimum dla współczynnika Γτ ≈1, który
odseparowany jest od pozostałych wartości (przerwa oznaczona czerwoną strzałką).
Opisane cechy predysponują zastosowanie współczynnika Γτ jako wskaźnika
klasyfikacji połączeń pobudzających i połączeń poprzez wspólne źródło. Piki symetryczne
na podstawie rozważań teoretycznych z rozdziału 4 klasyfikowane są jako wynik
wspólnego pobudzenia dwóch neuronów przez trzeci, piki niesymetryczne jako istnienie
połączenia monosynaptycznego pobudzającego.
Własność 3) jest szczególnie dobrze widoczna, jeśli w odpowiedni sposób przedstawi
się wykres zbiorczy histogramów. Bliższe spojrzenie na wykres z Rysunku 5-40 w zakresie
ilorazu stałych czasowych Γτ =[0 0.95], znormalizowany względem najwyższej wartości
występującej w danym histogramie, pozwala wyciągnąć wnioski na temat
prawdopodobieństwa wystąpienia pików o określonym stosunku stałej czasowej
narastania do opadania. Wartości histogramów przedstawione zostały w odpowiedniej
123
skali koloru, wiersze oznaczają numer eksperymentu zgodnie z tabelą zbiorczą
w kolejnym paragrafie, kolumny oznaczają wartość współczynnika Γτ.
Rysunek 5-41: Wykres zbiorczy znormalizowanych histogramów. Wartości histogramów
przedstawione zostały w skali kolorów ciepłych. Histogramy przyjmują najwyższe
wartości dla ilorazów stałych czasowych 0.48, 0,65, 0.72, 0.85.
5.4.
Podsumowanie wyników i wnioski
W Tabeli 5.2. przedstawione zostały wyniki analizy połączeń funkcjonalnych 52
eksperymentów, oznaczonych identyfikatorem składającym się z daty oraz numeru
skrawka badanego danego dnia. Nieciągłości w numeracji skrawka tego samego dnia
wynikają z odrzucenia niektórych eksperymentów, co było spowodowane bardzo niską
aktywnością nie pozwalającą na przeprowadzenie analizy lub zupełnym brakiem
aktywności.
Obok identyfikatora eksperymentu przedstawione zostały: liczba zidentyfikowanych
neuronów, gęstość połączeń pobudzających, gęstość połączeń hamujących, gęstość
połączeń synchronicznych w zakresie rytmu gamma oraz połączeń poprzez wspólne
źródło. Zaznaczona została też informacja, czy próbka pochodziła z mózgu myszy zdrowej
(WT, ang. Wild Type), myszy z uszkodzonym jednym chromosomem X (Heterozygoty, HZ,
ang. Heterozygous) lub myszy z uszkodzonymi dwoma chromosomami (Homozygota,
oznaczenie ZZ).
124
Tabela 5.2. Gęstość połączeń w badanych kulturach organotypowych
Identyfikator
Liczba
neuronów
2011-06-24-1
2011-06-26-2
2011-06-27-0
2011-06-27-1
2011-06-28-0
2011-06-28-1
2011-06-29-0
2011-06-30-0
2011-07-01-0
2012-04-15-0
2012-04-16-0
2012-04-16-1
2012-04-16-2
2012-04-16-3
2012-04-17-0
2012-04-17-1
2012-04-17-2
2012-04-17-3
2012-04-18-0
2012-04-18-1
2012-04-18-2
2012-04-18-3
2012-04-19-0
2012-04-19-1
2012-04-19-2
2012-05-21-0
2012-05-21-1
2012-05-21-2
2012-05-22-0
2012-05-22-1
2012-05-22-2
2012-05-22-3
2012-05-23-0
2012-05-23-1
2012-05-23-2
2012-05-23-3
2012-05-24-0
2012-05-24-1
2012-05-24-2
2012-05-25-0
2012-05-25-1
2012-05-25-2
2012-05-25-3
2012-05-26-0
2012-05-27-0
2012-05-27-1
2012-05-27-2
2012-05-28-0
2012-05-28-1
2012-05-28-2
2012-05-29-0
2012-05-29-2
74
79
65
98
66
172
123
86
135
106
88
106
23
130
98
175
63
236
20
89
256
100
107
48
143
165
167
210
174
289
242
204
151
259
293
149
94
355
213
161
134
118
227
95
235
163
121
177
133
185
75
312
Gęstość
połączeń
pobudzającyc
h [%]
4.7845
1.6183
1.7515
1.2495
2.4564
1.9707
3.4371
3.7047
5.5034
0.5785
0.9556
1.8779
1.5123
1.0533
0.7289
0.7967
1.4361
0.4130
1.2500
0.9216
0.4211
1.4500
0.8560
0.8247
0.8753
0.9183
1.2227
1.8662
1.0503
0.7890
0.4286
0.8026
1.1929
0.9630
1.1485
1.0180
2.7048
0.7903
1.0690
1.9405
2.3335
2.9015
2.2104
0.1994
1.6931
1.2571
2.4657
1.9758
1.3059
1.5281
2.5067
0.2322
Gęstość
połączeń
hamujących
[%]
0.6574
0.6890
0.5680
0.1978
0.5969
0.8315
0.5883
1.1087
1.4211
0.1335
0.2583
0.6052
0.1890
0.3254
0.3540
0.1110
0.5543
0.1867
0.2500
0.2020
0.0778
0.4300
0.3930
0.3472
0.3276
0.1726
0.3908
0.3832
0.3072
0.1281
0.0649
0.1754
0.3903
0.2743
0.3529
0.3784
0.7130
0.0968
0.3130
0.2315
0.7073
0.8403
0.4561
0.0111
0.3821
0.4931
0.6147
0.3671
0.4410
0.3682
0.3200
0.0380
125
Gęstość
połączeń
„gamma” [%]
2.6297
9.5978
14.1775
0.9371
1.6758
0.3008
0.2313
1.5955
1.3169
0.0445
0.1550
0
0
1.7574
1.0829
0.0620
2.7463
0.6105
0
0.1010
0
4.0700
0
0.1302
0.0685
0
1.8789
0
1.7473
0
0.3227
0.4638
1.0263
0.0328
0
0.4324
0.1698
0
0
0.4784
0
0.9983
0.1087
0.0665
0
2.7212
0
0
0.6445
0
2.3822
0
Gęstość
wspólnie
pobudzanych
[%]
0.2739
0.5448
0.4734
0.1354
0.3673
0.1961
0.2578
0.2569
0.4664
0.1513
0.1679
0.2403
0.1890
0.1716
0.0625
0.1176
0.3527
0.1077
0
0.1641
0.0717
0.2500
0.1485
0.0868
0.1223
0.1947
0.1829
0.1859
0.1817
0.1030
0.0871
0.1562
0.1228
0.1729
0.2050
0.1982
0.3282
0.1182
0.2138
0.2122
0.3342
0.6751
0.2523
0.0443
0.2318
0.2484
0.2800
0.2713
0.2827
0.2396
0.3733
0.0544
Syndrom
Łamliwego
Chromosomu
X
WT
WT
WT
WT
WT
WT
WT
WT
WT
ZZ
ZZ
WT
WT
ZZ
ZZ
WT
HZ
WT
HZ
WT
WT
WT
ZZ
HZ
WT
WT
WT
WT
HZ
HZ
ZZ
WT
WT
HZ
WT
HZ
ZZ
WT
HZ
WT
WT
WT
ZZ
HZ
WT
WT
ZZ
WT
WT
WT
WT
WT
Wyniki z powyższej tabeli przedstawione zostały na wykresach, aby sprawdzić
istnienie korelacji pomiędzy gęstościami połączeń danego typu. Na Rysunku 5-42
przedstawiony został wykres gęstości połączeń hamujących w funkcji gęstości połączeń
pobudzających w skali liniowej. Dopasowanie prostej regresji wskazuje, że wartość
oczekiwana współczynnika zależności liniowej wynosi 0.244. Oznacza to, że gęstość
połączeń hamujących jest w przybliżeniu 4 razy niższa niż gęstość połączeń
pobudzających. Wykres gęstości połączeń pobudzających i hamujących pozwala sądzić, iż
w badanych tkankach występuje korelacja pomiędzy gęstością połączeń pobudzających
i hamujących ze współczynnikiem korelacji liniowej Pearsona R = 0.842.
Nie są widoczne różnice pomiędzy zbiorami punktów reprezentujących myszy zdrowe
a hetero i homozygot y Syndromu Łamliwego Chromosomu X. Gdyby Syndrom wpływał na
gęstość połączeń (lub stosunek gęstości połączeń hamujących do pobudzających), zbiory
punktów tworzyłyby rozdzielone klastry. Zauważyć można jedynie brak występowania
gęstości połączeń pobudzających powyżej 2.8% oraz połączeń hamujących powyżej
0.75%. Być może cechą odróżniającą osobniki chore od próby kontrolnej byłby średni
stosunek połączeń gęstości połączeń hamujących do pobudzających (czyli nachylenie
krzywej z odpowiednio wysoką istotnością statystyczną), jednakże do tego celu potrzebna
byłaby większa statystyka zbadanych przypadków.
Rysunek 5-42: . Wykres gęstości połączeń hamujących w funkcji połączeń pobudzających.
