Nabywanie oporności na antybiotyki przez bakterie
advertisement
LABORATORIUM 3-4/2012 |DIAGNOST YKA L A B O R ATO R YJ N A Nabywanie oporności na antybiotyki przez bakterie STRESZCZENIE Rozwój chemioterapii będący konsekwencją odkrycia antybiotyków niósł nadzieję na skuteczne zwalczanie wielu infekcji wywoływanych przez drobnoustroje. Okazało się jednak, że na całym świecie rośnie odsetek opornych szczepów na wiele antybiotyków. Przyczyną takiego zjawiska jest swoista zdolność drobnoustrojów do obrony przed destrukcją. Dzięki wyspecjalizowanym mechanizmom wymiany elementów genetycznych, oporność może być również nabywana przez inne gatunki bakterii, nawet te niespokrewnione ze sobą i niewytwarzające inhibitujących substancji, a wręcz na nie wrażliwe. SŁOWA KLUCZOWE drobnoustroje, antybiotyki, oporność, e względu na sposób działania antybiotyki można podzielić na bakteriobójcze i bakteriostatyczne. Działanie bakteriobójcze polega na spowodowaniu śmierci komórek mikroorganizmów. Do leków o działaniu bakteriobójczym należą: -laktamy, aminoglikozydy, chinoliny, kotrimoksazol, glikopeptydy. Działanie bakteriostatyczne leku powoduje zjawisko bakteriostazy – czyli zahamowania wzrostu i rozmnażania mikroorganizmów, przy czym po przeniesieniu ich do środowiska pozbawionego antybiotyku lub po ustaniu jego działania ich procesy życiowe wracają do normy. Do leków o działaniu bakteriostatycznym należą makrolidy, linkozamidy, tetracykliny, chloramfenikol, trimetoprim, sulfonamidy [5, 6]. Z patogeny wielolekooporne SUMMARY The development of antibiotics and chemotherapy seemed to have put an end to many of the infections caused by the microorganisms. This however turned out to be not true, as the number of antibiotic resistant strains worldwide has rapidly grown. The reason for this phenomenon is the ability of developing self-defense mechanisms by the microorganisms. There exist highly specialized mechanisms of genetic information exchange thanks to which the resistance can be acquired by other bacteria species, even those not closely related and originally not producing the inhibiting substances. KEY WORDS microorganisms, antibiotics, resistance, multidrug resistant pathogens dr hab. n. med. Bogdan Mazur, mgr Teresa Nalewajek KATEDRA I ZAKŁAD MIKROBIOLOGII I IMMUNOLOGII, ŚLĄSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY W ZABRZU 44 MECHANIZM DZIAŁANIA ANTYBIOTYKÓW Mechanizm działania większości leków przeciwbakteryjnych nie jest całkowicie wyjaśniony. Jednak wygodny jest podział mechanizmów działania antybiotyków na 4 grupy: • blokowanie syntezy ściany komórkowej; do leków należą: -laktamy, glikopeptydy, fosfomycyna, bacytracyna, • zmiana przepuszczalności błony komórkowej lub hamowanie transportu czynnego przez błonę komórkową; leki to polimyksyny oraz leki przeciwgrzybicze, • blokowanie syntezy białek (np. hamowanie translacji i transkrypcji materiału genetycznego): leki to chloramfenikol, aminoglikozydy, tetracykliny, makrolity oraz kwas fusydowy, • blokowanie syntezy kwasów nukleinowych: do leków należą kotrimoksazol, chinoliny, nitrofurany, metronidazol, rifampicyna, leki przeciwwirusowe. Miarą aktywności bakteriobójczej antybiotyku jest najmniejsze stężenie bakteriobójcze (MBC – minimal bacteriocidal activity) – jest to najmniejsza ilość anty- biotyku potrzebna do zabicia