Rozwój technik biologii molekularnej i związana z nim możliwość

Małgorzata Mazur
Zakład Higieny Pasz
Państwowy Instytut Weterynarii – Państwowy Instytut Badawczy
w Puławach
Rośliny transgeniczne – molekularne sposoby detekcji
Rozwój technik biologii molekularnej i związana z nim możliwość manipulowania
genami pozwoliły na poznanie struktury genomów oraz funkcji jakie pełnią określone geny
w organizmie. Manipulowanie genami pozwala ingerować w genom organizmu i może
polegać np.: na wyłączaniu lub wyciszaniu genów, zwiększaniu liczby kopii genów już
istniejących w danym organizmie czy wprowadzaniu genów pochodzących od innych
gatunków [14]. Celowa zmiana genomu organizmu dzięki zastosowaniu metod inżynierii
genetycznej umożliwiła tworzenie tzw. genetycznie zmodyfikowanych organizmów (z ang.
genetically modified organisms). Manipulacja genami może odbywać się w obrębie jednego
organizmu lub pomiędzy różnymi gatunkami. W przypadku zwielokrotnienia kopii genu już
występującego w organizmie, dana cecha może być silniej wyrażana, natomiast wprowadzone
obce geny (transgeny) nadają organizmowi nowe, specyficzne cechy. Ponieważ tego typu
zmiany dokonywane są bezpośrednio na poziomie DNA, pozwala to ominąć tradycyjne
i
często
żmudne
metody
hodowli
rekombinacyjnej
czy
techniki
selekcyjne
i krzyżowanie [16]. Dzięki temu w szybszy sposób możemy uzyskiwać odmiany roślin lub
zwierząt charakteryzujące się pożądanymi przez człowieka cechami i nadawać nowe
właściwości określonym organizmom (gatunkom).
W przypadku roślin manipulacje materiałem genetycznym umożliwiają np. nadawanie
im odporności na herbicydy, pestycydy, choroby, szkodniki owadzie lub prowadzą do
polepszenia ich cech jakościowych. Zmianom takim podlegają przede wszystkim rośliny
wykorzystywane do produkcji żywności i pasz, tj. soja, kukurydza i rzepak. Pomimo
wzrastającego zainteresowania roślinami transgenicznymi, stale powiększającym się areałem
ich uprawy i wieloma korzyściami związanymi z wykorzystaniem roślin GM, budzą one
wiele obaw i kontrowersji. Pojawiają się przede wszystkim pytania odnośnie wpływu GMO
na zdrowie ludzi i zwierząt oraz środowisko naturalne. Szeroko dyskutowaną kwestią jest
możliwość utraty kontroli nad ich rozprzestrzenianiem się czy też zmniejszenie
bioróżnorodności ekosystemów. Obawy budzi również potencjalny, poziomy (czyli
międzygatunkowy) transfer wprowadzanych transgenów do innych organizmów [4, 17].
W ostatnich latach możliwość „ucieczki” transgenów do dziko rosnących roślin
podlega szczególnej uwadze naukowców [9, 10, 20]. Wymiana genów pomiędzy roślinami
może doprowadzić do wyginięcia gatunków dziko żyjących albo ich lepszego przystosowania
i rozszerzenia zajmowanego terytorium, co w teorii może doprowadzić do wzrostu
zachwaszczenia, a nawet powstawania tzw. „superchwastów” [20]. Aby zminimalizować
ryzyko ucieczki transgenów i krzyżowego zapylenia, w wielu przypadkach uprawa
transgenicznych roślin odbywa się w tzw. strefach izolacyjnych. Umożliwiają one separację
roślin GM od innych dzikich gatunków. Jednak pomimo stosowania takich przeszkód,
rozprzestrzenianie się transgenów oraz ich obecność w środowisku jest w wielu przypadkach
odnotowywana [6, 18]. Dotyczy to przede wszystkim rzepaku odpornego na środki ochrony
roślin [2, 5, 6, 18]. Rzepak jest rośliną częściowo samo-, a częściowo obcopylną.
