Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Wydział Biologii i Hodowli
advertisement
Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt Katedra Żywienia Zwierząt i Paszoznawstwa Iga Sobczyk WPŁYW WYBRANYCH SUBSTANCJI PRO-, PREI SYNBIOTYCZNYCH NA ZDROWIE ORAZ OBRAZ HISTOLOGICZNY PRZEWODU POKARMOWEGO SZCZURÓW THE INFLUENCE OF PRO-, PRE- AND SYNBIOTIC SUBSTANCES ON HEALTH AND HISTOLOGICAL PICTURE OF GASTROINTESTINAL TRACK OF RATS Praca doktorska wykonana pod kierunkiem dr hab. Agnieszki Szyszkowskiej, prof nadzw. UP WROCŁAW 2013 Praca doktorska była współfinansowana z Projektu Przedsiębiorczy doktorant inwestycja w innowacyjny rozwój regionu realizowany przez Wydział Rozwoju Gospodarczego Urzędu Marszałkowskiego Województwa Dolnośląskiego w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki, Priorytet VIII Regionalne Kadry Gospodarki, Działanie 8.2 Transfer Wiedzy, Poddziałania 8.2.2 Regionalne Strategie Innowacji. Zadanie współfinansowane ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego 2 PODZIĘKOWANIA Chciałam serdecznie podziekować Pani dr hab. Agnieszce Szyszkowskiej, prof nadzw. UP za nieocenioną pomoc, opiekę, życzliwość oraz wsparcie podczas realizacji pracy. Wyrazy podziękowania składam Wszystkim, którzy przyczynili się do powstania niniejszej pracy. Moją pracę doktorską dedykuję mojemu mężowi i córeczce Autor 3 Streszczenie Wpływ wybranych substancji pro-, pre- i synbiotycznych na zdrowie oraz obraz histologiczny przewodu pokarmowego szczurów Celem przeprowadzonych badaniach była analiza wpływu wybranych dodatków paszowych o charakterze probiotycznym, prebiotycznym i synbiotycznym na parametry żywieniowe szczurów oraz obraz histologiczny jelit i wątroby. Doświadczenia przeprowadzono na szczurach rasy Wistar, które po przydzieleniu do poszczególnych grup żywieniowych otrzymywały w paszy wybrane dodatki paszowe. W każdym z trzech cykli doświadczeń określone zostały przyrosty masy ciała szczurów, pobranie paszy oraz wykorzystanie paszy na jednostkę przyrostu. We krwi tych zwierząt zbadano składniki morfologiczne (WBC, RBC, HGB, HCT, PLT, MCV, MCH, MCHC), a w surowicy krwi poddano analizie składniki biochemiczne (ALT, AST, GGTP, lipaza, á-amylaza) oraz mineralne (Ca, Mg, P nieorg.). Zważona została masa jelit i wątroby oraz zmierzona długość jelit. Wykonano pomiary histomorfometryczne jelit, określono obraz histologiczny jelit i wątroby oraz wykonano badanie immunohistochemiczne jelit. Otrzymane wyniki poddano jednoczynnikowej analizie wariancji (ANOVA) przy użyciu programu komputerowego Statistica StatSoft 8. Istotność różnic oceniono przy użyciu testu Duncana dla poziomu istotności P ≤ 0,05 i P ≤ 0,01. W pierwszym cyklu badań grupy doświadczalne zwierząt otrzymywały w paszy dodatek probiotyku, inuliny oraz probiotyku z inuliną łącznie. W kolejnym doświadczeniu wykorzystano w paszy dodatek probiotyku, oligofruktozy oraz probiotyku z oligofruktozą. Z kolei w ostatnim badaniu szczury karmione były paszą zawierającą synbiotyki: probiotyk z β-glukanem oraz probiotyk z włóknem jabłkowym. Najwyższe przyrosty masy ciała przy obniżeniu wykorzystania paszy na jednostkę przyrostu stwierdzono we wszystkich grupach szczurów otrzymujących w paszy dodatek synbiotyków (probiotyk z inuliną; probioty z oligofruktozą; probiotyk z β-glukanem; probiotyk z włóknem jabłkowym). Zastosowane dodatki zmieniły wysokoistotnie parametry morfologiczne krwi. Probiotyk, inulina oraz oligofruktoza podwyższyły we krwi zawartość krwinek białych (WBC) bez wpływu na parametry biochemiczne oraz na zawartość wapnia i fosforu nieor. w surowicy krwi. 4 Probiotyk z β-glukanem oraz probiotyk z włóknem jabłkowym podwyższyły we krwi stężenie WBC, RBC, ALT, AST oraz zawartość wapnia nie mając wpływu dla długość jelita cienkiego. Pod wpływem zastosowanych synbiotyków wzrosła długość jelita grubego oraz masa jelit. Probiotyk z β-glukanem obniżył grubość błony śluzowej, podśluzowej oraz mięśniowej, skrócił długość kosmków jelitowych i głębokość krypt. Przeciwne parametry histomorfometryczne jelit uzyskano po zastosowaniu w paszy dla szczurów probiotyku z włóknem jabłkowym. Dodatki paszowe zastosowane w trzech cyklach doświadczeń, wyłączając probiotyk z β-glukanem, spowodowały wzrost długości kosmków jelitowych. Wszystkie wykorzystane suplementy wpłynęły na wzrost liczby komórek kubkowych w ścianie jelita cienkiego oraz grubego. Obraz histologicznego jelit i wątroby przedstawiał struktury charakterystyczne dla narządów prawidłowo funkcjonujących bez oznak cytotoksyczności zastosowanych w paszy dla zwierząt dodatków paszowych. Badania immunohistochemiczne ujawniły zwiększoną liczebność komórek układu białokrwinkowego (plazmocytów, limfocytów B) zarówno w błonie śluzowej jelita cienkiego jak i grubego w grupie zwierząt żywionych dodatkiem synbiotyku, co świadczy o pobudzeniu układu odpornościowego przez składniki synbiotyku (probiotyk z oligofruktozą). Słowa kluczowe: szczury, probiotyki, prebiotyki, synbiotyki, jelito, wątroba, histomorfometria, immunohistochemia 5 Summary The influence of pro-, pre- and synbiotic substances on health and histological picture of gastrointestinal track of rats The aim of conducted study was to analyse an influence of chosen fodder supplements - probiotic, prebiotic and synbiotic on nutrition's parameters in rats and histological pictures of intestine and liver. Experiments were conducted on Wistar rats which were divided into feeding groups diversified with the kind of applied supplement. In each of three experiments that were conducted body weight gains, individual feed consumption and feed conversion efficiency (FCR) were determined. In blood samples morphological parameters were assayed (WBC, RBC, HGB, HCT, PLT, MCV, MCH, MCHC), moreover in blood serum biochemical parameters (ALT, AST, GGTP, lipase, á-amylase) and minerals (Ca, Mg, P) were analysed. The weight of the intestine and liver were determined as well the intestine length. The intestine histomorphometry was examined as well as intestine and liver histological picture, moreover immunohistochemical measurement was done. All data are presented as means ± SE. The results were analysed statistically using 1-way analysis of variance (ANOVA) with Statistica StatSoft 8 computer software and the Duncan multiple range test. Differences were considered to be significant at P ≤ 0,05 and P ≤ 0,01. In the first of experiments the animals from experimental groups received in fodder supplements of probiotic, inulin and both probiotic with inulin. In the second experiment in fodders probiotic, oligofructose and both probiotic with oligofructose were applied. In the last experience the rats were received in fodder a supplements of probiotic with β-glucan and probiotic with apple's fibre. The highest body weight gains with simultaneous decrease of feed conversion efficiency (FCR) were observed in all of rats from groups which were received in fodder synbiotic supplements (probiotic with inulin, probiotic with oligofructose, probiotic with β-glucan, probiotic with apple's fibre). Applied supplements has significantly changed morphological parameters in blood samples. Probiotic, inulin and oligofructose increased level of white blood cells (WBC) without influence on biochemical parameters and level of calcium and inorganic phosphorus in serum blood. Probiotic with β-glucan and probiotic with apple's fibre increased level of WBC, RBC, ALT, AST and calcium without influence on length of intestine. 6 The applied synbiotics caused increase of intestinal length and intestinal weight. Probiotic with β-glucan lowered the thickness of tunica mucosa, tunica submucosa and tunica muscularis, reduced length of intestinal villi and crypts depth. The opposite data of histomorphometry parameters were received when fodder was supplemented with probiotic with apple's fibre. Supplements which were used in three experiments with exception of probiotic with β-glucan caused increase of intestinal villi length. All supplements caused growth of number intestinal cells in small and large intestine wall. The histological picture of intestine and liver was corrected without cytotoxic effect of applied in feeds additives. The immunohistochemical examination has showed that synbiotic addition into rats’ feeds influenced on increase of number of immune system cells (plasmocyte, limphocyte B) in tunica mucosa of small and large intestine. Supplementation of synbiotic (probiotic with oligofructose) stimulated immune response. Key words: rats, probiotic, prebiotic, synbiotic, intestine, liver, histomorphometry measurement, immunohistochemistry 7 Spis treści 1.WSTĘP…….…………………………………………………………………..………... 11 2. PRZEGLĄD PIŚMIENNICTWA…………………………………………..…….......... 13 2.1 Charakterystyka probiotyków………………………………………………. 13 2.2 Charakterystyka prebiotyków.……………………………………………… 35 2.3 Charakterystyka synbiotyków……………………………………………… 66 3. CEL PRACY…………………………………………………………………………… 84 4. MATERIAŁ I METODY BADAŃ DOŚWIADCZALNYCH………………………… 82 4.1 DOŚWIADCZENIE PIERWSZE 4.1.1 Zwierzęta.…………………………………………………………………. 85 4.1.2 Pasza i dodatki paszowe………………………………………………….. 85 4.1.3 Układ doświadczenia……………………………………………………… 87 4.1.4 Zabiegi i badania………………………………………………………….. 87 4.2 DOŚWIADCZENIE DRUGIE 4.2.1 Zwierzęta.………………………………………………………………… 91 4.2.2 Pasza i dodatki paszowe………………………………………………….. 91 4.2.3 Układ doświadczenia…………………………………………………….. 92 4.2.4 Zabiegi i badania…………………………………………………………. 92 4.3 DOŚWIADCZENIE TRZECIE 4.3.1 Zwierzęta.…………………………………………………………………. 93 4.3.2 Pasza i dodatki paszowe………………………………………………….. 93 4.3.3 Układ doświadczenia…………………………………………………….. 94 4.3.4 Zabiegi i badania…………………………………………………………. 94 5. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE ………………………………………………………. 95 5.1. DOŚWIADCZENIE PIERWSZE 5.1.1 Przyrosty masy ciała zwierząt doświadczalnych .................................................. 95 5.1.2 Pobranie paszy przez zwierzęta doświadczalne..................................................... 98 5.1.3 Zużycie paszy przez zwierzęta doświadczalne na jednostkę przyrostu [g] .......... 100 5.1.4 Składniki morfologiczne krwi zwierząt doświadczalnych .................................... 102 5.1.5 Składniki biochemiczne krwi zwierząt doświadczalnych ..................................... 104 5.1.6 Wybrane składniki mineralne krwi zwierząt doświadczalnych............................. 107 5.1.7 Długość jelit oraz masa jelit i wątroby zwierząt doświadczalnych……………… 108 5.1.8 Morfometria ściany jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych………………… 111 8 5.1.9 Morfometria ściany jelita grubego zwierząt doświadczalnych…………………. 116 5.1.10 Obraz histologiczny jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych…..………….. 118 5.1.11 Obraz jelita cienkiego z mikroskopu elektronowego- skaningowego (SEM) 121 zwierząt doświadczalnych ………………………………………………………………... 5.1.12 Obraz jelita cienkiego z mikroskopu transmisyjnego (TEM) zwierząt 123 doświadczalnych ………………………………………………………………………….. 5.1.13 Obraz histologiczny jelita grubego zwierząt doświadczalnych………………… 5.1.14 Obraz jelita grubego z mikroskopu elektronowego - skaningowego (SEM) zwierząt doświadczalnych………………………………………………………………... 5.1.15 Obraz histologiczny wątroby zwierząt doświadczalnych……………………… 125 127 129 5.2. DOŚWIADCZENIE DRUGIE 5.2.1 Przyrosty masy ciała zwierząt doświadczalnych ................................................... 131 5.2.2 Pobranie paszy przez zwierzęta doświadczalne..................................................... 133 5.2.3 Zużycie paszy przez zwierzęta doświadczalne na jednostkę przyrostu [g] ........... 135 5.2.4 Składniki morfologiczne krwi zwierząt doświadczalnych .................................... 137 5.2.5 Składniki biochemiczne krwi zwierząt doświadczalnych ..................................... 139 5.2.6 Wybrane składniki mineralne krwi zwierząt doświadczalnych.............................. 140 5.2.7 Długość jelit oraz masa jelit i wątroby zwierząt doświadczalnych………….…. 141 5.2.8 Morfometria ściany jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych………………... 142 5.2.9 Morfometria ściany jelita grubego zwierząt doświadczalnych……………….… 145 5.2.10 Obraz histologiczny jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych……………… 147 5.2.11 Obraz jelita cienkiego z mikroskopu elektronowego- skaningowego (SEM) 149 zwierząt doświadczalnych………………………………………………………………… 5.2.12 Obraz histologiczny jelita grubego zwierząt doświadczalnych ……………….. 151 5.2.13 Obraz jelita grubego z mikroskopu elektronowego- skaningowego (SEM) 153 zwierząt doświadczalnych………………………………………………………………… 5.2.14 Obraz immunohistochemiczny jelit zwierząt doświadczalnych........................... 155 5.2.15 Obraz histologiczny wątroby zwierząt doświadczalnych………………...…….. 158 5.3. DOŚWIADCZENIE TRZECIE 5.3.1 Przyrosty masy ciała zwierząt doświadczalnych ................................................... 159 5.3.2 Pobranie paszy przez zwierzęta doświadczalne.................................................... 161 5.3.3 Zużycie paszy przez zwierzęta doświadczalne na jednostkę przyrostu [g] ........... 162 5.3.4 Składniki morfologiczne krwi zwierząt doświadczalnych .................................... 163 5.3.5 Składniki biochemiczne krwi zwierząt doświadczalnych ..................................... 164 9 5.3.6 Wybrane składniki mineralne krwi zwierząt doświadczalnych............................. 166 5.3.7 Długość jelit oraz masa jelit i wątroby zwierząt doświadczalnych……………… 167 5.3.8 Morfometria ściany jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych………………… 168 5.3.9 Morfometria ściany jelita grubego zwierząt doświadczalnych...………………... 171 5.3.10 Obraz histologiczny jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych………………. 173 5.3.11 Obraz jelita cienkiego z mikroskopu elektronowego- skaningowego (SEM) 175 zwierząt doświadczalnych ………………………………………………………………... 5.3.12 Obraz histologiczny jelita grubego zwierząt doświadczalnych………………… 177 5.3.13 Obraz jelita grubego z mikroskopu elektronowego - skaningowego (SEM) 179 zwierząt doświadczalnych……………………..…………………….……………………. 5.3.14 Obraz histologiczny wątroby zwierząt doświadczalnych ……………………… 181 6. WNIOSKI………………………………………………………………………………. 182 7. SPIS LITERATURY………………………………………………………………….... 