komórki bakterii. Z kolei miarą aktywności bakteriostatycznej antybiotyku, czyli zdolności do zahamowania wzrostu bakterii, jest najmniejsze stężenie hamujące (MIC – minimal inhibitory concentration) – jest to najmniejsza ilość antybiotyku potrzebna do zahamowania wzrostu (i wstrzymania procesów życiowych) bakterii. Za bakteriobójcze uważa się te preparaty, dla których stosunek wartości MBC do MIC jest mniejszy lub równy 4. Antybiotyki o wysokiej aktywności bakteriobójczej charakteryzują się wartością MBC zbliżoną do wartości MIC [7, 8]. OPORNOŚĆ BAKTERII NA ANTYBIOTYKI Zdolność przystosowania się bakterii do środowiska zawierającego czynniki toksyczne jest dobrze znana od początków istnienia bakteriologii. Pierwsza praca na ten temat ukazała się w pierwszym tomie Annales d’Institut Pasteur opublikowanym w 1887 r. pod patronatem Ludwika Pasteura [9]. Już w kilka lat po wprowadzeniu do użytku (1943 r.) penicyliny doszło do wyselekcjonowania szczepów gronkowca złocistego Staphylococcus aureus opornych na ten antybiotyk [10]. Oporność na antybiotyki powstała wśród mikroorganizmów jako mechanizm obronny. Istnieją przypuszczenia, że początkowo pojawiła się u drobnoustrojów produkujących dany antybiotyk jako ochrona przed zniszczeniem własnej komórki [11]. Obecnie wiadomo, że oporność nie jest jedynie ochroną przed autodestrukcją. Dzięki wyspecjalizowanym mechanizmom wymiany elementów genetycznych może być ona nabywana przez inne gatunki bakterii, nawet te niespokrewnione ze sobą i niewytwarzające inhibitujących substancji, a wręcz na nie wrażliwych. Istnieje wiele mechanizmów umożliwiających komórce bakteryjnej nabycie oporności na dany czynnik bądź ich grupę [12]. D I AG N O S T Y K A L A B O R ATO R YJ N A Wyróżnia się naturalną i nabytą oporność na antybiotyki. Oporność naturalna polega na braku zdolności penetracji antybiotyku do wnętrza komórki. Naturalnie oporne na wiele antybiotyków są między innymi szczepy pałeczek Pseudomonas aeruginosa, ziarenkowce z rodzaju Enterococcus oraz gronkowce skórne. Nabyta oporność rozwija się albo w wyniku mutacji, albo wskutek nabycia genów oporności od innych bakterii. Nabyta oporność występuje wśród: Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Mycobacterium sp., pałeczek Gram (-) z rodziny Enterobacteriaceae [13]. Cechą współczesnych patogenów bakteryjnych jest ich wielolekooporność MDR (ang. multi drug resistant), czyli oporność na kilka lub wszystkie grupy terapeutyczne leków poprzez tworzenie złożonych biofilmów i mechanizmów oporności [14, 15]. MECHANIZMY OPORNOŚCI Istnieje wiele mechanizmów ujawniania oporności drobnoustrojów na leki: • bakterie wytwarzają enzymy, które niszczą czynny lek. Przykładem mogą być gronkowce oporne na penicylinę G, które wytwarzają -laktamazy. -laktamazy hydrolizują pierścień -laktamowy penicyliny G i wielu półsyntetycznych penicylin. Bakterie Gram-dodatnie uwalniają z komórki -laktamazę, co w konsekwencji prowadzi do spadku stężenia aktywnej postaci leku; • bakterie Gram-ujemne oporne na antybiotyki aminoglikozydowe wytwarzają enzymy adenylujące, fosforyzujące lub acetylujące, które niszczą ww. leki; • bakterie zmieniają przepuszczalność ściany komórkowej dla leku. Przykładem są tetracykliny, które gromadzą się we wrażliwych bakteriach, ale nie gromadzą się w bakteriach opornych. Gronkowce mają