Techniki zakładania i prowadzenia hodowli Andrzej Wójcik
advertisement
Techniki zakładania i prowadzenia hodowli Andrzej Wójcik [email protected] Zakładanie hodowli Hodowla narządu Zachowanie struktury histologicznej Hodowla wycinka tkanki Komórki wyrastają z pierwotnego eksplantatu tworząc rozrosty Hodowla komórek dysocjowanych Komórki osiadają na powierzchni płytki tworząc kolonie Hodowla narządopodobna Komórki hodowane na zrębie imitującym macierz zewnątrzkomórkową Według: R.I. Freshney, Culture of animal cells: a manual of basic techniques, 5th edition Zakładanie hodowli i rozrost komórek (według Hayflick i Moorhead 1961) Zakładanie hodowli Komórki limfatyczne Źródła: Krew obwodowa (limfocyty) Krew pępowinowa (komórki macierzyste) Szpik kostny Nowotwory układu limfatycznego Komórki rosnące jako monowarstwa (fibroblasty) Komórki rosnące w zawiesinie (HL-60) Wysięk u myszy Zakładanie hodowli Narząd / wycinek tkanki Siekanie na drobne kawałki Dysagregacja mechaniczna np. sitko, strzykawka ostre pipetowanie Dysagregacja enzymatyczna Zimna trypsyna (izolacja oszędzająca) Pierwotny eksplantant Ciepła trypsyna (izolacja ostra) Kolagenaza (izolacja oszczędzająca) inaktywacja w surowicy Odzysk komórek przez wirowanie Hodowla pierwotna Hodowla wtórna Rozrost Wtórny eksplantant pasażowanie Linia komórkowa Zakładanie hodowli Rozrost komórek z eksplantatu czerniaka ludzkiego 3 dni po eksplantacji 7 dni po eksplantacji Miejsce po eksplantacie Źródło: R.I. Freshney, Culture of animal cells: a manual of basic techniques, 5th edition Zakładanie hodowli Dysagregacja enzymatyczna Kadheryny Integryny Zależne od obecności wapnia Glikoproteiny błon komórkowych Fibronektyna, laminy Trypsyna Dyspaza Kolagenaza Inaktywowana przez surowicę płodową Trypsyna: proteaza ludzka wytwarzana przez trzustkę Dyspaza: niespecyficzna proteaza bakteryjna Kolagenaza: specyficzna proteaza bakteryjna rozkładająca kolagen Dysagregacja przy pomocy EDTA (chelator metali, np. wapnia) EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid = kwas wersenowy Hodowanie komórek pasażowanie Wylać pożwykę Dodać trypsynę rozpuszczoną w ciepłym PBS Potrząsać aż komórki się odkleją Dodać surowicę PBS: Phosphate buffered saline = buforowany fozjologiczny roztwór soli Przenieść do próbówki Wirować kilka razy, myjąc pożywką Policzyć w hemacytometrze Wysiać w odpowiedniej gęstości pasażowanie Źródło: R.I. Freshney, Culture of animal cells: a manual of basic techniques, 5th edition Pasażowanie Pompa Elektrody Jak liczyć komórki? Hemocytometr Ω Szkło nakrywkowe Pomiar oporności Podstawa szkła nakrywkowego Komora głębokość 0,1 mm Otwór dyszy Komórki martwe nie dają sygnału… Błękit trypanu barwi komórki martwe! 1 mm Dysza Pojemnik z zawiesiną komórek C= N V C = gęstość N = liczba V = objętość V = 0,1 mm3 1 mm Licznik Coultera Pasażowanie Jak liczyć komórki? C1 = 125000 / ml h = 24 C1 = 125000 / ml TD = 13,65 h Hodowla komórek – pożywka i stężenie pH Skład pożywki • Sole nieorganiczne Odpowiednie ciśnienie osmotyczne i pH Optymalne pH = 7,4 • Węglowodany inkubator • Aminokwasy 5% CO2 • Witaminy oraz lipidy • Kwasy tłuszczowe • Peptydy i proteiny • Surowica Bufor chemiczny: HEPES - 2- HCO CO 3 3 pH = 7,4 Czerwień fenolowa – wskaźnik pH 6,8 7,4 pH 8,0 CO2 Hodowla komórek – pożywki i buforowane roztwory solne Skład pożywki • Sole nieorganiczne • Węglowodany • Aminokwasy • Witaminy oraz lipidy • Kwasy tłuszczowe • Peptydy i proteiny Najczęściej używane pożywki: Dostępne jako: Roztwory gotowe MEM – Minimal Essential Medium Roztwory stężone DMEM – Dulbecco’s Minimal Essential Medium Proszek F12 RPMI 1640 McCoy’s Różne wersje, np. dodatek L-glutaminy Fisher’s bufor HEPES Ham's F-10 Wybór na podstawie