183 10 1. WSTĘP Prawny zakaz stosowania antybiotyków paszowych, obowiązujący w krajach członkowskich Unii Europejskiej od 1.01.2006 roku sprawił, że wzrosło zainteresowanie naturalnymi dodatkami paszowymi, których działanie korzystnie wpływa na zdrowie i produkcyjność zwierząt. Zdrowie organizmu to przede wszystkim sprawny układ odpornościowy, który jest w pełnej gotowości do przeciwstawiania się negatywnym czynnikom pochodzącym ze środowiska zewnętrznego. Stąd oczywisty wniosek, że zamiast osłabiać organizm stosując substancje farmakologiczne, których celem jest usunięcie powstałych efektów chorobowych należy skoncentrować się na naturalnym wzmacnianiu sił układu immunologicznego. Stosując odpowiednie dodatki synbiotyczne możemy wpływać na wzrost potencjału systemu obronnego, co ma bezpośrednie przełożenie na wzrost zdrowotności organizmu. Opierając się na wynikach badań dotyczących zastosowania w dawkach pokarmowych dla różnych gatunków zwierząt probiotyków, prebiotyków i synbiotyków postawiono hipotezę, iż wyżej wymienione dodatki paszowe, mogą w sposób naturalny i pozytywny wpłynąć na budowę i funkcjonowanie wybranych odcinków układu pokarmowego zwierząt. Większość prac skupiała się do tej pory na parametrach chemicznych i ekosystemie treści różnych odcinków jelita. Tylko nieliczne badania wskazują na zmiany zachodzące w budowie ścian wybranych przez badaczy odcinków jelita. Trzeba zaznaczyć, że jelita mają kluczowe znaczenie w układzie immunologicznym całego organizmu, co ma bezpośredni wpływ na funkcjonowanie i jakość produktów otrzymywanych od zwierząt. Uważa się również, że jelito jest największym narządem odpornościowym organizmu, gdyż w błonie śluzowej jelita znajduje się ok. 80% wszystkich komórek immunokompetentnych. Z dotychczasowych badań wynika, że dodatki paszowe o charakterze synbiotycznym korzystnie wpływają na funkcjonowanie układu odpornościowego organizmu poprzez zwiększenie m.in. ilości bakterii zakwaszających środowisko jelit (głównie kwasu mlekowego) oraz aktywację tkanki limfatycznej związanej z błonami śluzowymi. W badaniach naukowych wykazano, że niedobór synbiotyków jest przyczyną wielu negatywnych zmian zachodzących w układzie odpornościowym. Podawanie zwierzętom synbiotyków w naturalnej formie zapewnia korzyści zdrowotne oraz zwiększa wydajność zwierząt. 11 Na stan zdrowia ekosystemu jelitowego, a przez to całego organizmu, wpływa niewłaściwie zbilansowana dieta, zanieczyszczenia środowiska i paszy mykotoksynami oraz wiele innych czynników stresogennych. Zaburzenie homeostazy jelita może powodować pobudzanie nieprawidłowych reakcji immunologicznych i rozwój reakcji zapalnych osłabiających wydajność organizmu. Efektem tego są kłopoty z trawieniem i przyswajaniem substancji pokarmowych zawartych w podawanych paszach. Niestety, rozwój cywilizacji, który negatywnie wpływa również na zwierzęta jest główną przyczyną zaburzeń ze strony układu pokarmowego, osłabienia układu odpornościowego, co bezpośrednio wpływa na produkty otrzymywane od zwierząt (mięso, mleko, jaja). Prawie 80% kosztów produkcji zwierzęcej związana jest z nakładem finansowym na odpowiednio dobrane pasze i zbilansowane dawki pokarmowe. Korzyści jakie wynikają z praktycznego zastosowania dodatków paszowych o charakterze synbiotycznym w żywieniu zwierząt hodowlanych polegają na zwiększeniu przyswajania składników pokarmowych zawartych w paszach i regulacji mikroflory jelitowej. Manifestuje się to podwyższoną zdrowotnością organizmu i ma bezpośredni wpływ na obniżenie kosztów utrzymania hodowli oraz lepszą jakość produktu finalnego otrzymywanego od zwierząt. Poprzez wprowadzanie do pożywienia substancji pokarmowych pochodzenia naturalnego możemy pozytywnie stymulować i modyfikować procesy życiowe wewnątrz każdego organizmu. Efektem takich działań jest zmniejszenie zachorowalności i eliminacja patogennych szczepów bakterii zasiedlających ekosystem jelit oraz cały organizm. Największa liczba mikroorganizmów zlokalizowana jest w końcowych odcinkach układu pokarmowego. Wydaje się więc oczywiste, że skład flory bakteryjnej w której odbywa się wiele procesów biochemicznych ma bardzo ważne znaczenie na funkcjonowanie całego organizmu. W chwili obecnej opłacalność produkcji zwierzęcej jest na niskim poziomie. Główną jego przyczyną jest spadek zdrowotności zwierząt, co niestety negatywnie wpływa nie tylko na zaplecze finansowe hodowcy ale bezpośrednio przekłada się na nieodpowiednie wykorzystanie składników pokarmowych zawartych w paszy oraz obniżenie poziomu i jakość produktów otrzymywanych od zwierząt gospodarskich. Zastosowane dodatki paszowe regulują biologiczną równowagę mikroflory układu pokarmowego i redukują skłonność do wystąpienia chorób o podłożu 12 bakteryjnym, wirusowym i grzybiczym. Pozytywnie oddziałują na płodność, rozrodczość i ogólny dobrostan zwierząt przez co bezpośrednio wpływają na zaplecze finansowe hodowcy. 2. PRZEGLĄD PIŚMIENNICTWA 2. 1. Charakterystyka probiotyków Słowo probiotyk pochodzi z języka greckiego „pro bios”, co znaczy „dla życia”. Zgodnie z definicją przedstawioną w 2002 roku przez Organizację Narodów Zjednoczonych ds. Wyżywienia i Rolnictwa (FAO) oraz Światową Organizację Zdrowia (WHO), do probiotyków zaliczymy żywe, niepatogenne mikroorganizmy, w tym szczepy bakterii Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Enterococcus oraz grzyby i drożdże z rodzajów Saccharomyces cerevisiae i Saccharomyces boulardi [FAO/WHO, 2002]. Mikroorganizmy te po wprowadzeniu do wnętrza organizmu wywierają pozytywy wpływ na jego zdrowie i funkcjonowanie oraz procesy życiowe, w efekcie czego wpływają na zmniejszenia ryzyka wystąpienia określonych chorób o podłożu metabolicznym [Fuller, 1991; Simon i wsp., 2001; Isolauri i wsp., 2001; Cani i Delzenne, 2009]. W skład probiotyku lub preparatu probiotycznego może wchodzić odpowiednio wyselekcjonowany pojedynczy szczep bakterii probiotycznych lub mieszanina mikroorganizmów oraz ich metabolitów. Uważa się, że przyczyniają się one do stabilizacji populacji mikroorganizmów jelitowych, jak też i aktywności enzymatycznej w przewodzie pokarmowym danego organizmu, w efekcie czego wpływają pozytywnie na wzrost i rozwój zwierząt [Fuller i Gibson, 1997; Grela i Semaniuk, 1999]. Obecne badania naukowe wciąż dążą do szczegółowego poznania korzyści wynikających z działania łącznego oraz indywidualnego poszczególnych rodzajów, gatunków czy szczepów bakterii probiotycznych. Odkrycie i opublikowanie w 1907 roku przez Iliasa Miechnikova [Nowak i wsp., 2010] zjawiska probiozy - czyli wpływu spożywania fermentowanych napojów mlecznych na stan mikroflory jelitowej -nie zostało w tamtych czasach odpowiednio wykorzystane w sposób praktyczny. Najprawdopodobniej po raz pierwszy termin probiotyk został użyty w roku 1954 przez Ferdinanda Vergio, który w swoim artykule naukowym porównywał działanie antybiotyków oraz probiotyków na mikroflorę jelitową [Nowak i wsp., 2010]. W 1965 roku Lilly i Stillwel [1965] opisali probiotyki, 13 jako ‘’mikroorganizmy stymulujące wzrost innych mikroorganizmów’’. Natomiast w 1974 roku Parker stwierdził, że probiotyki przyczyniają się do zachowania równowagi mikroflory jelitowej gospodarza, a w 1989 roku Fuller [1989] rozszerzył pojęcie probiotyków, jako „żywe, mikrobiologiczne uzupełnienie pokarmu”. Schrezenmeir i De Vrese [2001] zaproponowali, by probiotykiem nazwać „produkt zawierający wystarczającą ilość mikroorganizmów, które zmieniają mikroflorę układu pokarmowego gospodarza i w ten sposób wywierają korzystny wpływ na jego zdrowie’’. Na przestrzeni lat, wraz z postępem badań nad probiotykami, ich definicja była wielokrotnie modyfikowana, rozszerzana i uzupełniana o nowe elementy [Parker, 1974; Fuller, 1989; Schrezenmeir i de Vrese, 2001; Holzapfel i Schillinger, 2002; Saulnier i wsp., 2009; Nowak i wsp., 2010]. Z danych historycznych wynika, że definicja probiotyków nadal może ulegać dalszym zmianom i modyfikacjom, gdyż wiele jest jeszcze obszarów badań naukowych, których celem jest poznanie korzyści wynikających ze stosowania w żywieniu substancji probiotycznych. Probiotyki podawane są najczęściej zwierzętom młodym, a stosowane dawki uzależnione są przede wszystkim od gatunku, wieku zwierzęcia i rodzaju podawanego probiotyku [Janik i Pieszka, 2008]. W zależności od wspomnianych czynników zmienia się ilość dodawanego do diety probiotyku. Dla młodych prosiąt dodatek probiotyku wynosi średnio 1 kg na tonę paszy, dla warchlaków i tuczników 0,2 – 1 kg/t, a dla loch hodowlanych 1 – 2 kg/t. Cielętom do 4 miesiąca życia dodatek probiotyków do paszy określono na 0,2 –1 kg/t, a dla bydła opasowego 1 kg/t., natomiast drób (indyki, brojlery, nioski) w okresie nieśności 0,2 kg/tonę. W procesie technologicznym często stosuje się otoczkowanie mikroorganizmów probiotycznych, co wpływa na zwiększenie ich przeżywalności po wprowadzeniu do układu pokarmowego. Dostępne na rynku preparaty probiotyczne występują w postaci proszku, zawiesiny, granulatu bądź pasty. W produkcji zwierzęcej za składniki probiotyków uważane są głównie szczepy bakterii kwasu mlekowego - Lactobacillus spp.,i Bifidobacterium spp., Leuconostoc spp., Streptococus spp. i Pediococcus spp., [Podkówka i Podkówka, 1995] oraz drożdże i pleśnie- Saccharomyces spp., Torulopsis spp., Aspergillus oryzae [Libudzisz, 2002]. Stosowane są również bakterie tworzące endospory: Bacillus spp., Clostridium butyricum oraz natywne kultury, pozyskiwane z przewodu pokarmowego zwierząt, jako względne beztlenowce [Simon i wsp., 2001]. 14 Probiotyki dostarcza się zwierzętom wraz z wodą pitną bądź jako dodatek do paszy pełnoporcjowej lub premiksu [Janik i wsp., 2006]. Technologia uzyskiwania mikroorganizmów używanych do produkcji probiotyków jest objęta ścisłą tajemnicą. Wiadomo jednak, iż materiałem wyjściowym są szczepy bakteryjne naturalnie zasiedlające przewód pokarmowy zwierząt dla których dany preparat jest przeznaczony [Janik i Pieszka, 2008]. Uzyskiwany w ten sposób materiał biologiczny jest najlepiej przystosowany do warunków panujących w przewodzie pokarmowym określonego gatunku zwierząt, co ułatwia ich kolonizację w błonie śluzowej jelit. Probiotyki rejestrowane są na okres jednego roku, ze względu na możliwość modyfikacji działania niektórych szczepów bakterii w zależności od środowiska i czasu stosowania. Rejestracja bezterminowa dotyczy preparatów probiotycznych zaliczanych do grupy konserwantów – stosowanych przy zakiszaniu pasz. Preparaty probiotyczne muszą być bezpieczne i niepatogenne dla zwierząt, nie mogą produkować toksyn, a także zanieczyszczać produktów pochodzenia zwierzęcego. Probiotyki dla zwierząt sporządza się z mikroorganizmów izolowanych ze światła ich przewodu pokarmowego, ponieważ szczepy bakterii powinny być dostosowane do specyfiki poszczególnych zwierząt gospodarskich, co ułatwia ich kolonizację w przewodzie pokarmowym. Aby dany szczep mikroorganizmów mógł być uznany za probiotyczny należy udowodnić jego przydatność do poprawy parametrów użytkowych oraz musi spełniać określone kryteria dotyczące stanu zdrowia zwierząt. Substancja probiotyczna powinna na opakowaniu zawierać szczegółową informację o zastosowanym probiotycznym szczepie bakterii lub grzybów (tj. rodzaj, gatunek, szczep) oraz informacje dotyczące minimalnej ilości żywych bakterii probiotycznych do daty końca przydatności do zużycia. Według Libudzisz [2002] probiotyki lub preparaty probiotyczne produkowane dla przemysłu paszowego powinny cechować się następującymi właściwościami: Muszą posiadać dokładnie zidentyfikowane pochodzenie, gatunek, szczep oraz przeprowadzone badania in vitro i in vitro na modelach zwierzęcych potwierdzające ich bezpieczeństwo stosowania i mechanizmy działania. Muszą mieć wykonane randomizowane, kontrolowane badania z podwójnie ślepą próbą z placebo na zwierzętach/ludziach lub inne odpowiednio zaprojektowane badania spełniające międzynarodowe kryteria. 15 Powinny wykazywać odporność na niską wartość pH soku żołądkowego i soli żółci oraz zdolność do natychmiastowego, dynamicznego namnażania się w przewodzie pokarmowym i konkurencyjność wobec drobnoustrojów patogennych. Probiotyki powinny utrzymywać odpowiedni poziom kwasowości (pH) treści jelitowej oraz zwiększać aktywności enzymów przewodu pokarmowego. Wymagana jest odporność na działanie temperatury i ciśnienia w procesie granulowania, a także poziom wilgotności i ewentualnego oddziaływania metali ciężkich podczas obróbki i magazynowania. Ten sam autor podaje rodzaje i gatunki drobnoustrojów probiotycznych, które zestawiono poniżej w tabeli. Tabela 1. Rodzaje i gatunki drobnoustrojów probiotycznych [Libudzisz, 2002] Rodzaj Gatunek Aspergillus A. oryzae, A.niger Bacillus B. subtilis, B. toyot Bifidobacterium B. bifidum, B. pseudolongum, B. adolescentis B. infantis B. breve, B. animals B. longum, B. thermophilum B. bifidum, B. pseudolongum Clostridum C. butyricum Enterococcus E. faecium, E. faecalis L. bulgaricus, L. acidophilus; L. brevis, L. delbrucekii; L.lactis Lactobacillus L.fermentum; L. casei, L. farciminis, L. rhamnosus L.reuteri, L. helveticus, L. salivarius, L. plantarum, L. sporogenes L. salivarius, L. plantarum, L. sporogenes Leuconostoc L. mesentereides Pediococcus P. acidilactici, P. damno sus, P. pentosaceus Streptococcus S. thermophilus, S. intermedius, S. infantarius Saccharomyces S. cerevisiae, S.boulardi, S. carlsbergensis Wpływ probiotyków na organizm zwierząt W ostatnich latach szeroko rozpowszechniane są probiotyki, którym przypisuje się właściwości zdrowotne i lecznicze w przypadku ich stosowania u ludzi oraz zwierząt [Nowak i wsp., 2010; Kapka-Skrzypczak i wsp., 2012]. Odpowiednio dobrane 16 szczepy bakterii probiotycznych, które zasiedlają przewód pokarmowy, w sposób naturalny uniemożliwiają nadmierny rozwój patogennych mikroorganizmów oraz zapewniają optymalne trawienie i lepsze wykorzystanie paszy przez zwierzęta [Grela i Semaniuk, 1999]. Uzupełnienie diety w odpowiednie gatunki bakteryjne o właściwościach probiotycznych umożliwia utrzymanie odpowiedniego poziomu homeostazy przewodu pokarmowego, zwiększa tolerancję organizmu na niesprzyjające bodźce zewnętrzne, wzmaga przyswajalność składników pokarmowych, natomiast w przypadku potrzeby stosowania antybiotyków w żywieniu chorych przyspiesza okres rekonwalescencji [Depta, 2001; Śliżewska i wsp., 2006; Libudzisz, 2008; Giang, 2010]. Wysoka aktywność biologiczna probiotyków sprawia, że preparaty zawierające określone mikroorganizmy są i będą coraz częściej stosowane w profilaktyce oraz lecznictwie zarówno zwierząt jak i ludzi. Probiotyki, będące głównie bakteriami kwasu mlekowego, po doustnym podaniu rozwijają się w przewodzie pokarmowym zwierząt uniemożliwiając rozwój bakterii chorobotwórczych [Fuller i Gibson, 1997; El-Banna i wsp., 2010]. Redukcję bakterii patogennych tłumaczy się często ścisłym pokryciem kosmków jelitowych przez bakterie probiotyczne. Obecność probiotyków w dawce pokarmowej sprzyja lepszemu wykorzystaniu składników pokarmowych paszy co przekłada się na wyższe przyrosty masy ciała u tych zwierząt [Aboderini i Oyetano, 2006; Wang i wsp., 2009]. Dzieje się tak dzięki wytworzeniu przez nie własnych enzymów wspierających działanie trawienne enzymów pokarmowych zwierząt. Substancje te poprzez produkcję kwasów organicznych (głównie mlekowego), obniżają poziom pH treści przewodu pokarmowego, powodując zahamowanie rozwoju lub ograniczenie wzrostu bakterii chorobotwórczych (głównie z rodzajów Clostridium sp.,Staphylococcus, Listeria, Escherichia coli, Salmonella sp., Shigella) [Kubik i wsp., 2006]. Bakterie probiotyczne produkują również nadtlenek wodoru (H2O2) oraz bakteriocyny o charakterze antybiotycznym (acidofilina, bakteriocyna, laktobacilina i rusina), które wpływają hamująco na rozwój drobnoustrojów chorobotwórczych. Bakteriocyny są związkami heterogennymi, różniącymi się budową chemiczną i właściwościami biochemicznymi oraz odpowiednim zakresem aktywności. Uważane są one za naturalne substancje antybiotyczne o działaniu bakteriobójczym i bakteriostatycznym [Prost, 1999; Depta, 2001]. W tabeli 2 zestawiono dane dotyczące produkcji bakteriocyn przez odpowiednie grupy bakterii probiotycznych. 