„Nisza” jako mikrośrodowisko komórek pozostające z nimi w stanie
advertisement
„Nisza” jako mikrośrodowisko komórek pozostające z nimi w stanie ciągłej wymiany informacji Mediatory wymiany informacji między komórką a „niszą”: 1 P1 1 2 S 2 P2 P3 3 Wnts - czynniki humoralne (np. czynniki wzrostowe i cytokiny – oddziaływania „krynne” - adhezja komórkowa (ścieżki sygnałowe zależne od integryn, kadheryn etc. - wymiana bodźców mechanicznych (za pośrednictwem białek adhezji międzykomórkowej i receptorów ECM) 3 -bezpośrednia wymiana metabolitów (złącza szczelinowe) Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: 167-174 1 „Nisza” jako mikrośrodowisko komórek pozostające z nimi w stanie ciągłej wymiany informacji Mediatory wymiany informacji między komórką a „niszą”: 1 P1 1 2 S 2 P2 P3 3 Wnts - czynniki humoralne (np. czynniki wzrostowe i cytokiny – oddziaływania „krynne” - adhezja komórkowa (ścieżki sygnałowe zależne od integryn, kadheryn etc. - wymiana bodźców mechanicznych (za pośrednictwem białek adhezji międzykomórkowej i receptorów ECM) 3 -bezpośrednia wymiana metabolitów 2 Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: 167-174 Mediatory bezposredniej międzykomórkowej wymiany metabolitów Plasmodesmy Złącza szczelinowe Nanotuby (Gallagher and Benfey, 2006) (www.molecular.biosciences.wsu.edu) Rośliny Rustom et al., 2004 Zwierzęta 3 Plazmodezmy w tkankach roślinnych - tworzą międzykomórkowe „mostki” obudowane ciągłą błoną komórkową łączące domeny cytoplazmatyczne sąsiednich komórek - stanowią „pozostałość” podziału komórki roślinnej, lub tworzone są „de novo” - plazmodezmy penetrowane są przez cysterny retikulum endpolazmatycznego (tzw. desmotubule”) oraz cytoszkielet aktynowy i mikrotubule Plazmodezmy pośredniczą w czynnym i biernym transferze cząsteczek między sąsiednimi komórkami 4 Maule, Curr. Op. Plant Biol.,2008, 11:680 Struktury nanotubularne jako analogi roślinnych plazmodezm w tkankach zwierzęcych • Not just another hole in the wall: understanding intercellular protein trafficking (Genes Dev. 2006) Kimberly L. Gallagher and Philip N. Benfey Department of Biology, Duke University, Durham, North Carolina, USA • Cutting Edge: Membrane Nanotubes Connect Immune Cells (J. Immunol. 2004) Björn Önfelt, Shlomo Nedvetzki, Kumiko Yanagi and Daniel M. Davis Department of Biological Sciences, Imperial College, London, United Kingdom • Nanotubular Highways for Intercellular Organelle Transport (Science 2004) Amin Rustom,1 Rainer Saffrich,2 Ivanka Markovic,3 Paul Walther,4 Hans-Hermann Gerdes,5 1 Interdisciplinary Center of Neuroscience, Institute of Neurobiology, University of Heidelberg, Germany University of Heidelberg, Germany 3Institute of Biochemistry, Faculty of Medicine, University of Belgrade, Yugoslavia 2Otto-Meyerhoff-Zentrum, 4 Electron Microscopy Facility, University of Ulm, Germany for Biochemistry and Molecular Biology, University of Bergen, Norway 5Institute 16 5 Analizy struktur nanotubularnych przy użyciu mikroskopii elektronowej i fluorescencyjnej Komórki szczurzej linii pheochromocytoma (PC12) wykazują obecność wydłużonych wypustek łączących sąsiednie komórki. 