Instrukcja do ćwiczeń - Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii

Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii
Wydział Farmaceutyczny z
Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Mikrobiologia ogólna
o
Biotechnologia medyczna II rok / I
Instrukcja do ćwiczeń
Temat: Woda jako środowisko życia mikroorganizmów. Analiza sanitarna wody – Cz.1/Cz.2/Cz.3
Wody powierzchniowe są drugim po glebie naturalnym środowiskiem bytowania mikroorganizmów. W
wodach dominują bakterie, ale również występują w nich grzyby i ich zarodniki, wirusy i bakteriofagi. Ścieki
komunalne, a także niektóre rodzaje ścieków przemysłowych, np. z rzeźni, garbarni, mleczarni wnoszą do
zbiorników wodnych poza mikroorganizmami saprofitycznymi wirusy i bakterie chorobotwórcze. Pochodzą one
przede wszystkim z odchodów ludzkich i zwierzęcych.
Najbardziej groźnymi chorobami wirusowymi są: choroba Heinego-Medina, zapalenie opon mózgowordzeniowych, zapalenie mięśnia sercowego u noworodków, zapalenie jelita grubego, zapalenie wątroby.
Najczęstszymi chorobami pochodzenia bakteryjnego, szerzącymi się przez zanieczyszczone wody są: tyfus i
paratyfus wywołany przez bakterie z rodzaju Salmonella, czerwonka wywołana przez pałeczki Shigella, gruźlica –
Mycobacterium tuberculosis i cholera – Vibrio cholerae.
Zakażenia te mogą się szerzyć drogą wodno-pokarmową, ale także przez bezpośredni kontakt z osobami
chorymi. Bakterie chorobotwórcze dostaja się do wody z wydalinami chorego. Przeżywalność tych bakterii w
wodzie i ściekach zależy głównie od rodzajów mikroorganizmów, a także od warunków fizycznych i chemicznych .
Waha się ona od kilku do kilkunastu dni, a przetrwalników nawet do kilkudziesięciu lat.
Zakres analizy bakteriologiczno – sanitarnej wody obejmuje następujące badania:
1. Oznaczanie ogólnej liczby mikroorganizmów zdolnych do wzrostu metodą posiewu na agarze
odżywczym wg. PN-EN ISO 6222: 2004
2. Oznaczanie liczby bakterii z grupy coli, bakterii z grupy coli typ fekalny i Escherichia coli
Ø metodą filtracji membranowej wg PN-EN ISO 9308-1: 2004
Ø metodą fermentacyjną probówkową wg. PN-75/C-04615/05: 1975
Ø metodą fermentacyjną probówkową wg. PN-77/C-04615/07: 1977
3. Oznaczanie liczby enterokoków kałowych
Ø metodą filtracji membranowej wg PN-EN ISO 7899-2: 2004
Ø metodą probówkową wg. PN-82/C-04615/25: 1982
4. Oznaczanie liczby Clostridium perfringens na podłożu m-CP metodą filtracji membranowej wg
Dyrektywy 98/83/WE z dn. 3.11.1998r i PN-ISO 8199: 2001
1
OZNACZANIE OGÓLNEJ LICZBY MIKROORGANIZMÓW ZDOLNYCH DO WZROSTU
METODĄ POSIEWU NA AGARZE ODŻYWCZYM wg. PN-EN ISO 6222:2004 (Jakość wody.
Oznaczanie ilościowe mikroorganizmów zdolnych do wzrostu. Określanie ogólnej liczby kolonii metodą
posiewu na agarze odżywczym).
