Techniki zakładania i prowadzenia hodowli Andrzej Wójcik

advertisement
Techniki zakładania i prowadzenia hodowli
Andrzej Wójcik
[email protected]
Zakładanie hodowli
Hodowla
narządu
Zachowanie struktury
histologicznej
Hodowla
wycinka
tkanki
Komórki wyrastają
z pierwotnego eksplantatu
tworząc rozrosty
Hodowla komórek
dysocjowanych
Komórki osiadają
na powierzchni
płytki tworząc kolonie
Hodowla
narządopodobna
Komórki hodowane na
zrębie imitującym macierz
zewnątrzkomórkową
Według: R.I. Freshney, Culture of animal cells: a manual of basic techniques, 5th edition
Zakładanie hodowli i rozrost komórek
(według Hayflick i Moorhead 1961)
Zakładanie hodowli
Komórki limfatyczne
Źródła:
Krew obwodowa (limfocyty)
Krew pępowinowa (komórki macierzyste)
Szpik kostny
Nowotwory układu limfatycznego
Komórki rosnące
jako monowarstwa
(fibroblasty)
Komórki rosnące
w zawiesinie (HL-60)
Wysięk u myszy
Zakładanie hodowli
Narząd / wycinek tkanki
Siekanie
na drobne
kawałki
Dysagregacja
mechaniczna
np. sitko, strzykawka
ostre pipetowanie
Dysagregacja enzymatyczna
Zimna trypsyna
(izolacja
oszędzająca)
Pierwotny
eksplantant
Ciepła trypsyna
(izolacja ostra)
Kolagenaza
(izolacja
oszczędzająca)
inaktywacja w surowicy
Odzysk komórek przez wirowanie
Hodowla pierwotna
Hodowla wtórna
Rozrost
Wtórny
eksplantant
pasażowanie
Linia komórkowa
Zakładanie hodowli
Rozrost komórek z eksplantatu czerniaka ludzkiego
3 dni po eksplantacji
7 dni po eksplantacji
Miejsce po eksplantacie
Źródło: R.I. Freshney, Culture of animal cells: a manual of basic techniques, 5th edition
Zakładanie hodowli
Dysagregacja enzymatyczna
Kadheryny
Integryny
Zależne od obecności wapnia
Glikoproteiny błon komórkowych
Fibronektyna, laminy
Trypsyna
Dyspaza
Kolagenaza
Inaktywowana przez surowicę płodową
Trypsyna: proteaza ludzka wytwarzana przez trzustkę
Dyspaza: niespecyficzna proteaza bakteryjna
Kolagenaza: specyficzna proteaza bakteryjna rozkładająca kolagen
Dysagregacja przy pomocy
EDTA (chelator metali, np. wapnia)
EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid
= kwas wersenowy
Hodowanie komórek
pasażowanie
Wylać pożwykę
Dodać trypsynę rozpuszczoną w ciepłym PBS
Potrząsać aż komórki się odkleją
Dodać surowicę
PBS: Phosphate buffered saline
= buforowany fozjologiczny roztwór soli
Przenieść do próbówki
Wirować kilka razy, myjąc pożywką
Policzyć w hemacytometrze
Wysiać w odpowiedniej gęstości
pasażowanie
Źródło: R.I. Freshney, Culture of animal cells:
a manual of basic techniques, 5th edition
Pasażowanie
Pompa
Elektrody
Jak liczyć komórki?
Hemocytometr
Ω
Szkło
nakrywkowe
Pomiar
oporności
Podstawa szkła
nakrywkowego
Komora
głębokość 0,1 mm
Otwór
dyszy
Komórki martwe
nie dają sygnału…
Błękit trypanu barwi komórki martwe!
1 mm
Dysza
Pojemnik z
zawiesiną komórek
C=
N
V
C = gęstość
N = liczba
V = objętość
V = 0,1 mm3
1 mm
Licznik Coultera
Pasażowanie
Jak liczyć komórki?
C1 = 125000 / ml
h = 24
C1 = 125000 / ml
TD = 13,65 h
Hodowla komórek – pożywka i stężenie pH
Skład pożywki
• Sole nieorganiczne
Odpowiednie ciśnienie osmotyczne i pH
Optymalne pH = 7,4
• Węglowodany
inkubator
• Aminokwasy
5% CO2
• Witaminy oraz lipidy
• Kwasy tłuszczowe
• Peptydy i proteiny
• Surowica
Bufor chemiczny: HEPES
-
2-
HCO
CO
3
3
pH = 7,4
Czerwień fenolowa – wskaźnik pH
6,8
7,4
pH
8,0
CO2
Hodowla komórek – pożywki i buforowane roztwory solne
Skład pożywki
• Sole nieorganiczne
• Węglowodany
• Aminokwasy
• Witaminy oraz lipidy
• Kwasy tłuszczowe
• Peptydy i proteiny
Najczęściej używane pożywki:
Dostępne jako:
Roztwory gotowe
MEM – Minimal Essential Medium
Roztwory stężone
DMEM – Dulbecco’s Minimal Essential Medium
Proszek
F12
RPMI 1640
McCoy’s
Różne wersje, np. dodatek L-glutaminy
Fisher’s
bufor HEPES
Ham's F-10
Wybór na podstawie doświadczenia…
• Surowica
Skład soli buforowanej
