Przegląd testów laboratoryjnych przydatnych w diagnostyce
advertisement
WYBRANE PROBLEMY KLINICZNE Przegląd testów laboratoryjnych przydatnych w diagnostyce pierwotnych niedoborów odporności Edyta Brzustewicz, Ewa Bryl Zakład Patologii i Reumatologii Doświadczalnej, Gdański Uniwersytet Medyczny Review of laboratory tests using in diagnosis of primary immunodeficiency diseases STRESZCZENIE Pierwotne niedobory odporności (PNO) obejmują grupę około 150 chorób, których patofizjologia dotyczyć może każdej składowej niespecyficznej i specyficznej odpowiedzi immunologicznej. Przy podejrzeniu PNO należy podjąć szereg badań dążących do ustalenia trafnej diagnozy, a badania laboratoryjne są nieodzownym ich elementem. Wyróżnić można testy podstawowe i specjalistyczne. Morfologia krwi z rozmazem mikroskopowym jest badaniem pierwszego rzutu. Inne testy pozwalają na ocenę odpowiedzi humoralnej, komórkowej, fagocytozy oraz układu dopełniacza. Rozwój nowoczesnych technik laboratoryjnych ułatwia postawienie trafnej diagnozy. Szczególną rolę odgrywa cytometria przepływowa, która umożliwia ocenę ilościową i jakościową ekspresji określonych antygenów powierzchniowych, istotnych dla PNO. Technika ta wyparła także tradycyjne metody oceny funkcji fagocytów. Należy podkreślić również znaczenie immunogenetyki, jako dziedziny dynamicznie rozwijającej się. Częste nawracające zakażenia u pacjentów z PNO wymagają odpowiedniej diagnostyki mikrobiologicznej. Forum Medycyny Rodzinnej 2014, tom 8, nr 1, 27–36 słowa kluczowe: pierwotne niedobory odporności, niedobory immunologiczne, immunodiagnostyka, cytometria przepływowa, badanie układu odpornościowego ABSTRACT Primary immunodeficiency diseases (PID) are heterogenous group of disorders including about 150 their different forms. These systemic disorders with multifactorial etiology can affect specific and nonspecific immune responses. The majority of PID arises from defects of B-cells development and function. However, some disorders are associated with defects in T cells, phagocytes or elements of complement system. Frequent recurrent infections Adres do korespondencji: dr hab. Ewa Bryl, prof. nadzw. GUMed Zakład Patologii i Reumatologii Doświadczalnej Gdański Uniwersytet Medyczny ul. Dębinki 7, 80–210 Gdańsk e-mail: [email protected] can suggest PID and require diagnostic procedures, both basic and specialistic. The full blood count with microscopic smear is a first-line study. There are available numerous Copyright © 2014 Via Medica ISSN 1897–3590 27 WYBRANE PROBLEMY KLINICZNE tests which assess B-cell, T-cell or combined T- and B-cell immunological functions. Some other basic mechanisms which play crucial role in pathomechanism of PID (phagocytosis, complement or cytokines functions) need to be investigated. Develoment of new advanced laboratory techniques helps to find accurate diagnosis. One of the most important method is flow cytometry, which allows the characterization of abnormalities of immune cells. We should underline growing role of immunogenetics in diagnosis and expanding our understanding of PID. There is also importance of early diagnosis and management of infectious complications, which can also be intricate in primary immunodeficiencies. Forum Medycyny Rodzinnej 2014, vol 8, no 1, 27–36 key words: primary immunodeficiency diseases, immunodeficiencies, immunodiagnostics, flow cytometry, immune system testing WSTĘP nologicznych (IUIS, International Union of Pierwotne niedobory odporności (PNO) obej- Immunological Society) w 2011 roku sklasyfi- mują grupę chorób o zróżnicowanej etiologii kowała PNO w 8 kategoriach [1]: i obrazie klinicznym. Patogeneza związa- I. Złożone niedobory odporności. na jest z zaburzeniami genetycznymi, które II. Inne dobrze zdefiniowane niedobory powodują upośledzenie składowych układu odpornościowego. W zależności od przewa- odporności. III. Niedobory z przewagą produkcji prze- gi dysfunkcji konkretnego typu odpowiedzi Międzynarodowa Unia Towarzystw Immu- ciwciał. IV. Choroby z dysregulacją odpowiedzi immunologicznej. V. Tabela 1 Uproszczony podział PNO uwzględniający wybrane choroby Typ zaburzeń Nazwa choroby Zaburzenia odpowiedzi nabytej Z przewagą zaburzeń odporności humoralnej Izolowany niedobór IgA Wrodzone zaburzenia komórek