Hodowle komórkowe

advertisement
ĆWICZENIE 1
HODOWLE KOMÓRKOWE. TWORZENIE MODELU IN VITRO
ODPOWIEDZI IMMUNOLOGICZNEJ NA ANTYGENY
BAKTERYJNE.
1. WSTĘP TEORETYCZNY
1.1. Odpowiedź nieswoista, cząstki PAMP, receptory TLR
Mimo ogromnego postępu naukowego współczesna medycyna nie potrafi nadal do
końca rozwiązać problemu zachorowalności i śmiertelności związanej z infekcjami
patogennymi
mikroorganizmami.
Niebezpieczne
drobnoustroje
zasiedlają
niemal
wszystkie nisze ekologiczne, stąd ze wszystkich stron jesteśmy narażeni na podstępny
atak. W walce z patogenami nie jesteśmy jednak bez szans, dzięki integralnej części
naszego organizmu – układowi immunologicznemu.
Pierwsza linia obrony przeciwbakteryjnej opiera się między innymi na istnieniu
szczelnych barier mechanicznych w postaci skóry i błon śluzowych, ruchu rzęsek w
tchawicy czy niskiego pH w żołądku. Taki nieswoisty (wrodzony) system obrony sprawia,
że tylko niewielka ilość potencjalnie groźnych mikroorganizmów z naszego otoczenia
może przenikać do tkanek. Jeśli jednak dojdzie do przełamania barier, organizm musi
natychmiastowo uruchomić systemy obronne w celu błyskawicznego zahamowania
rozprzestrzeniającej się infekcji.
Niewątpliwie ogromną rolę odgrywają tu mechanizmy nieswoiste, które
charakteryzują się większą szybkością niż odpowiedź swoista, co ma kluczową rolę, gdy
weźmie się pod uwagę szybkość podziałów bakteryjnych (1 podział komórki w ciągu 20
minut). Aby doszło do rozwoju nieswoistej reakcji obronnej, układ immunologiczny
organizmu musi rozpoznać obecność drobnoustrojów. Jest to możliwe dzięki
występowaniu na komórkach obrony nieswoistej receptorów selektywnie rozpoznających
wzorce molekularne związane z patogenami, zwane cząstkami PAMP (ang. pathogen
associated
molecular
drobnoustrojów.
patterns),
czyli
najbardziej
charakterystyczne
struktury
Receptory rozpoznające wzorce – PRR (ang. pathogen recognition
receptors), występujące na wielu rodzajach komórek (limfocytach, monocytach,
makrofagach, neutrofilach, komórkach dendrytycznych) pełnią niezwykle ważne funkcje w
organizmie. Dzięki rozpoznaniu klasy patogena (cząstki PAMP są typowe dla całych grup
1
mikroorganizmów – np. lipopolisacharyd dla bakterii grammujemnych) możliwe jest
precyzyjne
dopasowanie
mechanizmów
obronnych.
Jeśli
patogen
jest
zewnątrzkomórkowy, system immunologiczny błyskawicznie aktywuje eozynofile i
produkcję interleukiny 4 (IL-4) oraz immunoglobulin E (IgE) (odpowiedź typu T H2),
natomiast przy infekcji drobnoustrojami pasożytującymi wewnątrzkomórkowo (wirusy,
niektóre bakterie np. Chlamydia pneumoniae) dochodzi do aktywacji komórek NK (ang.
natural killers – naturalni zabójcy) oraz sekrecji m.in. interferonu gamma (IFN- γ)
(odpowiedź typu TH1).
Do najlepiej scharakteryzowanych receptorów PRR należą receptory Toll-podobne
(TLR, ang. Toll-like receptors), odkryte przy okazji badań nad mechanizmem rozwoju
muszki owocowej Drosophila melanogaster.
Receptory
TLR
rozpoznają
wiele
składników
mikroorganizmów
takich
jak
lipopolisacharyd bakterii grammujemnych (TLR4), peptydoglikany (TLR2), kwas
lipotejchojowy bakterii grammdodatnich (TLR2, TLR4) czy bakteryjne DNA (TLR9).
Aktywują one komórki układu odpornościowego do sekrecji szeregu cytokin i chemokin,
co prowadzi do zwiększenia przepuszczalności naczyń i napłynięcia do miejsca infekcji
komórek obronnych. Ta niezwykle silnie konserwowana filogenetycznie rodzina 10
receptorów zawdzięcza swą nazwę genowi „toll”, który nie tylko odpowiada za rozwój
embrionalny muszki, ale także koduje receptor, który bierze udział w reakcjach obronnych
(podobnie
jak
w
komórkach
ssaków).
Ssacze
receptory
TLR
posiadają
zewnątrzkomórkowe domeny bogate w leucynę (LRRs, ang. leucine reach repeats) oraz
fragmenty cytoplazmatyczne z domeną TIR (Toll-IL-1R, przez analogię do odcinków
występujących w receptorach interleukiny 1).
1.2. Bakteryjne DNA-specyficzne cząstki PAMP
Ostatnie badania wskazują na potencjalne immunostymulujące właściwości
bakteryjnego DNA. W przeciwieństwie do genomów kręgowców, u których częstotliwość
występowania dinukleotydów cytozyna – guanozyna (CpG) waha się w granicach 1/501/60, u bakterii wynosi ona około 1/16. Dodatkowo mniej niż 5% cytozyn w
dinukleotydach CpG bakteryjnego kwasu nukleinowego jest zmetylowana, podczas gdy aż
70-90% tych dinukleotydów w ssaczych genomach zawiera zmetylowana cytozynę.
2
Podczas infekcji uwolnienie takiego niemetylowanego CpG DNA z komórki
bakteryjnej rozpoznawane jest przez gospodarza jako sygnał o niebezpieczeństwie
i wyzwala odpowiedź obronną.