Najczęściej używane roztwory sole – BSS = balanced salt solution:
• Sole nieorganiczne
• Earl’s BSS
• Dulbecco’s BSS
• Glukoza
• (Surowica)
Używane do mycia komórek lub
eksperymentów nie wymagających hodowli.
Trzymać w +40C
Wyjaławianie pożywki przez filtrację
(niezbędne po rozpuszczeniu sproszkowanej pożywki w wodzie)
Sączki.
średnica porów: 0,22 µm
Hodowla komórek - surowica
Surowica bydlęca – calf serum/ bovine serum - BS
Surowica płodowa – fetal bovine serum – FBS
Surowica końska – Horse serum HoS
Trzymać w -200C – jak najrzadziej rozmrażać
Zawiera niezbędne do hodowli:
• Białka (albumina)
• Czynniki wzrostu (zwłaszcza FBS!)
• Hormony
Inaktywacja – Heat inactivation
Polega na trzymaniu surowicy przez 30 min w temperaturze 560C (łaźnia wodna)
Cel: inaktywacja układu dopełniacza
osłabienie virusów i mykoplasmy
Bo zawsze się tak robiło…
Hodowla komórek limfoidalnych – hodowla w miękkiej agarozie
Metoda używana do klonowani komórek limfoidalnych.
Metoda alternatywna: hodowla w mikropłytkach – „wyciąganie” klonów z pojedynczych komórek
Kolonie komórek TK6
hodowanych w miękkiej
agarozie
Hodowla komórek – pożywki bez surowicy
Wady związane z używaniem surowicy:
• Zmienność między płodami
• Stosunkowo krótki okres ważności: ~ roku
• Koszt
Wady związane z używaniem pożywki bez surowicy:
• Nie działa tak dobrze jak pożywka z surowicą
Hodowla komórek – transformacja i immortalizacja komórek
Co to znaczy transformacja komórkowa?
Komórki transformowane mogą posiadać
wybrane lub wszystkie cechy:
Cecha komórek macierzystych
• Immortalizacja (nieograniczona zdolność do podziałów komórkowych)
• Upośledzony rozrost: utrata zahamowania kontaktowego w hodowli lub tkance
• Złośliwość (malignancy): zdolność wytwarzania przerzutów
• Niestabilność genetyczna: Wzmożone występowanie aberracji chromosomowych
co prowadzi do akumulacji mutacji i zmiany
ploidalności (ilości DNA)
Cecha komórek zarodka w fazie preimplantacyjnej
Hodowla komórek – transformacja i immortalizacja komórek
Indukcja transformacji przez traktowanie:
• Mutagenem
• Onkowirusem
Uzyskanie komórek transformowanych
jest długim procesem
Komórka transformowana
Hodowla komórek – transformacja i immortalizacja komórek
Transformacja wywołana mutagenem
MSJ Crane. Mutagenesis and cell transformation in culture
Metods in Cell Science 29: 245-253, 1999
Zależność między przeżywalnością komórek
a częstością mutacji po traktowaniu mutagenem
Względna częstość mutacji po traktowaniu
komórek różnymi mutagenami
Transformacja przez wirusy
Wirusy używane do transformacji komórek
(Wszystkie: wirusy dsDNA - zawierające podwójnoniciowe DNA)
• SV40: Simian virus 40, gen LT
• Adenowirus – gen E1a
• HPV: Human papilloma virus, wirus brodawczaka ludzkiego, geny E6 i E7
• EBV: Epstein Barr virus, Wirus Epsteina-Barr – cały wirus
Geny odpowiedzialne za transformację prawdopodobnie znoszą blokadę
cyklu komórkowego przez inhibicję genów:
• CIP-1
• WAF-1
• p21
• Rb
• p53
• p16
Wydajność transformacji wyższa od mutagenów
Mechanizm transformacji przez wirusy dsDNA
http://info.cancerresearchuk.org/cancerstats/causes/infectiousagents/virusesandcancer/
Hodowla komórek nowotworowych
Zakładanie hodowli: podobnie jak hodowle komórek prawidłowych
Problem 1: komórki nowotworowe często nie dzielą się w warunkach hodowli in vitro.
Możliwe przyczyny: brak czynników stymulujących (czynniki wzrostu, zrąb…)
Problem 2: Guz nowotwory jest zlepkiem komórek nowotworowych i prawidłowych komórek
tkanki łącznej jak fibroblasty, komórek śródbłonkowych itp.
Hodowle 3D
Podłoże dla hodowli 3D
Symulacja in vitro:
ECM – macierzy międzykomórkowej - główne składniki: kolagen (żelatyna)
laminy
Żel
Filtr
Download
Random flashcards
ALICJA

4 Cards oauth2_google_3d22cb2e-d639-45de-a1f9-1584cfd7eea2

Create flashcards