PODSTAWY BIOTECHNOLOGII

PODSTAWY BIOTECHNOLOGII
Piotr Solarczyk
EFEKT KOŃCOWY
Po zakończeniu seminarium powinieneś umieć:
wyjaśnić pojęcia plazmid, fag, wektor, wektor ekspresyjny i czółenkowy, klonowanie,
transfekcja, transformacja, insert, episom,
wymienić i scharakteryzować poznane wektory,
scharakteryzować enzymy restrykcyjne,
omówić budowę sztucznych chromosomów bakteryjnych i drożdżowych,
scharakteryzować metody bezpośredniego wprowadzania DNA do komórek.
Biotechnologia jest interdyscyplinarną dziedziną nauki, która obejmuje wiele kierunków
technicznego wykorzystania materiałów i procesów biologicznych. Europejska Federacja
Biotechnologii (EFB) opisuje tę dziedzinę jako „integrację nauk przyrodniczych i inżynieryjnych w celu osiągnięcia zastosowań organizmów, komórek lub ich części oraz molekularnych
analogów dla pozyskania produktów lub usług”. Współczesna biotechnologia ma zastosowanie głównie w przemyśle spożywczym, chemicznym, farmaceutycznym, medycynie, rolnictwie i w ochronie środowiska. Przedstawienie podstaw biotechnologii jest niezwykle trudne
ze względu na złożoność zagadnień i szybki rozwój technik biologii molekularnej. Poniższy
przegląd dotyczy jedynie wybranych aspektów laboratoryjnej pracy z DNA.
Pierwszym etapem pracy z materiałem genetycznym jest izolacja DNA, która polega na
oddzieleniu DNA od innych struktur komórkowych oraz od cząsteczek RNA i białek (histonów). DNA można uzyskać z prawie każdego materiału biologicznego (np. z krwi, nasienia,
plwociny, kału, bakterii). Do niedawna w celu izolacji DNA wykorzystywano metodę z użyciem fenolu i chloroformu, a obecnie coraz częściej korzysta się z komercyjnych zestawów.
Każda procedura izolacji DNA powinna zakończyć się oceną jego ilości i jakości. Wyizolowany DNA można przechowywać w temperaturze +4°C lub - 20°C. Wyizolowany, totalny
kwas nukleinowy powinien być albo hydrolizowany odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi
albo powinien być bezpośrednio namnożony za pomocą PCR. Dalszym procesem, w zależności od założeń, jest klonowanie w wektorach i transformacja komórek gospodarza. Badanie
powinno zakończyć się analizą i/lub ekspresją odpowiednich genów/fragmentów DNA w komórkach docelowych.
Enzymy restrykcyjne
Enzymy restrykcyjne (endonukleazy restrykcyjne, restryktazy) to są enzymy bakteryjne
rozpoznające i hydrolizujące DNA w określonych miejscach. Restryktazy są zaangażowane
w obronę komórki bakteryjnej przed wirusami. Znanych jest kilka klas restryktaz. Największe
znaczenie mają enzymy II klasy. Dotychczas wyizolowono kilkaset enzymów restrykcyjnych,
których nazwy pochodzą od gatunku bakterii, np. Eco RI wyizolowano z Escherichia coli ze
szczepu RY 13, a Sau3A z Staphylococcus aureus. Oprócz restryktaz, istnieje szereg innych
enzymów wykorzystywanych w inżynierii genetycznej. Należą do nich:
- ligazy pozwalające na łączenie fragmentów DNA,
- egzonukleazy umożliwiające odpowiednią "obróbkę" końców w modyfikowanych fragmentach DNA,
- polimerazy, które są odpowiedzialne za powielanie (amplifikację) odpowiednich odcinków
DNA (PCR - reakcja łańcuchowej polimerazy).
1
Sekwencje restrykcyjne to krótkie, palindromowe fragmenty1 DNA rozpoznawane przez
enzymy restrykcyjne. Endonukleazy rozpoznają z reguły sekwencje o długości 4 do 8 pz,
a produkty ich trawienia mają zakończenia w postaci jednoniciowego ogona na końcu 3` lub
5` („lepkie” końce). „Lepkie” końce umożliwiają łączenie fragmentów DNA pochodzących
z różnych źródeł. Zatem jest to stosunkowo prosty sposób na wbudowanie fragmentów DNA
do plazmidów lub DNA innych wektorów.