17 Tabela 2. Substancje antybakteryjne (bakteriocyny) probiotyków [Prost, 1999] Bakteria probiotyczna Bakteriocyny Lactobacillus acidophilus acydolna , acidofilina laktacyna B Lactobacillus plantarum plantacyna, plantarycyna, plantarycyna s/k 83 Lactobacillus reuterii Lactobacillus sake reuteryna sakacyna A laktozyna S nizyna Streptococcus Według Depty [2001] bakterie kwasu mlekowego swój probiotyczny efekt uzyskują poprzez produkcję czynników antagonistycznych do których należą m.in.: kwasy organiczne (mlekowy, octowy), niskocząsteczkowe produkty przemiany materii (diacetyl, kwas-2-pirolino-5-karboksylowy, kwas piroglutaminowy oraz wspomniane wcześniej bakteriocyny). Natomiast supresyjne działanie probiotyków związane jest z wytwarzaniem substancji antykancerogennych (chromocyna A3, sarkomycyny, neokarcinomycyny). Stosowanie probiotyków w żywieniu zwierząt przyczynia się do zachowania odpowiedniej równowagi mikro środowiska w przewodzie pokarmowym oraz łagodzenia stresów przy braku optymalnych warunków środowiskowych, co stwarza podstawę do ciągłej i wysokiej wydajności zwierząt. Ponadto szczepy probiotyczne u osobników młodych redukują straty hodowlane powodowane biegunkami, zmniejszając ich ilość i czas trwania [Taras i wsp., 2006 i 2007], poprawiają wykorzystanie paszy oraz wzrost przyrostów dziennych i skracają okres tuczu (np. u tuczników) [Dziuba i Tokarska, 2001]. Dodatek bakterii probiotycznych do dawki pokarmowej dla zwierząt powoduje szerokie spektrum pozytywnych działań. Poprzez stymulację układu odpornościowego wzrasta zdrowotność organizmów, co ma korzystny wpływ na wykorzystanie składników pokarmowych, makroelementów i witamin oraz zmniejszenie stężenia toksyn w paszach powodując wzrost przyrostów masy ciała i lepszą jakość produktów finalnych otrzymywanych od zwierząt (mleko, mięso, jaja, skóra). Probiotyki skutecznie zmniejszają translokacje bakterii jelitowych w obrębie każdego organizmu. Nasilają one motorykę jelit, utrzymują prawidłową homeostazę bakteryjną wewnątrz organizmu oraz wspomagają układ odpornościowy, który jest podstawą prawidłowego funkcjonowania zdrowego organizmu. Bakterie probiotyczne 18 wspomagają specyficzne i niespecyficzne mechanizmy obronne zarówno człowieka, jak i zwierząt [Fuller, 1989; Gibson i Roberfroid, 1995]. Inną właściwością przypisywaną probiotykom jest obniżenie lub łagodzenie nietolerancji na laktozę, ponieważ bakterie probiotyczne uwalniają enzym- galaktozydazę w końcowej części przewodu pokarmowego, wspomagają hydrolizę laktozy w jelitach. Ma to duże znaczenie, gdyż pośród czynników niezakazanych powodujących nieżyt przewodu pokarmowego dość duże znaczenie przypisuje się nietolerancji pokarmowej na dwucukry występującej u osobników cierpiących na niedobór bądź brak enzymów rozszczepiających wspomniane dwucukry [Depta, 2001; Dziuba i Tokarska, 2001]. Według Zduńczyka [2002] aktywność bakterii probiotycznych eliminuje z paszy substancje kancerogenne i toksyczne oraz ogranicza rozwój komórek nowotworowych wskutek wyparcia bakterii produkujących w jelicie grubym amoniak, aminy alifatyczne, indole, fenole oraz związki siarki. Ponadto, probiotyki obniżają napięcie ścianek jelit poprzez zahamowanie fermentacji bakteryjnej, której efektem jest powstawanie gazów (H2, CO2, H2S, CH4) oraz ułatwienie defekacji poprzez osmotyczne zwiększenie masy stolca. Probiotyczne preparaty podawane zwierzętom w paszy lub aplikowane oralnie wykazują korzystny wpływ na ich wzrost, przez stymulujące oddziaływanie na przewód pokarmowy oraz procesy w nim zachodzące. Właściwie dobrane szczepy probiotyczne warunkują lepsze przyswajanie substancji pokarmowych z paszy, regulując równocześnie równowagę mikroflory jelitowej zwierząt [Grela i Semeniuk, 1999; Depta, 2001]. Efektem ich działania jest także redukcja liczby bakterii patogennych, które dostają się do wnętrza organizmu razem z wodą i paszą. Bardzo istotną cechą probiotyków jest to, że jako substancje naturalne nie powodują skutków ubocznych i nie powodują odkładania się szkodliwych substancji obcych, dlatego nie potrzebują okresu karencji, a także nie ma niebezpieczeństwa ich przedawkowania. Wspólną cechą probiotyków jest biologiczna aktywność oraz naturalne pochodzenie, co sprawia, że stosowanie preparatów probiotycznych nie jest kwestionowane, a także cieszy się dużą akceptacją wśród producentów pasz, osób zajmujących się żywieniem zwierząt, a także wśród lekarzy weterynarii. 19 Żywe kultury drożdży z gatunku Saccharomyces cerevisiae Poza bakteriami do grupy probiotyków zalicza się także żywe komórki drożdży z gatunku Saccharomyces cerevisiae. Drożdże stosuje się w żywieniu zwierząt jako źródło białka – drożdże paszowe oraz w niewielkiej ilości pod postacią żywych kultur (probiotyk) [Śliżewska i wsp., 2006]. Drożdże mogą być podawane w czystej postaci lub wchodzić w skład mieszanych preparatów probiotycznych. Największe znaczenie w żywieniu przeżuwaczy mają drożdże Saccharomyces cerevisiae, gdyż stymulują rozwój bakterii cellulolitycznych i proteolitycznych, zwiększają w żwaczu rozkład włókna (ADF), przyczyniają się do wzrostu ilości kwasu propionowego oraz podwyższają strawność azotu i wykorzystanie energii paszy [Nocek i wsp., 2002; Dobicki i Preś, 2006]. Czynniki te wpływają na lepsze pobranie oraz wykorzystanie paszy, wyższą syntezę białka bakteryjnego, a przez to wyższą wydajność zwierząt [Gedek, 1994; Dobicki i Preś, 2006]. Ściany komórkowe drożdży Saccharomyces cerevisiae zbudowane są z sacharydów, w skład których wchodzą β-D-glukany oraz mannany. Wśród polisacharydów ściany komórkowej możemy wyróżnić trzy główne grupy. Do pierwszej z nich zaliczamy polimery mannozy (mannanoproteiny), które stanowią 40% suchej masy komórek, a do drugiej polimery glukozy (β-glukan), które tworzą 60% suchej masy ściany komórkowej. β-glukan dzieli się z kolei na 2 podtypy w zależności od sposobu przyłączenia glukozy. Jeden z nich występuje w ilości do 90% s.m. ściany komórkowej w formie długich łańcuchów, na które składa się 1500 jednostek β-(1-3)glukozy. Z kolei krótsze łańcuchy tworzą glukopiranozy w układzie wiązań β-(1-6) i stanowią one 8-18% s.m. ściany komórkowej [Waszkiewicz- Robak, 2006]. Trzecią grupą polisacharydów ścian komórkowych drożdży są polimery N-acetyloglukozaminy (zwane chityną) wchodzące w zaledwie 2% suchej masy [Waszkiewicz-Robak, 2006]. Substancje te przyczyniają się do wzmacniania układu immunologicznego oraz poprawy funkcjonowania układu rozrodczego [Dobicki i Preś, 2006]. Ponadto stymulują procesy przemiany bakterii celulolitycznych żwacza u przeżuwaczy oraz działają stabilizująco na pracę jelit poprzez poprawę strawności suchej masy organicznej oraz redukują nieprawidłową fermentację oraz biegunki. Pozytywny rezultat stosowania drożdży Saccharomyces cerevisiae wiąże się z ich wybiórczym wpływem na drobnoustroje bytujące w przewodzie pokarmowym, gdyż wywierają korzystny wpływ na ilość pożądanych bakterii fermentacji mlekowej, a 20 jednocześnie obniżają poziom bakterii chorobotwórczych [Dobicki i wsp., 2005; Dobrzański i wsp., 2006]. Pofermentacyjne drożdże piwowarskie (Saccharomyces cerevisiae) są produktem ubocznym procesu warzenia i stanowią 2-3% całkowitej produkcji piwa. Według Jaehrig i wsp., [2008] w światowej produkcji piwa odpady drożdży stanowią do 48 mln hl/rok. Większość z tych drożdży jest sprzedawana jako pasza dla zwierząt. Często jednak odpady te nie są zagospodarowane z nieocenioną stratą dla przemysłu paszowego. W suchej masie drożdży browarnianych znajduje się około 54% białka ogólnego, trawionego w 90%, 10-15% kwasów nukleinowych wykorzystywanych do syntezy aminokwasów endogennych [Dobicki i wsp., 2004]. Komórki drożdży wykorzystywane są jako bioregulatory, które po wprowadzeniu do przewodu pokarmowego zwierzęcia utrzymują prawidłową równowagę mikroflory zapobiegając jednocześnie biegunkom i zatruciom toksynami paszowymi (DON, Zearalenol, Aflatoksynę B1, Ochrotoksynę A). Drożdże piwne są doskonałym źródłem białka i aminokwasów, a w szczególności lizyny, której niedobór powoduje zahamowanie wzrostu i rozwoju zwierząt młodych [Dobicki i wsp., 2005 i 2007; Yousefi i Karkoodi, 2007]. Witaminy z grupy B zawarte w drożdżach piwnych warunkują prawidłowy przebieg procesu trawienia i wchłaniania, co przekłada się na odpowiednie wykorzystanie składników pokarmowych zawartych w paszach oraz wzrost masy ciała zwierząt gospodarskich [Dobicki i wsp., 2004; Fuchs i wsp., 2005; Dobrzański i wsp., 2006]. Mechanizmy działania probiotyków Analizując zarówno biochemiczny jak i biologiczny mechanizm działania probiotyków należy zwrócić uwagę na różnorodność pełnionych przez nie funkcji w organizmie ludzi oraz zwierząt. Mikroorganizmy probiotyczne charakteryzują się przede wszystkim bardzo dobrą adhezją, kolonizacją oraz odpowiednim namnażaniem się i przeżywalnością w przewodzie pokarmowym gospodarza. Ponadto odporne są na warunki niskiego pH soku żołądkowego, co powoduje wzrost pożądanej populacji bakteryjnej w przewodzie pokarmowym oraz wykazują konkurencyjność w stosunku do patogennej mikroflory jelit. 21 Bakterie probiotyczne wspomagają specyficzne i niespecyficzne mechanizmy obronne człowieka i zwierząt. Badania przeprowadzone przez Libudzisz [2002] wykazały, że dzienne wzbogacenie diety w 109-1012 komórek bakterii probiotycznych powoduje wzrost liczby naturalnych komórek bójczych w surowicy krwi oraz zwiększa aktywność makrofagów i limfocytów. Stwierdzono ponadto zwiększenie poziomu interferonu gamma (INFγ) i immunoglobuliny IgA w surowicy krwi. Pojawiły się również informacje dokumentujące, że immunomodulacyjne działanie bakterii kwasu mlekowych może dodatkowo zmniejszać reakcje uczuleniowe. Wyjaśnia się to zjawisko wzrostem produkcji interferonu gamma (INFγ), który przeciwdziała syntezie immunoglobulin E (IgE) uaktywniających się w reakcjach alergicznych. W badaniach na zwierzętach wykazano także, że probiotyki mogą hamować rozrost niektórych komórek nowotworowych [Rafter i wsp., 2004]. Wykazano bowiem, że dla uzyskania wyraźnych efektów zdrowotnych niezbędne jest minimalne podawanie około 108-109 komórek żywych mikroorganizmów dziennie [Libudzisz, 2008]. Probiotyki działają za pośrednictwem układu limfatycznego, który jest związany z przewodem pokarmowym (układ GALT, ang. gut-associated lymphoid tissue), będącego integralną częścią układu limfatycznego związanego z błonami śluzowymi (układ MALT, ang. mucosa associated lypmhoid tissue). Bakterie probiotyczne stymulują produkcję podstawowych komórek układu immunologicznego, uszczelniają barierę jelitową, pośrednicząc w procesie fagocytozy, wpływając na aktywację i różnicowanie limfocytów [Pickard i wsp., 2004; Zimmermann i wsp., 2001] oraz aktywują produkcję cytokin regulujących odpowiedź organizmu na patogeny wnikające do jego wnętrza. Ponadto stymulują nieswoiste mechanizmy obronne takie jak: produkcja przeciwciał, dojrzewanie bariery jelitowej, odpowiadają za utrzymanie równowagi cytokinowej Th1/Th2 przez aktywację regulujących limfocytów T. Według Lasek, [2002] oraz Lasek i wsp., [2008] błona śluzowa w układzie pokarmowym narażona jest na ciągły kontakt z olbrzymią liczbą czynników zewnętrznych, które wnikając razem z pożywieniem czy wodą mają różny wpływ na stan śluzówki jelit. Mechanizmy obronne układu pokarmowego funkcjonują bardzo precyzyjnie. Z jednej strony indukowana jest odpowiedź immunologiczna w stosunku do czynników chorobotwórczych i patogennych, z drugiej zaś wyciszane są reakcje w stosunku do fizjologicznej mikroflory, w tym probiotyków. 22 Niepatogenne bakterie jelitowe mają podstawowe znaczenie w dojrzewaniu i rozwoju układu odpornościowego związanego z błonami śluzowymi jelita (tzw. układu MALT) w skład, którego wchodzą m.in. limfocyty B i T, komórki fagocytarne oraz komórki plazmatyczne uwalniające immunoglobuliny IgA. Działanie probiotyku związane jest z indukcją reakcji immunologicznych przez receptory rozpoznające charakterystyczne struktury mikroorganizmów patogennych [Marco i wsp., 2006]. W procesie aktywacji układu immunologicznego podstawową rolę odgrywają receptory z rodziny TLR (Toll like receptors), które są zlokalizowane na enterocytach (komórkach jelit) i licznych komórkach układu immunologicznego mających bezpośredni kontakt z czynnikami patogennymi i drobnoustrojami chorobotwórczymi [Rakoff-Nahoum i wsp., 2004: Galdeano i wsp., 2007]. Mechanizm działania immunomodulującego bakterii probiotycznych nie jest jednoznacznie wyjaśniony, ale wiele wskazuje na to, że może być związany z obecnością w ścianie komórkowej bakterii komponentów o charakterze antygenu, np. lipopolisacharydy i peptydoglukany. Ich obecność stymuluje leukocyty do produkcji cytokin sygnalizacyjnych i zapoczątkowania reakcji immunologicznych przeciwko patogenom pochodzenia bakteryjnego, wirusowego czy grzybiczego [Herich i wsp., 2002]. Z drugiej strony, przywracając równowagą mikrobiologiczną, bakterie te ograniczają występowanie stanów nadwrażliwości śluzówki jelit, co łagodzi ewentualne stany zapalne w przewodzie pokarmowym i biegunki [Galdeano i wsp., 2007; Saulnier i wsp., 2009]. Immunomodulacyjne działanie bakterii kwasu mlekowego w zakresie różnych mechanizmów odporności zostało udowodnione w badaniach modelowych na myszach, w których obserwowano, między innymi, podwyższoną produkcję cytokin, IFN-γ, IL-4, IL-5, wzrost aktywności makrofagów i limfocytów oraz zwiększoną syntezę immunoglobulin [Pickard i wsp., 2004]. Uważa się, że probiotyki odpowiedzialne są za wydzielanie czynników wpływających na modulowanie odpowiedzi immunologicznej [Iyer i wsp., 2008, Yasuda i wsp., 2008; Thomas i Versalovic, 2010]. Korzystny wpływ probiotyków na śluzówkę jelit (Ryc. 1) przedstawił na schemacie Saulnier i wsp., [2009]. 