Badania mikrobiologiczne gleby dla celów sanitarnych
advertisement
Temat 9: Analiza mikrobiologiczna gleby Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien: Wiedzieć, co to jest gleba i co rozumiemy pod pojęciem edafonu glebowego, Znać, jakie mikroorganizmy występują w glebie i czym się charakteryzują, Umieć scharakteryzować mikroorganizmy glebowe i omówić ich rolę w glebie, Znać rolę flory i fauny glebowej, Umieć scharakteryzować mikroflorę autochtoniczną i zymogeniczną gleby. Znać pojęcia: edafon, rizosfera, patogen, fitoedafon, zooedafon, helminty oraz pozostałe wymienione w punkcie 5.3. Znać zakres sanitarnej analizy mikrobiologicznej gleby Umieć oznaczyć liczebność w glebie bakterii, grzybów oraz jaj robaków pasożytniczych. 1.Gleba - to powierzchniowa warstwa litosfery ziemskiej, utworzona z wietrzejącej skały, przekształconej w specyficzny sposób przez organizmy żywe. Gleba jest złożonym utworem umożliwiającym funkcjonowanie ekosystemów glebowych. W skład gleby wchodzą cząstki stałe mineralne i organiczne, powietrze i roztwór glebowy oraz bytujące w niej organizmy żywe - edafon. Proporcje poszczególnych składników w glebie utrzymują się mniej więcej na tym samym poziomie właściwym dla danej gleby. 2. Edafon glebowy Organizmy zasiedlające glebę tworzą złożony zespół o bardzo dużej liczebności zwany edafonem. Są to mikroorganizmy, grzyby, jednokomórkowce roślinne i zwierzęce, rośliny naczyniowe oraz bezkręgowce bytujące w przypowierzchniowej warstwie gleby. Edafon może stanowić od 1 do 10% suchej masy substancji organicznej gleby. Ze względu na rozmiar organizmy żyjące w glebie można zaliczyć do trzech grup: - Mikrobiota (niedostrzegalne gołym okiem)- wirusy, bakterie, grzyby, pierwotniaki, glony - Mezobiota (0,2-2 mm) - wazonkowce, nicienie, ślimaki, owady bezskrzydłe, wije, roztocza i inne, małe rośliny, - Makrobiota (>2 mm) - dżdżownice, krety, gryzonie np. myszy polne, większe owady, korzenie dużych roślin i drzew. 3. Charakterystyka mikroorganizmów glebowych. Wirusy Wirusy prowadzą wyłącznie pasożytniczy tryb życia – reprodukują się w komórkach bakterii, roślin, zwierząt i człowieka. W środowisku glebowym najważniejszą rolę odgrywają wirusy bakterii – bakteriofagi, Fagi są jednym z elementów nisz ekologicznych ograniczającym nadmierny rozwój bakterii, Rola fagów w środowisku glebowym polega na ich zdolności niszczenia niektórych populacji bakterii i w związku z tym - prowadzenia ich selekcji, zarówno negatywnej, jak i pozytywnej. Przykładem negatywnego ich działania są fagi atakujące bakterie brodawkowe z rodzaju Rhizobium będące przyczyna spadku plonów roślin motylkowych Bakterie Bakterie stanowią podstawową masę mikroorganizmów glebowych. Charakteryzują się one wysoką aktywnością metaboliczną. Większość bakterii glebowych odznacza się właściwością przylegania (adhezji) do powierzchni cząstek mineralnych i koloidów glebowych. Szczególnie duże ilości bakterii gromadzą się w pobliżu resztek tkanek roślinnych i zwierzęcych oraz w odchodach zwierząt dostających się do gleby. Środowiskiem specjalnie sprzyjającym rozwojowi bakterii są korzenie roślin i ich inne podziemne części. Bakterie glebowe można podzielić na dwie grupy: takie, które występują w glebie zawsze, niezależnie