CpG DNA aktywuje kaskadę mechanizmów, które prowadzą do dojrzewania,
różnicowania i proliferacji komórek układu immunologicznego takich jak limfocyty B i T,
komórki NK, monocyty, makrofagi oraz komórki dendrytyczne.
DNA zawierający niemetylowane motywy CpG nie tylko indukuje poliklonalną
aktywację limfocytów B, ale stymuluje także pozostałe komórki do sekrecji prozapalnych
cytokin: interleukiny 1 (IL-1), IL-6, IL-18 oraz martwiczego czynnika nowotworu alfa
(TNF-α, ang. tumor necrosis factor alpha). Dodatkowo, wydzielana IL-12 stymuluje
aktywność przeciwbakteryjną, przeciwwirusową, przeciwnowotworową komórek NK oraz
sekrecję
IFN- γ, należącego do cytokin typu TH1. Wydzielane cytokiny (zarówno
prozapalne jak i typu TH1) wraz z innymi przeciwbakteryjnymi produktami takimi jak
tlenek azotu, czy fosfolipaza D mają na celu zahamowanie rozwijającej się infekcji.
1.3. Oligodeoksynukleotydy – typy, zastosowanie kliniczne
Szereg badań nad immunomodulacyjnymi właściwościami bakteryjnego DNA na układ
odpornościowy kręgowców, zarówno tych o pozytywnych, terapeutycznych aspektach, jak
i tych negatywnych, niebezpiecznych dla zdrowia narzuciło konieczność znalezienia
syntetycznego analogu, który mógłby zostać powszechnie (bez ryzyka kontaminacji
innymi składnikami komórek bakteryjnych) wykorzystany w doświadczeniach in vitro i in
vivo. Na początku lat 90-tych ubiegłego stulecia japoński naukowiec S. Yamamoto
udokumentował po raz pierwszy aktywację komórek NK i sekrecję IFN- γ po stymulacji
syntetycznymi oligodeoksynukleotydami, których sekwencje nukleotydowe oparto na
wzorze genomu bakteryjnego. Od tego momentu wiele grup badawczych na całym świecie
rozpoczęło poszukiwania takiej sekwencji nukleotydowej oligodeoksynukleotydów, która
byłaby optymalna dla celów terapeutycznych a jej stosowanie nie przynosiłoby efektów
ubocznych.
Postęp w badaniach nad oligonukleotydami wykazał, że efekty stymulacji układu
odpornościowego zależą przede wszystkim od długości (min. 10 nukleotydów), sekwencji
nukleotydowej, ilości powtórzeń niemetylowanego motywu CpG (oraz jego lokalizacji w
sekwencji), a także typu wiązań pomiędzy nukleotydami.
3
Ze względu na specyficzną budowę oligonukleotydów i związane z nią różnice
w
stymulacji aktywności ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej wyróżniono
trzy grupy: ODN typu K (zwany również typem B), ODN typu D (typ A) i ODN typu C.
Typ K oligodeoksynukleotydów posiada fosforosiarczanowy (phosphothioate)
szkielet i wielokrotnie powtórzony niemetylowany motyw CpG. Dzięki takiemu
rozwiązaniu są one mniej wrażliwe na działanie enzymów trawiących kwas nukleinowy
(DNaz) i wykazują dłuższy czas półtrwania in vivo niż tradycyjne oligonukleotydy
zawierające fosfodiestrowe wiązania. Za optymalną sekwencję uważa się powtórzone
motywy TCGTT i/lub TCGTA, które silnie stymulują proliferację oraz sekrecję IL-6 oraz
IgM. Przyjmuje się, że aktywność oligonukleotydów typu K rośnie wraz z ilością
powtórzonych niemetylowanych motywów CpG oraz wraz z długością sekwencji (min. 12
nukleotydów). Zaobserwowano również, że położenie motywu CpG w oligonukleotydach
ma znaczenie dla ich aktywności. Odnotowano bowiem, iż sztucznie syntetyzowane
oligodeoksynukleotydy zawierające silnie stymulujący motyw CpG przy końcu 5’
indukują dużo silniejszą aktywację układu immunologicznego niż te, które zawierały mniej
aktywny motyw w tej samej pozycji. Oligodeoksynukleotydy typu K wywołują silną
odpowiedź organizmu, która objawia się przede wszystkim aktywacją limfocytów B, ich
proliferacją i sekrecją IL-6 oraz immunoglobulin (IgM). Dodatkowo indukują dojrzewanie
komórek dendrytycznych pochodzenia plazmacytoidalnego.
Oligodeoksynukleotydy typu D charakteryzuje mieszany fosfodiestrowofosforosiarczanowy (phosphothioate) szkielet oraz niezbędny dla ich aktywności motyw, w
którym niemetylowany dinukleotyd CpG jest oflankowany z obu stron puryną i
pirymidyną (puryna,/pirymidyna/CG/ puryna,/pirymidyna). Dodatkowym elementem
wymaganym
dla wysokiej aktywności oligonukleotydów tego typu
jest ogon
poliguaninowy (poli-G) na końcu 3’ sekwencji, który może tworzyć strukturę pętli.
Minimalną długością sekwencji nukleotydowej dla optymalnej aktywności
oligonukleotydu wydaje się być wg D. Verthelyi i wsp. 18 par zasad.
Co ciekawe, niektórzy badacze sugerują, iż nie ma przesłanek, aby sądzić, iż typ D
oligonukleotydów oddziałuje z receptorami TLR9, a nawet podejrzewają, iż długi ogon
poliguaninowy może oddziaływać z receptorem zmiataczem (ang. scavenger receptor)
obecnym na wielu komórkach układu immunologicznego.
Mimo
wielu
wątpliwości,
związanych
z
mechanizmem
rozpoznawania
oligonukleotydów typu D przez komórki układu immunologicznego, znany jest efekt ich
aktywności. Stymulują one sekrecję IFN-alfa przez komórki dendrytyczne pochodzenia
4
plazmacytoidalnego oraz przez komórki NK.