naturalną barierę przepuszczalności aminoglikozydów. Można ją przełamać przez skojarzone podanie aminoglikozydów z lekami działającymi na ścianę komórkową, np. penicyliną; • bakterie wytwarzają zmienione miejsce docelowe działania leku, np. chromosomalna oporność na aminoglikozydy jest związana z utratą lub zmianą swoistego białka w podjednostce 30S rybosomu bakteryjnego, które służy jako miejsce |LABORATORIUM 3-4/2012 wiążące u wrażliwych organizmów. Organizmy oporne na erytromycynę mają zmieniony receptor na podjednostce 50S rybosomu w wyniku metylacji podjednostki 23S rybosomalnego RNA. Oporność na niektóre penicyliny może być wynikiem utraty lub zmiany białek wiążących penicyliny (PBP); • bakterie wytwarzają zmieniony szlak metaboliczny, który omija reakcję hamowaną przez lek. Zmutowany enzym może ominąć blokadę syntezy spowodowanej przez antybiotyk, np. wankomycynooporne szczepy Enterococcus wytwarzają syntezę D-alanino-D-mleczanu, prowadząc do syntezy prekursorowego pentapeptydu o znacznie mniejszym powinowactwie do wankomycyny; • bakterie wytwarzają zmienione enzymy, które dalej mogą spełniać swoje funkcje metaboliczne, lecz są mniej podatne na działanie leku niż enzym w komórce wrażliwej. Pochodzenie oporności na leki może być genetyczne lub niegenetyczne. Większość bakterii opornych na leki powstaje w wyniku zmian genetycznych, a następnie w wyniku procesu selekcji pod wpływem leków. 45 LABORATORIUM 3-4/2012 |DIAGNOST YKA Genetyczna oporność na leki ma charakter chromosomalny oraz zewnątrzchromosomalny. Oporność chromosomalna jest wynikiem samoistnej mutacji w miejscu, które kontroluje wrażliwość na dany lek przeciwbakteryjny. Obecność leku stanowi mechanizm selekcji, który tłumi organizmy wrażliwe, a faworyzuje wzrost mutantów opornych. Mutacje samoistne zachodzą z częstością 10-7-10-12 i dlatego rzadko są przyczyną powstawania klinicznej oporności na leki u danego chorego. O oporności zewnątrzchromosomalnej mówimy wtedy, kiedy bakterie zawierają plazmidy – zewnątrzchromosomalne elementy genetyczne. Czynniki R są klasą plazmidów, które niosą oporność na jeden, a często wiele leków przeciwbakteryjnych. Geny plazmidu oporności na leki często kontrolują wytwarzanie enzymów zdolnych do niszczenia leków przeciwbakteryjnych. W ten sposób plazmidy determinują oporność na penicyliny i cefalosporyny, gdyż zawierają geny kodujące wytwarzanie -laktamaz. Przekazywanie genów między przedstawicielami różnych gatunków, a nawet różnych rodzajów nazywane jest przekazywaniem w szerokim zakresie gospodarza. Przekazywanie w obrębie tego samego gatunku nazywamy przekazywaniem w wąskim zakresie gospodarza. Jednak oba typy przekazywania zachodzą według tego samego mechanizmu nazwanego horyzontalnym przekazywaniem genów, do którego zaliczamy: • transdukcję – gdzie plazmid DNA jest zamknięty w wirusie bakteryjnym i może być przekazywany przez wirus innej komórce tego samego gatunku, • transformację – w której nagi DNA przechodzi z jednej komórki danego gatunku do innej, zmieniając genotyp, • koniugację – podczas tego procesu następuje jednokierunkowe przeniesienie mate- L A B O R ATO R YJ N A riału genetycznego między bakteriami tego rodzaju lub odmiennego. Proces ten odbywa się za pośrednictwem czynnika płciowego (F). Plazmid lub DNA jest przenoszony przez cewki białkowe z komórki dawcy