immunofenotyp dojrza£ych komórek hematopoetycznych
advertisement
POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM 35 2008 SUPLEMENT NR 24 (4564) 45 IMMUNOFENOTYP DOJRZA£YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH... IMMUNOFENOTYP DOJRZA£YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH PIERWOTNE I WTÓRNE NIEDOBORY IMMUNOPHENOTYPE OF MATURE HEMATOPOIETIC CELLS PRIMARY AND SECONDARY IMMUNODEFICIENCES Anna PITUCH-NOWOROLSKA Zak³ad Immunologii Klinicznej, Polsko-Amerykañski Instytut Pediatrii, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloñski Streszczenie: W pracy przedstawiono charakterystykê leukocytów krwi obwodowej i wêz³ów ch³onnych z ocen¹ immunofenotypów, podaniem zmiennoci zwi¹zanej z wiekiem. W rozdziale o niedoborach odpornoci przedstawione zosta³y pierwotne niedobory wraz z opisem zmian w obrêbie proporcji populacji leukocytów ocenianych metod¹ cytometrii przep³ywowej. Omówiono szerzej te niedobory, w których badania immunofenotypu komórek krwi obwodowej i wêz³ów ch³onnych stanowi podstawê rozpoznania. Summary: The leukocytes characteristics from peripheral blood and lymph nodes including age-related changes were shown. Primary immunodeficiencies were described based on quantitative changes within lymphocytes T and B populations assayed with flow cytometry. Immunodeficiences with diagnosis based on analysis of peripheral blood and lymph node cells' immunophenotypes were discussed. 1. OCENA OBECNOCI I IMMUNOFENOTYPU POPULACJI KOMÓRKOWYCH Krew obwodowa W warunkach fizjologicznych we krwi obwodowej obecne s¹ nastêpuj¹ce populacje komórkowe wyodrêbnione na podstawie w³aciwoci fizyko-chemicznych: • ma³e ziarniste komórki odpowiadaj¹ce granulocytom, w tym równie¿ niewielka populacja najbardziej ziarnistych komórek czyli granulocytów kwasoch³onnych, • ma³e komórki nieziarniste odpowiadaj¹ce limfocytom, • redniej wielkoci komórki o niewielkiej iloci ziarnistoci odpowiadaj¹ce monocytom, komórkom NK. 46 A. PITUCH-NOWOROLSKA RYCINA 1. Populacje komórek krwi obwodowej po lizie erytrocytów. Rozk³ad punktowy (dot plot) oparty na parametrach SSC i FSC ukazuje populacje komórek ró¿ni¹ce siê cechami fizycznymi wielkoci¹ i rozbudow¹ powierzchni odzwierciedlaj¹c¹ iloæ ziarnistoci. Wyranie widoczne s¹ komórki ma³e, sk¹poziarniste odpowiadaj¹ce limfocytom (bramka R3), nieco wiêksze i bardziej ziarniste monocyty (R2) oraz najwiêksza ilociowo populacja granulocytów wieloj¹drzastych (R1). Proporcje granulocytów do limfocytów zmieniaj¹ siê z wiekiem i u dzieci do 3 roku ¿ycia przewa¿aj¹ limfocyty, a u starszych dzieci i osób doros³ych granulocyty Ponadto we krwi obwodowej stwierdza siê komórki wystêpuj¹ce w odsetku ni¿szym ni¿ 1% (populacje ladowe). Nale¿¹ do nich granulocyty zasadoch³onne, plazmocyty, komórki dendrytyczne, macierzyste komórki hematopoetyczne, czasami pojedyncze komórki ródb³onkowe i inne korzystaj¹ce z krwi jako drogi transportowej do miejsca docelowego. Do takich komórek nale¿¹ np. komórki nowotworowe, prekursorowe w stanach zapalnych. W cytometrze przep³ywowym zale¿nie od ustawienia na wykresie punktowym o osiach FSC i SSC rozk³ad tych populacji komórek obecnych we krwi obwodowej jest ró¿ny (ryc. 1). W przypadku poszukiwania i analiz np. populacji ladowych o parametrach odpowiadaj¹cych populacji limfoidalnej bardziej korzystne wydaje siê zastosowanie skali logarytmicznej FSC ani¿eli liniowej. Przygotowanie zawiesiny komórkowej jest równie¿ zale¿ne od celu analizy. Istniej¹ dwie podstawowe metody badania komórek krwi obwodowej. Jedna polega na barwieniu komórek w pe³nej krwi, a nastêpnie lizie erytrocytów. W pozostaj¹cej po lizie zawiesinie komórek do badania pozostaj¹ wszystkie populacje krwinek bia³ych ³¹cznie z granulocytami. Drugi sposób polega na nieci¹g³ym gradiencie gêstoci, po którym w interfazie pozostaje zawiesina komórek jednoj¹drzastych pozbawiona erytrocytów i granulocytów. Metody te s¹ stosowane zale¿nie od potrzeb, ale w praktyce laboratoryjnej w celach porównawczych powinna byæ stale u¿ywana jedna z tych metod, gdy¿ wyniki badañ tej samej zawiesiny komórkowej zale¿nie od metody mog¹ siê nieco ró¿niæ zw³aszcza w ocenie odsetka danej populacji komórkowej. IMMUNOFENOTYP DOJRZA£YCH RYCINA 2. Sposób pokazania obecnych populacji komórkowych. Komórki jednoj¹drzaste krwi obwodowej uzyskano poprzez nieci¹g³y gradient gêstoci. Pobrana na EDTA krew obwodowa po rozcieñczeniu 1:1 sol¹ fizjologiczn¹ zostaje nawarstwiona na limfoprep (Ficoll/Isopaque) i wirowana (400 g przez 20 min). Po gradiencie w interfazie pozostaj¹ komórki jednoj¹drzaste, a erytrocyty i granulocyty opadaj¹ poni¿ej warstwy limfoprepu na dno próbówki. Komórki zebrane z interfazy, stanowi¹ mieszaninê limfocytów, monocytów, komórek NK.Ustawienie parametru SSC w skali logarytmicznej pozwala na lepsze uwidocznienie populacji limfocytarnej. Taki uk³ad parametrów mo¿na poleciæ do badania tych w³anie komórek np. w diagnostyce bia³aczek i ch³oniaków. Ustawienie skali linearnej parametru SSC pozwala na uwidocznienie lepsze populacji monocytarnej i granulocytarnej (na rycinie tej populacji komórek nie ma). To ustawienie jest powszechnie u¿ywane, a jego mankamentem mo¿e byæ po³o¿enie populacji