Przegląd testów laboratoryjnych przydatnych w diagnostyce

advertisement
WYBRANE
PROBLEMY
KLINICZNE
Przegląd testów laboratoryjnych
przydatnych w diagnostyce
pierwotnych niedoborów odporności
Edyta Brzustewicz, Ewa Bryl
Zakład Patologii i Reumatologii Doświadczalnej,
Gdański Uniwersytet Medyczny
Review of laboratory tests using in diagnosis of
primary immunodeficiency diseases
STRESZCZENIE
Pierwotne niedobory odporności (PNO) obejmują grupę około 150 chorób, których patofizjologia dotyczyć może każdej składowej niespecyficznej i specyficznej odpowiedzi
immunologicznej. Przy podejrzeniu PNO należy podjąć szereg badań dążących do ustalenia trafnej diagnozy, a badania laboratoryjne są nieodzownym ich elementem. Wyróżnić
można testy podstawowe i specjalistyczne. Morfologia krwi z rozmazem mikroskopowym
jest badaniem pierwszego rzutu. Inne testy pozwalają na ocenę odpowiedzi humoralnej,
komórkowej, fagocytozy oraz układu dopełniacza. Rozwój nowoczesnych technik laboratoryjnych ułatwia postawienie trafnej diagnozy. Szczególną rolę odgrywa cytometria przepływowa, która umożliwia ocenę ilościową i jakościową ekspresji określonych antygenów
powierzchniowych, istotnych dla PNO. Technika ta wyparła także tradycyjne metody oceny
funkcji fagocytów. Należy podkreślić również znaczenie immunogenetyki, jako dziedziny
dynamicznie rozwijającej się. Częste nawracające zakażenia u pacjentów z PNO wymagają
odpowiedniej diagnostyki mikrobiologicznej.
Forum Medycyny Rodzinnej 2014, tom 8, nr 1, 27–36
słowa kluczowe: pierwotne niedobory odporności, niedobory immunologiczne, immunodiagnostyka,
cytometria przepływowa, badanie układu odpornościowego
ABSTRACT
Primary immunodeficiency diseases (PID) are heterogenous group of disorders including
about 150 their different forms. These systemic disorders with multifactorial etiology can
affect specific and nonspecific immune responses. The majority of PID arises from defects
of B-cells development and function. However, some disorders are associated with defects
in T cells, phagocytes or elements of complement system. Frequent recurrent infections
Adres do korespondencji:
dr hab. Ewa Bryl, prof. nadzw. GUMed
Zakład Patologii i Reumatologii Doświadczalnej
Gdański Uniwersytet Medyczny
ul. Dębinki 7, 80–210 Gdańsk
e-mail: [email protected]
can suggest PID and require diagnostic procedures, both basic and specialistic. The full
blood count with microscopic smear is a first-line study. There are available numerous
Copyright © 2014 Via Medica
ISSN 1897–3590
27
WYBRANE
PROBLEMY
KLINICZNE
tests which assess B-cell, T-cell or combined T- and B-cell immunological functions. Some
other basic mechanisms which play crucial role in pathomechanism of PID (phagocytosis,
complement or cytokines functions) need to be investigated. Develoment of new advanced
laboratory techniques helps to find accurate diagnosis. One of the most important method
is flow cytometry, which allows the characterization of abnormalities of immune cells. We
should underline growing role of immunogenetics in diagnosis and expanding our understanding of PID. There is also importance of early diagnosis and management of infectious
complications, which can also be intricate in primary immunodeficiencies.
Forum Medycyny Rodzinnej 2014, vol 8, no 1, 27–36
key words: primary immunodeficiency diseases, immunodeficiencies, immunodiagnostics, flow
cytometry, immune system testing
WSTĘP
nologicznych (IUIS, International Union of
Pierwotne niedobory odporności (PNO) obej-
Immunological Society) w 2011 roku sklasyfi-
mują grupę chorób o zróżnicowanej etiologii
kowała PNO w 8 kategoriach [1]:
i obrazie klinicznym. Patogeneza związa-
I.
Złożone niedobory odporności.
na jest z zaburzeniami genetycznymi, które
II.
Inne dobrze zdefiniowane niedobory
powodują upośledzenie składowych układu
odpornościowego. W zależności od przewa-
odporności.
III. Niedobory z przewagą produkcji prze-
gi dysfunkcji konkretnego typu odpowiedzi
Międzynarodowa Unia Towarzystw Immu-
ciwciał.
IV. Choroby z dysregulacją odpowiedzi immunologicznej.
V.
Tabela 1
Uproszczony podział PNO uwzględniający wybrane choroby
Typ zaburzeń
Nazwa choroby
Zaburzenia odpowiedzi nabytej
Z przewagą zaburzeń
odporności humoralnej
Izolowany niedobór IgA
Wrodzone zaburzenia komórek żernych.
VI. Zaburzenia odporności wrodzonej.
VII. Zaburzenia odpowiedzi zapalnej.
VIII.Niedobory układu dopełniacza.