do komórki biorcy. Seria ściśle związanych genów, z których każdy determinuje oporność na jeden lek, może być w ten sposób przeniesiona z bakterii opornej na wrażliwą. Jest to najpowszechniejszy sposób rozprzestrzeniania się oporności na wiele leków wśród różnych rodzajów bakterii Gram-ujemnych. Przeniesienie plazmidów oporności może również zachodzić u bakterii Gram-dodatnich, • transpozycję – czyli przeniesienie krótkich sekwencji DNA, które zachodzi między dwoma plazmidami lub między plazmidem a fragmentem chromosomu bakteryjnego wewnątrz komórki bakteryjnej. Drobnoustroje mogą zyskiwać oporność na leki, które cechują się tym samym mechanizmem działania. Taka zależność występuje głównie między związkami o bardzo zbliżonej budowie. Może też zaistnieć między niespokrewnionymi związkami, np. erytromycyna-linkomycyna. Taki typ oporności określa się mianem oporności krzyżowej. U pewnych klas leków czynne jądro związku jest bardzo podobne (np. tetracykliny, cefalosporyny) i należy oczekiwać znacznej oporności krzyżowej na te leki. Istnieje również pojęcie niegenetycznej oporności na leki. Do działania większości leków przeciwbakteryjnych konieczna jest czynna replikacja bakterii. Te drobnoustroje, które nie namnażają się, czyli są metabolicznie nieczynne, są oporne na leki przeciwbakteryjne. Jeśli jednak ponownie zaczną się namnażać, stają się w pełni wrażliwe – jest to oporność związana z cyklem życiowym drobnoustroju, niekodowana genetycznie. Innym przykładem może być utrata pewnych swoistych struktur docelowych dla leku, np. podczas stosowania penicyliny drobnoustroje wrażliwe mogą utracić ścianę komórkową i przez wiele pokoleń utrzymywać się w formie niewrażliwej na leki hamujące syntezę ściany komórkowej (penicyliny, cefalosporyny). Jeśli jednak zaczną syntetyzować ścianę komórkową, stają się znów wrażliwe na penicylinę [2, 5, 16]. PAŁECZKI Z RODZINY ENTEROBACTERIACEAE Najistotniejszym klinicznie i epidemiologicznie mechanizmem oporności pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae jest wytwarzanie -laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym ESBL (extended spectrum -lactamases). Enzymy te hydrolizują penicyliny, cefalosporyny (z wyjątkiem cefamycyn) i monobactemy (aztreonam). Dużą aktywność wykazują względem cefalosporyn III i IV generacji. Pomimo faktu wrażliwości in vitro na leki należące do substratów ESBL, zwłaszcza na niektóre cefalosporyny, przyjęto zalecenie, aby szczepy wytwarzające ESBL traktować jako szczepy oporne na wszystkie penicyliny (bez połączeń z inhibitorami), cefalosporyny (z wyjątkiem cefamycyn) i aztreonam [17]. Do niedawna szczepy ESBL+ były typowymi patogenami szpitalnymi. Ostatnio jednak identyfikuje się te szczepy rutynowo jako czynnik etiologiczny zakażeń pozaszpitalnych (zwłaszcza dróg moczowych). Stwierdza się je również u ludzi zdrowych, zwierząt domowych, hodowlanych, a nawet w produktach żywnościowych pochodzenia zwierzęcego [18, 19]. Drugim ważnym mechanizmem oporności pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae na antybiotyki -laktamowe jest wytwarzanie cefalosporynaz AmpC. Hydrolizują one penicyliny, cefalosporyny (z wyjątkiem leków IV generacji) i aztreonam. Enzymy typu AmpC są pierwotnie kodowane na chromosomach i wtórnie na plazmidach. Pierwotnie kodowana synteza AmpC występuje u E. coli i