Gęstość połączeń gamma nie wykazuje korelacji liczbowej z gęstościami połączeń
hamujących lub pobudzających. Również kultury pochodzące od myszy z Syndromem
Łamliwego Chromosomu X nie wykazują znaczących różnic w porównaniu do kultur
pochodzących od myszy zdrowych przy tym kryterium porównawczym.
Na ostatnich dwóch wykresach przedstawione zostały zależności gęstości
połączeń zsynchronizowanych w rytmie gamma od gęstości połączeń pobudzających
(Rysunek 5-43) oraz hamujących (Rysunek 5-44). Ze względu na bardzo duże różnice
gęstości połączeń zsynchronizowanych w rytmie gamma (prawie 3 rzędy wielkości),
126
wykresy przedstawione zostały w skali półlogarytmicznej. Przedstawione wyniki nie
pozwalają sądzić, aby gęstość połączeń funkcjonalnych w kulturach organotypowych
mogła służyć jako wskaźnik obecności Syndromu Łamliwego Chromosomu X.
Rysunek 5-43: Wykres gęstości połączeń gamma w funkcji gęstości połączeń pobudzających.
Rysunek 5-44: . Wykres gęstości połączeń gamma w funkcji gęstości połączeń hamujących.
127
PODSUMOWANIE
W rozprawie doktorskiej zaprezentowano wyniki prac nad rozwojem systemu do
równoczesnej rejestracji i stymulacji aktywności elektrycznej kultur organotypowych
mózgu myszy oraz sporządzania map połączeń funkcjonalnych pomiędzy neuronami.
Prace te podzielić można na część projektową oraz badawczą.
W części projektowej celem było opracowanie modułów prototypowego układu
scalonego, łączącego w sobie funkcjonalność odczytu oraz stymulacji elektrycznej
komórek nerwowych. Scalenie tych dwóch funkcji stanowi postęp w stosunku do
poprzednich generacji systemów rozwijanych w Zakładzie Oddziaływań i Detekcji
Cząstek WFiIS AGH we współpracy z Instytutem Fizyki Cząstek Uniwersytetu
Kalifornijskiego w Santa Cruz. Pojedynczy układ scalony powinien umożliwić
skonstruowanie zarówno systemu do badań in vitro, podobnego do opisanego
w rozdziale 2, zawierającego matrycę kilkuset elektrod z kilkoma (lub kilkunastoma)
układami scalonymi, jak również miniaturowego systemu do badań in vivo,
składającego się z mniejszej liczby (1-2) układów scalonych oraz matrycy lub
wszczepianej sondy mikroelektrodowej.
Pierwszym zadaniem autora rozprawy było opracowanie układu elektroniki
odczytu,
który
umożliwiałby
rejestrację
pełnego
spektrum
sygnałów
neurobiologicznych, czyli niskoczęstotliwościowych
potencjałów polowych,
potencjałów czynnościowych (~1 kHz) artefaktów stymulacyjnych, oraz superpozycji
wymienionych sygnałów. Zadanie to zostało zrealizowane w postaci prototypowego
układu scalonego, w którym pojedynczy kanał zawiera przedwzmacniacz oraz dwa
układy filtrów pasmowo-przepustowych ze wzmacniaczami wyjściowymi. Pierwszy
z tych układów o niższym wzmocnieniu i paśmie częstotliwości w zakresie
1 Hz - 300 Hz odpowiedzialny jest za rejestrację potencjałów polowych, drugi
o wyższym wzmocnieniu i paśmie częstotliwości 500 Hz – 2 kHz służy do rejestracji
potencjałów czynnościowych. Wzmocnienia w obu układach dobrane są tak, aby
wykorzystać pełny zakres dynamiczny multipleksera analogowego, który minimalizuje
liczbę linii wyjściowych. Multiplekser analogowy opiera się na nowatorskiej koncepcji
sterowania odczytem kolejnych kanałów, dzięki której problem przesłuchu sygnału
z rejestru przesuwnego w środku okresu multipleksowania został całkowicie
wyeliminowany. Do próbkowania wyjścia multipleksera wykorzystany może być
pojedynczy, dostępny komercyjnie układ ADC o częstotliwości próbkowania 2.5 MHz.
Drugim zadaniem w części projektowej było stworzenie przetwornika cyfrowoanalogowego o rozdzielczości 9 bitów do generacji sygnałów stymulacyjnych.
Przetwornik zrealizowany został na bazie koncepcji sukcesywnego dzielnika ładunku.
Projekt cechuje się niskim poborem mocy przy zachowaniu bardzo dobrej liniowości
różniczkowej i całkowej. Przetwornik wyposażony jest w układ próbkującopamiętający oraz układ redukcji przesłuchów sygnałów cyfrowych, co w połączeniu
z niską nieliniowością sprawia, że doskonale nadaje się do roli generatora sygnałów
stymulacyjnych.
Część badawcza, wykonywana głównie w Instytucie Fizyki Cząstek Uniwersytetu
Kalifornijskiego w Santa Cruz, koncentrowała się na wykorzystaniu istniejącego
systemu do rejestracji sygnałów nerwowych dla opracowania metody analizy danych
pozwalającej na automatyczną detekcję i klasyfikację połączeń funkcjonalnych między
neuronami.
128
Uczestnictwo w eksperymentach rejestracji aktywności spontanicznej kultur
organotypowych oraz poznanie technik ich preparatyki miało wysoką wartość
poznawczą i pozwoliło na całościowe spojrzenie na proces ekstrakcji informacji na
temat połączeń funkcjonalnych w żywych sieciach neuronowych. W analizie danych
eksperymentalnych punktem wyjściowym była metoda korelacji wzajemnej,
stosowana do poszukiwania połączeń funkcjonalnych pomiędzy neuronami.
Przeprowadzona została analiza funkcji korelacji wzajemnej szeregów czasowych
reprezentujących potencjały czynnościowe pod kątem rozróżnienia typu połączenia na
podstawie kształtu funkcji. Zaproponowana została wydajna obliczeniowo metoda
detekcji połączeń synaptycznych, analogiczna do stosowanej powszechnie metody
drgań losowych, ale pozwalająca na wykonanie tej samej analizy w czasie nawet
kilkaset razy krótszym. Analiza falkowa została wykorzystana do wykrywania
aktywności par neuronów zsynchronizowanych, generujących potencjały
czynnościowe z częstotliwością w zakresie fal mózgowych gamma (30-70 Hz). Łącznie
sporządzone zostały mapy połączeń (nie wszystkie zaprezentowane w niniejszej
rozprawie) pobudzających, hamujących oraz połączeń zsynchronizowanych w rytmie
gamma dla danych pochodzących z 52 eksperymentów. Część z badanych kultur
pochodziła od myszy z kontrolowanym defektem genetycznym Syndromu Łamliwego
Chromosomu X, jednak nie udało się zarejestrować istotnych statystycznie różnic
w stosunku do grupy kontrolnej myszy zdrowych.
Analiza funkcji korelacji wzajemnej neuronów połączonych synapsą pobudzającą,
pozwoliła na obserwację 4 maksimów na wykresach ilorazu stałej czasowej narastania
do stałej czasowej opadania funkcji korelacji. Prawdopodobnie maksima te
reprezentują 4 rodzaje synaps o różnych przekaźnikach chemicznych i różnej
dynamice synaptycznej. Jako kontynuację tych obserwacji, warto by przeprowadzić
serię eksperymentów, w którym kultury organotypowe poddano by działaniu
selektywnego blokera chemicznego działającego na jeden rodzaj synaps – brak
jednego z maksimów pozwoliłby na 100% potwierdzenie postawionej tezy.
Rozwijane systemy do rejestracji i stymulacji sygnałów elektrycznych w żywych
sieciach neuronowych, zwiększanie gęstości mikroelektrod, w połączeniu z metodami
cyfrowego przetwarzania sygnałów pozwalają na coraz bardziej precyzyjną rejestrację
aktywności pojedynczych neuronów. Niemniej jednak, nawet tak zaawansowane jak
obecnie istniejące systemy borykają się z problemami związanymi z sortowaniem
potencjałów czynnościowych, co ma swoje negatywne reperkusje na etapie tworzenia
map połączeń funkcjonalnych. Ostatecznym celem rozwoju technologii powinna być
możliwość przeprowadzenia eksperymentu na wycinku mózgu, w którym można
będzie zarejestrować aktywność absolutnie wszystkich neuronów, sporządzić mapę
połączeń funkcjonalnych, uwzględnić komunikację pojedynczymi impulsami oraz
seriami impulsów. Porównanie tych informacji z obrazem anatomicznym wysokiej
rozdzielczości pozwoli uzyskać pełny obraz działania sieci neuronowej i być może
doprowadzić do pełnego jej opisu i zrozumienia.
129
DODATEK A: SORTOWANIE POTENCJAŁÓW CZYNNOŚCIOWYCH
Bezpośrednim wynikiem przeprowadzenia eksperymentu rejestracji aktywności
elektrycznej komórek nerwowych jest zbiór danych – zarejestrowanych przebiegów
napięcia, próbkowanych na 512 elektrodach z częstotliwością 20kHz (okres 50μs). Każdy
przetwornik analogowo-cyfrowy pracuje z rozdzielczością 12 bitów, więc można przyjąć,
że do zapisania pojedynczej próbki napięcia na dysku potrzeba 2 bajtów. Proste
oszacowanie pozwala obliczyć ilość danych zapisywanych na dysku twardym w ciągu
jednej sekundy:
0-1
gdzie nb – liczba bajtów na jedną próbkowaną wartość napięcia, nch – liczba kanałów
w systemie, fs – częstotliwość próbkowania (na 1 s. na kanał).