Każda z chorób w klasyfikacji IUIS została
Agammaglobulinemia sprzężona z chromosomem X
(choroba Brutona)
szczegółowo scharakteryzowana z uwzględ-
Pospolity zmienny niedobór odporności (CVID)
nieniem między innymi sposobu dziedzicze-
Z przewagą zaburzeń
odporności komórkowej
Zespół Di George’a
nia i częstości zachorowania. Pierwotne nie-
Z upośledzeniem
odpowiedzi typu
komórkowego
i humoralnego
Zespół Wiskotta-Aldricha
Zespół Nezelofa
Ataksja-teleangiektazja
Ciężki złożony niedobór odporności (SCID)
Zaburzenia odpowiedzi wrodzonej
Zaburzenia komórek
fagocytujących
Niedobory składników
dopełniacza
Przewlekła choroba ziarniniakowa
Zespół Chediaka-Higashiego
mechanizmów odpowiedzi swoistej (nabytej)
jak i nieswoistej (wrodzonej). Na tej podstawie można dokonać uproszczonego podziału
PNO (tab. 1).
Podstawowymi komórkami odpowiedzi
Zaburzenia przylegania leukocytów
swoistej są limfocyty T, związane z odpowie-
Niedobory wczesnych składowych dopełniacza
C1q, C1r, C2, C4
dzią komórkową i limfocyty B, warunkujące
Niedobory późnych składowych dopełniacza: C5–C9
Niedobór C3
CVID (common variable immunodeficiency) — pospolity zmienny niedobór immunologiczny; SCID
(severe combined immunodeficiency) — ciężki złożony niedobór odporności
28
dobory odporności dotyczyć mogą zarówno
odporność humoralną. Nieprawidłowości na
którymś z etapów różnicowania i dojrzewania tych komórek powodują powstawanie
niedoborów odporności. Prawidłowa funkcja
www.fmr.viamedica.pl
Edyta Brzustewicz, Ewa Bryl
Przegląd testów laboratoryjnych
przydatnych w diagnostyce pierwotnych
niedoborów odporności
limfocytów B uwarunkowana jest przez limfocyty T, toteż większość defektów w obrębie
populacji limfocytów T powoduje złożone
niedobory odporności.
W odpowiedź wrodzoną zaangażowane
są między innymi neutrofile, makrofagi, komórki dendrytyczne oraz białka układu dopełniacza. Ich zaburzenia jakościowe czy też
ilościowe powodować mogą choroby objawiające się głównie niebezpiecznymi zakażeniami
bakteryjnymi i grzybiczymi [2].
Pacjenci z PNO podatni są na nawracające
zakażenia, z tendencją do przewlekania się
i zaostrzeń. Szczegółowe zebranie wywiadu
i badanie przedmiotowe to pierwsze kroki
w rozpoznaniu choroby. Kolejnym obligatoryjnym etapem diagnostyki, pozwalającym na
połączenie objawów klinicznych ze swoistym
zaburzeniem odporności, są stopniowe, coraz
bardziej szczegółowe badania laboratoryjne.
W pierwszej kolejności powinny być przeprowadzane badania przesiewowe, a następnie
badania specjalistyczne, które są dużo trudniej dostępne i kosztowne (ryc. 1) [3, 4].
Celem tego artykułu jest przedstawienie
dostępnych badań laboratoryjnych przydatnych w diagnostyce pierwotnych niedoborów
immunologicznych. Badania podzielono ze
Rycina 1. Schemat postępowania przy podejrzeniu niedoboru odporności
względu na ukierunkowanie na rozpoznanie
określonych dysfunkcji układu odpornościo-
ilościowych leukocytów obecnych we krwi
wego, uwzględniając testy przesiewowe i spe-
obwodowej. Szczególną ostrożność należy
cjalistyczne (tab. 2).
zachować przy ocenie morfologii krwi nowo-
Zawarto także krótki opis badań mikro-
rodków. Przy wyraźnych objawach niedoboru
biologicznych przydatnych przy ocenie powi-
odporności należy skierować dziecko na dal-
kłań infekcyjnych. Ze względu na bardzo dużą
sze konsultacje [5].
różnorodność dostępnych specjalistycznych
Przesunięcia w liczbie poszczególnych ro-
testów diagnostycznych, skupiono się na tych
dzajów komórek krwi nasuwają podejrzenie
najprzydatniejszych i najszerzej dostępnych.
danego rodzaju PNO. Limfopenia sugerować
Pierwotne niedobory
odporności mogą dotyczyć
każdego elementu układu
odpornościowego
może PNO związane z dysfunkcją odpowieZNACZENIE MORFOLOGII KRWI
dzi komórkowej, neutropenia — upośledzenie
Badaniem przeprowadzanym w pierwszej
komórek fagocytujących. Istotna jest szcze-
kolejności przy podejrzeniu PNO jest pełna
gółowa ocena preparatu mikroskopowego.
