Ocena limfocytów T regulatorowych i komórek dendrytycznych u

Kliniczna Perinatologia i Ginekologia, tom 43, zeszyt 3, 36-39, 2007
Ocena limfocytów T regulatorowych i komórek dendrytycznych
u noworodków urodzonych z ciąż fizjologicznych
D
OROTA DARMOCHWAŁ-KOLARZ 1, BOŻENA LESZCZYŃSKA-GORZELAK 1, JACEK ROLIŃSKI 2,
BOGDAN KOLARZ 3, JAN OLESZCZUK 1
The estimation of regulatory T lymphocytes and dendritic cells
in cord blood of healthy neonates
Objective: The purpose of our study was to estimate the proportions of regulatory T cells CD4 CD25 and dendritic myeloid (CD1c )
and lymphoid (BDCA-2 , BDCA-4 ) cells in cord blood of healthy neonates in comparison with immune cells of healthy adults. Material
and methods: Thirty healthy neonates born from normal pregnancies and thirty healthy adults were included in the study. The
mononuclear cells were isolated from cord and peripheral blood, stained with monoclonal antibodies and estimated using flow
cytometry. Results: The percentage of regulatory T cells CD4 CD25 and myeloid dendritic cells did not differ significantly in cord
blood of healthy neonates and in peripheral blood of healthy adults. The percentages of cord blood lymphoid dendritic cells of
neonates were significantly lower when compared to those cells in peripheral blood of adults. Conclusion: The results of our study
suggest that diminished acquired immune responses observed in neonates are not associated with the alterations of populations of
myeloid dendritic cells and regulatory T lymphocytes.
Key words: cord blood, dendritic cells, flow cytometry, neonates, regulatory T cells
+
+
+
Wstęp
Istnieją ilościowe i jakościowe różnice między układem immunologicznym płodu i noworodka a układem odpornościowym osoby dorosłej. Odrębności dotyczą zarówno odpowiedzi immunologicznej typu wrodzonego, jak też
nabytego. Przykładowo, układ odpornościowy noworodka
charakteryzuje się obniżoną liczbą i upośledzoną funkcją
granulocytów obojętnochłonnych oraz komórek NK, niską
produkcją cytokin, niskim stężeniem czynników wzrostowych, składników dopełniacza i białek ostrej fazy. Upośledzenie nabytej odpowiedzi immunologicznej u płodu i noworodka jest związane z niedojrzałością limfocytów B,
niedostateczną zdolnością limfocytów T do stymulowania
komórek B oraz niską produkcją cytokin. Limfocyty T krwi
pępowinowej są fenotypowo niedojrzałe i charakteryzują
się niedostateczną odpowiedzią na Interleukinę-2 i inne
stymulatory. Ponadto, noworodkowe limfocyty T mają
niższą ekspresję antygenu CD3 i niższą zdolność do produkcji interferonów w odpowiedzi na czynniki stymulujące
[1, 5, 15].
Zarówno krew obwodowa, jak też krew pępowinowa,
zawierają dwie populacje limfocytów T CD4+, które posiadają ekspresję antygenu CD 25 o różnym nasileniu. Większa populacja limfocytów T CD4+ charakteryzuje się niską
ekspresją antygenu CD25 i posiada fenotyp limfocytów T
pamięci (CD45RA/RO+, CD45RBlow, CD95+, CD62Llow,
CD38low). Mniejsza populacja limfocytów T CD4+ charakteryzuje się bardzo wysoką ekspresją antygenu CD25
(limfocyty T CD4+25+bright). Limfocyty te zwane limfocytami
T regulatorowymi posiadają wewnątrzkomórkową ekspres1
2
3
+bright
+
+
+bright
ję antygenu CD152 (CTLA-4), jak również antygenu powierzchniowego CD122. Limfocyty T regulatorowe CD4+25+bright
warunkują utrzymanie tolerancji immunologicznej, jak
również regulują równowagę Th1/Th2 stymulując ją w kierunku przewagi odpowiedzi typu Th2 [3, 10, 16].
Komórki dendrytyczne są istotne dla odpowiedzi immunologicznej typu wrodzonego, dla tolerancji immunologicznej, jak też dla regulacji odpowiedzi immunologicznej
związanej z limfocytami T. Komórki te wychwytują informacje wewnątrzkomórkowe i przenoszą je do komórek
biorących udział w odpowiedzi immunologicznej typu nabytego. U ludzi opisano dwie linie komórek dendrytycznych. Komórki dendrytyczne mieloidalne produkują Interleukinę-12 i stymulują różnicowanie limfocytów T w kierunku Th1. Komórki dendrytyczne limfoidalne stymulują
różnicowanie limfocytów T w kierunku odpowiedzi typu
Th2 [2, 6, 11, 12].