Jak łatwo zauważyć oba typy oligodeoksynukleotydów oddziałują z różnymi
typami
komórek
układu
odpornościowego
i
wywołują
odmienne
odpowiedzi
immunologiczne. Typ D silnie stymuluje produkcję IFN- alfa, ale niewiele wiadomo o jego
działaniu na limfocyty B, podczas gdy typ K oligonukleotydów wykazują odwrotny efekt
działania. Połączenie unikalnych cech sekwencji obu typów zaowocowało powstaniem
oligonukleotydu, który nie tylko silnie stymulował komórki B do zwiększonej produkcji
IL-6, ale jednocześnie aktywował sekrecję IFN- alfa przez komórki dendrytyczne
pochodzenia plazmacytoidalnego.
Tak powstał typ C oligodeoksynukleotydów, którego budowa opiera się
o szkielet fosforosiarczanowy. Zawiera on palindromową sekwencję z centralnie
umieszczonym niemetylowanym dinukleotydem CpG (cecha ODN typu D) oraz
pojedynczy lub wielokrotnie powtórzony motyw GTCGTT (cecha ODN typu K).
Dodatkowo jego aktywność zwiększa położony przy końcu 5’ dimer TCG (TCGTCG), ale
jednocześnie do stymulacji sekrecji IFN- alfa nie jest wymagany ogon poliguaninowy na
końcu 3’. Duże nadzieje wiąże się z poszukiwaniem optymalnych sekwencji
oligodeoksynukleotydów,
które
dzięki
ich
immunomodulacyjnym
właściwościom
mogłyby zostać potencjalnie wykorzystane w leczeniu.
Obecnie prowadzi się pierwsze próby kliniczne, mające na celu sprawdzenie
możliwości zastosowania oligonukleotydów z motywem CpG w immunoprotekcji,
leczeniu nowotworów, alergii.
Wydaje się, iż ochrona przeciwnowotworowa
wywołana poprzez stymulację oligodeoksynukleotydami z niemetylowanymi wyspami
CpG skupia się przede wszystkim na komponentach odpowiedzi nieswoistej niż
odpowiedzi. Przeciwnowotworowe właściwości oligonukleotydów prawdopodobnie
opierają się na zwiększaniu litycznej aktywności komórek NK. Nie wyklucza się także roli
komórek dendrytycznych, co sugerują wyniki modeli, w których komórki NK spowalniały
wzrost guza, ale nie powodowały jego regresji. Mimo, iż nadal trwają badania, które
pozwolą na znalezienie sekwencji oligonukleotydów optymalnych dla aktywacji komórek
NK lub cytotoksycznych limfocytów T, to już teraz z powodzeniem stosuje się je w terapii
białaczek, czerniaka, nowotworów jelit.
Oligonukleotydy, zawierające niemetylowany
motyw CpG mogą być wykorzystane ze względu na unikalne właściwości zarówno w
leczeniu infekcji, jak i immunoprotekcji. Jest to zasługa szybkiej aktywacji odpowiedzi
nieswoistej, która poprzez wydzielane cytokiny prozapalne i tlenek azotu, aktywację
fagocytów, komórek NK hamują rozwój infekcji.
5
W 1998 roku Zimmermann i wsp. po raz pierwszy opublikowali wyniki skutecznej
terapii infekcji Leishmania major z wykorzystaniem oligonukleotydów. Zawarty w nich
motyw CpG zmieniał profil cytokin produkowanych przez limfocyty z sekrecji IL-4 na
IFN- γ oraz klasy przeciwciał z IgG1 na IgG2a lub IgG2b. Taka odpowiedź hamowała
rozwój choroby, i jednocześnie zapewniała ochronę podczas powtórnej infekcji. Co więcej,
w kolejnych badaniach Zimmermann i wsp. wykazali, że oligonukleotydy wykazują także
terapeutyczne działanie po ich podaniu nawet po 20 dniach od rozpoczęcia infekcji L.
major. Leczenie z wykorzystaniem oligodeoksynukleotydów wydaje się być również
skuteczne w przypadku infekcji patogenami wewnątrzkomórkowymi m.in. Franciscella
tularensis czy Listeria monocytogenes. Już pojedyncza dawka oligonukleotydów
wystarczała do indukcji immunoprotekcji opartej na aktywności limfocytów B oraz
produkcji IFN- γ. Kilkukrotne podanie oligonukleotydów zapewniało długotrwałą ochronę
przeciwko tym bakteriom.
Dzięki immunostymulującym właściwościom oligonukleotydów z motywem CpG,
które objawiają się m.in. aktywacją komórek prezentujących antygen oraz zwiększeniem
ekspresji cząsteczek kostymulujących na powierzchni komórek układu odpornościowego
mają one szanse by być wykorzystane jako adiuwanty w szczepionkach. Jednoczesne
podanie CpG DNA i oczyszczonych antygenów prowadzi do rozwoju odpowiedzi opartej
na antygenowo-specyficznych limfocytach B i komórkach T, co czyni je przydatnymi jako
nowa klasa adiuwantów.
Unikalne, terapeutyczne działanie oligonukleotydów objawia się również przez
przesuwanie równowagi z odpowiedzi typu TH2 (IL-4, IL-5, IgG1), charakterystycznej dla
rozwoju alergii na TH1 (IFN- γ, IgG2a), dzięki czemu terapia oligonukleotydami może
hamować rozwój schorzenia, a nawet jest skuteczna w leczeniu astmy.
O skuteczności terapii oligodeoksynukleotydami decyduje wiele czynników.
Jednym z nich jest budowa szkieletu oligonukleotydu, a właściwie rodzaj połączeń
pomiędzy nukleotydami, który decyduje o stabilności i czasie półtrwania (modyfikowane
wiązania fosfosiarcznanowe wydają się być najstabilniejsze).