limfocytarnej jako ciasnej chmury komórek bliskiej linii. Aby te komórki uwidoczniæ, nale¿y zmieniæ poziom czu³oci SSC tak, aby kosztem chmury granulocytarnej wyranie pokazaæ ca³¹ populacjê limfocytarn¹ KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH... KREW OBWODOWA GRADIENT GÊSTOCI 47 SSC - skala logarytmiczna R1 - monocyty R2 - limfocyty KREW OBWODOWA GRADIENT GÊSTOCI SSC - skala linearna R3 - monocyty R4 - limfocyty Populacja limfocytów zawiera zarówno limfocyty T, jak i B. Stanowi ona wyranie odgraniczon¹ populacjê komórek ma³ych pozbawionych ziarnistoci ³atw¹ do bramkowania na podstawie parametrów FSC i SSC. W wielokolorowej cytometrii podstaw¹ selekcji populacji limfocytów T jest obecnoæ na powierzchni komórek CD3, a limfocytów B CD19 i/lub CD22. Zestaw przeciwcia³ wykorzystywany do oceny populacji limfocytów zawiera przeciwcia³a pozwalaj¹ce na szybk¹ i wstêpn¹ analizê (CD45, CD3, CD4, CD8, CD2, CD5, CD7, CD19, CD16+CD56, CD14) populacji limfocytów T i limfocytów B, monocytów oraz komórek NK (ryc. 2). Analiza pozwalaj¹ca na charakterystykê immunofenotypow¹ i czêciowo funkcjonaln¹ subpopulacji limfocytów T oparta jest na wykorzystaniu znacznej iloci pozwalaj¹cych na ocenê ekspresji determinant zwi¹zanych z ró¿nicowaniem i funkcj¹ tych komórek, przyk³ad takiej listy do trójkolorowej analizy zawiera tabela 1. 48 A. PITUCH-NOWOROLSKA TABELA 1. Zestawienia przeciwcia³ monoklonalnych u¿ywane do okrelenia immunofenotypu limfocytów krwi obwodowej Przeciwcia³o FITC Przeciwcia³o Przeciwcia³o Identyfikowana subpopulacja RPE sprzê¿one z 3. fluorochromem CD15 CD5 CD14 CD19 CD45 CD3 CD4 CD4 CD8 CD4 CD8 CD25 TRC a/b CD7 CD8 CD38 CD10 sIgM kappa CD8 CD45RA CD45RA CD45RO CD45RO HLA- DR TRC g/d CD16/CD56 CD16/CD56 HLA- DR CD20 CD22 lambda CD3 CD3 CD3 CD3 CD3 CD3 CD3 CD3 CD3 CD19 CD19 CD19 CD19 K ontrola "bramki" limfocytarnej Limfocyty T: C D3+ Limfocyty B: D5+/C D19,C D5- /C D19 Limfocyty T: C D3/C D4 i C D3/C D8 Limfocyty T: C D3/C D45RA Uwagi C zêsto w zestawieniu bez C D15 U dzieci ladowa populacja C D5+ Limfocyty T: C D3/C D45RO Marker aktywacji limfocytów T Limfocyty T: a/b i g/d K omórki N K K omórki NK Limfocyty B Limfocyty B: prekursory C D10+ C D38 marker komórek prekursorowych Odsetki i iloci limfocytów T i B, komórek NK, granulocytów i monocytów w warunkach prawid³owych zale¿nie od wieku i p³ci W tabeli 2 i 3 pokazano proporcje odsetkowe i iloci komórek nale¿¹cych do poszczególnych populacji w zale¿noci od wieku. Obecnie czêsto okrela siê obecnoæ populacji limfocytów T podwójnie ujemnych (CD3+/CD4/CD8-) we krwi obwodowej. Wzrost odsetkowy tej populacji obserwuje siê w okresach infekcji bakteryjnej, wirusowej. Opisano równie¿ niedobór odpornoci komórkowej polegaj¹cy na wysokim odsetku tych limfocytów T kr¹¿¹cych we krwi (tab. 2). Komórki NK stanowi¹ oko³o 10% populacji jednoj¹drzastych komórek krwi obwodowej. Ich liczba wzrasta w trakcie infekcji g³ównie wirusowych, aczkolwiek niektóre wirusy (np. wirus Epstein-Barr) prowadz¹ do d³ugotrwa³ego obni¿enia liczby komórek NK, co jest wi¹zane z objawami zespo³u przewlek³ego zmêczenia (chronic fatigue syndrome). Obecnie w wielu badaniach podkrela siê zaburzenia ekspresji determinant (np. CD16) na powierzchni komórek NK, ale kliniczne znaczenie tych zaburzeñ nie jest jednoznacznie ustalone. Monocyty nale¿¹ do komórek prezentuj¹cych antygeny i st¹d ich g³ówna rola w uk³adzie odpornoci. Krytycznym dla prezentacji przetworzonych antygenów jest ekspresja determinant HLA-DR. W stanach przewlek³ych infekcji, rekonwalescencji po ciê¿kich infekcjach wirusowych we krwi mog¹ wystêpowaæ ró¿ne subpopulacje monocytów w³¹cznie z prekursorami i komórkami aktywowanymi. Odpowiednio bêd¹ siê one ró¿ni³y immunofenotypami (np. w ekspresji CD14, CD64, CD16). IMMUNOFENOTYP DOJRZA£YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH... 49 TABELA 2. Zestawienia odsetkowe subpopulacji limfocytarnych T we krwi obwodowej u noworodka, dziecka 1- rocznego i osoby doros³ej Populacja limfocytów N oworodek (%) Limfocyty T: CD3 Subpopulacje CD3+ TCR a/b TCR g/d CD4 CD8 CD45 RA CD45 RO CD4/CD45RA CD8/CD45RA CD4/CD45RO CD8/CD45RO CD3/HLA- DR CD25 6 miesiêcy (%) 12 miesiêcy (%) Doros³y (%) 79 (5889) 72 (5078) 65 (5073) 72 (6083) 97 (9499) 2 (03) 76 (6987) 25 (1331) 79 (5290) 26 (1665) 76 (4188) 84 (6797) 26 (1773) 16 ( 5 4 3 ) 3 (127) 13 (1021) 95 (9097) 4 (16) 56 (3464) 15 (832) 80 (6490) 15 (1371) 82 (7291) 89 (8494) 15 (1390) 13 (565) 3 (26) 9 (611) 92 (88- 98) 4 (28) 50 (3062) 16 (834) 80 (7288) 16 (954) 80 (6597) 89 (81100) 16 (1165) 15 (741) 3 (27) 8 (610) 93 (8397) 5 (215) 58 (5269) 33 (2746) 60 (4671) 56 (4871) 49 (3570) 73 (5580) 63 (4781) 46 (3859) 28 (345) 27 (1936) O pracowano na podstawie: Im m unophenot yping of lym phocyt es in healt hy and im m unodef icient children. Esther de Vries, Immunologie, Rotterdam 1999 Wêz³y ch³onne Wêz³y ch³onne stanowi¹ struktury tkanki limfatycznej i s¹ zasiedlone tylko przez limfocyty w rejonach korowych i czêciowo rdzennych przez limfocyty T, natomiast tzw. orodki rozrodcze przez limfocyty B aktywowane zale¿nie od potrzeb, czyli produkcji swoistych przeciwcia³ i immunoglobulin. W centrach rozrodczych stwierdza siê