Ułatwionemu rozprzestrzenianiu się genów i przekrzyżowaniu sprzyja produkcja dużych
ilości pyłku, który może być przenoszony przez owady czy wiatr, a także zdolność
krzyżowania się rzepaku z gatunkami pokrewnymi takimi jak np.: Brassica rapa, B. juncea,
B. adpressa, B. oleracea, Raphanus raphinistrum, Hirschfeldia incana. Duże znaczenie ma
także wysoka produktywność nasion, brak konieczności okresu ich spoczynku oraz
zachowanie długiej zdolności do kiełkowania w niesprzyjających warunkach.
Wzrastające w ostatnich latach zainteresowanie uprawą rzepaku w Polsce związane
jest z jego wszechstronnym wykorzystywaniem. Stosowany jest on w przemyśle
spożywczym, technicznym (do produkcji biopaliw) czy w rolnictwie jako element
płodozmianu. Makuch i śruta rzepakowa będące pozostałością po tłoczeniu oleju mogą
stanowić wysokobiałkową paszę dla zwierząt. Jednak zawarte w rzepaku substancje
antyżywieniowe takie jak glukozynolany czy kwas erukowy początkowo znacznie
ograniczały jego stosowanie. W wyniku wieloletnich badań i zastosowaniu metod hodowli
rekombinacyjnej, selekcji i krzyżowania znacząco obniżono zawartość tych niepożądanych
substancji w rzepaku.
Obecnie stosowane techniki inżynierii genetycznej pozwalają w krótszym czasie
uzyskiwać rośliny o zmienionych właściwościach. Wzbogacenie informacji genetycznej
rzepaku przy wykorzystaniu technik transformacji genetycznej doprowadziło do uzyskania
odmian odpornych na środki ochrony roślin oraz ze zmienioną zawartością kwasów
tłuszczowych.
Na terenie Unii Europejskiej do uprawy dopuszczony jest transgeniczny rzepak (linia
GT73) odporny na glifosat [12, 13], herbicyd, którego mechanizm działania polega na
hamowaniu syntazy 5-enolopirogrono-3-fosfoszikimowej (EPSPS). Enzym ten uczestniczy
w biosyntezie aminokwasów aromatycznych i witamin. Rośliny nie potrafią wytwarzać tych
niezbędnych do wzrostu składników. Zahamowanie szlaku ich syntezy prowadzi do
zablokowania biosyntezy białka, czego następstwem jest śmierć rośliny. Uzyskanie rzepaku
GT73 cechującego się odpornością na glifosat polegało na wprowadzeniu do jego genomu
genu epsps, kodującego syntazę EPSPS odporną na ten herbicyd, a pozyskanego z bakterii
glebowych Agrobacterium tumefaciens szczep CP4 oraz genu gox pochodzącego
z Ochrobactrum anthropi szczep LBAA. Gen gox koduje oksydazę glifosatu, która
przyspiesza rozkład herbicydu. Kolejne odmiany rzepaku GM zarejestrowanego w UE tj.
Ms8xRf3 i T45 są odporne na działanie herbicydów fosfinotrycynowych zawierających
glufosynat. Glufosynat (fosfinotrycyna) pod względem chemicznym przypomina aminokwas glutaminę. Hamuje on aktywność enzymu - syntetazy glutaminy. Następstwem zmniejszenia
poziomu tego aminokwasu jest gromadzenie w tkankach dużych ilości amoniaku,
zablokowanie procesów fotooddychania i fotosyntezy, co prowadzi do obumierania roślin.
Wprowadzenie genu bar oraz genu pat, które kodują enzym N-acetylotransferazę –
fosfinotrycyny (PAT), odpowiednio do genomu rzepaku linii Ms8xRf3 i T45 pozwala tym
odmianom na acetylację glufosynatu i jego rozkład. W tym przypadku źródłem genów
warunkujących odporność na glufosynat stały się saprofity glebowe Streptomyces
viridochromogenes (geny pat) i Streptomyces hygroscopius (geny bar) [12, 13].