Wykonać rozcieńczenia wody:
(płyn do rozcieńczeń - roztwór fizjologiczny z peptonem)
- woda pitna z sieci wodociągowej: bez rozcieńczeń
- woda ze studni: bez rozcieńczenia + 10-1
- woda powierzchniowa: rozcieńczenia od 10-1 do 10-5
- ścieki: rozcieńczenia od 10-1 do 10-8
Wykonać posiew wgłębny
(po 1 ml próbki wody przenieść na 2 płytki Petriego (dla każdej temperatury)
i zalać ostudzonym agarem odżywczym
-
Inkubacja:
temp. 36oC ± 2 oC przez 44 h ± 4 h
temp. 22oC ± 2 oC przez 68 h ± 4 h
5. Podawanie wyników
Przedstawić wyniki jako liczbę jednostek tworzących kolonie na ml (jtk/ml) próbki dla każdej temperatury. Jeśli
obserwuje się brak wzrostu kolonii na płytkach zaszczepionych określonymi objętościami nie rozcieńczonej
próbki, wynik przedstawić jako nie wykryto w 1 ml. Jeżeli na płytkach zaszczepionych najwyższymi
rozcieńczeniami jest ponad 300 kolonii, wynik przedstawić jako > 300 lub jedynie przybliżony.
Uwaga! Oznaczenie na agarze odżywczym bakterii psychrofilnych (22oC ± 2oC) świadczy o zanieczyszczeniu
wody substancjami organicznymi łatwo ulegającymi rozkładowi, natomiast bakterie mezofile (36 oC ± 2oC),
oznaczone na podłożu agarowym informują o zanieczyszczeniu wody fekaliami, a więc o możliwości zakażenia
wody bakteriami chorobotwórczymi.
2
OZNACZANIE LICZBY BAKTERII Z GRUPY COLI, BAKTERII Z GRUPY COLI TYP FEKALNY
I ESCHERICHIA COLI W WODZIE METODĄ FILTRACJI MEMBRANOWEJ wg PN-EN ISO
9308-1:2004 (Jakość wody. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli.
Część 1: Metoda filtracji membranowej)
BADANIA WSTĘPNE
przygotować określone objętości próbek wody
do przefiltrowania:
- woda uzdatniona, dezynfekowana: 100 ml
- woda uzdatniona, niedezynfekowana: 100 ml
- woda ze studni: 100 ml i 10 ml
- wody powierzchniowe: 10 ml i 1 ml
- wody silnie zanieczyszczone: 1 ml i 0,1 ml
Uwaga! W przypadku filtracji próbek wody o obj. 10 i 1 ml do aparatu filtracyjnego wlać dodatkowo 20 50 ml jałowego płynu Ringera - czterokrotnie rozc. i dokładnie wymieszać zawartość leja filtracyjnego
przefiltrować próbki wody
przez sterylny filtr membranowy (0,45 mm)
TEST STANDARDOWY
TEST SZYBKI
przenieść filtr membranowy na
podłoże agarowe z laktozą
(agar laktozowy TTC)
przenieść filtr membranowy na
podłoże agarowe z kazeiną
(agar TSA)
inkubacja
temp. 36oC±2oC przez 21±3 h
(można przedłużyć do 44±4 h )
inkubacja
temp. 36oC±2oC przez 4-5 h
przenieść filtr na
podłoże zaw. kazeinę (tryptyczny
wyciąg kazeinowy) i sole żółci
agar TBA
wynik dodatni
kolonie, które na podłożu
pod filtrem maja żółte zabarwienie
(bakterie kaktozo-dodatnie)
inkubacja
temp. 44oC±0,5oC przez 19-20 h
test na oksydazę
przenieść przynajmniej 3 kolonie
na agar TSA
inkubacja
temp. 36oC±2oC przez 21±2 h
test na indol
przenieść przynajmniej 3 kolonie
na bulion tryptofanowy
przenieść filtr i umieścić
na krążku bibułowym
nasączonym odczynnikiem
do testu na wyrywanie indolu
inkubacja
temp. 44 oC±0,5oC przez 21±3 h
wystawić na działanie
lampy UV przez 10-30 minut
wykonać test na oksydazę
cytochromową
dodać 0,2-0,3 ml odczynnika
Kovacsa
wynik dodatni
wszystkie czerwone kolonie
policzyć jako E. coli
wynik dodatni
czerwony pierścień
Uwaga!