od jej rodzaju i żyzności (autochtoniczne) oraz takie, które rozwijają się w niej masowo po wprowadzeniu do gleby dużej ilości materii organicznej (zymogeniczne). Wśród licznych bakterii glebowych ilościowo dominują promieniowce oraz maczugowce z rodzaju Arthrobacter Grzyby Grzyby należą do organizmów eukariotycznych. Są bezwzględnymi chemoorganotrofami, większość z nich to tlenowce lub grzyby fermentacyjne. Energię i węgiel do budowy własnych komórek czerpią z rozkładu substancji organicznej. Nie posiadają chlorofilu. W przeciwieństwie do bakterii, ściana komórkowa grzybów zawiera chitynę, glukan i inne polisacharydy. Bytują one zwykle w powierzchniowych warstwach gleby; można je także spotkać na głębokości do ok. 1 m. Wchodzą w symbiotyczne zależności z glonami, owadami, i roślinami wyższymi. Wiele gatunków grzybów jest patogennych dla człowieka, roślin i zwierząt. Ich formy wegetatywne tworzą nitkowate strzępki, mniej lub bardziej rozgałęzione, zwykle wielokomórkowe, których gęste sploty formują grzybnię lub plechę. Poszczególne komórki mają wielkość ok. 10 m. Do najpospolitszych grzybów glebowych należą rodzaje:Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, Verticillium, Fusarium, Rhizopus, Mucor, Zygorhynchus, Chaetomium. Grzyby rozwijają się silnie w glebach kwaśnych i wpływają istotnie na zmiany odczynu gleby. Rola bakterii i grzybów Są współtwórcami struktury gleby – tworzą próchnicę - najważniejszy koloid glebowy, wpływający w zasadniczy sposób na jej strukturę, właściwości sorpcyjne, zasobność w składniki organiczne. Wpływają w decydujący sposób na powstawanie gruzełkowatej, gąbczastej struktury gleby przez wytwarzanie śluzów otoczkowych oraz, w przypadku bakterii nitkowatych i grzybów, przez formę swego wzrostu. Flora glebowa (fitoedafon) Fitoedafon stanowią głównie glony, oraz w mniejszym stopniu rośliny wyższe. Glony stanowią główny składnik fitoedafonu. Najliczniej występują na powierzchni gleby; do głębszych warstw dostają się na skutek jej uprawy, przesiąkania wody, działalności zwierząt i zdolności migracji. Wyróżniamy zbiorowiska glonów żyjących na powierzchni gleby – epifitoedafon oraz w głębszych jej warstwach - endofitoedafon Fauna glebowa Mikrofauna glebowa reprezentowana jest przez pierwotniaki (Protozoa). Odżywiają się one głównie bakteriami, ich rola polega na selekcji i odmładzaniu populacji bakterii glebowych. Dominują wśród nich korzenionóżki (ameby) i wiciowce. Mezofaunę reprezentują nicienie, wazonkowce, ślimaki, owady, wije, roztocza i inne. Odżywiają się one martwą materią organiczną przyczyniając się do tworzenia próchnicy. Spośród makrofauny pewne znaczenie mają dżdżownice, krety, gryzonie, które rozdrabniają materiał glebowy i przenoszą go na znaczną głębokość. Najważniejszą rolę wśród bezkręgowców odgrywają w glebie dżdżownice, które odżywiają się martwą materią organiczną, pobierając ją wraz z mineralną częścią gleby. Niestrawione resztki zmieszane z glebą mineralną i metabolitami wydalają w postaci grudek (koprolitów), przyczyniając się w ten sposób do tworzenia korzystnej gruzełkowatej struktury gleby i do jej spulchniania. W ciągu roku dżdżownice mogą na hektarze przepuszczać przez swój przewód pokarmowy około 7 tys. kg gleby. Dzięki