„Nisza” jako mikrośrodowisko komórek pozostające z nimi w stanie

advertisement
„Nisza” jako mikrośrodowisko komórek pozostające z
nimi w stanie ciągłej wymiany informacji
Mediatory wymiany informacji
między komórką a „niszą”:
1
P1
1
2
S
2
P2
P3
3
Wnts
- czynniki humoralne (np. czynniki wzrostowe
i cytokiny – oddziaływania „krynne”
- adhezja komórkowa (ścieżki sygnałowe
zależne od integryn, kadheryn etc.
- wymiana bodźców mechanicznych (za
pośrednictwem białek adhezji
międzykomórkowej i receptorów ECM)
3
-bezpośrednia wymiana metabolitów (złącza
szczelinowe)
Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: 167-174
1
„Nisza” jako mikrośrodowisko komórek pozostające z
nimi w stanie ciągłej wymiany informacji
Mediatory wymiany informacji
między komórką a „niszą”:
1
P1
1
2
S
2
P2
P3
3
Wnts
- czynniki humoralne (np. czynniki wzrostowe
i cytokiny – oddziaływania „krynne”
- adhezja komórkowa (ścieżki sygnałowe
zależne od integryn, kadheryn etc.
- wymiana bodźców mechanicznych (za
pośrednictwem białek adhezji
międzykomórkowej i receptorów ECM)
3
-bezpośrednia wymiana metabolitów
2
Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: 167-174
Mediatory bezposredniej międzykomórkowej
wymiany metabolitów
Plasmodesmy
Złącza szczelinowe
Nanotuby
(Gallagher and Benfey, 2006)
(www.molecular.biosciences.wsu.edu)
Rośliny
Rustom et al., 2004
Zwierzęta
3
Plazmodezmy w tkankach roślinnych
- tworzą międzykomórkowe „mostki” obudowane
ciągłą błoną komórkową łączące domeny
cytoplazmatyczne sąsiednich komórek
- stanowią „pozostałość” podziału komórki
roślinnej, lub tworzone są „de novo”
- plazmodezmy penetrowane są przez cysterny
retikulum endpolazmatycznego (tzw.
desmotubule”) oraz cytoszkielet aktynowy i
mikrotubule
Plazmodezmy pośredniczą w
czynnym i biernym transferze
cząsteczek między sąsiednimi
komórkami
4
Maule, Curr. Op. Plant Biol.,2008, 11:680
Struktury nanotubularne jako analogi roślinnych
plazmodezm w tkankach zwierzęcych
• Not just another hole in the wall: understanding
intercellular protein trafficking (Genes Dev. 2006)
Kimberly L. Gallagher and Philip N. Benfey
Department of Biology, Duke University, Durham, North Carolina, USA
• Cutting Edge: Membrane Nanotubes Connect
Immune Cells (J. Immunol. 2004)
Björn Önfelt, Shlomo Nedvetzki, Kumiko Yanagi and Daniel M. Davis
Department of Biological Sciences, Imperial College, London, United Kingdom
• Nanotubular Highways for Intercellular Organelle
Transport (Science 2004)
Amin Rustom,1 Rainer Saffrich,2 Ivanka Markovic,3 Paul Walther,4 Hans-Hermann Gerdes,5
1
Interdisciplinary Center of Neuroscience, Institute of Neurobiology, University of Heidelberg, Germany
University of Heidelberg, Germany
3Institute of Biochemistry, Faculty of Medicine, University of Belgrade, Yugoslavia
2Otto-Meyerhoff-Zentrum,
4
Electron Microscopy Facility, University of Ulm, Germany
for Biochemistry and Molecular Biology, University of Bergen, Norway
5Institute
16
5
Analizy struktur nanotubularnych przy użyciu
mikroskopii elektronowej i fluorescencyjnej
Komórki szczurzej linii pheochromocytoma (PC12) wykazują obecność wydłużonych
wypustek łączących sąsiednie komórki.
6
Nanotuby (ang. tubular nanotubes) w
układzie immunologicznym
Struktury nanotubularne formowane między ludzkimi
limfocytami B transformowanymi wirusem Epstein-Barra
(GFP).
Struktury nanotubularne między
monocytami/makrofagami obwodowej
krwi ludzkiej
7
Formowanie nanotub (TNTs) – mechanizm (I)
Stadia formowania nanotub
między komórkami PC12 [(B)
strzałka, (D) nanotuba].