Nie wyjaśniono, jak dotąd, czy przewaga odpowiedzi
immunologicznej typu Th2 obserwowana we krwi pępowinowej jest związana tylko z niedojrzałością odpowiedzi
immunologicznej związanej z limfocytami T czy też z charakterystycznymiodmiennościami dotyczącymi limfocytów
regulatorowych (Treg) lub komórek prezentujących antygen, w tym komórek dendrytycznych.
Celem pracy była ocena limfocytów T regulatorowych
CD4+25+bright oraz populacji komórek dendrytycznych mieloidalnych i limfoidalnych (CD1c+,BDCA-2+,BDCA-4+) we krwi
pępowinowej noworodków w porównaniu z limfocytami
T regulatorowymi CD4+25+bright oraz komórkami dendrytycznymi krwi obwodowej osób dorosłych.
Klinika Położnictwa i Perinatologii Akademii Medycznej w Lublinie im. Prof. Feliksa Skubiszewskiego
Zakład Immunologii Klinicznej Akademii Medycznej w Lublinie im. Prof. Feliksa Skubiszewskiego
Klinika Reumatologii i Układowych Chorób Tkanki Łącznej, Akademia Medyczna w Lublinie im. Prof. Feliksa Skubiszewskiego
Ocena limfocytów T regulatorowych i komórek dendrytycznych u noworodków urodzonych z ciąż fizjologicznych
Materiał i metodyka
Badaniem objęto 30 noworodków pacjentek hospitalizowanych w Katedrze i Klinice Położnictwa i Perinatologii
AM w Lublinie. Ciężarne te rodziły drogami natury między
37. a 40. t.c. Grupę kontrolną stanowiło 30 zdrowych osób
dorosłych. Wszystkie pacjentki zostały poinformowane o
celu badań i wyraziły zgodę na ich wykonanie. Lokalna Komisja Etyki Badań Naukowych wyraziła zgodę na przeprowadzenie badań.
Krew pępowinową pobierano w ilości 20 ml do probówek z heparyną, a następnie rozcieńczano 0,9% zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej PBS (Wytwórnia Surowic i Szczepionek, Biomed, Lublin). Komórki jednojądrowe izolowano z krwi świeżej heparynizowanej wykorzystując uznaną metodykę: poprzez wirowanie w gradiencie
gęstości przy użyciu preparatu Lymphoprep (Nycomed,
Torshov, Norway) z przyspieszeniem 250 g przez 20 min.
Zebrane na granicy faz komórki przepłukiwano dwukrotnie w 2 ml 0,9% zbuforowanego PBS bez Ca2+ i Mg2+ wirując
z przyspieszeniem 200 g przez 5 minut w temp. 4EC. Następnie komórki zawieszano w PBS z dodatkiem 2% surowicy
płodowej cielęcej FCS i liczono ich całkowitą liczbę pod
mikroskopem. Stężenie komórek ustalono na 20 × 106/ml
roztworu PBS zawierającego 0,1% azydek sodu i 1% FCS.
Do 100 μl zawiesiny komórek w PBS dodawano 50 :l
przeciwciał monoklonalnych (Becton Dickinson), związanych z fluorochromami: fluoresceiną (FITC) i fikoerytryną
(PE) w następujących kombinacjach: Control – anty-IgG1
(FITC)/IgG2a (PE); anty-CD 45 (FITC)/CD14 (PE); anty-CD 4
(FITC)/CD25 (PE).
Do oceny komórek dendrytycznych mieloidalnych
i limfoidalnych użyto przeciwciał monoklonalnych antyCD1c-FITC (Miltenyi-Biotec, Germany), anty-BDCA-2-FITC
(Miltenyi-Biotec, Germany), anty-BDCA-4-PE (Miltenyi-Biotec, Germany), CD123-PE (Becton Dickinson, USA), CD19CyChrome (Pharmingen, USA). Następnie przeprowadzano
inkubację przez 30 minut w temp. 4EC. Komórki płukano
dwukrotnie w roztworze PBS zawierającym 0,1% azydek
sodu i 1% FCS wirując przez 5 minut przy obrotach 700 g,
a następnie utrwalano w 0,5 ml 1% paraformaldehydu.