żernych. VI. Zaburzenia odporności wrodzonej. VII. Zaburzenia odpowiedzi zapalnej. VIII.Niedobory układu dopełniacza. Każda z chorób w klasyfikacji IUIS została Agammaglobulinemia sprzężona z chromosomem X (choroba Brutona) szczegółowo scharakteryzowana z uwzględ- Pospolity zmienny niedobór odporności (CVID) nieniem między innymi sposobu dziedzicze- Z przewagą zaburzeń odporności komórkowej Zespół Di George’a nia i częstości zachorowania. Pierwotne nie- Z upośledzeniem odpowiedzi typu komórkowego i humoralnego Zespół Wiskotta-Aldricha Zespół Nezelofa Ataksja-teleangiektazja Ciężki złożony niedobór odporności (SCID) Zaburzenia odpowiedzi wrodzonej Zaburzenia komórek fagocytujących Niedobory składników dopełniacza Przewlekła choroba ziarniniakowa Zespół Chediaka-Higashiego mechanizmów odpowiedzi swoistej (nabytej) jak i nieswoistej (wrodzonej). Na tej podstawie można dokonać uproszczonego podziału PNO (tab. 1). Podstawowymi komórkami odpowiedzi Zaburzenia przylegania leukocytów swoistej są limfocyty T, związane z odpowie- Niedobory wczesnych składowych dopełniacza C1q, C1r, C2, C4 dzią komórkową i limfocyty B, warunkujące Niedobory późnych składowych dopełniacza: C5–C9 Niedobór C3 CVID (common variable immunodeficiency) — pospolity zmienny niedobór immunologiczny; SCID (severe combined immunodeficiency) — ciężki złożony niedobór odporności 28 dobory odporności dotyczyć mogą zarówno odporność humoralną. Nieprawidłowości na którymś z etapów różnicowania i dojrzewania tych komórek powodują powstawanie niedoborów odporności. Prawidłowa funkcja www.fmr.viamedica.pl Edyta Brzustewicz, Ewa Bryl Przegląd testów laboratoryjnych przydatnych w diagnostyce pierwotnych niedoborów odporności limfocytów B uwarunkowana jest przez limfocyty T, toteż większość defektów w obrębie populacji limfocytów T powoduje złożone niedobory odporności. W odpowiedź wrodzoną zaangażowane są między innymi neutrofile, makrofagi, komórki dendrytyczne oraz białka układu dopełniacza. Ich zaburzenia jakościowe czy też ilościowe powodować mogą choroby objawiające się głównie niebezpiecznymi zakażeniami bakteryjnymi i grzybiczymi [2]. Pacjenci z PNO podatni są na nawracające zakażenia, z tendencją do przewlekania się i zaostrzeń. Szczegółowe zebranie wywiadu i badanie przedmiotowe to pierwsze kroki w rozpoznaniu choroby. Kolejnym obligatoryjnym etapem diagnostyki, pozwalającym na połączenie objawów klinicznych ze swoistym zaburzeniem odporności, są stopniowe, coraz bardziej szczegółowe badania laboratoryjne. W pierwszej kolejności powinny być przeprowadzane badania przesiewowe, a następnie badania specjalistyczne, które są dużo trudniej dostępne i kosztowne (ryc. 1) [3, 4]. Celem tego artykułu jest przedstawienie dostępnych badań laboratoryjnych przydatnych w diagnostyce pierwotnych niedoborów immunologicznych. Badania podzielono ze Rycina 1. Schemat postępowania przy podejrzeniu niedoboru odporności względu na ukierunkowanie na rozpoznanie określonych dysfunkcji układu odpornościo- ilościowych leukocytów obecnych we krwi wego, uwzględniając testy przesiewowe i spe- obwodowej. Szczególną ostrożność należy cjalistyczne (tab. 2). zachować przy ocenie morfologii krwi nowo- Zawarto także krótki opis badań mikro- rodków. Przy wyraźnych objawach niedoboru biologicznych przydatnych przy ocenie powi- odporności należy skierować dziecko na dal- kłań infekcyjnych. Ze względu na bardzo dużą sze konsultacje [5]. różnorodność dostępnych specjalistycznych Przesunięcia w liczbie poszczególnych ro- testów diagnostycznych, skupiono się na tych dzajów komórek krwi nasuwają podejrzenie najprzydatniejszych i najszerzej dostępnych. danego rodzaju PNO. Limfopenia sugerować Pierwotne niedobory odporności mogą dotyczyć każdego elementu układu odpornościowego może PNO związane z dysfunkcją odpowieZNACZENIE MORFOLOGII KRWI dzi komórkowej, neutropenia — upośledzenie Badaniem przeprowadzanym w pierwszej komórek fagocytujących. Istotna jest szcze- kolejności przy podejrzeniu PNO jest pełna gółowa ocena preparatu mikroskopowego. morfologia krwi z mikroskopową oceną roz- Dla przykładu w zespole Wiskotta-Aldricha mazu. Prawidłowy wynik pozwala w większo- obserwujemy limfopenię z trombocytopenią ści przypadków na wykluczenie niedoborów i nieprawidłowym wyglądem płytek krwi. Inne