ruchliwości zwierząt gleba ulega ciągłemu mechanicznemu mieszaniu, co powoduje lepsze jej napowietrzenie, natlenienie i przepływ wody. 4. Podział mikroflory glebowej ze względu na pochodzenie Mikroflora autochtoniczna Mikroflorę gleby dzieli się na autochtoniczną i zymogeniczną. Drobnoustroje autochtoniczne czerpią energię z rozkładu materii organicznej powodując jej mineralizację. Przedstawicielami tej grupy w glebie są najczęściej drobnoustroje, dla których źródło węgla i energii stanowią substancje humusowe, tj. związki powstałe z rozkładu i przetworzenia materii organicznej pochodzenia roślinnego i zwierzęcego. Przedstawicielami tej grupy są najczęściej tlenowe nieprzetrwalnikujące bakterie z rodzaju Arthrobacter oraz prątki z rodzaju Mycobacterium. Stałymi mieszkańcami gleby są także promieniowce z rodzaju Streptomyces i Nocardia oraz bakterie śluzowe (Myxobacteriales). Dla gleby, choć nie tylko dla niej, charakterystyczne są bakterie wiążące azot atmosferyczny, bakterie nitryfikacyjne. Pospolite są także tlenowe laseczki przetrwalnikujące z rodzaju Bacillus i beztlenowe z rodzaju Clostridium. Mikroflora zymogeniczna Drobnoustroje zymogeniczne wprowadzane są do gleb okresowo. Pochodzą one z wprowadzanych do gleb ścieków, odpadów komunalnych i przemysłowych oraz z odpadów powstających w hodowli zwierząt (np.obornik i gnojówka), Są to organizmy o dużych wymaganiach odżywczych, których rozwój uzależniony jest od dopływu świeżej, łatwo przyswajalnej materii organicznej. Bakterie zymogeniczne bytujące w glebie to głównie gramujemne pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae oraz z rodzaju Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium. W glebie zanieczyszczonej odchodami czy szczątkami zwierząt i roślin mogą występować drobnoustroje chorobotwórcze (patogenne). Spośród bakterii szczególnie niebezpieczne dla człowieka są pałeczki duru brzusznego z rodzaju Salmonella i pałeczki czerwonki – Shigella., beztlenowe laseczki wywołujące tężec – Clostridium tetani, zgorzel gazową – Clostridium perfringens, zatrucia pokarmowe – Clostridium botulinum oraz tlenowe laseczki wąglika – Bacillus anthracis, a także prątki – Mycobacterium tuberculosis. Ponadto do bakterii chorobotwórczych występujących w glebie zalicza się niektóre promieniowce wywołujące tzw. promienicę. Grzyby są przyczyną zakażeń skóry i tkanek wewnętrznych, a organizmy zwierzęce jak pierwotniaki i robaki – chorób głównie przewodu pokarmowego. Szczególną uwagę należy zwrócić na możliwość występowania w glebie jaj robaków pasożytniczych np. glisty ludzkiej. Jej jaja przechodzą w glebie okres dojrzewania i wykazują dużą odporność na działanie czynników zewnętrznych. Podobnie jak endospory bakterii, zarodniki grzybów i cysty pierwotniaków, mogą przez długi okres czasu bytować w glebie i stanowić zagrożenie dla człowieka. 5. Ocena jakości gleby za pomocą analizy mikrobiologiczno-helmintologicznej. 