Detekcja i identyfikacja drobnoustrojów

advertisement
STRESZCZENIE
|DIAGNOST YKA
L A B O R ATO R YJ N A
W medycznych laboratoriach mikrobiologicznych
do oznaczania lekowrażliwości bakterii stosowane są systemy automatyczne
fot. Thinkstock
LABORATORIUM 7-8/2012
oraz metody manualne, takie jak metoda dyfuzyjno-krążkowa i oznaczanie
minimalnego stężenia hamującego MIC metodą dyfuzji z paska
z gradientem antybiotyku. Interpretacja wyników oznaczania lekowrażliwości
jest dokonywana z zastosowaniem wartości granicznych EUCAST.
SŁOWA KLUCZOWE
oznaczanie lekowrażliwości, minimalne stężenie
hamujące MIC, metoda dyfuzyjno-krążkowa, wartości graniczne EUCAST
SUMMARY
Antimicrobial susceptibility testing of bacteria isolated
in the medical microbiology laboratories is performed with using
automated systems as well as manual methods, such as disc
diffusion method and gradient strip minimal inhibitory
concentration (MIC) evaluation. EUCAST breakpoints are
used for interpretation of susceptibility testing results.
KEY WORDS
susceptibility testing, minimal inhibitory
concentration MIC, disc diffusion method, EUCAST breakpoints
Detekcja i identyfikacja
drobnoustrojów
– oznaczanie lekowrażliwości bakterii
dr n. med. Dorota Żabicka
KRAJOWY OŚRODEK REFERENCYJNY DS. LEKOWRAŻLIWOŚCI DROB
NOUSTROJÓW, ZAKŁAD EPIDEMIOLOGII I MIKROBIOLOGII KLINICZNEJ,
NARODOWY INSTYTUT LEKÓW, WARSZAWA
40
D I AG N O S T Y K A L A B O R ATO R YJ N A
adania bakteriologiczne w medycznych laboratoriach
mikrobiologicznych mają na celu identyfikację gatunku
i oznaczenie lekowrażliwości bakterii, które wywołały
zakażenie u pacjenta. Wynik oznaczania lekowrażliwości jest
następnie interpretowany z zastosowaniem odpowiednich wartości granicznych, określonych w stosowanych w danym kraju
rekomendacjach amerykańskich CLSI (Clinical Laboratory
Standards Institute) lub europejskich EUCAST (European
Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing), kwalifikujących wyhodowany drobnoustrój do kategorii „wrażliwy”,
„średniowrażliwy” lub „oporny” na dany lek, co umożliwia
dobranie skutecznej terapii. W laboratoriach wykonujących
rutynowe badania bakteriologiczne dla szpitali i pacjentów
ambulatoryjnych lekowrażliwość bakterii oznaczana jest z zastosowaniem kilku podstawowych metod, takich jak metoda
dyfuzyjno-krążkowa, oznaczanie minimalnego stężenia hamującego MIC metodą dyfuzji z paska z gradientem antybiotyku
oraz przy użyciu systemów automatycznych.
B
䀈METODA DYFUZYJNO-KRĄŻKOWA
Metoda dyfuzyjno-krążkowa została opisana po raz pierwszy w 1954 roku przez Erickssona. W metodzie tej na bogate podłoże wzrostowe, najczęściej Muller-Hinton agar
lub Muller-Hinton agar z dodatkami wzrostowymi (defibrynowana krew barania lub defibrynowana krew końska +
20 mg/l β-NAD), nakładana jest zawiesina bakterii w 0,9%
NaCl o gęstości 0,5 w skali McFarlanda oraz krążki ze znanym stężeniem antybiotyku. Tak przygotowane płytki inkubowane są w temperaturze ± 35°C przez 18-24 godz.
Antybiotyk dyfundujący w podłożu agarowym powoduje
zatrzymanie wzrostu bakterii, co obserwujemy w postaci
strefy zahamowania wzrostu dookoła krążka (fot. 1, s. 42).
Średnica strefy zahamowania wzrostu badanego szczepu
