Hodowle komórkowe
advertisement
ĆWICZENIE 1 HODOWLE KOMÓRKOWE. TWORZENIE MODELU IN VITRO ODPOWIEDZI IMMUNOLOGICZNEJ NA ANTYGENY BAKTERYJNE. 1. WSTĘP TEORETYCZNY 1.1. Odpowiedź nieswoista, cząstki PAMP, receptory TLR Mimo ogromnego postępu naukowego współczesna medycyna nie potrafi nadal do końca rozwiązać problemu zachorowalności i śmiertelności związanej z infekcjami patogennymi mikroorganizmami. Niebezpieczne drobnoustroje zasiedlają niemal wszystkie nisze ekologiczne, stąd ze wszystkich stron jesteśmy narażeni na podstępny atak. W walce z patogenami nie jesteśmy jednak bez szans, dzięki integralnej części naszego organizmu – układowi immunologicznemu. Pierwsza linia obrony przeciwbakteryjnej opiera się między innymi na istnieniu szczelnych barier mechanicznych w postaci skóry i błon śluzowych, ruchu rzęsek w tchawicy czy niskiego pH w żołądku. Taki nieswoisty (wrodzony) system obrony sprawia, że tylko niewielka ilość potencjalnie groźnych mikroorganizmów z naszego otoczenia może przenikać do tkanek. Jeśli jednak dojdzie do przełamania barier, organizm musi natychmiastowo uruchomić systemy obronne w celu błyskawicznego zahamowania rozprzestrzeniającej się infekcji. Niewątpliwie ogromną rolę odgrywają tu mechanizmy nieswoiste, które charakteryzują się większą szybkością niż odpowiedź swoista, co ma kluczową rolę, gdy weźmie się pod uwagę szybkość podziałów bakteryjnych (1 podział komórki w ciągu 20 minut). Aby doszło do rozwoju nieswoistej reakcji obronnej, układ immunologiczny organizmu musi rozpoznać obecność drobnoustrojów. Jest to możliwe dzięki występowaniu na komórkach obrony nieswoistej receptorów selektywnie rozpoznających wzorce molekularne związane z patogenami, zwane cząstkami PAMP (ang. pathogen associated molecular drobnoustrojów. patterns), czyli najbardziej charakterystyczne struktury Receptory rozpoznające wzorce – PRR (ang. pathogen recognition receptors), występujące na wielu rodzajach komórek (limfocytach, monocytach, makrofagach, neutrofilach, komórkach dendrytycznych) pełnią niezwykle ważne funkcje w organizmie. Dzięki rozpoznaniu klasy patogena (cząstki PAMP są typowe dla całych grup 1 mikroorganizmów – np. lipopolisacharyd dla bakterii grammujemnych) możliwe jest precyzyjne dopasowanie mechanizmów obronnych. Jeśli patogen jest zewnątrzkomórkowy, system immunologiczny błyskawicznie aktywuje eozynofile i produkcję interleukiny 4 (IL-4) oraz immunoglobulin E (IgE) (odpowiedź typu T H2), natomiast przy infekcji drobnoustrojami pasożytującymi wewnątrzkomórkowo (wirusy, niektóre bakterie np. Chlamydia pneumoniae) dochodzi do aktywacji komórek NK (ang. natural killers – naturalni zabójcy) oraz sekrecji m.in. interferonu gamma (IFN- γ) (odpowiedź typu TH1). Do najlepiej scharakteryzowanych receptorów PRR należą receptory Toll-podobne (TLR, ang. Toll-like receptors), odkryte przy okazji badań nad mechanizmem rozwoju muszki owocowej Drosophila melanogaster. Receptory TLR rozpoznają wiele składników mikroorganizmów takich jak lipopolisacharyd bakterii grammujemnych (TLR4), peptydoglikany (TLR2), kwas lipotejchojowy bakterii grammdodatnich (TLR2, TLR4) czy bakteryjne DNA (TLR9). Aktywują one komórki układu odpornościowego do sekrecji szeregu cytokin i chemokin, co prowadzi do zwiększenia przepuszczalności naczyń i napłynięcia do miejsca infekcji komórek obronnych. Ta niezwykle silnie konserwowana filogenetycznie rodzina 10 receptorów zawdzięcza swą nazwę genowi „toll”, który nie tylko odpowiada za rozwój embrionalny muszki, ale także koduje receptor, który bierze udział w reakcjach obronnych (podobnie jak w komórkach ssaków). Ssacze receptory TLR posiadają zewnątrzkomórkowe domeny bogate w leucynę (LRRs, ang. leucine reach repeats) oraz fragmenty cytoplazmatyczne z domeną TIR (Toll-IL-1R, przez analogię do odcinków występujących w receptorach interleukiny 1). 1.2. Bakteryjne DNA-specyficzne cząstki PAMP Ostatnie badania wskazują na potencjalne immunostymulujące właściwości bakteryjnego DNA. W przeciwieństwie do genomów kręgowców, u których częstotliwość występowania dinukleotydów cytozyna – guanozyna (CpG) waha się w granicach 1/501/60, u bakterii wynosi ona około 1/16. Dodatkowo mniej niż 5% cytozyn w dinukleotydach CpG bakteryjnego kwasu nukleinowego jest zmetylowana, podczas gdy aż 70-90% tych dinukleotydów w ssaczych genomach zawiera zmetylowana cytozynę. 