morfologia krwi z mikroskopową oceną roz-
Dla przykładu w zespole Wiskotta-Aldricha
mazu. Prawidłowy wynik pozwala w większo-
obserwujemy limfopenię z trombocytopenią
ści przypadków na wykluczenie niedoborów
i nieprawidłowym wyglądem płytek krwi. Inne
immunologicznych, wynikających z zaburzeń
zmiany morfologii krwi, takie jak eozynofilia
Forum Medycyny Rodzinnej 2014, tom 8, nr 1, 27–36
29
WYBRANE
PROBLEMY
KLINICZNE
Tabela 2
Podział testów stosowanych w diagnostyce pierwotnych niedoborów
odpornościowych
Testy stosowane w diagnostyce pierwotnych niedoborów odporności
Testy oceniające
odpowiedź
humoralną
Testy skriningowe
Testy specjalistyczne
Poziom przeciwciał IgG,
IgM, IgA w surowicy
Miano podklas IgG
Miano specyficznych
przeciwciał w surowicy
Miano swoistych przeciwciał po aktywnej
immunizacji antygenowej
Miano izohemaglutynin
Ocena limfocytów B — cytometria przepływowa
Produkcja przeciwciał in vitro w odpowiedzi
na stymulację mitogenową, cytokinową lub
anty-CD40
Testy oceniające
odpowiedź
komórkową
Liczba limfocytów
Badanie nadwrażliwości
typu późnego — odczyn
tuberkulinowy
Ocena limfocytów T i NK — cytometria
przepływowa
Poziom ADA i PNP
Test transformacji blastycznej
Cytotoksyczność komórek NK
Ocena JAK3 i ZAP70 FISH — del 22q11, 10p11
Testy oceniające
fagocytozę
Ocena rozmazu krwi
obwodowej
Wytwarzanie rodników tlenowych — NBT
Ekspresja cząstek adhezyjnych — cytometria
przepływowa
Ocena chemotaksji
Ocena pochłaniania i fagocytozy
Testy oceniające
niedobory
składników
dopełniacza
Całkowita aktywność
hemolityczna dopełniacza:
CH50
Alternatywna aktywność hemolityczna
dopełniacza: AH50
Niedobór inhibitora C1 esterazy
Poziomy określonych składowych układu
dopełniacza
CH50 (total serum hemolytic complement assay) — badanie całkowitej aktywności hemolitycznej dopełniacza; ADA
— dezaminaza adenozyny; PNP — fosforylaza nukleozydów purynowych; JAK3(Janus kinase 3) — kinaza tyrozynowa 3;
ZAP70 (zeta-chain associated protein kinase 70) — niereceptorowa białkowa kinaza tyrozynowa; FISH (fluorescent in situ
hybridisation) — fluorescencyjna hybrydyzacja in situ; NBT — błękit nitrotetrazolowy; AH50 (alternative serum hemolytic
assay) — badanie alternatywnej aktywności hemolitycznej dopełniacza
W diagnostyce
PNO stosuje się
testy skriningowe
i specjalistyczne
w zespole Omenna — forma ciężkiego zło-
tujących antygen. Wskazana jest ilościowa
żonego niedoboru odporności (SCID, severe
ocena immunoglobulin, co umożliwia między
combined immunodeficiency) — czy obecność
innymi metoda nefelometryczna. Metoda im-
dużych ziarnistości w leukocytach w zespole
munoelektroforetyczna dostarcza wyników
Chediaka-Higashiego są kluczowe przy roz-
półilościowych [8]. Nieprawidłowe miana
poznaniu tych chorób [6, 7].
przeciwciał wykazuje ponad 80% pacjentów
z pierwotnymi niedoborami immunologiczny-
OCENA ODPOWIEDZI HUMORALNEJ
30
mi [6]. Na niedobór przeciwciał wskazuje wynik
Oznaczenie poziomów przeciwciał IgG,
całkowitego stężenia Ig < 400 mg/dl lub IgG
IgM, IgA
< 200 mg/dl [5]. Przy obniżonych wartościach
Jest ono niezbędne w diagnostyce PNO. Pozio-
mian przeciwciał ważne jest, by uwzględnić
my immunoglobulin pozwalają na pośrednią
możliwość ich utraty z organizmu przez prze-
ocenę kilku składowych układu immunolo-
wód pokarmowy lub moczowy [9]. Należy za-
gicznego, co związane jest z uwarunkowaniem
wsze interpretować wyniki w odniesieniu do
produkcji przeciwciał ścisłą współpracą lim-
norm dla danej grupy wiekowej. Poziom prze-
focytów B, limfocytów T i komórek prezen-
ciwciał u noworodka nie odzwierciedla własnej
www.fmr.viamedica.pl
Edyta Brzustewicz, Ewa Bryl
Przegląd testów laboratoryjnych
przydatnych w diagnostyce pierwotnych
niedoborów odporności
zdolności do produkcji, ponieważ utrzymują
całkowitym poziomem IgE, u których częste
się u niego IgG przekazane przez łożysko.
jest obniżenie poziomu IgG4 [11]. Istotność
Izolowany selektywny niedobór IgM jest
oceny podklas IgG jest jednak sporna. Bada-
bardzo rzadki. O czynności przeciwciał klasy
nie to ma ograniczoną wartość diagnostyczną
IgM mówi miano izohemaglutynin, czyli prze-
i stosunkowo wysoki koszt wykonania [6, 9].
ciwciał klasy IgM występujących naturalnie
w surowicy krwi człowieka, reagujących krzy-
Miano specyficznych przeciwciał
żowo z antygenami grup krwi [4].
w surowicy
Izolowany niedobór IgA jest najczęstszym
Pozwala ono na określenie wydolności od-
pierwotnym niedoborem immunologicznym
powiedzi humoralnej. Testami szacującymi
i występuje z częstością 1/500 [5]. Inne ze-
zdolność do odpowiedzi immunologicznej na
społy są dużo rzadsze i szacuje się je na około
antygeny białkowe są oznaczenia poziomów
1/10 000 do 1/1000 000 osób [10].
przeciwciał przeciwko anatoksynom tężca
Pod względem klinicznym PNO mogą
i błonicy po wcześniejszych szczepieniach Di-
bardzo przypominać wtórne upośledzenia
-Te. Oznaczenia te wskazują na odpowiedź
odporności powstałe między innymi podczas
immunologiczną zależną od limfocytów T. Na-
niektórych infekcji wirusowych, na przykład
tomiast odpowiedź immunologiczną niezależ-
HIV, po leczeniu immunosupresyjnym, tera-
ną od limfocytów T szacujemy poprzez ocenę
pii chorób autoimmunologicznych czy che-
przeciwciał przeciwko bakteriom otoczkowym
mioterapii nowotworów.