bakterii jest zależna zarówno od wrażliwości danego drobnoustroju na badany antybiotyk i jego tempa wzrostu, jak
i od dynamik dyfuzji antybiotyku w podłożu agarowym. Wykonując kolejne oznaczenia dla tego samego układu badanego: szczep bakterii – antybiotyk, można uzyskać niewielkie,
do kilku milimetrów, różnice średnicy strefy zahamowania
wzrostu dookoła krążka. Teoretycznie dla badanego szczepu
bakterii wielkość strefy zahamowania wzrostu odpowiada
wartości minimalnego stężenia hamującego MIC badanego
antybiotyku, jednakże różnice wielkości strefy obserwowane
w kolejnych oznaczeniach powodują, że z wielkości strefy
nie można odczytać prawdziwej wartości MIC. Zmierzoną
średnicę strefy zahamowania wzrostu dookoła krążka porównuje się z wartościami granicznymi dla szczepów wrażliwych
i opornych, określonych w stosowanych w danym kraju rekomendacjach CLSI lub EUCAST i następnie interpretację
„wrażliwy” lub „oporny” wpisuje się do wyniku oznaczania
lekowrażliwości badanego szczepu bakterii. W celu zapewnienia odpowiedniej jakości badań w wewnętrznej kontroli
jakości stosowane są kontrolne szczepy bakterii o znanym
profilu lekowrażliwości i zakresie wahań wielkości strefy zahamowania wzrostu wokół krążków z antybiotykami.
W Polce do oznaczania lekowrażliwości metodą dyfuzyjno-krążkową stosowane są najczęściej krążki i podłoża bakteriologiczne produkowane przez cieszące się dobrą opinią
i zapewniające odpowiednią jakość swoich produktów firmy
|LABORATORIUM
7-8/2012
O
znaczenie lekowrażliwości bakterii
ma na celu wskazanie odpowiedniej
terapii, skutecznej w leczeniu zakażenia
wywołanego przez badany izolat bakteryjny
BD Diagnostics, Bio-Rad, Oxoid Ltd. (Thermo Fisher Scientific) oraz MAST Group. Odczytu wielkości strefy zahamowania wzrostu dookoła krążków można dokonać manualnie
lub z użyciem systemu automatycznego Bio-Rad OSIRIS/
ADAGIO. W systemie Bio-Rad OSIRIS/ADAGIO możliwe
jest zaprogramowanie różnych wariantów płytek antybiogramowych z antybiotykami dobranymi do poszczególnych grup
drobnoustrojów. Aparat umożliwia automatyczny odczyt i manualną korektę wielkości strefy zahamowania wzrostu, która
jest następnie interpretowana przez aparat zgodnie z wybranymi wartościami granicznymi CLSI lub EUCAST.
Metoda dyfuzyjno-krążkowa jest także stosowana do wykrywania ważnych z punktu widzenia epidemiologicznego
mechanizmów oporności na antybiotyki, takich jak oporność
na metycylinę u gronkowców czy produkcja β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym ESBL (ang. extended-spectrumβ-lactamase), produkcja karabapenemaz MBL (ang. metalo-βlactamase) i karbapenemaz KPC (ang. Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) u pałeczek Gram-ujemnych (fot. 2, s. 42).
41
|DIAGNOST YKA
L A B O R ATO R YJ N A
fot. archiwum Zakładu Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej, NIL, Warszawa
LABORATORIUM 7-8/2012
䀈METODA DYFUZJI Z PASKA
Z GRADIENTEM
ANTYBIOTYKU
Fot. 1. Oznaczanie lekowrażliwości drobnoustrojów metodą dyfuzyjno-krążkową; szczep Staphylococcus aureus ATCC 25923
Fot. 2. Oznaczanie produkcji β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym ESBL metodą dyfuzyjno-krążkową; szczep
Klebsiella pneumoniae ESBL-dodatni
Fot. 3. Oznaczanie lekowrażliwości drobnoustrojów metodą dyfuzji z paska z gradientem antybiotyku; szczep Staphylococcus
