Szczep 121
advertisement
MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ CHARAKTERYSTYKA BAKTERII KULISTYCH I CYLINDRYCZNYCH – CZĘŚĆ 1 (GRAMDODATNIE) BARWIENIE METODĄ GRAMA Historia Metodę opracował w 1884 roku duński badacz, Christian Gram, który zaobserwował, że preparaty mikroskopowe bakterii można wybarwić wypracowaną przez niego metodą w ten sposób, że niektóre komórki mają albo kolor granatowy, albo różowy. Christian Gram z pewnością nie znał mechanizmu swojego bawienia, ani nawet nie mógł przewidzieć, że jego odkrycie będzie tak ważne i że będzie miało tak szerokie zastosowanie. Obecnie barwienie metodą Grama jest jedną z pierwszych czynności podczas identyfikacji mikroorganizmów odpowiedzialnych za infekcję i służy do podejmowania decyzji o wyborze odpowiedniego antybiotyku. Sam Gram stosował to barwienie do rozróżniania pneumokoków od Klebsiella pneumoniae Jest to typowy przykład barwienia złożonego. Jest to obecnie najczęściej stosowana metoda barwienia, o podstawowym znaczeniu taksonomicznym i diagnostycznym, która różnicuje bakterie na dwie grupy wykazujące wiele różnic w strukturze i właściwościach cytochemicznych. Są to bakterie gramdodatnie G(+) barwiące się na fioletowo i gramujemne G(-) barwiące się na różowo. Bakterie gramdodatnie – mają ścianę zbudowaną prawie wyłącznie z mureiny (zob. materiały dodatkowe do ćwiczeń), zatrzymują barwnik podstawowy po utrwaleniu go płynem Lugola i nie odbarwiają się pod wpływem alkoholu. Barwią się w metodzie Grama na kolor fioletowy lub fioletowo-niebieski (laseczki, ziarniaki bez tlenowych Neisseriaceae i beztlenowych Veilonella). Bakterie gramujemne – mają cieńszą warstwę mureinową, obok mureiny zbudowana jest z lipopolisacharydów, białek, są bardziej odporne na działanie różnych substancji chemicznych, nie zatrzymują kompleksu fioletu krystalicznego i płynu Lugola, odbarwiają się alkoholem i przyjmują barwnik kontrastowy (safraninę lub fuksynę). Barwią się na kolor różowy lub czerwono-różowy (pałeczki, ziarniaki – tlenowe Neisseriaceae i beztlenowe Veilonella). http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 1 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Gram-chwiejność. Niektóre rodzaje bakterii mogą wykazywać zmienne zabarwienie (gramchwiejne, gramzmienne). Zjawisko to dotyczy najczęściej bakterii gramdodatnich z rodzaju Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Propionibacterium. Niektóre gatunki tych bakterii rosnąc w „starej” hodowli (późne fazy wzrostu) lub w warunkach stresowych (gdy dochodzi do wyczerpania się w pożywce składników niezbędnych do syntezy ściany komórkowej), tracą swoją typową barwliwość. Podobnie zachowują się bakterie podczas podziału (etap wytwarzania przegrody podziałowej), gdy cienka warstwa mureiny będzie się barwić jak u bakterii gramujemnych. Nie wszystkie obecnie poznane bakterie możemy bezpośrednio zaklasyfikować do bakterii gramdodatnich lub gramujemnych. Należą do nich np. mykoplazmy (Mycoplasma), które nie posiadają ściany komórkowej. Ponadto niektóre bakterie bardzo słabo wybarwiają się metodą Grama i w związku z tym do ich identyfikacji nie stosuje się tej metody barwienia. Tak się dzieje w przypadku: mykobakterii (Mycobacterium), które określamy jako kwasooporne, gdyż raz zabarwione fuksyną karbolową, nie odbarwiają się pod wpływem kwaśnego alkoholu (95% EtOH, 3% HCl) - bakterie te barwi się metodą Ziehl-Nielsena, krętków (Treponema, Borrelia). MECHANIZM BARWIENIA - HIPOTEZY Odczynniki - barwnik podstawowy to roztwór fioletu krystalicznego (10 cm3 nasyconego roztworu fioletu krystalicznego w 96% etanolu, 2,5 g fenolu, 10 cm3 wody destylowanej), barwi wszystkie komórki na kolor ciemnoniebieski, - utrwalacz to płyn Lugola (zaprawa, bejca, czyli specjalny preparat, mający za zadanie utrwalenie wiązania barwnika), zawarty w nim jod tworzy stosunkowo duże kompleksy złożone z barwnika i jodu, - odbarwiacz, inaczej roztwór stosowany do kąpieli różnicującej (97 cm3 etanolu (70%), 3 cm3 acetonu), - barwnik kontrastowy to safranina lub roztwór fuksyny (10 cm3 fuksyny karbolowej, 90 cm3 wody destylowanej) – barwią na kolor inny niż fiolet krystaliczny. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 2 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Decydujące znaczenie ma etap kąpieli różnicującej, powoduje on bowiem, że kompleksy barwnika są wypłukiwane z komórek. Jeśli w ścianie komórkowej występują wystarczająco duże pory, barwnik zostaje wypłukany. Jednak gdy ściana komórkowa nie jest tak "dziurawa", barwnik pozostaje we wnętrzu komórki. W przypadku bakterii gramdodatnich ściana komórkowa ma kilkadziesiąt warstw. Można to wyobrazić sobie jako kilkadziesiąt nałożonych na siebie siatek. Mimo że oka każdej siatki są wystarczająco duże, aby kompleks barwnika mógł wypłynąć z komórki, to po nałożeniu na siebie kilkudziesięciu takich siatek, barwnik nie może już zostać wypłukany. Ponadto etanol powoduje odwodnienie ściany komórkowej, następuje zmniejszenie pustej przestrzeni i zaciskanie się poszczególnych warstw mureiny (uszczelnienie). W rezultacie kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie mogą ulec wypłukaniu. W przypadku bakterii gramujemnych 1-2 warstwy mureiny nie są przeszkodą i alkohol świetnie wypłukuje kompleksy barwnika. Ponadto ściana bakterii gramujemnych zawiera więcej substancji lipidowych, które są rozpuszczane przez alkohol, co powoduje dezorganizację struktury ściany komórkowej i dodatkowo uniemożliwia zatrzymywanie barwnego kompleksu przez komórkę. Najlepiej jeśli badanie wykonuje się na komórkach z 18-24 godzinnej hodowli, gdyż w komórkach starych zdolność do tworzenia trwałego kompleksu z fioletem krystalicznym maleje. UWAGA! Różnice w budowie ściany komórkowej