2 Podczas infekcji uwolnienie takiego niemetylowanego CpG DNA z komórki bakteryjnej rozpoznawane jest przez gospodarza jako sygnał o niebezpieczeństwie i wyzwala odpowiedź obronną. CpG DNA aktywuje kaskadę mechanizmów, które prowadzą do dojrzewania, różnicowania i proliferacji komórek układu immunologicznego takich jak limfocyty B i T, komórki NK, monocyty, makrofagi oraz komórki dendrytyczne. DNA zawierający niemetylowane motywy CpG nie tylko indukuje poliklonalną aktywację limfocytów B, ale stymuluje także pozostałe komórki do sekrecji prozapalnych cytokin: interleukiny 1 (IL-1), IL-6, IL-18 oraz martwiczego czynnika nowotworu alfa (TNF-α, ang. tumor necrosis factor alpha). Dodatkowo, wydzielana IL-12 stymuluje aktywność przeciwbakteryjną, przeciwwirusową, przeciwnowotworową komórek NK oraz sekrecję IFN- γ, należącego do cytokin typu TH1. Wydzielane cytokiny (zarówno prozapalne jak i typu TH1) wraz z innymi przeciwbakteryjnymi produktami takimi jak tlenek azotu, czy fosfolipaza D mają na celu zahamowanie rozwijającej się infekcji. 1.3. Oligodeoksynukleotydy – typy, zastosowanie kliniczne Szereg badań nad immunomodulacyjnymi właściwościami bakteryjnego DNA na układ odpornościowy kręgowców, zarówno tych o pozytywnych, terapeutycznych aspektach, jak i tych negatywnych, niebezpiecznych dla zdrowia narzuciło konieczność znalezienia syntetycznego analogu, który mógłby zostać powszechnie (bez ryzyka kontaminacji innymi składnikami komórek bakteryjnych) wykorzystany w doświadczeniach in vitro i in vivo. Na początku lat 90-tych ubiegłego stulecia japoński naukowiec S. Yamamoto udokumentował po raz pierwszy aktywację komórek NK i sekrecję IFN- γ po stymulacji syntetycznymi oligodeoksynukleotydami, których sekwencje nukleotydowe oparto na wzorze genomu bakteryjnego. Od tego momentu wiele grup badawczych na całym świecie rozpoczęło poszukiwania takiej sekwencji nukleotydowej oligodeoksynukleotydów, która byłaby optymalna dla celów terapeutycznych a jej stosowanie nie przynosiłoby efektów ubocznych. Postęp w badaniach nad oligonukleotydami wykazał, że efekty stymulacji układu odpornościowego zależą przede wszystkim od długości (min. 10 nukleotydów), sekwencji nukleotydowej, ilości powtórzeń niemetylowanego motywu CpG (oraz jego lokalizacji w sekwencji), a także typu wiązań pomiędzy nukleotydami. 3 Ze względu na specyficzną budowę oligonukleotydów i związane z nią różnice w stymulacji aktywności ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej wyróżniono trzy grupy: ODN typu K (zwany również typem B), ODN typu D (typ A) i ODN typu C. Typ K oligodeoksynukleotydów posiada fosforosiarczanowy (phosphothioate) szkielet i wielokrotnie powtórzony niemetylowany motyw CpG. Dzięki takiemu rozwiązaniu są one mniej wrażliwe na działanie enzymów trawiących kwas nukleinowy (DNaz) i wykazują dłuższy czas półtrwania in vivo niż tradycyjne oligonukleotydy zawierające fosfodiestrowe wiązania. Za optymalną sekwencję uważa się powtórzone motywy TCGTT i/lub TCGTA, które silnie stymulują proliferację oraz sekrecję IL-6 oraz IgM. Przyjmuje się, że aktywność oligonukleotydów typu K rośnie wraz z ilością powtórzonych niemetylowanych motywów CpG oraz wraz z długością sekwencji (min. 12 nukleotydów). Zaobserwowano również, że położenie motywu CpG w oligonukleotydach ma znaczenie dla ich aktywności. Odnotowano bowiem, iż sztucznie syntetyzowane oligodeoksynukleotydy zawierające silnie stymulujący motyw CpG przy końcu 5’ indukują dużo silniejszą aktywację układu immunologicznego niż te, które zawierały mniej aktywny motyw w tej samej pozycji. Oligodeoksynukleotydy typu K wywołują silną odpowiedź organizmu, która objawia się przede wszystkim aktywacją limfocytów B, ich proliferacją i sekrecją IL-6 oraz immunoglobulin (IgM). Dodatkowo indukują dojrzewanie komórek dendrytycznych pochodzenia plazmacytoidalnego. Oligodeoksynukleotydy typu D charakteryzuje mieszany fosfodiestrowofosforosiarczanowy (phosphothioate) szkielet oraz niezbędny dla ich aktywności motyw, w którym niemetylowany dinukleotyd CpG jest oflankowany z obu stron puryną i pirymidyną (puryna,/pirymidyna/CG/ puryna,/pirymidyna). Dodatkowym elementem wymaganym dla wysokiej aktywności oligonukleotydów tego typu jest ogon poliguaninowy (poli-G) na końcu 3’ sekwencji, który może tworzyć strukturę pętli. Minimalną długością sekwencji nukleotydowej dla optymalnej aktywności oligonukleotydu wydaje się być wg D. Verthelyi i wsp. 18 par zasad. Co ciekawe, niektórzy badacze sugerują, iż nie ma przesłanek, aby sądzić, iż typ D oligonukleotydów oddziałuje z receptorami TLR9, a nawet podejrzewają, iż długi ogon poliguaninowy może oddziaływać z receptorem zmiataczem (ang. scavenger receptor) obecnym na wielu komórkach układu immunologicznego. Mimo wielu wątpliwości, związanych