aureus MIC wankomycyny = 2 mg/l
42
Opracowana w Szwecji przez firmę
AB BIODISK metoda dyfuzji z paska
z gradientem antybiotyku została po raz
pierwszy zaprezentowana w 1988 roku.
Łączy ona zasadę metody dyfuzji antybiotyku w podłożu agarowym z oznaczaniem minimalnego stężenia hamującego
MIC antybiotyku metodą rozcieńczeń
w agarze. W metodzie tej stosowane
są paski z antybiotykiem w gradiencie
stężeń obejmujących 15 podwójnych
rozcieńczeń, najczęściej w zakresie stężeń
od 0,016 mg/l do 256 mg/l. Po nałożeniu paska z gradientem antybiotyku
na płytkę z podłożem agarowym (najczęściej Muller-Hinton agar lub MullerHinton agar z dodatkami wzrostowymi)
z naniesioną zawiesiną bakterii następuje
natychmiastowa dyfuzja antybiotyku
w podłożu agarowym. W rezultacie
w podłożu dookoła paska tworzy się
stabilny gradient stężenia antybiotyku,
odpowiadający stężeniu leku w pasku.
Odczytu wartości MIC dokonuje się
po inkubacji płytek w temperaturze ±
35°C przez 18-24 godz. Zahamowanie
wzrostu bakterii przez dyfundujący
w podłożu agarowym antybiotyk jest
widoczne w postaci elipsy, której krawędź przecina pasek w miejscu, w którym stężenie antybiotyku odpowiada
wartości MIC dla danej pary szczep
bakteryjny – antybiotyk (fot. 3). Odczytana wartość minimalnego stężenia hamującego jest następnie interpretowana
z zastosowaniem wartości granicznych
CLSI lub EUCAST.
Metoda dyfuzji z paska z gradientem
antybiotyku jest obecnie jedynym sposobem oznaczania wartości MIC stosowanym w rutynowych oznaczeniach
w medycznych laboratoriach mikrobiologicznych na całym świecie. Inne metody
oznaczania MIC, czyli metoda seryjnych
rozcieńczeń antybiotyku w podłożu
płynnym oraz metoda seryjnych rozcieńczeń antybiotyku w podłożu stałym,
ze względu na swoją pracochłonność mają
zastosowanie jedynie w laboratoriach
referencyjnych. Metoda dyfuzji z paska
z gradientem antybiotyku ma zastosowanie zarówno do oznaczania MIC dla szybko rosnących bakterii tlenowych, takich
jak gronkowce, pałeczki Gram-ujemne
z rodziny Enterobacteracieae czy pałeczki
Gram-ujemne niefermentujące, jak i dla
LABORATORIUM 7-8/2012
|DIAGNOST YKA
L A B O R ATO R YJ N A
Fot. 4. Oznaczanie lekowrażliwości drobnoustrojów metodą dyfuzji z paska z gradientem antybiotyku Etest® bioMerieux; szczep
Streptococcus pneumoniae MIC cefotaksymu = 0,023 mg/l oraz MIC penicyliny = 0,023 mg/l
a)
drobnoustrojów wymagających, takich
jak Streptococcus pneumoniae i inne paciorkowce, pałeczki hemofilie, gonokoki
i bakterie beztlenowe. Metoda ta pozwala również na oznaczenie wartości MIC
grzybów drożdżopodobnych i strzępkowych z rodzaju Aspergillus na wiele leków
przeciwgrzybiczych.
W Polsce oznaczenia MIC metodą
dyfuzji z paska z gradientem antybiotyku dla bakterii i grzybów są najczęściej
wykonywane z zastosowaniem pasków
z gradientem antybiotyku Etest® bioMerieux (fot. 4). Od 2009 roku są również
dostępne paski M.I.C. Evaluator Strips
Oxoid Ltd., które mają zastosowanie
do oznaczania MIC u wielu gatunków
bakterii (fot. 5). Oznaczenia należy wykonywać zgodnie z metodyką proponowaną
przez producenta stosowanych pasków
gradientowych, gdyż metody proponowane przez każdą z firmy różnią się w niektórych szczegółach. W celu zapewnienia