Nanotuby mogą być tworzone de novo dzięki
aktywności filopodiów tworzących mostki
międzykomórkowe
8
Formowanie nanotub (TNTs) – mechanizm (II)
Nanotuby jako pozostałość po
synapsie immunologicznej między
komórkami NK a komórką 721.221
Nanotuby jako pozostałość po
bezpośrednim kontakcie między
komórkami 721.221
Nanotuby mogą stanowić pozostałość ścisłych kontaktów
międzykomórkowych
9
„Sieć nanotubularna”
Komórki linii PC12 formują
wielokomórkowe struktury
nanotubularne
Trzy komórki linii monocytarnej
(J774) tworzące sieć nanotubularną
Wniosek: Nanotuby nie ograniczają się do łączenia par
komórek, lecz mogą tworzyć układy wielokomórkowe
10
Struktury nanotubularne uczestniczą w
międzykomórkowej wymianie organelli
Zgrubienia „podróżujące” wzdłuż nanotuby łączącej dwa makrofagi linii J774
Struktury wybarwione barwnikiem
znakującym organelle o pH
kwaśnym czyli np. lizosomy
(Lyso-Tracker) poruszają się w
nanotubie łączącej dwie komórki.
…międzykomórkowa wymiana lizosomów…
11
W jaki sposób odbywa się transport wzdłuż nanotub ?
Obecność
aktyny
w
nanotubach
utworzonych między komórkami PC12:
- α-tubulina- zielony,
- F-aktyna - czerwony,
- DNA - niebieski
C – synaptofizyna, marker wczesnych
endosomów – zielony; F-aktyna - czerwony
D – miozyna Va – zielony; F-aktyna czerwony
E - synaptofizyna – zielony; miozyna Va –
czerwony, F-aktyna - niebieski)
Wniosek: Częściowa kolokalizacja synaptofizyny i miozyny Va w połączeniu
z obecnością F-aktyny w nanotubach sugeruje mechanizm transportu
nanotubularnego zależny od aktyny
12
Mechanizmy międzykomórkowego transportu
organelli za pośrednictwem struktur nanotubularnych
Komórki linii PC12 cells
wybarwione DiI
Jednokierunkowy transport
organelli wyznakowanych
DiI
Transfer organelli zachodzi w temperaturze bliskiej 0°C, która
blokuje exo-, endo- i fagocytozę
Zaangażowanie aktomiozyny............
13
„Nisza” jako mikrośrodowisko komórek pozostające z
nimi w stanie ciągłej wymiany informacji
Mediatory wymiany informacji
między komórką a „niszą”:
1
P1
1
2
S
2
P2
P3
3
Wnts
- czynniki humoralne (np. czynniki wzrostowe
i cytokiny – oddziaływania „krynne”
- adhezja komórkowa (ścieżki sygnałowe
zależne od integryn, kadheryn etc.
- wymiana bodźców mechanicznych (za
pośrednictwem białek adhezji
międzykomórkowej i receptorów ECM)
3
-bezpośrednia wymiana metabolitów
14
Istnieją mocne poszlaki przemawiające za tym, że struktury
nanotubularne mogą uczestniczyć w komunikacji
międzykomórkowej w sposób komplementarny do innych systemów
Niewiele jednak nie wiemy na temat funkcji nanotub w
fizjologii organizmów wielokomórkowych
15
Wniosek:
Przedstawione wyniki wskazują, że komunikacja
międzykomórkowa oparta na ciągłości błon występuje
nie tylko w organizmach roślinnych
„Komunikacja międzykomórkowa”
Plasmodesmy
Złącza szczelinowe
Nanotuby
(Gallagher and Benfey, 2006)
(www.molecular.biosciences.wsu.edu)
Rośliny
Rustom et al., 2004
Zwierzęta
Złącza szczelinowe
9
16
Komunikacja międzykomórkowa za pośrednictwem złącz
szczelinowych…
Plasmodesmy
Złącza szczelinowe
Nanotuby
(Gallagher and Benfey, 2006)
(www.molecular.biosciences.wsu.edu)
Rośliny
Rustom et al., 2004
Zwierzęta
17
Złącza szczelinowe umożliwiają bierny międzykomórkowy
transfer jonów i drobnocząsteczkowych metabolitów…
…a to odróżnia je od
plazmodezm i nanotub…
...które do międzykomórkowego
transportu metabolitów wykorzystują
retikulum endoplazmatyczne, i system
aktomiozynowy
Gerdes@Carcalho, 2008
18
Złącza szczelinowe to konserwatywne struktury, dzięki
którym komórki komunikują się ze sobą metabolicznie
i elektrycznie
Miejsca ścisłego kontaktu pomiędzy dwoma komórkami, w obrębie którego
przerwa („gap”) między błonami wynosi około 2-3 nm (Benedetti, 1965)
19
Odrobina historii badań nad złączami szczelinowymi u
kręgowców
1.