Prędkość rejestracji 20.48 MB/s pomnożona przez czas trwania eksperymentu
6 godzin daje wynik 442.368 GB, czyli prawie pół terabajta danych. Taka ilość informacji
wymaga oczywiście zastosowania automatycznych procedur, przede wszystkim we
wstępnej fazie wykrywania potencjałów czynnościowych.
Pierwszym krokiem jest wykrycie potencjałów czynnościowych generowanych przez
pojedyncze neurony, interesujących z biologicznego punktu widzenia. Poważnym
problemem jest ograniczona rozdzielczość przestrzenna elektrod. W praktyce, na każdej
elektrodzie może zostać zarejestrowana aktywność wielu neuronów, jak również każdy
neuron może pobudzać kilka elektrod. Dlatego kluczowe jest rozróżnienie pojedynczych
neuronów na podstawie charakterystycznego kształtu potencjału czynnościowego.
Pierwszym krokiem jest identyfikacja momentów czasowych, w których mogły
wystąpić potencjały czynnościowe. Znajdywane są punkty, w których amplituda
przekroczyła, a następnie opadła poniżej pewnego progu napięcia. Typowo wartość
progowa wynosi 60μV.
Przy małej ilości danych wystarczyłoby ocenić wzrokowo, czy punkt, w którym
przekroczona została amplituda stanowi potencjał czynnościowy, czy tylko przypadkowy,
chwilowy wysoki poziom szumu za pomocą oceny rozłożenia punktów w przestrzeni
amplituda ⨯ szerokość potencjału. Wystąpienie grupy punktów (klastra) w takiej
przestrzeni oznaczałoby wystąpienie potencjałów o podobnym kształcie, których źródłem
jest najprawdopodobniej jeden neuron. Analiza wzrokowa wykresów amplitudy w funkcji
szerokości potencjału byłaby czasochłonna i subiektywna. Co więcej, zazwyczaj klastry
nakładają się na siebie, ponieważ dane z jednej elektrody zawierają aktywność kilku
Rysunek A-1: Geometria elektrod – elektroda centralna, na której wykryte zostało wystąpienie
nadprogowej amplitudy (1) oraz elektrody sąsiadujące (2-7).
komórek. Rozwiązaniem problemu separacji jest użycie danych pochodzących z kilku
elektrod jednocześnie.
130
Analiza automatyczna wykonywana za pomocą oprogramowania rozwijanego od kilku
lat przez zespół z Santa Cruz korzysta z danych zarejestrowanych na wybranej
elektrodzie, którą nazywać będziemy elektrodą centralną oraz 6-ciu elektrod ją
otaczających. Geometrię elektrod przedstawia Rysunek A-1.
Pierwszym etapem analizy automatycznej jest stworzenie 182-wymiarowego wektora
z surowych danych dla każdego zidentyfikowanego przekroczenia progu napięcia. Wektor
składa się 26 wartości napięcia z okresu od 0.5ms przed do 0.8ms po przekroczeniu
wartości progowej; z elektrody centralnej oraz sześciu sąsiadów (26 ·
) P
ięć ie ięciu
ż
c
ebie ów
ięci
ee
e
wi R u e A-2.
Rysunek A-2: Przebiegi napięć na elektrodzie centralnej (1) i sąsiadujacych (2-7). Pokazane
zostało 50 przebiegów [42].
Drugim etapem jest Analiza Głównych Składowych stosowana w celu zmniejszenia
liczby wymiarów poprzez znajdywanie N najbardziej znaczących zmiennych (zmiennych
o najwyższej wariancji). Zmienne te są liniowymi kombinacjami 182 punktów
pomiarowych. Na przykład, dla N=5, każdy potencjał czynnościowy jest reprezentowany
jako punkt w N-wymiarowej przestrzeni. Rysunek A-3 przedstawia wykres rozproszenia
dwóch najbardziej znaczących zmiennych dla danych przedstawionych na Rysunku A-2.
Rysunek A-3: Wykres rozproszenia dwóch najbardziej znaczących zmiennych, określony metodą
PCA. Dane w przestrzeni 5-wymiarowej (nie tylko 2-wymiarowej, jak pokazano na
rysunku) zostały dopasowane do sumy ważonej 5-wymiarowej funkcji Gaussa. 4 elipsy
przedstawiają dopasowane funkcje Gaussa, a dokładniej ich 2-wymiarowe rzuty [42].
W trzecim etapie, w przebiegach napięć rzutowanych na przestrzeń o zredukowanej
liczbie wymiarów równej N, poszukuje się klastrów, które interpretuje się jako zbiory
potencjałów czynnościowych pochodzące od pojedynczego neuronu. Wyróżnić można
4 grupy punktów, które potencjalnie stanowią aktywność pojedynczych neuronów.
Uśrednione przebiegi napięcia na 7 elektrodach przedstawione zostały na Rysunku A-4.
131
Rysunek A-4: Przebiegi w poszczególnych wierszach przedstawiają uśrednione wartości
zarejestrowanego napięcia dla odpowiadających im 4 grup sklasyfikowanych na
Rysunku A-3.
Niektóre z klastrów mogą nie odzwierciedlać aktywności pojedynczego neuronu, ale
nałożenie się aktywności dwóch lub więcej komórek. Dlatego czwartym etapem jest użycie
funkcji autokorelacji, aby wyeliminować „zanieczyszczone” klastry. Funkcja autokorelacji
to histogram różnic czasów pomiędzy potencjałami czynnościowymi dla wszystkich par
znalezionych potencjałów czynnościowych. Z podstaw elektrofizjologii wiadomo,
że pomiędzy dwoma potencjałami czynnościowymi występuje minimalny odstęp czasowy
(okres refrakcji) równy ok. 1.5ms, podczas którego neuron nie może wygenerować
potencjału czynnościowego po raz drugi. Dlatego jeżeli pomiędzy pewnymi parami
potencjałów czynnościowych interwał czasowy jest krótszy niż 1.5ms, uznaje się taki
klaster za „zanieczyszczony”.
Ostatnim etapem jest znajdywanie duplikatów. Wiele spośród zidentyfikowanych
neuronów jest tak naprawdę aktywnością jednego neuronu zarejestrowaną na kilku
sąsiadujących elektrodach. Identyfikacja duplikatów odbywa się na zasadzie poszukiwania
koincydencji pomiędzy momentami czasowymi, w których wykryto aktywność
poszczególnych neuronów.
132
DODATEK B: WŁASNOŚCI TRANSFORMATY FALKOWEJ I JEJ ZASTOSOWANIE DO WYKRYWANIA
KSZTAŁTÓW NA WYKRESACH KORELACJI WZAJEMNEJ
Transformata falkowa stała się popularną metodą analizy zmienności mocy sygnału w
szeregach czasowych. Poprzez rozkład szeregu czasowego do przestrzeni czasu
i częstotliwości można określić dominujące składowe częstotliwościowe oraz ich
zmienność w czasie. Chociaż istotą transformaty falkowej jest, podobnie jak transformaty
Fouriera, rozkład widma częstotliwościowego, przewaga transformaty falkowej polega na
dostarczeniu informacji, kiedy, a nie tylko czy wystąpiła składowa o danej częstotliwości
harmonicznej. Niestety większość publikacji i opracowań na temat transformaty falkowej
prezentuje ją jako metodę generowania atrakcyjnych, kolorowych ilustracji pomijając
element opisu ilościowego oraz istotności statystycznej [108]. Niemniej jednak jest to
metoda, na której oprzeć można algorytmy wykrywania kształtów na wykresach [106] jak
również bardziej złożonych obiektów graficznych [109]. Własność ta została
wykorzystana przez autora pracy właśnie do wykrywania kształtów wykresów funkcji
związanych z synchronizacją aktywacji par neuronów.
Transformacie falkowej można poddać szereg czasowy xn, z równymi interwałami
czasowymi t, gdzie n = 0, 1, 2 …N-1. W przedstawianym przypadku szeregiem czasowym
xn będą wartości funkcji korelacji wzajemnej w przedziale [-80ms; 80ms]. Ponieważ
transformata falkowa opiera się na operacji konwolucji, zwykle wybiera się kształt falki
podobny do kształtu, który ma być automatycznie rozpoznawany. Spośród najczęściej
stosowanych falek, falka Morleta jest najbardziej podobna do poszukiwanego. Falka
Morleta opisana jest wzorem (B-1):
( )
e
e
B-1
gdzie – tzw. bezwymiarowy parametr czasowy (
– czas, s jest arbitralnie
w b ą c
wi ą wie
ścią
e u
óbkowania), i – jednostka urojona,
bezwymiarowy
parametr
częstotliwości
falki
Morleta.
0
Aby funkcja mogła być zastosowana jako falka, jej średnia musi być równa 0 oraz musi
ona posiadać reprezentację zarówno w dziedzinie czasu, jak i częstotliwości. Parametr 0
może przyjmować tylko takie wartości, dla których powyższy warunek będzie spełniony.