Nieprawidłowe miana
przeciwciał występują
u ponad 80% pacjentów
z PNO
Haemopfilus influenzae bądź Streptococcus
Manifestacja choroby może być na tyle
pneumoniae. Przy ocenie miana specyficznych
subtelna, że diagnostyka pozbawiona specja-
przeciwciał musi być uwzględniony wiek cho-
listycznych badań immunologicznych może
rego oraz jego historia szczepień i przebytych
nie pozwolić na rozpoznanie. Jednocześnie
chorób. Ze względu na brak szczegółowych,
wczesne wykrycie choroby i włączenie odpo-
dopasowanych do wieku chorego norm po-
wiedniego leczenia zapobiega nieodwracal-
ziomów specyficznych przeciwciał prakty-
nym zmianom narządów i układów [2].
kuje się ocenę wzrostu miana przeciwciał po
szczepieniu przypominającym. W tym celu
Oznaczenia podklas IgG
należy pobrać krew przed szczepieniem przy-
Oznaczenia te powinny być przeprowadzane
pominającym w celu wyjściowego oznaczenia
wraz z oceną produkcji specyficznych przeciw-
miana danych przeciwciał, a następnie dru-
ciał. W kontakcie z antygenem białkowym za-
gi raz po określonym dla danej szczepionki
chodzi produkcja przeciwciał IgG1, natomiast
odstępie czasu. Najczęściej do laboratorium
po kontakcie z antygenem polisacharydowym
dostarcza się razem obie próbki w formie za-
wzrasta głównie poziom IgG2. Przy upośle-
mrożonych surowic [5]. Szczepionki polisa-
dzonej produkcji danej podklasy IgG wzrasta
charydowe przeciwko pneumokokom stosuje
tendencja do zakażeń określonymi patogena-
się po 2 roku życia. Należy zauważyć, że brak
mi. Dla przykładu u chorych z niedoborem
odpowiedzi na szczepionkę nie zawsze jest
IgG2 obserwujemy częste zapalenia płuc wy-
jednoznaczny z niedoborem odporności. Dla
wołane bakteriami Haemophilus influenzae,
przykładu u 5–15% pacjentów nie obserwuje
które posiadają otoczkę polisacharydową.
się zmiany poziomu specyficznych przeciwciał
Badanie podklas IgG należy zawsze wykonać
po podaniu pełnej serii szczepień przeciwko
u osób z podejrzeniem izolowanego niedobo-
wirusowi zapalenia wątroby typu B. Może
ru IgA, ponieważ u chorych tych często obser-
mieć to związek ze specyficznym haplotypem
wuje się także obniżenie poziomu IgG2. Przy-
HLA, warunkującym osobniczą konfigurację
datne jest ono także u pacjentów z niskim
immunogenetyczną [12]. HBV charakteryzuje
Forum Medycyny Rodzinnej 2014, tom 8, nr 1, 27–36
31
WYBRANE
PROBLEMY
KLINICZNE
się także możliwością mutacji, zmieniających
dodatni jest bardzo pomocny w postępowaniu
specyficzność antygenu Hbs i powodujących
diagnostycznym, natomiast należy ostrożnie
uniknięcie immunizacji. Dlatego nieprawidło-
podchodzić do wyników ujemnych. Ma to
we miano specyficznych przeciwciał po szcze-
związek z faktem, że na osłabienie reakcji
pieniu należy sprawdzić przez szczepionkę
nadwrażliwości typu późnego wpływa wiele
alternatywną.
czynników, takich jak wiek, terapia sterydowa
czy przebyte choroby [9].
Testy oceniające zdolność limfocytów B
do produkcji przeciwciał po pobudzeniu
mitogenowym
Cytometria przepływowa
Ze względu na wysoką czułość, wiarygod-
Jako mitogeny stosuje się wirus Epsteina-
ność i powtarzalność wyparła ona oznacze-
-Barr (EBV), Staphylococcus aureus Cowan I,
nia histochemiczne. W ocenie subpopulacji
anty-IgM lub komórki gronkowca. Można
limfocytów T stosuje się przeciwciała mono-
stosować także stymulację cytokinową lub
klonalne przeciwko antygenom powierzch-
anty-CD40 [5].
niowym: CD2, CD3 — dla całkowitej liczby
limfocytów T, CD4 — dla limfocytów Th,
Ocena cytometryczna limfocytów B
Immunofenotypizacja
jest bardzo przydatna
w diagnostyce ciężkich
złożonych niedoborów
odporności (SCID)
CD8 — dla limfocytów Tc. Przydatne może
Opiera się ona na zasadzie swoistego przy-
być wyznaczenie stosunku komórek CD4+/
łączania znakowanych przeciwciał mono-
/CD8+ [15]. Zmniejszona wartość tego in-
klonalnych do specyficznych receptorów na
deksu może nasuwać podejrzenie wtórnego
powierzchni komórek B.
