Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 1, str. 63–73 PRACA ORYGINALNA – Original Article DARIUSZ WOŁOWIEC, GRZEGORZ GANCZARSKI, BOŻENA JAŹWIEC, STANISŁAW POTOCZEK, DONATA URBANIAK-KUJDA, JAROSŁAW DYBKO, KAZIMIERZ KULICZKOWSKI Ekspresja B-LyS oraz apoptoza komórek przewlekłej białaczki limfocytowej B-komórkowej indukowana inhibitorem kinazy fosfatydyloinozytolu-3 (LY294002) B-LyS expression and phosphatidylinositol-3 kinase inhibitor LY294002-induced apoptosis in B-cell chronic lymphocytic leukemia cells Z Katedry i Kliniki Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku AM we Wrocławiu Kierownik: Prof. dr hab. Kazimierz Kuliczkowski STRESZCZENIE Kluczową rolę w zahamowaniu apoptozy komórek przewlekłej białaczki B-komórkowej (BPBL) przypisuje się kaskadzie kinazy fosfatydyloinozytolu 3 (PI3K). Jej konstytutywną aktywację, prowadzącą m.in. do inaktywacji białek proapoptotycznych, obserwuje się limfocytach BPBL, zaś zahamowanie jej aktywności powoduje apoptozę tych komórek. Pomimo udowodnionego udziału kaskady PI3K w przeżyciu limfocytów B-PBL, nie opublikowano dotychczas prac nad wpływem aktywacji tej kinazy na obraz kliniczny choroby. Nie jest też jasne znaczenie ekspresji czynnika stymulującego limfocyty B (B-lymphocyte stimulator, B-LyS) obserwowanej przez niektórych autorów na limfocytach B-PBL. Celem niniejszych badań była ocena ekspresji powierzchniowej B-LyS oraz indukowanej przez inhibitor PI3K (LY294002) apoptozy limfocytów krwi obwodowej uzyskanych od 81 uprzednio nie leczonych chorych na B-PBL w różnych stadiach zaawansowania klinicznego. Apoptozę indukowaną przez LY294002 oceniano obliczając różnicę pomiędzy określonym cytofluorometrycznie odsetkiem komórek barwiących się aneksyną V po 24-godzinnej hodowli w obecności tego czynnika oraz po 24-godzinnej hodowli bez LY294002 (różnica pomiędzy apoptozą zachodzącą w obecności LY294002 oraz apoptozą spontaniczną). Apoptozę indukowaną przez LY294002 określono również w limfocytach krwi obwodowej 13 zdrowych osób w porównywalnym wieku (grupa porównawcza). Podczas czasu obserwacji trwającego średnio 19,6 mies. u 30 pacjentów doszło do progresji choroby wymagającej rozpoczęcia leczenia cytostatycznego. Apoptoza indukowana LY294002 była istotnie wyższa zarówno w limfocytach B-PBL w porównaniu z limfocytami T osób zdrowych (20,4% ± 12,5 vs 1,9% ± 1,6), jak również u pacjentów wykazujących progresję białaczki w porównaniu z chorymi nie wymagającymi leczenia (27,7% ± 11,8 vs 16,1% ± 11,0), oraz u chorych wykazujących ekspresję antygenu CD38 lub ZAP-70 na co najmniej 20% limfocytów (CD38+, ZAP-70+) w stosunku do pacjentów odpowiednio CD38- i ZAP-70- (29,3% ± 15,4 vs 17,1% ± 11,6 dla CD38 i 26,0 ± 13,5 vs 15,9 ± 11,7 dla ZAP-70). Nie wykazano związku pomiędzy apoptozą indukowa- 64 D. WOŁOWIEC i wsp. ną LY294002 a stadium klinicznym Rai ani liczbą limfocytów krwi obwodowej. Na limfocytach żadnego z badanych pacjentów nie wykazano ekspresji B-LyS. Powyższe obserwacje wskazują na możliwość udziału szlaku PI3K w dynamice klinicznej B-PBL, oraz sugerują celowość badań nad związkiem pomiędzy aktywnością tego szlaku antyapoptotycznego w komórkach B-PBL a ekspresją na ich powierzchni antygenu CD38 i ZAP-70. SŁOWA KLUCZOWE: Przewlekła białaczka limfocytowa – Apoptoza – B-LyS – Kinaza fosfatydyloinozytolu-3 SUMMARY Constitutive activation of phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) is thought to play a crucial role in the down-regulation of apoptosis of B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) cells. The activity of PI3K leads to the inactivation of several proapoptotic proteins and the inhibition of this kinase results in the cell death. Despite a well documented role played by PI3K cascade for