immunologicznych, wynikających z zaburzeń zmiany morfologii krwi, takie jak eozynofilia Forum Medycyny Rodzinnej 2014, tom 8, nr 1, 27–36 29 WYBRANE PROBLEMY KLINICZNE Tabela 2 Podział testów stosowanych w diagnostyce pierwotnych niedoborów odpornościowych Testy stosowane w diagnostyce pierwotnych niedoborów odporności Testy oceniające odpowiedź humoralną Testy skriningowe Testy specjalistyczne Poziom przeciwciał IgG, IgM, IgA w surowicy Miano podklas IgG Miano specyficznych przeciwciał w surowicy Miano swoistych przeciwciał po aktywnej immunizacji antygenowej Miano izohemaglutynin Ocena limfocytów B — cytometria przepływowa Produkcja przeciwciał in vitro w odpowiedzi na stymulację mitogenową, cytokinową lub anty-CD40 Testy oceniające odpowiedź komórkową Liczba limfocytów Badanie nadwrażliwości typu późnego — odczyn tuberkulinowy Ocena limfocytów T i NK — cytometria przepływowa Poziom ADA i PNP Test transformacji blastycznej Cytotoksyczność komórek NK Ocena JAK3 i ZAP70 FISH — del 22q11, 10p11 Testy oceniające fagocytozę Ocena rozmazu krwi obwodowej Wytwarzanie rodników tlenowych — NBT Ekspresja cząstek adhezyjnych — cytometria przepływowa Ocena chemotaksji Ocena pochłaniania i fagocytozy Testy oceniające niedobory składników dopełniacza Całkowita aktywność hemolityczna dopełniacza: CH50 Alternatywna aktywność hemolityczna dopełniacza: AH50 Niedobór inhibitora C1 esterazy Poziomy określonych składowych układu dopełniacza CH50 (total serum hemolytic complement assay) — badanie całkowitej aktywności hemolitycznej dopełniacza; ADA — dezaminaza adenozyny; PNP — fosforylaza nukleozydów purynowych; JAK3(Janus kinase 3) — kinaza tyrozynowa 3; ZAP70 (zeta-chain associated protein kinase 70) — niereceptorowa białkowa kinaza tyrozynowa; FISH (fluorescent in situ hybridisation) — fluorescencyjna hybrydyzacja in situ; NBT — błękit nitrotetrazolowy; AH50 (alternative serum hemolytic assay) — badanie alternatywnej aktywności hemolitycznej dopełniacza W diagnostyce PNO stosuje się testy skriningowe i specjalistyczne w zespole Omenna — forma ciężkiego zło- tujących antygen. Wskazana jest ilościowa żonego niedoboru odporności (SCID, severe ocena immunoglobulin, co umożliwia między combined immunodeficiency) — czy obecność innymi metoda nefelometryczna. Metoda im- dużych ziarnistości w leukocytach w zespole munoelektroforetyczna dostarcza wyników Chediaka-Higashiego są kluczowe przy roz- półilościowych [8]. Nieprawidłowe miana poznaniu tych chorób [6, 7]. przeciwciał wykazuje ponad 80% pacjentów z pierwotnymi niedoborami immunologiczny- OCENA ODPOWIEDZI HUMORALNEJ 30 mi [6]. Na niedobór przeciwciał wskazuje wynik Oznaczenie poziomów przeciwciał IgG, całkowitego stężenia Ig < 400 mg/dl lub IgG IgM, IgA < 200 mg/dl [5]. Przy obniżonych wartościach Jest ono niezbędne w diagnostyce PNO. Pozio- mian przeciwciał ważne jest, by uwzględnić my immunoglobulin pozwalają na pośrednią możliwość ich utraty z organizmu przez prze- ocenę kilku składowych układu immunolo- wód pokarmowy lub moczowy [9]. Należy za- gicznego, co związane jest z uwarunkowaniem wsze interpretować wyniki w odniesieniu do produkcji przeciwciał ścisłą współpracą lim- norm dla danej grupy wiekowej. Poziom prze- focytów B, limfocytów T i komórek prezen- ciwciał u noworodka nie odzwierciedla własnej www.fmr.viamedica.pl Edyta Brzustewicz, Ewa Bryl Przegląd testów laboratoryjnych przydatnych w diagnostyce pierwotnych niedoborów odporności zdolności do produkcji, ponieważ utrzymują całkowitym poziomem IgE, u których częste się u niego IgG przekazane przez łożysko. jest obniżenie poziomu IgG4 [11]. Istotność Izolowany selektywny niedobór IgM jest oceny podklas IgG jest jednak sporna. Bada- bardzo rzadki. O czynności przeciwciał klasy nie to ma ograniczoną wartość diagnostyczną IgM mówi miano izohemaglutynin, czyli prze- i stosunkowo wysoki koszt wykonania [6, 9]. ciwciał klasy IgM występujących naturalnie w surowicy krwi człowieka, reagujących krzy- Miano specyficznych przeciwciał żowo z antygenami grup krwi [4]. w surowicy Izolowany niedobór IgA jest najczęstszym Pozwala ono na określenie wydolności od- pierwotnym niedoborem immunologicznym powiedzi humoralnej. Testami szacującymi i występuje z częstością 1/500 [5]. Inne ze- zdolność do odpowiedzi immunologicznej