cytometria przepływowa jako metoda fenotypowania komórek krwi.

CYTOMETRIA
PRZEPŁYWOWA JAKO
METODA
FENOTYPOWANIA
KOMÓREK KRWI
Anna Noatynska
Dorota Feret
CYTOMETRIA
PPZEPŁYWOWA
• Cytometria przepływowa to metoda
pomiaru pojedynczych komórek lub
cząsteczek przepływających przez aparat
w strumieniu cieczy.
• FACS (Fluorescence Activating Cell
Sorting) rozszerzona metoda cytometrii
przepływowej, w której oprócz pomiarów
komórek są stosowane również urządzenia
sortujące.
MIERZONE SYGNAŁY
• rozproszenie światła przez badaną próbkę,
• intensywność fluorescencji składników
komórki, lub zastosowanych barwników,
• absorbcja światła przez próbkę,
• pomiary w czasie (użyteczne dla badania
kinetyki, dynamicznych zachowań populacji
komórek)
ELEMENTY
BUDOWY
CYTOMETRU
TUBA Z PRZEPŁYWEM
LAMINARNYM PRÓBKI
•komórki w zawiesinie,
• przepływ w cienkim strumieniu
cieczy przez oświetlaną
objętość umożliwia pomiar
pojedynczych komórek.
PRZEPŁYW KOMÓREK
tu
nakładamy
próbkę
ciecz osłaniająca
fluorescencja
promień lasera
Purdue University Cytometry Laboratories
OPTYKA
•źródło światła: laser lub
lampa rtęciowa,
•detektory: diody,
fotopowielacze,
•filtry optyczne, lustra,
ŚWIATŁO
ROZPROSZONE
PRZEDNI DETEKTOR
ŚWIATŁA
ROZPROSZONEGO (Forward
Scatter)
Ilość światła rozproszonego wzdłuż osi
przebiegu światła wzbudzającego jest
zbierana przez przedni detektor światła
rozproszonego (forward scatter
channel). Intensywność tego światła jest
proporcjonalna do: rozmiaru, kształtu i
granularności cytoplazmy.
PRZEDNI
DETEKTOR ŚWIATŁA
ROZPROSZONEGO
laser
detektor
przedni
Purdue University Cytometry Laboratories
BOCZNY DETEKTOR
ŚWIATŁA ROZPROSZONEGO
(Side Scatter)
Ilość światła rozproszonego prostopadle do
osi przebiegu światła wzbudzającego jest
zbierana przez boczny detektor światła
rozproszonego ustawiony pod kątem 900
(side scatter channel). Intensywność tego
światła jest proporcjonalna do: rozmiaru,
kształtu i granularności cytoplazmy.
BOCZNY DETEKTOR
ŚWIATŁA
ROZPROSZONEGO
laser
detektor
przedni
detektor boczny
Purdue University Cytometry Laboratories
FLUORESCENCJA
DETEKTORY
FLUORESCENCJI
• Fotopowielacze (ilość od 2 do 4)
• można używać kilku barwników
fluorescencyjnych lub wyznakowanych
przeciwciał.
• Selektywność sygnału zapewniają
odpowiednio dobrane filtry optyczne i
lustra.
DETEKTORY
FLUORESCENCJI
detektor
przedni
Freq
laser
Fluorescence
detektory fluorescencji
(PMT3, PMT4 etc.)
Purdue University Cytometry
SYSTEM OPTYCZNY
PMT 5
próbka
PMT 4
lustro
dichroiczne
PMT 3
przepływ
komórek
detektor światła
rozproszonego
PMT 2
PMT 1
filtr zaporowy
laser
ELEKTRONIKA
• Urządzenia do przetwarzania
sygnału na obraz (wartości)
cyfrowe,
• System komputerowy do
przechowywania i obróbki danych
(list mode)
PRZECHOWYWANIE I OBRÓBKA
DANYCH (LIST MODE)
Entry No.
1
2
3
4
5
6
7
8
k
Value
80
100
40
20
90
120
100
110
50
75
110
120
Cell Number
1
1
1
1
2
2
2
2
n
n
n
n
Parameter
FSC
SSC
Green
Red
FSC
SSC
Green
Red
FSC
SSC
Green
Red
PARAMETRY MIERZALNE
ZA POMOCA CYTOMETRU
• STRUKTURALNE
 rozmiar,
 kształt,
 cytoplazmatyczna ziarnistość,
 zawartość barwnika np.: hemoglobina, barwniki
fotosyntetyczne, porfiryny,
 aminokwasy fluoryzujące w białkach
np.:tryptofan, tyrozyna,
 zawartość DNA, RNA, wszystkich białek,
lipidów, cukrów powierzchniowych, antygenów,
PARAMETRY MIERZALNE ZA
POMOCA CYTOMETRU cd...
• FUNKCJONALNE
 ładunek powierzchniowy,
 ekspresja receptorów powierzchniowych,
 integralność błony (żywotność),
 aktywność endocytarna,
 organizacja cytoszkieletu,
 aktywność enzymów,
WIELOPARAMETROWA
ANALIZA
Do analizy i obrazowania danych
stosuje się kilka typów wykresów:
 jednowymiarowe (histogram),
 dwuwymiarowe (kropkowy, gęstości,
konturowy),
 wykresy trójwymiarowe (perspektywiczny).