równie¿ obecnoæ plazmocytów i komórek histiocytarnych. Proporcje pomiêdzy limfocytami T i B s¹ zale¿ne od stanu funkcjonalnego danego wêz³a ch³onnego (w okresach aktywacji wzrasta wyranie odsetek limfocytów B, a w zaka¿eniu np. pr¹tkiem gulicy s¹ to prawie wy³¹cznie limfocyty T) oraz jego lokalizacji anatomicznej. Najczêciej badane s¹ wêz³y ch³onne szyjne, pachowe, nadobojczykowe i w warunkach fizjologicznych limfocyty T stanowi¹ 5070% wszystkich komórek, a resztê stanowi¹ limfocyty B. Proporcje te nieznacznie zmieniaj¹ siê z wiekiem u dzieci w okresie bujania tkanki ³¹cznej (37 lat) wy¿szy jest odsetek limfocytów B (5060%). W okresach pobudzenia (przewlek³e zaka¿enia bakteryjne regionu, z którego limfa sp³ywa do badanego wêz³a ch³onnego) przewa¿aj¹ limfocyty B, czêsto wykazuj¹ce ekspresjê determinant prekursorowych, co jest dodatkowo oznak¹ pobudzenia centrów rozrodczych. Natomiast budowa i proporcje komórkowe wêz³ów ch³onnych pachwinowych (wêze³ Rosen-Millera) i krezkowych s¹ inne (np. wykazuj¹ wy¿szy odsetek komórek CD45, CD3, CD19 ujemnych), co powoduje, ¿e diagnostyka zmian chorobowych jest znacznie trudniejsza (ryc. 3). B³ony luzowe MALT W obrêbie b³on luzowych MALT (mucous associated lymphoid tissue) znajduj¹ siê komórki uk³adu odpornoci w dwóch zasadniczych strukturach 50 A. PITUCH-NOWOROLSKA RYCINA 3. Krew obwodowa leukocyty uzyskane metod¹ lizy erytrocytów. Widoczne s¹ komórki odpowiadaj¹ce limfocytom, monocytom i granulocytom. Jest jeszcze populacja (R4) która stanowi mieszaninê limfocytów, komórek NK, pojedynczych monocytów. U zdrowego dziecka (5 lat) w populacji limfocytarnej (R1) limfocyty T stanowi¹ oko³o 70%, proporcja miêdzy subpopulacj¹ CD4 a CD8 jest zachowana (2,5), limfocyty B stanowi¹ 11,5%. Limfocyty T cytotoksyczne (CD8) wykazuj¹ siln¹ ekspresjê determinanty CD8 (ok. 103). Komórki o poredniej i niskiej ekspresji nale¿¹ do populacji komórek NK. Równoczesne barwienie tych komórek przeciwcia³em dla CD3 i HLA-DR pozwala na ocenê odsetka komórek wykazuj¹cych tylko ekspresjê HLA-DR (limfocyty B) oraz równoczesn¹ ekspresjê CD3 i HLA-DR (aktywowane limfocyty T) odpowiednikach wêz³ów ch³onnych, czyli kêpkach Peyera w przewodzie pokarmowym oraz w formie lunej tkanki limfatycznej. Populacja limfocytów T sk³ada siê z limfocytów T wspomagaj¹cych (Th) w 70% oraz supresyjnych (Ts) w 3035%. Ze wzglêdu na szczególn¹ rolê spe³nian¹ przez limfocyty T znajduj¹ce siê w obrêbie MALT, a zwi¹zan¹ z odpowiedzi¹ swoist¹ na liczne antygeny odsetek limfocytów T pamiêci siêga 50%, a aktywowanych 35%. Populacja limfocytów B wykazuje na powierzchni g³ównie obecnoæ ³añcuchów ciê¿kich IgM (sIgM) oraz IgD (sIgD), co odpowiada limfocytom naiwnym (55%). Populacja limfocytów B sIgM+ bez ekspresji IgD, co odpowiada limfocytom B pamiêci, stanowi pozosta³e 45%. Proces zmiany izotypu immunoglobulin (switch) prowadzi do powstania populacji dojrza³ych limfocytów B IMMUNOFENOTYP DOJRZA£YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH... 51 RYCINA 4. Komórki wêz³a ch³onnego. Zawiesinê komórek uzyskuje siê poprzez mechaniczne rozdrobnienie fragmentu wêz³a ch³onnego. W pokazanym rozk³adzie punktowym widoczne s¹ w obrêbie bramki (R1) dwie populacje komórek mniejsze i wiêksze stanowi¹ce ilociow¹ wiêkszoæ. Obydwie populacje s¹ limfocytami. W badanym wêle limfocyty T stanowi³y oko³o 48%, w tym 38% limfocyty T CD4, a 10% limfocyty CD8. Dojrza³e limfocyty B stanowi¹ oko³o 42%, wszystkie wykazuj¹ ekspresjê CD19, CD20, CD22 (niepokazane) oraz immunoglobulin o proporcji ³añcuchów lekkich k/l 2:1. Poza bramk¹ pozosta³y niewielkie iloci komórek o charakterystyce granulocytów, trochê resztek po uszkodzonych komórkach (detritus komórkowy). Te granulocyty, niekiedy trochê monocytów to komórki nap³ywaj¹ce z krwi¹ do wêz³a ch³onnego. Aby uzyskaæ zawiesinê limfocytów, nale¿y wstêpnie uzyskane komórki z wêz³a ch³onnego poddaæ gradientowi gêstoci. W wêle ch³onnym w trakcie przewlek³ego procesu zapalnego dochodzi do zmiany proporcji limfocytów T do B na rzecz tych ostatnich. Odsetek limfocytów B mo¿e osi¹gaæ nawet 70%, ale obecne s¹ limfocyty B z ³añcuchami lekkimi obydwu rodzajów (barwienie CD19/kappa, CD19/lambda). Obecnoæ ³añcucha lekkiego tylko jednego rodzaju mo¿e sugerowaæ rozrost monoklonalny wykazuj¹cych obecnoæ sIgA (5060%). S¹ to limfocyty B i plazmocyty produkuj¹ce lokalnie dwucz¹steczkowe IgA (tzw. sekrecyjne IgA). Produkcja w cianie jelita obejmuje równie¿ produkcjê elementu ³¹cz¹cego pojedyncze moleku³y IgA. Sekrecyjne IgA jest odpowiedzialne za reakcje z antygenami obecnymi w b³onie luzowej. 