5.1. Analizę stosuje się do oceny: - metod unieszkodliwiania odpadków miejskich, - jakości osadów ściekowych, odpadów i nawozów wykorzystywanych do celów rolniczych, - stanu sanitarnego gleby przy planowaniu i budowie osiedli mieszkaniowych , żłobków przedszkoli, obiektów dla służby zdrowia i przemysłu spożywczego oraz rekreacyjnych, jak również do oceny stanu sanitarnego gleby na cele rolnicze. Ponadto uzyskane wyniki mogą być przydatne do wyjaśnienia dróg zakażenia i określenia czasu przeżywalności mikroorganizmów chorobotwórczych w glebie. Są one również istotne z punktu widzenia możliwości zakażenia poprzez glebę wód gruntowych i powierzchniowych. 5.2. Zakres analizy mikrobiologicznej gleby pod względem sanitarnym powinien obejmować: Oznaczenie obecności w glebie bakterii chorobotwórczych z rodzaju Salmonella. W glebie przeznaczonej do celów rolniczych nie mogą się znajdować bakterie należących do tego rodzaju. Badania helmintologiczne polegające na określeniu liczby żywych jaj robaków jelitowych: glisty ludzkiej (Ascaris lumbricoides), glisty psiej (Toxocara sp.), włosogłówki (Trichuris trichiura), określeniu stadium ich rozwoju oraz stopnia odporności na różne warunki mikroklimatyczne. Stopień zanieczyszczenia gleby jajami robaków (helmintów) określa się w odniesieniu do 100 g gleby, uznając glebę za: o nie zanieczyszczoną - nie wykrycie jaj, o słabo zanieczyszczoną - wykrycie pojedynczych jaj (1-3), o średnio zanieczyszczoną - wykrycie do 10 jaj, o silnie zanieczyszczoną - wykrycie 10 jaj i więcej Ponadto badania uzupełnić można o oznaczenia: - ogólnej liczby bakterii – wykonywane na podłożu agarowym, temperatura - 280C, czas inkubacji –48 h, - bakterii przetrwalnikujących (sporowych) – podłoże agarowe, temperatura 280C, czas inkubacji–48 h, - bakterii termofilnych – podłoże agarowe, temperatura 550C, czas inkubacji–24 h. - liczebności bakterii wskaźnikowych: pałeczek grupy coli, pałeczek grupy coli typu fekalnego (termotolerancyjnych), głównie pałeczki okrężnicy (Escherichia coli), laseczek Clostridium perfringens, 5.3. Określenia stosowane w analizie mikrobiologiczno-helmintologicznej gleby: - Miano – najmniejsza ilość badanej gleby wyrażona w gramach, w której stwierdza się jeszcze obecność badanych bakterii. - Bakterie grupy coli – Gram-ujemne pałeczki niewytwarzające przetrwalników, rozwijające się w warunkach względnie beztlenowych, mające zdolność fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu w ciągu 48 h hodowania w temperaturze 35-37OC. Należą one do rodzaju Escherichia, Citrobacter i Enterobacter w obrębie rodziny Enterobacteriaceae. - Bakterie coli typu fekalnego (termotolerancyjne) pałeczki okrężnicy (Escherichia coli) – są to pałeczki z grupy coli, które poza wszystkimi właściwościami tej grupy (pałeczki Gram-ujemne, oksydazoujemne, niewytwarzające przetrwalników, względnie beztlenowe, fermentujące laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w temperaturze 370C w ciągu 48 h oraz dające charakterystyczne kolonie na pożywce Endo) mają ponadto zdolność wzrostu oraz przeprowadzania niektórych procesów biochemicznych, a w szczególności fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu również w temperaturze 440C - Bakterie Clostridium perfringens – są to nieruchliwe, beztlenowe laseczki Gramdodatnie wytwarzające otoczki i wykazujące zdolność do fermentacji glukozy, laktozy, rozkładu żelatyny, a także redukcji siarczynów do H2S. - Bakterie z rodzaju Salmonella – chorobotwórcze pałeczki przewodu pokarmowego. Wiele gatunków bakterii tego samego rodzaju