z mechanizmem rozpoznawania oligonukleotydów typu D przez komórki układu immunologicznego, znany jest efekt ich aktywności. Stymulują one sekrecję IFN-alfa przez komórki dendrytyczne pochodzenia 4 plazmacytoidalnego oraz przez komórki NK. Jak łatwo zauważyć oba typy oligodeoksynukleotydów oddziałują z różnymi typami komórek układu odpornościowego i wywołują odmienne odpowiedzi immunologiczne. Typ D silnie stymuluje produkcję IFN- alfa, ale niewiele wiadomo o jego działaniu na limfocyty B, podczas gdy typ K oligonukleotydów wykazują odwrotny efekt działania. Połączenie unikalnych cech sekwencji obu typów zaowocowało powstaniem oligonukleotydu, który nie tylko silnie stymulował komórki B do zwiększonej produkcji IL-6, ale jednocześnie aktywował sekrecję IFN- alfa przez komórki dendrytyczne pochodzenia plazmacytoidalnego. Tak powstał typ C oligodeoksynukleotydów, którego budowa opiera się o szkielet fosforosiarczanowy. Zawiera on palindromową sekwencję z centralnie umieszczonym niemetylowanym dinukleotydem CpG (cecha ODN typu D) oraz pojedynczy lub wielokrotnie powtórzony motyw GTCGTT (cecha ODN typu K). Dodatkowo jego aktywność zwiększa położony przy końcu 5’ dimer TCG (TCGTCG), ale jednocześnie do stymulacji sekrecji IFN- alfa nie jest wymagany ogon poliguaninowy na końcu 3’. Duże nadzieje wiąże się z poszukiwaniem optymalnych sekwencji oligodeoksynukleotydów, które dzięki ich immunomodulacyjnym właściwościom mogłyby zostać potencjalnie wykorzystane w leczeniu. Obecnie prowadzi się pierwsze próby kliniczne, mające na celu sprawdzenie możliwości zastosowania oligonukleotydów z motywem CpG w immunoprotekcji, leczeniu nowotworów, alergii. Wydaje się, iż ochrona przeciwnowotworowa wywołana poprzez stymulację oligodeoksynukleotydami z niemetylowanymi wyspami CpG skupia się przede wszystkim na komponentach odpowiedzi nieswoistej niż odpowiedzi. Przeciwnowotworowe właściwości oligonukleotydów prawdopodobnie opierają się na zwiększaniu litycznej aktywności komórek NK. Nie wyklucza się także roli komórek dendrytycznych, co sugerują wyniki modeli, w których komórki NK spowalniały wzrost guza, ale nie powodowały jego regresji. Mimo, iż nadal trwają badania, które pozwolą na znalezienie sekwencji oligonukleotydów optymalnych dla aktywacji komórek NK lub cytotoksycznych limfocytów T, to już teraz z powodzeniem stosuje się je w terapii białaczek, czerniaka, nowotworów jelit. Oligonukleotydy, zawierające niemetylowany motyw CpG mogą być wykorzystane ze względu na unikalne właściwości zarówno w leczeniu infekcji, jak i immunoprotekcji. Jest to zasługa szybkiej aktywacji odpowiedzi nieswoistej, która poprzez wydzielane cytokiny prozapalne i tlenek azotu, aktywację fagocytów, komórek NK hamują rozwój infekcji. 5 W 1998 roku Zimmermann i wsp. po raz pierwszy opublikowali wyniki skutecznej terapii infekcji Leishmania major z wykorzystaniem oligonukleotydów. Zawarty w nich motyw CpG zmieniał profil cytokin produkowanych przez limfocyty z sekrecji IL-4 na IFN- γ oraz klasy przeciwciał z IgG1 na IgG2a lub IgG2b. Taka odpowiedź hamowała rozwój choroby, i jednocześnie zapewniała ochronę podczas powtórnej infekcji. Co więcej, w kolejnych badaniach Zimmermann i wsp. wykazali, że oligonukleotydy wykazują także terapeutyczne działanie po ich podaniu nawet po 20 dniach od rozpoczęcia infekcji L. major. Leczenie z wykorzystaniem oligodeoksynukleotydów wydaje się być również skuteczne w przypadku infekcji patogenami wewnątrzkomórkowymi m.in. Franciscella tularensis czy Listeria monocytogenes. Już pojedyncza dawka oligonukleotydów wystarczała do indukcji immunoprotekcji opartej na aktywności limfocytów B oraz produkcji IFN- γ. Kilkukrotne podanie oligonukleotydów zapewniało długotrwałą ochronę przeciwko tym bakteriom. Dzięki immunostymulującym właściwościom oligonukleotydów z motywem CpG, które objawiają się m.in. aktywacją komórek prezentujących antygen oraz zwiększeniem ekspresji cząsteczek kostymulujących na powierzchni komórek układu odpornościowego mają one szanse by być wykorzystane jako adiuwanty w szczepionkach. Jednoczesne podanie CpG DNA i oczyszczonych antygenów prowadzi do rozwoju odpowiedzi opartej na antygenowo-specyficznych limfocytach B i komórkach T, co czyni je przydatnymi jako nowa klasa adiuwantów. Unikalne, terapeutyczne działanie oligonukleotydów objawia się również przez przesuwanie równowagi z odpowiedzi typu TH2 (IL-4, IL-5, IgG1), charakterystycznej dla rozwoju alergii na TH1 (IFN- γ, IgG2a), dzięki czemu terapia oligonukleotydami może hamować rozwój schorzenia, a nawet jest skuteczna w