niedoboru odporności wywołanego infekcją
Limfocyty B rozpoznawane są spośród
HIV [4], obserwowana jest także w ciężkich
innych limfocytów jako komórki posiadają-
postaciach pospolitego zmiennego niedoboru
ce antygeny powierzchniowe (CD, cluster of
immunologicznego (CVID, common variable
differentiation) CD19 i CD20. Prekursory lim-
immunodeficiency) oraz idiopatycznej limfo-
focytów B, czyli komórki pre-B rozróżniane
penii komórek T CD4.
są w oparciu o detekcję ciężkich łańcuchów
W diagnostyce PNO stosuje się także prze-
μ w cytoplazmie limfocytów CD19+ [13, 14].
ciwciała przeciwko CD45RA, CD62L (komórki T naiwne), CD45RO (komórki T pamięci),
OCENA ODPOWIEDZI KOMÓRKOWEJ
Testy skórne
32
CD16, CD56 (komórki NK), CD40L [13, 14].
Określona ekspresja tych antygenów su-
Odporność typu komórkowego określana jest
gerować może dane jednostki chorobowe, jak
między innymi przy zastosowaniu testów skór-
na przykład obniżona ekspresja CD45RA na
nych. Oceniają one reakcję nadwrażliwości
limfocytach T — CVID, przewaga limfocytów
typu późnego, zależną od limfocytów T. Testy
CD45RA+ przy braku limfocytów CD19+
te polegają na podaniu śródskórnym w ob-
— agammaglobulinemia sprzężona z chro-
rębie wewnętrznej części przedramienia po
mosomem X [13]. Immunofenotypizacja jest
0,1 ml zawiesiny antygenów. Wynik jest prawi-
bardzo przydatna w diagnostyce ciężkich zło-
dłowy, gdy średnica powstałej po 2 i 3 dniach
żonych niedoborów odporności (SCID, severe
zmiany przekracza 5 cm. Najszersze zastoso-
combined immunodeficiency). Dla przykładu
wanie ma odczyn tuberkulinowy. W innych
podano poniżej kilka form SCID z charakte-
testach jako antygeny stosowane są: Candida,
rystycznym immunofenotypem.
Proteus, Trichophyton, kompleks streptokina-
—— Th−Tc−B+NK− SCID — ciężki złożony
za-streptodornaza czy paciorkowce [7]. Oce-
niedobór odporności sprzężony z chromo-
niając nadwrażliwość typu późnego, należy
somem X jest najczęściej występującą for-
sprawdzić reakcję na kilka antygenów. Wynik
mą SCID, związaną z mutacją łańcucha g
www.fmr.viamedica.pl
Edyta Brzustewicz, Ewa Bryl
Przegląd testów laboratoryjnych
przydatnych w diagnostyce pierwotnych
niedoborów odporności
(CD132). Łańcuch ten współtworzy receptory interleukinowe niezbędne dla prawi-
OCENA FAGOCYTOZY
Cytometria przepływowa
dłowego różnicowania limfocytów T i B oraz
Metodą cytometrii przepływowej można zbadać
komórek NK. W zespole tym obserwuje się
ilość receptorów CD11b i CD18 na powierzchni
całkowity brak limfocytów T i komórek NK
leukocytów. Ich obniżenie świadczy o zmniej-
oraz nieprawidłowy immunofenotyp limfo-
szeniu adhezji leukocytów. Prawidłowa ekspre-
cytów B (ekspresja na ich powierzchni IgM).
sja tych receptorów warunkuje adhezję granu-
Podobny immunofenotyp ( T-B+NK-) wy-
locytów do śródbłonków i migrację przez ścianę
stępuje w SCID z mutacją kinazy tyrozyno-
naczynia do ogniska zapalnego, co jest wstępem
wej 3 (JAK3, Janus kinase 3)
do procesu fagocytozy. Brak cząsteczek adhe-
—— T−B+NK+ SCID — niedobór receptora
zyjnych występuje w zespole zaburzonego przy-
a IL-7 — w tej formie ciężkiego złożo-
legania leukocytów (LAD-1, leukocyte adhesion
nego niedoboru odporności nie wykrywa
deficiency-1) [17].
się komórek CD3+, CD4+ CD8+ lub
gd TCR+ (T-cell receptor). Ekspresja
Testy z wykorzystaniem gradientu
IL-7aR (CD127) jest obniżona lub nie
czynnika chemotaktycznego
obserwuje się jej.
Testy te określają chemotaksje leukocytów.
—— T−B−NK+ SCID — niedobór RAG1
Mierzy się spontaniczną migrację niespola-
i RAG2 (recombination activating genes)
ryzowanych leukocytów na żelu agarozowym
— brak lub obniżona liczba limfocytów T
w kierunku czynnika chemotaktycznego
i B przy prawidłowej liczbie komórek NK.
(fMLP — formylo-metionylo-leucylo-feny-
Nietypowy fenotyp jest efektem mutacji
loalanina, C5a — składowa dopełniacza, cy-
kilku genów odpowiedzialnych za tworze-
tokina — IL-8) [7]. Także w tym przypadku
nie receptorów na komórkach B i T.
analiza cytometryczna wypiera tradycyjne me-
—— T−B−NK− SCID — niedobór dezami-
tody. Test cytometryczny, tak zwany Migra-
nazy adenozyny. Niedobór tego enzymu
Test, określa procent komórek zdolnych do
prowadzi do akumulacji w komórce tok-
przeprowadzenia efektywnej migracji w gra-
sycznych metabolitów hamujących syntezę
diencie czynnika chemotaktycznego.