W przypadku oznaczania liczby bakterii z grupy coli typ fekalny należy kolonie oksydazo-ujemne przesiać na podłoże Endo i
przeprowadzić inkubację w temperaturze 44oC±1oC przez 24±2 h. Jako wynik dodatni należy uznać wzrost w postaci
ciemnoczerwonych kolonii charakteryzujących się często zielonozłotych metalicznym połyskiem.
5. Podawanie wyników
Wynik końcowy podać zgodnie z normą PN-EN ISO 9308-1:2004 (Jakość wody. Wykrywanie i oznaczanie
ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli. Część 1: Metoda filtracji membranowej) jako liczbę bakterii z
grupy coli lub bakterii z grupy coli typ fekalny lub Escherichia coli w 100 ml próbki wody.
3
OZNACZANIE LICZBY BAKTERII Z GRUPY COLI W WODZIE METODĄ FERMENTACYJNĄ
PROBÓWKOWĄ wg. PN-75/C-04615/05:1975 (Woda i ścieki. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie
bakterii grupy coli metodą fermentacyjną probówkową)
BADANIA WSTĘPNE
posiać podane objętości próbek wody na podłoże Eijkmana (LPB) + rurki Durhama:
a) woda uzdatniona, dezynfekowana:
- 5 x po 10 ml na (2x)LPB
- 1 x po 50 ml na (2x)LPB
b) woda uzdatniona, niedezynfekowana woda ze studni, wody
powierzchniowe i ścieki
- 2/3 x 10 ml na (2x)LPB
- 2/3 x 1 ml na (1x)LPB
- 2/3 x 1 ml na (1x)LPB z rozcieńczeń: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5
Uwaga! W przypadku rozcieńczania próbek wody użyć jałowego płynu do rozcieńczeń
inkubacja
temp. 37oC przez 24 - 48 h
(po 24 h obejrzeć hodowle)
wynik dodatni
obecność gazu w rurkach Durhama i
zmiana barwy pożywki z fioletowej na żółtą
(probówki bez widocznych zmian inkubować do 48 h)
BADANIA POTWIERDZAJĄCE
posiew na podłoże Endo lub Endo wg ISO
z każdej dodatniej hodowli po 24 h oraz hodowli dodatnich i wątpliwych po 48 h
przenieść ezą zawiesinę bakterii (posiew redukcyjny) na podłoże Endo
inkubacja
temp. 37oC przez 24 h
wynik dodatni
kolonie ciemnoczerwone
z metalicznym zielonozłotym połyskiem
(obecność grupy coli)
wynik wątpliwy
kolonie czerwone lub różowe bez połysku
BADANIA UZUPEŁNIAJĄCE
1. przeszczepić kolonie
nietypowe do probówek
z pożywkę laktozową
ze wsk. Andrade (5 ml)
+ rurki Durhama
inkubacja
temp. 37oC przez 48 h
2. kolonie nietypowe przeszczepić
na skosy agarowe
3. test na oksydazę
inkubacja
temp. 37oC przez 24 h
wykonać 2 preparaty
barwione metodą Grama
wynik dodatni:
gaz w rurkach Durhama
i różowe zabarwienie podłoża
(obecność grupy coli)
5. Podawanie wyników
Wynik końcowy odczytać z tablic podanych w Normie PN-75 C-04615/05 - Woda i ścieki. Badania
mikrobiologiczne. Oznaczanie bakterii grupy coli metodą fermentacyjną probówkową i podać jako NPL bakterii z
grupy coli w 100 ml próbki wody.
4
OZNACZANIE LICZBY BAKTERII Z GRUPY COLI TYP FEKALNY I ESCHERICHIA COLI W
WODZIE METODĄ FERMENTACYJNĄ PROBÓWKOWĄ wg. PN-77/C-04615/07:1977 (Woda i
ścieki. Badania mikrobiologiczne: Oznaczanie bakterii grupy coli typu kałowego (fekalnego) metodą
fermentacyjną probówkową).