leczeniu astmy. O skuteczności terapii oligodeoksynukleotydami decyduje wiele czynników. Jednym z nich jest budowa szkieletu oligonukleotydu, a właściwie rodzaj połączeń pomiędzy nukleotydami, który decyduje o stabilności i czasie półtrwania (modyfikowane wiązania fosfosiarcznanowe wydają się być najstabilniejsze). Dużą rolę w wyborze terapii odgrywa typ oligodeoksynukleotydu i związane z nim właściwości immunomodulacyjne. Typ D wydaje się być korzystniejszy w leczeniu alergii oraz infekcji patogenami wewnątrzkomórkowymi, podczas gdy typ K może być wykorzystany jako adiuwant w szczepionkach indukujących silna odpowiedź humoralną. Dodatkowo, bardzo ważną rolę w osiągnięciu pozytywnego efektu terapeutycznego odgrywa miejsce podania oligonukleotydów. Przykładowo, oligodeoksynukleotydy podane 6 dopochwowo zapewniały odporność przeciwko wirusowi Herpes simplex, czego nie osiągnięto w leczeniu systemicznym. W przeciwieństwie do szczepionek antygenowo-specyficznych, po których odporność organizmu rozwija się w ciągu tygodni, ale może trwać przez całe życie, CpG DNA aktywuje odpowiedź w ciągu paru dni, ale zapewnia ochronę tylko na około dwóch tygodni. Szczepionki na bazie oligonukleotydów mogą być wykorzystywane w terapii infekcji wolno rosnącymi patogenami bądź niskimi dawkami bardziej „agresywnych” patogenów. Wydają się również użyteczne dla uzyskania odporności u pacjentów, o których wiadomo, iż mogą być narażeni na infekcje. Aby przedłużyć dość krótką aktywność oligodeoksynukleotydów, co zwiększyłoby potencjalnie ich terapeutyczną użyteczność próbuje się dwie nowe metody ich podawania. Jedną z nich jest powtarzanie dawek oligonukleotydów co dwa tygodnie, druga zakłada ich enkapsulację w kationowe liposomy, które znacznie zwiększają pobieranie CpG DNA i nawet dwukrotnie wydłużają odporność. 2. HODOWLE KOMÓRKOWE 2.1. DEFINICJA Hodowla komórkowa – jest modelem in vitro próbującym odzwierciedlić system in vivo. Umożliwia utrzymanie żywych komórek poza organizmem przez minimum 24 h. 7 2.2. Typy hodowli: A) podział ze względu pochodzenie komórek i ich czas życia: 1. hodowle pierwotne – hodowle komórek wyizolowanych z organizmu 2. hodowle ciągłe - hodowle unieśmiertelnione i transformowane nowotworowo B) podział ze względu na typ hodowli: 1. hodowle w zawiesinie 2. hodowle komórek przylegających 3. hodowle na mikronośnikach 4. hodowle przestrzenne TYPY HODOWLI A) HODOWLE PIERWOTNE Hodowle pierwotne zakładane są z pojedynczych komórek świeżo wyizolowanych z organizmu. Mogą to być zarówno komórki bezpośrednio izolowane z organizmu np. komórki krwi lub uzyskane po działaniu enzymów na pobrany fragment tkanki. Komórki te proliferują i tworzą skupiska (klony) w zawiesinie lub jednolitą warstwę na podłożu. Po pierwszym pasażu, czyli rozdzieleniu i przeniesieniu do nowego naczynia komórek z konfluntej hodowli (zbyt duża ilość komórek na powierzchnię podłoża prowadzi do zjawiska kontaktowego zahamowania wzrostu, starzenia się hodowli i obumierania) staje się linią komórkową. W immunologii bardzo często wykorzystuje się hodowle pierwotne do oceny morfologii i funkcji komórek układu odpornościowego. Z krwi żylnej izoluje się jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC; ang. peripheral blood mononuclear cells), które stanowią podstawową bazę do zakładana stymulacji. Wykorzystuje się też poszczególne subpopulacje komórek tj. monocyty, limfocyty, komórki dendrytyczne. wymagają one specyficznych warunków hodowli i odpowiednich suplementów. 8 B) LINIE KOMÓRKOWE. HODOWLE UNIEŚMIERTELNIONE Linia komórkowa powstaje z hodowli pierwotnej po pierwszym pasażu. Wyróżniamy dwa typy linii: linia o określonej długości życia (najczęściej wywodzi się z linii komórek diploidalnych, po kilku pasażach zamiera) oraz tzw. linia komórkowa ciągła. Linia ta powstaje albo w wyniku unieśmiertelnienia komórek na skutek transfekcji lub transformacji spontanicznej. Mogą to być również komórki nowotworowe. Linie komórkowe mają tą przewagę nad hodowlą pierwotną, że są bardziej homogenną populacją i zapewniają tym samym lepszą powtarzalność wyników. Spośród wielu rodzajów linii komórkowych, w immunologii najczęściej wykorzystuje się komórki: WEHI 164 – linia komórek nowotworowych wyizolowanych z mysiego fibrosarcoma (włókniakomięsak). Są wrażliwe na działanie czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF). Wykorzystywane do testów biologicznych w celu oznaczenia aktywności biologicznej tej cytokiny w surowicy krwi czy w nadsączach znad hodowli (supernatantach). B9 - hybrydoma powstała po fuzji komórek mysiej śledziony z komórkami szpiczaka. Jest to linia, która potrzebuje do wzrostu interleukiny 6 (IL-6), stąd wykorzystuje się ją do oznaczeń jej aktyw biologicznej. K562 - linia nowotworowa wywodząca się z komórek przewlekłej białaczki szpikowej pobranych w fazie przełomu blastycznego. Wykorzystywane są w testach określających aktywność cytotoksyczną komórek NK, ze względu na brak ekspresji częsteczek MHC kl. I. U937 - monocytarna linia białaczkowa naśladująca hodowle pierwotne monocytów. 