W diagnostyce PNO
dotyczących komórek
fagocytujących bardzo
ważną rolę odgrywają
testy czynnościowe
DNA. U chorych występuje silna limfopenia < 500 komórek/μl.
Ocena fagocytozy
—— T+B+NK− SCID — ekspresja IL-2R
Fagocytozę, czyli zdolności neutrofilów do
I IL-15Rß wynosi poniżej 10% normy.
pochłaniania bakterii, ocenia się tradycyjnie
—— T+B+ NK+ — brak cząsteczki MHC
na podstawie średniej liczby cząstek sfagocy-
II, całkowita liczba limfocytów B i T jest
towanych przez jeden leukocyt w warunkach
w normie, populacja limfocytów T CD4+
in vitro. Po sporządzeniu zawiesiny granulo-
silnie zmniejszona, obniżona jest także
cytarnej i znakowanych bakterii, drożdży czy
ekspresja CD45RA. Brak ekspresji białek
lateksu metodą mikroskopową odczytuje się
MHC II na limfocytach B.
pochłonięte cząsteczki w 50 lub 100 fagocy-
—— złożony niedobór odporności z nadpro-
tach [7].
dukcją IgM (hyper IgM syndrome) — jest
Obecnie coraz częściej bada się zdolność
rzadkim zespołem charakteryzującym się
komórek do fagocytozy przy pomocy testu cy-
wysokim poziomem poliklonalnych IgM
tometrycznego PhagoTest. Badanie to określa
i IgD oraz obniżonym poziomem IgG, IgE
zdolność komórek do przeprowadzenia fago-
oraz IgA. U tych chorych obserwuje się
cytozy opsonizowanych bakterii Escherichia
obniżoną ekspresję CD40L (CD154) na
coli, znakowanych barwnikiem fluorescencyj-
aktywowanych limfocytach [13, 14].
nym. Wynik stanowi odsetek granulocytów
Forum Medycyny Rodzinnej 2014, tom 8, nr 1, 27–36
33
WYBRANE
PROBLEMY
KLINICZNE
cytometryczna, tak zwany BurstTest, w dużej
mierze wyparł testy z NBT [4]. Wyniki cytofluorymetrii określają procent granulocytów
zdolnych do produkcji rodników tlenowych
po stymulacji (Escherichia coli, fMLP — formylo-metionylo-leucylo-fenyloalanina, PMA
— octan mirystynianu forbolu.
OCENA UKŁADU DOPEŁNIACZA
Dopełniacz stanowi układ kilkudziesięciu białek spełniających istotną rolę głównie w nieswoistej humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Jego główne funkcje to między innymi
udział w opsonizacji i usuwaniu patogenów
oraz aktywacja reakcji zapalnej.
Niedobory dopełniacza dotyczyć mogą
każdego elementu tego układu: drogi klasyczRysunek 2. Zasada działania testu cytometrycznego do oceny zjawiska fagocytozy;
I. Próba kontrolna, fagocytoza zatrzymana poprzez inkubację w temperaturze
0°C, bardzo niska intensywność emitowanej fluorescencji; II, III — próby badane,
inkubacja w 37°C, (II) pomiar u pacjenta z dysfunkcją procesu fagocytozy,
zarejestrowano obniżony poziom fluorescencji, (III) pomiar u pacjenta zdrowego,
emisja fluorescencji w zakresie normy (70–99% — w zależności od użytego zestawu
normy różnią się)
nej (C1, C2, C4), alternatywnej (C3) czy lektynowej. Możliwy jest także defekt regulatora
dopełniacza — inhibitora C1 esterazy [10].
Badanie całkowitej aktywności
hemolitycznej dopełniacza (CH50, total
i monocytów pełnej krwi heparynizowanej,
zdolnej do aktywnej fagocytozy [rys. 2].
serum hemolytic complement assay)
Pozwala ono na detekcję większości przypadków PNO związanych z niedoborami dopełnia-
Niedobory dopełniacza
mogą dotyczyć elementów
drogi klasycznej,
alternatywnej i lektynowej
aktywacji dopełniacza
Ocena zdolności neutrofilów do
cza. Badanie polega na inkubacji opłaszczo-
wytwarzania rodników tlenowych
nych przeciwciałami krwinek baranich z su-
Zdolność zabijania sfagocytowanych bakterii
rowicą pacjenta i spektrofotometrycznym po-
oceniana jest poprzez ocenę zdolności neu-
miarze ich rozpadu. Dodana do testu objętość
trofilów do wytwarzania rodników tlenowych.
surowicy powinna spowodować lizę około 50%
Tradycyjnie służył do tego test z błękitem
krwinek zwierzęcych (stąd CH50). Nieprawi-
nitrotertrazolowym (NBT) lub z cytochro-
dłowy wynik należy zweryfikować dokładniej-
mem c. Test polega na spektrofotometrycznym
szymi specjalistycznymi testami oceniającymi
pomiarze zmiany absorpcji światła spowodo-
każdą ze składowych dopełniacza [5].