Do oceny ekspresji receptorów użyto cytometru
FACSCalibur z laserem argonowym emitującym promieniowanie o długości fali 488 nm (Beton Dickinson, USA) oraz
oprogramowania CellQuest Software. Celem dokładnej
oceny wczytywanych próbek stosowano kombinacje
przeciwciał CD45/CD14, co pozwala na dokładne oznaczenie miejsca bramki dla limfocytów. Wyniki badań podano
jako procent pozytywnych komórek w badanej próbce.
Analizę statystyczną wykonano przy użyciu testu nieparametrycznego Manna-Whitneya, przyjmując za poziom
istotności p < 0,05.
Wyniki
Odsetek limfocytów T regulatorowych CD4+CD25+bight
oraz komórek dendrytycznych mieloidalnych nie różnił się
37
istotnie statystycznie w obu badanych grupach (4,75
±3,44% vs. 4,40 ±2,41%, NS; 0,31 ±0,30% vs. 0,34 ±0,17%, NS).
Odsetek komórek dendrytycznych limfoidalnych BDCA-2 ,
BDCA-4 we krwi pępowinowej był istotnie statystycznie
niższy w porównaniu z populacją tych komórek we krwi
obwodowej dorosłych (BDCA-2 : 0,12 ±0,19% vs 0,23 ±0,13%
p < 0,001; BDCA-4 : 0,13 ±0,18% vs 0,19 ±0,11%, p < 0,005).
Iloraz komórek dendrytycznych mieloidalnych do limfoidalnych CD1c : BDCA-2 we krwi pępowinowej noworodków był istotnie statystycznie wyższy w porównaniu
z krwią obwodową dorosłych (4,84 ±4,09% vs. 2,02 ±1,45%,
p < 0,005).
+
+
+
+
+
+
Dyskusja
Ostatnie lata przyniosły rosnącą liczbę doniesień dotyczących komórek dendrytycznych. Wzrost liczby publikacji związany jest niewątpliwie z wprowadzeniem nowych metod badawczych i nowych możliwości detekcji
tych komórek. Zaobserwowano, że proporcje komórek
dendrytycznych mieloidalnych i limfoidalnych we krwi
pępowinowej noworodków różnią się od proporcji tych
komórek we krwi obwodowej dorosłych. Postawiono hipotezę, że dysproporcje w populacji komórek dendrytycznych krwi pępowinowej mogą być odpowiedzialne za niedojrzałość nabytej odpowiedzi immunologicznej u noworodków. Niedojrzałość i związane z tym upośledzone różnicowanie monocytów krwi pępowinowej do komórek dendrytycznych może wpływać na aktywację limfocytów T
dziewiczych, szczególnie limfocytów Th1 i wiązać się
z większą podatnością noworodków na infekcje, jak równieżzniższączęstością występowania odpowiedzi immunologicznej typu GvHD – przeszczep przeciwko gospodarzowi w przypadku transplantacji krwi pępowinowej [8].
Zaobserwowano, że komórki dendrytyczne krwi pępowinowej mają mniejszą zdolność do osiągnięcia fenotypu
charakterystycznego dla dorosłych oraz do aktywacji limfocytów pomocniczych CD4 . Langrish i wsp. sugerują, że
komórki dendrytyczne krwi pępowinowej są zaprogramowane na ukierunkowanie odpowiedzi immunologicznej
w kierunku odpowiedzi typu Th2 [9].
Stwierdzono, że u noworodków odpowiedź immunologiczna noworodków związana z limfocytami T różnicuje
się w kierunku odpowiedzi typu Th2. Wyniki badań Delespese i wsp. sugerują, że przewaga odpowiedzi typu Th2 nie
jest związana tylko z niedojrzałością odpowiedzi immunologicznej związanej z limfocytami T, ale również z charakterystycznymi odmiennościami dotyczącymi komórek prezentujących antygen, w tym komórek dendrytycznych [5].
Ponieważ limfocyty T regulatorowe CD4 25 stymulują równowagę Th1/Th2 w kierunku odpowiedzi typu
Th2, mogą być jednym z czynników odpowiedzialnych za
przewagę odpowiedzi immunologicznej Th2 u noworodków.
Aby zweryfikować hipotezę, czy niedojrzałość odpowiedzi immunologicznej noworodków jest związana z populacją limfocytów T regulatorowych lub odmiennościami
+
+
+bright
D. Darmochwał-Kolarz, B. Leszczyńska-Gorzelak, J. Roliński, B. Kolarz, J. Oleszczuk
38
w obrębie komórek dendrytycznych ocenialiśmy populację limfocytów Treg CD4 25
oraz komórek CD1c ,
BDCA-2 i BDCA-4 we krwi pępowinowej noworodków
i we krwi obwodowej zdrowych dorosłych.