9 C) HODOWLE W ZAWIESINIE Są to hodowle, w których komórki, aby proliferować nie muszą mieć kontaktu z podłożem. Tworzą się klony (grona) komórek. Najczęściej prowadzi się je w butelkach hodowlanych, czasem w specjalnych naczyniach z wbudowanym mieszadełkiem, które zapewnia stały ruch pożywki i chroni przed opadaniem na dno, a na skalę przemysłową w bioreaktorach. W immunologii takimi nieprzylegającymi komórkami są: limfocyty, komórki NK, linie komórkowe B9 i K562. D) HODOWLE KOMÓREK PRZYLEGAJĄCYCH Komórki przylegające potrzebują kontaktu z podłożem do proliferacji. W takich warunkach interakcje między komórkami sprzyjają wzajemnym korzystnym oddziaływaniom. Utrata zdolności przylegania komórek lub nie sprzyjające warunki hodowlane przyczyniają się do obumierania hodowli. Komórki przylegające; monocyty, komórki dendrytyczne, WEHI 164, linia U937 10 E) HODOWLE NA MIKRONOŚNIKACH Dodanie do hodowli mikronośników w postaci kuleczek (plastikowych, szklanych, czy z dekstranu) zwiększa kilkukrotnie powierzchnię hodowlaną przy zastosowaniu małej objętości pożywki. F) HODOWLE PRZESTRZENNE Wykorzystywane są w hodowlach narządowych. Dzięki próbom stworzenia przestrzennego układu (trójwymiarowe rusztowania) naśladującego interakcje między komórkami zachodzące in vitro stanowią obecnie najlepszy model doświadczalny. 2.2. ZALETY I WADY HODOWLI KOMÓRKOWYCH A. ZALETY 1. Badacz ma możliwości prowadzenia doświadczeń (np. testowania leków) na wybranej linii komórek. Dzięki temu mona ocenić wpływ badanej substancji (np. leku) na przeżywalność, metabolizm, fenotyp, czy odpowiedź określonej komórki. 2. Hodowle komórkowe są modelem odzwierciedlającym patologiczne zmiany in vivo. 3. Ścisła kontrola parametrów środowiska, stosowanie gotowych podłóż hodowlanych i suplementów zapewnia powtarzalność eksperymentu i wiarygodne wyniki 4. Hodowle komórkowe w zdefiniowanych warunkach umożliwiają badanie interakcji komórka-komórka 5. Koszt prowadzenia linii komórkowej jest niższy niż prowadzenie doświadczeń na zwierzętach (nie dotyczy to jednak hodowli przemysłowych) B. WADY 1. Mimo wielu zalet hodowle komórkowe nadal są tylko modelami in vitro, które tylko naśladują systemy in vivo. 2. Wyizolowanie komórek z trójwymiarowych układów, jakimi są narządy i przeniesienie ich do płaskich naczyń hodowlanych może zmienić zarówno ich fenotyp jak i metabolizm. 11 3. Monokultury pozbawione są wielu niezbędnych bodźców generowanych przez inne komórki. 4. Hodowle komórkowe (zwłaszcza linie ciągłe, po wielu pasażach) są niestabilne genetycznie, co może wpływać na ich heterogenność. 5. Hodowle komórkowe są bardzo podatne na zakażenia, które mogą zakłócać wiarygodność wyników. 6. Nie wszystkie komórki są nadal możliwe do hodowania. 7. Problem starzenia się hodowli (zwłaszcza diploidalnych komórek w hodowlach pierwotnych). 2.4. ZASTOSOWANIE HODOWLI KOMÓRKOWYCH PRZYKŁADOWE ZASTOSOWANIE HODOWLI KOMÓRKOWYCH 1. testowanie toksyczności leków 2. produkcja szczepionek 3. hodowanie tkanek do przeszczepów 4. badanie odpowiedzi immunologicznej 5. badanie interakcji komórka-komórka 6. produkcja rekombinowanych białek 7. produkcja przeciwciał monoklonalnych 8. baza do hodowli wirusów 9. ... i wiele innych zastosowań... :) 12 2.5. METODY HODOWLI KOMÓRKOWEJ 2.5.1. METODY IZOLACJI KOMÓREK UKŁADU IMMUNOLOGICZNEGO Zakładanie hodowli pierwotnych komórek układu immunologicznego wymaga ich izolacji z organizmu. U zwierząt laboratoryjnych najczęściej pobiera się śledzionę, grasicę czy obwodowe węzły chłonne, szpik kostny lub makrofagi z otrzewnej. U ludzi pobranie takich narządów wiąże się z zabiegami chirurgicznymi, stąd najlepszym i najłatwiej dostępnym źródłem komórek immunologicznych jest krew obwodowa. 