6 Nanotuby (ang. tubular nanotubes) w układzie immunologicznym Struktury nanotubularne formowane między ludzkimi limfocytami B transformowanymi wirusem Epstein-Barra (GFP). Struktury nanotubularne między monocytami/makrofagami obwodowej krwi ludzkiej 7 Formowanie nanotub (TNTs) – mechanizm (I) Stadia formowania nanotub między komórkami PC12 [(B) strzałka, (D) nanotuba]. Nanotuby mogą być tworzone de novo dzięki aktywności filopodiów tworzących mostki międzykomórkowe 8 Formowanie nanotub (TNTs) – mechanizm (II) Nanotuby jako pozostałość po synapsie immunologicznej między komórkami NK a komórką 721.221 Nanotuby jako pozostałość po bezpośrednim kontakcie między komórkami 721.221 Nanotuby mogą stanowić pozostałość ścisłych kontaktów międzykomórkowych 9 „Sieć nanotubularna” Komórki linii PC12 formują wielokomórkowe struktury nanotubularne Trzy komórki linii monocytarnej (J774) tworzące sieć nanotubularną Wniosek: Nanotuby nie ograniczają się do łączenia par komórek, lecz mogą tworzyć układy wielokomórkowe 10 Struktury nanotubularne uczestniczą w międzykomórkowej wymianie organelli Zgrubienia „podróżujące” wzdłuż nanotuby łączącej dwa makrofagi linii J774 Struktury wybarwione barwnikiem znakującym organelle o pH kwaśnym czyli np. lizosomy (Lyso-Tracker) poruszają się w nanotubie łączącej dwie komórki. …międzykomórkowa wymiana lizosomów… 11 W jaki sposób odbywa się transport wzdłuż nanotub ? Obecność aktyny w nanotubach utworzonych między komórkami PC12: - α-tubulina- zielony, - F-aktyna - czerwony, - DNA - niebieski C – synaptofizyna, marker wczesnych endosomów – zielony; F-aktyna - czerwony D – miozyna Va – zielony; F-aktyna czerwony E - synaptofizyna – zielony; miozyna Va – czerwony, F-aktyna - niebieski) Wniosek: Częściowa kolokalizacja synaptofizyny i miozyny Va w połączeniu z obecnością F-aktyny w nanotubach sugeruje mechanizm transportu nanotubularnego zależny od aktyny 12 Mechanizmy międzykomórkowego transportu organelli za pośrednictwem struktur nanotubularnych Komórki linii PC12 cells wybarwione DiI Jednokierunkowy transport organelli wyznakowanych DiI Transfer organelli zachodzi w temperaturze bliskiej 0°C, która blokuje exo-, endo- i fagocytozę Zaangażowanie aktomiozyny............ 13 „Nisza” jako mikrośrodowisko komórek pozostające z nimi w stanie ciągłej wymiany informacji Mediatory wymiany informacji między komórką a „niszą”: 1 P1 1 2 S 2 P2 P3 3 Wnts - czynniki humoralne (np. czynniki wzrostowe i cytokiny – oddziaływania „krynne” - adhezja komórkowa (ścieżki sygnałowe zależne od integryn, kadheryn etc. - wymiana bodźców mechanicznych (za pośrednictwem białek adhezji międzykomórkowej i receptorów ECM) 3 -bezpośrednia wymiana metabolitów 14 Istnieją mocne poszlaki przemawiające za tym, że struktury nanotubularne mogą uczestniczyć w komunikacji międzykomórkowej w sposób komplementarny do innych systemów Niewiele jednak nie wiemy na temat funkcji nanotub w fizjologii organizmów wielokomórkowych 15 Wniosek: Przedstawione wyniki wskazują, że komunikacja międzykomórkowa oparta na ciągłości błon występuje nie tylko w organizmach roślinnych „Komunikacja międzykomórkowa” Plasmodesmy Złącza szczelinowe Nanotuby (Gallagher and Benfey, 2006) (www.molecular.biosciences.wsu.edu) Rośliny Rustom et al., 2004 Zwierzęta Złącza szczelinowe 9 16 Komunikacja międzykomórkowa za pośrednictwem złącz szczelinowych… Plasmodesmy Złącza szczelinowe Nanotuby (Gallagher and Benfey, 2006) (www.molecular.biosciences.wsu.edu) Rośliny Rustom et al., 2004 Zwierzęta 17 Złącza szczelinowe umożliwiają bierny międzykomórkowy transfer jonów i drobnocząsteczkowych metabolitów… …a to odróżnia je od plazmodezm i nanotub… ...które do międzykomórkowego transportu metabolitów wykorzystują retikulum endoplazmatyczne, i system aktomiozynowy Gerdes@Carcalho, 2008 18 Złącza szczelinowe to konserwatywne struktury, dzięki którym komórki komunikują się ze sobą metabolicznie i elektrycznie Miejsca ścisłego kontaktu pomiędzy dwoma komórkami, w obrębie którego przerwa („gap”) między błonami wynosi około 2-3 nm (Benedetti, 1965) 19 Odrobina historii badań nad złączami szczelinowymi u kręgowców 1. 