na społy są dużo rzadsze i szacuje się je na około antygeny białkowe są oznaczenia poziomów 1/10 000 do 1/1000 000 osób [10]. przeciwciał przeciwko anatoksynom tężca Pod względem klinicznym PNO mogą i błonicy po wcześniejszych szczepieniach Di- bardzo przypominać wtórne upośledzenia -Te. Oznaczenia te wskazują na odpowiedź odporności powstałe między innymi podczas immunologiczną zależną od limfocytów T. Na- niektórych infekcji wirusowych, na przykład tomiast odpowiedź immunologiczną niezależ- HIV, po leczeniu immunosupresyjnym, tera- ną od limfocytów T szacujemy poprzez ocenę pii chorób autoimmunologicznych czy che- przeciwciał przeciwko bakteriom otoczkowym mioterapii nowotworów. Nieprawidłowe miana przeciwciał występują u ponad 80% pacjentów z PNO Haemopfilus influenzae bądź Streptococcus Manifestacja choroby może być na tyle pneumoniae. Przy ocenie miana specyficznych subtelna, że diagnostyka pozbawiona specja- przeciwciał musi być uwzględniony wiek cho- listycznych badań immunologicznych może rego oraz jego historia szczepień i przebytych nie pozwolić na rozpoznanie. Jednocześnie chorób. Ze względu na brak szczegółowych, wczesne wykrycie choroby i włączenie odpo- dopasowanych do wieku chorego norm po- wiedniego leczenia zapobiega nieodwracal- ziomów specyficznych przeciwciał prakty- nym zmianom narządów i układów [2]. kuje się ocenę wzrostu miana przeciwciał po szczepieniu przypominającym. W tym celu Oznaczenia podklas IgG należy pobrać krew przed szczepieniem przy- Oznaczenia te powinny być przeprowadzane pominającym w celu wyjściowego oznaczenia wraz z oceną produkcji specyficznych przeciw- miana danych przeciwciał, a następnie dru- ciał. W kontakcie z antygenem białkowym za- gi raz po określonym dla danej szczepionki chodzi produkcja przeciwciał IgG1, natomiast odstępie czasu. Najczęściej do laboratorium po kontakcie z antygenem polisacharydowym dostarcza się razem obie próbki w formie za- wzrasta głównie poziom IgG2. Przy upośle- mrożonych surowic [5]. Szczepionki polisa- dzonej produkcji danej podklasy IgG wzrasta charydowe przeciwko pneumokokom stosuje tendencja do zakażeń określonymi patogena- się po 2 roku życia. Należy zauważyć, że brak mi. Dla przykładu u chorych z niedoborem odpowiedzi na szczepionkę nie zawsze jest IgG2 obserwujemy częste zapalenia płuc wy- jednoznaczny z niedoborem odporności. Dla wołane bakteriami Haemophilus influenzae, przykładu u 5–15% pacjentów nie obserwuje które posiadają otoczkę polisacharydową. się zmiany poziomu specyficznych przeciwciał Badanie podklas IgG należy zawsze wykonać po podaniu pełnej serii szczepień przeciwko u osób z podejrzeniem izolowanego niedobo- wirusowi zapalenia wątroby typu B. Może ru IgA, ponieważ u chorych tych często obser- mieć to związek ze specyficznym haplotypem wuje się także obniżenie poziomu IgG2. Przy- HLA, warunkującym osobniczą konfigurację datne jest ono także u pacjentów z niskim immunogenetyczną [12]. HBV charakteryzuje Forum Medycyny Rodzinnej 2014, tom 8, nr 1, 27–36 31 WYBRANE PROBLEMY KLINICZNE się także możliwością mutacji, zmieniających dodatni jest bardzo pomocny w postępowaniu specyficzność antygenu Hbs i powodujących diagnostycznym, natomiast należy ostrożnie uniknięcie immunizacji. Dlatego nieprawidło- podchodzić do wyników ujemnych. Ma to we miano specyficznych przeciwciał po szcze- związek z faktem, że na osłabienie reakcji pieniu należy sprawdzić przez szczepionkę nadwrażliwości typu późnego wpływa wiele alternatywną. czynników, takich jak wiek, terapia sterydowa czy przebyte choroby [9]. Testy oceniające zdolność limfocytów B do produkcji przeciwciał po pobudzeniu mitogenowym Cytometria przepływowa Ze względu na wysoką czułość, wiarygod- Jako mitogeny stosuje się wirus Epsteina- ność i powtarzalność wyparła ona oznacze- -Barr (EBV), Staphylococcus aureus Cowan I, nia histochemiczne. W ocenie subpopulacji anty-IgM lub komórki gronkowca. Można limfocytów T stosuje się przeciwciała mono- stosować także stymulację cytokinową lub klonalne przeciwko antygenom powierzch- anty-CD40 [5]. niowym: CD2, CD3 — dla całkowitej liczby limfocytów T, CD4 — dla limfocytów Th, Ocena cytometryczna limfocytów B Immunofenotypizacja jest bardzo przydatna w diagnostyce ciężkich złożonych niedoborów odporności (SCID) CD8 — dla