Dużą rolę w wyborze terapii odgrywa typ oligodeoksynukleotydu i związane z nim
właściwości immunomodulacyjne. Typ D wydaje się być korzystniejszy w leczeniu alergii
oraz infekcji patogenami wewnątrzkomórkowymi, podczas gdy typ K może być
wykorzystany jako adiuwant w szczepionkach indukujących silna odpowiedź humoralną.
Dodatkowo, bardzo ważną rolę w osiągnięciu pozytywnego efektu terapeutycznego
odgrywa miejsce podania oligonukleotydów. Przykładowo, oligodeoksynukleotydy podane
6
dopochwowo zapewniały odporność przeciwko wirusowi Herpes simplex, czego nie
osiągnięto w leczeniu systemicznym.
W przeciwieństwie do szczepionek antygenowo-specyficznych, po których
odporność organizmu rozwija się w ciągu tygodni, ale może trwać przez całe życie, CpG
DNA aktywuje odpowiedź w ciągu paru dni, ale zapewnia ochronę tylko na około dwóch
tygodni. Szczepionki na bazie oligonukleotydów mogą być wykorzystywane w terapii
infekcji wolno rosnącymi patogenami bądź niskimi dawkami bardziej „agresywnych”
patogenów. Wydają się również użyteczne dla uzyskania odporności u pacjentów, o
których wiadomo, iż mogą być narażeni na infekcje.
Aby przedłużyć dość krótką aktywność oligodeoksynukleotydów, co zwiększyłoby
potencjalnie ich terapeutyczną użyteczność próbuje się dwie nowe metody ich podawania.
Jedną z nich jest powtarzanie dawek oligonukleotydów co dwa tygodnie, druga zakłada ich
enkapsulację w kationowe liposomy, które znacznie zwiększają pobieranie CpG DNA i
nawet dwukrotnie wydłużają odporność.
2. HODOWLE KOMÓRKOWE
2.1. DEFINICJA
Hodowla komórkowa – jest modelem in vitro próbującym odzwierciedlić
system in vivo. Umożliwia utrzymanie żywych komórek poza organizmem
przez minimum 24 h.
7
2.2. Typy hodowli:
A) podział ze względu pochodzenie komórek i ich czas życia:
1. hodowle
pierwotne – hodowle komórek
wyizolowanych
z
organizmu
2. hodowle ciągłe - hodowle unieśmiertelnione i transformowane
nowotworowo
B) podział ze względu na typ hodowli:
1. hodowle w zawiesinie
2. hodowle komórek przylegających
3. hodowle na mikronośnikach
4. hodowle przestrzenne
TYPY HODOWLI
A) HODOWLE PIERWOTNE
Hodowle pierwotne zakładane są z pojedynczych komórek świeżo wyizolowanych z
organizmu. Mogą to być zarówno komórki bezpośrednio izolowane z organizmu np.
komórki krwi lub uzyskane po działaniu enzymów na pobrany fragment tkanki. Komórki
te proliferują i tworzą skupiska (klony) w zawiesinie lub jednolitą warstwę na podłożu. Po
pierwszym pasażu, czyli rozdzieleniu i przeniesieniu do nowego naczynia komórek z
konfluntej hodowli (zbyt duża ilość komórek na powierzchnię podłoża prowadzi do
zjawiska kontaktowego zahamowania wzrostu, starzenia się hodowli i obumierania) staje
się linią komórkową.
W immunologii bardzo często wykorzystuje się hodowle pierwotne do oceny morfologii i
funkcji komórek układu odpornościowego. Z krwi żylnej izoluje się jednojądrzaste
komórki krwi obwodowej (PBMC;
ang. peripheral blood mononuclear cells), które
stanowią podstawową bazę do zakładana stymulacji. Wykorzystuje się też poszczególne
subpopulacje komórek tj. monocyty, limfocyty, komórki dendrytyczne. wymagają one
specyficznych warunków hodowli i odpowiednich suplementów.
8
B) LINIE KOMÓRKOWE. HODOWLE UNIEŚMIERTELNIONE
Linia komórkowa
powstaje z hodowli pierwotnej po pierwszym pasażu.
Wyróżniamy dwa typy linii: linia o określonej długości życia (najczęściej wywodzi się z
linii komórek diploidalnych, po kilku pasażach zamiera) oraz
tzw. linia komórkowa
ciągła. Linia ta powstaje albo w wyniku unieśmiertelnienia komórek na skutek transfekcji
lub transformacji spontanicznej. Mogą to być również komórki nowotworowe. Linie
komórkowe mają tą przewagę nad hodowlą pierwotną, że są bardziej homogenną
populacją i zapewniają tym samym lepszą powtarzalność wyników.
Spośród wielu rodzajów linii komórkowych, w immunologii najczęściej wykorzystuje się
komórki:
WEHI 164 – linia komórek nowotworowych wyizolowanych z mysiego
fibrosarcoma
(włókniakomięsak). Są
wrażliwe na działanie
czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF). Wykorzystywane do
testów biologicznych w celu oznaczenia aktywności biologicznej
tej cytokiny w surowicy krwi czy w nadsączach
znad hodowli
(supernatantach).
B9 -
hybrydoma powstała po fuzji komórek mysiej śledziony z komórkami
szpiczaka. Jest to linia, która potrzebuje do wzrostu interleukiny 6 (IL-6),
stąd wykorzystuje się ją do oznaczeń jej aktyw biologicznej.
K562
- linia nowotworowa wywodząca się z komórek przewlekłej białaczki
szpikowej pobranych w fazie przełomu blastycznego. Wykorzystywane
są w testach określających aktywność cytotoksyczną komórek NK, ze
względu na brak ekspresji częsteczek MHC kl. I.
U937 - monocytarna linia białaczkowa naśladująca hodowle pierwotne
monocytów.