23 Ryc. 1 Działanie probiotyków na poziomie błony śluzowej jelita cienkiego [Saulnier i wsp., 2009]. Z przeglądu literatury dotyczącej obrazu histologicznego jelit wynika, że probiotyki mają zdolność do wiązania i degradacji potencjalnych karcynogenów, a także do indukcji enzymów biorących udział w ich metabolizmie. U zwierząt monogastrycznych, głównym miejscem działania dodatków paszowych o charakterze probiotycznym jest rąbek szczoteczkowy jelita cienkiego, który zapobiega przyleganiu patogenów, toksyn oraz obcych mikroorganizmów do nabłonka ściany jelit. Pod wpływem stosowania probiotyków występują różnorodne zmiany w błonie śluzowej jelit [Frias i wsp., 2009; Ross i wsp., 2010], w tym takie, które zmieniają wchłanianie składników pokarmowych [Lodemann i wsp., 2006]. Zmiany, jakie można zauważyć w obszarze obrazu histologicznego jelita cienkiego jak i grubego uzależnione są przede wszystkim od składu diety i uznawane są za jedną z głównych i podstawowych przyczyn zachorowalności u zwierząt. Badania na modelach zwierzęcych dostarczają coraz więcej dowodów naukowych, które wskazują na duże znaczenie zarówno probiotyków, prebiotyków jak i synbiotyków w walce ze zmianami chorobotwórczymi jelit. Jednak dotychczasowe wyniki badań są ciągle niejednoznaczne i niewystarczające do potwierdzenia hamowania procesów zapalnych przez te składniki czy suplementy diety [Rafter, 2004; Gibson i Roberfroid, 2008]. Bakterie probiotyczne mają zdolność do wiązania i degradacji potencjalnych karcynogenów, a także do indukcji enzymów biorących udział w ich metabolizmie 24 przez co wzrasta zainteresowanie probiotykami wykorzystywanymi w celach profilaktycznych oraz terapeutycznych [Kapka-Skrzypczak i wsp., 2012]. Wyniki licznych badań in vitro i in vivo [Geier i wsp., 2007; Olejnik i wsp., 2010] wskazują, że substancje probiotyczne hamują rozwój początkowych niekorzystnych zmian jakie można zauważyć w obrazie histologicznym jelit u szczurów i u myszy [Ishida-Fujii i wsp., 2007, Lutgendorff i wsp., 2009]. W badaniach naukowych dotyczących histologii obrazu mikroskopowego jelit i wątroby coraz częściej wskazuje się na wspólną rolę probiotyków [Rafter, 1995 i 2004], prebiotyków [Gibson i Roberfroid, 1995; Wollowski i wsp., 2001] oraz synbiotyków [Gibson i Roberfroid, 2008] w zapobieganiu zmian chorobotwórczych jelit na tle czynników żywieniowych oraz środowiskowych. Według najnowszej literatury z zakresu obrazu histologicznego jelit [Verghese i wsp., 2002; Frence i wsp., 2009; Lutgendorf i wsp., 2009; Ross i wsp., 2010], najwcześniej rozwijającymi się prekursorami zmian błony śluzowej jelit, jakie można zauważyć pod mikroskopem to tzw. ogniska nieprawidłowych krypt ACF (z ang. Aberrant Crypt Foci). Zastosowanie probiotyków w żywieniu zwierząt Drób Zastosowanie szczepów probiotycznych w żywieniu kurcząt rzeźnych [Jin i wsp., 1996 i 2000], indyków rzeźnych [Capcarová i wsp., 2008] oraz brojlerów [Alkhalf i wsp., 2010] miało korzystny wpływ na przyrosty masy ciała oraz wykorzystanie paszy. Wyższe przyrosty (P≤0,01) oraz lepsze wykorzystanie paszy u brojlerów kurzych potwierdzili również Brzóska i wsp., [1999]. Kaczki otrzymujące w diecie dodatek probiotyku miały wyższą (P≤0,01) masę ciała, wyższe pobranie paszy i lepsze wykorzystanie paszy, jednak parametry te nie wpłynęły na masę mięsa poubojowego [Wang i Zhou, 2007]. Wzrost przyrostów masy ciała po zastosowaniu w mieszankach paszowych dodatku szczepów probiotycznych stwierdzono u kur [Capcarová i wsp., 2010] oraz kurcząt brojlerów [Brzóska i wsp., 1999 i 2008]. Wraz ze wzrostem ilości zastosowanych w paszy (0,5-2,0%) probiotycznych drożdży Saccharomyces cerevisiae istotnie wzrastała masa ciała kurcząt jak podają w swojej pracy Shareef i Al-Dabbagh [2009]. 25 Suplementacja diety probiotykiem przyczyniła się do rozwoju korzystnej mikroflory jelit poprzez wzrost liczby lotnych kwasów tłuszczowych (SCFA) w jelicie krętym, a także obniżenie wartości pH jelita ślepego brojlerów [Jin i wsp., 1997, 1998 i 2000]. Probiotyki korzystnie wpłynęły na liczbę erytrocytów (RBC), poziom hemoglobiny (HGB) oraz cholesterolu we krwi brojlerów bez wpływu na liczbę leukocytów (WBC), albumin i globulin [Al-Kassie i wsp., 2008]. Z kolei Četin i Guclu [2005] stwierdzili wzrost liczby krwinek czerwonych (RBC), wartości hemoglobiny (HGB), hematokrytu (HCT) oraz immunoglobulin klasy IgG oraz IgM. Niektórzy autorzy są zdania, że zastosowanie probiotyku u indyków rzeźnych [Capcarová i wsp., 2008] oraz u brojlerów [Brzóska i wsp., 1999; Alkhalf i wsp., 2010] nie miało wpływu na zmianę wskaźników hematologicznych krwi. Pod względem wskaźników biochemicznych zauważono obniżenie stężenia triglicerydów we krwi u kurcząt [Capcarová i wsp., 2011] oraz cholesterolu u kur [Capcarová i wsp., 2008]. Podawanie brojlerom w paszy probiotyków wpłynęło stymulująco na tkankę limfoidalną oraz zwiększenie odporności poprzez wzrost poziomu limfocytów T [Dalloul i wsp., 2003] i aktywności bakteriobójczej heterofilów, a także wzmocnienie systemu odpornościowego [Alkhalf i wsp., 2010]. Podawanie kurczętom Lactobacillus acidophilus i Lactobacillus casei wywołało wzrost poziomu immunoglobuliny IgA w surowicy krwi bez wpływu na wartość IgG [Huang i wsp., 2004]. Inne badania [Četin i Guclu, 2005; Haghighi i Gong, 2006; Ogawa i Asai, 2006] wykazały pozytywny wpływ zastosowanych w diecie probiotyków na układ immunologiczny poprzez zwiększenie poziomu immunoglobulin klasy IgG i IgM w surowicy krwi, a także immunoglobulin IgA i IgG w treści jelit u kurcząt. Omawiane substancje wpłynęły znacząco na produkcję przeciwciał u drobiu poprzez wzrost ich poziomu w surowicy krwi [Panda i wsp., 2000; Haghighi i wsp., 2005; Rowghani i wsp., 2007], a także zmieniły parametry immunologiczne i hematologiczne krwi [Gill i wsp., 2001]. W obrazie histologicznym jelita ślepego oraz w błonie podśluzowej wola zidentyfikowano wyraźną mitozę komórek i wzrost wielkości jąder komórkowych [Kabir i wsp., 2005] oraz wzrost masy bursy Fabryciusza, która odpowiedzialna jest za wytwarzanie limfocytów B i leukocytów. W zależności od potencjału genetycznego, wieku i typu użytkowego ptaków oraz różnej dawki zastosowanego w diecie szczepu Pedicoccus acidilactis uzyskano 26 odmienny wpływ na układ pokarmowy i odpornościowy [Koenen i wsp., 2004; Lee i wsp., 2007]. W badaniach Samanya i Yamauchi [2002] oraz Chichlowskiego i wsp., [2007] probiotyki wpłynęły na wzrost wysokości kosmków jelitowych w jelicie cienkim u brojlerów i kurcząt oraz u kur niosek [Mahdavi i wsp., 2005]. Ponadto wpłynęły na złagodzenie zmian degeneracyjnych kosmków jelitowych wywołanych deoxyniwalenolem (DON) [Awad i wsp., 2009]. Probiotyki zastosowane przez Jin i wsp., [2000] w diecie kurcząt rzeźnych nie miały wpływu na masę jelita cienkiego, jelita grubego i wątroby. Trzoda chlewna Probiotykom przypisuje się dodatni wpływ na wzrost masy ciała i przyrosty u trzody chlewnej [Podkówka i Podkówka, 1995; Rekiel i Kulisiewicz, 1996; Grela i Semeniuk, 1999; Simon i wsp., 2001; Grela, 2004; Mikołajczak i wsp., 2004]. Pozytywne zmiany w zakresie przyrostów masy ciała u prosiąt, warchlaków i tuczników żywionych paszą z dodatkiem probiotyków stwierdzili również Rekiel i Kulisiewicz [1996], Siuta, [2000], Simon i wsp., [2001], Van Heugten i Dorton, [2001], Bobel i Sokół, [2002], Rekiel, [2002], Taras i wsp., [2005, 2006]. Wpływ zastosowanych w paszy probiotyków odzwierciedla się głównie na poprawie strawności składników pokarmowych oraz pod względem cech produkcyjnych (wyższe przyrosty masy ciała i lepsze wykorzystanie paszy) co potwierdza wielu autorów [Simnon i wsp., 2001; Bobel i Sokól, 2002; Ross i wsp., 2010; Wang i wsp., 2009; Kenny i wsp., 2011] przy jednoczesnej redukcji padnięć [Siuta, 2000; Mokrzycka i Michałowski, 2001]. Prosięta otrzymujące w diecie probiotyki odznaczały się lepszą żywotnością, wyższą przeżywalnością oraz wzrostem cech produkcyjnych (P≤0,001) przy zmniejszonej częstotliwości i ostrości biegunek oraz liczebności padnięć na tym tle [Siuta, 2000]. Po zastosowaniu szczepu Lactobacillus acidophilus uzyskano porównywalne wartości badanych wskaźników biochemicznych surowicy krwi jak przy stosowaniu antybiotyków, co świadczy o skuteczności stosowania probiotyków, jako naturalnych stymulatorów wzrostu [Rekiel, 2002]. Probiotyki obniżyły poziomu poziom triglicerydów [Rekiel i wsp., 2008] oraz cholesterolu [Rekiel i Gajewska, 2006], a 27 probiotyczne drożdże wpłynęły na wyższy poziom IgG w surowicy krwi badanych zwierząt [White i wsp., 2002]. Większą zdolność fagocytarną leukocytów (P≤0,05) i wyższe miano przeciwciał przeciwko Escherichia coli oraz obniżenie poziomu Escherichia coli w kale zwierząt [Scharek i wsp., 2007] było efektem stosowania dodatku do diety probiotyku. Badania post mortem przewodu pokarmowego, ujawniły korzystne zmiany mikroflory jelit u zwierząt otrzymujących szczep bakterii Pediococcus acidilactici MA18/5M. Stwierdzono wzrost liczebności bakterii fermentacji mlekowej oraz zmniejszenie ilości bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, co najprawdopodobniej może przeciwdziałać powstawaniu wolnych rodników [Rekiel i wsp., 2008]. Stosowanie w diecie dodatku probiotyków ograniczyło emisję przez te zwierzęta do środowiska amoniaku [Wang i wsp., 2009] oraz siarkowodoru [Mokrzycka i Michałowski, 2001; Ushida i wsp., 2003; Chen i wsp., 2006]. W hodowli trzody chlewnej często występującym problemem są nieżyty przewodu pokarmowego prosiąt objawiające się biegunką. Powodowane jest to zaburzeniami mikroflory jelitowej, stresem, spożyciem nieświeżej paszy oraz przedwczesnym odsadzeniem. Podawanie preparatów probiotycznych w tym okresie życia prosiąt zwiększa odporność na infekcje bakteryjne przewodu pokarmowego. Przewaga probiotycznej mikroflory mobilizuje immunologicznie śluzówkę jelit, a na drodze mechanicznego zasiedlania tworzy naturalną barierę przeciw czynnikom patogennym. W konsekwencji prowadzi to do zmniejszenia zachorowalności oraz padnięć prosiąt [Mokrzycka i Michałowski, 2001;Taras i wsp., 2007; Siuta, 2000; Scharek i wsp., 2007]. Doświadczalnie wykazano, że probiotyki zmniejszyły ryzyko wystąpienia choroby obrzękowej u prosiąt odsadzonych [Paluch i wsp., 2006] oraz wykazały właściwości przeciwpasożytnicze [Bautista-Garfias i wsp., 2001]. Podawanie szczepu Bacillus cereus var. toyoi lochom i prosiętom skutkowało wzrostem komórek T CD8+ w śródbłonku i limfocytów Tγδ oraz limfocytów T CD24+ u prosiąt odsadzonych. Badania te pokazują, że wpływ probiotyku jest szczególnie ważny do momentu odsadzenia prosiąt [Scharek i wsp., 2007] i jest ważnym czynnikiem, korzystnie oddziałującym na prosięta w późniejszych etapach. Ponadto mleko loch, które otrzymywały w diecie aktywne drożdże Saccharomyces cerevisiae, zawierało istotnie więcej suchej masy, białka ogólnego i gamma globulin [Jurgens i wsp., 1997]. 28 Wzrost zawartości kwasu mlekowego, octowego i propionowego w jelicie krętym i okrężnicy [Ross i wsp., 2010] oraz większe i lepsze rozwiniecie struktur morfotycznych jelit to efekt zastosowania w diecie probiotyków [Marinho i wsp., 2007; Siggers i wsp., 2008; Ross i wsp., 2010]. Przydatność zastosowania probiotyków w żywieniu zwierząt wielokrotnie została wykazana, choć ze zmiennym skutkiem, w odniesieniu do wskaźników produkcyjnych. Kritas i Morrison, [2004], Min i wsp., [2004] oraz Taras i wsp., [2007] nie potwierdzają wpływu zastosowanych probiotyków na przyrosty masy ciała i wykorzystanie paszy. Nie wykazano wpływu na wartość pH, zawartość we krwi triglicerydów, bakterii kwasu mlekowego w kale oraz emisję H2S i merkaptanu [Wang i wsp., 2009]. Przeżuwacze Pierwsze próby zastosowania bakterii probiotycznych w żywieniu młodego bydła miały miejsce w latach siedemdziesiątych dwudziestego wieku. Głównym ich celem było zapobieganie oraz redukcja nieżytów układu pokarmowego objawiających się biegunką u cieląt [Szyszkowska i wsp., 1984]. W cyklu badań polskich naukowców [Szyszkowska i wsp., 1984; Kwiatkowski i wsp., 1985] jako probiotyczny stymulator wzrostu cieląt zastosowano liofilizowany szczep Streptococcus faecium. Pierwsze próby wykorzystania tego typu dodatku w żywieniu cieląt nie przyniosło oczekiwanych korzyści gdyż badacze ci nie stwierdzili pozytywnego wpływu na przyrosty masy ciała oraz ilość zużytej paszy na jednostkę przyrostu. Zastosowany szczep nie miał wpływu na ograniczenie częstości występowania biegunek i nie ograniczył zjawiska dysbiozy przewodu pokarmowego młodych zwierząt. Wyższą masę ciała cieląt odnotowali Bakr i wsp., [2009] oraz Al-Saiady [2010] po dodaniu bakterii probiotycznych do paszy standardowej. Pozytywne wyniki na tej samej grupie zwierząt uzyskali Jatkauskas i Vrotniakiene [2010], którzy suplementowali preparaty mlekozastępcze szczepem Enterococcus faecium M74 i stwierdzili wzrost masy ciała, przyrostów masy ciała oraz poprawę (P≥0,05) wykorzystania mleka przy obniżeniu częstotliwości występowania biegunek. 29 Trzeba jednak wspomnieć, że w doświadczeniu na cielętach żywionych paszą z dodatkiem szczepów Enterococcus faecium, Bacillus subtilis oraz Lactobacillus casei, Berleć i Traczykowski [2004] nie wykazali wpływu czynnika probiotycznego na zdrowie oraz zawartość makroelementów w surowicy krwi cieląt. Badania przeprowadzone na krowach mlecznych potwierdzają pozytywny wpływ stosowania drożdży piwnych na wzrost wydajności mlecznej, stymulację przemiany materii oraz stabilizację i regulację flory żwacza i jelit [Schwartz i wsp., 1994; Kuczaj i wsp., 2010]. Doświadczalnie stwierdzono, że u tej grupy zwierząt żywe kultury drożdży wspomagają trawienie, zapobiegają zaburzeniom przemiany materii oraz chorobom metabolicznym (kwasica, ketoza). Wykazano również, że stosowanie w dawce pokarmowej preparatów zawierających w swoim składzie drożdże piwne zmniejszyły zanieczyszczenie paszy substancjami szkodliwymi oraz mykotoksynami (dezoksynivalenol, zearalenon, ochratoksyna A) [Whitlow i wsp., 2000; Dobicki i Preś, 2006]. Żywe komórki drożdży z gatunku Saccharomyces cerevisiae, według Strusińskiej i wsp., [2003] zwiększyły biodostępność składników mineralnych, koncentrację mikroelementów (Zn, Fe, Cu), oraz witamin (E, A, β-karoten). Probiotyczne drożdże przyczyniły się do wyższego poziomu parametrów biochemicznych we krwi (białka i glukozy) wpływając tym samym na stan zdrowotny i wzrost mleczności zwierząt. Badania nad wzrostem biodostępności pierwiastków po zastosowaniu w diecie drożdży piwnych prezentowali w swojej pracy przeprowadzonej na owcach Abdelrahman i Hunaiti [2008], co skutkowało zwiększeniem wydajności mleka (P≤0,01) i wyższym poziomem suchej masy mleka i tłuszczu mlecznego w 70 dniu laktacji [Lachowski, 2000]. Dodatek kultur drożdży wpłynął na rozwój brodawek żwacza oraz na metabolizm azotu w żwaczu. Badania te potwierdzili Dobicki i wsp., [2007], Mašek i wsp., [2008], Bruno i wsp., [2009]. Należy wspomnieć, że w badaniach Bruno i wsp., [2009] dodatek żywych kultur Saccharomyces cerevisiae (30g/dzień) nie miał wpływu na pobranie paszy i kondycję krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej. Po wprowadzeniu krowom [Wang i wsp., 2001] oraz kozom mlecznym [Abd ElGhani, 2004] do dawki pokarmowej kultur Saccharomyces cerevisiae istotnie wzrosła ich mleczność, zawartość energii, białka, suchej masy i masy nietłuszczowej mleka w porównaniu do grupy kontrolnej. Według Hadjipanayiotou i wsp., [1997] podawanie kultur drożdżowych mlecznym owcom i krowom nie miało wpływu na wzrost mleczności oraz skład chemiczny mleka. 