Analizując wzór (B-1) jest jasne, że falka Morleta jest funkcją zespoloną, iloczynem fali
płaskiej i funkcji Gaussa. Przebieg falki w dziedzinie bezwymiarowego współczynnika
czasu t/s przedstawiony został na Rysunku B-1.
Rysunek B-1: Falka Morleta, a) wykres wartości zespolonych, b) rzut wartości rzeczywistych, i c)
rzut wartości urojonych
Jak widać, falka ma kształt spirali o zmiennym promieniu. Rzut wartości rzeczywistych
jest symetryczny względem t/s, odpowiada składowej rzeczywistej funkcji cos(t/s)
133
pomnożonej przez funkcję Gaussa, natomiast rzut wartości urojonych odpowiada
składowej urojonej funkcji fali płaskiej (sin(t/s)) pomnożonej przez funkcję Gaussa.
Ciągła transformata falkowa szeregu czasowego zdefiniowana jest jako konwolucja
(splot) szeregu czasowego xn z przeskalowaną falką o odpowiednim przesunięciu:
( )
(
[
∑
)
]
B-2
gdzie (*) oznacza liczbę zespoloną sprzężoną, sumowanie po n = 0, …N-1 oznacza, że
splot obliczany jest po całym szeregu czasowym xn.
Poprzez zmianę skali falki „s” i przesuwanie po indeksie czasu n, można zbudować
obraz pokazujący amplitudę danej cechy w funkcji skali „s” jak również zmienność tej
cechy w czasie. Brak indeksu „0” przy falce oznacza, że Falka jest znormalizowana. Mimo
że jest możliwe obliczenie transformaty Falkowej w dziedzinie zespolonej, bardziej
wydajne obliczeniowo jest przejście od dziedziny czasu do dziedziny częstotliwości.
Aby przybliżyć transformatę ciągłą, należy konwolucję przeprowadzić N razy dla
każdej skali, gdzie N oznacza liczbę punktów w szeregu czasowym xn. Twierdzenie
o konwolucji pozwala wykonać wszystkie N konwolucji równolegle w przestrzeni Fouriera
przy pomocy dyskretnej transformaty Fouriera. Dyskretna transformata Fouriera szeregu
xn wyraża się wzorem:
̂
N
∑
e
B-3
gdzie k=0, 1, … N–1 oznacza numerację wartości częstotliwości, dla których obliczana
jest transformata.
W ograniczonym przedziale, transformata Fouriera falki Morleta ( ) dana jest
przez funkcję ̂ ( ), opisaną wzorem (B-4).
̂ (
)
( )e
(
)
B-4
gdzie – częstość kołowa, H( ) jest funkcją Haevisidea (skok jednostkowy) równa
1 dla >0 i 0 w pozostałym przedziale.
Korzystając z twierdzenia o konwolucji, transformata falkowa wyrazi się jako
odwrotna transformata Fouriera z iloczynu szeregu i falki w dziedzinie częstotliwości:
( )
Częstość kątowa
k
∑ ̂ ̂(
)e
zdefiniowana jest następująco:
N
{ N
N
N
B-5
B-6
Wykorzystując powyższe równania można obliczyć transformatę falkową dla danego
czynnika skalującego „s” we wszystkich N punktach w jednym kroku.
Aby zachować pewność, że transformata falkowa (B-6) dla każdego czynnika
skalującego jest porównywalna oraz że jest porównywalna z innymi szeregami czasowymi
poddawanymi transformacie, konieczna jest normalizacja funkcji Falkowej tak ,aby miała
ona energię równą jedności. Równanie normalizacji ma postać:
134
̂(
)
(
) ̂ (
)
B-7
Wynik obliczenia transformaty Falkowej (wzór (B-7) po odwrotnej transformacie
Fouriera) jest szeregiem liczb zespolonych. Można zatem wyróżnić część rzeczywistą
Re( ( )) , część urojoną m( ( )) , amplitudę | ( )| , fazę
c [ m{ ( )}
(
)}]
|
(
)|
Re{
oraz najbardziej istotną wielkość : moc widmową falki
.
Aby łatwo porównywać różne wyniki mocy widmowych falki, pożądane jest
stosowanie wspólnej normalizacji dla zakresu transformaty Falkowej. Stosując
normalizację zgodnie z (B-7) i transformatę Falkową (B-5), wartość oczekiwana mocy
widmowej | ( )| jest równa iloczynowi N razy wartość oczekiwana szeregu | ̂ | . Dla
szeregu, który składałby się tylko z wartości szumu białego, wartość oczekiwana wynosi
N, gdzie oznacza wariancję, N oznacza liczbę punktów w szeregu czasowym (w tym
przypadku liczbę punktów funkcji korelacji wzajemnej). Podzielenie mocy widmowej
transformaty Falkowej przez pozwala uzyskać wartość mocy widmowej względem
poziomu szumu, przy czym
obliczona została jako wartość oczekiwana szeregu
czasowego po transformacie Fouriera | ̂ | .
135
BIBLIOGRAFIA
1. Schuetze, S. M. The discovery of the action potential. Trends in neuroscience. 1983, Vol. 6, pp. 164-168.
2. Office of the Home Secretary, National Academy of Sciences. Biographical Memoirs. Wyd. 1.
Washington D.C. : National Academies Press, 1982. pp. 178-211. Vol. 53. ISBN 0-309-03287-3.
3. Hodgkin, A. L. and Huxley, A. F. A Quantitative Description of Membrane Current and It's Application
to Conductance and Excitation. Journal of Physiology. 1952, 117, pp. 500-544.
4. Thomas, Jr CA, et al. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured
cells. Experimental Cell Research. 1972, Vol. 74(1), pp. 61-66.
5. Henze, D. A, et al. On the Origin of the Extracellular Action Potential Waveform: A Modeling Study.
Journal of Neurophysiology. 2006, Vol. 95, pp. 3113-3128.
6. Silicon-Substrate Intracortical Microelectrode Arrays. Kipke, D. R., et al. 2, 2003, IEEE TRANSACTIONS
ON NEURAL SYSTEMS AND REHABILITATION ENGINEERING, Vol. 11, pp. 151-155.
7. Mind Creators. [Online] maj 2012. http://www.mindcreators.com /NeuronBasics.htm.
8. Traczyk, W. Fizjologia człowieka w zarysie. wyd. 7. Warszawa : Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2002.
9. Matthews, G. G. Neurobiologia. Od cząsteczek i komórek do układów. Wyd. 1. Warszawa : Wydawnictwo
Lekarskie PZWL, 1998. ISBN 83-200-2452-8.
10. Shepherd, G. M. The Synaptic Organization of the Brain. Wyd. 5. New York : Oxford University Press,
2004. 0-19-515955-1.
11. Beaulieu, C. and Colonnier, M. Number of neurons in individual laminae of areas 3B, 4γ, and 6aα of
the cat cerebral cortex: A comparison with major visual areas. The Journal of Comparative Neurology. 1989, Vol.
279, 2, pp. 228-234.
12. A.Schuz, G.Palm. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. The Journal of
Comparative Neurology. 1989, Vol. 286, 4, pp. 442-455.
13. Izhikevich, E. M. Simple Model of Spiking Neurons. IEEE Transactions on Neural Networks. 2003, 14,
pp. 1569-1572.
14. Roth, A. and Rossum, M. C.W. Modeling Synapses. [book auth.] de, Erik Shutter. Computational
modeling methods for neuroscientists. Cambridge : MIT Press, 2010, 6, pp. 139-160.
15. Herstrin, S., et al. Analysis of Excitatory Synaptic Action in Pyramidal Cells Using Whole-Cell
Recording from Rat Hippocampal Slices. Journal of Physiology. 1990, Vol. 422, pp. 203-225.
16. Hennig, M. H. Modelling Synapses. http://homepages.inf.ed.ac.uk/mhennig/ synaptic_transmission.pdf.
[Materiały dydaktyczne]. Edinburgh : ANC, Informatics, University of Edinburgh, 2012.
17. Savtchenko, L. P. Bilateral processing in chemical synapses with electrical ‘ephaptic’ feedback: A
theoretical model. Mathematical Biosciences. 2007, Vol. 207(1), pp. 113-137.
18. D.Milatovic, S.Zaja-Milatovic, K.S Montine, F-S.Shie and T.J Montine. Neuronal oxidative damage
and dendritic degeneration following activation of CD14-dependent innate immune response in vivo. Journal
of Neuroinflammation. 2004, Vol. Vol.1, pp:1-20.
19. J.A.N. Corsellis, C.J. Bruton. Neuropathology of status epilepticus in humans. Advanced Neurology.
1983, 34, pp. 129-139.
20. T.F.Freund, G.Bouzsaki. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 1996, Vol. 6(4), pp. 345470.
21. Andersen, P., Bliss, T.V.P. and Skrede, K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways.
Experimental Brain Research. 1971, 13, pp:222-238.
22. Martina, M., Royer, S. and Pare, D. Propagation of neocortical inputs in the perirhinal cortex. Journal
of Neuroscience. 2001, Vol. 21(8), pp. 2878-2888.
23. J.Csicsvari, H.Hirase, A.Czurko, A.Mamiya, G.Buzsaki. Oscillatory Coupling of Hippocampal,
pyramidal cells, interneurons in the behaving rat. Neuroscience. 1999, Vol. 19, 1, pp. 274-287.