Ogólna charakterystyka plazmidów i bakteriofagów
Plazmid to pozachromosomowa, z reguły kolista cząsteczka DNA zdolna do samodzielnej
replikacji, która występuje u prokariota i niektórych organizmów eukariotycznych. Plazmidy
pełnią w komórkach funkcje pomocniczych chromosomów i są przenoszone w trakcie procesu koniugacji między komórkami bakteryjnymi. Jednym z najlepiej poznanych plazmidów
jest plazmid F z E. coli. Jest to plazmid typu koniugacyjnego, ponieważ jest transferowany
z komórki donora do akceptora. Szczepy bakterii zawierają różną liczbę plazmidów. Plazmidy ulegają replikacji niezależnie od macierzystego genomu bakterii, także w komórkach gospodarzy należących do innych gatunków. Chociaż plazmidy nie są one konieczne
do życia bakterii, to jednak mogą: (1) powodować oporność na antybiotyki i jony metali
ciężkich, (2) umożliwiać katabolizm toksycznych związków (toluen), (3) wpływać na chorobotwórczość bakterii oraz na zdolność do syntezy związków oddziaływujących na rozwój
innych bakterii, (4) umożliwiać interakcje z roślinami (wiązanie azotu) oraz koniugację
bakterii. Plazmidy można wyizolować niezależnie od chromosomu bakteryjnego.
W pracach molekularnych, w których wykorzystuje się E. coli, stosuje się także wiele bakteriofagów (wirusy infekujące bakterie). Bakteriofagi pasożytują w organizmach prokariotycznych, dlatego wykazują znaczne podobieństwo do swoich gospodarzy. Bakteriofagi mają
różne kształty - ikosaedralne2, pałeczkowate, helikalne lub są w postaci główki z ogonem.
W ich budowie wyróżnia się jedno- lub dwuniciowy DNA lub RNA, otoczony białkiem kapsydu2. Namnażanie fagów jest szybkie, wskutek czego na jedną komórkę bakteryjną przypadają setki cząsteczek faga. W przyrodzie występuje wiele różnych typów fagów, które infekują tylko określone gatunki bakterii. Ekspresja genomu faga wymaga zawsze enzymów komórkowych bakterii, ponieważ wirus nie jest zdolny do samodzielnego powielenia się. Jednym
z najlepiej poznanych fagów jest fag λ, którego można używać jako wektora do klonowania.
Fag λ, o wielkości 48 kpz, naturalnie infekuje bakterie E. coli wstrzykując dwuniciowy, liniowy DNA do komórki, w której przekształca się w formę kolistą. To przekształcenie umożliwiają sekwencje cos znajdujące się na końcach liniowego DNA faga. DNA faga albo ulega
replikacji i tworzy potomne cząsteczki wirusa uwalniane na drodze lizy komórki bakteryjnej (droga lityczna) albo ulega integracji z genomem gospodarza i pozostaje w nim przez
długi czas (droga lizogeniczna). W cyklu litycznym ekspresji ulegają wszystkie geny wirusa,
podczas gdy ekspresja i replikacja genów gospodarza jest zahamowana. Z zarażonej komórki
uwalnia się ok. 100 potomnych cząstek wirusowych (wirionów). Natomiast zintegrowana
forma wirusa (zwana profagiem), pozostaje w komórce gospodarza przez wiele pokoleń.
Przerwanie szlaku lizogenicznego może nastąpić dopiero wtedy, gdy zainfekowana komórka
zostanie narażona na bodźce chemiczne lub fizyczne (np. promieniowanie); ekspresja genów
faga zachodzi w różnym czasie po infekcji; najpierw następuje ekspresja genów, tzw. natychmiastowych, a następnie opóźnionych. W końcu powstają białka strukturalne niezbędne do
złożenia nowych cząstek wirusa i lizy komórki.