wanej redukcją barwnika przez uwalniane rodniki tlenowe. Test przydatny jest szczególnie
w diagnostyce przewlekłej choroby ziarninia-
Metodami oceny poszczególnych składni-
kowej i zespole Chediaka-Higashiego. U osób
ków są nefelometria, turbidymetria bądź
dotkniętych tymi jednostkami chorobowymi
test immunoenzymatyczny (ELISA, enzy-
produkcja nadtlenków jest znacznie upośle-
me-linked immunosorbent assay) [7]. Ob-
dzona, w efekcie czego nie powstaje produkt
niżone poziomy C3 i C4 wskazują na stałe
reakcji redukcji barwnika [5].
zużycie dopełniacza, co charakterystyczne
Obecnie test czynnościowy oceniający
wybuch tlenowy wykonywany jako analiza
34
Oceny poszczególnych składników
jest w przypadku powstawania kompleksów
immunologicznych [4].
www.fmr.viamedica.pl
Edyta Brzustewicz, Ewa Bryl
Przegląd testów laboratoryjnych
przydatnych w diagnostyce pierwotnych
niedoborów odporności
Badanie alternatywnej aktywności
Tabela 3
hemolitycznej dopełniacza (AH50,
Najczęstsze rodzaje zakażeń w poszczególnych grupach
pierwotnych niedoborów immunologicznych [17]
alternative serum hemolytic assay)
Niedobory składowych alternatywnej drogi
Typ zaburzenia
odporności
Typowe patogeny
Zaburzenia odporności
humoralnej
Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae,
Campylobacter, Yersinia, Giargia intestinalis,
Mycoplasma, enterowirusy
lytic assay). Test ten wykorzystuje technikę
Zaburzenia odporności
komórkowej i złożone
niedobory odporności
Haemophilus influenza, Streptococcus pneumonia,
prątki gruźlicy, Candida, Aspergillus, Cryptosporidium,
HSV, CMV, EBV, RSV, adenowirusy
immunodyfuzji radialnej. Surowicę pacjenta
Zaburzenia fagocytozy
Staphylococcus aureus, jelitowe pałeczki G(–), Serratia
marcescens, Mycobacterium bovis, Aspergillus
Zaburzenia układu
dopełniacza
Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumonia,
Neisseria
aktywacji dopełniacza są niezmiernie rzadkie [6]. Do ich oceny wykorzystuję się badanie alternatywnej aktywności hemolitycznej
dopełniacza (AH50, alternative serum hemo-
nakłada się na żel agarozowy zawierający kurze krwinki czerwone. Następuje aktywacja
alternatywnej drogi dopełniacza, której aktywność jest proporcjonalna do obszaru zli-
HSV (Herpes simplex virus) — wirus opryszczki pospolitej; CMV (Cytomegalovirus) — wirus cytomegalii;
EBV — wirus Epsteina-Barr; RSV — respiratory syncytial virus
zowanych krwinek [16].
Stłumienie obu indeksów CH50 i AH50
moralnej. Dla przykładu u pacjenta ze złożo-
wskazuje na defekty końcowych składowych
nym niedoborem odporności wyniki IgG, IgM
dopełniacza (C5, C6,C7, C8), tworzących ze-
mogą być ujemne mimo zakażenia wirusem.
spół atakujący błonę komórki [4].
Lekarz powinien przy interpretacji wyników
uwzględnić także terapię dożylną czy podskór-
DIAGNOSTYKA POWIKŁAŃ INFEKCYJNYCH W PNO
ną immunoglobulinami.
Istota diagnostyki mikrobiologicznej wynika
Popełniane błędy mogą być dla chorych
nie tylko z konieczności zapobiegania i lecze-
bardzo poważne w skutkach. Należy podkre-
nia powikłań infekcyjnych, ale może dostar-
ślić znaczenie techniki reakcji łańcuchowej
czyć także informacji o rodzaju niedoboru
polimerazy (PCR, polymerase chain reaction)
odporności.
w diagnostyce infekcji u chorych z PNO [17].
Zaburzenia określonego elementu układu
immunologicznego zwiększają podatność na
ZNACZENIE BADAŃ GENETYCZNYCH
określone patogeny (tab. 3).
Pierwotne niedobory odporności są chorobami
Zakażenia u chorych z PNO mają charak-
o podłożu genetycznym. Mają różny charakter,
ter przewlekły i często nawracający. Najczę-
mogą być sprzężone z chromosomem X bądź
ściej dotyczą układu oddechowego, rzadziej
są autosomalne dominujące lub recesywne.
układu pokarmowego i skóry. U takich cho-
Obecnie szybko rozwijającą się gałęzią
rych możliwe są zakażenia nie tylko drobno-
diagnostyki jest immunogenetyka. Znamy
ustrojami patogennymi, ale także oportuni-
szereg metod, takich jak fluorescencyjna hy-
stycznymi, między innymi Cryptosporidium,
brydyzacja in situ (FISH, fluorescent in situ hy-
Candida, Staphylococcus aureus, Mycobacte-
bridization), hybrydyzacja metodą Southerna
rium czy wirusem cytomegalii.