Pomimo oficjalnego zakazu obrotu na terenie Polski materiałem siewnym
zmodyfikowanym genetycznie możliwe jest tzw. "trans-graniczne" przemieszczanie się
GMO. Zanieczyszczenia transgenicznym rzepakiem mogą być technicznie nieuniknione
podczas uprawy, transportu i przechowywania nasion rzepaku. Brak właściwego monitoringu
GMO może doprowadzić do jego niekontrolowanego rozprzestrzeniania. Zgodnie
z obowiązującymi w Polsce przepisami Komisji Europejskiej, Rozporządzeniami Parlamentu
Europejskiego i Rady Europy (1829/2003/WE, 1830/2003/WE) istnieje konieczność
monitorowania oraz oznaczania żywności i pasz zawierających powyżej 0,9% GMO [22, 23].
Do wykrywania i identyfikacji organizmów genetycznie zmodyfikowanych najczęściej
wykorzystuję się specyficzną i czułą technikę PCR (ang. polymerase chain reaction) [1, 7].
Pozwala ona na szybką amplifikację (powielenie w próbówce) wybranego fragmentu DNA,
charakterystycznego dla danego organizmu. Metody oparte na PCR przeznaczone do detekcji
GMO, w zależności od ich specyficzności, można podzielić na kilka kategorii. Wstępną
informację odnośnie GMO mogą zapewnić metody przesiewowe (screeningowe). Pozwalają
one jednak tylko stwierdzić obecność genetycznej modyfikacji. Służą one bowiem
wykrywaniu takich elementów genetycznych jak sekwencje regulujące wyrażanie się
transgenów np. promotorów (P-35S wirusa mozaiki kalafiora CaMV), terminatorów (NOS
terminator genu syntazy nopaliny z Agrobacterium tumefaciens) czy też genów niosących
oporność na antybiotyki (np. nptII warunkujący odporność na kanamycynę/neomycynę).
Wykrycie takiego elementu w materiale genetycznym wyizolowanym z rośliny nie musi
jednak wcale oznaczać, że dany organizm rzeczywiści uległ transformacji genetycznej.
Źródłem takich elementów genetycznych mogą być chociażby bakterie glebowe np.
Agrobacterium sp. naturalnie występujące w przyrodzie, które w tym wypadku mogą
powodować swego rodzaju kontaminację w badanym DNA [11, 19]. Podobnie jest z tzw.
metodami genowo-specyficznymi, które pozwalają na wykrycie fragmentu wbudowywanego
transgenu. Geny takie mogą również występować w warunkach naturalnych przy czym te,
które są wykorzystywane w procesie transformacji często zwykle podlegają dodatkowym
modyfikacjom [8, 11], polegającym np. na ich skróceniu lub zmianie częstości
wykorzystywania kodonów [11]. Wykrycie fragmentu wbudowanego transgenu nie pozwala
jednak na ostateczne zidentyfikowanie odmiany GMO, ponieważ tego typu geny np.
warunkujące pożądaną cechę są wykorzystywane w wielu genetycznie zmodyfikowanych
roślinach. W związku z powyższym należy przeprowadzić bardziej szczegółową analizę.
Kolejnym typem reakcji PCR, wykorzystywanym w identyfikacji roślin GM, jest
reakcja, w której powielaniu ulega fragment konstruktu genowego wprowadzonego do
genomu podczas procesu transformacji. Jest to zazwyczaj miejsce znajdujące się pomiędzy
sąsiadującymi ze sobą wprowadzonymi elementami np. promotorem czy terminatorem
i transgenem. Podobnie jednak jak w przypadku opisanych powyżej sposobów detekcji GMO,
takie konstrukty genowe mogą być także wykorzystywane w wielu roślinach genetycznie
zmodyfikowanych [11]. Najbardziej specyficzną i wiarygodną reakcją, umożliwiającą
określenie odmiany GMO jest reakcja typu „event-specific”. Pozwala ona na wykrycie ściśle
specyficznego dla danego organizmu GM fragmentu DNA, obejmującego odcinek genomu
gospodarza i sąsiadującą z nim część wprowadzonego konstruktu genowego [8, 11].