24. R.Quian Quiroga, Z.Nadsady, Y.Ben-Shaul. Unsupervised spike sorting with wavelets,
superparamgnetic clustering. Neural Computation. 2004, Vol. 16(8), pp. 1661-1687.
25. G.Holt. A Critical Reexamination of Some Assumptions, Implications of Cable Theory in Neurobiology
(PhD Thesis). California Institute of Technology, Pasadena (CA): Program in Computation and Neural Systems :
1998.
26. G.Holt, C.Koch. Electrical interactions via the extracellular potential near cell bodies. Journal of
Computational Neuroscience. 1999, 6, pp.169-184.
27. López-Aguado, L., Ibarz, L.M. and O., Herreras. Activity-dependent changes of tissue resistivity in
the CA1 region in vivo are layer-specific: modulation of evoked potentials. Neuroscience. 2001, Vol. 108, 2, pp.
249-262.
136
28. Thomas Jr C.A., Springer P.A., Loeb G.E., Berwald-Netter Y., Okun L.M. A miniature microelectrode
array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 1972, Vol. 74(1), pp. 6166.
29. Gross, G W, Wen, W and Lin, J. Transparent indium-tin oxide patterns for extracellular, multisite
recording in neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 1985, 15, pp. 243-252.
30. Maher, M.P., et al. The neurochip: a new microelectrode device dor stimulating and recording from
cultured neurons. Journal of Neuroscience Methods. 1999, Vol. 87(1), pp. 45-56.
31. Hottowy, P. Opracowanie modelu matryc mikroelektrodowych oraz układu scalonego do elektrycznej
stymulacji żywych sieci neuronowych. Rozprawa doktorska. Kraków : Akademia Górniczo-Hutnicza w Krakowie,
2006.
32. Henze, D A, et al. Intracellular Features Predicted by Extracellular Recordings in the Hippocampus.
Journal of Neurophysiology. 2000, Vol. 84, 1, pp. 390-400.
33.
Pyzowski,
P.
Mems
Journal.
[Online]
[Cited:
grudzień
30,
2012.]
http://www.memsjournal.com/2010/07/mems-for-neuroscience-research-applications.html.
34.
Dugue,
G.
Open
Optogenetics.
[Online]
[Cited:
grudzień
30,
2012.]
http://www.openoptogenetics.org/index.php?title=Arrays_and_Silicon_Optrodes.
35. An autonomus, broadband, multi-channel neural recording system for freely behaving primates.
Linderman, M. D., et al. s.l. : US National Library of Medicine, 2006. Proceedings of IEEE Conference on
Engineering in Medicine and Biology. Vol. 1, pp. 1212-1215. PMID: 17946450.
36. Mathieson, K., et al. Large-area microelectrode arrays for recording of neural signals. IEEE
Transactions on Nuclear Science. 2004, Vol. 51(5), pp. 2027-2031.
37. Gryboś, P., et al. Neuroplat 64 - low noise CMOS integrated circuit for neural recording applications.
Proceedings of the 5th International Meeting on substrate-Integrated Micro Electrode Arrays. 2006, pp. pp.208209.
38. Low noise multichannel front-end electronics for recording signals from alive neuronal cells. Gryboś, P.,
et al. Szczecin, Polska : s.n., June 2004. Proceedings of the 11th International Conference Mixed Design of
Integrated Circuits and Systems. pp. pp.214-219.
39. Hottowy, P., et al. An integrated multichannel waveform generator for large-scale spatio-temporal
stimulation of neural tissue. Analog Integrated Circuits and Systems. 2008, Vol. 55, pp. 239-248.
40. Bove, M, et al. Interfacing cultured neurons to planar substrate microelectrodes: characterization of
the neuron-to-microelectrode junction. Biochemistry and Bioenergetics. 1995, Vol. 38, 2, pp. 255-265.
41. Pillow J.W., Shlens J., Paninski L., Sher A., Litke A.M.,Chichilnisky E.J., Simoncelli E. P.,. Spatiotemporal correlations and visual signaling in a complete neuronal population. Nature. 2008, 454, pp. 995-999.
42. Litke A. M., Bezayiff N., Chichilnisky E. J., Cunningham W.,Dąbrowski W., Grillo A. A., Grivich M.,
Gryboś P., Hottowy P.,Kachiguine S., Kalmar R.S., Mathieson K., Petrusca D.,Rahman M., Sher, A. What
does the eye tell the brain? Development of a system for the large scale recording of retinal output activity.
IEEE Transaction on Nuclear Science. 2004, Vol. 55, 4, pp. 239-248.
43. Tang A., Jackson D., Hobbs J., Chen W., Smith J. L., Patel H.,Prieto A., Petrusca D., Grivich M. I.,
Sher, A., Hottowy, P.,Dąbrowski, W., Litke A. M., Beggs J. M.,. A Maximum Entropy Model Applied to Spatial
and Temporal Correlations from Cortical Networks In Vitro. Journal of Neuroscience. 2008, Vol. 28(2), pp. 505518.
44. Gryboś, Paweł. Low Noise Multichannnel Integrated Circuits in CMOS Technology for Physics and
Biology Applications. Kraków : AGH Uczelniane Wydawnictwa Naukowo-Dydaktyczne, 2002.
45. Fully Integrated and Low Power CMOS Amplifier for Neural Signal Recording. Wang, Y., et al. Shanghai :
s.n., 2005. 27th Annual International Conference of the Engineering in Medicine and Biology Society, 2005.
IEEE-EMBS 2005. pp. 5250-5253. ISBN 0-7803-8741-4.
46. Harrison, R. R. and Charles, C. A low-power low-noise CMOS amplifier for neural recording
applications. IEEE Journal of Solid-State Circuits. 2003, Vol. Vol. 38, Issue: 6, pp. pp. 958-965.
47. Sodagar, A. M., Wise, K. D. and Najafi, K. A Fully Integrated Mixed-Signal Neural Processor for
Implantable Multichannel Cortical Recording. IEEE Transctions on Biomedical Engineering. 2007, Vol. 54(6), pp.
1075-1088.
48. Harrison, Reid R., et al. A Low-Power Integrated Circuit for a Wireless 100-Electrode Neural
Recording System. IEEE Journal of Solid State Circuits. 2007, Vol. Vol. 42, Issue: 1, pp. pp. 123-133.
49. Pitfalls in the dipolar model for the neocortical EEG sources. Riera, J. J., et al. 2012, Vol. 108, pp. 956975.
137
50. Courtemanche, R. and Lamarre, Y. Local Field Potential Oscillations in Primate Cerebellar Cortex:
Synchronization With Cerebral Cortex During Active and Passive Expectancy. Journal of Neurophysiology. 2004,
Vol. Vol. 93, No. 4, pp. pp.2039-2052.
51. Bijan, P. Uncovering the Mysterious Origins of Local Field Potentials. Neuron. 2009, Vol. 61, 1, pp. 1-2.
52. Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal
multiplexing. Nature Methods. 2011, Vol. 8, pp. 139-142.
53. Hottowy, P., et al. Properties and application of a multichannel integrated circuit for low-artifact,
patterned electrical stimulation of neural tissue. Journal of Neural Engineering. Grudzień 2012, Vol. 9, 6, p.
066005.
54. Rydygier, P., Fiutowski, T. and Dąbrowski, W.. A low noise, low power, high dynamic range
amplifier-filter circuit for recording neural signals using multielectrode arrays. Przegląd Elektrotechniczny.
2010, Vol. 86, 11a, pp. pp. 64-68.
55. Allen, P. E. and Holberg, D. R. CMOS Analog Circuit Design. New York : Oxford University Press, 2011.
ISBN-10: 0199765073.
56. Suarez, Ricardo E., Gray, Paul R. and Hodges, David A. All-MOS CHarge Redistribution Analog-toDigital Conversion Techniques - Part II. IEEE Journal of Solid-State Circuits. 1975, Vols. SC-10, 6, pp. 379-385.
57. Dabrowski, W., Grybos, P and Litke, A. M. A low noise multichannel integrated circuit for recording
neuronal signals using microelectrode arrays. Biosensors Bioelectronics. 2004, No. 19, pp. pp. 749-761.
58. Miller, J. M. Dependence of the input impedance of a three-electrode vacuum tube upon the load in
the plate circuit. Scientific Papers of Bureau of Standards. 1920, Vol. 15, 351, pp. 367-385.
59. Low Power, High Dynamic Range, Sample&Hold Circuit and Analogue Multiplexer for Multi-channel
recording of Neuronal Signals. Rydygier, P., et al. Wrocław : s.n., 2010. Proceedings of the 17th International
Conference Mixed Design of Integrated Circuits and Systems.
60. Gregorian, R. Introduction to CMOS OP-AMPs and Comparators. 1. New York : John Wiley and Sons,
1999. pp. 164-170. ISBN 0-471-31778-0.
61. Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen
supply. European Journal of Neuroscience. 2009, Vol.29, pp. pp.319-327.
62. Freshney, I. R. Culture of Animal Cells. Wydanie trzecie. New Jersey : Johan Willey & Sons Inc., 1994.
ISBN 978-0-470-52812-9.
63. Egert, U., et al. A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated
multielectrode arrays. Brain Research Protocols. 1998, 2, pp. pp. 229-242.
64. Gahwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends in Neurosciences. 1988, Vol. Vol. 11, No.
11., pp. pp.484-489.
65. Pozzo Miller, L. D., et al. Spontaneous pyramidal cell death in organotypic slice cultures from rat
hippocampus is prevented by glutamate receptor antagonists. Neuroscience. 1994, Vol. 63(2), pp. 471-487.
66. Borst, A. and Theunissen, F. E. Information theory nad neural coding. Nature Neuroscience. 1999,
Vol. 2, 11, pp. 947-957.
67. Garofalo, M., et al. Evaluation of the Performance of Information Theory-Based Methods and CrossCorrelation to Estimate the Functional Connectivity in Cortical Networks. PLoS ONE. 2009, Vol. Vol.4, Issue 8,
pp. e6482-1-14.
68. Brown, E. N., Kass, R. E. and Mitra, Partha P. Multiple neural spike train data analysis: state-of the
art and future challenges. Nature Neuroscience. 2004, Vol. 7, 5, pp. 456-461.
69. Watts, D. J. and Strogatz, S.H. Collective dynamics of 'small-world' networks. Nature. 1998, 393, pp.
440-442.
70. Schreiber, T. Measuring Information Transfer. Physical Review Letters. 2000, 85, pp. 461-464.
71. Aersten, A.M.H.J. and Gerstein, George L. Evaluation of Neuronal Connectivity: Sensitivity of CrossCorrelation. Brain Research. 1985, 340, pp. 341-354.
72. Bryant, H.L., Marcos, A.R. and Segundo, J.P. Correlations of Neuronal Spike Discharges Produced by
Monosynaptic Connections and by Common Inputs. Journal of Neurophysiology. 1973, Vol. 36, 2, pp. 205-225.
73. Moore, G. P., et al. Statistical Signs of Synaptic Interaction in Neurons. Biophysical Journal. 1970, Vol.
10(9), pp. 876-900.
74. Nini, A., et al. Neurons in the Globus Pallidus Do Not Show Correlated Activity in the Normal Monkey,
but Phase-Locked Oscillations Appear in the MPTP Model of Parkinsonism. Journal of Neurophysiology. 1995,
Vol. 74(4), pp. 1800-1805.
75. Yin, T. C., Chan, J. and Carney, L. H. Effects of Interaural Time Delays of Noise Stimuli on LowFrequency Cells in the Cat's Inferior Colliculus. III Evidence for Cross-Correlation. Journal of Neurophysiology.
Vol. 58(3), pp. 562-583.
138
76. Brunel, N. and van Rossum, M. Lapicque’s 1907 paper: from frogs to integrate-and-fire. Biological
Cybernetics. 2007, Vol. 97, 5-6, pp. 337-339.
77. Wójcik, D. Prezentacja: Od neuronu do sieci: modelowanie układu nerwowego. Proste modele
neuronów. [Online] [Cited: wrzesień 26, 2012.] http://www.neuroinf.pl/Members/danek/swps/mun/
Article.2007-06-19.3506/getFile.
78. Badel, L., Gerstner, W. and Richardson, M.J. Spike-triggered averages for passive and resonant
neurons receiving filtered excitatory and inhibitory synaptic drive. Physical Review E. 2008, Vol. 78, 1, pp.
011914 1-12.
79. Ostojic, S., Brunel, N. and Hakim, V. How Connectivity, Background Activity, and Synaptic Properties
Shape the Cross-Correlation between Spike trains. The Journal of Neuroscience. 2009, Vol. 29(33), pp. 1023410253.
80. Gerstner, W. and Kistler, W. Spiking Neuron Models. Single Neurons, Populations, Plasticity. wyd. 1.
Cambridge : Cambridge University Press, 2002. ISBN 0 521 89079 9.
81. Hessler, N. A., Shirke, A. M. and Malinow, R. The probability of transmitter release at a mammalian
central synapse. Nature. 1993, Vol. 366, 6455, pp. 569-572.
82. Gabbiani, F., Midtgaard, J. and Knoepfl, T. Synaptic integration in a model of cerebellar granule cells.
Journal of Neurophysiology. 1994, 72, pp. 999-1009.
83. Wang, X. J., et al. Division of labor among distinct subtypes of inhibitory neurons in a cortical
microcircuit of working memory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. February 3, 2004,
Vol. 101(5), pp. 1368-1373.
84. Douglas, R. J., Martin, K. A.C. and Whitteridge, D. A Cannonical Microcircuit for Neocortex. Neural
Computation. March 13, 1989, Vol. Vol. 1, No.4, pp. 480-488.
85. Sears, T. A. and Stagg, D. Short-term synchronization of intercostal motoneurone activity. Journal of
Physiology. 1976, 263, pp. 357-381.
86. Shea-Brown, E., et al. Correlation and synchrony transfer in integrate-and-fire neurons: basic
properties and consequences for coding. Physical Review Letters. 2008, 100, p. 108102.
87. Melssen, W. J. and Epping, W. J. Detection and estimation of neural connectivity based on cross
correlation analysis. Biological Cybernetics Journal. 1987, 57(6), pp. 403-414.
88. Alonso, J. M. and Martiinez, L. M. Functional connectivity between simple cells and complex cells in
cat striate cortex. Nature Neurosicence. 1998, 1, pp. 395-403.
89. Fujisawa, S., et al. Behavior-dependent short-term assembly dynamics in the medial prefrontal
cortex. Nature Neuroscience. 2008, Vol. Vol.11, No.7, pp. 823-833.
90. Rompelman, O. and Ros, H. H. Coherent Avaraging Technique: A Tutorial Review. Part 2: Trigger
jitter, overlapping responses and non-periodic stimulation. Journal of Biomedical Engineering. 1986, Vol. 8, pp.
30-35.
91. Weisstein, E. W. Uniform Distribution. From MathWorld - A Wolfram Web Resource. [Online] [Cited:
09 21, 2012.] http://mathworld.wolfram.com/UniformDistribution.html.
92. Chatfield, C. The Analysis of Time Series: An Introduction. New York : CHapman & Hall, 2003.
93. Zieliński, T.P. Cyfrowe przetwarzanie sygnałów. Wyd.1. Warszawa : Wydawnictwo Komunikacji i
Łączności, 2007. ISBN: 978-83-206-1640-8.
94. Jortner, R. A, Farivar, S. S and Laurent, G. A Simple Connectivity Scheme for Sparse Coding in an
Olfactory System. Journal of Neuroscience. 2007, Vol. 27, 7, pp. 1659-1669.
95. Wiesel, T. N., Ts'o, D. Y. and Gilbert, C. D. Relationships Between Horizontal Interactions and
Functional Architecture in Cat Striate Cortex as Revealed by Cross-Correlation Analysis. The Journal of
Neuroscience. 1986, Vol. 6(4), pp. 1160-1170.
96. Csicsavari, J., et al. OscillatoryCoupling of Hippocampal Pyramidal Cells and Interneurons in the
Behaving Rat. The Journal of Neuroscience. 1999, 19(1), pp. 274-287.
97. Bartho, P., et al. Characterization of Neocortical Principal Cells and Interneurons by Network
Interactions and Extracellular Features. Journal of Neurophysiology. 2004, Vol. 92, 1, pp. 600-608.
98. Buchwalow, I.B. and Bocker, W. Immunochemistry: Basics and Methods. Wyd. 1. Berlin-Heidelberg :
Springer-Verlag, 2010. ISBN:978-3-642-04608-7.
99. Borg-Graham, I., J. Interpretations of data, mechanisms for hippocampal pyramidal cell models.
Cerebral Cortex. New York : Plenum Press, 1999, 13, pp. 19-138.
100. Engel, A. K., Fries, P. and Singer, W. Dynamic predictions: oscillations and synchrony in top-down
processing. Nature Review Neuroscience. 2001, No. 2, pp. 704-716.
101. Traub, R. D., Jeffreys, J. G. and Whittington, M. A. Fast Oscillations in Cortical Circuits. Cambridge :
MIT Press, 1998. ISBN 0262201186.
139
102. Llinas, R., et al. The neuronal basis for consciousness. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 1998, Vol. 353,
1377, pp. 1841-1849.
103. Gray, C. M., et al. Oscillatory responses in cat visual cortex exhibit inter-collumnar synchronization
which reflects global stimulus properties. Nature. 1989, No. 338, pp. 334-337.
104. Csicsvari, J., et al. Mechanisms of gamma Oscillations in the Hippocampus of the Behaving Rat.
Neuron. 2003, Vol. Vol. 37, pp. 311-322.
105. Torrence, Ch. and Compo, G. P. A Practical Guide to Wavelet Analysis. Bulletin of the American
Meteorological Society. 1998, Vol. 79(1), pp. 61-78.
106. Shen, D. and Ip, H.. Discriminative wavelet shape descritors for recognition of 2-D patterns. Pattern
Recognition. 1999, 32, pp. 151-165.
107. Garcia, C. and Tziritas, G. Face detection using quantized skin color regions merging and wavelet
packet analysis. IEEE Transactions on Multimedia. 1999, Vol. Vol. 1, No. 3, pp. pp.264-277.
108. MathWorks Web Page. [Online] http://www.mathworks.com/help/signal/ref/findpeaks.html.
109. Colbert, C., M. and Pan, E. Ion channel properties underlying axonal action potential initiation in
pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 2002, Vol. 5, pp. 533-538.