52 A. PITUCH-NOWOROLSKA TABELA 3. Zestawienie odsetkowe populacji limfocytarnych i iloci bezwzglêdne tych komórek we krwi obwodowej osób w ró¿nym wieku Populacja limfocytów Limfocyty T: CD3 CD4 CD8 Stosunek CD4:CD8 Limfocyty B: CD19 i/lub CD20 Dziecko 6 m- cy % (Iloæ/ ml) 12 miesiêcy % (Iloæ/ ml) 25 lat % (Iloæ/ml) 717 lat % (Iloæ/ ml) Doros³y % (Iloæ/ ml) 71 (4030) 45- 79(3610- 8840) 49 (2950) 36- 61(1690- 4600) 24 (1450) 16- 34 (650- 2450) 2,2 (1,33,5) 66(3300) 53- 81(1460- 6450) 43(2070) 31- 54(1020- 3600) 25(1320) 16- 38(570- 230) 1,6(1,0- 3,0) 72 (3040) 62- 80 (1610- 4230) 41(1800) 35- 51(900- 2860) 30(1180) 630- 1910) 1,4(1,0- 2,4) 70 (1800) 66- 76 (1400- 2000) 37(800) 33- 41(700- 1100) 30 (800) 27- 35 (600- 900) 1,3 (1,1- 1,4) 73 (1600) 61- 84 (960- 2600) 46 (940) 32- 60 (540- 1660) 27 (520) 13- 40 (270- 930) 1,7 (0,9- 4,5) 23 (900) 23 (900) 24 (900) 16 (400) 13 (246) 19- 31(500- 1500) 19- 31(500- 1500) 21- 28(700- 1300) 12- 22 (300- 500) K omórki N K : CD16 12,7 (790 +/- 352) 12,5 (714 +/- 300) 12,9 (573 +/- 264) 15,2 (408+/- 196) CD56 10,6 (627+/- 308) 12,2 (676 +/- 296) 13,1 (586 +/- 310) 16,5 (438 +/- 181) 10- 31(122- 632) 15,5 (318 +/- 191) 16,4 (343 +/- 214) O pracowano na podstawie: Im m unodef iciency disorders, G eneral considerat ions. E.R. St iehm , H.D. Ochs, A Wink elst ein 2. EKSPRESJA MOLEKU£ ZWI¥ZANYCH Z FUNKCJ¥ LIMFOCYTÓW T I B W zapocz¹tkowaniu odpowiedzi immunologicznej na antygen odgrywa rolê aktywacja limfocytu T sk³adaj¹ca siê z dwóch etapów pierwszego sygna³u i wytworzenia synapsy immunologicznej pomiêdzy limfocytem T a komórk¹ prezentuj¹c¹ antygen oraz drugiego sygna³u, w którym najistotniejsze s¹ tzw. cz¹stki kostymuluj¹ce. Po procesie aktywacji i odpowiedzi na swoisty antygen wytwarza siê pamiêæ immunologiczna. Limfocyty T pamiêci maj¹ inny immunofenotyp w porównaniu z limfocytami T naiwnymi (dziewiczymi). CD45RA wystêpuj¹ g³ównie na populacji dziewiczych limfocytów T. Tylko niewielki odsetek tych limfocytów T wykazuje ekspresjê CD45RO. Ta ostatnia determinanta jest charakterystyczna dla limfocytów T pamiêci. CD25 receptor dla interleukiny 2 (IL-2). Wystêpuje na aktywowanych limfocytach T. Jest zwi¹zany z produkcj¹ IL-2 przez limfocyty T po aktywacji drugim sygna³em po kontakcie z antygenem. HLA-DR wystêpuje na limfocytach B i monocytach bez wzglêdu na stan aktywacji. Na limfocytach T wystêpuje po aktywacji i rozpoczêciu odpowiedzi immunologicznej. Aktywowane limfocyty B wykazuj¹ zwiêkszon¹ ekspresjê HLA-DR w porównaniu ze spoczynkowymi limfocytami B. TCR a/b jest stwierdzane na 95% limfocytów T. Heterodimer ³añcuchów a/b reaguje z antygenem w pocz¹tkowych stadiach odpowiedzi limfocytów T. TCR g/d we krwi obwodowej stanowi¹ mniej ni¿ 5% limfocytów T, a w populacji MALT 510%. Uwa¿a siê, ¿e limfocyty T g/d maj¹ zdolnoæ rozpoznawania antygenów nieprzetworzonych przez komórki prezentuj¹ce antygen. Limfocyty TCR g/d bior¹ udzia³ w odpowiedzi przeciwzakanej i przeciwnowo- IMMUNOFENOTYP DOJRZA£YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH... 53 TABELA 4. Zestawienia ciê¿kich skojarzonych niedoborów odpornoci Typ niedoboru Poziom Limfocyty B immunoglobulin iloæ Limfocyty T iloæ 1. T- B+ SCID: O bni¿ony Prawid³owa lub podwy¿szona Znacznie obni¿ona Znacznie obni¿ona Znacznie obni¿ona a/ X- linked (niedobór gc) b/ brak JAK 3 c/ brak IL7receptora d/ brak CD45 O bni¿ony 2. T- B- SCID a/ niedobór RAG1/2 b/ niedobór ARTEMIS c/ niedobór ADA d/ dysgenezja siateczki O bni¿ony, 3. zespó³ O menn'a Wzrost IgE Prawid³owa lub obni¿ona (brak) Typ dziedziczenia Uwagi XL* AR** AR AR obni¿ona iloæ N K - "N K prawid³owe prawid³owe limfocyty Tgd AR AR AR AR O becne (aktywowane) AR granulocytopenia, ma³op³ytkowoæ erytrodermia, eozynofilia, hepatosplenomegalia granulocytopenia, ma³op³ytkowoæ, infekcje oportunistyczne granulocytopenia 4. zespó³ hiper IgM (sprzê¿ony z p³ci¹) Wzrost IgM, O becne tylko niskie IgG, IgA IgM+, IgD+ Prawid³owe XL 5. brak C D40 Wzrost IgM, niskie IgG, IgA Prawid³owe lub obni¿one Prawid³owe Prawid³owe AR Prawid³owe lub obni¿one C D4 Prawid³owe C D4, obni¿one C D8 Prawid³owe C D4, obni¿one C D8 AR AR brak ekspresji determinant MHC klasy I Prawid³owe XL Prawid³owe AR ciê¿kie bakteryjne infekcje ciê¿kie bakteryjne infekcje 6. niedobór determinant MHC klasy II 7. niedobór ZAP- 70 r 8. niedobór TAP- 1, TAP- Prawid³owe 2 N iedobory immunoglobulin 1. choroba Brutona (agammaglobulinemia) N iski lub brak 2. agammaglobulinemia N iski lub brak O becne IgM+, IgD+ Prawid³owe Prawid³owe Prawid³owe Pojedyncze lub brak Pojedyncze lub brak AR O pracowano na podstawie: P rim ary im m unodef iciency diseases: an updat e. C lin. E x p. Im m unol., 2003, 132, 9- 15 tworowej. Wiêkszoæ limfocytów T g/d nale¿y do populacji CD8, a tylko niewielki odsetek jest CD4. W obrêbie MALT limfocyty T g/d odgrywaj¹ istotn¹ rolê jako komórki regulacyjne zapobiegaj¹c uogólnionej odpowiedzi na antygeny pokarmowe. TH1 i TH2 s¹ to funkcjonalne subpopulacje limfocytów T (g³ównie Th) ró¿ni¹ce siê przede wszystkim profilem produkowanych cytokin. 3. PIERWOTNE NIEDOBORY ODPORNOCI Ze wzglêdu na mo¿liwoci cytometrii przep³ywowej jako metody diagnostycznej przedstawiono tylko te niedobory odpornoci, w których okrelenie iloci i proporcji poszczególnych populacji komórek krwi obwodowej oraz ocena ich immunofenotypu ma znaczenie dla diagnostyki i monitorowania przebiegu choroby. Do niedoborów odpornoci, w których dochodzi do zaburzeñ ilociowych (brak okrelonej populacji 54 A. PITUCH-NOWOROLSKA komórek), nale¿¹ ciê¿kie skojarzone niedobory odpornoci (SCID) oraz niedobory z przewag¹ zaburzeñ odpornoci humoralnej (np. agammaglobulinemia sprzê¿ona z chromosomem X, jak i dziedziczona recesywnie autosomalnie, zespó³ hiper IgM ryc. 5, 6, 7) i komórkowej (np. zespó³ DiGeorge'a, niedobór ZAP70 obecnie wliczany przez niektórych