Elektroforeza płytowa DNA w żelu poliakrylamidowym

Ćwiczenie 3
Część teoretyczna:
1. Enzymy restrykcyjne.
2. Charakterystyka endonukleaz restrykcyjnych.
3. Zastosowanie endonukleaz restrykcyjnych.
4. Elektroforeza poliakrylamidowa DNA.
Część praktyczna:
Trawienie DNA plazmidowego enzymami restrykcyjnymi
MATERIAŁY
- Próbki DNA plazmidowego oraz DNA genomowego E. coli w buforze TE
- Enzymy restrykcyjne: HinfI, BamHI
- 10x stężone bufory, w których działają dane enzymy restrykcyjne
- H2O (jałowa, redestylowana)
WYKONANIE
Do pojedynczej reakcji trawienia używa się zwykle 0,2 - 1 g DNA w roztworze o
objętości 20 l.
1. Przygotować odpowiednie mieszaniny reakcyjne według wskazań
prowadzącego.
2. Na koniec do każdej próbki dodać 1 jednostkę odpowiedniego enzymu
restrykcyjnego.
3. Inkubować mieszaniny reakcyjne w temperaturze 37C w czasie równym lub
większym od 1 godziny.
4. Przerwanie reakcji (w większości przypadków jest to niekonieczne) można
uzyskać przez termiczną inaktywację restryktazy (15 min, 65C) lub przez
dodanie 0,5 M roztworu EDTA pH = 8,0 do końcowego stężenia 10 mM
(chelatacja jonów magnezu niezbędnych dla aktywności restryktaz).
Elektroforeza płytowa DNA w żelu poliakrylamidowym
MATERIAŁY
- 30% roztwór akrylamidów (29g akrylamidy, 1g N,N’-metylenobisakrylamidy, 70
ml H2O)
- 10% nadsiarczan amonu
- Bufor 10x TBE
- TEMED
- Bufor do nanoszenia próbek na studzienki (40% sacharoza, 0,25% błękit
bromofenolowy lub 15% fikol, 0,25% błękit bromofenolowy, 0,25% cyjan
ksylenu)
- Zestaw do elektroforezy płytowej
- Markery wielkości DNA
WYKONANIE
1. Umyte i odtłuszczone płyty szklane założyć i spiąć klipsami.
2. Uszczelnić i wlać roztwór akrylamidów do momentu wypełnienia całej
przestrzeni pomiędzy płytami. Dla 6% żelu poliakrylamidowego należy
zmieszać:
 30% roztwór akrylamidów
2 ml
 H2O
7 ml
 10xTBE
1 ml
 TEMED
10 l
 10% nadsiarczan amonu
200 l
Całkowita objętość – 10 ml.
3. Po napełnieniu płyt włożyć grzebień. Polimeryzacja żelu trwa od 30 do 60
minut.
4. Po polimeryzacji żelu wyjąć grzebień i wstawić żel do aparatu do
elektroforezy.
5. Napełnić aparat buforem 1xTBE.
6. Do próbek DNA o objętości 20 l, dodać 5 l buforu do nanoszenia.
Jednocześnie przygotować próbkę kontrolną (marker wielkości).
7. Włączyć zasilanie ze stabilizacją prądu do aparatu do elektroforezy (1-6V/cm).
8. Kiedy barwniki w żelu zawędruje do dolnego końca żelu, wyłączyć zasilanie.
9. Wyjąć żel z płyt i umieścić w wanience zawierającej wodny roztwór bromku
etydyny (0,5 g/ml). Barwić żel 10-20 minut.