+
+
+bright
+
+
Tabela 1. Odsetek limfocytów T regulatorowych CD4 CD25
we krwi pępowinowej zdrowych noworodków (grupa badana,
n = 30) i we krwi obwodowej zdrowych dorosłych
(grupa kontrolna, n = 30)
Grupa
Grupa badana kontrolna
Istotność
średnia ± SD średnia ± SD statystyczna
(%)
(p)
(%)
4,75 ± 3,44
4,40 ± 2,41
NS
CD 4 25
+
+
+
+bright
Tabela 2. Odsetek komórek dendrytycznych mieloidalnych
i limfoidalnych (CD-1c , BDCA-2 i BDCA-4 )
we krwi pępowinowej noworodków (n = 30)
i we krwi obwodowej zdrowych dorosłych (n = 30)
Istotność
Noworodki Dorośli statystyczna
(%)
(%)
(p)
+
Komórki CD1c
Komórki BDCA-2
Komórki BDCA-4
+
+
+
0,31 ± 0,30
0,12 ± 0,19
0,13 ± 0,18
+
0,34 ± 0,17
0,23 ± 0,13
0,19 ± 0,11
+
NS
p < 0,001
p < 0,005
Nie zaobserwowaliśmy istotnych statystycznie różnic
w odsetku limfocytów T regulatorowych Treg CD4 25 we
krwi pępowinowej noworodków w porównaniu z krwią
obwodową osób dorosłych. Wyniki naszych badań są
zgodne z wynikami innych autorów, którzy nie zaobserwowali różnic w odsetku limfocytów T regulatorowych we
krwi pępowinowej i krwi obwodowej [14, 16]. Zaobserwowano, że limfocyty T regulatorowe pojawiają się już w życiu płodowym około 14. tygodnia ciąży, po czym ich odsetek rośnie aż do momentu porodu. We krwi pępowinowej noworodków odsetek limfocytów Treg CD4 25 osiąga
poziom obserwowany we krwi obwodowej dorosłych [7].
W badaniach Sorg i wsp. opisano komórki dendrytyczne krwi pępowinowej jako niedojrzałe komórki limfoidalne CD11c [13].
Borras i wsp. zaobserwowali we krwi pępowinowej
obie populacje komórek dendrytycznych – komórki limfoidalne HLA-DR+ CD123+++ CD11c- CD33- i mieloidalne HLADR++ CD123+ CD11c+ CD33+. Wśród komórek dendrytycznych przeważały komórki limfoidalne, ale komórki CD11c+
również były obecne. Proporcja komórek mieloidalnych
do limfoidalnych CD11c+/CD11c- krwi pępowinowej była
odwrócona i wynosiła 1:3 w porównaniu z ich proporcją
we krwi zdrowych osób dorosłych (3:1). Badania wykazały
upośledzoną zdolność komórek dendrytycznych limfoidalnych do indukowania potencjalnej allostymulacji dziewiczych limfocytów T krwi pępowinowej [4].
W przeciwieństwie do wyników autorów brytyjskich,
Schiebler i wsp. zaobserwowali, że, odsetek komórek den+
+
-
+
+
drytycznych mieloidalnych krwi pępowinowej jest wyższy
w porównaniu z krwią obwodową dorosłych, podczas gdy
odsetek komórek limfoidalnych nie różnił się istotnie
statystycznie, zarówno we krwi pępowinowej, jak też obwodowej. Wyniki ich badań sugerują, że we krwi pępowinowej nie obserwuje się zmienionych proporcji w obrębie populacji komórek dendrytycznych i komórki te nie
są związane z upośledzeniem nabytej odpowiedzi immunologicznej u noworodków [12].
W naszej pracy odsetek komórek dendrytycznych
mieloidalnych CD1c+ nie różnił się istotnie statystycznie
w obu badanych grupach, natomiast odsetek komórek
dendrytycznych był istotnie statystycznie niższy w porównaniu z populacją tych komórek we krwi obwodowej dorosłych. Iloraz komórek dendrytycznych mieloidalnych do
limfoidalnych CD1c+: BDCA-2+ we krwi pępowinowej noworodków (4:1) był istotnie statystycznie wyższy w porównaniu z krwią obwodową dorosłych (2:1).