Shigella spp. lub indukcyjnie u Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Proteus spp., Pseudomonas spp. [13, 20, 21]. fot. Thinkstock PAŁECZKI GRAM-UJEMNE NIEFERMENTUJĄCE 46 Pałeczki Gram-ujemne niefermentujące posiadają więcej naturalnych mechani- D I AG N O S T Y K A L A B O R ATO R YJ N A zmów oporności na leki niż rodzina Enterobacteriaceae. Pojawiają się również u nich mechanizmy nabyte. Pseudomonas aeruginosa oraz Acinetobacter spp. posiadają gatunkowo specyficzne cefalosporynazy AmpC. Pseudomonas aeruginosa dysponuje większą aktywnością oraz liczbą enzymów o charakterze pomp błonowych, dlatego komórki tego drobnoustroju są dużo mniej wrażliwe na różne leki przeciwbakteryjne. Poziom tej oporności może się podnosić wskutek nabywania nowych mutacji, wynikających z mechanizmów oporności nabytej. Pałeczka ropy błękitnej wytwarza: -laktamazy typu ESBL, -laktamazy indukowane (IBL) oraz metalo- -laktamazy klasy B (MBL). Metalo--laktamazy klasy B (MBL) nazwano tak, ponieważ wykorzystują jony Zn2+. Hydrolizują one penicyliny, cefalosporyny i karbapenemy. Enzymy te hamowane są przez kwas merkaptopropionowy i EDTA. Szczepy MBL+ interpretuje się jako niewrażliwe na karbapenemy i inne -laktamy, z wyjątkiem aztreonamu. Oporność na -laktamy wynika nie tylko z wytwarzania enzymów typu cefalosporynaza i karbapenemaz, ale w istotnym stopniu ze zmniejszenia przepuszczalności osłony zewnętrznej. Wskutek utraty białka porynowego OprD, które stanowi kanał dla wejścia karbapenemów do komórki, dochodzi do oporności na tę grupę antybiotyków [17, 22]. Oporność na karbapenemy wśród bakterii Gram-ujemnych stała się obecnie niesłychanie groźna. Enzym KPC, czyli enzym warunkujący oporność bakterii na karbapenemy, odkryto w szczepie bakterii wyizolowanym w 1996 roku w szpitalu w Karolinie Północnej. Obecnie bakterie KPC stają się coraz bardziej powszechne, wywołując infekcje, które nastręczają wiele problemów klinicystom. W Szwecji w 2008 roku w moczu hospitalizowanego pacjenta wykryto bakterię Klebsiella pneumoniae posiadającą nieznany dotąd gen. Nowo wykryty gen kodował enzym, który nazwano NDM-1 – New Delhi metallo-betalactamase. Nazwa New Delhi wskazuje na miejsce zakażenia się pacjenta wyjątkowo opornym szczepem. „Lancet Infectious Diseases” w sierpniu 2010 r. opublikował wyniki odkrycia – 180 przypadków zakażeń wywołanych szczepami zawierającymi NDM-1. Najbardziej niepokojący jest jednak fakt, że kodujący gen blaNDM-1 wykryto nie tylko w szczepach Klebsiella pneumonice, ale również u bakterii Escherichia coli, która współtworzy naturalną mikroflorę jelit wszystkich zwierząt stałocieplnych i występuje powszechnie w naszym otoczeniu. Infekcje powodowane przez szczepy KPC i NDM-1 zwalczane są w zasadzie tylko dwoma antybiotykami: tygecykliną i kolistyną. Poszukiwanie leków o innowacyjnych mechanizmach działania nastręcza firmom farmaceutycznym wielu problemów. Można stwierdzić, że trwa swoisty wyścig nauki z dynamicznie zmieniającymi się mechanizmami obronnymi bakterii. Niepokojące stają się sugestie badaczy mówiące o pojawieniu się szczepów bakterii Gram-ujemnych opornych na wszystkie antybiotyki na długo przed wprowadzeniem nowych leków. Szefowie Resortów Zdrowia, zgodnie z deklaracją Światowej Organizacji Zdrowia z listopada ubiegłego roku, określają rozprzestrzenianie się oporności