wywołuje salmonellozy, czyli zatrucia pokarmowe. Salmonella typhi wywołuje chorobę zwaną durem brzusznym. - Bakterie wytwarzające przetrwalniki (bakterie sporowe) – Gram-dodatnie laseczki (tlenowe i beztlenowe) wytwarzające przetrwalniki (zwane również endosporami). Należą głównie do rodzaju Bacillus i Clostridium. - Bakterie termofilne – to bakterie rozwijające się w wyższych temperaturach, 45-600C (optimum – 550C), głównie w oborniku i kompoście, stosowanych do nawożenia i mogą być wskaźnikiem ich obecności w glebach uprawnych. - „Ogólna” liczba bakterii – to wskaźnik zawartości związków organicznych w glebie. W końcowym etapie procesu mineralizacji, w miarę wyczerpywania się łatwo rozkładalnych źródeł pokarmowych wzrasta ilość spor bakteryjnych Stosunek ogólnej liczby bakterii do liczby bakterii sporowych – świadczy o stopniu rozkładu w glebie związków organicznych. - Badania helmintologiczne – służą wykrywaniu robaków jelitowych w glebie, a głównie ich jaj (tzw. jaj „geohelmintów”): glisty ludzkiej (Ascaris lumbricoides), glisty psiej (Toxocara sp.), włosogłówki (Trichuris trichiura). - Stadium tworzenia się larwy w jaju i okresy zdolności życiowych robaków (helmintów) w glebie, mogą być użyte do oceny, od jak dawna gleba jest zanieczyszczona. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Analiza mikrobiologiczno-helmintologiczna gleby Pobieranie próbek do badań: 1) Przy wyborze miejsca pobrania próbek gleby konieczne jest posiadanie danych charakteryzujących: - strukturę gleby, - sposoby nawożenia, - pokrycie roślinne, - warunki klimatyczne, - należy uwzględnić również: wielkość badanej powierzchni gleby, umiejscowienie na niej źródeł zanieczyszczenia, obecność lub brak kanalizacji. 2) Słoje zawierające próbki gleby należy zamknąć korkami z waty i zaopatrzyć w etykiety uwzględniające: datę i miejsce pobrania próbki, nazwisko pobierającego. Przechowywanie i przesyłanie próbek: Badanie bakteriologiczne gleby należy wykonać w dniu pobierania próbek. W razie konieczności ich przechowywania oraz podczas transportu do laboratorium należy umieścić je w temperaturze ok. 40C na okres nie dłuższy niż 24 h. Przygotowanie próbki do badań: - Objętość posiewanej próbki uzależniona jest od jej rodzaju i stopnia zanieczyszczenia oraz celu badania i wymagań sanitarnych. - Przygotowane rozcieńczenia próbek mogą być przetrzymywane nie dłużej niż 30 min. Przed posiewem należy: - Sprawdzić probówki z pożywką Kesslera i odrzucić te, w których stwierdza się obecność pęcherzyka powietrza w probówce Durhama. - Wszystkie naczynia z pożywkami należy odpowiednio oznakować podając: numer próbki, datę i ewentualnie posiewaną objętość próbki. - Przy posiewie próbki, jak i przy jej rozcieńczeniu, należy zachować warunki jałowości. Zadanie 1. Badanie „ogólnej” liczby bakterii saprofitycznych i przetrwalnikujących Badanie przeprowadza się metodą płytkową Kocha stosując posiew wgłębny próbek na podłoże agarowe odżywcze. Badania obejmują określenie: a) „ogólnej” liczby bakterii na podłożu agarowym odżywczym – zwykłym, w temperaturze - 280C w czasie inkubacji – 48±2 h, b) liczby bakterii wytwarzających przetrwalniki (sporowych) – na podłożu agarowym odżywczym – zwykłym, w temperaturze 280C, czas inkubacji–48±2 