bakterii gramdodatnich i gramujemnych to w efekcie nie tylko odmienny wynik barwienia Grama, ale także poważne, o medycznym znaczeniu, różnice w fizjologii tych bakterii. Staphylococcus aureus (gramdodatnie) Escherichia coli (gramujemne) http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 3 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ PROTOKÓŁ BARWIENIA METODĄ GRAMA 1. odtłuścić szkiełko podstawowe przez trzykrotne przeciągnięcie przez płomień palnika 2. sporządzić cienki rozmaz i wysuszyć go w powietrzu 3. utrwalić w płomieniu palnika 4. zalać fioletem krystalicznym i barwić przez około 1 minutę, zlać barwnik 5. spłukać nadmiar barwnika wodą 6. zalać płynem Lugola na około 1 minutę, zlać barwnik 7. spłukać wodą 8. odbarwić, czyli zastosować kąpiel różnicującą – spłukać kilkakrotnie alkoholem aż do wypłukania barwnika (do momentu spływania bezbarwnych kropli alkoholu przez 15-20 sek) 9. przerwać działanie alkoholu spłukać wodą 10. barwić kontrastowo safraniną przez 30 sekund 11. spłukać wodą 12. wysuszyć bibułą i oglądnąć pod immersją Gram(+) Gram(-) utrwalenie fiolet krystaliczny płyn Lugola odbarwianie barwienie kontrastowe http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 4 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Pamiętaj! Utrwalenie rozmazu ma dwojakie znaczenie. Po pierwsze, przeciąganie szkiełka nad płomieniem powoduje, że bakterie bardzo silnie do niego przylegają, co zapobiegnie ich zmyciu z powierzchni szkiełka w trakcie kolejnych manipulacji. Dlatego mówimy tutaj o utrwaleniu preparatu. Po drugie - bakterie są zabijane - może mieć to pewne znaczenie przy przygotowywaniu preparatów z gatunków patogennych, gdyż powoduje zwiększenie bezpieczeństwa pracy. CHARAKTERYSTYKA WYBRANYCH PRZEDSTAWICIELI ZIARNIAKÓW Drobnoustroje tej grupy stanowią normalną mikroflorę powietrza, mleka i przetworów mlecznych, spotykamy je w glebie, na skórze zwierząt i ludzi (powodują stany ropne i zapalenia, zapalenie płuc). Spotykane są też (gronkowce) w produktach żywnościowych i stanowią duże niebezpieczeństwo dla konsumentów. Cechy charakterystyczne: - gramdodatnie ziarniaki, - komórki kuliste, dzielą się w 1, 2 lub 3 płaszczyznach i mogą występować jako komórki pojedyncze, dwoinki, paciorkowce lub gronkowce, - nieruchliwe, - nie wytwarzają przetrwalników, - są mezofilami, tlenowcami lub względnymi beztlenowcami, - fermentują węglowodany bez wytworzenia gazu, z wytworzeniem małych ilości kwasu mlekowego, - niektóre gatunki wytwarzają charakterystyczne barwniki (żółte, złociste, pomarańczowe lub czerwone), inne tworzą kolonie bezbarwne, - typowi przedstawiciele: Micrococcus luteus (jasnożółte kolonie), Staphylococcus aureus (pomarańczowe), Staphylococcus saprophiticus (białe). Rodzaj Micrococcus - bakterie szeroko rozpowszechnione w przyrodzie (powietrzu, kurzu, wodzie), - optymalna temperatura wzrostu 25-30C, niektóre gatunki są ciepłooporne, niektóre rosną w niskich temperaturach, małe wymagania odżywcze, http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 5 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ - tolerują wysoką zawartość soli (halotoleranty), rosną przy obecności 5% NaCl – składniki solanek przemysłowych, - są tlenowcami (niektóre utleniają glukozę z pożywki), wytwarzają katalazę, powodują psucie się produktów konserwowanych solą, mleka pasteryzowanego (M. varians), margaryny, serów, żywności przechowywanej w chłodniach, - uważane są za niechorobotwórcze, jednak mogą być oportunistami, występować gatunki opisano 9 gatunków, na skórze człowieka, biorące udział w psuciu: 8 może najważniejsze Micrococcus freudenreichii, M. varians, M. luteus, M. caseolyticus (ale bierze też udział w dojrzewaniu sera tylżyckiego), - typowy przedstawiciel M. luteus, średnica komórki przekracza 2 m, - kolonie są nieprzejrzyste i wyraźnie zabarwione (od cytrynowożółtego do czerwonego). Rodzaj Staphylococcus - gronkowce występują na powierzchni ciała ludzi i zwierząt, na błonach śluzowych, w nosogardzieli, a także w glebie i wodzie, - gramdodatnie, przekraczają średnicę 1 m, są nieruchliwe, - kolonie gładkie, okrągłe, lekko wypukłe, od białych do pomarańczowych, - względne beztlenowce, choć wykazują wzrost w obecności tlenu, - wzrost w temperaturze 15-46C i pH 4,2-9,3, - na podłożu płynnym rosną w postaci zmętnienia i tworzą żółty osad (kłaczkowaty), - gatunek chorobotwórczy Staphylococcus aureus (gronkowiec złocisty, optymalna temp. 37C) wywołuje ropnie skóry, anginy, zapalenie płuc i opon mózgowordzeniowych, nieżyt błon śluzowych i ucha środkowego, zatrucia pokarmowe typu intoksykacji, u krów ostre lub przewlekłe zapalenie wymienia, - są halotolerantami, - obecność soli peklujących w produktach spożywczych nie zapobiega rozwojowi gronkowców i produkcji enterotoksyn, natomiast ich wytwarzanie hamuje temp. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 6 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ poniżej 10C i pH poniżej 4,5 zapobieganie zakażeniom gronkowcami polega na przestrzeganiu higieny produkcji i temperatury obróbki termicznej, aby nie dopuścić do rozmnażania się bakterii i produkcji ciepłoopornej enterotoksyny przed ich zniszczeniem, - hydrolizują żelatynę, nie hydrolizują skrobi, - wytwarzają katalazę (katalazo-dodatnie), niektóre mają zdolność wytwarzania koagulazy (S. aureus), - w pracowniach diagnostycznych stosuje się podział na: a) gronkowce koagulazododatnie (Staphylococcus aureus) b) gronkowce koagulazoujemne (S. epidermidis, S. saprophyticus) w oparciu o zdolność wykrzepiania osocza przez S. aureus i brak takich zdolności u innych gatunków, choć nowe badania taki podział uznały za mało precyzyjny, - znanych jest kilkadziesiąt gatunków – połowa związana z człowiekiem, - kolonizują