9
C) HODOWLE W ZAWIESINIE
Są to hodowle, w których komórki, aby proliferować nie muszą mieć kontaktu z
podłożem. Tworzą się klony (grona) komórek. Najczęściej prowadzi się je w butelkach
hodowlanych, czasem w specjalnych naczyniach z wbudowanym mieszadełkiem, które
zapewnia stały ruch pożywki i chroni przed opadaniem na dno, a na skalę przemysłową w
bioreaktorach.
W immunologii takimi nieprzylegającymi komórkami są: limfocyty, komórki NK,
linie komórkowe B9 i K562.
D) HODOWLE KOMÓREK PRZYLEGAJĄCYCH
Komórki przylegające potrzebują kontaktu z podłożem do proliferacji. W takich
warunkach
interakcje
między
komórkami
sprzyjają
wzajemnym
korzystnym
oddziaływaniom. Utrata zdolności przylegania komórek lub nie sprzyjające warunki
hodowlane przyczyniają się do obumierania hodowli.
Komórki przylegające; monocyty, komórki dendrytyczne, WEHI 164, linia U937
10
E) HODOWLE NA MIKRONOŚNIKACH
Dodanie do hodowli mikronośników w postaci kuleczek (plastikowych, szklanych,
czy z dekstranu) zwiększa kilkukrotnie powierzchnię hodowlaną przy zastosowaniu małej
objętości pożywki.
F) HODOWLE PRZESTRZENNE
Wykorzystywane są w hodowlach narządowych. Dzięki próbom stworzenia
przestrzennego układu (trójwymiarowe rusztowania) naśladującego interakcje między
komórkami zachodzące in vitro stanowią obecnie najlepszy model doświadczalny.
2.2. ZALETY I WADY HODOWLI KOMÓRKOWYCH
A. ZALETY
1. Badacz ma możliwości prowadzenia doświadczeń (np. testowania leków) na
wybranej linii komórek. Dzięki temu mona ocenić wpływ badanej substancji (np.
leku) na przeżywalność, metabolizm, fenotyp, czy odpowiedź określonej komórki.
2. Hodowle komórkowe są modelem odzwierciedlającym patologiczne zmiany in
vivo.
3. Ścisła kontrola parametrów środowiska, stosowanie gotowych podłóż hodowlanych
i suplementów zapewnia powtarzalność eksperymentu i wiarygodne wyniki
4. Hodowle komórkowe w zdefiniowanych warunkach umożliwiają badanie interakcji
komórka-komórka
5. Koszt prowadzenia linii komórkowej jest niższy niż prowadzenie doświadczeń na
zwierzętach (nie dotyczy to jednak hodowli przemysłowych)
B. WADY
1. Mimo wielu zalet hodowle komórkowe nadal są tylko modelami in vitro, które
tylko naśladują systemy in vivo.
2. Wyizolowanie komórek z trójwymiarowych układów, jakimi są narządy i
przeniesienie ich do płaskich naczyń hodowlanych może zmienić zarówno ich
fenotyp jak i metabolizm.
11
3. Monokultury pozbawione są wielu niezbędnych bodźców generowanych przez inne
komórki.
4. Hodowle komórkowe (zwłaszcza linie ciągłe, po wielu pasażach) są niestabilne
genetycznie, co może wpływać na ich heterogenność.
5. Hodowle komórkowe są bardzo podatne na zakażenia, które mogą zakłócać
wiarygodność wyników.
6. Nie wszystkie komórki są nadal możliwe do hodowania.
7. Problem starzenia się hodowli (zwłaszcza diploidalnych komórek w hodowlach
pierwotnych).
2.4. ZASTOSOWANIE HODOWLI KOMÓRKOWYCH
PRZYKŁADOWE ZASTOSOWANIE HODOWLI KOMÓRKOWYCH
1. testowanie toksyczności leków
2. produkcja szczepionek
3. hodowanie tkanek do przeszczepów
4. badanie odpowiedzi immunologicznej
5. badanie interakcji komórka-komórka
6. produkcja rekombinowanych białek
7. produkcja przeciwciał monoklonalnych
8. baza do hodowli wirusów
9. ... i wiele innych zastosowań... :)
12
2.5. METODY HODOWLI KOMÓRKOWEJ
2.5.1. METODY IZOLACJI KOMÓREK UKŁADU
IMMUNOLOGICZNEGO
Zakładanie hodowli pierwotnych komórek układu immunologicznego wymaga ich
izolacji z organizmu. U zwierząt laboratoryjnych najczęściej pobiera się śledzionę, grasicę
czy obwodowe węzły chłonne, szpik kostny lub makrofagi z otrzewnej. U ludzi pobranie
takich narządów wiąże się z zabiegami chirurgicznymi, stąd najlepszym i najłatwiej
dostępnym źródłem komórek immunologicznych jest krew obwodowa.
2.5.1.1.
Metody izolacji ludzkich jednojądrzastych komórek krwi
obwodowej.
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej izoluje się metodą wirowania w
gradiencie gęstości. Wykorzystuje się Fikol, złożony, hydrofilowy polisacharyd, który
charakteryzuje się wyższą gęstością właściwą niż limfocyty i niższą od erytrocytów i
granulocytów. Pozwala więc na rozdział komórek na poszczególne frakcje.
Rozcieńczoną krew nawarstwia się na mieszaninę Fikol-Paque lub Fikol-Uropolina.
Wirowanie probówki przy odpowiedniej ilości obrotów powoduje separację PBMC na
poszczególne frakcje komórek. Erytrocyty i granulocyty przechodzą przez warstwę Fikolu
i osiadają na dnie probówki, natomiast limfocyty i monocyty tworzą „kożuszek” komórek
na granicy warstw Fikolu i osocza. Należy delikatnie zebrać warstwę komórek z
„kożuszka” a następnie kilkukrotnie przepłukać buforem PBS pozbawionym jonów Ca2+ i
Mg2+ w celu odpłukania niepotrzebnych elementów.