110. Storm, J., F. Determinants of voltage attenuation in neocortical hippocampal neurons. Nature. 1988,
Vol. 336, pp. 379-381.
111. Halliwell, J., V. and Adams, P., R. Voltage-clamp analysis of muscarinic excitation in hippocampal
neurons. Brain Research. 1982, Vol. 250, pp. 71-92.
112. Magee, J., C. Dendritic hyperpolarization-activated currents modify the integrative properties of
hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuroscience. 1998, Vol. 18, pp. 7613-7624.
113. Christie B., R. and al, et. Different Ca2 channels in soma, dendrites of hippocampal pyramidal
neurons mediate spike-induced Ca2 influx. Journal of Neurophysiology. 1995, Vol. 73, pp. 2553-2557.
114. Magee, J., C. and Johnston, D. Characterization of single voltage-gated Na+, Ca2+ channels in apical
dendrites of rat CA1 pyramidal neurons. Journal of Physiology. 1995, 487, pp. 67-90.
115. Fisher, R., E., Gray, R. and Johnston, D. Properties, distributions of single. voltage-gated calcium
channels in adult hippocampal neurons. 1990, Vol. 64, pp. 91-104.
116. Mainen, Z.,F., et al. A model of spike initiation in neocortical pyramidal neurons. Neuron. 1995, Vol.
15, pp. 1427–1439.
117. Hoffman, D., A., et al. K+ channel regulation of signal propagation in dendrites of hippocampal
pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 1997, Vol. 387, pp. 869-875.
118. Klee, R., Ficker., E. and Helnemann, U. Comparison of voltage-dependent potassium currents in rat
pyramidal neurons acutely isolated from hippocampal regions CA1, CA3. Journal of Neurophysiology. 1995, Vol.
74, 5, pp. 1982-1995.
119. Lancater, B. and Nicoll, B., A. Properties of two calcium-activated hyperpolarizations in rat
hippocampal slices. Journal of Physiology. 1987, 389, pp. 187-203.
120. Williamson, A. and Alger, B., E. Characterization of an early afterhyperpolarization after a brief
train of action potentials in rat hippocampal neurons in vitro. Journal of Neurophysiology. 1990, Vol. 63(1), pp.
72-81.
121. Meaney, D. F. Molecular Neuroengineering, University of Pansylvania. [Online] [Cited: 01 01, 2013.]
http://www.seas.upenn.edu/~molneuro/projects.html.
140
SPIS RYSUNKÓW
1-1: Budowa komórki nerwowej [7]
12
1-2: Sekwencja działania kanałów błonowych w kolejnych fazach generacji potencjału czynnościowego
[9].
14
1-3: Propagacja potencjału czynnościowego: [8], [9].
16
1-4: Budowa i działanie synapsy. [8]
17
1-5: Dwa główne typy synaps chemicznych. [10]
18
1-6: Model elektryczny błony komórkowej wg. Hodgkina-Huxleya
1-7: Model elektryczny synapsy chemicznej. [17]
20
1-8: Schemat mózgu myszy z przekrojem kory dla uwidocznienia położenia hipokampa [10]
21
1-9: Przekrój poprzeczny hipokampu myszy ukazujący warstwowe ułożenie komórek[18]
23
1-10: Rycina ukazująca kształt i ilość kluczowych neuronów w zakręcie zębatym (DG) i hipokampie (CA3,
CA1). [10]
23
1-11: Diagram połączeń formacji hipokampu mózgu szczura oraz wybranych struktur kory mózgowej.
[21]
25
2-1: Mikrofotografia matrycy 512 mikroelektrod o wymiarach ~1mm x 2mm.
29
2-2: Schemat zastępczy dla wyznaczenia parametrów sygnału rejestrowanego przez mikroelektrodę
zewnątrzkomórkową.
29
2-3: Porównanie kształtów impulsu zarejestrowanego elektrodą wewnątrzkomórkową (intra) i
zewnątrzkomórkową (extra).[ 32]
30
2-4: Matryca mikroigieł do rejestracji aktywności elektrycznej neuronów [33]
31
2-5: A) sonda mikroelektrodowa wykonana w technologii CMOS wraz z systemem odczytu [34] B)
Fotografia trójwymiarowej macierzy sond. Każda sonda zawiera 112 niezależnych elektrod (w
sumie 1792 elektrody) [34].
31
2-6: Schemat blokowy 512-elektrodowego systemu do rejestracji aktywności komórek nerwowych. 32
2-7: Fotografia płytki drukowanej – komora z matrycą mikroelektrod, osiem par układów Stimchip i
Neuroplat.
33
2-8: Schemat blokowy układu scalonego Neuroplat..
33
2-9: Schemat blokowy kanału odczytu układu “Neuroplat” [38].
34
2-10: Przykładowy przebieg 700 s zarejestrowanej aktywności 76 neuronów.
36
2-11: Pasożytniczy przesłuch sygnału zegarowego (CLK) powodujący zakłócenia w trakcie próbkowania
przetwornikiem ADC.
39
2-12: Schemat blokowy układu scalonego NEUROSTIM
39
3-1: Moduły układów scalonych NEURO2, NEURO_DAC oraz NEUROSTIM.
41
3-2: Przetwornik cyfrowo-analogowy z sukcesywną redystrybucją ładunku, schemat koncepcyjny.
42
3-3: Ilustracja przebiegu napięć na pojemnościach sekwencyjnego przetwornika cyfrowo-analogowego.
43
3-4: Schemat połączenia kondensatorów przetwornika uwzględniający pojemności pasożytnicze klucza
45
3-5: Przebieg napięcia na wyjściu sekwencyjnego przetwornika cyfrowo-analogowego dla
przykładowego słowa: 110010101.
46
3-6: Układ próbkująco-pamiętający zastosowany jako bufor sekwencyjnego przetwornika cyfrowoanalogowego:
47
3-7: Schemat przetwornika cyfrowo-analogowego z układem próbkująco-pamiętającym i układem
redukcji artefaktów.
47
3-8: Przebiegi napięć wyjściowych dla przetwornika cyfrowo-analogowego
48
3-9: Wartości prądu wyjściowego oraz nieliniowości różniczkowa (DNL) i całkowa (INL) dla trzech
zakresów prądowych: ±1µA, ±5µA i ±25µA.
49
141
3-10: Wykres maksymalnych (niebieskie) i minimalnych (czerwone) wartości nieliniowości różniczkowej
(DNL) oraz całkowej (INL).
50
3-11: Wykres zbiorczy prądów wyjściowych przetwornika DAC.
50
3-12: Wykres wartości wzmocnienia DACa przy polarności ujemnej (kolor czarny) i dodatniej (kolor
różowy)
51
3-13: Wykres napięć wyjściowych dla 64 kanałów przetwornika, tryb napięciowy w zakresie ±100mV
(kolor niebieski) i ±500mV (kolor czerwony)
51
3-14: Nieliniowość różniczkowa (DNL) i całkowa (INL), zakres ±100mV i ±500mV
52
3-15: Fotografia układu scalonego NEUROSTIM umieszczonego na płytce testowej. Wymiary układu to
5 mm ⨯ 7 mm.
49
3-16: Schemat blokowy kanału odczytu
52
3-17: Schemat układu przedwzmacniacza: wejściowy filtr CR (MC, MR), przedwzmacniacz różnicowy
(M1-M6), wtórnik napięciowy o całkowitym poborze prądu 20μA.
53
3-18: Schemat ilustrujący koncepcję działania filtru pasmowo-przepustowego
54
3-19: Filtr pasmowo przepustowy.
55
3-20: Schemat małosygnałowy filtru pasmowo przepustowego
55
3-21: Filtr pasmowo przepustowy – kanał dla częstotliwości od kilkuset do kilku tysięcy Hz.
56
3-22: Schemat blokowy wzmacniacza wyjściowego.
57
3-23: Fotografia układu NEURO2. Wymiary układu scalonego 1700 µm ⨯ 2600 µm.
57
3-24: Charakterystyki częstotliwościowe filtrów pasmowo przepustowych.
58
3-25: Napięcia wyjściowe w funkcji napięcia wejściowego i nieliniowość całkowa.
58
3-26: Schemat blokowy multipleksera analogowego
59
3-27: Komórka pamięci analogowej z dwoma kondensatorami pamiętającymi – 4 tryby pracy.
60
3-28: Wzmacniacz operacyjny z pływającym źródłem prądowym.
61
3-29: Napięcie wyjściowe multipleksera podczas odczytu z komórek.
62
3-30: Przebiegi napięć wyjściowych rejestru przesuwnego oraz schemat koncepcyjny rejestru
przesuwnego z „wędrującą jedynką”.
63
3-31: Graf stanów multipleksera analogowego.
64
4-1: Hodowla kultury organotypowej hipokampu na matrycy mikroelektrod (mysz 6-dniowa).
68
4-2: Teoretyczne, uproszczone kształty funkcji korelacji wzajemnej
71
4-3: Przykładowe wykresy funkcji korelacji wzajemnej.
72
4-4: Schemat modelu neuronu „całkuj i strzelaj” [77].
73
4-5: Schemat modelu neuronu „przeciekający całkuj i strzelaj” [77].
73
4-6: Wykres przewodności synapsy.