2.
3.
4.
Weidmann (1952): szybkość rozchodzenia się potencjałów czynnościowych w miokardium przekracza
wartości oczekiwane (sugestia istnienia międzykomórkowej ścieżki o niskim oporze elektrycznym)
Odkrycie transmisji sygnałów elektrycznych w synapsach neuronów motorycznych kałamarnicy
(Furshpan and Potter; 1959)
Synapsa elektryczna (Robertson 1963)
Revel & Karnowsky; 1967; termin „gap junction”. Zdominował on inne nazwy, w tym „nexus” i
„macula communicans”
5. Identyfikacja miejsc ścisłego kontaktu
pomiędzy dwoma komórkami, w obrębie
którego przerwa („gap”) między błonami
wynosi około 2-3 nm (Benedetti, 1965)
6. Koneksyna (Cx32; wątroba; 1986)
7. Przepuszczalność kanałów złącz……
8. Selektywność kanałów złącz…
235. Badania z wykorzystaniem AFM
potwierdziły ścisłe upakowanie kanałów w
układzie heksagonalnym (Hoh et al., 1993)
Saez et al., 2003
20
117..9. Ruchliwość komórek nowotworowych
a intensywność GJIC (Daniel et al., 2008)
Złącza szczelinowe i koneksony - budowa
Jednostka strukturalna - koneksyna
• Koneksyny stanowią dużą konserwatywną rodzinę (wykazują homologię pod
względem sekwencji aminokwasowej w 60%). Geny kodujące różne rodzaje
koneksyn znajdują się na kilku chromosomach
• W jej skład wchodzi przynajmniej 20 konserwatywnych ewolucyjnie rodzajów
białek, które zaklasyfikowano do różnych grup i nazwano według ich mas
cząsteczkowych ( 26 – 60 kDa)
• Białka te w środowisku lipidowym spontanicznie formują heksamery
(koneksony)
• W jednej komórce możliwa jest ekspresja kilku różnych rodzajów koneksyn,
również w obrębie jednego koneksonu mogą występować różne koneksyny
•Koneksyny obecne są u kręgowców. U bezkręgowców
występują ineksyny
21
Budowa i funkcje złącz
NH
szczelinowych…
3
+
1
E1
- tworzenie kanałów łączących przedziały
cytoplazmatyczne sąsiednich komórek
2
- międzykomórkowa bierna wymiana
dobnocząsteczkowych metabolitów o
3
E2
4
COO
_
masie poniżej 1.5 kDa
Konekson
(Eckert &Huelser, zmienione)
22 22
Kanały łączące przedziały cytoplazmatyczne sąsiednich komórek
Ineksyny
Ineksyny w komórkach stułbi (Hydra sp.)
zwizualizowane przy pomocy GFP
- Budują złącza szczelinowe
między komórkami bezkręgowców
(INvertebrate conEXINS)
- Brak homologii sekwencji
aminokwasowej z koneksynami
- Bardzo podobna budowa
kanałów zb. z ineksyn i koneksyn
oraz podobne ich właściwości
Ineksyny stanowią rodzinę białek budujących międzykomórkowe kanały białkowe
łączące przedziały cytoplazmatyczne sąsiednich komórek, która jest ewolucyjnie starsza
23
niż
rodzina
koneksyn
Bauer et al., 2004
Paneksyny
Erytrocyty
- tworzą heksamery
analogiczne do
koneksonów
Oocyty
- występują m.in. w
komórkach krwi
Prostata
Funkcja:
- uczestniczą one m.