skórę człowieka – naturalna flora bakteryjna, ale w zmienionych warunkach mogą wywołać infekcje, - najczęściej wywołują zakażenia szpitalne: o S. aureus (gronkowiec złocisty) – infekcje miejscowe wszystkich tkanek i narządów oraz uogólnione: ropne stany zapalne skóry i tkanek miękkich (czyraki, jęczmienie, liszajec, ropnie, ropowice, zapalenie szpiku kostnego, septyczne zapalenie stawów, zapalenie wsierdzia, zapalenie płuc), o S. epidermidis (gronkowiec naskórkowy) – czynnik etiologiczny szpitalnych posocznic, zapalenie wsierdzia, o S. saprophyticus (gronkowiec saprofityczny) – odpowiada za 10-20% zakażeń dróg moczowych. Rodzaj Streptococcus i Lactococcus – paciorkowce Innym rodzajem zaliczanym do gramdodatnich ziarniaków są paciorkowce. Bardzo rozpowszechnione w przyrodzie, występują w produktach mleczarskich, kiszonkach, produktach zbożowych, sokach owocowych, jamie ustnej i przewodzie pokarmowym zwierząt i człowieka. Liczne są wykorzystywane w przemyśle mleczarskim jako szczepionki do ukwaszania mleka lub jego przetworów. Niektóre mogą być szkodliwe dla przetwórstwa, albo chorobotwórcze (S. pneumoniae – zapalenie płuc, S. pyogenes – paciorkowcowe zapalenie gardła, angina, szkarlatyna, S. agalactiae – zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków, bakteremia, S. viridans – zapalenie wsierdzia, ropień zęba). http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 7 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Cechy charakterystyczne: - ziarniaki ułożone w długie łańcuszki (paciorki), - gramdodatnie, - nie przetrwalnikują, - względne tlenowce lub beztlenowce. Wyróżnia się 4 grupy: 1) paciorkowce ropotwórcze (S. pyogenes, S. agalactiae), 2) paciorkowce zieleniejące (S. salivarius, S. viridans), 3) paciorkowce mleczne (Lactococcus lactis, L. cremoris, L. thermophilus), 4) paciorkowce kałowe – enterokoki (E. faecalis). Dawniej jako paciorkowce grupy D klasyfikowano enterokoki, obecnie coraz częściej są wydzielane jako osobny rodzaj, gdyż nie wszystkie mają w ścianie komórkowej antygen D. Zdolność wzrostu na zwykłych podłożach i na bulionie z dodatkiem 6,5% NaCl wyraźnie odróżnia rodzaj Enterococcus od paciorkowców. Rodzaj Enterococcus – paciorkowce kałowe Są gramdodatnie, nieco owalne, duże (ok. 2,5 m) ziarniaki, w preparatach tworzą pary, czasem krótkie łańcuszki lub nieregularne skupiska. Względne tlenowce, na podłożu płynnym rosną dyfuzyjnie, na stałym tworzą duże (2 mm), szarawoprzejrzyste kolonie. Wyodrębniono kilkanaście gatunków, u ludzi dominują E. faecalis (80-90%), E. faecium (10-15%). Enterokoki dysponują licznymi czynnikami chorobotwórczymi, niektóre szczepy wytwarzają adhezynę (czynnik agregujący) czy enzym hialuronidazę. Są to bakterie ciepłooporne, choć rosną też w niskich temperaturach (4-5C), dobrze przeżywają proces zamrażania i warunki pasteryzacji stosowane w przemyśle spożywczym. Bytują głównie w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt – używane są jako wskaźnik zanieczyszczenia kałowego wody i środków spożywczych (pasteryzowanych lub mrożonych). Czasami są spotykane w jamie ustnej – patogeny oportunistyczne, przyczyniają się do zakażenia dróg moczowych, bakteremii, zapalenia wsierdzia. Powszechnie występują w różnych rodzajach żywności, są przyczyną psucia się pasteryzowanych konserw mięsnych przechowywanych w chłodniach, mleka i pasteryzowanych produktów mlecznych, powodują też zielenienie powierzchni mięsa. Nadmierny rozwój enterokoków i produkcja przez nie amin biogennych (w produktach białkowych) jest przyczyną zatruć pokarmowych lub reakcji alergicznych u ludzi. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 8 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ TEST NA OBECNOŚĆ KATALAZY Powstający w procesach oddychania nadtlenek wodoru (H2O2) jest substancją silnie trującą dla komórek bakteryjnych. Mikroorganizmy likwidują jej nadmiar za pomocą enzymu – katalazy. Katalaza – enzym przyspieszający reakcję: 2 H2O2 → 2 H2O + O2 ↑ Wykrywanie katalazy znalazło praktyczne zastosowanie w diagnostyce bakterii, szczególnie w rozróżnianiu ziarenkowców (Staphylococcus od Streptococcus) i laseczek gramdodatnich (Bacillus od Clostridium). Wyróżniamy organizmy: - katalazododatnie (Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus) - katalazoujemne (Streptococcus, Enterococcus, Clostridium) Obecność enzymu wykrywa się, dodając do hodowli 3% roztwór wody utlenionej. Wynik dodatni – wydzielanie się pęcherzyków tlenu. dysmutaza ponadtlenkowa i katalaza peroksydaza Jeśli barwienie Grama wykazało, że badany szczep jest ziarniakiem gramdodatnim, szybkie rozróżnienie między gronkowcem a paciorkowcem umożliwia test na katalazę. Streptokoki (paciorkowce) nie wytwarzają grup hemowych, w związku z czym nie mogą wytworzyć enzymu zawierającego hem – katalazy. Jeśli na kolonię paciorkowców nakropimy wodę utlenioną, kolonia po prostu stanie się mokra, gdyż bakterie te nie potrafią pozbyć się nadtlenku wodoru. Natomiast kolonie gronkowców zaczną wytwarzać pęcherzyki powietrza. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 9 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Staphylococcus aureus Enterococcus faecium TEST NA OBECNOŚĆ KOAGULAZY Jeśli test na obecność katalazy wypadł pozytywnie, test na koagulazę pozwala na rozróżnienie między Staphylococcus aureus a nie-patogennymi gronkowcami. Posiadanie koagulazy umożliwia drobnoustrojowi wykrzepianie osocza wokół komórki, co sprawia, że taka komórka jest odporna na fagocytozę. Test polega na inokulacji osocza króliczego badanymi bakteriami i inkubacji 1-4 godzin w 37C. Jeśli organizm wytwarza koagulazę, w tym czasie wytworzy się skrzep. skrzep organizm koagulazododatni brak skrzepu organizm koagulazoujemny Staphylococcus aureus jest najważniejszym patogenem tego rodzaju. Ponieważ liczne gatunki typowej (normalnej) mikroflory również są zaliczane do tego rodzaju, ważne jest aby móc szybko rozróżnić S. aureus od innych gronkowców. Wśród gronkowców (Staphylococcaceae) niektóre właściwości wykazuje jedynie dla S. aureus: - jest koagulazododatni, - halotolerant - odporny na wysokie stężenia soli (7,5-10%), - fermentuje mannitol do kwasów organicznych (mannitol-positive), - w cząsteczkach kwasu tejchojowego znajduje się rybitol, - w hodowli na agarze z krwią po 24-36 h można zaobserwować hemolizę. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 10 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ HEMOLIZA – polega na zmianach w krwinkach czerwonych, dodanych do podłoża, pod wpływem toksyn bakteryjnych. -hemoliza u S. aureus brak hemolizy S. epidermidis hemoliza - toksyny bakteryjne powodują redukcję hemoglobiny do methemoglobiny, co uwidacznia się żółto-zielonkawymi obwódkami wokół kolonii, hemoliza - toksyny bakteryjne rozpuszczają erytrocyty, powstaje strefa przejaśnienia wokół kolonii, hemoliza γ - toksyny bakteryjne nie oddziałują na erytrocyty. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 11 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ PODZIAŁ MIKROORGANIZMÓW ZE WZGLĘDU NA OPTYMALNĄ TEMPERATURĘ WZROSTU Mikroorganizmy mogą rozwijać się w bardzo szerokim zakresie temperatur, od – 23°C (silnie zasolone wody Antarktydy, w których stwierdzono obecność bakterii z rodzaju Corynebacterium i grzybów z rodzaju Sporobolomyces) do 113°C (gorące źródła, kominy termalne – Pyrodictium brockii). Większość mikroorganizmów rozwija się jednak w zakresie temperatur od 10 do 37°C. W warunkach laboratoryjnych najczęściej stosuje się 30–37°C dla bakterii i 20–28°C dla grzybów. Ze względu na różnice w minimalnych, optymalnych i maksymalnych temperaturach wzrostu, mikroorganizmy dzieli się na ogół na trzy grupy: Psychrofile (minimum -23-0C; optimum 15C; maksimum 20(40)°C) Do tej grupy zalicza się szereg drobnoustrojów zdolnych do rozwoju w środowiskach naturalnych o niskich temperaturach (lodowce Antarktyki, szczyty gór, dno oceanów i głębokich jezior). Bakterie tej grupy stanowią również poważny problem w przechowalnictwie. Występując w chłodniach i magazynach, na i w schłodzonych produktach mleczarskich, mięsnych i owocowo-warzywnych, wywierają niekorzystny wpływ na ich jakość i trwałość. W mikrobiologii żywności często wyróżnia się wśród nich 2 podgrupy: obligatoryjne psychrofile (nie przeżywają w temp. powyżej 20C) oraz fakultatywne psychrofile (psychrotrofy, rosną w zakresie 0-40C, nie rozmnażają się poniżej 0C, choć mogą utrzymać podstawowe funkcje fizjologiczne). Najczęściej są to bakterie gramujemne należące do rodzaju Pseudomonas, Vibrio, Aeromonas, Acinetobacter, Alcaligenes, Chromobacterium i Flavobacterium. Wśród bakterii gramdodatnich dominują gatunki należące do rodzajów: Micrococcus, Bacillus i Arthrobacter oraz niektóre Lactobacillus. Spośród drożdży są to przedstawiciele rodzajów Candida, Debaryomyces, Pichia, Rhodotorula i Torulopsis, a spośród pleśni: Aureobasidium pullulans, Botrytis cinerea i Geotrichum candidum. Szczególne niebezpieczeństwo zatruć pokarmowych stwarzają niektóre bakterie patogenne: Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica i Bacillus cereus. Mezofile (minimum 10-30C; optimum 20-37C; maksimum 35-50°C) Grupa drobnoustrojów zdolna do wzrostu w umiarkowanych temperaturach. Do mezofili zalicza się większość drobnoustrojów występujących w środowisku (glebie, wodzie, na powierzchni ciała roślin i zwierząt). Są to na ogół mikroorganizmy saprofityczne oraz chorobotwórcze dla roślin, zwierząt i człowieka, wśród nich wywołujące zatrucia pokarmowe. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 12 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Termofile (minimum 25-45C; optimum 45-65C; maksimum 60-90°C) Drobnoustroje o wysokich optymalnych temperaturach wzrostu. Podzielono je na dwie grupy: obligatoryjne termofile wymagają wysokich temperatur do wzrostu i rozmnażania, fakultatywne termofile natomiast dobrze prosperują w wysokich temperaturach, ale również w niższych (poniżej 50C). Przykłady: Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Chloroflexus aurantiacus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus coagulans, Alicyclobacillus acidoterrestris, a także niektóre gatunki z rodzaju Clostridium, Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina, Staphylococcus. Hypertermofile Mikroorganizmy o optymalnej temperaturze wzrostu powyżej 80°C. Najbardziej odpornym na gorąco mikroorganizmem jest odkryty w 2003 r. Szczep 121, który jest w stanie podwoić swoją populację w ciągu 24 godzin w autoklawie w 121C (stąd nazwa). Pozostałe są zdolne do przetrwania w temperaturach koło 100C. Należą tu niektóre bakterie i gatunki z Archea. Przykłady: Pyrolobus fumarii (Archea, żyje w 113C, Atlantyk), Methanopyrus kandleri (Archea, 80-100C, Zatoka Kalifornijska), Pyrococcus furiosus (Archea, 100C, ujście wulkanu, Włochy), Geothermobacterium ferrireducens (bakteria, 65-100C, Park Yellow Stone), Aquifex aeolicus (bakteria, 85-95C, Park Yellow Stone). 1 m Grand Prismatic Spring, Yellowstone National Park Szczep 121 Thermus aquaticus Przed rokiem 2003 uważano, że 15-minutowa ekspozycja na temperaturę 121°C (autoklawowanie) jest wystarczająca do zabicia wszystkich żyjących organizmów. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 13 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ OGÓLNA CHARAKTERYSTYKA BAKTERII CYLINDRYCZNYCH Należą do nich głównie krótkie, nieprzetrwalnikujące pałeczki (bacterium), o długości nieco większej niż szerokość oraz przetrwalnikujące laseczki (bacillus) o długości przekraczającej 10-20-krotnie ich szerokość. Średnica większości to 0,5-2 m, długość 1-6 m (u form nitkowatych ponad 100 m). Podczas podziału błona dzieląca powstaje wyłącznie w płaszczyźnie prostopadłej do osi wzrostu, w młodej hodowli można spotkać w związku z tym: dwoinki – diplobacillus lub łańcuszki – streptobacillus oraz diplobacterium i streptobacterium. BAKTERIE PRZETRWALNIKUJĄCE BACILLACEAE Przetrwalnikowanie, czyli tworzenie endospor jest cechą wspólną bakterii z rodziny Bacillaceae, obejmującej bardzo zróżnicowane fizjologicznie rodzaje: Bacillus i Clostridium. Większość gatunków bakterii przetrwalnikujących bytuje w środowisku naturalnym jako organizmy saprofityczne. Niektóre jednak, np. laseczka wąglika (B. antracis), laseczka jadu kiełbasianego (C. botulinum), laseczka tężca (C. tetani), należą do groźnych drobnoustrojów chorobotwórczych. Wśród bakterii przetrwalnikujących występują laseczki tlenowe (rodzaj Bacillus) oraz beztlenowe (Clostridium), gatunki mezofilne i termofilne, a także bakterie osmofilne. Bakterie te są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie: w glebie i wodzie, na częściach roślin, w psującej się żywności, treści żołądkowej zwierząt przeżuwających, w mule, osadach wód powierzchniowych, gorących źródłach. Cechy charakterystyczne Bacillaceae: - laseczki, - gramdodatnie, - tworzą przetrwalniki, - są tlenowcami (Bacillus) lub względnymi beztlenowcami (Clostridium), - są w większości mezofilami, - nieruchliwe lub ruchliwe – okołorzęse, - katalazododatnie (Bacillus) lub katalazoujemne (Clostridium), - wiele z nich rozkłada niektóre węglowodany oraz białka. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 14 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Rodzaj Bacillus Bakterie rodzaju Bacillus, dzięki możliwości tworzenia przetrwalników, są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie. Zawdzięczają to także zdolnościom adaptowania się do warunków środowiska i aktywnemu rozwojowi w otoczeniu o dużej rozpiętości temperatur, pH i zasolenia. Można je spotkać w glebie, w wodach słodkich i słonych, mule, osadach wód powierzchniowych, gorących źródłach, na różnych częściach roślin, w przewodzie pokarmowym zwierząt czy psującej się żywności. Bakterie z rodzaju Bacillus najpospolitsze są w glebie. Występują tu zarówno gatunki mezofilne, jak i psychrofilne. Zaliczane są do zymogennej mikroflory gleby, a więc w przeciwieństwie do autochtonicznej, ich intensywny rozwój występuje w przypadku dużego napływu do gleby materii organicznej (np. opad liści w lesie, nawożenie obornikiem itp.), uczestniczą w mineralizacji gleby. W przypadku niekorzystnych warunków mogą penetrować środowisko w poszukiwaniu dostępu do substancji odżywczych (gatunki urzęsione) lub tworzą endospory. Głównym przedstawicielem laseczek glebowych jest Bacillus cereus, nieco mniej liczne są B. licheniformis, B. subtilis, B. pumilus. Są to bakterie o niewielkich wymaganiach pokarmowych. Bardziej wymagające gatunki (B. psychrosaccharolyticus, B. polymyxa, B. macerans, B. azotofixans) rosną głównie w strefie ryzosfery, korzystając z substancji odżywczych wydzielanych przez rośliny i odwdzięczając się im wiązaniem azotu atmosferycznego. Bakterie występują też w wodzie. W wodach słodkich klimatu umiarkowanego spotyka się te same gatunki, co w glebach, tylko w mniejszych ilościach. W gorących źródłach, gejzerach i jeziorach o wysokich temperaturach swoją niszę znalazły gatunki termofilne, które nie rosną w temperaturze poniżej 45ºC (Bacillus stearothermophilus i Bacillus thermoruber). W przybrzeżnych wodach morskich i ujściach rzek (zwłaszcza zanieczyszczonych) spotyka się bakterie glebowe: B. subtilis i B. licheniformis. W wodach morskich o dużej czystości rozwija się B. cereus. W wodach i glebach zasadowych spotyka się laseczki alkalofilne (B. firmus, B. alcalophilus, B. lentus). Bakterie z rodzaju Bacillus powszechnie występują w ściółce i na martwych tkankach roślin, aktywnie uczestnicząc w II fazie ich rozkładu (B. megaterium, B. cereus, B. mycoides). Bakterie te wydzielają liczne enzymy, w tym rozkładające biopolimery i pochodne aromatyczne, przyczyniając się do rozkładu martwych liści http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 15 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ drzew bogatych w taniny i ligniny. Bakterie występujące na powierzchni żywych roślin, często są dostarczycielami azotu (asymilowanego z powietrza), chronią przed szkodliwymi owadami (wydzielają -endotoksyny), zapobiegają lub hamują rozwój chorób grzybiczych. Niektóre gatunki Bacillus występują w przewodzie pokarmowym zwierząt uczestnicząc w procesach trawienia. B. coagulans, B. licheniformis, B. circulans, B. laterosporus, B. pumilus znaleziono w żwaczu przeżuwaczy, gdzie pomagają w degradacji białek, hemiceluloz, ksylenu, glikozydów. Morfologia i fizjologia Bakterie z rodzaju Bacillus są tlenowymi lub względnie beztlenowymi, gramdodatnimi laseczkami, często tworzącymi układy łańcuszkowe. Są to cylindryczne, ruchliwe komórki o przeciętnych długościach 1-3 μm, ale bywają też większe (Bacillus megaterium zalicza się do jednych z największych bakterii). Urzęsienie głównie perytrychalne lub biegunowe. Spotyka się jednak również szczepy nieurzęsione (atrychalne) i nieruchliwe (B. anthracis). Ze względu na kształt i rozmieszczenie przetrwalników w komórce bakterie rodzaju Bacillus dzieli się na trzy grupy: laseczki wytwarzające przetrwalniki o średnicy mniejszej od sporangium, o kształcie owalnym lub cylindrycznym: B. anthracis, B. cereus, B. megaterium, B. licheniformis, B. subtilis, B. thuringiensis, laseczki wytwarzające przetrwalniki o średnicy większej od sporangium (komórka macierzysta ulega