the survival of B-CLL lymphocytes, it is unclear to what extent its activation influences the clinical picture of the disease. It is also unknown what is the biological and clinical significance of the expression of B-LyS (B-lymphocyte stimulator) stated by some investigators on B-CLL cells. We therefore undertook a study on the surface B-LyS expression and phosphatidylinositol-3 kinase inhibitor LY294002-induced apoptosis of leukemia cells of 81 previously untreated patients with B-CLL. LY294002-induced apoptosis was calculated using a flow cytometry method as a difference between the percentage of annexin V- staining cells after 24-hours culture in the medium containing LY294002 (LY294002-enhanced apoptosis) and in the medium without this factor (spontaneous apoptosis). LY294002-induced apoptosis was also calculated for peripheral blood T lymphocytes obtained from 13 healthy subjects. During the follow-up period of an average 19.6 months the cytostatic treatment had to be started in 30 patients. LY294002-induced apoptosis was significantly higher in B-CLL cells than in normal lymphocytes (20.4% ± 12.5 vs 1.9% ± 1.6). LY294002-induced apoptosis was also significantly higher in B-CLL patients with progressive disease as compared to patients who did not need treatment (27.7% ± 11.8 vs 16.1% ± 11.0), as well as in patients CD38- or ZAP-70-positive (i.e. with CD38 or ZAP-70 expression on > 20% leukemic lymphocytes) than in patients CD38- and ZAP-70-negative (respective number being: 29.3% ± 15.4 vs 17.1% ± 11.6 for CD38 and 26.0 ± 13.5 vs 15.9 ± 11.7 for ZAP-70). We did not find any relationship between LY294002-induced apoptosis and clinical stage according to Rai classification nor peripheral blood lymphocytosis. Surface B-LyS expression was detected in none of the B-CLL lymphocyte populations studied. Our findings suggest a possibility of the involvement of PI3K cascade in the clinical progression of B-CLL patients, and point out to the necessity of further studies on a possible relationship between the PI3K signaling pathway and CD38 as well as ZAP-70 expression in B-CLL cells. KEY WORDS: Chronic lymphocytic leukemia – Apoptosis – B-LyS – phosphatidylinositol-3 kinase WSTĘP Do najważniejszych zjawisk patogenetycznych leżących u podstaw akumulacji limfocytów CD5+/CD19+ w przewlekłej białaczce limfocytowej B-komórkowej (BPBL) należy stwierdzane in vivo zahamowanie ich zaprogramowanej śmierci (apoptozy). W warunkach in vitro natomiast limfocyty B-PBL utrzymywane w krótkoterminowej hodowli ulegają apoptozie spontanicznej. Na zahamowanie apoptozy limfocytów CD5+/CD19+ krążących we krwi pacjentów chorych na B-PBL mają wpływ tak czynniki mikrośrodowiska, np. cytokiny (IL-4, IL-8, IFN gamma), jak również zjawiska wewnątrzkomórkowe. Szczególnie dobrze poznana jest tu rola białka Bcl-2, którego nadekspresja, stwierdzana w komórkach B-PBL, chroni je przed apoptozą. Udo- Ekspresja B-LyS oraz apoptoza B-PBL 65 wodnione jest też znaczenie czynnika jądrowego κB (nuclear factor NF- κB,), ulegającego konstytucyjnej aktywacji w limfocytach B-PBL (1,2). Kluczową rolę w przeżyciu limfocytów B-PBL przypisuje się kinazie fosfatydyloinozytolu-3 (PI3K). Wykazano, że w tych komórkach dochodzi do konstytucyjnej aktywacji PI3K i zależnej od niej kinazy białkowej Cδ (PKCδ). PI3K z kolei aktywuje kinazę serynowo-treoninową Akt/PKB, wpływającą na przeżycie różnorodnych komórek i ulegającą nadekspresji w nowotworach różnego pochodzenia, jak rak trzustki, jajnika czy piersi (3, 4, 5). Niedawno stwierdzono też, że na apoptozę limfocytów B-PBL może mieć wpływ czynnik zwany stymulatorem limfocytów B (B-lymphocyte stimulator, B-LyS). Należy on do nadrodziny czynnika martwicy guza (TNF), jest białkiem błonowym typu II