76
4-7: Funkcja korelacji wzajemnej odpowiadająca pojedynczej synapsie pobudzającej [79].
77
4-8: Wykres funkcji analitycznej odpowiadającej korelacji wzajemnej neuronów połączonych synapsą
hamującą [79].
79
4-9: Funkcja korelacji wzajemnej neuronów A i B będąca wynikiem ich wzbudzenia przez trzeci neuron.[
79].
79
4-10: Funkcja korelacji wzajemnej dla dwóch wzbudzających się neuronów [79].
80
4-11: Funkcja korelacji wzajemnej dla ujemnego sprzężenia zwrotnego.
80
4-12: Pięć przykładów korelacji wzajemnej obrazujących względność oceny manualnej
81
4-13: Detekcja pojedynczych połączeń synaptycznych metodą drgań losowych.
83
4-14: Charakterystyki częstotliwościowe filtracji metodą drgań losowych.
85
4-15: Przykładowe charakterystyki częstotliwościowe filtru uśredniającego z wagami malejącymi liniowo
względem wartości centralnej.
87
4-16: Porównanie wartości progowych uzyskanych metodą drgań losowych z szerokością okna
czasowego +/-20ms (a) i metodą filtru uśredniającego (b).
88
4-17: Porównanie charakterystyk: filtr uśredniający 5-rzędu o 29 współczynnikach (zielona krzywa z
diamentami).
88
142
4-18: Przykład separacji funkcji korelacji wzajemnej na trzy składowe: składową stałą, sygnał i szum. 89
4-19: Przykładowe wykresy funkcji korelacji wzajemnej bez oznak połączeń synaptycznych (a,b) oraz
bardzo niskiej liczbie koincydencji (c,d).
90
4-20: Przykładowe wykresy korelacji wzajemnych, CDC(t) – korelacje po filtracji filtrem o częstotliwości
granicznej 10Hz, kolorem ciemnoniebieskim zaznaczono obszary, w których obliczony zostanie
poziom szumu względem poziomu CDC(t).
91
4-21: Wykrycie zakresów korelacji wzajemnej wykraczających poza granice istotności statystycznej.
Zakres na osi czasu został zawężony w stosunku do poprzedniego rysunku dla przejrzystości. Dane z
eksperymentu 2011-06-28-1.
92
4-22: Określenie typu komórki w obszarze hipokampa na podstawie danych z rejestracji
zewnątrzkomórkowej [96].
94
4-23: Połączenie dwóch neuronów poprzez dwa połączenia monosynaptyczne.
96
4-24: Połączenia synaptyczne 3 neuronów: neuron A pobudza synaptycznie C i B.
96
5-1: Fotografie mikroskopowe kultur organotypowych.
98
5-2: Zdjęcia kultur organotypowych wykonane po umiejscowieniu na matrycy mikroelektrod;
99
5-3: Rozpoznawanie struktur anatomicznych.
100
5-4: Fotografia kultury organotypowej na matrycy nałożona na fotografię z pierwszego dnia hodowli
(DIV1).
100
5-5: Mapa połączeń funkcjonalnych uzyskana z eksperymentu 2011-06-26-2.
101
5-6: Mapa połączeń funkcjonalnych uzyskana z eksperymentu 2011-06-26-2 połączenia hamujące
102
5-7: Mapa neuronów, eksperyment 2011-06-28-1..
103
5-8: Mapa połączeń pobudzających, eksperyment 2011-06-28-1.
103
5-9: Mapa połączeń hamujących, eksperyment 2011-06-28-1.
104
5-10: Mapa neuronów, eksperyment 2012-04-17-1.
104
5-11: Mapa połączeń pobudzających, eksperyment 2012-04-17-1.
105
5-12: Mapa połączeń hamujących, eksperyment 2011-04-17-1.
105
5-13: Mapa neuronów, eksperyment 2012-04-19-0.
106
5-14: Mapa połączeń pobudzających, eksperyment 2012-04-19-0. Zaznaczone zostały obszary
hipokampa CA1, CA3.
106
5-15: Mapa połączeń hamujących, eksperyment 2011-04-19-0.
106
5-16: Mapa neuronów, eksperyment 2012-05-21-0.
107
5-17: Mapa połączeń pobudzających, eksperyment 2012-05-21-0.
107
5-18: Mapa połączeń hamujących, eksperyment 2011-05-21-0.
108
5-19: Mapa neuronów, eksperyment 2012-05-22-1.
108
5-20: Mapa połączeń pobudzających, eksperyment 2012-05-22-1.
109
5-21: Mapa połączeń hamujących, eksperyment 2011-05-22-1.
109
5-22: Mapa neuronów, eksperyment 2011-06-27-1.
110
5-23: Mapa połączeń pobudzających, eksperyment 2011-06-27-1.
110
5-24: Mapa połączeń hamujących, eksperyment 2011-06-27-1.
111
5-25: Przykładowy wykresy funkcji korelacji wzajemnej: maksimum centralne i maksima boczne dla
czasu dodatniego i ujemnego w równej odległości
111
5-26: Mechanizm powstawania oscylacji typu gamma w hipokampie według [104]..
112
Rysunek 5-27 Wykres względnej mocy widmowej dla korelacji wzajemnej połączenia synaptycznego o
charakterze pobudzającym.
113
Rysunek 5-28: Wykres względnej mocy widmowej dla pary neuronów, których aktywność jest
zsynchronizowana z częstotliwością ok. 45Hz.
113
Rysunek 5-29: Wykres względnej mocy widmowej połączenia funkcjonalnego
114
Rysunek 5-30: A) wykres korelacji wzajemnej zawierający częstotliwości harmoniczne poniżej 50Hz
pozwala wnioskować o synchronizacji aktywności neuronów
114
143
5-31: Wykresy zbiorcze maksimów mocy widmowej – maksimum względnej mocy widmowej w funkcji
częstotliwości.
116
5-32: Wykresy zbiorcze maksimów mocy widmowej.
117
5-33: Histogram średnich częstotliwości synchronizacji aktywności par neuronów.
118
5-34: Mapa połączeń neuronów zsynchronizowanych w rytmie gamma, kultura 2012-05-23-0. W
centralnej części rysunku widoczny neuron hamujący (zielone kółeczko) zsynchronizowany z bardzo
dużą liczbą neuronów.
119
5-35: Mapa połączeń neuronów zsynchronizowanych w rytmie gamma, kultura 2011-06-28-1. Odcienie
koloru czerwonego zostały dodane dla przejrzystości.
119
5-36: Mapa połączeń neuronów zsynchronizowanych w rytmie gamma, kultura 2012-05-21-1.
Szczególnie widoczne jest nierównomierne rozłożenie ilości połączeń przypadających na 1 neuron.
120
5-37: Mapa połączeń neuronów zsynchronizowanych w rytmie gamma, kultura 2011-06-26-2.
120
5-38: Ilustracja czasu narastania i opadania na wykresie korelacji wzajemnej aktywności pary neuronów
połączonych połączeniem pobudzającym, z którym związane są stałe czasowe w modelu synapsy
pobudzającej.
121
5-39: Histogramy ilorazów stałych czasowych. Charakterystyczną cechą jest bardzo wyraźne oddzielenie
piku dla wartości Γτ = 1, który oznacza zbiór krzywych symetrycznych. Pozostałe wartości oznaczają
połączenia pobudzające.
122
5-40: Wykres zbiorczy znormalizowanych histogramów ilorazu stałych czasowych Γτ . Wszystkie
histogramy posiadają maksimum dla współczynnika Γτ ≈1, który odseparowany jest od pozostałych
wartości (przerwa oznaczona czerwoną strzałką).
123
5-41: Wykres zbiorczy znormalizowanych histogramów. Wartości histogramów przedstawione zostały w
skali kolorów ciepłych. Histogramy przyjmują najwyższe wartości dla ilorazów stałych czasowych
0.48, 0,65, 0.72, 0.85.
124
5-42: . Wykres gęstości połączeń hamujących w funkcji połączeń pobudzających.
126
5-43: Wykres gęstości połączeń gamma w funkcji gęstości połączeń pobudzających.
127
5-44: . Wykres gęstości połączeń gamma w funkcji gęstości połączeń hamujących.
127
A-1: Geometria elektrod
130
A-2: Przebiegi napięć na elektrodzie centralnej (1) i sąsiadujacych (2-7).
131
A-3: Wykres rozproszenia najbardziej znaczących zmiennych, określony met. PCA.
131
A-4: uśrednione wartości zarejestrowanego napięcia dla odpowiadających im 4 grup sklasyfikowanych
na Rysunku.
132
B-1: Falka Morleta, a) wykres wartości zespolonych, b) rzut wartości rzeczywistych, i c) rzut wartości
urojonych
133
144
SPIS TABEL
Tabela 2.1 Parametry analogowego układu odczytu oraz rozdzielczość ADC wymagana dla
poszczególnych klas sygnałów występujących w eksperymentach z rejestracją potencjałów
zewnątrzkomórkowych ..................................................................................................................... 37
Tabela 3.1 Tryby pracy multipleksera oraz wartości logiczne sygnałów mode0 i mode1 ........................ 64
Tabela 5.1 Gęstość połączeń zsynchronizowanych oraz średnie częstotliwości synchronizacji .............. 117
Tabela 5.2. Gęstość połączeń w badanych kulturach organotypowych .................................................. 125
145