rozszerzeniu), o kształcie owalnym lub kulistym: B. macerans, B. stearothermophilus, B. circulans, B. polymyxa, laseczki wytwarzające duże kuliste endospory o średnicy większej niż komórka macierzysta, położone terminalnie: B. pasteurii, B. sphaericus. Przetrwalniki są wytwarzane tylko w procesach tlenowych, nie barwią się w barwieniu Grama, przetrzymują proces pasteryzacji – poważny problem dla przemysłu konserwowego. Wśród bakterii Bacillus znane są gatunki mezofile (B. licheniformis, B. subtilis), termofilne (Bacillus stearothermophilus, B. sporothermodurans, psychrofile (B. polymyxa), a nawet psychrotrofowe. W zależności od gatunku, bakterie z rodzaju Bacillus, rosną w środowiskach o bardzo różnym pH (pH 1-11), alkalifile to np. B. alkalophilus, do acydofili należy m.in. B. polymyxa, natomiast B. subtilis i B. licheniformis lepiej rosną w pH obojętnym. Niektóre laseczki są halofilne (B. pantothenticus, B. pasteurii, B. globisporus, B. marinus, B. halophilus), wytrzymują nawet 10% stężenie NaCl. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 16 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Wszystkie gatunki wytwarzają katalazę. Na agarze z krwią powodują hemolizę typu , a strefa wokół kolonii zwykle bardzo duża. Do identyfikacji i rozróżniania gatunków wykorzystuje się cechy morfologiczne komórki (wielkość, kształt, położenie przetrwalnika, otoczka, rzęski, ruch), właściwości biochemiczne i biologiczne (lecytynaza, hemoliza typu ) oraz wrażliwość na penicylinę. Metabolizm Bacillus należą do grupy wybitnie heterogennych chemoorganotrofów. Na agarze rosną w postaci dużych kolonii o rozmiarach 3-10 mm, płaskich, zwykle matowych, o postrzępionych brzegach (choć zdarzają się kolonie błyszczące i śluzowe). Wymagania pokarmowe są bardzo zróżnicowane gatunkowo. Wykorzystywane do wzrostu substancje organiczne, metabolizowane są w komórkach Bacillus w procesach tlenowych i/lub fermentacyjnych. U niektórych gatunków tlen, jako akceptor elektronów, może być zastąpiony przez jony NO3- (redukcja NO3- do NO2-). Niektóre gatunki mogą wiązać azot atmosferyczny. Gatunki oddychające beztlenowo przeprowadzają fermentację sacharydów, wytwarzając różne produkty końcowe (2,3-butandiol, glicerol, CO2, kwas mlekowy, octowy lub mrówkowy, etanol). Niektóre gatunki rozkładają skrobię, pektyny bądź mocznik. Na podstawie produktów fermentacji rozróżnia się poszczególne gatunki z rodzaju Bacillus. Podczas wzrostu wegetatywnego bakterie Bacillus gromadzą kwasy organiczne powodując zakwaszanie środowiska nawet do pH 4,0-5,0. Chorobotwórczość Wśród bakterii Bacillus jedynie B. anthracis jest uważany za gatunek silnie patogenny dla człowieka i innych ssaków (a nawet kręgowców). Endospory tego gatunku, są bardzo odporne na warunki środowiska i mogą wiele lat oczekiwać w glebie czy wodzie. Ich przedostanie się do żywności powoduje chorobę zwaną wąglikiem, której śmiertelność wśród zwierząt sięga 100%. U ludzi stykających się zawodowo z materiałem pochodzenia zwierzęcego (szczególnie skóry, wełna, sierść) choroba ma łagodniejszy przebieg, choć jej postaci płucna lub jelitowa także mogą przebiegać ciężko i prowadzić do śmierci. Z B. anthracis blisko spokrewniony jest B. cereus, wywołujący zatrucia pokarmowe, lokalne infekcje ran, choroby oczu, posocznicę i in. Ze względu na swoje występowanie w glebie, zatrucia tymi laseczkami są dość powszechne (łatwość przedostania się do produktów spożywczych, szczególnie niedokładnie umytych owoców, warzyw). Patogenami są także Bacillus alvei, B. popilliae i B. larvae wywołujące choroby pszczół. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 17 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Pozostałe gatunki uważa się za saprofity, jakkolwiek mogą wywołać infekcje w przypadku osłabienia organizmu. Znaczenie dla przemysłu Najważniejszą rolę Bacillus odgrywają w przemyśle enzymatycznym. Prawie 60% produkowanych w światowej skali preparatów enzymatycznych przypada na proteinazy (w tym subtilizyny, enzymu stosowanego do produkcji środków piorących) i -amylazy otrzymywane w oparciu o hodowlę bakterii Bacillus. W odróżnieniu od bakterii gramujemnych nie posiadają w swej ścianie komórkowej toksycznych lipopolisacharydów oraz mają tylko pojedynczą warstwę membrany cytoplazmatycznej, co ułatwia sekrecję wytwarzanych przez nie enzymów. Liczne gatunki z rodzaju Bacillus wytwarzają antybiotyki, które są stosowane w leczeniu różnych schorzeń. B. brevis (gramicydyna, tyrotrycyna), B. laterosporus (laterosporyna), B. licheniformis (bacytracyna), B. polymyxa (polimyksyna, kolistyna), B. pumilus (pumulina) B. subtilis (subtylina). Znaczenie dla przemysłu spożywczego i przetwórczego ma fakt, że przetrwalniki są odporne na pasteryzację. Mogą być przenoszone do różnych produktów żywnościowych (mięsa i jego przetworów, produktów mleczarskich, zbożowych, owocowo-warzywnych, przypraw). Powodują psucie się różnych produktów: hydrolizują skrobię (śluz, ciągliwość miękiszu pieczywa, nieprzyjemny zapach), kwaśne zepsucie konserw owocowo-warzywnych, wady serów (gorzki smak, wzdęcia), speptonizowany skrzep mleka („na słodko”), zepsucie mleka zagęszczonego. Wartość D140 dla endospor B. sporothermodurans waha się od 3,4 do 7,9 s. Są one uznawane za najbardziej odporne na ciepło przetrwalniki bakteryjne. Rodzaj Clostridium Są to gramdodatnie beztlenowe laseczki przetrwalnikujące. Są szeroko rozpowszechnione, gł. w glebie, występują także w przewodzie pokarmowym (C. perfringens), mogą zanieczyszczać produkty żywnościowe (przez kurz, ziemię). Rozmiary komórek zależą od gatunku i są różne, przetrwalniki okrągłe lub owalne nadają komórkom charakterystyczny kształt rakiety http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 18 