i odgrywa kluczową rolę w przeżyciu limfocytów B. W szczególności stwierdzono, że limfocyty B myszy transgenicznych B-LyS wykazują podwyższony poziom białka Bcl-2 i wydłużony czas przeżycia. B-Lys wydłuża też przeżycie limfocytów B spoczynkowych i aktywowanych oraz we współpracy z CD40L hamuje apoptozę. Czynnik ten ponadto ma zdolność aktywacji NF- κB w komórkach limfoidalnych B (6,7). Stało się to przesłanką do podjęcia badań nad możliwą rolą tego czynnika w zahamowaniu apoptozy limfocytów B-PBL. Ponadto, ostatnio wykazano, że u niektórych chorych na B-PBL komórki CD5+/CD19+, w odróżnieniu od prawidłowych limfocytów B spoczynkowych i aktywowanych, wykazują ekspresję B-LyS, jak również wykazującego znaczną z nim homologię białka APRIL (a proliferation-inducing ligand, ligand indukujący proliferację). Na rolę B-LyS w patogenezie B-PBL może wskazywać obserwacja że egzogenny B-LyS i APRIL chroni białaczkowe limfocyty CD5+/CD19+ przed apoptozą, natomiast inkubacja ich z przeciwciałem wiążącym B-LyS i APRIL indukuje śmierć tych komórek (8, 9). Ekspresja B-LyS i jego receptora została też wykazana na komórkach innych chłoniaków B-komórkowych (10, 11, 12) Powyższe obserwacje sugerują udział B-LyS, stwierdzany w limfocytach białaczkowych niektórych pacjentów chorych na B-PBL, w przedłużeniu życia tych komórek. Pomimo zasygnalizowanego wyżej związku B-LyS z ekspresją Bcl-2 i aktywacją NF- κB, nie jest również jasny antyapoptotyczny mechanizm działania tego czynnika oraz jego ewentualny związek z innymi wewnątrzkomórkowymi szlakami prowadzącymi do zaprogramowanej śmierci komórki, w szczególności szlakiem PI3K. Nie ustalono też związku pomiędzy aktywnością omówionych wyżej szlaków chroniącymi komórki B-PBL przed apoptozą: PI3K oraz B-LyS, a obrazem klinicznym choroby oraz jej dynamiką. Dlatego też za cel niniejszych badań postawiono zbadanie ekspresji B-LyS na limfocytach krwi obwodowej pacjentów chorych na B-PBL oraz wpływ inhibitora PI3K, LY294002, na spontaniczną apoptozę limfocytów białaczkowych in vitro w warunkach krótkoterminowej hodowli, jak również związek tych zjawisk z obrazem klinicznym choroby. MATERIAŁ I METODY Badaniem objęto 81 uprzednio nie leczonych chorych na B-PBL (34 kobiety, 47 mężczyzn) w wieku 48–90 lat (śr. 66,8 ± 10,72). Rozpoznanie choroby ustalono na 66 D. WOŁOWIEC i wsp. podstawie ogólnie przyjętych kryteriów przyjmując jako dolną wartość graniczną liczby limfocytów krwi obwodowej o fenotypie CD5+/CD19+/CD23+ 5,0 G/l. Poziom hemoglobiny wynosił 6,2 – 16,5 g% (śr. 13,4 ± 2,1), liczba leukocytów 10,86 – 125,0 G/l (śr. 32,5 ± 21,8), limfocytów 7,2 – 95,0 G/l (śr. 26,8 ± 19,0), płytek krwi natomiast 21,0 – 329,0 G/l (śr. 176,1 ± 65,2). Dwudziestu siedmiu pacjentów było w stadium zaawansowania klinicznego 0 wg Rai, 27 – I, 16 – II, 6 – III i pięciu pozostałych w IV. Podczas obserwacji wynoszącej od 6 do 36 miesięcy (śr. 19,6 ± 7,3) u 23 pacjentów rozpoczęto leczenie cytostatyczne. Wskazania do niego ustalono zgodnie z rekomendacjami National Cancer Institute (13). Grupę porównawczą stanowiło 13 populacji prawidłowych limfocytów T uzyskanych z krwi obwodowej zdrowych osób w porównywalnym wieku. Badania przeprowadzono na limfocytach krwi obwodowej uzyskanych od chorych w celu przeprowadzenia rutynowych badań diagnostycznych. Komórki jednojądrowe (MNC) izolowano z krwi obwodowej w gradiencie gęstości z użyciem Gradisolu L (Aqua-Medica, Łódź). Oprócz analizy typowego zestawu markerów powierzchniowych (CD5, CD19, CD23), w komórkach CD19+, u 50 pacjentów określano cytofluorometrycznie ekspresję antygenu powierzchniowego CD38 za pomocą przeciwciała anty-CD38 sprzężonego z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (DakoCytomation), a u 23 pacjentów ekspresję powierzchniową