Istnieją komercyjne zestawy do izolacji PBMC z pełnej krwi, które znacznie
skracają
czas procedury. Przykładowo probówki CPT, dzięki unikalnemu, żelowemu
wypełnieniu rozdzielają frakcje – powyżej żelowej bariery znajduje się warstwa surowicy
oraz obłoczek limfocytów i monocytów, poniżej – warstwa neutrofili i erytrocytów.
Jednojądrzaste komórki krwi można rozseparować na poszczególne frakcje
komórek. Wykorzystując zdolność przylegania monocytów do podłoża, można je oddzielić
poprzez 2h inkubację PBMC sterylnej płytce Petriego w cieplarce (37°C, 5%CO 2, 100%
wilgotności). Zebrany nadsącz stanowią komórki nieprzylegające (limfocyty). Komórki
przylegające (monocyty) przepłukuje się lodowatym buforem PBS pozbawionym jonów
Ca2+ i Mg2+, który ułatwia odklejanie się komórek.
13
Do rozdziału komórek na poszczególne subpopulacje najczęściej wykorzystuje się
cytometr przepływowy z przystawką sortującą FACS, który pozwala na rozdział np. na
subpopulacje limfocytów T i B. Zasady działania cytometru przepływowego omówione
będą szerzej w ćwiczeniu 4.
2.5.1.2.
Metody izolacji komórek mysich na przykładzie osteoklastów
Po uśpieniu i przerwaniu rdzenia kręgowego myszy linii C57b2 pobiera się dwie
długie kości kończyn
- kość udową i piszczelową. Kości oczyszcza się z mięśni i
umieszcza się w buforze PBS pozbawionym jonów Ca2+ i Mg2+. Następnie sterylizuje się je
w 70% roztworze etanolu i przemywa na płytce Petriego sterylnym buforem PBS, w celu
odpłukania alkoholu. Kości umieszcza się w medium dla osteoklastów (OCM) i odcina
końcówki. Świeżym OCM wypłukuje się szpik kostny i przenosi do jałowego Corninga.
Agregaty komórkowe rozbija się przez stanowcze rozpipetowanie pożywki. Komórki
wiruje się (1000 obr/min; 10 min.). Do peletu komórek dodaje się świeżego OCM i
inkubuje się na płytce ok. 2h. Nieprzylegające komórki zbiera się i nakłada na płytkę
wołową. Pożywkę suplementuje się czynnikami stymulującymi różnicowanie się
osteoklastów: RANKL, M-CSF.
14
2.6. NACZYNIA HODOWLANE, POŻYWKI
2.6.1. Naczynia hodowlane
Do hodowli komórkowych (tkankowych) używa się przede wszystkim sterylnych,
szklanych lub plastikowych (obecnie najczęściej) naczyń płaskodennych:
•
butelki hodowlane - ze specjalnymi zatyczkami, które umożliwiają swobodną
wymianę gazową, ale zapobiegają zakażeniu hodowli. Wykorzystywane są do
hodowli komórek w większej ilości pożywki.
•
Płytki (szalki) Petriego – wykorzystywane do hodowli komórek przylegających
•
Płytki do hodowli - 4-, 6-, 24- lub 96-dołkowe. Im więcej dołków, tym mniejsza
ich średnica i tym samym mniejsza objętość pożywki hodowlanej. Przykrywka
ogranicza parowanie pożywki, ale umożliwia wymianę gazową.
Aby poprawić warunki hodowli podłoże w naczyniach hodowlanych można pokrywać
kolagenem, czy fibronektyną, które ułatwiają adhezję i wzrost komórek przylegających
lub hodowlą fibroblastów, które dostarczają niezbędnych czynników wzrostowych.
15
2.6.2. Pożywki
Pożywki do hodowli różnią się w zależności od typu hodowanych komórek, jednak
istnieją podstawowe zasady komponowania składu.
Przede wszystkim w składzie
każdego medium musi się znaleźć źródło energii w postaci węglowodanów (najczęściej
glukoza lub galaktoza), aminokwasy, kwasy tłuszczowe, lipidy, cholesterol. Bardzo
ważny jest dodatek soli nieorganicznych, które utrzymują ciśnienie osmotyczne, pH, czy
potencjał błonowy. Pełnią one również kluczową rolę jako kofaktory reakcji
enzymatycznych. Do pożywki dodaje się także związki buforujące pod postacią NaHCO3,
który wraz z gazowym CO2 w inkubatorze (5-10% atmosferze) utrzymują odpowiednie
pH. Markerem właściwego pH jest czerwień fenolowa. Dodatkowo pożywki suplementuje
się witaminami (ryboflawina, tiamina, biotyna), mikroelementami (cynk, miedź, selen),
hormonami,
czynnikami wzrostu. Dodaje się również antybiotyki
(penicylina,
streptomycyna), które zmniejszają ryzyko zakażenia hodowli komórkowej. Kluczowym
suplementem pożywki hodowlanej jest bydlęca (FBS) lub cielęca (FCS) surowica
płodowa. Stanowi ona cenne źródło białek (m.in. albumin), witamin, hormonów,
czynników wzrostowych, adhezyjnych etc. Zwykle dodaje się jej do pożywki w ilości 510% części objętościowych. Mimo wielu zalet, suplementowanie pożywek surowicą
niesie za sobą pewne ryzyko. Przede wszystkim istnieje ryzyko zakażenia wirusowego
hodowli. Poza tym składniki surowicy nie mają ustalonego stężenia, każda kolejna partia
może różnić się między sobą dając odmienne wyniki.