2.5.1.1. Metody izolacji ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej izoluje się metodą wirowania w gradiencie gęstości. Wykorzystuje się Fikol, złożony, hydrofilowy polisacharyd, który charakteryzuje się wyższą gęstością właściwą niż limfocyty i niższą od erytrocytów i granulocytów. Pozwala więc na rozdział komórek na poszczególne frakcje. Rozcieńczoną krew nawarstwia się na mieszaninę Fikol-Paque lub Fikol-Uropolina. Wirowanie probówki przy odpowiedniej ilości obrotów powoduje separację PBMC na poszczególne frakcje komórek. Erytrocyty i granulocyty przechodzą przez warstwę Fikolu i osiadają na dnie probówki, natomiast limfocyty i monocyty tworzą „kożuszek” komórek na granicy warstw Fikolu i osocza. Należy delikatnie zebrać warstwę komórek z „kożuszka” a następnie kilkukrotnie przepłukać buforem PBS pozbawionym jonów Ca2+ i Mg2+ w celu odpłukania niepotrzebnych elementów. Istnieją komercyjne zestawy do izolacji PBMC z pełnej krwi, które znacznie skracają czas procedury. Przykładowo probówki CPT, dzięki unikalnemu, żelowemu wypełnieniu rozdzielają frakcje – powyżej żelowej bariery znajduje się warstwa surowicy oraz obłoczek limfocytów i monocytów, poniżej – warstwa neutrofili i erytrocytów. Jednojądrzaste komórki krwi można rozseparować na poszczególne frakcje komórek. Wykorzystując zdolność przylegania monocytów do podłoża, można je oddzielić poprzez 2h inkubację PBMC sterylnej płytce Petriego w cieplarce (37°C, 5%CO 2, 100% wilgotności). Zebrany nadsącz stanowią komórki nieprzylegające (limfocyty). Komórki przylegające (monocyty) przepłukuje się lodowatym buforem PBS pozbawionym jonów Ca2+ i Mg2+, który ułatwia odklejanie się komórek. 13 Do rozdziału komórek na poszczególne subpopulacje najczęściej wykorzystuje się cytometr przepływowy z przystawką sortującą FACS, który pozwala na rozdział np. na subpopulacje limfocytów T i B. Zasady działania cytometru przepływowego omówione będą szerzej w ćwiczeniu 4. 2.5.1.2. Metody izolacji komórek mysich na przykładzie osteoklastów Po uśpieniu i przerwaniu rdzenia kręgowego myszy linii C57b2 pobiera się dwie długie kości kończyn - kość udową i piszczelową. Kości oczyszcza się z mięśni i umieszcza się w buforze PBS pozbawionym jonów Ca2+ i Mg2+. Następnie sterylizuje się je w 70% roztworze etanolu i przemywa na płytce Petriego sterylnym buforem PBS, w celu odpłukania alkoholu. Kości umieszcza się w medium dla osteoklastów (OCM) i odcina końcówki. Świeżym OCM wypłukuje się szpik kostny i przenosi do jałowego Corninga. Agregaty komórkowe rozbija się przez stanowcze rozpipetowanie pożywki. Komórki wiruje się (1000 obr/min; 10 min.). Do peletu komórek dodaje się świeżego OCM i inkubuje się na płytce ok. 2h. Nieprzylegające komórki zbiera się i nakłada na płytkę wołową. Pożywkę suplementuje się czynnikami stymulującymi różnicowanie się osteoklastów: RANKL, M-CSF. 14 2.6. NACZYNIA HODOWLANE, POŻYWKI 2.6.1. Naczynia hodowlane Do hodowli komórkowych (tkankowych) używa się przede wszystkim sterylnych, szklanych lub plastikowych (obecnie najczęściej) naczyń płaskodennych: • butelki hodowlane - ze specjalnymi zatyczkami, które umożliwiają swobodną wymianę gazową, ale zapobiegają zakażeniu hodowli. Wykorzystywane są do hodowli komórek w większej ilości pożywki. • Płytki (szalki) Petriego – wykorzystywane do hodowli komórek przylegających • Płytki do hodowli - 4-, 6-, 24- lub 96-dołkowe. Im więcej dołków, tym mniejsza ich średnica i tym samym mniejsza objętość pożywki hodowlanej. Przykrywka ogranicza parowanie pożywki, ale umożliwia wymianę gazową. Aby poprawić warunki hodowli podłoże w naczyniach hodowlanych można pokrywać kolagenem, czy fibronektyną, które ułatwiają adhezję i wzrost komórek przylegających lub hodowlą fibroblastów, które dostarczają niezbędnych czynników wzrostowych. 15 2.6.2. Pożywki Pożywki do hodowli różnią się w zależności od typu hodowanych komórek, jednak istnieją podstawowe zasady komponowania składu. Przede wszystkim w składzie każdego medium musi się znaleźć źródło energii w postaci węglowodanów (najczęściej glukoza lub galaktoza), aminokwasy, kwasy tłuszczowe, lipidy, cholesterol. Bardzo ważny jest dodatek soli nieorganicznych, które utrzymują ciśnienie osmotyczne, pH, czy potencjał błonowy. Pełnią one również kluczową rolę jako kofaktory reakcji enzymatycznych. Do pożywki dodaje się także związki buforujące pod postacią NaHCO3, który wraz z gazowym CO2 w inkubatorze (5-10% atmosferze) utrzymują odpowiednie pH. Markerem właściwego pH jest czerwień fenolowa. Dodatkowo pożywki suplementuje się witaminami (ryboflawina, tiamina, biotyna), mikroelementami (cynk, miedź, selen), hormonami, czynnikami wzrostu. Dodaje się również antybiotyki (penicylina, streptomycyna), które zmniejszają ryzyko zakażenia hodowli komórkowej. Kluczowym suplementem pożywki hodowlanej jest bydlęca (FBS) lub cielęca (FCS) surowica płodowa. Stanowi ona cenne źródło białek (m.in. albumin), witamin, hormonów, czynników wzrostowych, adhezyjnych etc. Zwykle dodaje się jej do pożywki w ilości 510% części objętościowych. Mimo wielu zalet, suplementowanie pożywek surowicą niesie za sobą pewne ryzyko. Przede wszystkim istnieje ryzyko zakażenia wirusowego hodowli. Poza tym składniki surowicy nie mają ustalonego stężenia, każda kolejna partia może różnić się między sobą dając odmienne wyniki. 