B-LyS (BAFF) za pomocą przeciwciała anty-B-LyS sprzężonego z fikoerytryną (PE) (eBioscience). Kontrolą pozytywną dla oznaczenia ekspresji B-LyS była linia komórkowa U-937, ludzkich komórek wyprowadzonych z chłoniaka histiocytowego o właściwościach i fenotypie monocytoidalnym; komórki linii HL60 (ludzkie mieloblasty) i Jurkat (limfoblasty T) nie wykazywały ekspresji B-LyS. U 52 pacjentów oznaczono ponadto cytoplazmatyczną ekspresję białka ZAP-70. W tym celu 0,5–0,75×106 MNC inkubowano w objętości 50 µl z przeciwciałem anty CD19-PE, utrwalano przez 15 min w roztworze A odczynnika do permeabilizacji IntraStain (Dako-Cytomation), płukano i permeabilizowano przez 15 min w odczynniku B zestawu IntraStain w obecności przeciwciała monoklonalnego anty-ZAP-70 skoniugowanego z izotiocjanianem fluoresceiny (mysie IgG2b, klon SB70, Dako-Cytomation) lub izotypowo zgodnego przeciwciała kontrolnego. Komórki ponownie płukano i ekspresję ZAP-70 analizowano na limfocytach CD19-pozytywnych. Badanie apoptozy spontanicznej i indukowanej LY294002 MNCs uzyskane od badanych pacjentów i osób zdrowych poddawano 24godzinnej hodowli w ilości 1x106 komórek na hodowlę w dwóch probówkach zawierających podłoże hodowlane RPMI 1640 (Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej, Wrocław) z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej (Invitrogen) oraz 100 µg/ml gentamycyny). Do jednej z probówek dodawano inhibitor fosfatazy fosfatydyloinozytolu LY294002 (Calbiochem) rozpuszczony w dwumetylosulfotlenku (DMSO, Sigma) (stężenie końcowe LY294002 w hodowli: 10 µM), do drugiej natomiast 10 µl DMSO. Po zakończeniu hodowli komórki znakowano anneksyną V sprzężoną z FITC oraz jodkiem propidyny w buforze bogatym w jony wapnia (Becton Dickinson Phar- Ekspresja B-LyS oraz apoptoza B-PBL 67 mingen) oraz analizowano cytofluorometrycznie, określając odsetek komórek ulegających apoptozie jako sumę odsetka komórek barwiących się anneksyną (apoptoza wczesna) lub anneksyną oraz jodkiem propidyny (apoptoza późna). Apoptozę indukowaną LY294002 obliczano jako różnicę pomiędzy odsetkiem komórek ulegających apoptozie w hodowli zawierającej LY294002 oraz komórek ulegających apoptozie spontanicznej (t.j. w podłożu zawierającym środowisko hodowlane oraz DMSO). Analizę cytofluorometryczną wykonywano w cytometrze przepływowym PAS (Partec, Niemcy) wyposażonym w laser argonowy o mocy 20 mW i program do akwizycji/analizy danych FloMax 2,4b. Każdorazowo analizie poddawano 15000 komórek. METODY STATYSTYCZNE Rozkład danej cechy w badanych populacjach porównywano za pomocą testów nieparametrycznych: Manna-Whitney`a i χ2, natomiast związek pomiędzy dwiema zmiennymi ilościowymi oceniano za pomocą współczynnika korelacji r Pearsona. WYNIKI Ekspresja CD38, ZAP-70 i B-Lys na limfocytach B-PBL. U jedenastu spośród 50 pacjentów (22%) wykazano dodatnią ekspresję CD38 na limfocytach białaczkowych, przy czym za dodatnią ekspresję CD38 w badanej populacji komórkowej uznano obecność tego antygenu na co najmniej 20% komórek (14, 15); pozostałych 39 zaś zostało uznanych jako CD38-. Dodatnią ekspresję ZAP-70, również rozumianą jako obecność tego białka w > 20% komórek, wykazano natomiast u 21 spośród 52 chorych (40,4%), a u 39 pozostałych uznano, że ekspresja ZAP-70 jest nieobecna. Spośród 50 pacjentów, u których oznaczono jednocześnie CD38 i ZAP-70, u 34 (68%) wykazano zgodność ekspresji obu tych antygenów (27 osób CD38-/ZAP70– i 7 CD38+/ZAP-70+, Tabela 1). Związek pomiędzy występowaniem antygenu CD38 i ZAP-70 był na granicy istotności statystycznej (p= 0,05). U żadnego z badanych pacjentów nie wykazano ekspresji powierzchniowej białka B-LyS. Wskazania do rozpoczęcia leczenia cytostatycznego ustalono u 9 spośród 39 pacjentów CD38- (23,1%) i