Inne podejście do klonowania

2016-12-19
Inne podejście do klonowania
1
2016-12-19
Typowe klonowanie z użyciem
enzymów restrykcyjnych
•
•
•
Klonowanie konwencjonalne/dwukierunkowe – 1 restrykaza
Klonowanie kierunkowe – 2 restrykazy
Zabezpieczenie przed self-ligacją
UNIVERSAL TA-cloning
Phosphorylation/dephosphorylation
2
2016-12-19
Directional TA-cloning
Wektor PRESAT
Generowanie
miejsca
restrykcyjnego NcoI
w przypadku
niewłaściwej
orientacji wstawki
XcmI sites (CCANNNNN^NNNNTGG)
3
2016-12-19
Zastosowanie Topoizomerazy
TOPO® TA Cloning® of Taq-amplified DNA.
Zero Blunt® TOPO® cloning of blunt-end DNA.
Directional TOPO® cloning of blunt-end DNA.
4
2016-12-19
- Wygenerowanie 10-12 nt overhangów
- Wykorzystanie aktywności
egzonukleolitycznej polimerazy DNA z faga T4
5
2016-12-19
6
2016-12-19
Klonowanie GIBSONA z wykorzystaniem 5’ egzonukleazy,
polimerazy DNA i ligazy DNA.
7
2016-12-19
Gibson Cloning
8
2016-12-19
GOLDEN GATE CLONING
• Golden Gate Cloning overcomes this restriction by
exploiting the ability of type IIs restriction enzymes (such
as BsaI, BsmBI or BbsI) to produce 4 bp sticky ends right
next to their binding sites, irrespective of the adjacent
nucleotide sequence. Thus, these enzymes are capable of
producing multiple sticky ends at different DNA
fragments in one reaction. Importantly, binding sites of
type IIs restriction enzymes are not palindromic and
therefore are oriented towards the cutting site
9
2016-12-19
10
2016-12-19
11
2016-12-19
12
2016-12-19
Klonowanie rekombinacyjne GATEWAY
Zalety technologii Gateway®
• Szybka 1-godzinna reakcja
klonowania z efektywnością >99%
• Zachowuje orientację i ramkę
odczytu sklonowanego DNA
(klony gotowe do ekspresji) bez
konieczności użycia enzymów
restrykcyjnych i ligazy
• Eliminuje konieczność
resekwencjonowania po każdym
etapie przeklonowania
• Wygodne przenoszenie insertu z
między eksperymentami
Rekombinacja oparta na systemie z bakteriofaga Lambda:
- Miejsca rekombinacji att
- Białko prowadzące do reakcji rekombinacji - Clonase™ (klonaza)
• The lysogenic pathway is catalyzed by the
bacteriophage λ Integrase (Int) and E. coli
Integration Host Factor (IHF) proteins (BP Clonase™
enzyme mix) while the lytic pathway is catalyzed by
the bacteriophage λ Int and Excisionase (Xis)
proteins, and the E. coli Integration Host Factor (IHF)
protein (LR Clonase™ enzyme mix).
13
2016-12-19
14
2016-12-19
15
2016-12-19
16
2016-12-19
17
2016-12-19
Redagowanie/Edytowanie genomu
Motorem opracowanych metod było:
• Klasyczna metoda dla komórek to rekombinacja
homologiczna
– Otrzymanie myszy ok. 1 rok /ludzkie komórki
trudniejsze, u wielu organizmów jeszcze bardziej
problematyczne
• Alternatywy: oligonukleotydy antysensowne,
siRNA
– Efekt niecałkowity
– Efekty non-target
– Czasowa redukcja ekspresji
Redagowanie/Edytowanie genomu
• Zmiana genomu przy zastosowaniu specyficznie
zaprojektowanych nukleaz
• Budowa: domena wiążąca specyficzną
sekwencję DNA + domena tnąca DNA
niespecyficznie
• Poprzez wprowadzanie nacięcia obu nici DNA
(ang. double-strand breaks - DSBs) następuje
precyzyjna i wydajna insercja genu do genomu
• DSB – indukuje endogenne mechanizmy
naprawcze:
– łączenie końców niehomologicznych (ang. nonhomologous
end joining - NHEJ)
– naprawa homologiczna (ang. homology-directed repair HDR)
18
2016-12-19
19
2016-12-19
Red. genomu na osi czasu
Meganukleazy
• Samonaprowadzające
endonukleazy (homing
endonucleases)
• LAGLIDADG
– kodowane w intronach
lub inteinach
– Np. I-Cre1 i I-Sce1
•
•
•
•
GIY-YIG
HNH
His-Cys box
PD-(D/E)XK
20
2016-12-19
Nukleazy z motywem palca cynkowego
ZFN
• syntetyczne białka, powstałe w wyniku połączenia
naturalnie występujących domen – wiążącej DNA, z
motywem palca cynkowego oraz domeny nacinającą DNA,
posiadającej enzym restrykcyjny typu IIS, np. FokI
Białka TALE
• białka TALE (ang. Transcription Activator-Like
Effector) występują naturalnie w patogennych
bakteriach roślin z rodzaju Xanthomonas
• zawierają domenę wiążącą DNA zbudowaną z
zestawu domen o powtórzeniach 33-35 aa
• każda z tych domen posiada 2 zmienne aa
(repeat-variable di-residue - RVD) – każde RVD