doświadczenia… • Surowica Skład soli buforowanej Najczęściej używane roztwory sole – BSS = balanced salt solution: • Sole nieorganiczne • Earl’s BSS • Dulbecco’s BSS • Glukoza • (Surowica) Używane do mycia komórek lub eksperymentów nie wymagających hodowli. Trzymać w +40C Wyjaławianie pożywki przez filtrację (niezbędne po rozpuszczeniu sproszkowanej pożywki w wodzie) Sączki. średnica porów: 0,22 µm Hodowla komórek - surowica Surowica bydlęca – calf serum/ bovine serum - BS Surowica płodowa – fetal bovine serum – FBS Surowica końska – Horse serum HoS Trzymać w -200C – jak najrzadziej rozmrażać Zawiera niezbędne do hodowli: • Białka (albumina) • Czynniki wzrostu (zwłaszcza FBS!) • Hormony Inaktywacja – Heat inactivation Polega na trzymaniu surowicy przez 30 min w temperaturze 560C (łaźnia wodna) Cel: inaktywacja układu dopełniacza osłabienie virusów i mykoplasmy Bo zawsze się tak robiło… Hodowla komórek limfoidalnych – hodowla w miękkiej agarozie Metoda używana do klonowani komórek limfoidalnych. Metoda alternatywna: hodowla w mikropłytkach – „wyciąganie” klonów z pojedynczych komórek Kolonie komórek TK6 hodowanych w miękkiej agarozie Hodowla komórek – pożywki bez surowicy Wady związane z używaniem surowicy: • Zmienność między płodami • Stosunkowo krótki okres ważności: ~ roku • Koszt Wady związane z używaniem pożywki bez surowicy: • Nie działa tak dobrze jak pożywka z surowicą Hodowla komórek – transformacja i immortalizacja komórek Co to znaczy transformacja komórkowa? Komórki transformowane mogą posiadać wybrane lub wszystkie cechy: Cecha komórek macierzystych • Immortalizacja (nieograniczona zdolność do podziałów komórkowych) • Upośledzony rozrost: utrata zahamowania kontaktowego w hodowli lub tkance • Złośliwość (malignancy): zdolność wytwarzania przerzutów • Niestabilność genetyczna: Wzmożone występowanie aberracji chromosomowych co prowadzi do akumulacji mutacji i zmiany ploidalności (ilości DNA) Cecha komórek zarodka w fazie preimplantacyjnej Hodowla komórek – transformacja i immortalizacja komórek Indukcja transformacji przez traktowanie: • Mutagenem • Onkowirusem Uzyskanie komórek transformowanych jest długim procesem Komórka transformowana Hodowla komórek – transformacja i immortalizacja komórek Transformacja wywołana mutagenem MSJ Crane. Mutagenesis and cell transformation in culture Metods in Cell Science 29: 245-253, 1999 Zależność między przeżywalnością komórek a częstością mutacji po traktowaniu mutagenem Względna częstość mutacji po traktowaniu komórek różnymi mutagenami Transformacja przez wirusy Wirusy używane do transformacji komórek (Wszystkie: wirusy dsDNA - zawierające podwójnoniciowe DNA) • SV40: Simian virus 40, gen LT • Adenowirus – gen E1a • HPV: Human papilloma virus, wirus brodawczaka ludzkiego, geny E6 i E7 • EBV: Epstein Barr virus, Wirus Epsteina-Barr – cały wirus Geny odpowiedzialne za transformację prawdopodobnie znoszą blokadę cyklu komórkowego przez inhibicję genów: • CIP-1 • WAF-1 • p21 • Rb • p53 • p16 Wydajność transformacji wyższa od mutagenów Mechanizm transformacji przez wirusy dsDNA http://info.cancerresearchuk.org/cancerstats/causes/infectiousagents/virusesandcancer/ Hodowla komórek nowotworowych Zakładanie hodowli: podobnie jak hodowle komórek prawidłowych Problem 1: komórki nowotworowe często nie dzielą się w warunkach hodowli in vitro. Możliwe przyczyny: brak czynników stymulujących (czynniki wzrostu, zrąb…) Problem 2: Guz nowotwory jest zlepkiem komórek nowotworowych i prawidłowych komórek tkanki łącznej jak fibroblasty, komórek śródbłonkowych itp. Hodowle 3D Podłoże dla hodowli 3D Symulacja in vitro: ECM – macierzy międzykomórkowej - główne składniki: kolagen (żelatyna) laminy Żel Filtr