2.7. ZAKŁADANIE HODOWLI, ZMIANA POŻYWEK, PASAŻOWANIE 2.7.1.Zakładanie hodowli komórkowej Po izolacji komórek zawieszamy je w ogrzanej do temperatury 37°C pożywce i nakładamy w odpowiedniej ilości do naczynia hodowlanego. Otrzymanie odpowiedniego stężenia komórek w zawiesinie ułatwia liczenie ich w hemocytometrze (komora FuchsaRosenthala, Bűrkera). Jest to grube szkiełko podstawowe, pokryte siatką prostopadłych do siebie linii (kształt litery H), przykryte szkiełkiem nakrywkowym, położonym dokładnie na wysokość 0,1 nm od szkiełka podstawowego. Linie tworzą siatkę Thoma, która składa się z 16 kwadratów, rozdzielanych potrójnymi liniami. Całkowita powierzchnia siatki wynosi 1 mm2. Określoną objętość wybarwionych (płyn Tűrka) komórek nakłada się pod szkiełko nakrywkowe a następnie zlicza się pojedyncze komórki w poszczególnych kratkach. 16 Aby uniknąć błędu w obliczeniach, nie liczy się komórek na lewych i górnych liniach ograniczających. Ilość wyizolowanych komórek wylicza się z matematycznego wzoru, uwzględniającego parametry kamery, rozcieńczenie. 17 2.2.1.Zmiana pożywek hodowlanych Hodowla komórek w warunkach in vitro powoduje nagromadzenie się metabolitów (często toksycznych) w pożywce. Wpływają one negatywnie na stan komórek, które przestają się dzielić, zmieniają fenotyp i w końcu zaczynają obumierać. Im wyższa gęstość hodowli tym szybszy spadek składników odżywczych i wzrost metabolitów w pożywce, a więc i częstsza potrzeba zmiany medium hodowlanego. Bardzo przydatnym indykatorem zmian jest czerwień fenolowa, która zmienia barwę na żółtą pod wpływem zmian pH. Istnieje kilka podstawowych zasad prawidłowej zmiany medium hodowlanego. Po pierwsze wymianę pożywki wykonujemy w sterylnych warunkach. Świeżą pożywkę zawsze podgrzewamy do temperatury 37°C, aby komórki nie przeżyły szoku termicznego. Zużytą pożywkę usuwa się z naczynia hodowlanego za pomocą jednorazowej pipety pasterowskiej lub pipety automatycznej, pozostawiając jednak pewną jej objętość, aby nie pozbawić komórek wyprodukowanych już czynników wzrostowych. Butelkę ze świeżą pożywką dezynfekuje się 70% etanolem, opala nad palnikiem gazowym. Pożywkę pobieramy jednorazową strzykawką i dodajemy do komórek. 2.2.2. Pasażowanie komórek Aby zapobiec odróżnicowaniu się komórek oraz zjawisku kontaktowego zahamowania wzrostu w konfluentnej hodowli należy wykonać pasażowanie, czyli przeniesienie części komórek. W przypadku hodowli komórek w zawiesinie procedura jest prostsza, ponieważ wystarczy przenieść część zawiesiny komórek do nowego naczynia i uzupełnić świeżym medium. Komórki przylegające należy najpierw mechanicznie oderwać od podłoża przy pomocy sterylnej drapaczki, delikatnie rozpipetować, aby rozbić zlepki komórek i równomiernie rozprowadzić w zawiesinie, a następnie można przenieść do nowego naczynia. 18 2.2.1.Mrożenie, bankowanie i rozmrażanie komórek Komórki, które nie są w danym momencie wykorzystywane, mogą być przetrzymywane zamrożone nawet przez wiele lat w ciekłym azocie. Zamrażane komórki muszą być w fazie log wzrostu oraz być w dobrej kondycji, aby uniknąć strat w czasie przechowywania. Do krioampułki zawierającej komórki dodaje się znacznie wyższe stężenie surowicy min. 20% oraz DMSO (dimetylosulfotlenek) lub glicerol (10%), które chronią przed powstającymi kryształkami lodu. Proces zamrażania przeprowadza się stopniowo, obniżając temperaturę o 1°C na minutę. Po zamrożeniu komórki umieszcza się w ciekłym azocie (-196°C). Komórki rozmraża się w możliwie jak najkrótszym czasie, aby uniknąć toksycznego działania DMSO. Krioampułkę umieszcza się w łaźni wodnej w temperaturze 37°C i w momencie rozpuszczenia zawartości, przenosi się komórki do dużej objętości ogrzanej pożywki, wiruje (1100 obr./min, 5 min) i odpłukuje toksyczne związki. 19 3. CEL ĆWICZENIA Celem ćwiczenia jest stworzenie modelu in vitro odpowiedzi immunologicznej na antygeny bakteryjne. UWAGA: Założone hodowle i stymulacje jednojądrzastych komórek krwi obwodowej posłużą za bazę do kolejnych ćwiczeń! 