2. 3. 4. Weidmann (1952): szybkość rozchodzenia się potencjałów czynnościowych w miokardium przekracza wartości oczekiwane (sugestia istnienia międzykomórkowej ścieżki o niskim oporze elektrycznym) Odkrycie transmisji sygnałów elektrycznych w synapsach neuronów motorycznych kałamarnicy (Furshpan and Potter; 1959) Synapsa elektryczna (Robertson 1963) Revel & Karnowsky; 1967; termin „gap junction”. Zdominował on inne nazwy, w tym „nexus” i „macula communicans” 5. Identyfikacja miejsc ścisłego kontaktu pomiędzy dwoma komórkami, w obrębie którego przerwa („gap”) między błonami wynosi około 2-3 nm (Benedetti, 1965) 6. Koneksyna (Cx32; wątroba; 1986) 7. Przepuszczalność kanałów złącz…… 8. Selektywność kanałów złącz… 235. Badania z wykorzystaniem AFM potwierdziły ścisłe upakowanie kanałów w układzie heksagonalnym (Hoh et al., 1993) Saez et al., 2003 20 117..9. Ruchliwość komórek nowotworowych a intensywność GJIC (Daniel et al., 2008) Złącza szczelinowe i koneksony - budowa Jednostka strukturalna - koneksyna • Koneksyny stanowią dużą konserwatywną rodzinę (wykazują homologię pod względem sekwencji aminokwasowej w 60%). Geny kodujące różne rodzaje koneksyn znajdują się na kilku chromosomach • W jej skład wchodzi przynajmniej 20 konserwatywnych ewolucyjnie rodzajów białek, które zaklasyfikowano do różnych grup i nazwano według ich mas cząsteczkowych ( 26 – 60 kDa) • Białka te w środowisku lipidowym spontanicznie formują heksamery (koneksony) • W jednej komórce możliwa jest ekspresja kilku różnych rodzajów koneksyn, również w obrębie jednego koneksonu mogą występować różne koneksyny •Koneksyny obecne są u kręgowców. U bezkręgowców występują ineksyny 21 Budowa i funkcje złącz NH szczelinowych… 3 + 1 E1 - tworzenie kanałów łączących przedziały cytoplazmatyczne sąsiednich komórek 2 - międzykomórkowa bierna wymiana dobnocząsteczkowych metabolitów o 3 E2 4 COO _ masie poniżej 1.5 kDa Konekson (Eckert &Huelser, zmienione) 22 22 Kanały łączące przedziały cytoplazmatyczne sąsiednich komórek Ineksyny Ineksyny w komórkach stułbi (Hydra sp.) zwizualizowane przy pomocy GFP - Budują złącza szczelinowe między komórkami bezkręgowców (INvertebrate conEXINS) - Brak homologii sekwencji aminokwasowej z koneksynami - Bardzo podobna budowa kanałów zb. z ineksyn i koneksyn oraz podobne ich właściwości Ineksyny stanowią rodzinę białek budujących międzykomórkowe kanały białkowe łączące przedziały cytoplazmatyczne sąsiednich komórek, która jest ewolucyjnie starsza 23 niż rodzina koneksyn Bauer et al., 2004 Paneksyny Erytrocyty - tworzą heksamery analogiczne do koneksonów Oocyty - występują m.in. w komórkach krwi Prostata Funkcja: - uczestniczą one m. in. w sekrecji ATP - tworzą kanały błonowe łączące cytoplazmę z otoczeniem komórki, a nie z jej sąsiadem Dahl et al., 2006 Locovei et al., 2006 24 Tkankowo-specyficzne funkcje złącz szczelinowych Sprzężenie elektryczne; np. w miokardium , układzie nerwowym i innych tkankach pobudliwych Serce Koneksyna Cx40 Cx43 Cx45 Funkcja - międzykomórkowy transfer jonów wapnia -synchronizacja aktywności skurczowej kardiomiocytów Układ nerwowy Cx32 Cx37 Cx43 - przewodnictwo nerwowe - wewnątrzcytoplazmatyczny transfer metabolitów w komórkach Schwanna Sprzężenie metaboliczne; np. wątroba i inne tkanki niepobudliwe Np. wątroba i trzustka Cx32 Cx36 - synchronizacja wydzielania insuliny przez komórki b trzustki - synchronizacja sekrecji glukozy