u 5 spośród 11 pacjentów CD38+ (45,5%). Różnica ta nie była statystycznie znamienna. Leczenia wymagało 10 spośród 21 pacjentów (47,6%) wykazujących ekspresję ZAP-70 i jedynie 5 spośród 31 (16,1%), u których nie ujawniono obecności tego antygenu; różnica ta była istotna statystycznie (p<0,05) . Apoptoza spontaniczna i indukowana limfocytów kontrolnych oraz limfocytów B-PBL Odsetek limfocytów B-PBL wykazujących cechy apoptozy spontanicznej po 24-godzinnej hodowli wynosił 1,5 – 42,9% (śr. 10,8 ± 8,7) i był istotnie wyższy niż w grupie kontrolnych populacji limfocytów T (2,1 – 33,4%, śr. 6,7 ± 8,4, p=0,004). 68 D. WOŁOWIEC i wsp. Ekspresja B-LyS oraz apoptoza B-PBL 69 Apoptoza indukowana LY294002 w grupie badanej wynosiła 1,6 – 54,4% (śr. 20,4 ± 12,5) i również była istotnie wyższa niż w populacjach porównawczych (0 – 5,1%, śr. 1,9 ± 1,6, p < 10-6). Nie wykazano zależności pomiędzy apoptozą spontaniczną ani indukowaną, a podstawowymi parametrami klinicznymi i hematologicznymi pacjentów (wiek, płeć, stadium zaawansowania klinicznego wg Rai, liczba limfocytów i płytek krwi oraz poziom hemoglobiny). Zarówno apoptoza spontaniczna, jak i indukowana była znamiennie wyższa w grupie pacjentów, u których podczas obserwacji rozpoczęto leczenie w stosunku do chorych nie wymagających chemioterapii. Odsetek limfocytów białaczkowych ulegających apoptozie był też istotnie wyższy u chorych CD38+ w stosunku do CD38– oraz u chorych ZAP-70+ w porównaniu z pacjentami ZAP-70–. Nie wykazano natomiast znamiennych statystycznie różnic we wskaźniku apoptozy spontanicznej w zależności od ekspresji CD38 ani ZAP-70 (Tabela 2). Tabela 1. Współzależność ekspresji CD38 i ZAP-70 w komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej B-komórkowej. W polach tabeli podano liczebności grup pacjentów. Za dodatnią ekspresję uznano obecność danego antygenu w co najmniej 20% komórek. χ2 = 3,87, p = 0,05 Table 1. Relationship between CD38 and ZAP-70 expression in Bcell chronic lymphocytic leukemia cells. Figures in the fields of the table represent the number of patients. The positivity was defined as the presence of the antigen in more than 20% cells. χ2 = 3,87, p = 0,05 - ZAP-70 ZAP-70+ Ogółem CD3827 12 39 CD38+ 4 7 11 ogółem 31 19 50 DYSKUSJA Za jeden z najważniejszych elementów patogenezy B-PBL, prowadzących do akumulacji długo żyjących limfocytów w szpiku kostnym, krwi obwodowej, narządach limfatycznych i innych narządach wewnętrznych, uważa się zahamowanie apoptozy komórek białaczkowych. Zahamowanie to jest wynikiem nie tylko zaburzeń wewnątrzkomórkowych szlaków przekazywania sygnałów, co prowadzi do akumulacji czynników hamujących śmierć komórki bądź unieczynnienia białek uczestniczących w procesie apoptozy, ale też oddziaływania czynników pozakomórkowych: wpływu cytokin i interakcji z komórkami mikrośrodowiska, jak komórki dendrytyczne, komórki podścieliska czy komórki typu pielęgniarek (nurse-like cells) (2). Rola tych właśnie czynników środowiska w przeżyciu limfocytów B-PBL tłumaczy pozorną sprzeczność pomiędzy zahamowaniem ich apoptozy in vivo i szybkim obumieraniem w hodowli in vitro. Ta rozbieżność stanowi również trudność w ocenie wpływu czasu przeżycia limfocytów B-PBL na kształtowanie się obrazu klinicznego tej choroby. Nieliczne poświęcone temu publikacje donosiły o przedłużonym czasie przeżycia in vitro limfo- 70 D. WOŁOWIEC i wsp. cytów uzyskanych od chorych na B-PBL z bardziej agresywną postacią schorzenia (16, 17), jednak nie jest jasne czy limfocyty tych chorych wykazują też większe zahamowanie apoptozy in vivo. Dlatego też celem niniejszych badań była ocena związku pomiędzy apoptozą limfocytów B-PBL indukowaną przez inhibitor PI3K, LY294002, oraz ekspresją powierzchniową cząsteczki B-LyS, a obrazem