limfocytów Tc. Przydatne może Opiera się ona na zasadzie swoistego przy- być wyznaczenie stosunku komórek CD4+/ łączania znakowanych przeciwciał mono- /CD8+ [15]. Zmniejszona wartość tego in- klonalnych do specyficznych receptorów na deksu może nasuwać podejrzenie wtórnego powierzchni komórek B. niedoboru odporności wywołanego infekcją Limfocyty B rozpoznawane są spośród HIV [4], obserwowana jest także w ciężkich innych limfocytów jako komórki posiadają- postaciach pospolitego zmiennego niedoboru ce antygeny powierzchniowe (CD, cluster of immunologicznego (CVID, common variable differentiation) CD19 i CD20. Prekursory lim- immunodeficiency) oraz idiopatycznej limfo- focytów B, czyli komórki pre-B rozróżniane penii komórek T CD4. są w oparciu o detekcję ciężkich łańcuchów W diagnostyce PNO stosuje się także prze- μ w cytoplazmie limfocytów CD19+ [13, 14]. ciwciała przeciwko CD45RA, CD62L (komórki T naiwne), CD45RO (komórki T pamięci), OCENA ODPOWIEDZI KOMÓRKOWEJ Testy skórne 32 CD16, CD56 (komórki NK), CD40L [13, 14]. Określona ekspresja tych antygenów su- Odporność typu komórkowego określana jest gerować może dane jednostki chorobowe, jak między innymi przy zastosowaniu testów skór- na przykład obniżona ekspresja CD45RA na nych. Oceniają one reakcję nadwrażliwości limfocytach T — CVID, przewaga limfocytów typu późnego, zależną od limfocytów T. Testy CD45RA+ przy braku limfocytów CD19+ te polegają na podaniu śródskórnym w ob- — agammaglobulinemia sprzężona z chro- rębie wewnętrznej części przedramienia po mosomem X [13]. Immunofenotypizacja jest 0,1 ml zawiesiny antygenów. Wynik jest prawi- bardzo przydatna w diagnostyce ciężkich zło- dłowy, gdy średnica powstałej po 2 i 3 dniach żonych niedoborów odporności (SCID, severe zmiany przekracza 5 cm. Najszersze zastoso- combined immunodeficiency). Dla przykładu wanie ma odczyn tuberkulinowy. W innych podano poniżej kilka form SCID z charakte- testach jako antygeny stosowane są: Candida, rystycznym immunofenotypem. Proteus, Trichophyton, kompleks streptokina- —— Th−Tc−B+NK− SCID — ciężki złożony za-streptodornaza czy paciorkowce [7]. Oce- niedobór odporności sprzężony z chromo- niając nadwrażliwość typu późnego, należy somem X jest najczęściej występującą for- sprawdzić reakcję na kilka antygenów. Wynik mą SCID, związaną z mutacją łańcucha g www.fmr.viamedica.pl Edyta Brzustewicz, Ewa Bryl Przegląd testów laboratoryjnych przydatnych w diagnostyce pierwotnych niedoborów odporności (CD132). Łańcuch ten współtworzy receptory interleukinowe niezbędne dla prawi- OCENA FAGOCYTOZY Cytometria przepływowa dłowego różnicowania limfocytów T i B oraz Metodą cytometrii przepływowej można zbadać komórek NK. W zespole tym obserwuje się ilość receptorów CD11b i CD18 na powierzchni całkowity brak limfocytów T i komórek NK leukocytów. Ich obniżenie świadczy o zmniej- oraz nieprawidłowy immunofenotyp limfo- szeniu adhezji leukocytów. Prawidłowa ekspre- cytów B (ekspresja na ich powierzchni IgM). sja tych receptorów warunkuje adhezję granu- Podobny immunofenotyp ( T-B+NK-) wy- locytów do śródbłonków i migrację przez ścianę stępuje w SCID z mutacją kinazy tyrozyno- naczynia do ogniska zapalnego, co jest wstępem wej 3 (JAK3, Janus kinase 3) do procesu fagocytozy. Brak cząsteczek adhe- —— T−B+NK+ SCID — niedobór receptora zyjnych występuje w zespole zaburzonego przy- a IL-7 — w tej formie ciężkiego złożo- legania leukocytów (LAD-1, leukocyte adhesion nego niedoboru odporności nie wykrywa deficiency-1) [17]. się komórek CD3+, CD4+ CD8+ lub gd TCR+ (T-cell receptor). Ekspresja Testy z wykorzystaniem gradientu IL-7aR (CD127) jest obniżona lub nie czynnika chemotaktycznego obserwuje się jej. Testy te określają chemotaksje leukocytów. —— T−B−NK+ SCID — niedobór RAG1 Mierzy się spontaniczną migrację niespola- i RAG2 (recombination activating genes) ryzowanych leukocytów na żelu agarozowym — brak lub obniżona liczba limfocytów T w kierunku czynnika chemotaktycznego i B przy prawidłowej liczbie komórek NK. (fMLP — formylo-metionylo-leucylo-feny- Nietypowy fenotyp jest efektem mutacji loalanina, C5a — składowa dopełniacza, cy- kilku genów odpowiedzialnych za tworze- tokina — IL-8) [7]. Także w tym przypadku nie receptorów na komórkach B i T. analiza cytometryczna wypiera tradycyjne