1
Sekwencja palindromowa - sekwencja zasad w jednej nici DNA jest identyczna jak odczytywana wspak
sekwencja nici komplementarnej.
2
Wirusy o symetrii ikosaedralnej – kapsyd tych wirusów ma bardzo uporządkowaną strukturę, składa się
z dwudziestu trójkątnych ścian i dwunastu rogów, czyli wierzchołków.
2
kapsyd – zbudowana z wielu podjednostek (kapsomerów) otoczka białkowa chroniąca DNA wirusa.
2
Wektory
Wektor to cząsteczka DNA (wirus, plazmid, kosmid, lub sztuczny chromosom), która służy
do wprowadzenia obcego materiału genetycznego do innego gospodarza. Wektor, w którym
umieszcza się stosunkowo krótki fragment DNA, zawierający badany gen lub sekwencję,
nazywany jest rekombinowanym DNA. Wektory stosuje się do klonowania i amplifikacji
sekwencji DNA, badania mechanizmów ekspresji DNA, wprowadzania genów do komórek
zwierzęcych (transfekcja) i bakteryjnych (transformacja). Każdy wektor nie powinien zakłócać funkcji życiowych komórek gospodarza. Natomiast powinien posiadać zdolność do niezależnej replikacji razem z wbudowanym fragmentem DNA. Wektor powinien być też łatwo
wykrywalny w komórce za pomocą genów markerowych.
Jednym z ważniejszych problemów w biotechnologii jest pojemność wektora, która decyduje o wielkości wprowadzanego DNA (wielkości klonowanego insertu). Plazmidy, które są
najczęściej stosowane jako wektory, mają najmniejszą pojemność; w przypadku klonowania
dłuższych insertów stosowane są bakteriofagi, kosmidy, sztuczne chromosomy bakteryjne
(BAC) E. coli lub sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC) Saccharomyces cerevisiae
(Tabela 1).
Tabela 1. Pojemność wybranych wektorów.
Wektor
Wielkość insertu
wektor ekspresyjny
ok. 8 kpz
plazmid (E. coli)
ok. 15 kpz
fag λ
ok. 25 kpz
kosmid
ok. 45 kpz
BAC
ok. 500 kpz
YAC
ok. 1000 kpz
W biotechnologii stosowane są także wektory plazmidowe dla drożdży, tzw. episomalne
wektory drożdżowe (YEps), które służą do klonowania i ekspresji genów w komórkach
drożdży S. cerevisiae. YEps są zbudowane na bazie plazmidu 2µ naturalnie występującego
u drożdży. Wektory episomalne, mimo że replikują jak plazmidy, mogą albo włączać się do
chromosomu drożdży albo pozostać pozachromosomowo.
Odmienne nośniki przystosowano do włączenia obcego DNA do genomu roślinnego, ponieważ praca z materiałem roślinnym wymaga zastosowania nieco innej strategii. Najczęściej
wykorzystywany jest bakteryjny plazmid Ti z bakterii Agrobacterium tumefaciens, która
naturalnie infekuje rośliny dwuliścienne (pomidor, tytoń, groch) oraz rośliny jednoliścienne
(ryż). Podczas naturalnej infekcji, część plazmidu Ti zwana T-DNA, włączana jest do chromosomowego DNA roślinnego, co powoduje niekontrolowany wzrost komórek roślinnych
(guzowatość szyjki korzenia, czyli zrakowacenie).
Wektory do wprowadzania DNA do innych komórek eukariotycznych, np. utrzymywanych
w hodowlach tkankowych, są konstruowane w oparciu o wirusy, które naturalnie infekują
dany gatunek gospodarza. DNA wektora utrzymywany jest w komórce pozachromosomowo
albo też w formie zintegrowanej z genomem gospodarza (SV40, bakulowirusy, retrowirusy,
adenowirusy).