in. w sekrecji ATP
- tworzą kanały
błonowe łączące
cytoplazmę z
otoczeniem
komórki, a nie z jej
sąsiadem
Dahl et al., 2006
Locovei et al., 2006
24
Tkankowo-specyficzne funkcje złącz szczelinowych
Sprzężenie elektryczne; np. w miokardium , układzie nerwowym i innych tkankach pobudliwych
Serce
Koneksyna
Cx40
Cx43
Cx45
Funkcja
- międzykomórkowy transfer jonów
wapnia
-synchronizacja aktywności
skurczowej kardiomiocytów
Układ nerwowy
Cx32
Cx37
Cx43
- przewodnictwo nerwowe
- wewnątrzcytoplazmatyczny transfer
metabolitów w komórkach Schwanna
Sprzężenie metaboliczne; np. wątroba i inne tkanki niepobudliwe
Np. wątroba i trzustka
Cx32
Cx36
- synchronizacja wydzielania insuliny
przez komórki b trzustki
- synchronizacja sekrecji glukozy
przez hepatocyty
25
Czynniki determinujące funkcje złącz
szczelinowych:
- poziom I – zależny od typu i lokalizacji koneksyny w danej komórce
- poziom ekspresji danej koneksyny
- transport do błony i wewnątrzkomórkowa lokalizacja koneksyn
- typ koneksyny budującej złącze i ‘kompatybilność’ koneksonów
zbudowanych z różnych koneksyn
- selektywność kanałów złącz szczelinowych
- poziom II – zależny od zewnętrznych regulatorów funkcji złącz szczelinowych
- regulatory przepuszczalności kanałów złącz szczelinowych np. pH, stężenie wewnątrzkomórkowego
wapnia
- aktywność szlaków sygnałowych determinujących przepuszczalność kanałów poprzez zmiany poziomu
fosforylacji koneksyn
-stabilizacja złącz przez białka adhezji międzykomórkowej - stabilizacja mechaniczna
26
Szlak zależny od Wnt reguluje ekspresję koneksyn
Nucleus
Cadherins
LEF
b-catenin
b-catenin
a-actinin
a-catenin
DNA
TCF
g-catenin
p120ctn
vinculin
Wnt responsive gene expression
LEF
GJs
b-catenin
b-catenin
GSK3b
APC
Axin
paxillin
tensin
talin
Dsh
vinculin
b-catenin
a-actinin
b-catenin
TCF
Integrin
frizzled
ECM
Wnt-1
27
„Obrót” koneksyn
Saez et al., 2003
28
Kompleksy białkowe towarzyszące złączom szczelinowym
Winkulina
Mikrotubule
kateniny
N-kadheryna
Szlak Wnt
Wei et al., 2004
Białka związane z „kompleksem powierzchniowym” decydują zarówno o ekspresji,
jak i o funkcji złącz szczelinowych
29
Schematyczny diagram opisujący system sarkomeryczny w
komórkach mięśnia sercowego (kardiomiocytach)
Złącza szczelinowe
Kontakty międzykomórkowe zależne od kadheryn
Oddziaływania komórka-macierz zewnątrzkomórkowa
30 30
za pośrednictwem integryn
Trends in Cell Biology, 2005
Podsumowanie: wewnątrzkomórkowy transport
koneksyn
Tylko koneksony
„zakotwiczone” w błonie
komórkowej mają szanse
zbudować funkcjonalne złącza
szczelinowe
Laird 2006
- Równowaga między transportem do- i od- membranowym koneksyn decyduje o liczbie
czynnych złącz szczelinowych, a tym samym o intensywności komunikacji
31
międzykomórkowej za ich pośrednictwem
Kompleksy białkowe związane z „kompleksem
powierzchniowym” decydują o intensywności komunikacji
międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych
poprzez wpływ na ekspresję koneksyn, wewnątrzkomórkową
lokalizację i „obrót” koneksonów
Kompleksy białkowe towarzyszące złączom szczelinowym
Winkulina
Wzajemne proporcje między szybkością do-membranowego transportu
koneksyn z miejsc ich syntezy i wydajnością internalizacji koneksonów i
ich degradacji decydują o obfitości złącz szczelinowych w plazmalemmach
sąsiadujących ze sobą komórek
To z kolei musi mieć przełożenie na intensywność międzykomórkowej wymiany metabolitów
Mikrotubule
kateniny
N-kadheryna
Szlak Wnt
Wei et al., 2004
Białka związane z „kompleksem powierzchniowym” decydują zarówno o ekspresji,
jak i o funkcji złącz szczelinowych
11
Saez et al., 2003
…szlaki sygnałowe zaangażowane w regulację ekspresji koneksyn…
6
32
Budowa złącz szczelinowych
NH3+
1
E1
Cx26
Cx36
Cx43
2
Cx45
3
E2
4
COO
_
Konekson
33
Huelser&Eckert
Selektywność złącz szczelinowych
zbudowanych z Cx32
Goldberg et al., 2002
Wniosek: złącza szczelinowe zbudowane z Cx32 wykazują selektywną
34
przepuszczalność dla cząsteczek o ładunku dodatnim
Selektywność złącz szczelinowych