Większość reakcji PCR służących identyfikacji GMO opiera się na amplifikacji
pojedynczego fragmentu DNA. Wiąże się to z koniecznością przeprowadzania kilku
oddzielnych reakcji i w związku z tym znacząco wydłuża analizę. Aby ominąć ten problem
i skrócić czas potrzebny do skutecznego wykrycia GMO możliwe jest zastosowanie reakcji
PCR w odmianie multipleks. Multipleks-PCR polega na zastosowaniu kilku par starterów
jednocześnie i umożliwia wykrycie w jednej reakcji więcej niż jednego fragmentu DNA
[8, 15, 19, 21].
Do ilościowego oznaczania organizmów zmodyfikowanych genetycznie wykorzystuje
się najczęściej technikę Real-Time PCR (odmiana PCR z wykrywaniem amplifikacji w czasie
rzeczywistym). Pozwala ona na monitorowanie w trakcie reakcji ilości powielanego DNA
poprzez pomiar fluorescencji związanej z ilością powstających produktów. Kontrolowanie
wydajności przebiegu reakcji możliwe jest dzięki zastosowaniu związków fluorescencyjnych
wiążących się z dwuniciowym DNA np.: SYBER Green, bądź poprzez użycie tzw. sond
molekularnych (np. typu TaqMan, Skorpion, Molecular Beacons lub FRET), ściśle
komplementarnych
do
powielanych
sekwencji
i
wyznakowanych
fluorochromami.
W przypadku wykonywania ilościowych oznaczeń GMO najczęściej wykorzystuje się sondy
typu TaqMan. Zawierają one na końcu 5’ barwnik fluorescencyjny, a na końcu 3’ barwnik
wygaszający. Podczas reakcji polimeraza posiadająca aktywność egzonukleazową 5’-3’
degraduje sondę, w wyniku czego następuje rozdzielenie barwników i emisja fluorescencji
barwnika z końca 5’ sondy, której intensywność można zmierzyć [3]. Zawartość
zmodyfikowanego DNA w badanym materiale oznacza się poprzez określenie ilości
transgenu w stosunku do ilości tzw. genu referencyjnego [24]. W tym celu wykorzystuje się
najczęściej metodę krzywych standardowych, względem których określa się ilość
amplifikowanego DNA w analizowanych próbkach. Technika Real-time PCR umożliwia
wykrycie nawet śladowych ilości GMO w badanym materiale biologicznym.
Metody wykorzystujące technikę PCR i Real-time PCR umożliwiają przeprowadzanie
szybkiej,
wiarygodnej
i
stosunkowo
taniej
analizy.
Brak
odpowiednich
zabezpieczeń upraw GMO oraz efektywnego monitoringu w tym zakresie może
doprowadzić
do
zanieczyszczenia
upraw
konwencjonalnych
i
ekologicznych.
W związku z powyższym niezwykle istotne jest prowadzenie badań pozwalających na
kontrolowanie obecności GMO w środowisku oraz rozszerzanie i opracowywanie nowych
metodyk służących tego typu badaniom.