me- —— T−B−NK− SCID — niedobór dezami- tody. Test cytometryczny, tak zwany Migra- nazy adenozyny. Niedobór tego enzymu Test, określa procent komórek zdolnych do prowadzi do akumulacji w komórce tok- przeprowadzenia efektywnej migracji w gra- sycznych metabolitów hamujących syntezę diencie czynnika chemotaktycznego. W diagnostyce PNO dotyczących komórek fagocytujących bardzo ważną rolę odgrywają testy czynnościowe DNA. U chorych występuje silna limfopenia < 500 komórek/μl. Ocena fagocytozy —— T+B+NK− SCID — ekspresja IL-2R Fagocytozę, czyli zdolności neutrofilów do I IL-15Rß wynosi poniżej 10% normy. pochłaniania bakterii, ocenia się tradycyjnie —— T+B+ NK+ — brak cząsteczki MHC na podstawie średniej liczby cząstek sfagocy- II, całkowita liczba limfocytów B i T jest towanych przez jeden leukocyt w warunkach w normie, populacja limfocytów T CD4+ in vitro. Po sporządzeniu zawiesiny granulo- silnie zmniejszona, obniżona jest także cytarnej i znakowanych bakterii, drożdży czy ekspresja CD45RA. Brak ekspresji białek lateksu metodą mikroskopową odczytuje się MHC II na limfocytach B. pochłonięte cząsteczki w 50 lub 100 fagocy- —— złożony niedobór odporności z nadpro- tach [7]. dukcją IgM (hyper IgM syndrome) — jest Obecnie coraz częściej bada się zdolność rzadkim zespołem charakteryzującym się komórek do fagocytozy przy pomocy testu cy- wysokim poziomem poliklonalnych IgM tometrycznego PhagoTest. Badanie to określa i IgD oraz obniżonym poziomem IgG, IgE zdolność komórek do przeprowadzenia fago- oraz IgA. U tych chorych obserwuje się cytozy opsonizowanych bakterii Escherichia obniżoną ekspresję CD40L (CD154) na coli, znakowanych barwnikiem fluorescencyj- aktywowanych limfocytach [13, 14]. nym. Wynik stanowi odsetek granulocytów Forum Medycyny Rodzinnej 2014, tom 8, nr 1, 27–36 33 WYBRANE PROBLEMY KLINICZNE cytometryczna, tak zwany BurstTest, w dużej mierze wyparł testy z NBT [4]. Wyniki cytofluorymetrii określają procent granulocytów zdolnych do produkcji rodników tlenowych po stymulacji (Escherichia coli, fMLP — formylo-metionylo-leucylo-fenyloalanina, PMA — octan mirystynianu forbolu. OCENA UKŁADU DOPEŁNIACZA Dopełniacz stanowi układ kilkudziesięciu białek spełniających istotną rolę głównie w nieswoistej humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Jego główne funkcje to między innymi udział w opsonizacji i usuwaniu patogenów oraz aktywacja reakcji zapalnej. Niedobory dopełniacza dotyczyć mogą każdego elementu tego układu: drogi klasyczRysunek 2. Zasada działania testu cytometrycznego do oceny zjawiska fagocytozy; I. Próba kontrolna, fagocytoza zatrzymana poprzez inkubację w temperaturze 0°C, bardzo niska intensywność emitowanej fluorescencji; II, III — próby badane, inkubacja w 37°C, (II) pomiar u pacjenta z dysfunkcją procesu fagocytozy, zarejestrowano obniżony poziom fluorescencji, (III) pomiar u pacjenta zdrowego, emisja fluorescencji w zakresie normy (70–99% — w zależności od użytego zestawu normy różnią się) nej (C1, C2, C4), alternatywnej (C3) czy lektynowej. Możliwy jest także defekt regulatora dopełniacza — inhibitora C1 esterazy [10]. Badanie całkowitej aktywności hemolitycznej dopełniacza (CH50, total i monocytów pełnej krwi heparynizowanej, zdolnej do aktywnej fagocytozy [rys. 2]. serum hemolytic complement assay) Pozwala ono na detekcję większości przypadków PNO związanych z niedoborami dopełnia- Niedobory dopełniacza mogą dotyczyć elementów drogi klasycznej, alternatywnej i lektynowej aktywacji dopełniacza Ocena zdolności neutrofilów do cza. Badanie polega na inkubacji opłaszczo- wytwarzania rodników tlenowych nych przeciwciałami krwinek baranich z su- Zdolność zabijania sfagocytowanych bakterii rowicą pacjenta i spektrofotometrycznym po- oceniana jest poprzez ocenę zdolności neu- miarze ich rozpadu. Dodana do testu objętość trofilów do wytwarzania rodników tlenowych. surowicy powinna spowodować lizę około 50% Tradycyjnie służył do tego test z błękitem krwinek zwierzęcych (stąd CH50). Nieprawi- nitrotertrazolowym (NBT) lub z cytochro- dłowy wynik należy zweryfikować dokładniej- mem c. Test polega na spektrofotometrycznym szymi specjalistycznymi testami oceniającymi pomiarze zmiany absorpcji światła spowodo- każdą ze składowych dopełniacza [5]. wanej redukcją barwnika przez uwalniane rodniki