klinicznym choroby. Konstytutywna aktywacja PI3K uważana jest obecnie za jeden z kluczowych mechanizmów wewnątrzkomórkowych warunkujących przeżycie limfocytów B-PBL, dlatego też apoptoza zachodząca pod wpływem jej inhibitora może być traktowana jako pośredni wskaźnik aktywności szlaku PI3K in vivo. Aktywacja PI3K prowadzi do zwiększonej ekspresji genów kodujących białka antyapoptotyczne takie jak białka z rodzin Bcl-2 i IAP (inhibitors of apoptosis) oraz do unieczynnienia kaspaz 3 i 8 (3,4,5,18). Proces ten zachodzi za pośrednictwem kinazy białkowej Akt lub w drodze zależnej od kinazy białkowej C δ (PKCδ), co prowadzi do aktywacji za pośrednictwem czynnika jądrowego NF-κB. Pomimo licznych badań nad rolą szlaku przewodzenia sygnałów inicjowanego przez PI3K w przeżyciu komórek B-PBL, nie ustalono dotychczas w jakim stopniu aktywność PI3K wpływa na akumulację limfocytów białaczkowych in vivo oraz na dynamikę choroby. W przedstawionych wyżej badaniach wykazano, że obecność LY294002 w krótkoterminowej hodowli limfocytów B-PBL zwiększa odsetek komórek apoptotycznych w stosunku do obserwowanego w hodowli bez tego czynnika, co może pośrednio świadczyć o aktywności PI3K w badanych populacjach komórek białaczkowych. Nie stwierdziliśmy związku pomiędzy apoptozą zależną od LY294002 a stadium klinicznym wg Rai ani limfocytozą krwi obwodowej. Wykazaliśmy natomiast, że apoptoza zależna od LY294002 była istotnie wyższa u chorych, u których doszło do progresji choroby lub rozwoju takich jej objawów, które stanowiły wskazanie do rozpoczęcia leczenia. Ta obserwacja nasuwa przypuszczenie, że wyższa aktywność PI3K w limfocytach B-PBL jest związana z większą dynamiką choroby. Hipoteza ta wymaga jednak potwierdzenia badaniami bezpośrednio oceniającymi aktywność tej kinazy w komórkach poddanych działaniu jej inhibitora. Zwraca też uwagę fakt, że u tych pacjentów wyższa była też apoptoza spontaniczna, co jednak nie upoważnia do wnioskowania na temat czasu przeżycia komórek białaczkowych w warunkach in vivo. Interesujące wydaje się także spostrzeżenie, że wskaźnik apoptozy indukowanej był istotnie wyższy u pacjentów CD38+ oraz u chorych ZAP-70+ w porównaniu z odpowiednimi grupami chorych nie wykazujących ekspresji tych antygenów, podczas gdy apoptoza spontaniczna nie wykazywała związku z ekspresją badanych antygenów. Zarówno ekspresja CD38 jak i ZAP-70 na limfocytach B-PBL są uważane za niekorzystne czynniki rokownicze (14,15,19,20). Nie można więc wykluczyć, że wyższa podatność limfocytów B-PBL na apoptozę indukowaną inhibitorem PI3K u chorych z wymagających leczenia w stosunku co pacjentów z chorobą stabilną, może mieć związek z wyższym (choć w przypadku CD38 statystycznie niezamiennie) odsetkiem chorych wykazujących ekspresję tych antygenów wśród pacjentów leczonych w stosunku do grupy nie wymagającej chemioterapii. Wskazuje to na celowość badań nad związkiem pomiędzy ekspresją CD38 i ZAP-70, a aktywnością wewnątrzkomórkowego szlaku PI3K Ekspresja B-LyS oraz apoptoza B-PBL 71 hamującego obumieranie limfocytów B-PBL. Na możliwość udziału CD38 w hamowaniu apoptozy wskazują obserwacje, że połączenie tego antygenu z agonistycznym przeciwciałem monoklonalnym zapobiega apoptozie ludzkich komórek B centrów germinalnych migdałków (21) oraz, we współpracy z egzogenną interleukiną 2, także limfocytów B-PBL w długoterminowej hodowli (22). Istnieją również dane doświadczalne sugerujące udział ZAP-70 w przeżyciu limfocytów B-PBL. Stymulacja limfocytów B-PBL hodowanych razem z komórkami typu pielęgniarek (nurse-like cells) przez SDF1-α (stromal-derived factor, czynnik przeżycia produkowany przez komórki stomalne) przedłuża przeżycie jedynie komórek białaczkowych wykazujących ekspresję ZAP-70, nie zaś limfocytów