30 Dodatek drożdżowy pozytywnie wpłynął na użytkowość tuczną jagniąt, przyrosty dobowe i wykorzystanie paszy oraz użytkowość rzeźną z wyszczególnieniem wyższej masy udźca i większej powierzchni oka polędwicy [Milewski, 2009]. Dodatek probiotycznych drożdży piwnych znacząco zredukował emisję siarkowodoru i merkaptanu do środowiska, obniżył wartość pH gnojowicy oraz podniósł wydajność mleczną przy niższym pobraniu suchej masy paszy (P≤0,05) i lepszym wykorzystaniu paszy u bawołów [Gujjar i wsp., 2006]. Zwierzęta laboratoryjne Według licznych autorów [Shu i wsp., 1999; Dock i wsp., 2004; Urdaneta i wsp., 2007; Alves de Azerědo i wsp., 2010] zastosowanie w diecie u szczurów probiotycznych szczepów bakterii nie wpłynęło na końcową masę i przyrosty masy ciała tych zwierząt. Wzrost masy ciała po wykorzystaniu w diecie u tych zwierząt szczepu Lactobacillus plantarum wykazał Aboderin i Oyetayo [2006]. Dodatek probiotycznych szczepów bakterii w diecie u szczurów [Alves de Azerědo i wsp., 2010; De Azeredo i wsp., 2010] nie miał wpływu na wielkość spożycia paszy. Istnieją doświadczenia w których szczury otrzymujące w paszy dodatek szczepu probiotycznego odnotowały niższą masą ciała [Tanida i wsp., 2008], przeciwnie do wyników badań uzyskanych przez Aboderin i Oyetayo [2006], w których stwierdzono istotne (P≤0,05) zwiększenie masy ciała i przyrostów masy ciała u szczurów otrzymujących w diecie probiotyk. Stosowanie bakterii Lactobacillus i Bifidobacterium w diecie u myszy nie wpłynęło na końcową masę i przyrosty masy ciała tych zwierząt [El-Jakee i wsp., 2010]. Z kolei istotne zwiększenie masy ciała myszy stwierdzono w innych badaniach [Gill i wsp., 2001, Shu i Gill, 2002; Wagner i wsp., 2009]. Według Chaucheyras-Durant i Durant [2010] najlepsze probiotyki wykorzystywane jako dodatki paszowe w żywieniu zwierząt monogastrycznych to drożdże z gatunku Saccharomyces cereviviae i Saccharonyces boulardi oraz bakterie probiotyczne (Lactobacillus spp., Enterococcus spp., Pediococcus spp., Bacillus spp.), których zastosowanie ma istotny wpływ na wyższe przyrosty masy ciała tych zwierząt. 31 Podawanie w paszy dla szczurów dodatku probiotyków wpłynęło (P≤0,05) na zmianę wartości wskaźnika hematokrytowego (HCT), wzrost liczby płytek krwi (PLT), leukocytów (WBC) [Nara i wsp., 2009; De Azeredo i wsp., 2010] oraz stężenia RBC, PCV i HGB [Aboderin i Oyetayo, 2006], a obniżenie stężenia ALT-u [Adawi i wsp., 2001]. Badania przeprowadzone przez [Aboderin i Oyetayo, 2006] wykazały immunostymulujące właściwości probiotyku, wzrost wartości PCV, HGB, RBC oraz podwyższenie liczby leukocytów i limfocytów w surowicy krwi szczurów. Według Usman’a i Hosono’a [2001] probiotyki obniżyły poziom lipidów w surowicy krwi szczurów oraz supresje resorpcji kwasów żółciowych, co w konsekwencji potwierdza ich hypocholesterolemiczny efekt działania. Stwierdzono też wzrost zawartość sodu (P≤0,05), magnezu i potasu (P≥0,05) w surowicy krwi [Urdaneta i wsp., 2007] bez wpływu na stężenie wapnia, amylazy i lipazy [Nara i wsp., 2009]. Zdolność przylegania szczepów probiotycznych do błony śluzowej jelita szczurów oraz wzmożoną konkurencyjność wobec szczepów chorobotwórczych wykazały badania opublikowane przez Adawi i wsp., [1997], Mangel i wsp., [2006] oraz Laudanno i wsp., [2008]. Probiotyczne bakterie Laktobacillus wzmocniły odpowiedz immunologiczną związaną z procesem zapalenia błony śluzowej jelit u szczurów [Frias i wsp., 2009] oraz zapobiegły zmianom morfologicznym błony śluzowej jelit pod wpływem czynników uszkadzających. Probiotyki ograniczyły również ilości krypt (P<0,05) w dystalnej części jelita grubego w grupie szczurów otrzymujących szczep Bacillus polyfermenticus SCD, według Lee i wsp., [2007] sugeruje to skuteczność w terapii antynowotworowej. Peran i wsp., [2005, 2006] i Geier i wsp., [2007] wskazują na możliwość wykorzystania szczepów Bifidobacterium lactis, Lactobacillus casei i Lactobacillus acidophilus jako potencjalnych środków wspomagających leczenie nieswoistego zapalenia jelita grubego (IBD- z ang. - inflammatory bowel disease) oraz szczepu Lactobacillus paracasei w profilaktyce leczenia otyłości [Tanida i wsp., 2008]. Szczep Bifidobacterium lactis najskuteczniej zredukował u szczurów biegunki, a także podniósł poziom glutationu (P<0,05), który jest istotnym antyoksydantem korzystnie wpływającym na kondycję jelit, a jego poziom obniżył się na skutek stresu oksydacyjnego [Peran i wsp., 2006]. Probiotyki pozytywnie wpłynęły na masę jelit [Dock i wsp., 2004; Fåk i wsp., 2008], objętość błony śluzowej [Dock i wsp., 2004] oraz długość kosmków jelitowych i 32 głębokość krypt jelitowych [Buts i wsp., 1994, Ichikawa i wsp., 1999; Dock i wsp., 2004; Zareie i wsp., 2006; Geier i wsp., 2007]. Wykazano również znaczący wzrost proliferacji enterocytów (jejunum) [Mogilner i wsp., 2007] oraz redukcję występowania przewlekłych zapaleń okrężnicy, wrzodów żołądka i trzustki [Sushma i wsp., 2009]. Probiotyczne Bifidobacterie mogą być wykorzystywane w zapobieganiu bakteryjnym translokacjom (BT) pod wpływem czynników uszkadzających organizm. Według wielu autorów [Zimmermana i wsp., 2001; Dock i wsp., 2004; Juśkiewicz i wsp., 2007; Urdaneta i wsp., 2007] zastosowanie probiotyku w diecie dla szczurów nie wpłynęły na długość jelita cienkiego i grubego oraz masę wątroby [Dock i wsp., 2004; Urdaneta i wsp., 2007; Fåk i wsp., 2008]. Zareie i wsp., [2006] nie stwierdzili zmian w głębokość krypt jelitowych w jelicie cienkim u szczurów oraz długość kosmków jelitowych w jelicie cienkim u myszy [Allori i wsp., 2000]. Hamowanie procesu karcynogenezy w obrazie histologicznym jelit wykazano przy zastosowaniu bakteryjnych szczepów Lactic acid bacterium, Lactobacillus acidophilus, L. gasseri, L. confusus, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium breve, B. longum [Goldin i Gorbach 1980; Pool- Zoobel i wsp., 1996] oraz Lactobacillus bulgaricus i Streptococcus thermophilus [Wollowski i wsp., 2001]. Gallaher i Khil, [1999] oraz Juśkiewicz i wsp., [2007] potwierdzają skuteczność diety zawierającej zarówno probiotyki jak i prebiotyki w profilaktyce zmian komórkowych obrazu histologicznego jelit. Szczepy bakterii probiotycznych wykazały zdolność do obniżania aktywności enzymów bakteryjnych, które stymulują karcynogenezę komórek nabłonka jelit [Nowak i wsp., 2010]. Ponadto, po zastosowaniu w diecie probiotyków stwierdzono lepiej rozwinięte obszary i struktury morfologiczne błony śluzowej jelit [Adawi i wsp., 1997: Le Leu i wsp., 2005; Mangel i wsp., 2006; Peran i wsp., 2006; Zareie i wsp., 2006; Geier i wsp., 2007; Laudanno i wsp., 2008; Frias i wsp., 2009; Sushma i wsp., 2009; Ross i wsp., 2010]. Myszy otrzymujące w diecie szczepy probiotyczne Lactobacillus rhamnosus HN001, Lactobacillus i Bifidobacterium wykazały istotne (P≤0,05) zwiększenie masy ciała [Gill i wsp., 2001; Shu i Gill, 2002; Wagner i wsp., 2009]. Z kolei El-Jakee i wsp., [2010] podali, że szczepy Lactobacillus i Bifidobacterium nie miały wpływu na końcową masę, przyrosty masy ciała oraz spożycie paszy u tych zwierząt. Pozytywny wpływ zastosowanego dodatku probiotyku do diety dla mysz na parametry morfologiczne krwi odnotowali Gill i wsp., [2001] oraz Medici i wsp., 33 [2004].Według Zhou i wsp., [2000] zastosowanie w paszy dodatku Lactobacillus rhamnosus, L. acidophilus oraz Bifidobacterium lactis nie wpłynęło na poziom RBC, HGB, HCT we krwi u myszy. Probiotyki wpłynęły na wzrost aktywności enzymów jelitowych wspomagających trawienie białek i obniżenie indeksu glikemicznego [Urdaneta i wsp., 2007] oraz aktywność fagocytarną makrofagów otrzewnowych [Ishida-Fujii i wsp., 2007] bez wpływu na poziom cytotoksyczności komórek NK (z ang. Natural Killer) oraz immunglobuliny IgA [Ishida-Fujii i wsp., 2007]. Szczep probiotyczny Enterococcus faecium w diecie u myszy [Maia i wsp., 2001] spowodował istotne zmniejszenie rozwoju Salmonella thypimurium, Clostridium oraz Bacterioides spp. w przewodzie pokarmowym badanych zwierząt. Wagner i wsp., [2009] donoszą, że Lactobacillus i Bifidobakterie mogą stanowić utrudnienie w zasiedleniu przewodu pokarmowego myszy przez Camphylobacter jejuni. Suplementacja diety probiotykami okazała się nieskuteczna w przypadku ograniczenia oporności Salmonelli, mimo to prowadziła do skuteczniejszej walki z infekcją i szybszego wyzdrowienia. Według Lutgendorff i wsp., [2009] dodatek probiotyków zwiększył poziom glutationu (GSH) w błonie śluzowej (P≤0,001) i zastymulował jego produkcję w jelicie, osłabiając oksydacyjne uszkodzenia w błonie śluzowej ochraniając komórki przed uszkodzeniem ze strony toksyn. Probiotyki zastosowane w dawce pokarmowej nie miały wpływu na długość kosmków jelitowych w jelicie cienkim myszy [Allori i wsp., 2000] oraz zmianę masy narządów wewnętrznych w tym wątroby i jelit [Urdaneta i wsp., 2007]. Suplementacja diety szczepami Bifidobacterium, Lactobacillus, Streptococcus thermophilus u mysz z niealkoholowym stłuszczeniem wątroby obniżyło zapalenie i stłuszczenie tego narządu oraz usprawniło jego funkcję [Li i wsp., 2003]. 34 2.2 Charakterystyka prebiotyków Zarówno samą koncepcję, jak i świadome stosowanie prebiotyków w diecie wprowadzono znaczniej później niż w przypadku probiotyków [Hamilton-Miller, 2004]. Prebiotyki po raz pierwszy w literaturze zostały zdefiniowane przez Gibsona i Roberfroid’a w 1995 roku [Gibson i Roberfroid, 1995] jako „nieprzyswajalne składniki pokarmowe, które korzystnie wpływają na gospodarza poprzez selektywną stymulację wzrostu i/lub działania określonej liczby bakterii w jelicie grubym, a tym samym poprawiając zdrowie gospodarza’’. Aktualna definicja określa prebiotyki jako niestrawne składniki pożywienia, które korzystnie wpływają na gospodarza przez selektywną stymulację wzrostu i/lub modyfikację aktywności metabolicznej jednego lub określonej liczby gatunków bakterii obecnych w okrężnicy [Roberfroid, 1999; Ohimain i Ofongo, 2012]. Po wprowadzeniu do wnętrza organizmu prebiotyki wykazują odporność na enzymy, procesy trawienne i wchłanianie zachodzące w górnym odcinku układu pokarmowego oraz podlegają procesowi fermentacji w dolnym odcinku układu pokarmowego gospodarza. Prebiotyki zostały zaklasyfikowane jako składniki odżywcze jelit (z ang. specific colonic nutrient) [Roberfroid, 2005; Wang, 2009]. Podstawową kwestią zawartą w obydwu powyższych definicjach jest fakt, że prebiotyki posiadają selektywny wpływ na mikroflorę jelitową, co w rezultacie poprawia zdrowie organizmu, który je przyjmuje razem z pożywieniem [Gibson i wsp., 2004]. Według Libudzisz [2002] aby dane składniki żywności mogły zostać uznane jako prebiotyki muszą spełniać określone wymagania: nie mogą ulegać wchłanianiu i trawieniu przez enzymy trawienne ssaków, powinny stymulować wzrost i aktywność pożądanych bakterii w przewodzie pokarmowym, głównie Bifidobakterii, produkty ich rozkładu przez bakterie jelitowe powinny obniżać pH treści pokarmowej, muszą mieć znaną i udokumentowaną budowę chemiczną oraz powinny być łatwe do uzyskania w skali przemysłowej. Zwiększenie ilości prebiotyków w dawce pokarmowej zmienia rodzaj oraz liczebność mikroorganizmów w jelitach. Wpływa to na wzrost i jakość pożytecznej mikroflory jak i ograniczenie ilości bakterii patogennych oraz produktów ich przemiany 35 materii, co w efekcie stymuluje odporność organizmu [Grela i Semeniuk, 2006] i wydzielanie immunoglobulin klasy IgA [Roberfroid i wsp., 2010]. Działanie substancji prebiotycznych oraz wpływ na stan śluzówki jelit przedstawiono poniżej (Ryc. 3). Rycina 3. Działanie prebiotyków na poziomie błony śluzowej jelita [Saulnier i wsp., 2009]. Ca2+ - wapń, GLP-1 glukagonopodobny peptyd 1, Gpr41 -proteina związana z receptorem 41; SCFA – krótko łańcuchowe kwasy tłuszczowe. Gibson i Roberfroid [2008] wyszczególniają dwie kategorie tzw. substancji odżywczych dla jelit. Za główną substancję uważane jest włókno pokarmowe (z ang. DF - dietary fibers), które wchodzi w skład niestrawnych węglowodanów i podlega częściowej lub całkowitej fermentacji przez poszczególne mikroorganizmy jelitowe. Kolejną grupą są specyficzne substancje odżywcze (np. fruktany), które dostarczają substratów metabolicznych oraz prekursorów biosyntezy i kofaktorów jako związków niezbędnych do katalizowania określonych reakcji chemicznych dla poszczególnej grupy mikroorganizmów. Reasumując powyższe informacje można stwierdzić, że prebiotyki wpływają znacząco na modyfikację mikroflory jelitowej, obniżają poziom pH w jelitach, przyczyniają się do wzrostu absorbcji związków mineralnych oraz produkcji witamin, wpływają na metabolizm lipidów oraz węglowodanów, zapobiegają infekcjom, 36 biegunkom i zaparciom oraz redukują ryzyko powstania zmian nowotworowych [Wang, 2009; Roberfroid i wsp., 2010]. Substancje prebiotyczne stymulują wzrost pałeczek kwasu mlekowego, głównie z rodzaju Bifidobacterium, przez co uważane są za tzw. czynnik bifidogenny stymulujący rozrost kolonii bakterii w jelicie. Mechanizm efektu bifidogennego jest związany z selektywną fermentacją fruktanów przez Bifidobakterie, które syntetyzują αfruktozydazę, enzym rozkładający wiązania α-1,2-glikozydowe inuliny i oligofruktozy. Wprowadzenie lub zwiększenie prebiotyków w diecie korzystnie wpływa na selektywne pobudzanie wzrostu i aktywności wybranych szczepów bakterii jelitowych oraz hamowanie rozwoju i namnażania patogenów flory jelitowej przez zmniejszenie przylegania tych mikrobów do ścianek nabłonka jelitowego [Kleessen i wsp., 2001; Roberfroid, 2007, Saulnier i wsp., 2007; Charalampopoulos i Rastall, 2012]. Wskutek blokowania adhezji mikroorganizmów oraz receptorów patogennych na prebiotyki powierzchni wpływają na śluzówki wzrost jelit dla wskaźników produkcyjnych zwierząt oraz podnoszą zdrowotność organizmu. Prebiotyki ulegając fermentacji w jelitach mają wpływ na wartość pH oraz ilość wytworzonych kwasów SCFAs, które w 95% ulegają szybkiemu wchłanianiu przez nabłonek jelit [Roberfroid i wsp., 2010]. Według niektórych autorów [Seifert i Watzl, 2007] mechanizmy, za pośrednictwem których prebiotyki wywierają pożądany wpływ na organizm gospodarza nie zostały jeszcze w pełni poznane. Jak dotąd można jedynie przypuszczać, że prebiotyki w tym oligosacharydy, są częściowo absorbowane w przewodzie pokarmowym w niezmienionej postaci, co może prowadzić do ich bezpośredniego lub miejscowego kontaktu z komórkami układu odpornościowego organizmu i wywoływać efekt uważany powszechnie za immunomodulacyjny. Od kilku lat, zarówno naukowcy jak i lekarze dostrzegli istotną rolę oraz potrzebę utrzymywania odpowiedniej homeostazy środowiska mikroflory jelitowej ze względów medycznych oraz żywieniowych. 