Real Time PCR— sondy molekularne

Real
Time
molekularne
PCR—
sondy
W przeciwieństwie do barwników niespecyficznych (np. SYBR Green),
sondy molekularne pozwalają na wysoce precyzyjną i czułą detekcję
kwasów nukleinowych metodą PCR w czasie rzeczywistym. Najczęściej
stosowane są oligonukleotydy (sondy TaqMan, Molecular Beacons),
wykorzystujące zjawisko rezonansowego transferu energii pomiędzy
dwoma fluoroforami (FRET).
W metodzie FRET (Förster Resonance Energy Transfer) fluorochrom pierwszy
(zwany reporterem) w wyniku wzbudzenia falą świetlą o odpowiedniej długości,
przenosi energię na fluorochrom drugi (wygaszacz), który następnie emituje
kwant światła o innej długości lub powoduje wygaszenie emisji reportera.
Rodzaje sond
Pierwszymi i wciąż najbardziej popularnymi specyficznymi detektorami są sondy
TaqMan — krótkie oligonukleotydy, wyznakowane dwoma fluorochromami:
reporterem na 3’ końcu (np. FAM, NED) oraz wygaszaczem na końcu 5’
(najczęściej TAMRA). Odległość, pomiędzy tymi cząsteczkami jest niewielka, przez
co nienaruszona sonda nie emituje fluorescencji (fluorofor 5’ końca powoduje
całkowite wygaszenie emisji reportera). Dopiero podczas etapu wydłużania (po
związaniu się sondy z sekwencja komplementarną) dochodzi do degradacji
oligonukleotydu przez polimerazę Taq, co powoduje rozdzielenie fluoroforów i
emisję światła o danej długości fali.
Dostępne są również modyfikacje sondy TaqMan — zamiast fluoroforu na 3’ może
być użyty niefluorescencyjny wygaszacz, którym jest cząsteczka wiążąca mniejszą
bruzdę w DNA (tzw. NFQ-MGB, nonfluorescent quencher-minor groove binder).
Wygaszacz taki nie emituje światła, co w praktyce oznacza niższe tło oraz bardziej
precyzyjny pomiar. Podwyższa on również temperaturę topnienia sondy bez
konieczności jej wydłużania, co zwiększa specyficzność reakcji. Ponadto krótkie
sondy znajdują wykorzystanie m.in. w genotypowaniu polimorfizmu pojedynczych
nukleotydów (SNP, single nucleotide polymorphism).
Innym rodzajem sond molekularnych są oligonukleotydy typu Molecular
Beacons. Sonda taka posiada komplementarne do siebie końce 3’ i 5’
(wyznakowane dwoma fluoroforami), przez co przy braku sekwencji wiążącej
(targetu) tworzy strukturę pnia i pętli (czyli tzw. spinki do włosów) i nie emituje
światła. Natomiast, gdy sonda ulega związaniu do regionu docelowego (pętla jest
do niego komplementarna) dochodzi do zmiany konformacyjnej (linearyzacji
sondy) i emisji fluorescencji przez cząsteczkę reportera. Wygaszaczem
fluorescencji w sondach tego typu najczęściej jest cząsteczka nie będąca
fluoroforem (np. DABCYL).
Producenci odczynników do real time PCR oferują nam także inne rozwiązania.
Amplifluor Primers to połączenie sondy i startera w jednym oligonukleotydzie —
koniec 3’ jest komplementarny do sekwencji docelowej, natomiast na 5’ końcu
znajduje się fluorescencyjny znacznik. Scorpion Primers z kolei, to również
połączenie sondy ze starterem, lecz w takim oligonukleotydzie kowalencyjnie
przyłączona sonda wyznakowana jest dwoma fluoroforami. W obu powyższych
przypadkach, emisja fluorescencji zachodzi po związaniu z DNA (lub RNA jeśli
reakcją jest reverse transcription real time PCR).
Nieco innym rozwiązaniem jest stosowanie znaczników typu Plexor Primers — w
tej metodzie wykorzystywane są dwa zmodyfikowane startery (posiadające reszty
izoguanozyny oraz izocytozyny), których nietypowe nukleotydy mogą tworzyć
wiązania wodorowe jedynie same ze sobą. Startery takie są również odpowiednio
wyznakowane – jeden z nich (z nukleotydami izo-dC) zawiera na 5’ końcu
fluorofor, natomiast drugi (posiadający nukleotydy izo-dG) połączony jest z
niefluorescencyjnym wygaszaczem. Połączenie się obu starterów podczas reakcji
powoduje wygaszenie wcześniej emitowanej fluorescencji.
Projektowanie specyficznych starterów
Podobnie, jak w przypadku detekcji niespecyficznej odpowiednie zaprojektowanie
oligonukleotydów jest kluczowym etapem w wykorzystaniu techniki real time
PCR. Warto pamiętać o kilku następujących zasadach:
* długość amplikonu (dla optymalnej amplifikacji) powinna wynosić od 50 do 150
pz;
* optymalna długość starterów to około 20 pz, a ich sekwencje nie mogą powielać
się z sekwencją sondy;
* optymalna Tm starterów to 58 – 60°C;
* zawartość GC starterów oraz sondy powinna wynosić od 30-80%;
* koniec 3′ starterów nie może być bogaty w nukleotydy G lub C (nie więcej niż 5);
* długość sondy powinna wynosić od 13 do 25 pz;
* optymalna Tm sondy to 68 – 70°C;
* ostatnim nukleotydem od końca 5’ sondy nie może być G (reszta ta będzie
wygaszać reporter nawet po odcięciu sondy przez polimerazę!)
* powtarzających się nukleotydów (w szczególności reszt G);
* następujących po sobie reszt A;
* dinukleotydów CC (szczególnie w środku sekwencji sondy, gdyż będzie to
redukowało sygnał) .
Trudny wybór? Oto podsumowanie
AM
Data publikacji: 22.05.2016r.