ZAP-70- (23). Nie wiadomo natomiast, czy CD38 i ZAP70 biorą udział w szlakach przewodzenia sygnałów angażujących PI3K, na co mogłyby wskazywać nasze obserwacje o wyższej zachodzącej pod działaniem inhibitora tego enzymu apoptozie limfocytów białaczkowych CD38+ lub ZAP-70+. W ostatnich latach zwraca się uwagę na rolę, jaką w regulacji przeżycia limfocytów B-PBL odgrywają cząsteczki z nadrodziny TNF: B-LyS, zwany też BAFF, oraz APRIL, oraz ich receptory: BCMA (B-cell maturation antygen), TACI (transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand-interactor) i BAFF-R. Ekspresję B-LyS stwierdza się fizjologicznie na powierzchni monocytów, makrofagów i komórek dendrytycznych, a uczestniczy on w regulacji dojrzewania i proliferacji limfocytów B (6). Stwierdzono, że B-LyS i APRIL wykazują w stosunku do limfocytów B-PBL działanie ochronne przeciw apoptozie spontanicznej i indukowanej lekami, a wykrycie ich transkryptu oraz jego produktu – białka błonowego na komórkach białaczkowych pozwoliło na sformułowanie hipotezy o autokrynnej drodze oddziaływania pomiędzy tymi cząsteczkami a ich receptorami (8, 9). Dotychczas opublikowane badania nad ekspresją błonową B-LyS na limfocytach B-PBL nie dały jednak jednoznacznych wyników. Novak i wsp. badając 11 chorych wykryli mRNA oraz niską ekspresję jego produktu białkowego u 11 spośród 23 chorych (8). Kern i wsp. z kolei wykazali cytofluorometrycznie obecność tego białka na 14–71% limfocytów w analizowanych 15 populacjach komórek B-PBL (9). Słabą ekspresję powierzchniową B-LyS na komórkach nowotworowych trzech spośród 4 analizowanych chorych na BPBL/chłoniaka z małych limfocytów wykazali He i wsp. (12). Briones i wsp. (10) oraz Novak i wsp. (11) natomiast nie uwidocznili tego białka na powierzchni analizowanych komórek B-PBL lub B-PBL/chłoniaka z małych limfocytów, pomimo wykrycia w nich obecności odpowiedniego mRNA. W naszych badaniach nie wykazaliśmy ekspresji B-LyS u żadnego spośród analizowanych pacjentów pomimo uzyskania dodatniego barwienia przeciwciałem anty-BAFF populacji kontrolnej (linia komórkowa U-967). Być może jest to wynikiem zbyt małej gęstości powierzchniowej tego białka, poniżej progu wykrywalności przez zastosowaną przez nas metodę. Zagadnienie ekspresji B-LyS na limfocytach B-PBL, jego związku z aktywacją antyapoptotycznych wewnątrzkomórkowych szlaków sygnalizacyjnych oraz z obrazem klinicznym choroby wymaga więc dalszych badań z zastosowaniem odpowiednio czułych metod. Podsumowując, przedstawione badania wskazują, że populacje limfocytów B-PBL wykazują różną wrażliwość in vitro na proapoptotyczne działanie inhibitora PI3K 72 D. WOŁOWIEC i wsp. LY294002, przy czym wyższy wskaźnik apoptozy indukowanej tym czynnikiem występuje w populacjach wykazujących ekspresję CD38 lub ZAP-70 oraz u pacjentów z aktywną bądź progresywną chorobą. Obserwacja ta sugeruje istnienie związku pomiędzy aktywnością proapoptotycznego szlaku sygnalizacyjnego PI3K a obrazem klinicznym choroby oraz wskazuje na celowość dalszych badań nad rolą CD38 i ZAP-70 w regulacji przeżycia komórek B-PBL. PIŚMIENNICTWO 1. Podhorecka M. Proces apoptozy w patogenezie przewlekłej białaczki limfatycznej B-komórkowej. Postępy Hig. Med. Dośw. 2004; 58: 236–242. 2. Munk Pedersen I, Reed JC. Microenvironmental interactions and survival of CLL B-cells. Leukemia and Lymphoma, 2004; 45: 2365–2372. 3. Ringshausen I, Scheller F, Bogner C. et al. Constitutively activated phosphatidylinositol-3 kinase (PI-3K) is involved in the defect of apoptosis in B-CLL: association with protein kinase Cδ. Blood 2002; 110: 3741–3748. 4. Cuní S, Pérez-Aciego P, Pérez-Chacón G et al. A sustained activation of PI3K/NF-κB pathway is critical for the survival of chronic lymphocytic leukemia B-cells. Leukemia 2004; 18: 1391–1400. 