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ tenisowej, pałeczki dobosza, osełki. Większość gatunków orzęsiona – perytrychalnie i bardzo ruchliwa, nieliczne wytwarzają otoczki. Substancją zapasową są wielocukry podobne do skrobi. Nie wytwarzają katalazy. Mimo że są beztlenowcami, można wyróżnić 3 grupy o różnej wrażliwości na tlen: typy bezwzględne (obligatoryjne) beztlenowe – zawartość tlenu w atmosferze powyżej 0,5% zabija je, umiarkowanie beztlenowe – 3% tlenu, aerotolerancyjne – mogą rosnąć słabo w warunkach zwykłej atmosfery. Przetrwalniki są ciepłooporne i tworzą się tylko w warunkach beztlenowych. Nie barwią się metodą Grama. Większość to mezofile, ale np. C. botulinum typu E żyje w temp. 3,3°C. Spotyka się także termofilne gatunki: C. thermoaceticum (60°C) i C. thermohydrosulfuricum (75°C). Liczne gatunki chorobotwórcze. Gatunki saprofityczne zwykle o znaczących właściwościach biochemicznych: bakterie proteolityczne powodujące procesy gnilne produktów białkowych w warunkach beztlenowych (konserw mięsnych – H2S i NH3), psucie serów podpuszczkowych (C. sporogenes) – tzw. biała zgnilizna (amoniak), gatunki zdolne do fermentacji różnych węglowodanów, np. bakterie fermentacji masłowej (C. butyricum) przekształcające cukry w lotny kwas masłowy i produkty gazowe (CO2 i H2), spotykane są w glebie, paszach, nawozie, wadliwych kiszonkach, mleku, serach dojrzewających. Rodzaj liczy około 120-160 gatunków, z czego 70-80% jest saprofityczna, ok. 25 to niezbyt groźne patogeny, a 13 to groźne patogeny (dla ludzi: C. botulinum (grupa I, II i III), C. difficile, C. histolyticum, C. novyi, C. perfringens, C. septicum, C. sordellii, C. tetani,). Clostridium botulinum (laseczka jadu kiełbasianego) – wywołuje botulizm klasyczny (zatrucie pokarmowe toksyną znajdującą się w produktach żywnościowych), botulizm niemowląt (źródło – miód), botulizm przyranny, różne szczepy w obrębie gatunku wytwarzają 8 typów egzotoksyn (A,B,C1,C2,D,E,F,G). Wytwarza owalne przetrwalniki położone subterminalnie, jest ruchliwy. Clostridium tetani – laseczka tężca, wytwarza terminalne endospory, gatunek ruchliwy, wytwarza egzotoksynę. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 19 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Clostridium difficile – wytwarza duże, owalne subterminalne spory i 2 rodzaje toksyn: toksynę A i toksynę B, powoduje choroby (poantybiotykowe rzekomobłoniaste zapalenie jelita grubego, biegunki poantybiotykowe), w sytuacji gdy prawidłowa mikroflora zostanie zniszczona (np. antybiotykami). Clostridium perfringens, Clostridium novyi, C. sordellii, C. hystolyticum, C. septicum, C. bifermentans – laseczki powodujące zgorzel gazową (gangrenę), martwicę mięśni (bakterie „żywią się” tkanką mięśni) lub tkanki łącznej z tworzeniem gazu i znamionami ogólnej toksemii, na skutek zakażenia rozległych ran, ze zmniejszonym krążeniem (słaby dopływ tlenu). REDUKCJA AZOTANÓW Chemolitoautotrofy (uzyskują energię z utleniania chemicznego, wykorzystują składniki nieorganiczne jako dawców elektronów i CO2 jako głównego źródła) oraz liczne chemoorganoheterotrofy (wymagają składników organicznych do wzrostu, składniki - organiczne służą jako źródło węgla i energii) mogą wykorzystywać azotany(V) (NO3 ) jako końcowy akceptor elektronów podczas oddychania beztlenowego. W procesie tym - - azotany(V) (NO3 ) ulegają redukcji do azotanów(III) (NO2 ) pod wpływem reduktazy azotanowej. - - NO3 + 2H+ + 2e- NO2 + H2O Niektóre z bakterii mają także enzymy do dalszej redukcji azotanów(III) do jonu amonowego lub azotu cząsteczkowego. - NO2 NH3+ ½ N2 Zdolność niektórych bakterii do redukcji azotanów jest wykorzystywana do ich identyfikacji i izolacji. Przykładowo E. coli redukuje azotany(V) do azotanów(III), Pseudomonas fluoresens do azotu cząsteczkowego, natomiast Staphylococcus epidermidis nie wykorzystuje azotanów w ogóle. Do patogennych bakterii redukujących azotany należą przedstawiciele rodziny Enterobacteriaceae: E. coli, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Proteus mirabilis, a także Staphylococcus aureus, Bacillus anthracis, B. subtilis, B. licheniformis i inne nie będące członkami tej rodziny. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 20 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Test redukcji azotanów przez rosnące bakterie oceniany jest w hodowli w probówce, na podłożu azotanowym, zawierającym 0,5% azotanu(V) potasowego. Po inkubacji hodowla - jest badana pod kątem obecności gazu i jonów NO2 w pożywce. Gaz (mieszanina CO2 i N2) jest uwalniany podczas redukcji azotanów(V) i podczas cyklu kwasu cytrynowego (CO2). Jony azotanowe(III) są wykrywane przez dodatek kwasu sulfanilowego i N-1-naftalenodiaminy (odczynnik + + ++ +++ Griessa) do hodowli. W reakcji powstaje barwny (różowomalinowy do intensywnie czerwonego) związek azowy, który jest wykrywany spektrofotometrycznie przy 548 nm. FERMENTACJA Jest to beztlenowy proces biochemiczny, polegający na enzymatycznym rozpadzie cukrów, który jest jednym z elementów fizjologii drobnoustrojów. Do przebiegu fermentacji konieczne są drobnoustroje lub wytworzone przez nie enzymy. - homofermentacja – proces fermentacji, w której powstaje 1 produkt końcowy, np. fermentacja mlekowa (glukoza kwas mlekowy) prowadzona przez Lactococcus lactis, - heterofermentacja – powstaje 2 lub więcej produktów, np. mlekowa (glukoza kwas mlekowy + CO2 + alkohol) prowadzona przez Lactobacillus. Do najważniejszych typów fermentacji należą: alkoholowa, cytrynowa, propionowa, masłowa, mlekowa, octowa. Fermentacja masłowa Fermentację masłową wywołują gł. bakterie masłowe należące do rodzaju Clostridium. Jest to typowy proces beztlenowy w wyniku, którego przy rozkładzie węglowodanów powstaje kwas masłowy (CH3CH2CH2COOH). Jest to heterofermentacja, mikroorganizm produkuje więc także i inne związki. Najczęściej wytwarzane są również: butanol, aceton, metanol, propan, 2-propanol, kwas octowy i inne kwasy organiczne itp. Równanie sumaryczne fermentacji masłowej C6H12O6 + bakterie masłowe → CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + 2H2 + ok. 15 kcal/mol glukoza kwas masłowy http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 21 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Do fermentacji mogą być wykorzystywane wielocukry (skrobia, glikogen, celuloza, hemiceluloza, pektyny), kwasy nukleinowe, białka, aminokwasy, puryny i pirymidyny. Bakterie z rodzaju Clostridium można podzielić na: - sacharolityczne (wielocukry, cukry), - peptolityczne (białka, peptony, aminokwasy). Maślan może być też wytwarzany przez inne organizmy, np. gramdodatnie, nieprzetrwalnikujące beztlenowe laseczki, wyizolowane ze żwacza bakterie Butyrivibrio fibrisolvens lub gramujemne, np. Ruminococcus albus. Udział bakterii masłowych w niszczeniu produktów spożywczych w mleczarstwie powodują psucie się pasteryzowanego mleka i tzw. późne wzdęcia serów podpuszczkowych dojrzewających (gł. C. tyrobutyricum, C. butyricum, C. sporogenes, do mleka mogą dostać się np. przy karmieniu krów nieprawidłowo przygotowanymi kiszonkami), powodują psucie się konserw warzywnych i owocowych (C. butyricum, C. pasteurianum, C. sporogenes), powodują psucie się kiszonych pasz. Korzystny udział bakterii masłowych Bakterie masłowe odgrywają ważną rolę w roszarnictwie lnu i konopi (podczas ich moczenia po ścięciu), ponieważ rozkładają pektyny, dzięki czemu len i konopie dają się rozdzielać na pojedyncze włókna i można oddzielić włókna przędne od tkanki korowej i zdrewniałej. BARWIENIE PRZETRWALNIKÓW METODĄ SCHAEFFERA-FULTONA Budowa przetrwalników, szczególnie obecność wielowarstwowych błon powoduje, że słabo się barwią. W zabarwionych komórkach (np. metodą Grama) pozostają jako obszary niezabarwione. Stosuje się barwienie kontrastowe przetrwalników i komórek wegetatywnych. Jedną z kilku metod jest metoda Schaeffera-Fultona, w której przetrwalniki barwią się na zielono, a komórki wegetatywne na czerwono. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 22 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Endospory są mniejsze od komórek wegetatywnych. W preparacie mogą być uwolnione poza komórki (czarne strzałki) lub pozostawać w ich wnętrzu (niebieska). PROTOKÓŁ BARWIENIA PRZETRWALNIKÓW METODĄ SCHAEFFERA-FULTONA 1. przygotować rozmaz komórek bakteryjnych 2. wysuszone i utrwalone w płomieniu preparaty zalać 5% roztworem wodnym zieleni malachitowej, 3. nie spłukując barwnika, podgrzewać nad palnikiem 3-krotnie do ukazania się obłoczka pary – do trzeciej pary (ważne by nie odparować barwnika), przez 30-60 sekund, ostudzić powoli, 4. spłukać delikatnie pod bieżącą wodą (30 sekund), 5. dobarwić 0,5% roztworem wodnym safraniny (30 sekund), 6. spłukać wodą i wysuszyć, 7. oglądnąć pod immersją - podać kształt zarodników, usytuowanie w komórce i wykonać odpowiedni rysunek. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 23 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ SCHEMAT WYKONANIA PREPARATU W KROPLI WISZĄCEJ z wazeliny wykonaj okrąg wokół wgłębienia szpatułka pierścień z wazeliny wgłębienie w szkiełku nanieś ezą na szkiełko badane bakterie eza kropla zawiesiny bakterii szkiełko nakrywkowe połóż szkiełko podstawowe na nakrywkowym kropla zawiesiny bakterii wazelina odwróć szybko do góry nogami WŁAŚCIWOŚCI ENZYMATYCZNE MIKROORGANIZMÓW Aktywność proteolityczna – aby białka mogły być wykorzystywane przez mikroorganizmy, muszą zostać najpierw rozłożone. Drobnoustroje wydzielają w tym celu proteinazy, enzymy zewnątrzkomórkowe, które hydrolizują białka, początkowo do peptydów, a w końcowym efekcie do aminokwasów. Aminokwasy mogą dalej ulegać reakcjom dekarboksylacji lub/i dezaminacji. W pierwszym przypadku powstają aminy biogenne – typowe produkty gnilnego rozkładu białek. Aktywność proteolityczną mikroorganizmów bada się na podłożach zawierających żelatynę. Wynikiem pozytywnym jest rozpuszczenie pożywki, wokół posiewu. Aktywność lipolityczna – drobnoustroje rozkładające tłuszcze tworzą lipazy, za pomocą których hydrolizują je do gliceryny i kwasów tłuszczowych. Kwasy tłuszczowe (szczególnie nienasycone), mogą dalej ulegać przemianom tzw. jełczeniu, w wyniku czego tworzą się związki o bardzo nieprzyjemnym zapachu. Aktywność lipolityczna badana jest na podłożu z margaryną. Wynikiem pozytywnym jest rozpuszczona pożywka wokół kolonii (strefa przejaśnienia). http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 24 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 4 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Aktywność celulolityczna – enzymatyczne rozszczepienie celulozy katalizowane jest przez celulazę, na której aktywność składają się co najmniej trzy enzymy: endo-β-1,4glukanaza (atakuje wiązania wewnątrz łańcuchów, tworzą się krótsze łańcuchy celulozowe), egzo-β-1,4-glukanaza (odcinająca disacharyd celobiozę od końców łańcuchów celulozy) oraz β-glukozydazy (hydrolizuję celobiozę do glukozy). Aktywność celulolityczną bada się na podłożu zawierającym karboksymetylocelulozę. Wynikiem pozytywnym jest upłynnienie pożywki. Aktywność amylolityczna – skrobia hydrolizowana jest przez enzymy amylazy. W wyniku jej rozpadu powstają coraz krótsze łańcuchy dekstryn, a w końcowym etapie maltotrioza, maltoza i glukoza. Aktywność tę bada się na podłożu zawierającym skrobie rozpuszczalną. Na posiew po tygodniu inkubacji nanosi się płyn Lugola, przejaśnienia wokół kolonii świadczą o reakcji pozytywnej. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 25