2.7. ZAKŁADANIE HODOWLI, ZMIANA POŻYWEK, PASAŻOWANIE
2.7.1.Zakładanie hodowli komórkowej
Po izolacji komórek zawieszamy je w ogrzanej do temperatury 37°C pożywce i
nakładamy w odpowiedniej ilości do naczynia hodowlanego. Otrzymanie odpowiedniego
stężenia komórek w zawiesinie ułatwia liczenie ich w hemocytometrze (komora FuchsaRosenthala, Bűrkera). Jest to grube szkiełko podstawowe, pokryte siatką prostopadłych do
siebie linii (kształt litery H), przykryte szkiełkiem nakrywkowym, położonym dokładnie na
wysokość 0,1 nm od szkiełka podstawowego. Linie tworzą siatkę Thoma, która składa się
z 16 kwadratów, rozdzielanych potrójnymi liniami. Całkowita powierzchnia siatki wynosi
1 mm2. Określoną objętość wybarwionych (płyn Tűrka) komórek nakłada się pod szkiełko
nakrywkowe a następnie zlicza się pojedyncze komórki w poszczególnych kratkach.
16
Aby uniknąć błędu w obliczeniach, nie liczy się komórek na lewych i górnych liniach
ograniczających. Ilość wyizolowanych komórek wylicza się z matematycznego wzoru,
uwzględniającego parametry kamery, rozcieńczenie.
17
2.2.1.Zmiana pożywek hodowlanych
Hodowla komórek w warunkach in vitro powoduje nagromadzenie się metabolitów
(często toksycznych) w pożywce. Wpływają one negatywnie na stan komórek, które
przestają się dzielić, zmieniają fenotyp i w końcu zaczynają obumierać. Im wyższa gęstość
hodowli tym szybszy spadek składników odżywczych i wzrost metabolitów w pożywce, a
więc i częstsza potrzeba zmiany medium hodowlanego. Bardzo przydatnym indykatorem
zmian jest czerwień fenolowa, która zmienia barwę na żółtą pod wpływem zmian pH.
Istnieje kilka podstawowych zasad prawidłowej zmiany medium hodowlanego. Po
pierwsze
wymianę pożywki wykonujemy w sterylnych warunkach. Świeżą pożywkę
zawsze podgrzewamy do temperatury 37°C, aby komórki nie przeżyły szoku termicznego.
Zużytą pożywkę usuwa się z naczynia hodowlanego za pomocą jednorazowej pipety
pasterowskiej lub pipety automatycznej, pozostawiając jednak pewną jej objętość, aby nie
pozbawić komórek wyprodukowanych już czynników wzrostowych. Butelkę ze świeżą
pożywką dezynfekuje się
70% etanolem, opala nad palnikiem gazowym. Pożywkę
pobieramy jednorazową strzykawką i dodajemy do komórek.
2.2.2. Pasażowanie komórek
Aby
zapobiec
odróżnicowaniu
się
komórek
oraz
zjawisku
kontaktowego
zahamowania wzrostu w konfluentnej hodowli należy wykonać pasażowanie, czyli
przeniesienie części komórek. W przypadku hodowli komórek w zawiesinie procedura jest
prostsza, ponieważ wystarczy przenieść część zawiesiny komórek do nowego naczynia i
uzupełnić świeżym medium. Komórki przylegające należy najpierw mechanicznie
oderwać od podłoża przy pomocy sterylnej drapaczki, delikatnie rozpipetować, aby rozbić
zlepki komórek i równomiernie rozprowadzić w zawiesinie, a następnie można przenieść
do nowego naczynia.
18
2.2.1.Mrożenie, bankowanie i rozmrażanie komórek
Komórki, które nie są w danym momencie wykorzystywane, mogą być
przetrzymywane zamrożone nawet przez wiele lat w ciekłym azocie. Zamrażane komórki
muszą być w fazie log wzrostu oraz być w dobrej kondycji, aby uniknąć strat w czasie
przechowywania. Do krioampułki zawierającej komórki dodaje się znacznie wyższe
stężenie surowicy min. 20% oraz DMSO (dimetylosulfotlenek) lub glicerol (10%), które
chronią przed powstającymi kryształkami lodu. Proces zamrażania przeprowadza się
stopniowo, obniżając temperaturę o 1°C na minutę. Po zamrożeniu komórki umieszcza się
w ciekłym azocie (-196°C).
Komórki rozmraża się w możliwie jak najkrótszym czasie, aby uniknąć toksycznego
działania DMSO. Krioampułkę umieszcza się w łaźni wodnej w temperaturze 37°C i w
momencie rozpuszczenia zawartości, przenosi się komórki do dużej objętości ogrzanej
pożywki, wiruje (1100 obr./min, 5 min) i odpłukuje toksyczne związki.
19
3. CEL ĆWICZENIA
Celem ćwiczenia jest stworzenie modelu in vitro odpowiedzi immunologicznej na
antygeny bakteryjne.
UWAGA: Założone hodowle i stymulacje jednojądrzastych komórek krwi obwodowej
posłużą za bazę do kolejnych ćwiczeń!
4. MATERIAŁY
4.1. MATERIAŁ BIOLOGICZNY
•
PBMC (peripheral blood mononuclear cells) -
jednojądrzaste komórki krwi
obwodowej
•
PBL (peripheral blood lymphocytes) – limfocyty krwi obwodowej:
limfocyty T, limfocyty B, komórki NK
• monocyty
4.2. STYMULANTY:
CpG ODN – oligodeoksynukleotyd syntetyzowany na wzorze genomu bakterii
Chlamydophila pneumoniae AR39 ( omp4/omp5 - geny, kodujące białka błony
zewnętrznej)
LPS – lipopolisacharyd (endotoksyna) – silny aktywator reakcji zapalnej, rozpoznawany
przez kompleks receptorów CD14/TLR2
GM-CSF – czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów, prozapalna
cytokina, wykorzystywany w generacji komórek dendrytycznych
TNF - czynnik martwicy nowotworu, najsilniejsza prozapalna cytokina, silny aktywator
apoptozy
20
4.3. SPRZĘT LABORATORYJNY, ODCZYNNIKI
•
Mieszanina Ficoll/ Uropolina
(gęstość 1,007 g/cm3)
•
bufor PBS, pozbawiony jonów
Mg2+ i Ca2+
• Jałowe szklane probówki
• Sterylne probówki typu eppendorf
• Sterylne tipsy
• Pipetki pasterowskie
• RPMI 1640 z dodatkiem 5%
płodowej
surowicy
bydlęcej
(FCS)
oraz
antybiotyków:
penicyliny
(10000U/ml),
streptomycyny (1mg/ml)
• Sterylne płytki hodowlane: 24dołkowa, 96-dołkowa
• Sterylna płytka Petriego
• Płyn Tűrka
• Kamera Fuchsa-Rosenthala
• Błękit trypanu
• Pipety automatyczne
• Probówki z antykoagulantem
•
• Strzykawki
SPRZĘT LABORATORYJNY:
komora laminarna, wirówka,
mikroskop świetlny, cieplarka
5. METODY.
5.1. Izolacja PBMC z krwi żylnej metodą wirowania w gradiencie gęstości
Ficoll/Uropolina
1. Pobrać 20 ml krwi żylnej do sterylnych probówek zawierających antykoagulant
(EDTA).
2. Krew rozcieńczyć buforem PBS, pozbawionym jonów Mg2+ i Ca2+ w stosunku
1:1 i nawarstwić
na ok. 2,5 ml mieszaniny Ficoll/Uropolina w szklanej
probówce.
3. Wirować 15 minut (2500 obr/min.) w celu rozdzielenia frakcji komórek.
4. Zebrać „obłoczek” limfocytów do nowej, sterylnej probówki.
5.
Zebrane komórki dwukrotnie przepłukać buforem PBS, pozbawionym jonów
Mg2+ i Ca2+, (wirowanie - 8 minut; 1500 obr/min.)
6. Komórki zawiesić w 1 ml pożywki hodowlanej RPMI 1640 z dodatkiem 5%
płodowej
surowicy
bydlęcej
(FCS)
oraz
antybiotyków:
penicyliny
(10000U/ml), streptomycyny (1mg/ml).
21
5.2. Liczenie komórek z wykorzystaniem kamery Fuchsa-Rosenthala
1. Przygotować kamerę Fuchsa-Rosenthala. Nałożyć szczelnie szkiełko nakrywkowe.
2. Z zawiesiny komórek w pożywce hodowlanej pobrać 10μl i dodać do 90μl płynu
Türka.
3. Po dwóch minutach inkubacji (czas potrzebny, aby doszło do lizy erytrocytów i
wybarwienia się błon żywych komórek) mieszaninę nałożyć na kamerę. Pobrać
17μl i delikatnie wpuścić ją od góry pod szkiełko nakrywkowe, uważając aby do
nie przesunąć.
4. Komórki zliczyć pod mikroskopem świetlnym w 8 kolejnych, kwadratowych
polach (trzykrotnie powtarzając pomiar).
5. Całkowitą ilość wyizolowanych komórek oszacować na podstawie wzoru:
A = 80 000 x B x C x D
A – całkowita ilość wyizolowanych PBMC
80 000 – współczynnik przeliczeniowy dla kamery FuchsaRosenthala, uwzględniający jej parametry budowy
B – średnia ilość komórek przypadająca na 1 pole
C – rozcieńczenie komórek po przygotowaniu mieszaniny z płynem
Türka ( C = 10 )
D – całkowita objętość zawiesiny komórek w medium hodowlanym
5.3. Ocena żywotności wyizolowanych komórek z wykorzystaniem błękitu trypanu
1. Z zawiesiny wyizolowanych komórek pobrać 10 μl i zmieszać z błękitem trypanu
(4mg/ml) w stosunku 1:1. Nałożyć na kamerę Fuchsa-Rosenthala.
2. Komórki ocenić pod mikroskopem świetlnym. Komórki o ciemnych, okrągłych
symetrycznych brzegach i jasnym środku uznaje się za żywe, a ciemno zabarwione,
o nierównych, postrzępionych brzegach za martwe.
22
3. Żywotność komórek przedstawić procentowo jako stosunek ilości żywych komórek
do całkowitej ilości zliczonych PBMC przemnożony przez 100.
4. UWAGA !!! Hodowlę można założyć, jeśli żywotność świeżo wyizolowanych
komórek wynosiła powyżej 80%.
5.4. Przygotowanie zawiesiny komórek w pożywce RPMI 1640 w stężeniu 1 mln
komórek na 1 ml pożywki
Wyizolowane komórki rozcieńczyć do stężenia 1 mln/ml odpowiednią ilością
pożywki hodowlanej RPMI 1640 z dodatkiem 5% płodowej surowicy bydlęcej (FCS)
oraz antybiotyków: penicyliny (10000U/ml), streptomycyny (1mg/ml).
5.5. Zakładanie hodowli komórek
a. Płytka 24-dołkowa – hodowle PBMC, PBL, monocytów do oznaczania
profilu cytokin, do generacji komórek dendrytycznych, analizy cyklu
komórkowego i apoptozy
1.
Aby otrzymać osobne populacje PBL i monocytów należy PBMC
inkubować min. 1 h na sterylnej szalce Petriego w cieplarce w odpowiednich
warunkach
2.
Świeżo wyizolowane PBMC metodą wirowania w gradiencie
gęstości mieszaniny Ficoll/Uropolina hodować na 24-dołkowej sterylnej płytce
w ilości 1 miliona komórek na 1 ml pożywki RPMI 1640 wzbogaconej 5% FCS
i antybiotykami P/S na dołek
23
Download
Random flashcards
123

2 Cards oauth2_google_0a87d737-559d-4799-9194-d76e8d2e5390

bvbzbx

2 Cards oauth2_google_e1804830-50f6-410f-8885-745c7a100970

Pomiary elektr

2 Cards m.duchnowski

słowka

2 Cards kksenia.kot1997

2-2=0

2 Cards jogaf85537

Create flashcards