(SB, Southern blotting), hybrydyzacja northern
W diagnostyce mikrobiologicznej pacjen-
(NB, northern blotting), rekombinowanie
tów z PNO istnieje wiele problematycznych
i klonowanie DNA, przydatnych w ustaleniu
kwestii. Ze względu na źle dobrany materiał
czynnika odpowiadającego za chorobę [10].
do badań czy na włączenie antybiotykoterapii
Analiza molekularna nie pozwala jednak na
u chorych posiewy mikrobiologiczne często
jasne przyporządkowanie wadliwego genu do
dają wyniki ujemne. Podobnie badania serolo-
określonej jednostki chorobowej. Ma to zwią-
giczne mogą dawać wyniki fałszywie ujemne.
zek z tym, że mutacja tych samych genów może
Ma to związek z zaburzeniami odpowiedzi hu-
powodować różne objawy kliniczne.
Forum Medycyny Rodzinnej 2014, tom 8, nr 1, 27–36
Zaburzenia określonego
elementu układu
immunologicznego
zwiększają podatność
na określone patogeny.
Zakażenia w PNO mają
charakter przewlekły
i często nawracający
35
WYBRANE
PROBLEMY
KLINICZNE
Pierwotny niedobór odporności był pierw-
kłaniom. Niestety wciąż duża część pacjen-
szą chorobą wrodzoną, w której zastosowano
tów zostaje zdiagnozowana zbyt późno mimo
terapię genową. Zanotowano sukces w tera-
częstych hospitalizacji, spowodowanych ty-
pii genowej SCID z niedoborem deaminazy
powymi dla PNO infekcjami. Szybki rozwój
adenozynowej oraz w kilku innych zespołach.
nowoczesnych technik diagnostyki laborato-
Dalsze badania są obiecujące. Dodatkowo ba-
ryjnej wymaga od lekarza ciągłej aktualizacji
dania genetyczne mają znaczenie w diagno-
wiedzy w tej dziedzinie. Lekarz pierwszego
styce prenatalnej.
kontaktu powinien skierować pacjenta z charakterystycznymi symptomami na konsultacje
ZAKOŃCZENIE
specjalistyczne. Dalsza szczegółowa diagnoza,
Prawidłowa i szybka diagnoza pacjentów
obejmująca opisane w niniejszym artykule ba-
z PNO pozwala na wprowadzanie skutecznej
dania laboratoryjne, pozwoli na trafne posta-
terapii i zapobieganie niebezpiecznym powi-
wienie diagnozy.
PIŚMIENNICTWO
1. Capel H. Classification of primary immunodeficiency
10. Zeman K., Szałowska D. Pierwotne niedobory od-
diseases by the international Union of Immunologi-
porności — ważna grupa rzadkich chorób uwarun-
cal Societies (IUIS) Expert Committee on Primary
kowanych genetycznie. Przegląd pediatryczny 2006;
Immunodeficiency 2011. Clinical and Experimental
Immunology 2011; 168: 58–59.
2. McCuster Ch., Warrington R. Primary immunodeficiency.
munodeficiency: a multi-stage diagnostic protocol
Allergy Asthma & Clinical Immunology 2011; 7 (1): 1–11.
designed for non-immunologists. Clinical and Experi-
3. Cooper M., Pommering T., Koranyi K. Primary Immunode-
mental Immunology 2006; 145: 204–214.
ficiencies. Am. Fam. Physician 2003; 68 (10): 2002–2008.
12. Fried A.J., Bonnila L., Pathogenesis, diagnosis and
4. Chinratanapisit S., Sriaroon P., Sleasman J. W., Good
management of primary antibody deficiencies and
R. A. Diagnostyka osoby dorosłej z podejrzeniem
infections. Clinical Microbiology Reviews 2009; 22
niedoboru odporności. Witryna Word Allergy Organization, 2008.
5. Dizon J.G., Goldberg B.J., Kaplan M.S. Diagnostyka
niedoborów odporności. Medycyna praktyczna —
pediatria 2000; 4: 98–109.
6. Lederman H.M. The clinical presentation of primary
immunodeficiency diseases. Clinical Focus on Primary Deficiencies, 2000; 2 (1).
7. Dembińska-Kieć A., Naskalski J.W. Diagnostyka laboratoryjna z elementami biochemii klinicznej. Wrocław
2010: 851–859.
8. Ballow M. Primary immunodeficiency disorders: Antibody deficiency. J. Allergy Clin. Immunol. 2002; 109
(4): 581–591.
36
36 (4): 251–257.
11. Vries E., Patient-centred screening for primary im-
(3): 396–414.
13. Illoh Orieji C. Current application of flow cytometry
in diagnosis of primary immunodeficiency diseases.
Arch. Pathol. Lab. Med. 2004; 128: 23–31.
14. O’gorman M. Role of flow cytometry in the diagnosis
and monitoring of primary immunodeficiency diseases. Clin. Lab. Med. 2007; 27: 591–626.
15. Kopeć-Szlęzak J. Subpopulacje limfocytów T. Onkol.
Pol. 2005; 8 (1): 17–20.
16. Bonnila F.A., Bernstein L., Khan D. A i wsp. Practice
parameter for the diagnosis and management of primary immunodeficiency. 2005: 94.
17. Wolska-Kuśnierz B., Kurenko-Deptuch M., Bernatowska E. Trudności w rozpoznawaniu i leczeniu
9. Primary immunodeficiency diseases — raport of an
powikłań infekcyjnych u chorych z pierwotnymi
IUIS Scientific Committee. Clin. Exp. Immunol. 1999;
niedoborami odporności. Przeg. Epidemiol. 2008;
118 (1): 1–28.
62: 123–131.
www.fmr.viamedica.pl
Download