37 Podział prebiotyków Prebiotyki, w tym błonnik pokarmowy i fruktany należą do substancji, które tak jak wspomniano na wstępie nie ulegają trawieniu w przewodzie pokarmowym ze względu na brak w soku żołądkowym, trzustkowym i jelitowym enzymów hydrolizujących wiązania β (2~1) glikozydowe. Substancje te jednak ulegają częściowej hydrolizie w środowisku kwaśnym. Prebiotyki należą do węglowodanów i są klasyfikowane według ich masy cząsteczkowej oraz stopnia polimeryzacji DP (liczby monosacharydów budujących jednostkę) do monosacharydów (tagatoza), oligosacharydów i polisacharydów. Wśród oligosacharydów możemy wyróżnić krótkołańcuchowe fruktooligosacharydy FOS - (oligofruktoza), ketozę oraz mannano-oligosacharydy (MOS). Inne substancje stosowane w paszy jako oligosacharydy to galaktooligosacharydy (GOS), transgalakto-oligosacharydy (TOS), sojo-oligosacharydy (SOS), izomalto-oligosacharydy (IMO) i xylo-oligosacharydy (XOS) [Roberfroid, 2007]. Do tej grupy należy również laktuloza i palatynoza. Aktualnie, obiecującą alternatywą do syntezy nowych oligosacharydów są oligoglukany, oligochitosany i oligogalakturany. Prebiotycznym działaniem wyróżniają się między innymi niestrawne oligosacharydy (NDO-s, z ang. non-digestible oligosaccharides), stanowiące grupę krótkołańcuchowych cukrów złożonych, których zróżnicowana budowa chemiczna powoduje, że nie są hydrolizowane w układzie trawiennym człowieka, a także zwierząt monogastrycznych, a metabolizm ich zachodzi dopiero w okrężnicy pod wpływem bytujących tam drobnoustrojów [Wang, 2009]. W przemyśle paszowym sacharydy te mają bardzo długą historię stosowania i są uznawane za bezpieczne. Konfiguracja cząsteczki węgla decyduje o tym czy dany cukier wykazuje czy też nie aktywność hydrolityczną na enzymy trawienne gospodarza. Główną kategorią podziału niestrawnych oligosacharydów jest obecność fruktozy, galaktozy, glukozy lub xylozy [Mussatto i wsp., 2009]. Z kolei długołańcuchowe do polisacharydów zaliczamy fruktooligosacharydy (inulina), skrobię oporną glukany, chemicznie, glukomannany, polidekstrozę oraz niskocukrowe alkohole (laktitol, sorbitol, maltitol, ksylitol). Do prebiotyków możemy zaliczyć również nieskrobiowe polisacharydy (pektyny, celulozy, hemicelulozy, gumę guar, xylan), oligosacharydy z rodziny rafinoz 38 (ORR) oraz oligosacharydy sojowe (rafinoza, stachioza, werbaskoza) [Smiricky i wsp., 2002] i stachylozę. Błonnik pokarmowy, zwany też włóknem pokarmowym stanowi element żywności pochodzenia roślinnego o charakterze polisacharydowym i niepolisacharydowym, który występuje w naturze pod wieloma postaciami. Definicja błonnika charakteryzuje go jako kompleks heterogennych składników ścian komórkowych roślin, nie podlegających procesowi trawienia pod wpływem enzymów pokarmowych. Ze względu na zdolność rozpuszczania błonnika możemy wyróżnić frakcję rozpuszczalną i nierozpuszczalną w wodzie. Jest to bardzo istotny podział gdyż decyduje on o dalszym wpływie tych substancji na parametry procesu trawienia [Gibson i Roberfroid, 2008]. Błonnik rozpuszczalny w wodzie zwiększa swoją objętość i tworzy rodzaj substancji, która wyglądem i konsystencją przypomina galaretowaty żel. Do tej frakcji możemy zaliczyć pektyny, które występują przeważnie w owocach miąższowych (jabłka, marchew, czereśnie, gruszki, morele) oraz cytrusach i owocach jagodowych. Najwięcej pektyn znajduje się w porzeczkach, a najskuteczniejszy błonnik pektynowy pochodzi z jabłek i owsa. Błonnik, który nie podlega rozpuszczeniu w wodzie posiada zdolność do pochłaniania wody, przez co pęcznieje, zwiększa swoją objętość i w sposób mechaniczny drażni i stymuluje do ruchu i biologicznej funkcji ścianę jelit. Ten rodzaj błonnika to przede wszystkim celulozy, które występują głównie w otrębach pszennych oraz w roślinach kapustnych, korzennych, szparagach, łupinach fasoli, ryżu, kukurydzy, orzechach. Najwięcej celulozy zawierają nasiona lnu oraz bawełny. Duże ilości tego rodzaju substancji znajdują się również w pełnych ziarnach zbóż. Ten rodzaj błonnika pomaga eliminować z organizmu toksyny, metale ciężkie, kwasy żółciowe i niektóre azotyny, które należą do substancji powodujących rozwój nowotworów. Wpływ włókna pokarmowego na wzrost parametrów zdrowotnych oraz immunologicznych dokładnie został opisany przez Brownlee [2011]. W ostatnich latach wzrosło zainteresowanie wzbogacaniem diety błonnikiem jabłkowym ze względu na jego cenne biologiczne właściwości oraz znaczną ilość pektyn. Pektyny, jako polisacharydy o zmiennym składzie otrzymywane są ze ściany komórkowej roślin wyższych. Pod względem chemicznym są polisacharydami o 39 strukturze liniowej utworzonej z cząsteczek kwasu galakturonowego, połączonych wiązaniami α-1,4-glikozydowymi, w znacznej części zestryfikowanych grupami metylowymi (Ryc. 4) [Aprikian i wsp., 2003]. Kwasy poligalakturonowe (tzw. kwasy pektynowe) zawierają w swoim łańcuchu od kilkuset do ok. 1000 cząsteczek kwasu galakturonowego. Wolne grupy kwasowe mogą być częściowo lub w pełni zneutralizowane za pomocą jonów sodu, potasu lub amonu. Stopień polimeryzacji kwasu galakturonowego decyduje o właściwościach żelujących pektyny, natomiast stopień estryfikacji określa szybkość żelowania oraz temperaturę żelowania pektyny. Omawiana grupa polisacharydów jest dobrze rozpuszczalna w wodzie, a nierozpuszczalna w rozpuszczalnikach organicznych. Ryc. 3 Wzór chemiczny pektyny [Aprikian i wsp., 2003]. Dieta bogata we włókno jabłkowe, w którego składzie dominują pektyny, powoduje głównie wzrost koncentracji kwasów SCFAs w jelicie ślepym w szczególności kwasu masłowego i izomasłowego oraz wzrost koncentracji poliamin w tym diaminy-kadaweryny w treści jelitowej u szczurów [Rao i wsp., 1998; Aprikian i wsp., 2003]. Stwierdzono również wpływ zastosowanych w diecie pektyn na wzrost ilości kwasu octowego w jelicie szczurów [Sembries i wsp., 2006] oraz wpływ na wzrost liczby Bacterioides [Sembries i wsp., 2003], Eubacteria, Clostridia, Lactobacilli, Enterobacteria i Streptococci w treści jelitowej u myszy [Tamura i wsp., 2007]. Pektyny powodują znaczący rozrost kolonii bifidobacterii i lactobacilli oraz wzrost metabolizmu cholesterolu, w tym koprostanolu. Wraz ze wzrostem liczby kolonii fusobacterium w treści jelitowej wzrasta stężenie poliamin o właściwościach biologicznych i terapeutycznych. Wielu autorów [Brown i wsp., 1979; Aprikian i wsp., 2003; Sembries i wsp., 2003; Tamura i wsp., 2007] zwraca uwagę na prozdrowotne 40 właściwości po zastosowaniu w diecie pektyn, w tym na działanie immunomodulujące [Brownlee, 2011]. Zastosowanie dodatku pektyn do diety szczurów wpłynęło (P≤0,01) na obniżenie masy i przyrostów masy ciała oraz pobrania suchej masy paszy. Współczynniki strawności poszczególnych składników pokarmowych były (P≤0,01) niższe u osobników otrzymujących w diecie dodatek pektyn [Pirman i wsp., 2009]. Pektyny obniżyły głównie strawność białka oraz aminokwasów, co potwierdziły badania wykonane na świniach [Mosenthin i wsp., 1994; Zhu i wsp., 2005; LibaoMercado i wsp., 2006]. Doświadczenie wykonane przez Pirmana i wsp., [2007] wykazało, że zastosowanie dodatku pektyn obniżyło masę ciała i przyrosty masy ciała szczurów oraz pobranie i wykorzystanie suchej masy paszy w tym eksperymencie. Odnotowano również obniżenie wartości pH oraz wzrost stężenia kwasów SCFA w treści jelita ślepego (cecum), które stymulują wzrost śluzówki jelit, proliferację komórek i wydzielania jelitowego hormonu GLP-1 odpowiedzialnego za wzrost długości kosmków i głębokości krypt jelitowych. Pod wpływem zastosowanych pektyn wzrosła masa jelita cienkiego i grubego oraz długość kosmków jelitowych w jelicie cienkim i głębokość krypt jelitowych (zarówno w jelicie cienkim jak i grubym). Stwierdzono również, że zastosowane pektyny przyczyniły się do obniżenia masy okrężnicy szczurów. Wzrost długości kosmków jelitowych i głębokości kryp po zastosowaniu dodatku pektyn obserwowali również inni autorzy [Brown i wsp., 1979; Fukunaga i wsp., 2003], którzy wykonali swoje obserwacje wcześniej niż wyżej wspomniani Pirman i wsp., [2007]. Wielu autorów [McCullough i wsp., 1998; Barcelo i wsp., 2000; Brownlee i wsp., 2003 i 2005] w swych doświadczeniach odnotowało wpływ dodatku do diety pektyn na stymulację procesu bakteryjnej fermentacji w jelitach u zwierząt monogastrycznych. Przeprowadzone przez Bindelle i wsp., [2008] eksperymenty wskazały na istotną rolę włókna pokarmowego jako czynnika żywieniowego warunkującego zdrowotność trzody chlewnej. Trzeba zaznaczyć, że pozytywny wpływ zastosowanych w diecie szczurów pektyn odnotował Kirat i wsp., [2009] w badaniach immunohistochemicznych jelit. 41 Charakterystyka fruktooligosacharydów (inulina, oligofruktoza) Do najczęściej stosowanych oligosacharydów w żywieniu zwierząt należą pochodne fruktozy – fruktooligosacharydy FOS (inulina i oligofruktoza) oraz pochodne glukozy – mannanooligosacharydy (MOS). Fruktany występują pospolicie w wakuolach roślin należących do rodzin: Compositae, Campanulance, Liliacea i Iridiacea. W stanie naturalnym występują w cebuli, czosnku, bulwach karczochów, dalii i cykorii. Znaleźć je można również w porach, szparagach, pomidorach, topinamburze, bananach oraz agawie [Kaur i Gupta, 2002; Gibson i wsp., 2004; Cieślik i Gębusiak, 2011], a w postaci oligosacharydów – również w mleku kobiecym. Udowadnia to fakt, że w przewodzie pokarmowym noworodków karmionych piersią populacja bifidobakterii jest 10-krotnie większa niż u dzieci karmionych mieszankami sztucznymi. Według LaraWiloslada i wsp., [2006] wśród wszystkich ssaków mleko kobiece ma najwyższą zawartość oligosacharydów szacowaną na poziomie 0,7-1,2 g/100ml. Fruktany są polisacharydami zbudowanymi z jednostek β-D-fruktozy i jednej, na ogół na końcu łańcucha, cząsteczki glukozy, tworząc rzadko spotykane w przyrodzie łańcuchy składające się z pięcioczłonowych pierścieni furanozowych [Roberfroid i Slavin, 2000]. Najprostszymi fruktanami są trisacharydy: kestoza, nystoza, fruktozylonystoza oraz oligosacharydy o wiązaniach mieszanych [Kubik i wsp., 2006]. Według Zduńczyka [2002], na skalę przemysłową wytwarza się 12 klas oligosacharydów, w tym galakto-oligosacharydy (GOS), frukto-oligosacharydy (FOS), mannano-oligosacharydy (MOS) oraz laktozę. Praktyczny termin frukto-oligosachrydy jest używany dla krótkołańcuchowych fruktanów zawierających od dwóch do czterech jednostek fruktozylowych połączonych wiązaniami β- (2,1)-glikozydowymi [Kubik i wsp., 2006]. Uważa się, że niektóre szczepy bakterii z rodzajów Pseudomonas sp., Xanthomonas sp., Bacillus sp., Streptococcus sp., Zymomonas sp. wytwarzają liniowe fruktany z serii 6-kestozy o nazwie lewan. Zdolność wytwarzania fruktooligosacharydów wykazuje również wiele szczepów z rodzajów Aspergillus i Aureobasidium. Fruktooligosacharydy, w tym inulina i oligofruktoza są węglowodanami, które nie są rozpuszczalne w 80% etanolu oraz nie ulegają rozkładowi pod wpływem enzymów trawiennych. Rozpuszczalne są natomiast w wodzie, a poziom słodkości 42 uzależniony jest od budowy chemicznej, stopnia polimeryzacji DP (z ang. degree of polimeryzation) łańcucha węglowego oraz od stosunku mono i disacharydów. Roberfroid i Salvin [2000] stwierdzili, że poziom słodkości spada wraz z wydłużaniem łańcucha oligosacharydowego. Fruktooligosacharydy w porównaniu do sacharozy charakteryzują się niższą kalorycznością oraz słodkością. Według Gibsona i Roberfroid’a [2008] zarówno fruktooligosacharydy (FOS) jak i oligofruktozę uważa się za synonimy i opisuje jako mieszaninę oligomerów o maksymalnym stopniu polimeryzacji DPmax 10. Na skalę przemysłową możemy wyróżnić dwie metody pozyskiwania tych substancji. Pierwsza z nich polega na reakcji transgalaktozydacji cukru przez enzym β-fruktofuranozydazę pochodzącą z Aspergillus Niger, a otrzymany produkt charakteryzuje się stopniem polimeryzacji od 2 do 4. Druga metoda to enzymatyczna hydroliza inuliny pod wpływem enzymu endoinulinazy i otrzymany produkt charakteryzuje się stopniem polimeryzacji DP 2-7. Wartość kaloryczna oligofruktozy oraz inuliny to 1,1-1,7 kcal/g [Roberfroid, 1999]. Fruktooligosacharydy są wykorzystywane w jelitach jako źródło węgla przez Bifidobacterium spp. (bez B.bifidum), Bacterioides fragilis, Peptostreptococcus spp., oraz Klebsiella pneumoniae, a nie są metabolizowane przez E.coli, Clostridium perfringens, Eubacterium oraz Fusarium spp. Z tego względu Zduńczyk [2002] uważa, że frukto-oligosacharydy uznawane są za modelowe substancje prebiotyczne, najbardziej przydatne do stymulacji pożytecznej mikroflory jelitowej. Inulina Inulinę odkrył aptekarz Valentine von Rose, w Berlinie, w 1804 roku, izolując ją z korzeni omanu Radix Inulae (Inula helenium L.) i nazwał ją alantyną (alantin). Ostatecznie przyjęła się nazwa Thomsona – inulina (inulin), zaproponowana w 1818 roku (cytat za Gibson i Roberfroid, 2008). Inulina pochodzenia naturalnego należy do najlepiej poznanej grupy fruktanów, które różnią się między sobą ciężarem cząsteczkowym, budową wewnętrzną oraz rodzajem wiązań pomiędzy resztami fruktozy. Głównym źródłem inuliny jest kłącze topinamburu (Heliantus tuberosus L.), korzeń cykorii (Cichorium intybu L.), mniszka (Taraxacum offi cinale Web), omanu (Inula helenium L.) oraz agawa (Agape azul tequilana). 43 Na skalę przemysłową pozyskuje się ją zazwyczaj z cykorii oraz topinamburu. Inulina jest mieszaniną oligomerów i polimerów zmiennej liczby molekularnych łańcuchów fruktozy połączonych wiązaniem β(2-1) [González-Tomás i wsp., 2009] o masie cząsteczkowej ok. 5 kDa, co odpowiada masie 30–35 reszt cukrowych. Inulina jest białym proszkiem bez smaku, przypominającym wyglądem zewnętrznym skrobię, nie daje jednak zabarwienia z jodem, rozpuszcza się łatwo w gorącej wodzie wypadając z roztworu w niskich temperaturach (ta właściwość ułatwia jej otrzymywanie). Pod wpływem działania kwasów lub enzymu –inulinazy zostaje rozłożona całkowicie do fruktozy. Stopień polimeryzacji inuliny pochodzenia roślinnego waha się od 2 do 60 i uzależniony jest przede wszystkim od gatunku, wieku i warunków pogodowych w jakich rosła dana roślina. Molekuły ze stopniem polimeryzacji 2-10 ulegają fermentacji poprzez naturalną mikroflorę jelitową w stosunku o połowę szybszym niż molekuły ze stopniem polimeryzacji wyższym niż 10. Inulina pochodząca z różnych części roślin wykazuje odmienny stopień polimeryzacji określany jako DP, [Van Loo i wsp., 1995; López- Molina i wsp., 2005]. Średni zakres stopnia polimeryzacji dla inuliny wynosi od 10-ciu do 65-ciu [Niness, 1999; Roberfroid, 2000]. Tabela 3. Zawartość oraz stopień polimeryzacji inuliny w różnych roślinach [Van Loo i wsp., 1995]. Roślina Zawartość inuliny g/100g Karczoch zwyczajny (Cynara scolymus) 2-7 Banan (Musa cavendishii) Jęczmień (Hordeum vulgare) Cykoria podróznik (Cichorium intybus) 1 0,5-1 15-20 Mniszek lekarski(Taraxacum officinale) Czosnek pospolity (Allium sativum) Słonecznik bulwiasty (Helianthus tuberosus) 12-15 16 44 DP ≥ 5 = 95% DP ≥ 40 = 87% DP < 5 = 100% DP < 5 = 100% DP < 40 = 83% DP 2–65 DP ≥ 40 = 917% 1-7,5 20 DP ≥ 5 = 75% DP < 40 = 94% DP 2–50 DP ≥ 40 = 6% DP 2–12 DP ≥ 5 = 75% 1-4 DP > 5 = 50% 17-20,5 Cebula (Allium cepa) Wężymord czarny (Scorzonera hispanica) Pszenica (Triticum aestivum) Stopień polimeryzacji DP Inulina pochodzenia bakteryjnego posiada bardzo wysoki stopień DP 10.000100.00, a cząsteczka inuliny jest mocno rozgałęziona. Długość łańcucha węglowego cząsteczki inuliny wpływa na określone właściwości prebiotyczne [Van Loo, 2004]. Zawartość inuliny w wybranych roślinach oraz stopień polimeryzacji łańcucha węglowego cząsteczki przedstawiono w tabeli poniżej. Oligofruktoza Oligofruktoza otrzymywana jest głównie z inuliny na drodze częściowej hydrolizy enzymatycznej [Kubik i wsp., 2006]. Oligofruktoza jest substancją wysoko rozpuszczalną w wodzie, a jej stopień polimeryzacji jest mniejszy od dziesięciu (DP<10).Molekuły z wyższym stopniem polimeryzacji (DP>10) ulegają fermentacji wolniej niż łańcuchy węglowe krótsze. Średni zakres stopnia polimeryzacji dla oligofruktozy wynosi od 2 do 10 [Ninees, 1999; Roberfroid, 2000]. Zwraca się ponadto uwagę na fakt, iż szybko fermentujące prebiotyki mają zazwyczaj niski stopień polimeryzacji DP [Gibson i Roberfroid, 2008]. Działanie na organizm Prebiotyki, takie jak inulina i oligofruktoza, są oporne na działanie enzymów trawiennych przewodu pokarmowego gospodarza, ulegają selektywnej i szybkiej fermentacji w jelitach do gazów metabolicznych oraz krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (z ang. SCFA-schort chain fatty acid) [Reid i wsp., 2008; Wang, 2009] i są głównym źródłem energii dla mikroorganizmów zasiedlających nabłonek jelit [Vrese i Marteau, 2007; Huebner i wsp., 2007]. Wspomniane kwasy SCFA (masłowy, mlekowy, propionowy i octowy) wpływają na metabolizm ogólnoustrojowy organizmu. Wykazują one korzystne działanie w przypadku biegunki, gdyż stymulują zwrotne wchłanianie wody i sodu, bezpośrednio pobudzają perystaltykę jelit na drodze chemicznej oraz wiążą wodę, przyczyniając się do zwiększenia objętości stolca oraz jego rozmiękczenia, co ma istotne znaczenie w przypadku zaparć. Poprzez zakwaszenie środowiska jelit kwasy SCFA zwiększają rozpuszczalność soli wapniowych i magnezowych oraz powodują wzrost wchłaniania wapnia, magnezu i żelaza [Kaur i 45 Gupta, 2002; Laparra i wsp., 2008; Gibson i Roberfroid, 2008] oraz innych związków mineralnych [Coudray i wsp., 1997]. Omawiane kwasy SCFA powodują również spadek przepuszczalności komórek jelitowych- kolonocytów dla bakterii patogennych. Zdolne są one również do poprawy parametrów morfologicznych śluzówki jelit poprzez wzrost produkcji mucyn oraz spadek translokacji bakteryjnych przez receptory komórek immunologicznych związanych z układem GALT [Lomax i Calder, 2008]. Sakata i wsp., [1995] stwierdzili, że kwasy SCFA odżywiają oraz nasilają proliferację komórek nabłonka jelit, które otrzymują w ten sposób około 70% energii szczególnie istotnej w przypadku uszkodzeń śluzówki jelita, jakie ma miejsce w stanach zapalnych jelita grubego spowodowanego czynnikami środowiskowymi i niekorzystnymi dla zwierząt substancjami i mykotoksynami zawartymi w paszach [Butler i wsp., 2007]. Poprzez produkcję kwasów SCFAs, prebiotyki obniżają wartość pH stolca, a tym samym ilość toksycznych metabolitów (szczególnie amoniaku). Regulują absorpcję lipidów i cholesterolu przez co wykazują hipocholesterolemiczne [Cieslik i Topolska, właściwości hipoglikemiczne i 2009]. Substancje o działaniu prebiotycznym wpływają na odpowiednie wchłanianie węglowodanów przez co zmniejsza się ich poziom w surowicy krwi [Gibson i Roberfroid, 1995; Bengmark, 1998; Gibson, 2004; Wang, 2009]. Z przeglądu literatury dotyczącej wpływu frukto-oligosacharydów na liczbę enterobacterium z rodziny Enterobacteriaceae otrzymano rozbieżne wyniki. Po zastosowaniu tej substancji u szczurów stwierdzono zarówno wzrost [Ten Bruggencate i wsp., 2003], jak i spadek liczby tych bakterii [Azorín-Ortuño i wsp., 2009]. Metabolizm inuliny jest związany z dziesięciokrotną stymulacją populacji bakterii Lactobacillus w treści jelita cienkiego. Bakterie te obniżają wartość pH treści jelitowej i stwarzają niekorzystne warunki do rozwoju patogennej flory jelitowej [McBain i wsp., 2001]. Inulina i oligofruktoza stymulują specyficzne szczepy bakterii jelitowych oraz hamują namnażanie patogennej flory jelitowej, w wyniku czego korzystnie wpływają na zdrowie gospodarza [Osman i wsp., 2006; Roberfroid, 2007; Gibson i Roberfroid, 2008]. Substancje te podnoszą poziom białka wiążącego wapń (CaBP) w jelicie grubym [Ohta i wsp., 1998] oraz wpływają na wzrost mineralizacji kości i zawartości wapnia w kościach udowych [Ohta i wsp., 1998; Scholz-Ahrens i wsp., 2001]. 46 Proces absorbcji wapnia w jelitach przebiega zarówno aktywnie jak i pasywnie oraz podlega regulacji hormonalnej przez parathormon, kalcytoninę i somatotropinę. Aktywna absorbcja uzależniona jest przede wszystkim od podaży witaminy D oraz stopnia rozpuszczenia wapnia i ma miejsce głównie w jelicie cienkim. Stwierdzono naukowo, że proces ten u szczurów jest większy w jelicie krętym (ileum) niż w dwunastnicy. Transport pasywny wapnia zachodzi na całej długości jelit poprzez dyfuzyjny gradient stężeń, a poziom jego wchłaniania jest zbliżony zarówno w jelicie kretym (ileum), co w dwunastnicy szczurów. Według Karczmarewicz i wsp., [2002] pod wpływem oligosacharydów zwiększa się przepływ krwi w krążeniu jelitowym oraz wchłanianie wapnia na drodze transportu pasywnego. Oligosacharydy stymulują ekspresję białka wiążącego wapń (CaBP) w efekcie tego procesu dochodzi do wzrostu wchłaniania tego pierwiastka na drodze transportu aktywnego [Ohta i wsp., 1998; Jenkins i wsp., 1999; Scholz- Ahrens i wsp., 2002]. Jednak Wang i wsp., [2009] w doświadczeniu przeprowadzonym na szczurach nie stwierdzili wzrostu absorbcji Ca i Zn po zastosowaniu dodatku FOS w diecie u tych zwierząt. Godne uwagi jest doświadczenie przeprowadzone przez Beynen i wsp., [2002]. Autorzy ci stwierdzili, że oligofruktoza zastosowana w diecie u psów znacząco wpłynęła na wzrost absorbcji wapnia i magnezu ale nie miała wpływu na wartość pH mas kałowych. Stwierdzono, że na poziom wchłaniania wapnia wpłynęła przede wszystkim zmiana składu bakteryjnej mikroflory jelitowej, a nie obniżenie wartości pH jakie zazwyczaj ma miejsce przy podaży w diecie prebiotyków, w tym oligofruktozy. Trzeba zaznaczyć, że wzrost absorbcji wapnia w jelitach nie jest równoznaczny ze wzrostem stężenia tego makroelementu w surowicy krwi, co potwierdzają badania wielu autorów [Baba i wsp., 1996; Ohta i wsp., 1994; Delzenne i wsp., 1995; Lopez i wsp., 2000 i 2007; Younes i wsp., 2001]. Według Ohty i wsp., [1994] dieta, w której była wyższa zawartoścć wapnia i fosforu w obecności dodatku oligofruktozy spowodowała spadek koncentracji wapnia w surowicy krwi szczurów. Zastosowanie prebiotyków w diecie powoduje również wzrost absorbcji magnezu w jelicie cienkim i okrężnicy, która odbywa się na zasadzie transportu aktywnego i pasywnego. Zjawisko wzrostu absorbcji omawianego związku mineralnego potwierdza wiele badań przeprowadzonych na trzodzie chlewnej [Yasuda i wsp., 2006], psach [Beynen i wsp., 2002] i szczurach [Ohta i wsp., 1994; Delzenne i wsp., 1995; Ohta i wsp., 1995; Baba i wsp., 1996; Coudray i wsp., 2005]. Jednak eksperyment 47 przeprowadzony przez Vanhoof i DeSchrijver [1996] nie wykazał wzrostu absorbcji tego pierwiastka po zastosowaniu inuliny w diecie szczurów i świń. Prebiotyki wpływają również na wzrost absorbcji w jelitach innych związków mineralnych, w tym żelaza [Ohta i wsp., 1998], cynku [Delzenne i wsp., 1995] i miedzi [Coundray i wsp., 2005]. Uważa się, że pod wpływem podaży w diecie fruktooligosacharydów, dochodzi do przerostu błony śluzowej jelit, co również może zwiększać wchłanianie związków mineralnych. Udowodniono, że za gęstość minerału kostnego (z ang. bone mineral density – BMD) w 70-80% odpowiedzialne są czynniki genetyczne. Karczmarewicz i wsp., [2002] stwierdzili, że niekorzystny układ alleliczny genu receptora witaminy D powoduje obniżoną masę kostną związaną z przyspieszeniem utraty kości, którą można odpowiednio modyfikować przez dodatek wapnia do diety. Autorzy ci zwracają uwagę na zwiększenie biodostępności związków mineralnych, głównie wapnia poprzez zastosowanie w diecie oligosacharydów, co potwierdzają liczne badania przeprowadzone na szczurach przez Ohta i wsp., [1995, 1998, 1998, 1999]. ScholzAhrens i wsp., [2001] zaobserwowali wzrost zawartości mineralnej kości (z ang. bone mineral content- BMC) szczurów pod wpływem zastosowania w diecie dodatku oligofruktozy. Fruktany wykazują ochronne działanie na komórki ściany jelit przez blokowanie miejsc, do których mogą dołączyć się patogeny. Immunologiczny efekt stosowania prebiotyków tłumaczy się przede wszystkim wzrostem liczby laktobacilli i bifidobacterii oraz kwasów SCFA, w szczególności kwasu masłowego, który z jednej strony jest głównym źródłem energii dla komórek nabłonka jelit, a z drugiej osłabia ekspresje cytokin. Kwas masłowy metabolizowany jest do glutaminy, która z kolei może łatwo syntezować amid azotowy i przetransportować go w organizmie w miejsce, gdzie jest aktualnie potrzebny do syntezy białek odpornościowych oraz pobudza wzrost tkanki limfoidalnej [Macfarlane i wsp., 2008]. Uważa się także, że SCFA redukują apoptozę oraz mogą stanowić czynnik chroniący organizm przed procesem karcynogenezy poprzez wzrost produkcji immunoglobulin, cytokin, limfocytów i kępek Payera. Według Taper i wsp., [1998] omawiane fruktany przyczyniają się do zahamowania rozwoju nowotworu oraz zmniejszenia zmienionych krypt jelita grubego u zwierząt laboratoryjnych. Natomiast Osman i wsp., [2006] stwierdzili, że fruktany mają także działanie immunostymulujące, co wyraża się korzystnym wpływem ma 48 rozwój i czynność systemu immunologicznego błony śluzowej jelita. Efekt ten jest prawdopodobnie związany ze stymulującym oddziaływaniem Bifidobakterii na produkcję przez makrofagii cytokin (interleukina IL-6, TNF), aktywność limfocytów i metabolizm innych komórek czy reaktywnych związków antybakteryjnych (NO, H2O2). Dowiedziono również, że inulina hamuje produkcję sialomucyn o działaniu nowotworowym, a pobudza wydzielanie sulfomucyn o działaniu terapeutycznym. Pod wpływem zastosowania w diecie fruktanów następuje stymulacja syntezy przeciwciał (głównie IgA) przez limfocyty B oraz aktywność cytotoksyczną komórek NK. Komórki te są najważniejszą grupą komórek układu odpornościowego odpowiedzialną za zjawisko naturalnej cytotoksyczności gdyż uczestniczą we wczesnych fazach odpowiedzi nieswoistej oraz nadzorze immunologicznym [Waltz i wsp., 2005]. Drzymała - Czyż i wsp., [2011] stwierdzili, że w dostępnej literaturze naukowej nie ma doświadczeń, które dotyczą wpływu inuliny na parametry immunohistochemiczne jelit u szczurów z zaindukowanym zapaleniem tego narządu. Badacze ci podjęli próbę zbadania wpływu inuliny na wspomniany wyżej parametr jednak efekty ich badań nie zostały jeszcze opublikowane. Zastosowanie fruktooligosacharydów, inuliny i oligofruktozy w żywieniu różnych gatunków zwierząt Drób Zastosowanie dodatku fruktanów w żywieniu drobiu miało wpływ na modyfikację składu mikroflory układu pokarmowego poprzez wzrost liczby Bifidobacterium i Lactobacillus oraz obniżenie liczby bakterii patogennych (E.coli) w treści jelita cienkiego i jelita ślepego [Xu i wsp., 2003]. Pod wpływem zastosowanych w paszy fruktanów wzrosła aktywność enzymów jelitowych. Fruktooligosacharydy oraz inulina korzystnie zmieniły parametry histo-morfometryczne wpływając pozytywnie na długość kosmków jelitowych (w jelicie czczym i biodrowym), głębokość krypt jelitowych [Xu i wsp., 2003; Rehman i wsp., 2006; Awad i wsp., 2006 i 2009] oraz masę jelit [Juśkiewicz i wsp., 2007]. Z badań przeprowadzonych na indykach przez Juśkiewicza i wsp., [2006] wynika, że dodatek fruktooligosacharydów (0,5%; 1,0% i 2%) nie zmienił masy i długości jelita cienkiego oraz grubego. 49 Wykazano również korzystny wpływ fruktanów, inuliny i oligofruktozy na parametry produkcyjne kur nieśnych w tym wydajność nieśną, masę wyprodukowanych jaj oraz obniżenie całkowitej zawartości cholesterolu w żółtkach jaj [Chen i wsp., 2005 i 2005]. Zaobserwowano istotny wzrost wytrzymałości mechanicznej skorupy jaja oraz dostępności składników mineralnych, co przełożyło się na wyższy poziom wapnia i fosforu w kości piszczelowej kur [Chen i Chen, 2004]. Dodatek do paszy fruktooligosacharydów [Xu i wsp., 2003] oraz inuliny [Xu i wsp., 2003] poprawił ogólne wskaźniki produkcyjne, w tym przyrosty masy ciała, spożycie paszy i wykorzystanie paszy u drobiu. Terada i wsp., [1994] w swoich badaniach wykazali, że zastosowanie dodatku do paszy oligosacharydów nie wpływa na poprawę wydajności i parametrów produkcyjnych kurcząt. Natomiast zastosowanie inuliny w ilości 0,3% diety wpłynęło niekorzystnie na kurczęta, gdyż obniżyło masę ciała i pobranie paszy oraz podwyższyło wskaźnik zużycia paszy na jednostkę przyrostu [Józefiak i wsp., 2008]. Również Wang i Zhou [2007] przy podawaniu w paszy dla kaczek prebiotyku stwierdzili, że nie wpłynął on pozytywnie na masę ciała, pobranie paszy i wykorzystanie paszy oraz jakość mięsną tuszek. Wyniki te sugerują brak skuteczności tego rodzaju dodatków prebiotycznych, jako potencjalnych czynników stymulujących wzrost tych zwierząt. Z eksperymentu Juśkiewicza i wsp., [2002] wynika, że zastosowanie dodatku FOS w ilości 0,4% diety nie miało wpływu na masę ciała ale nieznacznie zmieniło profil i koncentrację kwasów SCFA w jelicie. Według Juśkiewicza i wsp., [2006] suplementacja diety FOS (05%; 1,0% i 2%) wpłynęła na obniżenie wartości pH oraz zwiększenie ilości SCFA w jelicie ślepym bez istotnego wpływu na parametry produkcyjne oraz aktywność enzymów bakteryjnych (α i β-glukozydazy,α i β-galaktozydazy oraz β-glukoronidazy). W późniejszych badaniach Juśkiewicz i wsp., [2007] stwierdzili, że dodatek FOS działał niekorzystnie gdyż zmienił parametry jelit przez co spowodował biegunkę i niską zawartość kwasów SCFA w treści jelita ślepego. Istnieje jednak wiele publikacji, w których autorzy wskazali wiele pozytywnych aspektów stosowania prebiotyków w mieszankach paszowych dla drobiu ze względów żywieniowych oraz zdrowotnych. 50 Trzoda chlewna Dodatek inuliny do dawki pokarmowej dla trzody chlewnej wpłynął korzystnie przede wszystkim na modyfikację wartości pH jelit [Loh i wsp., 2006; Pierce i wsp., 2006; Lynch i wsp., 2007], składu mikroflory jelit [Xu i wsp., 2002] oraz parametrów morfologicznych jelit, w tym zwiększeniu wysokości kosmków jelitowych w jelicie cienkim [Pierce i wsp., fruktooligosacharydów 2006]. stwierdzono Po zastosowaniu większe przyrosty w żywieniu masy ciała tuczników i lepsze wykorzystanie paszy oraz wzrost aktywności enzymatycznej w jelitach [Xu i wsp., 2002]. Wzrost spożycia paszy przy zastosowaniu dodatku inuliny do diety dla trzody chlewnej wykazano w badaniach przeprowadzonych przez Farnworth i wsp., [1992], Houdijk i wsp., [1998], Estrada i wsp., [2001] oraz He i wsp., [2002]. W badaniach na prosiętach oraz tucznikach również wykazano korzystny wpływ dodatku fruktanów na spożycie i wykorzystanie paszy oraz przyrosty masy ciała [Grela i Pastuszak, 2001; Xu i wsp., 2002]. Dodatek inuliny do paszy w eksperymencie Yasuda i wsp., [2006] wpłynął na wzrost zdrowotności warchlaków poprzez wzrost koncentracji hemoglobiny (HGB) we krwi i większą zawartość rozpuszczalnego żelaza w treści pokarmowej jelit tych zwierząt. Pozytywny wpływ zastosowania w diecie świń dodatku fruktanów potwierdziły badania wielu autorów [Houdijk i wsp., 1999; Mikkelsen i wsp., 2004; Loh i wsp., 2006; Rideout i wsp., 2004; Byrne i wsp., 2008; Kjos i wsp., 2010]. Suplementacja diety inuliną nie wpłynęła na strawność białka w doświadczeniach wykonanych przez Vanhoof i De Schrijver [1996] oraz Rideout i Fan [2004]. Efekt bifidogenny po wprowadzeniu fruktanów do paszy rosnących świń został stwierdzony przez Mølbak i wsp., [2007]. Inulina i oligofruktoza pełni rolę czynnika redukującego liczbę patogennych enterobakterii oraz pasożytów w jelitach [Rideout i wsp., 2004; Mountzouris i wsp., 2006; Byrne i wsp., 2008]. Mieszanki paszowe dla trzody chlewnej zawierające dodatek fruktooligosacharydów [Russell i wsp., 1996] lub inuliny [Jensen i wsp., 1995; Jensen, 2006] przyczyniły się do redukcji ilości szkodliwych odorów, jakie powstają podczas bakteryjnego rozkładu aminokwasów w jelitach, w tym skatolu, indolu, krezolu. 