przez hepatocyty 25 Czynniki determinujące funkcje złącz szczelinowych: - poziom I – zależny od typu i lokalizacji koneksyny w danej komórce - poziom ekspresji danej koneksyny - transport do błony i wewnątrzkomórkowa lokalizacja koneksyn - typ koneksyny budującej złącze i ‘kompatybilność’ koneksonów zbudowanych z różnych koneksyn - selektywność kanałów złącz szczelinowych - poziom II – zależny od zewnętrznych regulatorów funkcji złącz szczelinowych - regulatory przepuszczalności kanałów złącz szczelinowych np. pH, stężenie wewnątrzkomórkowego wapnia - aktywność szlaków sygnałowych determinujących przepuszczalność kanałów poprzez zmiany poziomu fosforylacji koneksyn -stabilizacja złącz przez białka adhezji międzykomórkowej - stabilizacja mechaniczna 26 Szlak zależny od Wnt reguluje ekspresję koneksyn Nucleus Cadherins LEF b-catenin b-catenin a-actinin a-catenin DNA TCF g-catenin p120ctn vinculin Wnt responsive gene expression LEF GJs b-catenin b-catenin GSK3b APC Axin paxillin tensin talin Dsh vinculin b-catenin a-actinin b-catenin TCF Integrin frizzled ECM Wnt-1 27 „Obrót” koneksyn Saez et al., 2003 28 Kompleksy białkowe towarzyszące złączom szczelinowym Winkulina Mikrotubule kateniny N-kadheryna Szlak Wnt Wei et al., 2004 Białka związane z „kompleksem powierzchniowym” decydują zarówno o ekspresji, jak i o funkcji złącz szczelinowych 29 Schematyczny diagram opisujący system sarkomeryczny w komórkach mięśnia sercowego (kardiomiocytach) Złącza szczelinowe Kontakty międzykomórkowe zależne od kadheryn Oddziaływania komórka-macierz zewnątrzkomórkowa 30 30 za pośrednictwem integryn Trends in Cell Biology, 2005 Podsumowanie: wewnątrzkomórkowy transport koneksyn Tylko koneksony „zakotwiczone” w błonie komórkowej mają szanse zbudować funkcjonalne złącza szczelinowe Laird 2006 - Równowaga między transportem do- i od- membranowym koneksyn decyduje o liczbie czynnych złącz szczelinowych, a tym samym o intensywności komunikacji 31 międzykomórkowej za ich pośrednictwem Kompleksy białkowe związane z „kompleksem powierzchniowym” decydują o intensywności komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych poprzez wpływ na ekspresję koneksyn, wewnątrzkomórkową lokalizację i „obrót” koneksonów Kompleksy białkowe towarzyszące złączom szczelinowym Winkulina Wzajemne proporcje między szybkością do-membranowego transportu koneksyn z miejsc ich syntezy i wydajnością internalizacji koneksonów i ich degradacji decydują o obfitości złącz szczelinowych w plazmalemmach sąsiadujących ze sobą komórek To z kolei musi mieć przełożenie na intensywność międzykomórkowej wymiany metabolitów Mikrotubule kateniny N-kadheryna Szlak Wnt Wei et al., 2004 Białka związane z „kompleksem powierzchniowym” decydują zarówno o ekspresji, jak i o funkcji złącz szczelinowych 11 Saez et al., 2003 …szlaki sygnałowe zaangażowane w regulację ekspresji koneksyn… 6 32 Budowa złącz szczelinowych NH3+ 1 E1 Cx26 Cx36 Cx43 2 Cx45 3 E2 4 COO _ Konekson 33 Huelser&Eckert Selektywność złącz szczelinowych zbudowanych z Cx32 Goldberg et al., 2002 Wniosek: złącza szczelinowe zbudowane z Cx32 wykazują selektywną 34 przepuszczalność dla cząsteczek o ładunku dodatnim Selektywność złącz szczelinowych Znakowanie komórek DiI/glukozą C14 kohodowla sortowanie komórek (FACS) analiza ilości C14 w komórkach donorowych (D) i akceptorowych (R; HPLC) 35 Selektywność złącz szczelinowych 36 Goldberg et al., 2002 Drzewo filogenetyczne koneksyn g-80-100 aminokwasów w pętli cytoplazmatycznej NH3+ 1 E1 2 a-50-55 aminokwasów w pętli cytoplazmatycznej 3 E2 4 _ COO b-30-35 