4. MATERIAŁY 4.1. MATERIAŁ BIOLOGICZNY • PBMC (peripheral blood mononuclear cells) - jednojądrzaste komórki krwi obwodowej • PBL (peripheral blood lymphocytes) – limfocyty krwi obwodowej: limfocyty T, limfocyty B, komórki NK • monocyty 4.2. STYMULANTY: CpG ODN – oligodeoksynukleotyd syntetyzowany na wzorze genomu bakterii Chlamydophila pneumoniae AR39 ( omp4/omp5 - geny, kodujące białka błony zewnętrznej) LPS – lipopolisacharyd (endotoksyna) – silny aktywator reakcji zapalnej, rozpoznawany przez kompleks receptorów CD14/TLR2 GM-CSF – czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów, prozapalna cytokina, wykorzystywany w generacji komórek dendrytycznych TNF - czynnik martwicy nowotworu, najsilniejsza prozapalna cytokina, silny aktywator apoptozy 20 4.3. SPRZĘT LABORATORYJNY, ODCZYNNIKI • Mieszanina Ficoll/ Uropolina (gęstość 1,007 g/cm3) • bufor PBS, pozbawiony jonów Mg2+ i Ca2+ • Jałowe szklane probówki • Sterylne probówki typu eppendorf • Sterylne tipsy • Pipetki pasterowskie • RPMI 1640 z dodatkiem 5% płodowej surowicy bydlęcej (FCS) oraz antybiotyków: penicyliny (10000U/ml), streptomycyny (1mg/ml) • Sterylne płytki hodowlane: 24dołkowa, 96-dołkowa • Sterylna płytka Petriego • Płyn Tűrka • Kamera Fuchsa-Rosenthala • Błękit trypanu • Pipety automatyczne • Probówki z antykoagulantem • • Strzykawki SPRZĘT LABORATORYJNY: komora laminarna, wirówka, mikroskop świetlny, cieplarka 5. METODY. 5.1. Izolacja PBMC z krwi żylnej metodą wirowania w gradiencie gęstości Ficoll/Uropolina 1. Pobrać 20 ml krwi żylnej do sterylnych probówek zawierających antykoagulant (EDTA). 2. Krew rozcieńczyć buforem PBS, pozbawionym jonów Mg2+ i Ca2+ w stosunku 1:1 i nawarstwić na ok. 2,5 ml mieszaniny Ficoll/Uropolina w szklanej probówce. 3. Wirować 15 minut (2500 obr/min.) w celu rozdzielenia frakcji komórek. 4. Zebrać „obłoczek” limfocytów do nowej, sterylnej probówki. 5. Zebrane komórki dwukrotnie przepłukać buforem PBS, pozbawionym jonów Mg2+ i Ca2+, (wirowanie - 8 minut; 1500 obr/min.) 6. Komórki zawiesić w 1 ml pożywki hodowlanej RPMI 1640 z dodatkiem 5% płodowej surowicy bydlęcej (FCS) oraz antybiotyków: penicyliny (10000U/ml), streptomycyny (1mg/ml). 21 5.2. Liczenie komórek z wykorzystaniem kamery Fuchsa-Rosenthala 1. Przygotować kamerę Fuchsa-Rosenthala. Nałożyć szczelnie szkiełko nakrywkowe. 2. Z zawiesiny komórek w pożywce hodowlanej pobrać 10μl i dodać do 90μl płynu Türka. 3. Po dwóch minutach inkubacji (czas potrzebny, aby doszło do lizy erytrocytów i wybarwienia się błon żywych komórek) mieszaninę nałożyć na kamerę. Pobrać 17μl i delikatnie wpuścić ją od góry pod szkiełko nakrywkowe, uważając aby do nie przesunąć. 4. Komórki zliczyć pod mikroskopem świetlnym w 8 kolejnych, kwadratowych polach (trzykrotnie powtarzając pomiar). 5. Całkowitą ilość wyizolowanych komórek oszacować na podstawie wzoru: A = 80 000 x B x C x D A – całkowita ilość wyizolowanych PBMC 80 000 – współczynnik przeliczeniowy dla kamery FuchsaRosenthala, uwzględniający jej parametry budowy B – średnia ilość komórek przypadająca na 1 pole C – rozcieńczenie komórek po przygotowaniu mieszaniny z płynem Türka ( C = 10 ) D – całkowita objętość zawiesiny komórek w medium hodowlanym 5.3. Ocena żywotności wyizolowanych komórek z wykorzystaniem błękitu trypanu 1. Z zawiesiny wyizolowanych komórek pobrać 10 μl i zmieszać z błękitem trypanu (4mg/ml) w stosunku 1:1. Nałożyć na kamerę Fuchsa-Rosenthala. 2. Komórki ocenić pod mikroskopem świetlnym. Komórki o ciemnych, okrągłych symetrycznych brzegach i jasnym środku uznaje się za żywe, a ciemno zabarwione, o nierównych, postrzępionych brzegach za martwe. 22 3. Żywotność komórek przedstawić procentowo jako stosunek ilości żywych komórek do całkowitej ilości zliczonych PBMC przemnożony przez 100. 4. UWAGA !!! Hodowlę można założyć, jeśli żywotność świeżo wyizolowanych komórek wynosiła powyżej 80%. 5.4. Przygotowanie zawiesiny komórek w pożywce RPMI 1640 w stężeniu 1 mln komórek na 1 ml pożywki Wyizolowane komórki rozcieńczyć do stężenia 1 mln/ml odpowiednią ilością pożywki hodowlanej RPMI 1640 z dodatkiem 5% płodowej surowicy bydlęcej (FCS) oraz antybiotyków: penicyliny (10000U/ml), streptomycyny (1mg/ml). 5.5. Zakładanie hodowli komórek a. Płytka 24-dołkowa – hodowle PBMC, PBL, monocytów do oznaczania profilu cytokin, do generacji komórek dendrytycznych, analizy cyklu komórkowego i apoptozy 1. Aby otrzymać osobne populacje PBL i monocytów należy PBMC inkubować min. 1 h na sterylnej szalce Petriego w cieplarce w odpowiednich warunkach 2. Świeżo wyizolowane PBMC metodą wirowania w gradiencie gęstości mieszaniny Ficoll/Uropolina hodować na 24-dołkowej sterylnej płytce w ilości 1 miliona komórek na 1 ml pożywki RPMI 1640 wzbogaconej 5% FCS i antybiotykami P/S na dołek 23