do grupy SCID). Drug¹ grup¹ niedoborów, w których cytometria przep³ywowa jako metoda diagnostyczna jest przydatna, s¹ zaburzenia ekspresji okrelonych determinant, receptorów itp. Do takich niedoborów nale¿¹ m.in. zespó³ LAD (brak ekspresji moleku³ adhezyjnych), brak ekspresji determinant uk³adu MHC klasy II oraz niedobór TAP-1, TAP-2 (brak ekspresji MHC klasy I), grupa niedoborów zwi¹zanych z brakiem ekspresji CD40 i CD40L (CD154), receptorów dla interferonu, IL-12. Ciê¿kie skojarzone niedobory odpornoci W tabeli 4 zestawiono wybrane skojarzone niedobory odpornoci, w których dochodzi do braku okrelonej populacji komórek rozwijaj¹cych siê w szpiku. Du¿¹ grupê zró¿nicowanych klinicznie ciê¿kich skojarzonych niedoborów stanowi¹ zespo³y CD 4 - 51,2% CD 8 - 28,9% RYCINA 5. Krew obwodowa. Pacjent (W.B.) z zespo³em Brutona (agammaglobulinemia sprzê¿ona z chromosomem X). Komórki uzyskano metod¹ lizy erytrocytów. W bramkach wyselekcjonowano populacjê limfocytarn¹ (R1), monocytarn¹ (R2) oraz granulocytarn¹ (R3). Limfocyty T stanowi¹ 82% populacji R1, natomiast komórki wykazuj¹ce ekspresjê CD19 (limfocyty B) stanowi¹ mniej ni¿ 1,0%. Proporcja pomiêdzy subpopulacj¹ CD4 a CD8 limfocytów T jest prawid³owa (2,3). Ze wzglêdu na znaczenie kliniczne rozpoznania choroby Brutona brak populacji limfocytów B powinien byæ wykazany równie¿ przy u¿yciu przeciwcia³ monoklonalnych reaguj¹cych z innymi determinantami ani¿eli CD19. Najczêciej u¿ywa siê przeciwcia³ dla CD20, CD22, ³añcuchów lekkich i ciê¿kich immunoglobulin (podwójnego barwienia, np. CD19/m, CD19/k, CD19/l) IMMUNOFENOTYP DOJRZA£YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH... 55 RYCINA 6. W badaniach limfocytów krwi obwodowej (bramka R2) u chorego (Sz.D.) z agammaglobulinemi¹ wykazano zaburzenia proporcji limfocytów CD4:CD8 oraz podwy¿szony odsetek aktywowanych limfocytów T (wykazuj¹cych ekspresjê HLA-DR, CD25). Jest to czêsto zwi¹zane z przewlek³ymi i nawracaj¹cymi zaka¿eniami bakteryjnymi 56 A. PITUCH-NOWOROLSKA przed stymulacj¹ po stymulacji przed stymulacj¹ po stymulacji przed stymulacj¹ po stymulacji RYCINA 7. Ekspresja ligandu dla CD40 (CD154) na komórkach zdrowego dawcy (kontrola) i 2 pacjentów z zespo³em hiper IgM. Limfocyty T pacjenta 1 po stymulacji wykazuj¹ tylko 27% komórek z indukowaln¹ ekspresj¹ CD154. Limfocyty pacjenta 2 wykazuj¹ indukowaln¹ ekspresjê CD154 w wysokim odsetku (88%), ale iloæ cz¹steczek przypadaj¹ca na komórkê jest niewielka (niski wskanik MCF). Limfocyty zdrowego dawcy odpowiadaj¹ na stymulacjê wysokim odsetkiem komórek i odpowiednio wysokim wskanikiem MCF dla ekspresji CD154 IMMUNOFENOTYP DOJRZA£YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH... 57 RYCINA 8. Ciê¿ki skojarzony niedobór odpornoci (SCID) zespó³ Omenna. W zawiesinie komórek krwi obwodowej uzyskanych po lizie erytrocytów stwierdzono populacjê granulocytarn¹ (R2), limfocytarn¹ (R1) oraz monocytarn¹ (R3). W obrêbie populacji R1 limfocyty T (CD3) stanowi³y 65%, limfocyty B (CD19) 2,6%. Poza znacznie obni¿onym odsetkiem limfocytów B wykazano równie¿ zaburzony stosunek limfocytów T CD4:CD8 (4,25), znacznie podwy¿szony odsetek aktywowanych limfocytów T (CD3/HLA-DR 45%) charakteryzuj¹ce siê brakiem populacji limfocytów T we krwi obwodowej, co jest zwi¹zane nie tylko z zaburzeniem szpikowej hematopoezy, ale i obecnoci¹ funkcji grasicy. Wstêpn¹ sugestiê takiego niedoboru u dziecka (noworodka, niemowlêcia) mo¿na wysun¹æ na podstawie oceny obrazu odsetkowego leukocytów w badaniu morfologii. Zaburzenie proporcji limfocytów i granulocytów na rzecz granulocytów, czêsto znaczne przesuniêcie w stronê form m³odych zwi¹zane z zaka¿eniem bakteryjnym mo¿e wskazywaæ na koniecznoæ szczegó³owego badania ilociowego i jakociowego tych komórek. W ocenie komórek wêz³ów ch³onnych i grasicy równie¿ nie stwierdza siê zasiedlenia rejonów zwi¹zanych z obecnoci¹ limfocytów T. U tych dzieci wêz³y ch³onne i grasica stanowi¹ resztkow¹ tkankê ³¹czn¹. Niewielk¹ ilociowo populacjê komórek o charakterystyce limfoidalnej stanowi¹ limfocyty B, które i tak nie mog¹ spe³niaæ swojej funkcji. Wykazanie obni¿enia lub braku 58 A. PITUCH-NOWOROLSKA RYCINA 9. Ciê¿ki skojarzony niedobór odpornoci (SCID) zespó³ Omenna pacjent M.F. W zawiesinie komórek krwi obwodowej uzyskanych po lizie erytrocytów stwierdzono populacjê granulocytarn¹ (R2) zawieraj¹c¹ jedynie granulocyty kwasoch³onne (brak granulocytów obojêtnoch³onnych) oraz limfocytarn¹ (R1). W obrêbie populacji R1 limfocyty T (CD3) stanowi³y ok. 90%, limfocyty B (CD19) poni¿ej 1,0%. Poza brakiem limfocytów B wykazano równie¿ zaburzony stosunek limfocytów T CD4:CD8 (0,82), znacznie podwy¿szony odsetek aktywowanych limfocytów T (CD3/HLA-DR 59%) limfocytów T, a czêsto równie¿ i B we krwi obwodowej jest podstaw¹ potwierdzenia wstêpnego klinicznego rozpoznania SCID. W jednej z odmian SCID populacjê prawid³owych limfocytów T i B zastêpuj¹ komórki NK. Trudnoci z wczesn¹ diagnostyk¹ polegaj¹ na tym, ¿e w obrazie krwi w podstawowym badaniu morfologii proporcje granulocytów i limfocytów (komórki NK) mog¹ byæ zachowane. Natomiast w ocenie immunofenotypu stwierdza siê obecnoæ wysokiego odsetka komórek NK, a prawid³owe limfocyty T i B stanowi¹ czêsto jedynie populacje resztkowe. Obecnie znane s¹ genetyczne zmiany zwi¹zane z patogenez¹ i wykazanie w badaniach molekularnych tych zmian stanowi podstawê klasyfikacji danego niedoboru. W ocenie zaburzeñ sugeruj¹cych zespó³ SCID istotne jest wykonanie badania przynajmniej dwukrotnie, gdy¿ mo¿e siê zdarzyæ nasilona odpowied szpikowa na stan IMMUNOFENOTYP DOJRZA£YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH... 59 RYCINA 10. Ciê¿ki skojarzony niedobór odpornoci (SCID): W zawiesinie komórek krwi obwodowej uzyskanych po lizie erytrocytów stwierdzono populacjê granulocytarn¹ (R2), monocytarn¹ (R3) oraz limfocytarn¹ (R1). W obrêbie populacji R1 limfocyty T (CD3) stanowi³y jedynie 10%, limfocyty B (CD19) ok. 7%, a komórki NK ok. 70%. Obecne niewielkie ilociowo populacje limfocytów T i B by³y zdolne do swoistej odpowiedzi immunologicznej u tego pacjenta z zaka¿eniem wirusem cytomegalii stwierdzano przeciwcia³a w klasie IgG dla tego wirusa zaka¿enia, posocznicy, a znaczne obni¿enie odsetka limfocytów jest zjawiskiem przejciowym. Równie krytycznie nale¿y analizowaæ wzrost odsetka komórek NK, który mo¿e byæ zwi¹zany z zaka¿eniem, np. wirusem cytomegalii, a nie obrazem zespo³u SCID. Powtórne badanie za kilka dni, czêsto w innej sytuacji klinicznej (poprawa stanu dziecka) mo¿e pomóc w rozstrzygniêciu tych w¹tpliwoci. Najczêciej jednak obraz kliniczny, brak obecnoci wêz³ów ch³onnych, cienia grasicy, wywiad rodzinny jednoznacznie wskazuj¹ na zespó³ skojarzonego niedoboru odpornoci, co u³atwia analizê, a przed wszystkim interpretacjê zaburzeñ komórkowych we krwi obwodowej. Do SCID nale¿y równie¿ zespó³ Omenna, który ma bardzo charakterystyczny obraz kliniczny (erytrodermia, powiêkszenie wêz³ów ch³onnych, w¹troby, ledziony, czêsto przewlek³e biegunki). W badaniu morfologii typowa jest wysoka liczba leukocytów (hiperleukocytoza) oraz wysoki odsetek granulocytów kwasoch³onnych. 60 A. PITUCH-NOWOROLSKA W ocenie immunofenotypowej komórek krwi obwodowej stwierdza siê obecnoæ dodatkowej populacji komórek ziarnistych (granulocyty kwasoch³onne), a w populacji limfocytarnej czêsto obni¿ony odsetek lub brak limfocytów B. Limfocyty T przewa¿aj¹, proporcje pomiêdzy subpopulacjami tych komórek s¹ zachowane. Stwierdza siê cechy aktywacji, co przejawia siê tym, ¿e wiêkszoæ, a w niektórych przypadkach wszystkie limfocyty T wykazuj¹ ekspresjê HLA-DR, CD25. W ciê¿kich postaciach zespo³u Omenna mog¹ byæ dodatkowe zaburzenia hematopoezy, np. dyserytropoeza, agranulocytoza. W wêz³ach ch³onnych nie stwierdza siê centrów rozrodczych w ocenie histologicznej, a limfocytów B w badaniach populacji komórkowych wêz³a ch³onnego w cytometrze (ryc. 8 i 9). Innym dobrze okrelonym niedoborem odpornoci komórkowej, w którym dominuje brak populacji limfocytów T jest anomalia DiGeorge'a. Jest to zespó³ wad zwi¹zanych z zaburzeniem rozwoju trzeciej i czwartej kieszonki skrzelowej. Do tego zespo³u nale¿¹ wada serca (g³ównie du¿ych pni naczyniowych, tetralogia Fallota), brak przytarczyc (zaburzenia gospodarki wapniowej), niedorozwój lub brak grasicy (w konsekwencji brak limfocytów T), dysmorfia twarzy. W ocenie subpopulacji komórek jednoj¹drzastych krwi obwodowej populacja limfocytów jest zmniejszona, sk³ada siê g³ównie z limfocytów B. Istniej¹ postacie kompletnej i niekompletnej anomalii DiGeorge'a, a liczba limfocytów T mo¿e byæ ró¿na od kilkunastu procent do prawie prawid³owej, proporcje pomiêdzy subpopulacjami CD4 i CD8 zachowane. Potwierdzenie zespo³u DiGeorge'a opiera siê na wykazaniu typowych delecji w chromosomie 22, u czêci chorych w chromosomie 10. Podobny obraz obni¿onego odsetka limfocytów T obserwuje siê w zespole Nijmehen oraz innych zespo³ach, takich jak: ataksjateleangiektazja, zespó³ ataksjopodobny (mutacja genu Mre 11) nale¿¹cych do grupy zwi¹zanej z niestabilnoci¹ chromosomów. W tych zespo³ach obraz kliniczny jest bardzo typowy i ocena populacji limfocytów jest jedynie pomocnicza. W niedoborach z przewag¹ mechanizmów humoralnych ocena populacji limfocytów jest krytyczna dla rozpoznania agammaglobulinemii zarówno w postaci sprzê¿onej z chromosomem X (choroba Brutona), jak i znacznie rzadszej postaci o dziedziczeniu autosomalnym recesywnym, w której choruj¹ i ch³opcy, i dziewczêta. Wykazanie bardzo niskiej liczby lub braku limfocytów B potwierdza inne wyniki badañ, takie jak: brak immunoglobulin w surowicy, klinicznie obserwowane ladowe migda³ki czy niewyczuwalne wêz³y ch³onne u dziecka z ciê¿kim przebiegiem zaka¿eñ bakteryjnych (ryc.5 i 6). Znacznie czêciej ani¿eli agammaglobulinemiê obserwuje siê pospolity zmienny niedobór odpornoci (CVID) wystêpuj¹cy w ró¿nym wieku, u obu p³ci. W tym zespole podstaw¹ rozpoznania jest obni¿ony poziom najczêciej IgG, ale towarzysz¹ temu u znacznego odsetka chorych zaburzenia proporcji limfocytów T CD4:CD8. Limfocyty B s¹ obecne w iloci prawid³owej dla wieku, choæ u czêci chorych ich liczba mo¿e byæ na dolnej granicy normy. Zespó³ hiper-IgM wystêpuje w formie sprzê¿onej z p³ci¹ (dziedziczony jako sprzê¿ony z chromosomem X) oraz w formie dziedziczonej autosomalnie recesywnie. W postaci sprzê¿onej z chromosomem X na aktywowanych limfocytach T wspomagaj¹cych (CD4) chorego nie udaje siê