rozpoznaje 1 nt
• domeny białka TALE są połączone razem i
rozpoznają określoną sekwencję
21
2016-12-19
TALE wiąże okolice TATA-boxu
H-histydyna/D-kwas asparaginowy/N-asparagina/I-izoleucyna/G-glicyna/S-seryna
NI > A
NG > T
HD > C
NN > G/A
NH > G
22
2016-12-19
Struktura białka
TALE
Klonowanie systemem Golden-Gate
•Technologie TALEN i CRISPR/Cas – dają ogromne możliwości
•Problem: klonowanie powtórzeń TALE oraz CRISPR – technicznie
problematyczne ze względu na powtarzalność sekwencji i dużą ilość
„modułów”, które trzeba umieścić w 1 konstrukcji genetycznej
•System klonowania ‘Golden Gate’ (Engler i wsp., 2008) umożliwia
wydajne klonowania takich fragmentów – stosuje endonukleazy
typu IIS, które tną fragment DNA w oddaleniu od sekwencji którą
rozpoznają
•Procedura przebiega w 3 etapach:
1. Amplifikacja sekwencji DNA przy pomocy PCR, dodając
flankujące fragmenty restrykcyjne
2. Klonowanie produktów PCR w wektorach pośrednich
3. Składanie pośrednich konstruktów do wektora
ostatecznego w 1 reakcji
23
2016-12-19
Klonowanie TALENów systemem Golden-Gate
Przygotowanie TALENu – etap I
Przygotowanie TALENu – etap II
24
2016-12-19
CRISPR
•
System CRISPR/Cas (ang. clustered regulatory interspaced short palindromic
repeats/CRISPR associated) – loci występujące endogennie w komórkach
bakterii i wirusów
•
Krótkie wielokrotne powtórzenia CRISPR odpowiadają za odpowiedź obronną
bakterii na atak bakteriofagów
•
Pomiędzy powtórzeniami CRISPR - sekwencje rozdzielające (ang. spacers)
•
Po wniknięciu bakteriofaga – powtórzenia CRISPR i sekwencje rozdzielające są
przepisywane na prekursorowe RNA, które jest docinane do RNA CRISPR
(crRNA) rozpoznającego specyficzną sekwencje oraz tracrRNA wiążącego
nukleazę Cas
•
crRNA i tracrRNA tworza strukturę dwuniciową, po czym wiązane są przez
nukleazę Cas (ang. CRISPR-associated nuclease)
•
Kompleks dostarczany jest do cząsteczki DNA patogenu -> rozcinanie
CRISPR/Cas9 geneza
25
2016-12-19
Inżynieria systemu CRISPR/Cas
• Można stworzyć własny system
CRISPR/Cas rozpoznający
określoną sekwencję,
dostarczając do komórki
matrycę, na której zajdzie
synteza naszego
nakierowującęgo RNA (single
guide RNA – sgRNA)
• sgRNA = crRNA (CRISPR RNA) +
tracrRNA (trans activating crRNA)
26
2016-12-19
Programy wspomagające projektowanie narzędzi do edycji genomu
27
2016-12-19
Przeszkody w technologii TALEN i CRISPR/Cas 9:
•Off-targets – inne sekwencje niż ta pożądana przez nas mogą
być rozcinane
•Dostarczanie do komórek docelowych – muszą być to
komórki embriogeniczne, które przekażą modyfikację genomu
komórkom potomnym
- transformacja eksplantatów przy pomocy Agrobacterium
-> somatyczna embriogeneza
- bombardowanie kulkami złota opłaszczonymi
konstruktami
28
2016-12-19
29
2016-12-19
System CRISPRi do represji transkrypcji
w komórkach drożdży i człowieka.
30
2016-12-19
Paweł SEGA, Anna LINKIEWICZ, 2014
Paweł SEGA, Anna LINKIEWICZ, 2014
31
2016-12-19
Wiele możliwości
Dostarczanie narzędzi edytowania
genomu do komórek
32
2016-12-19
Choroby, które można by
wyleczyć metodami
redagowania genomu:
Layla Richards – pierwsza pacjentka leczona nową
technologią edycji genomu (TALEN) w Great Ormond Street
Hospital w Londynie – czerwiec 2015
Roczna dziewczynka została
wyleczona z nieuleczalnej ostrej
białaczki (acute lymphoblastic
leukemia - ALL) dzięki
eksperymentalnej terapii genowej
wykorzystującej TALENy.
To pierwszy na świecie przypadek,
w którym zastosowano skrojoną na
miarę potrzeb terapię
immunologiczną wymierzoną w raka.
Layla otrzymała 1 ml
eksperymentalnego leku
z genetycznie modyfikowanymi
limfocytami T, zwanymi Ucart19.
Choroba całkowicie się wycofała. Po
miesiącach spędzonych w szpitalu
dziewczynka jest wolna od raka.
33
2016-12-19
Representative ongoing and
completed gene-editing clinical trials
Naturalne GMO? Słodki ziemniak został
zmodyfikowany genetycznie 8000 lat temu.
A może by tak dla „dobra
ludzkości” usunąć
modyfikację korzystając z
technologii CRISPR/Cas9?
Wilec ziemniaczany (Ipomoea batatas (L. Poir.) – gatunek byliny należący do rodziny
powojowatych, znany pod nazwami: batat, patat, kūmara lub słodki ziemniak
34