5. Plate JMD. PI3-kinase regulates survival of chronic lymphocytic leukemia B-cells by preventing caspase 8 activation. Leukemia and Lymphoma 2004; 45: 1519–1529. 6. Moore PA, Belvedere O, Orr A i wsp. BLyS: member of the tumor necrosis factor family and B lymphocyte stimulator. Science 1999; 285: 260–263. 7. Ng LG, Mackay CR, Mackay F. The BAFF/APRIL system: life beyond B lymphocytes. Mol Immunol 2005; 42: 763–772. 8. Novak AJ, Bram RJ, Kay NE, Jelinek DF. Aberrant expression of B-lymphocyte stimulator by B chronic lymphocytic leukemia cells: a mechanism for survival. Blood 2002; 100: 2973–2979. 9. Kern C, Cornuel JF, Billard C. et al. Involvement of BAFF and APRIL in the resistance to apoptosis of B-CLL through an autocrine pathway. Blood 2004; 103: 679-688. 10. Briones J, Timmerman JM, Hilbert DM, Levy R. BLyS and BLyS receptor expression in nonHodgkin’s lymphoma. Exp. Hematol. 2002; 30: 135–141. 11. Novak AJ, Grote DM, Stenson M. et al. Expression of BLyS and its receptors in B-cell non Hodgkin lymphoma: correlation with disease activity and patients outcome. Blood 2004; 104: 2247–2253. 12. He B, Chadburn A, Jou E, Schattner EJ, Knowles DM, Cerutti A. Lymphoma B cells evade apoptosis through the TNF family members BAFF/BLyS and APRIL. J. Immunol. 2004; 172: 3268–3279. 13. Cheson BD, Bennett JM, Grever M et al. National Cancer Institute – sponsored working group guidelines for chronic lymphocytic leukemia: revised guidelines for diagnosis and treatment. Blood 1996; 87: 4990–4997. 14. Domingo-Domenech E., Domingo-Claros A., Gonzales-Barca E. et al. CD38 expression in Bchronic lymphocytic leukemia: association with clinical presentation and outcome in 155 patients. Haematologica 2002; 87: 1021–1027. 15. Ibrahim S, Keating M, Do KA et al. CD38 expression as an important prognostic factor in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 2001; 98: 181-186. 16. Vrhovac R, Delmer A, Tang R, Marie JP, Zittoun R, Ajchenbaum-Cymbalista F. Prognostic significance of the cell cycle inhibitor p27Kipl in chronic B-cell lymphocytic leukemia. Blood 1998; 12: 4694– 4700. 17. Aguilar-Santelises M, Rottenberg ME, Lewin N, Mellstedt H, Jondal M. Bcl-2, Bax and p53 expression in B-PBL in relation to in vitro survival and clinical progression. Int. J. Cancer 1996; 69: 114. Ekspresja B-LyS oraz apoptoza B-PBL 73 18. Barragan M, de Frias M, Iglesias-Serret D. et al. Regulation of Akt/PKB by phosphatidylinositol 3-kinase-dependent and –independent pathways in B-cell chronic lymphocytic leukemia cells: role of protein kinase C (beta). J. Leukoc. Biol. 2006; 80: 1473–1479. 19. Orchard JA, Ibbotson RE, Davis Z et al ZAP-70 expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Lancet 2004; 363: 105–111. 20. Rassenti LZ, Huynh L., Toy TL et al. ZAP-70 compared with immunoglobulin heavy-chain gene mutation status as a predictor of disease progression of chronic lymphocytic leukemia. N. Engl. J. Med. 2004; 351: 893–901. 21. Zupo S, Rugari E, Dono M, Taborelli G, Malavasi F, Ferrarini M. CD38 signaling by agonistic monoclonal antibody prevents apoptosis of human terminal center B cells. Eur J. Immunol. 1994; 24: 1218–1222. 22. Deaglio S., Capobianco A., Bergui L. et al. CD38 is a signaling molekule in B-cell chronic lymphocytic leukemia cells. Blood 2003; 102: 2146–2155. 23. Richardson SJ., Matthews C, Catherwood MA i wsp. ZAP-70 expression is associated with enhanced ability to respond to migratory and survival signals in B-cell chronic lymphocytic leukemia (BCLL). Blood 2006; 107: 3584–3592. Praca wpłynęła do Redakcji 1.02.2007 r. i została zakwalifikowana do druku 12.03.2007 r. Adres Autorów: Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku AM ul. Pasteura 4 50-367 Wrocław