Wektory plazmidowe
Wektory oparte na plazmidach są stosowane jako narzędzia do poznawania genomów
komórek roślin i zwierząt. Wektor plazmidowy musi zawierać region początku replikacji
(ori), który pozwala na niezależne namnażanie się w komórkach. Należy jednak podkreślić,
że proces niezależnego namnażania wektora zachodzi z udziałem polimerazy i innych składników cytofizjologii komórki gospodarza. Drugim ważnym miejscem w wektorze plazmidowym jest wielokrotne miejsce klonowania (wiele miejsc rozpoznawanych przez różne enzy-
3
my restrykcyjne, MCS). Jest to miejsce, do którego wprowadza się badany fragment DNA,
czyli insert. Wektor plazmidowy musi posiadać promotor.
Niektóre wektory plazmidowe wymagają sekwencji wiążącej rybosom (RBS) i kodonu
inicjacji translacji, a inne - sekwencji umożliwiającej łatwiejsze oczyszczenie na drodze
chromatografii (metka HisTag). Wektory, które służą do ekspresji klonowanych fragmentów
DNA w komórkach, nazywamy plazmidowymi wektorami ekspresyjnymi.
Wektory bakteriofagowe (fagi)
Wektory bakteriofagowe pozwalają na wklonowanie większego insertu niż wektory
plazmidowe; np. do cząsteczki faga λ można wprowadzać insert o wielkości 25 kpz. Na
podstawie faga λ opracowano szereg innych wektorów, zwanych wektorami wymiennymi
(np. EMBL3 lub λDASH).
Jako wektory w pracach z E. coli używa się także fagi pałeczkowate, np. M13. Cząsteczki
tego wirusa zawierają kolisty, jednoniciowy DNA. Po wniknięciu faga M13 do komórki bakteryjnej syntetyzowana jest komplementarna nić i fagowy DNA powiela się już jako dwuniciowy kolisty DNA; ta forma replikacyjna (RF) występuje w około 100 kopiach na komórkę. W przeciwieństwie do faga λ, fag M13 nie powoduje lizy komórek bakteryjnych, a tylko spowalnia ich wzrost. Ponadto, oprócz formy RF, jednocześnie powstają opakowywane
kapsydem cząsteczki jednoniciowego DNA, które są uwalniane z komórek w kolejnych podziałach bakterii. Użyteczną cechą wektora M13 jest to, że formę RF można oczyszczać
i stosować tak jak plazmid, a jednocześnie można izolować DNA wektora z pożywki w
formie jednoniciowej.
Wiele wektorów plazmidowych opracowano jako hybrydowe połączenia z fagiem M13,
np. wektor pBluescript, który zawiera zarówno fagowe i plazmidowe miejsce początku
replikacji, lecz nie posiada genów potrzebnych do pełnego cyklu życiowego faga. Wektory
hybrydowe łączą zalety łatwej obróbki i szybkiego wzrostu.
Kosmidy
Kosmidy są sztucznie stworzonymi wektorami, powstałymi z połączenia plazmidu i sekwencji cos faga λ (sekwencja odpowiedzialna za cyrkulizację DNA). Kosmidy z wprowadzonym insertem są pakowane w kapsydy i są wykorzystywane do zakażenia komórek bakteryjnych. W przeciwieństwie do faga λ, kosmidy nie niszczą zainfekowanych komórek. Najprostszym wektorem kosmidowym jest typowy plazmid z miejscem ori i markerem selekcyjnym, zawierającym dodatkowo sekwencję cos i odpowiednie miejsce restrykcyjne do klonowania. Po trawieniu (cięciu) wektora odpowiednim enzymem restrykcyjnym i zligowaniu3
z docelowym insertem, kosmid pakowany jest do cząsteczek fagowych. Po wprowadzeniu
większego insertu do kosmidu wydłuża się czas jego replikacji oraz zmniejsza się liczba jego
kopii. Kosmidy umożliwiają klonowanie długich fragmentów DNA (ok. 45 kpz).
Sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC)
Wektor YAC jest wektorem bifunkcjonalnym, ponieważ jest zdolny do powielania w komórkach bakterii i drożdży. S. cerevisiae to organizm dobrze scharakteryzowany metodami
fizjologicznymi i biochemicznymi, który jest hodowany w warunkach in vitro na dużą skalę,
m.in. dla potrzeb przetwórstwa żywności, ponieważ nie wytwarza toksyn, a hodowle nie ulegają zakażeniom wirusowym. Sekwencje „drożdżowe” centromeru (CEN 4), telomeru (TEL)
i miejsca początku replikacji (ARS) zostały wyizolowane i połączone z plazmidami skonstruowanymi dla E. coli. Sekwencja TEL stanowi część DNA, która w komórkach drożdży
wydłużana jest przez enzym telomerazę. Sekwencja CEN 4 funkcjonuje prawidłowo podczas
3
ligacja DNA – łączenie się odcinków DNA poprzez wytwarzanie wiązań fosfodiestrowych za pomocą enzymu
ligazy DNA.
4
segregacji chromosomów S. cerevisiae w procesie mitozy. Sekwencja ARS pełni rolę miejsca
początku replikacji, podobnie jak sekwencja ori u bakterii. Chociaż w wektorach YAC można
klonować bardzo długie odcinki DNA, często okazuje się, że klonowane inserty zawierają
nieciągłe sekwencje, przez co są niestabilne.
Sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC)
Wektory BAC skonstruowano, aby uniknąć problemów związanych ze stosowaniem wektorów YAC. Do wektorów BAC można wprowadzić insert o długości około 100-500 kpz.
W porównaniu do wektorów YAC, wektory BAC są bardziej stabilne, łatwiej się nimi transformuje komórki E. coli oraz łatwiej je namnażać i izolować z komórek bakteryjnych. Wektory BAC zbudowane są na bazie plazmida F; zawierają geny istotne dla replikacji i utrzymywania się w komórce bakterii E. coli. Wektory BAC są obecnie używane w projektach mapowania genów.
Wektory eukariotyczne oparte na wirusach
Transfekcja jest procesem, który polega na wprowadzeniu obcego DNA do komórek
eukariotycznych. Rekombinowanie organizmów wyższych stwarza więcej problemów niż
transformacja bakterii. Komórki, do których może wniknąć obcy DNA w warunkach in vitro,
nazwane są komórkami kompetentnymi. Wiele wektorów stosowanych do transfekcji komórek eukariotycznych skonstruowano jako wektory czółenkowe, zwane również wektorami wahadłowymi, ponieważ zawierają sekwencje potrzebne do replikacji i selekcji w E. coli
oraz w komórkach eukariotycznych.
Dzięki technikom biologii molekularnej możliwe jest usuwanie z genomu wirusów genów
związanych z ich cyklem rozwojowym i wstawianie w ich miejsce genu terapeutycznego. Tak
zmodyfikowany wirus nie ulega namnażaniu w komórce gospodarza, ale pozostawia w niej
wprowadzony insert.
Retrowirusy4 potrafią zakażać wiele rodzajów komórek, lecz ulegają stabilnej integracji
z DNA gospodarza, co nie zawsze jest korzystne. Adenowirusy mogą wnikać do nie dzielących się komórek, ale wywołują niepotrzebną reakcję odpornościową gospodarza. Chociaż
niektóre wirusy AAV, często towarzyszące adenowirusom, nie wywołują odpowiedzi układu
odpornościowego, to jednak w warunkach laboratoryjnych trudno uzyskać je w dużej liczbie.
Wektory skonstruowane w oparciu o genom herpetowirusów (wirus opryszczki, HSV)
mogą infekować także nie dzielące się komórki i przenosić duże fragmenty obcego DNA.
Wirus HSV, pomimo chorobotwórczości, jest jednym z najważniejszych kandydatów do
wykorzystania jako wektor.
Bakulowirusy infekują komórki owadów i powodują nadekspresję białka - poliedryny,
która gromadzi się w zakażonych komórkach. Ta cecha bakulowirusów wykorzystywana jest
do nadekspresji obcych genów, dzięki czemu można produkować duże ilości białka w hodowli zainfekowanych komórek owadów. Metoda ta jest coraz częściej stosowana do produkcji
białek pochodzenia zwierzęcego na dużą skalę.
Do wprowadzania genów do komórek ssaków wykorzystywane są wirusy ssaków. Jednym z pierwszych użytych do tego celu był wirus SV40 infekujący wiele gatunków ssaków.