4. Przebieg procedury
BADANIA WSTĘPNE
posiać podane objętości próbek wody na podłoże Eijkmana (LPB) + rurki Durhama:
c) woda uzdatniona, dezynfekowana:
- 5 x po 10 ml na (2x)LPB
- 1 x po 50 ml na (2x)LPB
d) woda uzdatniona, niedezynfekowana woda ze studni, wody
powierzchniowe i ścieki
- 2/3 x 10 ml na (2x)LPB
- 2/3 x 1 ml na (1x)LPB
- 2/3 x 1 ml na (1x)LPB z rozcieńczeń: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5
Uwaga! W przypadku rozcieńczania próbek wody użyć jałowego płynu do rozcieńczeń
inkubacja
temp. 44oC przez 24 - 48 h
(po 24 h obejrzeć hodowle)
wynik dodatni
obecność gazu w rurkach Durhama i
zmiana barwy pożywki z fioletowej na żółtą
(probówki bez widocznych zmian inkubować do 48 h)
posiew na podłoże Endo wg ISO
inkubacja
temp. 44oC przez 24 h
posiew na podłoże z zielenią lub posiew na bulion tryptofanowy
brylantową + rurki Durhama
+ rurki Durhama
inkubacja
temp. 44oC przez 24 h
wynik dodatni
wynik dodatni
kolonie ciemnoczerwone
zmętnienie podłoża
z metalicznym zielonozłotym połyskiem
+ gaz
(obecność grupy coli typu fekalnego i
domniemanych E. coli)
potwierdzenie przynależności
domniemanych E. coli do E. coli
inkubacja
temp. 44oC przez 24 h
wynik dodatni
zmętnienie podłoża
+ gaz
czerwony pierścień
po dodaniu od. Kovacsa
posiew na bulion tryptofanowy
inkubacja
temp. 44oC przez 24 h
dodać 0,2-0,3 ml odczynnika Kovacsa
wynik dodatni
czerwony pierścień
5. Podawanie wyników
Wynik końcowy odczytać z tablic podanych w Normie PN-75/C-04615/05 - Woda i ścieki. Badania
mikrobiologiczne. Oznaczanie bakterii grupy coli metodą fermentacyjną probówkową i podać jako NPL bakterii z
grupy coli typ fekalny lub Escherichia coli w 100 ml próbki wody w 100 ml próbki wody.
5
OZNACZANIE LICZBY ENTEROKOKÓW KAŁOWYCH W WODZIE METODĄ FILTRACJI
MEMBRANOWEJ wg PN-EN ISO 7899-2:2004 (Jakość wody. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe
enterokoków kałowych. Część 2: Metoda filtracji membranowej).
Przygotować określone objętości próbek wody do przefiltrowania:
- woda uzdatniona, dezynfekowana: 100 ml
- woda uzdatniona, niedezynfekowana: 100 ml
- woda ze studni: 100 ml i 10 ml
- wody powierzchniowe: 10 ml i 1 ml
- wody silnie zanieczyszczone: 1 ml i 0,1 ml
Uwaga! W przypadku filtracji próbek wody o obj. 10 i 1 ml do aparatu filtracyjnego wlać dodatkowo 20 50 ml jałowego płynu do rozcieńczeń i dokładnie wymieszać zawartość leja filtracyjnego
przefiltrować próbki wody
przez sterylny filtr membranowy (0,45 mm)
przenieść filtr membranowy na
podłoże Slanetza i Bartleya
inkubacja: temp. 36oC ± 2 oC przez 44 ± 4h
wynik dodatni:
kolonie 0,2 - 1 mm, (obserwować pod lupą)
koloru czerwonego, czerwonawego z ciemniejszym
środkiem lub różowym lub barwy kasztanowej
przenieść filtr nie odwracając go na wstępnie ogrzane
do 44oC podłoże agarowe z żółcią, eskuliną i azydkiem
inkubacja
temp. 44oC ± 0,5 oC przez 2h
wynik dodatni
policzyć kolonie wokół których podłoże przybiera barwę brązową do czarnej
5. Podawanie wyników
Wynik końcowy podać zgodnie z normą PN-EN ISO 7899-2:2004 (Jakość wody. Wykrywanie i oznaczanie
ilościowe enterokoków kałowych. Część 2: Metoda filtracji membranowej) jako liczbę enterokoków kałowych w
100 ml próbki wody.