stwierdziæ ekspresji ligandu dla cz¹steczki CD40 (CD154). Brak tego ligandu upoledza interakcjê pomiêdzy limfocytami T a IMMUNOFENOTYP DOJRZA£YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH... 61 limfocytami B. W konsekwencji nie dochodzi do prawid³owego ró¿nicowania limfocytów B i nie nastêpuje zmiana izotypu wytwarzanych immunoglobulin. We krwi kr¹¿¹ limfocyty B wykazuj¹ce na powierzchni jedynie IgM i IgD. Ocena ekspresji CD40L wymaga procedury aktywacji komórek, równoleg³ego hodowania komórek osoby zdrowej (jako kontrola), równoczesnego barwienia CD4, CD8. Wykazanie braku zmiany izotypu immunoglobulin polega na pokazaniu obecnoci jedynie ³añcucha ciê¿kiego m i d na powierzchni limfocytów B, a braku obecnoci ³añcucha ciê¿kiego g, a, e. Proporcja limfocytów B z IgM i ³añcuchem lekkim k do limfocytów B z ³añcuchem lekkim l jest zachowana. 4. WTÓRNE NIEDOBORY ODPORNOCI Zmiany po infekcjach wirusowych Infekcje wirusowe (np. wirus herpes, cytomegalii, Epsteina-Barr i odry, ró¿yczki) powoduj¹ czêsto obni¿enie odsetka limfocytów Th (CD4), któremu towarzyszy brak odpowiedzi na stymulacjê mitogenami i antygenami. Zjawisko to jest przejciowe aczkolwiek u niektórych chorych zw³aszcza po przebyciu mononukleozy zakanej o ciê¿kim przebiegu zaburzenia w odpornoci komórkowej mog¹ trwaæ nawet kilka lat. Z obserwacji wiadomo, ¿e wirus odry równie¿ prowadzi do przejciowego zaburzenia odpowiedzi na antygeny i przebieg zaka¿eñ nastêpuj¹cych nied³ugo po przebyciu odry mo¿e byæ ciê¿ki i trudny do opanowania. Monitorowanie zaburzeñ w proporcji subpopulacji limfocytów T oraz odpowiedzi limfocytów B na antygeny (np. szczepionki) pozwala na okrelenie, jak g³êbokie s¹ to zaburzenia i jak d³ugo trwa³y. Niedobory zwi¹zane z chemioterapi¹ D³ugotrwa³a chemioterapia prowadzi najczêciej do obni¿enia odsetka limfocytów. W przypadku ostrych bia³aczek limfoblastycznych lub ch³oniaków nieziarniczych z linii limfocytu B obni¿enie liczby tych komórek mo¿e byæ bardzo znaczne (nawet poni¿ej 5%) i trwaæ stosunkowo d³ugo (do kilku miesiêcy). U niektórych chorych obserwuje siê zjawisko odwrotne wzrost liczby limfocytów B i ich prekursorów w szpiku, a czasem nawet we krwi obwodowej w nied³ugi czas po zakoñczeniu chemioterapii. Jest to tzw. odbicie (rebound). Taki obraz mo¿e sugerowaæ wznowê ostrej bia³aczki limfoblastycznej z linii limfocytu B i wymaga czêstej kontroli. Opisuje siê, ¿e wzrost liczby prekursorów i limfocytów B po zakoñczeniu leczenia mo¿e trwaæ do kilku miesiêcy (ponad 6 miesiêcy) bez objawów wznowy procesu rozrostowego. Po tym okresie nastêpuje normalizacja. W zakresie limfocytów T nie obserwuje siê zjawiska odbicia natomiast mo¿e doæ d³ugo utrzymywaæ siê zaburzenie proporcji limfocytów CD4:CD8. Obni¿enie odsetka i liczby bezwzglêdniej limfocytów T CD4 mo¿e utrzymywaæ siê ponad rok. Monitorowanie immunofenotypowe limfocytów T pozwala na okrelenie czasu normalizacji ilociowych proporcji pomiêdzy subpopulacjami tych komórek. Osobnym zagadnieniem jest zaburzenie funkcji tych komórek, które utrzymuje siê u niektórych chorych przez d³ugi okres. Chorzy 62 A. PITUCH-NOWOROLSKA ci po zakoñczeniu leczenia chemioterapi¹ mog¹ wymagaæ stosowania do¿ylnych preparatów immunoglobulin jako leczenia wtórnego niedoboru odpornoci humoralnej. AIDS Ze wzglêdu na powszechn¹ znajomoæ zmian w obrêbie subpopulacji limfocytów T u chorych zaka¿onych wirusem HIV i w trakcie rozwijaj¹cego siê zespo³u AIDS wspominamy jedynie o tym, aby przypomnieæ, ¿e i w Polsce nale¿y o tym zaka¿eniu pamiêtaæ. Znaczne i postêpuj¹ce spadki odsetka i iloci limfocytów CD4 u osób m³odocianych i doros³ych zw³aszcza z grup ryzyka powinny byæ uzupe³niane badaniami wirusologicznymi na obecnoæ przeciwcia³ dla antygenów wirusa HIV. Monitorowanie chorych polega na systematycznej ocenie odsetka limfocytów CD4 i CD8 i okreleniu bezwzglêdniej liczby limfocytów w ka¿dej z tych subpopulacji. 5. ZASTRZE¯ENIA I UWAGI DO OCENY ILOCIOWEJ I JAKOCIOWEJ (W TYM IMMUNOFENOTYPU) KOMÓREK IMMUNOKOMPETENTNYCH W DIAGNOSTYCE PIERWOTNYCH I WTÓRNYCH NIEDOBORÓW ODPORNOCI Zastrze¿enie i problemy w tych badaniach s¹ natury podstawowej i zwi¹zanej z pierwotnymi niedoborami. Te podstawowe to mo¿liwoæ uszkodzenia komórek tak, ¿e iloæ nieuszkodzonych jest niewielka, ekspresja determinant niska, zmienna lub nieobecna. Wniosek z takiego obrazu na ekranie cytometru (dot plot FSC/SSC lub CD45/CD3/CD19) jest jeden powtórzyæ badanie. W drugiej grupie problemów s¹ takie, które wynikaj¹ z natury niedoborów, np. w niektórych postaciach SCID brakuje prawie ca³kiem populacji o charakterystyce limfocytarnej we krwi obwodowej. Problem jest tym wiêkszy, ¿e najczêciej s¹ to noworodki, niemowlêta lub ma³e dzieci o niskiej wadze, tak wyniszczone, ¿e pobranie wiêkszych iloci krwi stanowi pewn¹ trudnoæ (np. mo¿e byæ wskazane przetoczenie napromieniowanej i ubogo leukocytarnej masy erytrocytarnej przed badaniami). Do zestawu przeciwcia³ dla leukocytów krwi obwodowej (zestawy firmowe) czêsto trzeba dodaæ przeciwcia³a, np. dla komórek NK. Poszukiwanie komórek NK jest wskazane szczególnie wtedy, gdy komórki obecne w bramce limfocytarnej nie wykazuj¹ ekspresji determinant typowych dla limfocytów lub suma komórek o charakterystyce immunofenotypowej limfocytów T i B jest niska, np. oko³o 40%. Rozpoznanie pierwotnego niedoboru odpornoci jest rozpoznaniem wa¿nym dla chorego i lekarza, a najczêciej jest to rozpoznanie na ca³e ¿ycie. Standardy postêpowania diagnostycznego sugeruj¹ wykonanie wiêcej ni¿ tylko jednego badania i sprawdzenie wyniku np. stosuj¹c kilka przeciwcia³ dla limfocytów B, poszerzaj¹c panel przeciwcia³ dla aktywnych limfocytów T itd. Mo¿liwoæ uzyskania zawiesiny komórek do oceny immunofenotypu metod¹ lizy erytrocytów lub gradientu gêstoci pozwala na unikniêcie problemów zwi¹zanych z IMMUNOFENOTYP DOJRZA£YCH KOMÓREK HEMATOPOETYCZNYCH... 