Różnice dotyczące obserwacji komórek dendrytycznych we krwi pępowinowej mogą wynikać z zastosowania
różnych metod badawczych. W badaniach autorów brytyjskich i niemieckich ocena komórek dendrytycznych
była oparta na metodzie negatywnej selekcji [4, 13]. W badaniach autorów amerykańskich ocena komórek dendrytycznych mieloidalnych i limfoidalnych krwi pępowinowej
była oparta na ocenie ekspresji antygenów CD1c i BDCA-2
[12]. W naszej pracy zastosowaliśmy przeciwciała monoklonalne anty-CD1c, anty-BDCA-2 i anty-BDCA-4 do oceny
populacji komórek dendrytycznych krwi pępowinowej.
Wnioski
Przeważającą populację komórek dendrytycznych
krwi pępowinowej stanowią komórki mieloidalne. Wyniki
naszych badań sugerują, że upośledzenie swoistej odpowiedzi immunologicznej u noworodków nie jest związane
ze zmianami w obrębie populacji komórek dendrytycznych mieloidalnych i limfocytów T regulatorowych.
Piśmiennictwo
[1] Banasik M., Zeman K., Malinowski A. et al. (1997). Cytometric analysis of lymphocyte phenotype in cord and
newborn blood. Polski Merkuriusz Lekarski 3: 236-240.
[2] Banchereau J., Briere F., Caux Ch. et al. (2000). Immunobiology of dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 18: 767-811.
[3] Baecher-Allan C., Viglietta V., Hafler D.A. (2004). Human CD
4 CD25 regulatory T cells. Semin. Immunol. 16: 89-98.
[4] Borras A., Matthews N.C., Lowdell M.W., Navarette C.V.
(2001). Identification of both myeloid CD11c and lymphoid
CD11c dendritic cell subsets in cord blood. Br. J. Haematol.
113: 925-931.
[5] Delespesse G., Yang L.P., Ohshime Y. et al. (1998). Maturation of human neonatal CD4 and CD8 T lymphocytes into
Th1/Th2 effectors. Vaccine 16: 1415-1419
[6] Dzionek A., Fuchs A., Schmidt P. et al. (2000). BDCA-2,
BDCA-3 and BDCA-4: three markers for distinct subsets of
dendritic cells in human peripheral blood. J. Immunol. 165:
6037-6046.
+
+
+
-
+
+
Ocena limfocytów T regulatorowych i komórek dendrytycznych u noworodków urodzonych z ciąż fizjologicznych
[7] Izcue A., Powrie F. (2005). Prenatal tolerance-a role for regulatory T cells? Eur. J. Immunol. 35: 383-390.
[8] Liu E., Tu W., Law H.K., Lau Y.L. (2001). Decreased yield,
phenotypic expression and function of immature monocytederived dendritic cells in cord blood. Br. J. Hematol. 113:
240-246.
[9] Langrish C.L., Buddle J.C., Thrasher A.J., Goldblatt D (2002).
Neonatal dendritic cells are intrinsically biased against Th-1
immune responses. Clin. Exp. Immunol. 128: 118-123.
[10] Ng W.F., Duggan P.J., Ponchel F. et al. (2001) Human CD4 (+)
CD25 (+) cells: a naturally occurring population of regulatory T cells. Blood 98: 2736-2744.
[11] Robinson S.P., Patterson S., English N. et al. (1999) Human
peripheral blood contains two distinct lineages of dendritic
cells. Eur. J. Immunol. 29: 2769-2778.
[12] Schibler K.R., Georgelas A., Rigaa A. (2002) Developmental
biology of the dendritic cell system. Acta Pediatr. Suppl. 91:
9-16.
[13] Sorg R.V., Kogler G., Wernet P. (1999) Identification of cord
blood dendritic cells as an immature CD11c- population.
Blood 93: 2302-2307.
39
[14] Takahata Y., Nomura A., Takada H. et al. (2004) CD25+CD4+
T cells in human cord blood: an immunoregulatory subset
with naive phenotype and specific expression of forkhead
box p3 (Foxp3) gene. Exp. Hematology 32 (7): 622-629.
[15] Wilson C.B., Westall J., Johnson L. (1986) Decreased production of interferon-gamma by human neonatal cells.
Intrinsic and regulatory deficiencies. J. Clin. Invest. 77:
860-867.
[16] Wing K., Ekmark A., Karlsson H. et al. (2002) Characterization of human CD25+ CD4+ T cells in thymus, cord and
adult blood. Immunology 106 (2): 190-199.
J Dorota Darmochwał-Kolarz
Klinika Położnictwa i Perinatologii
Akademii Medycznej w Lublinie
im. Prof. Feliksa Skubiszewskiego
20-950 Lublin, ul. Jaczewskiego 8
e-mail: [email protected]