Znakowanie komórek
DiI/glukozą C14  kohodowla  sortowanie
komórek (FACS)  analiza
ilości C14 w komórkach
donorowych (D) i
akceptorowych (R; HPLC)
35
Selektywność złącz szczelinowych
36
Goldberg et al., 2002
Drzewo filogenetyczne koneksyn
g-80-100 aminokwasów
w pętli cytoplazmatycznej
NH3+
1
E1
2
a-50-55 aminokwasów
w pętli cytoplazmatycznej
3
E2
4
_
COO
b-30-35 aminokwasów
w pętli cytoplazmatycznej
37
Saez et al., 2003
Budowa złącz szczelinowych
NH3+
1
E1
Cx26
Cx36
Cx43
2
Cx45
3
E2
4
COO
_
Konekson
38
Huelser&Eckert
„Kompatybilność” koneksonów
bCx32
bCx26
Barrio, 92
Swenson, 89
Cx50
aCx37
Elgang, 1995
Elfgang,95
bCx31
Hennemann, 92
White, 1994
Elgang, 1995
aCx40
aCx45
Bruzzone, 93
Elgang, 1995
aCx43
38
Obecność kompatybilnych izoform koneksyn decyduje o
intensywności komunikacji za pośrednictwem złącz
szczelinowych między sąsiednimi komórkami
39
Ekspresja różnych izoform koneksyn w komórkach sugeruje
rolę interakcji między nimi w determinowaniu funkcji
koneksonów i złącz szczelinowych
homomeryczne heteromeryczne
- ze względu na budowę koneksonów
homotypowe
heterotypowe
heterotypowe-heteromeryczne
-ze względu na budowę kanałów
40
Konkluzja
Złącza szczelinowe stanowią
(wbrew pozorom) selektywny
system międzykomórkowej
wymiany informacji
41
Skład koneksonów decyduje o funkcji złącz jako
specyficznych mediatorów międzykomórkowej
wymiany informacji
Laird, 2007
Złącza szczelinowe wykazują selektywność dla cząsteczek, która
42
zależy od składu koneksonów
Czynniki determinujące funkcje złącz
szczelinowych:
- poziom I – zależny od typu i lokalizacji koneksyny w danej komórce
- typ koneksyny budującej złącze i ‘kompatybilność’ koneksonów zbudowanych z różnych koneksyn
- selektywność kanałów złącz szczelinowych
- poziom ekspresji danej koneksyny
- transport do błony i wewnątrzkomórkowa lokalizacja koneksyn
- poziom II – zależny od zewnętrznych regulatorów funkcji złącz
szczelinowych
- regulatory przepuszczalności kanałów złącz szczelinowych np. pH,
stężenie wewnątrzkomórkowego wapnia
- aktywność szlaków sygnałowych determinujących przepuszczalność
kanałów poprzez zmiany poziomu fosforylacji koneksyn
-stabilizacja złącz przez białka adhezji międzykomórkowej - stabilizacja
mechaniczna
43
Zmiany stężenia jonów wpływają na przepuszczalność
kanałów złącz szczelinowych
Niskie Ca++
Wysokie Ca++
Sens – ochrona komórek przed „szokiem wapniowym” wynikającym z napływu
jonów wapnia do uszkodzonej sąsiedniej komórki
Właściwość ta służy utrzymaniu homeostazy wapniowej w tkankach
44
Szlaki sygnałowe warunkujące bramkowanie kanałów złącz
szczelinowych
closed
Kniga p. 47
Różnorodne szlaki sygnałowe wpływają na intensywność komunikacji
międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych w sposób
45
zależny od przewodnictwa kanałów
COO
_
E2
NH3+
E1
Regulacja funkcji złącz szczelinowych - fosforylacja koneksyn
Domeny:
- wewnątrz-membranowe a-helisy – konserwatywne
- domeny zewnątrzkomórkowe - konserwatywne
- N-końcowy łańcuch wewnątrzkomórkowy – konserwatywny
- domena wewnątrzkomórkowa – zmienna
- C-końcowy łańcuch wewnątrzkomórkowy – wysoce zmienny
Giepmans et al., 2004
46
Kategorie składników „kompleksu powierzchniowego”
regulujących funkcje złącz szczelinowych
1. Białka sygnałowe
2. Białka strukturalne
47
Laird, 2005
Funkcja „Niszy” czyli mikrośrodowiska komórek w
transformacji nowotworowej
Mediatory wymiany informacji
między komórką a „niszą” wspomagające
transformację nowotworową:
Neo
- zaburzenia funkcji endo- i egzogennych
czynników humoralnych– oddziaływania
„krynne”
- modyfikacje składu macierzy
międzykomórkowej oraz ekspresji receptorów
adhezji komórkowej, np. integryn i kadheryn
- zmiany równowagi mechanochemicznej w
obrębie „niszy”, prowadzące do zaburzeń
wymiany bodźców mechanicznych między
komórka a jej mikrośrodowiskiem
-deregulacja bezpośredniej wymiany
metabolitów za pośrednictwem złącz
szczelinowych
Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: 167-174
48
Download