6
OZNACZANIE ENTEROKOKÓW KAŁOWYCH W WODZIE METODĄ PROBÓWKOWĄ wg. PN82/C-04615/25:1982 (Woda i ścieki. Badania mikrobiologiczne: Oznaczanie paciorkowców kałowych
metodą filtrów membranowych (FM) i metodą probówkową).
BADANIE WSTĘPNE
posiać podane objętości próbek wody
na podłoże (APB z azydkiem i purpurą bromokrezolową)
e) woda uzdatniona, dezynfekowana:
- 5 x po 10 ml na (2x) APB
- 1 x po 50 ml na (2x) APB
f) woda uzdatniona, niedezynfekowana woda ze studni,
wody powierzchniowe i ścieki
- 2/3 x 10 ml na (2x) APB
- 2/3 x 1 ml na (1x) APB
- 2/3 x 1 ml na (1x) APB z rozcieńczeń: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5
Uwaga! W przypadku rozcieńczania próbek wody użyć jałowego płynu do rozcieńczeń
inkubacjatemp. 37oC przez 24 - 48 h
wynik dodatni:
zmętnienie podłoża i zmiana zabarwienia z czerwonej na żółtą
Badania potwierdzające
przenieść trzykrotnie ezą z dodatnich hodowli na podłożu APB
materiał do probówek z 5 ml
podłoża z azydkiem sodowym i fioletem etylowym (AFE)
inkubacja temp. 37oC przez 48 h (odczyt zrobić już po 24 h)
Wynik dodatni:
niebieski osad bakterii na dnie probówki
5. Podawanie wyników
Wynik końcowy odczytać z tablic podanych w Normie PN-82/C-04615/25: 1982 - Woda i ścieki. Badania
mikrobiologiczne: Oznaczanie paciorkowców kałowych metodą filtrów membranowych (FM) i metodą
probówkową i podać jako NPL bakterii z grupy coli w 100 ml próbki wody.
7
OZNACZANIE LICZBY CLOSTRIDIUM PERFRINGENS W WODZIE NA PODŁOŻU m-CP
METODĄ FILTRACJI MEMBRANOWEJ wg Dyrektywy 98/83/WE z dn. 3.11.1998r i PN-ISO
8199: 2001 (Jakość wody. Ogólne wytyczne oznaczania liczby bakterii metodą hodowl).
Filtracja:
Przefiltrować przez filtr membranowy określoną objętość badanej próbki wody (zazwyczaj 100 ml). W
przypadku wód silniej zanieczyszczonych przefiltrować dodatkowo 10 i 1 ml próbki i do tego celu użyć
sterylnego płynu do rozcieńczeń w ilości od 20 do 50 ml. W przypadku oznaczania liczby spor Clostridium
perfringens próbkę wody przed filtracją należy ogrzać w temperaturze 60±2oC przez 15 min ±1 min.
Przenieść filtr membranowy na agar m-CP w taki sposób aby pod filtrem nie powstawały pęcherzyki
powietrza. Następnie płytki odwrócić i poddać inkubacji.
Inkubacja:
44oC±1oC / 21±3 h
w warunkach beztlenowych
Odczyt:
Po określonym czasie inkubacji policzyć wyrosłe kolonie. Za domniemane Clostridium perfringens należy uznać
wszystkie rosnące na agarze m-CP w postaci żółtych kolonii. Podłoże pod filtrem przyjmuje zabarwienie żółte.
Potwierdzenie:
Umieścić otwarta płytkę z filtrem membranowym w pojemniku z oparami wody amoniakalnej. Po 20-30 s
dokonać odczytu. Za wynik dodatni należy uznać te kolonie, które zmieniły barwę z żółtej na różową
5. Podawanie wyników
Wynik podać jako liczbę Clostridium perfringens lub liczbę spor Clostridium perfringens w 100 ml próbki wody.
8