HISTOGRAM
Zawartość DNA w komórkach w hodowli
asynchronicznej
M
G0 / G1
G2
G0
G1
S
C
o
u
n
t
G2 / M
S
0
200
400
600
800
4N
2N
zawartość DNA
1000
ilość komórek
HISTOGRAM DNA
G0-G1
G2-M
S
intensywność fluorescencji
•pik G0-G1 odpowiada
ilości DNA = 2n
w fazie G0 i G1
•obszar S to rozkład
zawartości DNA w
fazie S cyklu
komórkowego
•pik G2-M odpowiada
ilości DNA = 4n
w fazie G2 i M
WYKRES
DWUWYMIAROWY
(KROPKOWY)
WYKRES DWUWYMIAROWY
(KROPKOWY)
•PI – jodek propidyny
komórki martwe
– barwi DNA
martwych komórek
się z fosfatydyloserną
obecną w na zewnątrz
błony komórek
apoptotycznych
•FL2-H
•Aneksyna- FITC
(fluoresceina) –łączy
PI
aneksyna V-FITC
•FL1-H
komórki żywe
komórki apoptotyczne
Na przykład:
trzy populacje komórek:
•niebieska,
•zielona
•czerwona,
Wykres trójwymiarowy
(przedstawia trzy mierzone
parametry)
IMMUNOFLUORESCENCYJNA
ANALIZA KOMÓREK KRWI
Głównym zastosowanie cytometrii jest
analiza i sortowanie komórek krwi.
Jest to możliwe dzięki:
 ekspresji różnych markerów
powierzchniowych
( antygeny CD – przeciwciała monoklonalne
anty-CD znakowane fluorescencyjnie).
 różnicom w wielkości jądra i granularności
cytoplazmy (różnice w stgnałach FSC i SSC)
LEUKOCYTY CD 45 +
GRANULOCYTY
CD 14 +
NEUTROFILE
AGRANULOCYTY
MAKROFAGI
MONOCYTY
CD 14 +
EOZYNOFILE
CD 4 +
BAZOFILE
LIMFOCYTY
LIMFOCYTY T
LIMFOCYTY B
CD 4 +
CD 19 +
CD 3 +
WYKRES KRWINEK NA PODSTAWIE
ŚWIATŁA ROZPROSZONEGO
1000
200
100
600
SKALA
NEUTROFILE
400
Forward Scatter
1000
800
1000
SS
FS
50
200
40
0
30
20
0
15
8
200
MONOCYTY
600
800
90 Degree Scatter
400
1000
LIMFOCYTY
0
1000
Purdue University Cytometry Laboratories
Na przykład:
MONOCYTY
NEUTROFILE
„Multi parametric investigation of immunem system during major surgery by
LSC”
Limfocyty 2 populacje :
CD3+CD4+ oraz CD3- CD4+
LIMFOCYTY CD3+CD4+
LIMFOCYTY CD3- CD4+
„Multi parametric investigation of immunem system during major surgery by LSC”
PODSUMOWANIE: zalety
cytometru przepływowego
• W zależności od jakości cytometru
można badać koekspresję nawet
czterech antygenów, co nie jest
możliwe w żadnej innej metodzie
• analizowania bardzo licznych populacji
obiektów w krótkim czasie, oraz
pozwala osiągnąć wysoką dokładność i
zminimalizować rozrzut wyników.
• W ciągu kilku sekund można z niezwykłą
dokładnością i powtarzalnością wykryć
subpopulacje rzadko występujące i
nietypowe
• Ogólnie, cytometria przepływowa jest
wspaniałym nieinwazyjnym (tzn. nie
naruszającym integralności komórkowej)
narzędziem badawczym w
wieloparametrowej ocenie struktury i
funkcji komórek.
• możliwość oznaczenia ploidii w komórkach o
określonym fenotypie
LITERATURA:
•PURDUE UNIVERSITY
CYTOMETRY LABOLATORIES
(CD volume 5,6 2000)
•www.cyto.purdue.edu
DZIĘKUJĘ ZA
UWAGĘ!
When cells are in such altered states
You don't know where to set the gates,
It's best to minimize the risk
And store them all on your hard disk.
If there's a clog before you're done,
You'll save some data from a run,
And, thus, you may stay out of jams
You'd get in with live histograms.
List mode, just work in list mode;
When you consider all the options, it's the only thing to do.
This mode, and only this mode,
Lets you make sense of samples which, at first, leave you without
a clue.
Once we're in list mode, anyway,
With prices as they are today,
It isn't putting on the Ritz
To digitize to sixteen bits.
It's clear that, once we've made this change,
We'll have enough dynamic range
To transform data digitally,
So log amps will be history.
...
List mode, we'll work in list mode,
And go from linear to log and back without the log amps' ills.
Once we've got list mode, our only pissed mode
May be when we try pinning down which agencies will pay the bills.
List mode helps us analise
How many molecules of dyes
And antibodies will be found
On each cell type to which they're bound.
At long last, different labs can see
Results compared objectively,
Advancing science as a whole
And aiding quality control.
List mode, by using list mode,
We'll alt get heightened sensitivities and much reduce the fears
And trepidation of calibration,
Although the folks who make the particles may have us by the spheres.
From East to West, from South to North,
We'll send our data back and forth,
Why, we'll soon have it in our reach
To run our samples from the beach.
But, unless they've been well prepared,
When they are run, we'll run them scared,
List mode or not, there's still no doubt
That garbage in gives garbage out.
List mode, we all need list mode, Though
there are ends for which list mode itself
can never be the means. Even with list
mode, there won't exist code
Which gets good data from bad samples
and/or misaligned machines.