h, w celu usunięcia niesporowej flory bakteryjnej, rozcieńczenia gleby przed posiewem należy ogrzewać na łaźni wodnej w ciągu 15 minut w temperaturze 800C. Do posiewu należy użyć po 1 cm3 zawiesiny z następujących rozcieńczeń: - gleba piaszczysta – 10-1 –10-3, - gleba ogrodowa oraz kompost z odpadków miejskich: 10-4 – 10-6. Po okresie inkubacji należy policzyć ilość wyrosłych kolonii. Do obliczenia liczby kolonii wybrać płytki, na których wyrosło 30-300 kolonii. Równolegle oznaczyć suchą masę 100 g próbki gleby uprzednio wysuszonej w temperaturze 1050C do uzyskania stałej wagi. Ostateczny wynik badania podaje się jako liczbę bakterii występującą w 1 g sm gleby w stosunku do „ogólnej” liczby bakterii. Należy też podać procentową zawartość bakterii sporowych.. - Zadanie 2. Wykrywanie bakterii grupy coli i bakterii coli typu kałowego (Escherichia coli) Bakterie wykrywa się metodą fermentacyjną probówkową, opartą na zdolności tych bakterii do fermentowania laktozy z wytworzeniem w podłożu kwasu oraz widocznego gazu. a) Oznaczenia bakterii grupy coli przeprowadza się w 3 etapach: Etap I - Badanie wstępne - polega na posiewie (wprowadzeniu) odpowiednich objętości roztworu glebowego do podłoża płynnego Kesslera-Swenartona i inkubacji w temperaturze 37 OC przez 24-48 h. Za wynik dodatni badania wstępnego przyjmuje się: - obecność każdej objętości gazu w probówce Durhama, lub wystąpienie pęcherzyków gazu w całej objętości pożywki przy lekkim wstrząśnięciu, przy jednoczesnym zmętnieniu podłoża i jego zakwaszeniu (zmiana barwy z granatowej na żółtą o różnym stopniu intensywności). Powyższe zmiany mogą wystąpić po pierwszej lub drugiej dobie hodowli. Wyniki należy odczytywać po raz pierwszy bezwzględnie po 18-24 h. Przy braku uprzednio podanych zmian po 24 h hodowle inkubuje się dalej i ponownie odczytuje wynik po 48 h. Za wynik ujemny badania wstępnego przyjmuje się: - brak gazu i zakwaszenia po 48 h inkubacji. Za wynik wątpliwy badania wstępnego przyjmuje się: - pojawienie się bardzo małej ilości gazu przy jednoczesnym bardzo słabym zakwaszeniu lub braku zakwaszenia, szczególnie po 48 h. Hodowle uznane za wątpliwe po 24 h inkubacji poddaje się badaniu potwierdzającemu już po tym okresie, a następnie inkubuje dalej do 48h. W przypadku uzyskania wyniku dodatniego badania potwierdzającego z dwudziestogodzinnej hodowli, nie wykonuje się badania potwierdzającego po raz drugi po 48 h. Etap II – Badanie potwierdzające – należy wykonać w celu potwierdzenia obecności bakterii grupy coli, w zasadzie ze wszystkich dodatnich i wątpliwych hodowli badania wstępnego uzyskanych po 24 lub 48 h. Potwierdzenie hodowli dodatnich uzasadnia się koniecznością wykluczenia tzw. wyników dodatnich fałszywych. Badania potwierdzające obecność bakterii grupy coli wykonuje się na pożywce Endo metodą posiewu powierzchniowego. Badanie potwierdzające wykonuje się zgodnie z metodyka stosowaną w badaniu mikrobiologicznym wody dla celów sanitarnych. Etap III – Badanie uzupełniające – jest to dalszy etap badania potwierdzającego i stosuje się je w przypadku, gdy na pożywce Endo wyrosną nietypowe bakterie, podejrzewane o przynależność do bakterii grupy coli. Badanie uzupełniające wykonuje się zgodnie z metodyka stosowaną w