wiarygodności oznaczeń w wewnętrznej
kontroli jakości stosowane są odpowiednie szczepy kontrolne o znanych wartościach MIC.
䀈SYSTEMY AUTOMATYCZNE
b)
Fot. 5. a, b. Oznaczanie lekowrażliwości drobnoustrojów metodą dyfuzji z paska z gradientem antybiotyku M.I.C. Evaluator Strips
Oxoid Ltd. a) Szczep Enterococcus faecalis MIC wankomycyny = 4 mg/l ; b) Streptococcus grupy viridans MIC penicyliny = 2 mg/l
44
Systemy automatyczne znalazły zastosowanie zarówno w identyfikacji, jak
i w oznaczaniu lekowrażliwości bakterii.
Używane w poszczególnych systemach
gotowe panele diagnostyczne umożliwiają albo osobne oznaczenie lekowrażliwości lub identyfikację drobnoustroju,
albo jednoczesne wykonanie obu oznaczeń w jednym panelu. Zakres stężeń
antybiotyków w panelach do systemów
automatycznych umożliwia oznaczenie
wartości MIC w zakresie wartości granicznych i zakwalifikowanie oznaczanego szczepu bakterii do kategorii „wrażliwy”, „średniowrażliwy” lub „oporny”
na dany antybiotyk, nie pozwala natomiast podać prawdziwej wartości
MIC. W zależności od systemu panele
są napełniane ręcznie lub automatyczne
w aparacie zawiesiną bakterii o określonej gęstości, przygotowanej w sterylnej
wodzie lub 0,9-proc. NaCl.
Stosowane w medycznych laboratoriach mikrobiologicznych systemy automatyczne pozwalają na identyfikację
i oznaczenie lekowrażliwości najczęściej
izolowanych bakterii Gram-dodatnich
i Gram-ujemnych: gronkowców, paciorkowców (w tym S. pneumoniae), enterokoków, pałeczek fermentujących z rodziny
D I AG N O S T Y K A L A B O R ATO R YJ N A
Enterobacteriaceae i pałeczek niefermentujących. W Polsce najczęściej są stosowane systemy automatyczne firmy bioMérieux:
ATB Expression miniApi, Vitek 2 i Vitek 2 Compact, rzadziej
Phoenix/EpiCenter firmy BD diagnostics i aparat WalkAway®
Plus System z rodziny aparatów MicroScan® Simens Healthcare
Diagnostic. Do kontroli jakości oznaczeń w poszczególnych
systemach automatycznych każda z firm proponuje odpowiedni zestaw kontrolnych szczepów bakterii. Wszystkie stosowane
w Polsce systemy automatyczne dają możliwość interpretacji
wyników oznaczania wrażliwości bakterii na leki z zastosowaniem zarówno rekomendacji europejskich EUCAST, jak i rekomendacji amerykańskich CLSI. Systemy te mają najczęściej
również odpowiednie oprogramowanie do sporządzania zestawień statystycznych i analizy wyników w celu monitorowania
lekowrażliwości hodowanych szczepów bakterii.
䀈INTERPRETACJA WYNIKÓW OZNACZANIA
LEKOWRAŻLIWOŚCI BAKTERII
Oznaczenie lekowrażliwości bakterii ma na celu wskazanie odpowiedniej terapii, skutecznej w leczeniu zakażenia wywołanego
przez badany izolat bakteryjny. Interpretacja wyników polega
na zakwalifikowaniu wyhodowanego szczepu bakterii do kategorii „wrażliwy”, „średniowrażliwy” lub „oporny” na dany
lek, z zastosowaniem klinicznych wartości granicznych definiowanych następująco:
• wrażliwy – wrażliwość drobnoustroju na standardowe dawki
leku – wysokie prawdopodobieństwo odniesienia sukcesu
terapeutycznego;
• średniowrażliwy – szczep w zakresie wartości MIC pomiędzy
wrażliwym a opornym, efekt terapeutyczny niepewny, ale
może zostać osiągnięty, jeśli zakażenie przebiega w takiej
lokalizacji, gdzie lek jest fizycznie zagęszczany (np. drogi
moczowe) lub gdy jest możliwość podania wysokich dawek