tlenowe. Test przydatny jest szczególnie w diagnostyce przewlekłej choroby ziarninia- Metodami oceny poszczególnych składni- kowej i zespole Chediaka-Higashiego. U osób ków są nefelometria, turbidymetria bądź dotkniętych tymi jednostkami chorobowymi test immunoenzymatyczny (ELISA, enzy- produkcja nadtlenków jest znacznie upośle- me-linked immunosorbent assay) [7]. Ob- dzona, w efekcie czego nie powstaje produkt niżone poziomy C3 i C4 wskazują na stałe reakcji redukcji barwnika [5]. zużycie dopełniacza, co charakterystyczne Obecnie test czynnościowy oceniający wybuch tlenowy wykonywany jako analiza 34 Oceny poszczególnych składników jest w przypadku powstawania kompleksów immunologicznych [4]. www.fmr.viamedica.pl Edyta Brzustewicz, Ewa Bryl Przegląd testów laboratoryjnych przydatnych w diagnostyce pierwotnych niedoborów odporności Badanie alternatywnej aktywności Tabela 3 hemolitycznej dopełniacza (AH50, Najczęstsze rodzaje zakażeń w poszczególnych grupach pierwotnych niedoborów immunologicznych [17] alternative serum hemolytic assay) Niedobory składowych alternatywnej drogi Typ zaburzenia odporności Typowe patogeny Zaburzenia odporności humoralnej Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Campylobacter, Yersinia, Giargia intestinalis, Mycoplasma, enterowirusy lytic assay). Test ten wykorzystuje technikę Zaburzenia odporności komórkowej i złożone niedobory odporności Haemophilus influenza, Streptococcus pneumonia, prątki gruźlicy, Candida, Aspergillus, Cryptosporidium, HSV, CMV, EBV, RSV, adenowirusy immunodyfuzji radialnej. Surowicę pacjenta Zaburzenia fagocytozy Staphylococcus aureus, jelitowe pałeczki G(–), Serratia marcescens, Mycobacterium bovis, Aspergillus Zaburzenia układu dopełniacza Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumonia, Neisseria aktywacji dopełniacza są niezmiernie rzadkie [6]. Do ich oceny wykorzystuję się badanie alternatywnej aktywności hemolitycznej dopełniacza (AH50, alternative serum hemo- nakłada się na żel agarozowy zawierający kurze krwinki czerwone. Następuje aktywacja alternatywnej drogi dopełniacza, której aktywność jest proporcjonalna do obszaru zli- HSV (Herpes simplex virus) — wirus opryszczki pospolitej; CMV (Cytomegalovirus) — wirus cytomegalii; EBV — wirus Epsteina-Barr; RSV — respiratory syncytial virus zowanych krwinek [16]. Stłumienie obu indeksów CH50 i AH50 moralnej. Dla przykładu u pacjenta ze złożo- wskazuje na defekty końcowych składowych nym niedoborem odporności wyniki IgG, IgM dopełniacza (C5, C6,C7, C8), tworzących ze- mogą być ujemne mimo zakażenia wirusem. spół atakujący błonę komórki [4]. Lekarz powinien przy interpretacji wyników uwzględnić także terapię dożylną czy podskór- DIAGNOSTYKA POWIKŁAŃ INFEKCYJNYCH W PNO ną immunoglobulinami. Istota diagnostyki mikrobiologicznej wynika Popełniane błędy mogą być dla chorych nie tylko z konieczności zapobiegania i lecze- bardzo poważne w skutkach. Należy podkre- nia powikłań infekcyjnych, ale może dostar- ślić znaczenie techniki reakcji łańcuchowej czyć także informacji o rodzaju niedoboru polimerazy (PCR, polymerase chain reaction) odporności. w diagnostyce infekcji u chorych z PNO [17]. Zaburzenia określonego elementu układu immunologicznego zwiększają podatność na ZNACZENIE BADAŃ GENETYCZNYCH określone patogeny (tab. 3). Pierwotne niedobory odporności są chorobami Zakażenia u chorych z PNO mają charak- o podłożu genetycznym. Mają różny charakter, ter przewlekły i często nawracający. Najczę- mogą być sprzężone z chromosomem X bądź ściej dotyczą układu oddechowego, rzadziej są autosomalne dominujące lub recesywne. układu pokarmowego i skóry. U takich cho- Obecnie szybko rozwijającą się gałęzią rych możliwe są zakażenia nie tylko drobno- diagnostyki jest immunogenetyka. Znamy ustrojami patogennymi, ale także oportuni- szereg metod, takich jak fluorescencyjna hy- stycznymi, między innymi Cryptosporidium, brydyzacja in situ (FISH, fluorescent in situ hy- Candida, Staphylococcus aureus, Mycobacte- bridization), hybrydyzacja metodą Southerna rium czy wirusem cytomegalii. (SB, Southern blotting), hybrydyzacja northern W diagnostyce mikrobiologicznej pacjen- (NB, northern blotting), rekombinowanie tów z PNO istnieje wiele problematycznych i klonowanie DNA, przydatnych w ustaleniu