na karbapenemy, warunkowanej obecnością enzymów KPC i NDM-1, jako „zagrożenie zdrowia publicznego o międzynarodowym znaczeniu” [23, 24]. BAKTERIE GRAM-DODATNIE Gronkowce i paciorkowce wykazują oporność na makrolidy, linkozaminy, streptograminy (MLS). Nabywanie tej oporności polega na: aktywnym usuwaniu antybiotyku z komórki (efflux), inaktywacji enzymatycznej oraz zmianie miejsca wiązania na rybosomach na skutek metylacji lub mutacji. U gronkowców wyróżnia się dwa mechanizmy oporności na antybiotyki -laktamowe. Jest to produkcja -laktamaz oraz produkcja nowego białka PBP2a o niskim powinowactwie do antybiotyków -laktamowych, a określona mianem oporności na metycylinę. Szczepy gronkowców produkujące -laktamazę są oporne na penicylinę, ampicylinę, amoksycyklinę oraz ureidopenicyliny i tikarcylinę. Szczepy wrażliwe na metycylinę oznaczane są skrótem MSSA (metycylinowrażliwe S. aureus), MSCNS (metycylinowrażliwe gronkowce koagulazo-ujemne). Gronkowce oporne na metycylinę określane są skrótami MRSA w przypadku metycylinoopornych szczepów Staphylococcus aureus oraz MRCNS w przypadku metycylinoopornych szczepów gronkowców koagulazoujemnych, a także MRSE w przypadku metycylinoopornych szczepów Staphylococcus epidermidis [25, 26]. |LABORATORIUM 3-4/2012 OGRANICZENIE NABYWANIA OPORNOŚCI NA LEKI Na całym świecie narasta problem oporność bakterii na antybiotyki, co jest spowodowane zwiększaniem odsetka opornych szczepów. Do podstawowych przyczyn tego problemu należy zbyt duże zużycie antybiotyków oraz nieprawidłowa struktura zużycia leków przeciwdrobnoustrojowych. Pojawianiu się i narastaniu zjawiska lekooporności drobnoustrojów można do pewnego stopnia zapobiegać przez np.: • stosowanie antybiotyków w dawkach umożliwiających utrzymanie się ich stężenia w ognisku zakażenia powyżej spodziewanej wartości MIC dla danego leku, aby zahamować wzrost populacji oryginalnej, jak również uniemożliwić selekcję mutantów opornych pierwszego stopnia; • jednoczesne podawanie dwóch leków o różnym punkcie uchwytu, między którymi nie istnieje oporność krzyżowa; • unikanie ekspozycji drobnoustrojów na szczególnie cenny lek przez ograniczenie jego stosowania, zwłaszcza w szpitalach i w paszy zwierzęcej [2]. Stosowanie skutecznych leków przeciwbakteryjnych bezpośrednio nie powoduje oporności, a eliminuje z populacji bakteryjnych bakterie wrażliwe. Daje to zwiększoną szansę na przewagę, a nawet wyłączność przeżycia bakteriom, które nabyły cechy oporności według podanych mechanizmów, a które przed zastosowaniem chemioterapeutyku mogły znajdować się w danej populacji, nawet w minimalnej liczbie [1]. Polska należy do krajów o szczególnie dużym zużyciu antybiotyków, które powszechnie przepisuje się w leczeniu zakażeń wirusowych. Problem jest tak poważny, że WHO i kraje UE z Polską włącznie podpisały zobowiązanie do wprowadzenia programu ochrony przed nadmiarem stosowanych antybiotyków oraz ich racjonalnego stosowania. Program ten monitoruje minister zdrowia. Polega on na starannym sprawdzaniu sytuacji epidemiologicznej w celu wdrażania celowanych działań, ograniczających stosowanie nagminnej terapii antybiotykowej. Ogromną rolę spełnia tu kontrola zakażeń szpitalnych z dokładnym monitoringiem pacjentów, którzy są nosicielami wieloopornych szczepów [27]. Piśmiennictwo dostępne na www.laboratorium.elamed.pl 47