63 trudnoci¹ wyodrêbnienia poszczególnych populacji na podstawie parametrów SSC i FSC. Ponadto, obecnie d¹¿y siê do wykorzystania 3- i 4-kolorowej cytometrii, co pozwala na równoczesne barwienie badanych komórek przeciwcia³em dla tzw. determinanty wyró¿niaj¹cej np. dla limfocytów T CD3, a dla limfocytów B CD19 w ka¿dej próbówce, w której s¹ komórki barwione przeciwcia³ami dla innych determinant, np. CD4/CD8, CD20/CD22, ³añcuchy lekkie kappa/lambda itp. Diagnostyka pierwotnych i wtórnych niedoborów odpornoci jest istotna dla ustalenia rozpoznania, prowadzenia chorych (profilaktyka zaka¿eñ, leczenie aktualnych infekcji), planowania leczenia perspektywicznego w tym równie¿ przesz-czepienia szpiku jako metody trwa³ego wyleczenia w wielu niedoborach, zw³aszcza skojarzonych (np. SCID). Wprowadzanie szerokiego panelu przeciwcia³ do oceny immunofenotypu pozwala na bardziej precyzyjne okrelenie typu niedoboru, a w konsekwencji bardziej skuteczne leczenie. LITERATURA [1] ALEMAN K, NOORDZIJ JG, DE GROOT R et al. Reviewing Omenn syndrome. Eur J Pediatr 2001; 160: 718/0725. [2] BALLOW M. Primary immunodeficiency disorders: antibody deficiency. J Allergy Clin Immunol 2002; 109: 581591. [3] CHAPEL H, GEHA R, ROSEN F. Primary immunodeficiency disease: an update. Clin Exp Immunol 2003; 132: 915. [4] CONLEY MH, NOTARANGELO LD, ETZIONI A. Diagnostic criteria for primary immunodeficiences. Clinical Immunology 1999; 93: 190197. [5] CUNNINGHAM-RUNDLES CH, BODIAN C. Common variable immunodeficiency: clinical and immunological features of 248 patients. Clinical Immunology 1999; 92: 3448. [6] CUNNINGHAM-BUNDLES S, YEGER-ARBITMAN R, NACHMAN SA et al. New variant of MHC class II deficiency with Interleukin-2 abnormality. Clin Immunol Immunopathol 1990; 56: 116123. [7] DANIELS JA, LEDERMAN HM, MAITRA A et al. Gastrointestinal tract pathology in patients with common variable immunodeficiency (CVID). A clinicopathologic study and review. Am J Surg Pathol 2007; 31: 18001812. [8] ETZIONI A, OCHS HD. The hyper IgM syndrome - an evolving story. Review article. Pediatric Research 2004; 56: 519525. [9] GEHA RS, NOTARANGELO LD, CASANOVA J-L et al. Primary immunodeficiency diseases: an update from the International Union of Immunological Societies Primary Immunodeficiency Diseases Classification Committee. J Allergy Clin Immunol 2007; 120: 776794. [10] GILMOUR KC, WALSHE D, HEATH S et al. Immunological and genetic analysis of 65 patients with a clinical suspicion of X linked hyper-IgM. J Clin Pathol Mol Pathol 2003; 56: 256262. [11] KATO M, KIMURA H, SEKI M et al. Omenn syndrome review of several phenotypes of Omenn syndrome and RAG1/RAG2 mutations in Japan. Allergology International 2006; 55: 115119. 12] KILIC SS. Omenn's syndrome. Clinical article. International Pediatrics 2003; 18: 4142. [13] VAN KOOTEN C, BANCHEREAU J. CD40-CD40ligand. J Leukoc Biol 2000; 67: 217. [14] LOPEZ-GRANADOS E, CAMBRONERO R, FERREIRA A et al. Three novel mutations reflect the variety of defects causing phenotypically diverse X-linked hyper-IgM syndrome. Clin Exp Immunol 2003; 133: 123131. [15] NOTARANGELO LD, HAYWARD AR. X-linked immunodeficiency with hyper-IgM (XHIM). Clin Exp Immunol 2000; 120: 399405. [16] PAVELEC G, BUHRING HJ. Expression of MHC class II epitopes on human T cell lymphocyte clones. Cellular Immunology 1990; 127: 520526. 64 A. PITUCH-NOWOROLSKA [17] PITUCH-NOWOROLSKA A, KOWALCZYK D, MACURA-BIEGUN A et al. The clinical features of hyper IgM syndrome. A 4 cases report. Clinical Immunol 2007; 32: 105112. [18] PRIMARY IMMUNODEFICIENCY DISEASES. REPORT OF A WHO SCIENTIFIC GROUP. Clin Exp Immunol 1997; 109: 128. [19] PUCK JM. Severe combined immunodeficiency: new advances in diagnosis and treatment. Immunol Res 2007; 38: 6467. [20] STENT G, IRVING L, LEWIN S et al. The kinetics of surface expression of CD11/CD18 integrins and CD54 on monocytes and macrophages. Clin Exp Immunol 1995; 100: 366376. [21] STIEHM ER, OCHS HD, WINKELSTEIN JA.[red.] Immunologic disorders in infants and children. 5th edition. Elsevier, 2004. [22] de VRIES E. Immunophenotyping of lymphocytes in healthy and immunodeficient children. Rotterdam 1999. [23] ZEMAN K. [red.] Zaburzenia odpornoci u dzieci. Biblioteka Pediatry. PZWL. 2002. [24] ZEMBALA M, GÓRSKI A. [red.] Zarys immunologii klinicznej. PZWL 2001. Anna Pituch-Noworolska, Zak³ad Immunologii Klinicznej, Polsko-Amerykañski Instytut Pediatrii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagielloñskiego, ul. Wielicka 265, 30-663 Kraków e-mail: [email protected]