kwestii. Ze względu na źle dobrany materiał czynnika odpowiadającego za chorobę [10]. do badań czy na włączenie antybiotykoterapii Analiza molekularna nie pozwala jednak na u chorych posiewy mikrobiologiczne często jasne przyporządkowanie wadliwego genu do dają wyniki ujemne. Podobnie badania serolo- określonej jednostki chorobowej. Ma to zwią- giczne mogą dawać wyniki fałszywie ujemne. zek z tym, że mutacja tych samych genów może Ma to związek z zaburzeniami odpowiedzi hu- powodować różne objawy kliniczne. Forum Medycyny Rodzinnej 2014, tom 8, nr 1, 27–36 Zaburzenia określonego elementu układu immunologicznego zwiększają podatność na określone patogeny. Zakażenia w PNO mają charakter przewlekły i często nawracający 35 WYBRANE PROBLEMY KLINICZNE Pierwotny niedobór odporności był pierw- kłaniom. Niestety wciąż duża część pacjen- szą chorobą wrodzoną, w której zastosowano tów zostaje zdiagnozowana zbyt późno mimo terapię genową. Zanotowano sukces w tera- częstych hospitalizacji, spowodowanych ty- pii genowej SCID z niedoborem deaminazy powymi dla PNO infekcjami. Szybki rozwój adenozynowej oraz w kilku innych zespołach. nowoczesnych technik diagnostyki laborato- Dalsze badania są obiecujące. Dodatkowo ba- ryjnej wymaga od lekarza ciągłej aktualizacji dania genetyczne mają znaczenie w diagno- wiedzy w tej dziedzinie. Lekarz pierwszego styce prenatalnej. kontaktu powinien skierować pacjenta z charakterystycznymi symptomami na konsultacje ZAKOŃCZENIE specjalistyczne. Dalsza szczegółowa diagnoza, Prawidłowa i szybka diagnoza pacjentów obejmująca opisane w niniejszym artykule ba- z PNO pozwala na wprowadzanie skutecznej dania laboratoryjne, pozwoli na trafne posta- terapii i zapobieganie niebezpiecznym powi- wienie diagnozy. PIŚMIENNICTWO 1. Capel H. Classification of primary immunodeficiency 10. Zeman K., Szałowska D. Pierwotne niedobory od- diseases by the international Union of Immunologi- porności — ważna grupa rzadkich chorób uwarun- cal Societies (IUIS) Expert Committee on Primary kowanych genetycznie. Przegląd pediatryczny 2006; Immunodeficiency 2011. Clinical and Experimental Immunology 2011; 168: 58–59. 2. McCuster Ch., Warrington R. Primary immunodeficiency. munodeficiency: a multi-stage diagnostic protocol Allergy Asthma & Clinical Immunology 2011; 7 (1): 1–11. designed for non-immunologists. Clinical and Experi- 3. Cooper M., Pommering T., Koranyi K. Primary Immunode- mental Immunology 2006; 145: 204–214. ficiencies. Am. Fam. Physician 2003; 68 (10): 2002–2008. 12. Fried A.J., Bonnila L., Pathogenesis, diagnosis and 4. Chinratanapisit S., Sriaroon P., Sleasman J. W., Good management of primary antibody deficiencies and R. A. Diagnostyka osoby dorosłej z podejrzeniem infections. Clinical Microbiology Reviews 2009; 22 niedoboru odporności. Witryna Word Allergy Organization, 2008. 5. Dizon J.G., Goldberg B.J., Kaplan M.S. Diagnostyka niedoborów odporności. Medycyna praktyczna — pediatria 2000; 4: 98–109. 6. Lederman H.M. The clinical presentation of primary immunodeficiency diseases. Clinical Focus on Primary Deficiencies, 2000; 2 (1). 7. Dembińska-Kieć A., Naskalski J.W. Diagnostyka laboratoryjna z elementami biochemii klinicznej. Wrocław 2010: 851–859. 8. Ballow M. Primary immunodeficiency disorders: Antibody deficiency. J. Allergy Clin. Immunol. 2002; 109 (4): 581–591. 36 36 (4): 251–257. 11. Vries E., Patient-centred screening for primary im- (3): 396–414. 13. Illoh Orieji C. Current application of flow cytometry in diagnosis of primary immunodeficiency diseases. Arch. Pathol. Lab. Med. 2004; 128: 23–31. 14. O’gorman M. Role of flow cytometry in the diagnosis and monitoring of primary immunodeficiency diseases. Clin. Lab. Med. 2007; 27: 591–626. 15. Kopeć-Szlęzak J. Subpopulacje limfocytów T. Onkol. Pol. 2005; 8 (1): 17–20. 16. Bonnila F.A., Bernstein L., Khan D. A i wsp. Practice parameter for the diagnosis and management of primary immunodeficiency. 2005: 94. 17. Wolska-Kuśnierz B., Kurenko-Deptuch M., Bernatowska E. Trudności w rozpoznawaniu i leczeniu 9. Primary immunodeficiency diseases — raport of an powikłań infekcyjnych u chorych z pierwotnymi IUIS Scientific Committee. Clin. Exp. Immunol. 1999; niedoborami odporności. Przeg. Epidemiol. 2008; 118 (1): 1–28. 62: 123–131. www.fmr.viamedica.pl