leku;
• oporny – wysokie prawdopodobieństwo niepowodzenia terapeutycznego, nawet w przypadku zastosowania wysokich
dawek leku.
Na świecie do interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości bakterii stosowane są obecnie rekomendacje amerykańskie CLSI oraz opracowane po raz pierwszy w 2009 r. rekomendacje europejskie EUCAST.
W Polsce do kwietnia 2011 r. stosowane były rekomendacje
amerykańskie CLSI, natomiast od kwietnia 2011 r. stosowane
są rekomendacje europejskie EUCAST. Rekomendacje EUCAST
zostały opracowane w oparciu o doświadczenia kliniczne oraz
wiedzę o zależnościach farmakokinetyki i farmakodynamiki
przy zastosowaniu odpowiedniej dawki leku. Zgodnie z tymi
rekomendacjami zakwalifikowanie bakterii do kategorii „wrażliwy” oznacza, że występuje wysokie prawdopodobieństwo sukcesu terapeutycznego w przypadku zastosowania standardowej
dawki leku. W przypadku szczepów kwalifikowanych do kategorii „średniowrażliwy” osiągnięcie sukcesu terapeutycznego
jest możliwe w przypadku zastosowania maksymalnej dawki
leku. Tabele z klinicznymi wartościami granicznymi EUCAST
obowiązujące w roku następnym są publikowane corocznie
w grudniu roku poprzedzającego ich wejście w życie.
W Polsce w celu ułatwienia stosowania rekomendacji EUCAT
na stronach internetowych Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości – KORLD (www.korld.edu.pl) oraz
|LABORATORIUM
7-8/2012
konsultanta krajowego w dziedzinie mikrobiologii lekarskiej
(www.mikrobiologia.edu.pl) zostały opublikowane podstawowe
dokumenty EUCAST w tłumaczeniu na język polski: „Europejski Komitet ds. Oznaczania Lekowrażliwości EUCAST.
Tabele interpretacji wartości granicznych minimalnych stężeń
hamujących (MIC) oraz wielkości stref zahamowania wzrostu,
Wersja 2.0, obowiązująca od 1 stycznia 2012” oraz „Zasady
interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów – zalecenia ekspertów EUCAST, 2011”. Na wymienionych stronach dostępne są również inne opracowania, w tym
przygotowane przez powołany przez konsultanta krajowego
w dziedzinie mikrobiologii lekarskiej prof. dr hab. n. med.
Walerię Hryniewicz zespół ds. oznaczania lekowrażliwości
zgodnie z zaleceniami EUCAST, odpowiadające na wiele pytań związanych ze stosowaniem zaleceń EUCAST w praktyce
medycznego laboratorium mikrobiologicznego.
Oznaczanie lekowrażliwości bakterii izolowanych z zakażeń jest ostatnim etapem badania bakteriologicznego
w medycznym laboratorium mikrobiologicznym. Prawidłowe
wykonanie oraz właściwa interpretacja wyniku oznaczenia lekowrażliwości umożliwiają dobranie terapii celowanej u pacjenta, od którego izolowano drobnoustrój. Analiza danych
o wrażliwości drobnoustrojów izolowanych od pacjentów
umożliwia śledzenie trendów lekowrażliwości wśród izolatów bakteryjnych danego gatunku i rekomendowanie terapii
empirycznej, a w przypadku analizy wyników wrażliwości
bakterii hodowanych w szpitalach jest również niezbędnym
elementem kształtowania jego polityki antybiotykowej. ‰
45
Download
Random flashcards
123

2 Cards oauth2_google_0a87d737-559d-4799-9194-d76e8d2e5390

ALICJA

4 Cards oauth2_google_3d22cb2e-d639-45de-a1f9-1584cfd7eea2

Motywacja w zzl

3 Cards ypy

Pomiary elektr

2 Cards m.duchnowski

Create flashcards