badaniu mikrobiologicznym wody dla celów sanitarnych. W zależności od rodzaju próbki stosuje się następujący system posiewów: - gleba piaszczysta – 10 cm3 z rozcieńczenia 10-1, czyli 10 x 0,1 g – co jest równoważne 1 g gleby, - gleba ogrodowa i kompost z odpadków miejskich: – 10 cm3 z rozcieńczenia 10-1, czyli 10 x 0,1 g – co jest równoważne 1 g gleby, – 1 cm3 z rozcieńczenia 10-1-10 -6, czyli 1 x 0,1 – 0,000001 g. Posiewy 10 cm3 próbki rozcieńczonej 10-1 należy wykonać na podłoże o stężeniu podwójnym, a posiewy 1 cm3 próbek z rozcieńczeń 10-1 – 10-6 na podłoże o stężeniu normalnym. Ostateczny wynik badania podaje się jako miano bakterii grupy coli (miano coli). b) Oznaczenia bakterii coli typu kałowego (termotolerancyjnych), pałeczki okrężnicy (Escherichia coli) - przeprowadza się w 2 etapach: Etap I - Badanie wstępne - polega na posiewie (wprowadzeniu) odpowiednich objętości roztworu glebowego do podłoża płynnego Kesslera-Swenartona i inkubacji w temperaturze 37 OC przez 24-48 h (tak jak w etapie I przy oznaczaniu bakterii grupy coli). Badanie wstępne wykonuje się zgodnie z metodyka stosowaną w badaniu mikrobiologicznym wody dla celów sanitarnych. Etap II – Badanie potwierdzające – ma na celu stwierdzenie, czy bakterie fermentujące laktozę w badaniu wstępnym należą do grupy coli typu kałowego. Badanie potwierdzające wykonuje się zgodnie z metodyką stosowaną w badaniu mikrobiologicznym wody dla celów sanitarnych. W przypadku konieczności lub potrzeby zidentyfikowania bakterii jako Escherichia coli, należy wykonać dodatkowo badania: - według szeregu IMViC, - lub zastosować szybki test w temperaturze 44 0C. Identyfikowanie bakterii jako Escherichia coli, wykonuje się zgodnie z metodyką stosowaną w badaniu mikrobiologicznym wody dla celów sanitarnych. Ostateczny wynik badania podaje się jako miano bakterii coli typu kałowego (miano E. coli). Zadanie 3. Wykrywanie bakterii Clostridium perfringens Przeprowadza się je stosując posiew wgłębny próbek na podłoże siarczynowo-żelazowe wg. Wilsona-Blaira w temperaturze 370C przez 18-24±2 h. (Wykrywanie bakterii Clostridium perfringens można przeprowadzać również metodą hodowli na pożywce stałej). Do posiewu należy użyć po 1 cm3 zawiesiny z następujących rozcieńczeń: - gleba piaszczysta – 10-1 –10-4, - gleba ogrodowa oraz kompost z odpadków miejskich: 10-1 – 10-6. W celu wyeliminowania mikroflory niesporowej wszystkie rozcieńczenia próbek należy przed posiewem ogrzewać w łaźni wodnej w temperaturze 800C w ciągu 15 min. Pojawienie się w ciągu pierwszych 18 h inkubacji w głębi agaru czarnych kolonii często rozrywających podłoże na skutek wytwarzania gazu świadczy o obecności Clostridium perfringens. Czarne zabarwienie kolonii powstaje w wyniku redukcji siarczynu do siarczku sodu, który z chlorkiem żelaza tworzy czarno zabarwiony siarczek żelaza. Ostateczny wynik badania podaje się jako miano bakterii Clostridium perfringens. Zadanie 4. Oznaczanie bakterii z rodzaju Salmonella Badanie przeprowadza się w 2 etapach: Etap I – Badanie wstępne – metoda hodowli na podłożu płynnym wybiórczo namnażającym z kwaśnym seleninem sodu, w którym pewne pałeczki chorobotwórcze ulegają namnożeniu, a wzrost innych jest w różnym stopniu zahamowany - polega na posiewie (wprowadzeniu) odpowiedniej ilości gleby do podłoża namnażającego i inkubacji w temperaturze 370C przez 18-24 h. Za wynik dodatni badania wstępnego przyjmuje się: - zmętnienie podłoża, - uzyskanie barwy ceglastej. Za wynik ujemny badania wstępnego przyjmuje się : - brak zmętnienia i barwy podłoża. Za wynik wątpliwy badania wstępnego przyjmuje się: - pojawienie się bardzo słabego zmętnienia przy jednoczesnym słabym zabarwieniu podłoża na kolor ceglasty, - brak zmętnienia i zabarwienie na kolor ceglasty. Hodowle uznane za wątpliwe po 18-24 h inkubacji poddaje się badaniu potwierdzającemu. Etap II – Badanie potwierdzające – należy wykonać w celu potwierdzenia obecności bakterii z rodzaju Salmonella, w zasadzie ze wszystkich dodatnich i wątpliwych hodowli badania wstępnego uzyskanych w czasie 18- 24 h. Potwierdzenie hodowli dodatnich uzasadnia się koniecznością wykluczenia tzw. wyników dodatnich fałszywych. Badania potwierdzające obecność bakterii z rodzaju Salmonella wykonuje się w temperaturze 370C, na podłożach wybiórczo-różnicujących, stałych, na których w zależności od właściwości biochemicznych kolonie drobnoustrojów mogą wykazywać różnice o znaczeniu rozpoznawczym. Z tego rodzaju podłoży zalecane są podłoża wykorzystujące zdolność pałeczek jelitowych do fermentacji laktozy, co uwidacznia się jako zmiana zabarwienia kolonii lub jako zdolność do zmiany potencjału oksydoredukcyjnego w czasie wzrostu drobnoustrojów: - metodą powierzchniową: o na podłożu Mc Conkeya, o na podłożu SS (Salmonella-Shigella). - metodą kłutą i posiewu powierzchniowego na podłożu Kliglera Za wynik dodatni badania potwierdzającego przyjmuje się: o na podłożu Mc Conkeya – obecność i wzrost kolonii nie rozkładających laktozy, czyli kolonii o zabarwieniu różowym, o na podłożu SS (Salmonella-Shigella) - obecność i wzrost kolonii bezbarwnych, gładkich z czarnymi środkami, o na podłożu Kliglera: - zmianę barwy dolnej części podłoża na żółtą, podczas gdy powierzchnia skośna pozostaje bez zmian (czyli ma kolor czerwony tak jak pożywka wyjściowa), - ciemnienie (zaczernienie) podłoża wskazujące na wytworzenie się siarkowodoru z równoczesnym rozmieszczaniem się tego gazu wewnątrz podłoża w postaci baniek. W wykrywaniu bakterii z rodzaju Salmonella wykorzystywane są również podłoża pozwalające na wykrycie właściwości biochemicznych izolowanych drobnoustrojów np.: fermentacji cukrów, alkoholi, wytwarzanie indolu itp Do posiewu należy użyć 4 x 25 g gleby, tak, aby zostało przebadane 100 g gleby. Zadanie 5. Wykrywanie żywych jaj robaków jelitowych i określenie stadium ich rozwoju: glisty ludzkiej (Ascaris lumbricoides), glisty psiej (Toxocara sp.), włosogłówki (Trichuris trichiura). Wykrywanie żywych jaj pasożytów jelitowych wykonuje się w 3 etapach: Etap I – polega na „odlepieniu” jaj pasożytów od podłoża (grudek ziemi i osadów). Etap ten trwa 1 h i przeprowadzony jest z użyciem 5 % wodorotlenku sodu. Etap II flotacja- przeprowadzona przy użyciu 5 % siarczanu cynku i w wyniku wirowania roztworu glebowego (od 1 do 5 wirowań). zagęszczanie do niewielkiej ilości, za pomocą pipety, wyflotowanych na powierzchnię roztworu glebowego jaj pasożytów. Etap III – to obserwacja i rozpoznawanie jaj pasożytów przy użyciu mikroskopu.