1. Alexander T.W., Reuter T., Aulrich K., Sharma R., Okine E.K., Dixon W.T.,
McAllister T.A.: A review of the detection and fate of novel plant molecules derived
from biotechnology in livestock production. Anim Feed Sci Technol, 2007, 133, 31-62
2. Beckie H.J., Wawrick S.I.: Persistence of an oilseed rape transgene in the
environment. Crop Prot 2010, 29, 509-512
3. Burns M.J., Valdivia H., Harris N.: Analysis and interpretation of data from real-time
PCR trace detection methodsusing quantitation of GM soya as a model system. Anal
Bioanal Chem 2004, 378, 1616–1623
4. Clark A.E.: Enviromental risks of genetic engineering. Euphytica 2006, 148, 47-60
5. D'Hertefeldt T., Jørgensen R.B., Pettersson L.: Long-term persistence of GM oilseed
rape in the seedbank. Biol Lett 2008, 4, 314-317
6. Damgaard Ch., Kjellsson G.: Gene flow of oilseed rape (Brassica napus) according to
isolation distance and buffer zone. Agric Ecosyst Environ 2005, 108, 291-301
7. Desighn A.K., Badrie N.: Detection approaches for genetically modified organisms in
foods. Food Res Int 2005, 38, 639-649
8. Dörries H.H., Remus I., Grönewald A., Grönewald C., Berghof-Jäger K.:
Development of a qualitative, multiplex real-time PCR kit for screening of genetically
modified organisms (GMOs). Anal Bioanal Chem 2009, 396, 2043-54
9. Funk T., Wenzel G., Schwarz G.: Outcrossing frequencies and distribution of
transgenic oilseed rape (Brassica napus L.) in the nearest neighbourhood. Eur J Agron
2006, 24, 26-34
10. Gasson M.J.: Gene transfer from genetically modified food. Curr Opin Biotechnol
2000, 11, 505-508
11. Holst-Jensen A., Ronning S.B., Lovseth A.: PCR technology for screening and
quantification of genetically modified organisms (GMOs). Anal Bioanal Chem 2003,
375, 985-993
12. http://bch.cbd.int/database/lmo-registry/
13. http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm
14. Hughes M.A.: Plant molecular genetics Sep 30, 1996
15. James D., Schmidt A.M., Wall E., Green M., Masri S.: Reliable detection and
identification of genetically modified maize, soybean, and canola by multiplex PCR
analysis. J Agric Food Chem 2003, 51, 5829-34
16. Käppeli O., Auberson L.: How safe is safe enough in plant genetic engineering?
Trends Plant Sci 1998, 7, 276-281
17. Kuiper H.A., Kleter G.A.: The scientific basis for risk assessment and regulation of
genetically modified Food. Trends Food Sci Techn 2003, 14, 277-293
18. Londo J.P., Bautista N.S., Sagers C.L., Lee E.H.: Watrud L.S.Glyphosate drift
promotes changes in fitness and transgene gene flow in canola (Brassica napus) and
hybrids. Ann Bot 2010, 106, 957-65
19. Marmiroli N., Maestri E., Gullì M., Malcevschi A., Peano C., Bordoni R., De Bellis
G.: Methods for detection of GMOs in food and feed. Anal Bioanal Chem 2008, 392,
369-384
20. Munier D.J., Brittan K.L., Lanini W.T., Seed bank persistence of genetically modified
canola in California. Environ Sci Pollut Res Int 2012, 19, 2281-2284
21. Peano C., Bordoni R., Gulli M., Mezzelani A., Samson M.C., Bellis G.D., Marmiroli
N.: Multiplex polymerase chain reaction and ligation detection reaction/universal
array technology for the traceability of genetically modified organisms in foods. Anal
Biochem 2005, 346, 90-100
22. Rozporządzenie nr 1829/2003/WE Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 22
września 2003 r. w sprawie zmodyfikowanej genetycznie żywności i paszy
23. Rozporządzenie nr 1830/2003/WE Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 22
września 2003 r. dotyczące możliwości śledzenia i etykietowania organizmów
zmodyfikowanych genetycznie oraz możliwości śledzenia żywności i produktów
paszowych wyprodukowanych z organizmów zmodyfikowanych genetycznie i
zmieniające Dyrektywę 2001/18/WE
24. Schmidt A.M., Rott M.E.: Real-Time Polymerase Chain Reaction (PCR) Quantitative
Detection of Brassica napus Usilng a locked Nukleid acid TaqMan Probe. J Agric
Food Chem 2006, 54, 1158-1165