aminokwasów w pętli cytoplazmatycznej 37 Saez et al., 2003 Budowa złącz szczelinowych NH3+ 1 E1 Cx26 Cx36 Cx43 2 Cx45 3 E2 4 COO _ Konekson 38 Huelser&Eckert „Kompatybilność” koneksonów bCx32 bCx26 Barrio, 92 Swenson, 89 Cx50 aCx37 Elgang, 1995 Elfgang,95 bCx31 Hennemann, 92 White, 1994 Elgang, 1995 aCx40 aCx45 Bruzzone, 93 Elgang, 1995 aCx43 38 Obecność kompatybilnych izoform koneksyn decyduje o intensywności komunikacji za pośrednictwem złącz szczelinowych między sąsiednimi komórkami 39 Ekspresja różnych izoform koneksyn w komórkach sugeruje rolę interakcji między nimi w determinowaniu funkcji koneksonów i złącz szczelinowych homomeryczne heteromeryczne - ze względu na budowę koneksonów homotypowe heterotypowe heterotypowe-heteromeryczne -ze względu na budowę kanałów 40 Konkluzja Złącza szczelinowe stanowią (wbrew pozorom) selektywny system międzykomórkowej wymiany informacji 41 Skład koneksonów decyduje o funkcji złącz jako specyficznych mediatorów międzykomórkowej wymiany informacji Laird, 2007 Złącza szczelinowe wykazują selektywność dla cząsteczek, która 42 zależy od składu koneksonów Czynniki determinujące funkcje złącz szczelinowych: - poziom I – zależny od typu i lokalizacji koneksyny w danej komórce - typ koneksyny budującej złącze i ‘kompatybilność’ koneksonów zbudowanych z różnych koneksyn - selektywność kanałów złącz szczelinowych - poziom ekspresji danej koneksyny - transport do błony i wewnątrzkomórkowa lokalizacja koneksyn - poziom II – zależny od zewnętrznych regulatorów funkcji złącz szczelinowych - regulatory przepuszczalności kanałów złącz szczelinowych np. pH, stężenie wewnątrzkomórkowego wapnia - aktywność szlaków sygnałowych determinujących przepuszczalność kanałów poprzez zmiany poziomu fosforylacji koneksyn -stabilizacja złącz przez białka adhezji międzykomórkowej - stabilizacja mechaniczna 43 Zmiany stężenia jonów wpływają na przepuszczalność kanałów złącz szczelinowych Niskie Ca++ Wysokie Ca++ Sens – ochrona komórek przed „szokiem wapniowym” wynikającym z napływu jonów wapnia do uszkodzonej sąsiedniej komórki Właściwość ta służy utrzymaniu homeostazy wapniowej w tkankach 44 Szlaki sygnałowe warunkujące bramkowanie kanałów złącz szczelinowych closed Kniga p. 47 Różnorodne szlaki sygnałowe wpływają na intensywność komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych w sposób 45 zależny od przewodnictwa kanałów COO _ E2 NH3+ E1 Regulacja funkcji złącz szczelinowych - fosforylacja koneksyn Domeny: - wewnątrz-membranowe a-helisy – konserwatywne - domeny zewnątrzkomórkowe - konserwatywne - N-końcowy łańcuch wewnątrzkomórkowy – konserwatywny - domena wewnątrzkomórkowa – zmienna - C-końcowy łańcuch wewnątrzkomórkowy – wysoce zmienny Giepmans et al., 2004 46 Kategorie składników „kompleksu powierzchniowego” regulujących funkcje złącz szczelinowych 1. Białka sygnałowe 2. Białka strukturalne 47 Laird, 2005 Funkcja „Niszy” czyli mikrośrodowiska komórek w transformacji nowotworowej Mediatory wymiany informacji między komórką a „niszą” wspomagające transformację nowotworową: Neo - zaburzenia funkcji endo- i egzogennych czynników humoralnych– oddziaływania „krynne” - modyfikacje składu macierzy międzykomórkowej oraz ekspresji receptorów adhezji komórkowej, np. integryn i kadheryn - zmiany równowagi mechanochemicznej w obrębie „niszy”, prowadzące do zaburzeń wymiany bodźców mechanicznych między komórka a jej mikrośrodowiskiem -deregulacja bezpośredniej wymiany metabolitów za pośrednictwem złącz szczelinowych Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: 167-174 48