Natomiast, retrowirusy, których genomy zbudowane są z RNA, planuje się do użycia w terapii genowej, ponieważ obcy DNA może być za ich pośrednictwem włączony do genomu gospodarza w stabilny sposób. Dodatkową zaletą retrowirusów jest niska immunogenność, natomiast ich wadą jest wywołanie mutacji w DNA gospodarza. Najczęściej wykorzystywanym
wektorem retrowirusowym jest wirus białaczki mysiej Moloneya (MoMuLV). Istotnym ograniczeniem jest fakt, że do retrowirusów nie można wbudować insertu większego niż 1 kpz.
4
Retrowirusy – posiadają genom RNA oraz kodują odwrotną transkryptazę; niektóre mają budowę ikosaedralną
(np. HIV).
5
Inne metody wprowadzania DNA do komórki
Niektóre obecnie stosowane wektory nie są precyzyjne w swoim działaniu, inne niezbyt
wydajnie przenoszą DNA, a jeszcze inne pobudzają niepożądaną odpowiedź układu odpornościowego gospodarza. Stąd prowadzone są intensywne badania nad syntetycznymi nośnikami DNA. Liposomy to zamknięte pęcherzyki lipidowe, w których umieszcza się zrekombinowany DNA; zapewnia to ochronę przed nukleazami (enzymy hydrolizujące kwasy nukleinowe). Liposomy mogą być użyte do przenoszenia DNA przez błonę komórkową. Niestety
wydajność tej metody jest niska. Natomiast zaletą tej metody jest fakt braku odpowiedzi
immunologicznej w komórkach zwierzęcych. Jednakże jest to metoda pracochłonna i duże
fragmenty DNA nie zawsze udaje się właściwie zapakować do liposomów bez uszkodzeń.
Obcy DNA może być także wprowadzany do komórek eukariotycznych bez użycia wektora, czyli na drodze bezpośredniego przenoszenia genów. Istnieje kilka metod bezpośredniego transferu fragmentu obcego DNA do komórki docelowej.
Elektroporacja to proces zachodzący w błonie komórkowej pod wpływem wyładowań
pól elektrycznych (milisekundy), który powoduje odwracalne zmiany w błonie komórkowej.
W przypadku komórek drożdży i roślin, ściana komórkowa musi być wcześniej strawiona za
pomocą enzymów; dopiero wtedy powstaje delikatny protoplast zdolny do przyjęcia obcego
DNA. Protoplast jest wystawiony na działanie krótkich impulsów elektrycznych rzędu mikroi milisekund o wysokim napięciu. Następnie protoplast przenoszony jest do pożywki w celu
odtworzenia ściany komórkowej i namnożenia.
Mikrowstrzeliwanie polega na wprowadzeniu DNA opłaszczonego na mikroskopijnych
kulkach złota lub wolframu za pomocą urządzenia zwanego „armatką genową”.
Mikroiniekcja stosowana jest do wprowadzania obcego DNA do komórek zwierząt;
w tym celu trzeba wyizolować zygotę lub wczesny embrion i przy pomocy szklanej mikropipety wprowadzić obcy DNA do jądra komórki. W celu dalszego rozwoju ztransformowaną
komórkę umieszcza się w zastępczej matce. Zaletą tej metody jest wysoka wydajność, lecz
wadą - pracochłonność.
Biotechnologia jest jedną z najszybciej rozwijających się dziedzin nauki. Niesie za sobą
korzyści i niebezpieczeństwa. Zatem należy pamiętać, aby zawsze stawiać pytanie jak daleko
można się posunąć aby nie naruszyć delikatnej równowagi stworzonej przez naturę.
Zalecane piśmiennictwo i strony internetowe:
1. Turner P. C., McLennan A. G., Bates A. D., White M. R. H.,(przekład zbiorowy pod
redakcją Zofii Szweykowskiej-Kulińskiej), Biologia molekularna, Wydawnictwo
Naukowe PWN, Warszawa, 2004.
2. www.biotechnolog.pl
6