51 Przeżuwacze Zastosowanie dodatku inuliny do diety dla cieląt wpłynęło pozytywnie na przyrosty masy ciała bez wpływu na pobranie paszy i wykorzystanie paszy na jednostkę przyrostu. Inulina obniżyła poziom glukozy, mocznika oraz cholesterolu całkowitego bez istotnego wpływu na zawartość aminotransferazy asparaginianowej (AST). Substancja prebiotyczna zmieniła również stężenie takich parametrów krwi jak RBC, WBC, HGB bez wpływu na poziom hematokrytu (HCT). U cieląt otrzymujących dodatek inuliny odnotowano wzrost stężenia gammaglobulin w surowicy krwi. Płyn żwaczowy cieląt otrzymujących wspomniany dodatek charakteryzował się wyższym stężeniem amoniaku i lotnych kwasów tłuszczowych [Król, 2011]. Zastosowanie oligosacharydów mannozy wpłynęło na zmianę stężenia glukozy, mocznika, cholesterolu całkowitego oraz liczbę krwinek białych (WBC), hemoglobiny (HGB) i hematokrytu (HCT) w surowicy krwi badanych cieląt. Pozytywne zmiany odnotowano w stosunku do liczby bakterii oraz zawartości lotnych kwasów tłuszczowych w płynie żwaczowym u cieląt grupy doświadczalnej [Król, 2011]. Zwierzęta laboratoryjne Na podstawie dostępnej literatury można stwierdzić, że w wielu badaniach [Levrat i wsp., 1991; Kleessen i wsp., 2001; Van De Viele i wsp., 2007; Juśkiewicz i wsp., 2009; Azorín-Ortuño i wsp., 2009] zastosowanie inuliny w diecie u szczurów nie wpłynęło na przyrosty masy ciała. Są również badania [Levrat i wsp., 1991], w których wykazano, że dodatek inuliny w ilości 5% i 10% oraz 20% diety istotnie pogorszył przyrosty masy ciała szczurów, ale według Bosscher i wsp., [2005] oraz Zaky, [2009] inulina zastosowana w ilości 5%, 10% oraz 15% diety poprawiła zarówno przyrosty masy ciała szczurów jak i spożycie paszy. Suplementacja diety szczurów inuliną w ilości od 4% do 10% diety nie miała wpływu na pobranie paszy przez zwierzęta doświadczalne [Juśkiewicz i Zduńczyk, 2004; Juśkiewicz i wsp., 2009; Vanhoof i De Schrijver, 1996; Żary-Sikorska i Juśkiewicz, 2007; Gråsten i wsp., 2002; Van Loo, 2004]. Spożywanie przez szczury paszy zawierającej w swoim składzie dodatek fruktooligosacharydów 52 wpłynęło na wzrost końcowej masy ciała i przyrostów masy ciała oraz istotne obniżenie spożycia paszy [Gallaher i wsp., 1996]. Dodatek do paszy inuliny nie miał wpływu na zmianę stężenia parametrów morfologicznych krwi, co stwierdzono w wielu eksperymentach żywieniowych [Juśkiewicza i wsp., 2005, 2009; Azorín-Ortuňo i wsp., 2009; López-Molina i wsp., 2005; Van De Viele i wsp., 2007]. Z kolei Cieślik i Topolska [2009] oraz Kaur i Gupta, [2002] wykazali pozytywny wpływ dodatku do diety fruktooligosacharydów na metabolizm tłuszczu, poziom cholesterolu i trójglicerydów [Fiordaliso i wsp., 1995; Kim i Shin, 1998; Delzenne i Kok, 1998 i 1999] oraz glukozy w surowicy krwi [Kok i wsp.,1998; Kopeć i Cieślik, 2005]. Inulina i oligofruktoza zastosowane w dietach tej grupy zwierząt wpłynęły na znaczny wzrost absorbcji Ca [Delzenne i wsp., 1995; Ohta i wsp., 1994; Ohta i wsp., 1995; i wsp., 1995; Coundray i wsp., 1997; Lopez i wsp., 2000; Scholz-Ahrens i wsp., 2002; Kaur i Gupta, 2002; Abrams i wsp., 2007; Laparra i wsp., 2008; Lobo i wsp., 2009], Mg [Delzenne i wsp., 1995; Ohta i wsp., 1994 i 1995; Younes i wsp., 2001; Scholz-Ahrens i Schrezenmeir, 2002; Lopez i wsp., 2000; Weaver, 2005; Krejpcio i wsp., 2009], Fe [Delzenne i wsp., 1995; Lopez i wsp., 2000; Azorín-Ortuňo i wsp., 2009; Van de Wiele i wsp., 2007] oraz Zn [Delzenne i wsp., 1995; Fiordaliso i wsp., 1995; Kok i wsp., 1998; Bosscher i wsp., 2005; Lobo i wsp., 2009] i Cu [Lopez i wsp., 2000]. Baba i wsp., [1996] oraz Lopez i wsp., [2000] nie stwierdzili wpływu zastosowanej w diecie u szczurów oligofruktozy na wzrost jelitowej absorbcji wapnia oraz magnezu. Wzrost absorbcji jelitowej zapobiega deficytowi mineralnemu towarzyszącemu procesowi osteoporozy oraz anemii [Abrams i wsp., 2007]. Stwierdzono również, że podawanie fruktanów może zwiększyć mineralizację kości [Scholz-Ahrens i wsp., 2001]. Józefiak i wsp., [2005] stwierdzili wzrost stężenia kwasów SCFA w treści jelita ślepego po zastosowaniu w diecie u szczurów inuliny. Według Kruger i wsp., [2003] biodostępność wapnia była znacząco wyższa u szczurów, które otrzymywały w diecie długołańcuchową inulinę w porównaniu do krótkołańcuchowej oligofruktozy. Z kolei produkcja biomasy oraz kwasu mlekowego i octowego była wyższa w przypadku oligofruktozy. Tłumaczy się ten fakt tym, że krótsze łańcuchy ulegają szybszej fermentacji przez Bifidobakterie, a długie łańcuchy cząsteczki inuliny wydłużają czas fermentacji w jelicie grubym [Perrin i wsp., 2002]. 53 Zastosowanie oligofruktozy w diecie u szczurów obniżyło wartość pH jelit oraz aktywność enzymu mieloperoksydazy (MPO), który organizm uwalnia podczas reakcji zapalnych m.in. podczas powstawania chorób układu krążenia. Przeciwzapalny efekt zastosowanej oligofruktozy tłumaczy się głównie wpływem na wzrost kolonii lactobacilli [Cherbut i wsp., 2003]. Uważana za długołańcuchowy polimer fruktozy inulina, z pozytywnym efektem stosowana była u szczurów m.in. w obniżaniu mediatorów zapalnych, aktywności enzymu MPO oraz produkcji leukotrienów LTB4, które regulują funkcje granulocytów obojętnochłonnych i kwasochłonnych. Fruktan ten poprzez swoje biologiczne działanie obniża ekspresję induokowanej syntazy tlenku azotu (iNOS), który jest cząsteczką regulującą odpowiedź immunologiczną oraz wywołuje hipotensję podczas szoku septycznego stresu oksydacyjnego [Videla i wsp., 2001]. Włącznie do diety inuliny obniżyło strawność białka u szczurów [Levrat i wsp., 1993]. Suplementacja diety inuliną wpłynęła na zwiększenie masy jelit [Bielecka i wsp., 2002; Gråsten i wsp., 2002; Zduńczyk i wsp., 2004; Juśkiewicz i wsp., 2009] oraz ich długości. W obrazie histologicznym jelit stwierdzono zmiany dotyczące wysokości kosmków jelitowych [Pierce i wsp., 2006; Lynch i wsp., 2007; Rehman i wsp., 2007], głębokości krypt [Rehman i wsp., 2007] oraz liczby komórek nabłonkowych przypadających na poszczególne kosmki. Substancje prebiotyczne poprzez swoje działanie przyczyniają się do ograniczenia zmian patologicznych tkanek jelit oraz zmniejszenia występowania aberracji krypt (ACF) jelita cienkiego i grubego u szczurów [ Gibson i Roberfroid, 1995; Taper i wsp., 1998; Taper i Roberfroid, 1999; Verghese i wsp., 2002; Lobo i wsp., 2009]. Ponadto hamują apoptozę i proliferację komórek nabłonka jelit [Pool-Zoobel i wsp., 2007]. Inulina redukuje powstawanie szkodliwych form amoniaku, które zakwaszając silnie treść pokarmową uważane są za czynnik uszkadzający błonę śluzową i nabłonek jelitowy oraz przyczyniają się do nekrozy śluzówki jelitowej [Pool-Zobel i Sauer, 2007]. Lara-Wiloslada i wsp., [2006] są zdania, że wzrost produkcji kwasów SCFAs po zastosowaniu w diecie u szczurów fruktooligosacharydów pozytywnie wpłynął na obraz histologiczny jelit. Krótkołańcuchowe fruktany SC-FOS (chort-chain fructooligosaccharides), uważane są za efektywniejsze w redukcji czynników zapalnych jelit niż pozostałe fruktany [Lara-Wiloslada i wsp., 2006]. Wzrost produkcji kwasu 54 masłowego, mas kałowych, wzrost ilości Bifidobakterii oraz wzmożona proliferacja komórkowa w obrębie jelit przy braku zmian patologicznych w obrazie histologicznym szczurów to efekt dodatku do diety inuliny [Rowland i wsp., 1998]. Substancja ta zastosowana w diecie u szczurów obniżyła ryzyko wystąpienia nowotworu jelita grubego poprzez zmianę wartości pH treści pokarmowej jelita, zwiększenie procesu fermentacji i produkcji kwasów SCFA oraz proliferacji komórek jelit co potwierdziło wielu autorów [Kleessen i wsp., 2001; Poulson i wsp., 2002; Verghese i wsp., 2002; Jurgoński i wsp., 2008]. Inulina i oligofruktoza wykazały działanie przeciwzapalne oraz stymulujące układ immunologiczny u szczurów [Osman i wsp., 2006; Drzymała-Czyż i wsp., 2011], zredukowały proliferację i aktywność komórek nowotworowych okrężnicy (colon) oraz ekspresję głównych enzymów odpowiedzialnych za proces nowotworowy u szczurów z wywołanym przez azoxymetan nowotworem [Femia i wsp., 2002; Van Loo i wsp., 1999]. Według Delgado i wsp., [2011] sposób działania prebiotyków w procesie zapobiegania zmianom o przebiegu nowotworowym jelit jest jak dotąd mało poznany. Pod wpływem zastosowanej w diecie inuliny wzrosła aktywność enzymów bakteryjnych: β-glukozydazy, β-glukoronidazy i ureazy, które uważane są za produkt toksyczny wpływający kancerogennie i mutagennie na okrężnicę szczurów [Zhang i Lupton, 1994]. Istnieją publikacje, w których zastosowana inulina obniżyła aktywność enzymu β-glukuronidazy [Rowland i wsp., 1998] oraz takie, w których nie miała wpływu na jego aktywność [Rao i wsp., 1998; Rao, 2001; Gråsten i wsp., 2002]. Żary-Sikorska i Juśkiewicz [2007] po zastosowaniu dodatku fruktooligosacharydów oraz inuliny stwierdzili zmiany w aktywności enzymatycznej mikroflory jelitowej szczurów. Pierwszy dodatek paszowy istotnie obniżył stężenie β-glukozydazy, a inulina obniżyła aktywność β-galaktozydazy oraz β-glukoronidazy, której obecność, według autorów jest wyznacznikiem aktywności mikroorganizmów patogennych w organizmie. 55 Charakterystyka β-glukanów Pod względem budowy należą one do polisacharydów i występują m.in. w ścianach komórkowych wielu mikroorganizmów, w tym z gatunku Saccharomyces cerevisiae. Tada i wsp., [2008], Steve i wsp., [2009] oraz Wang [2009] twierdzą, że uzyskuje się go z różnych naturalnych źródeł np.: wyższych grzybów, bakterii lub zbóż, ale najlepszym źródłem do jego uzyskiwania są zwykle drożdże piwne. Beta-glukany wchodzą w skład polisacharydów nieskrobiowych, zaliczane są do hemiceluloz będących długołańcuchowymi polimerami glukozy. Poszczególne cząsteczki glukopiranozy mogą być połączone w sposób liniowy wiązaniami (1-3)/(14)-β-glikozydowymi. Z takim układem wiązań spotykamy się w przypadku zbóż. U bakterii, drożdży i innych grzybów dodatkowo do rdzenia głównego cząsteczki przyłączone są różnej długości łańcuchy boczne wiązaniem (1-6)-β-glikozydowym. W zależności od źródła pochodzenia β-glukany różnią się strukturą chemiczną, masą cząsteczkową oraz sposobem i liczbą odgałęzień łańcuchów bocznych, co z kolei wpływa na ich aktywność biologiczną. β-glukan drożdżowy zaliczany jest do glukanów drobnocząsteczkowych, gdyż prawie 85% wiązań stanowią łańcuchy liniowe, pozostałe 15% tworzą wiązania rozgałęzione. Struktura ściany komórkowej drożdży, z której izolowane są β-glukany czyni je mało podatnymi na rozpuszczanie w wodzie. Jest to wynikiem obecności chityny, która stanowi około 1-2% masy ściany komórkowej i tworzy kompleksy z glukanami (3-9% masy ściany komórkowej). Dodatkowo znajdująca się na powierzchni zewnętrznej ściany komórkowej warstwa mannanoprotein utrudnia pozyskiwanie tej formy β-glukanu [Waszkiewicz-Robak, 2006]. Lepszą rozpuszczalność tych związków można uzyskać poprzez ich modyfikację chemiczną. Ponadto lepsza rozpuszczalność charakteryzuje związki o mniejszym stopniu rozgałęzień. Ważne jest także, aby polisacharydy te były odizolowane od mannanoprotein bez użycia agresywnych kwasów i zasad w procesie hydrolizy, były w niezmienionej, naturalnej formie gwarantującej wysoką aktywność biologiczną. Efekt prebiotyczny po zastosowaniu β-glukanów może być tłumaczony powinowactwem niektórych receptorów drobnoustrojów (Salmonella i E. coli) względem mannozy, która tworząc trwałe połączenia z mikroorganizmami sprzyja obniżeniu liczebności patogennych drobnoustrojów jelitowych [Waszkiewicz-Robak, 2006]. W tabeli nr 4 przedstawiono klasyfikację β-glukanów. 56 Tabela 4. Klasyfikacja β-glukanów [Waszkiewicz-Robak, 2006] Pochodzenie Nazwa βglukanu Źródło β-glukanu Lentinian Lentinus edodes (1-3)/(1-6)-β commune (1-3)/(1-6)-β Sclerotium glucanicum (1-3)/(1-6)-β Sclerotium Rolfsii (1-3)/(1-6)-β Sclerotinia (1-3)-β Grifolan Grifola frondosa (1-3)-β Krestin Cariolus versicolor (1-3)-β Pleuran Pleurotus ostreatus (1-3)/(1-4)/(1-6)-β Poria cocos (1-6)-β Skleroglucan Pachyman Kurdlan Bakterie cząsteczce Schizophyllan Schizofilan Grzyby Typ wiązań w Laminarin Exopolisaccharide (EPS) Agrobacterium sp., Alcaligenes faecalis (1-3)-β Laminaria digitata (1-3)/(1-6)-β Sorangium cellulosum (1-4)/(1-6)-β jęczmień (3-11% s.m.) owies (3-7% s.m.) Zboża β-glukan żyto (1,5-6% s.m.) zbożowy (1-3)/(1-4)-β ryż (2% s.m.) pszenica (0,8% s.m.) sorgo (0,2-0,5% s.m.) (1-3)/(1-4)/(1-6)-β S.cerevisiae Drożdże β-glukan S.carlsbergensis (1-3)/(1-6)-β drożdżowy S.Uvarum S.astorianus β-glukan pochodzący z drożdży Saccharomyces cerevisiae należy do substancji, która wykazuje pozytywny efekt immunomodulacyjny zarówno w organizmie zwierzęcym jak i ludzkim [Delaney i wsp., 2003; Hiss i wsp., 2003; Chae, 2006]. Stymuluje on przede wszystkim podstawowe komórki systemu odpornościowego zwane makrofagami [Compton i wsp., 1996; Hunter i Washburn, 1998; Brown i Gordonm 57 2001; Hunter i wsp., 2002]. Komórki te tworzą tzw. pierwszą linię obronną organizmu, która pochłania i niszczy nieporządane mikroorganizmy, bakterie i komórki obce dostające się do wnętrza organizmu. Mechanizm działania β-glukanów opiera się głównie na regulacji procesu metabolizmu tłuszczów w organizmie oraz specyficznym pobudzaniu komórek immunokompetentnych (np.: makrofagów, limfocytów B i T, na których znajdują się swoiste dla nich receptory). Stosowanie dodatku β-glukanów do diety przyczynia się do redukcji ryzyka hipoglikemii, alergii oraz chorób nowotworowych. Efektem działania β-glukanu jest podniesiony stan gotowości organizmu na obronę przeciwko różnego rodzaju infekcjom: wirusowym, bakteryjnym, grzybiczym czy pasożytniczym [Milewski i wsp., 2007]. Zainteresowanie β-glukanem jako dodatkiem do dawek pokarmowych dla zwierząt wzrosło, gdy udowodniono korzystny jego wpływ na dobrostan i zdrowie zwierząt. Poprzez wzmocnienie układu odpornościowego ograniczył on częstotliwość zachorowań [Mantovani i wsp., 2008; Hso-Chi Chung i wsp., 2009], wykazał wysoką aktywność przeciwutleniającą Toklu i wsp., 2006; Sener i wsp., 2007; Ju –Woon Lee i wsp., 2009], polepszył przyswajanie składników pokarmowych zawartych w paszy i wpłynął na poprawę zdrowia [Li i wsp., 2005]. Wielu autorów [Brown i Gordon, 2001; Modesto i wsp., 2009] jest zgodnych z twierdzeniem, że makrofagi odgrywają podstawową rolę w odporności przeciwzakaźnej, w usuwaniu nieprawidłowych lub obumarłych komórek oraz obcych substancji dostających się do wnętrza organizmu. Makrofagi zwane są także komórkami żernymi. Ich rolą jest pochłanianie obcego elementu np. wirusa, bakterii i jego niszczenie w procesie trawienia wewnątrzkomórkowego oraz wyzwalanie dalszej odpowiedzi immunologicznej następującej po strawieniu antygenu. Cząsteczki β-glukanu, ze względu na swoją budowę, idealnie pasują do receptorów znajdujących się na makrofagach (komórkach odpornościowych) i dlatego β-glukan jest stosowany jako preparat wspomagający leczenie chorób powiązanych ze spadkiem odporności organizmu oraz zapobieganiem ponownym infekcjom [Compton i wsp., 1996, Hunter i wsp., 2002; Kivela i wsp., 2009]. Mechanizm aktywacji makrofagów przez β-glukan rozpoczyna się od połączenia substancji czynnych z receptorami na makrofagach. Można porównać obrazowo β-glukan wysokoenergetycznej odżywki dla makrofagów, która wzmacnia ich działanie. 58 do Gedek [2001] oraz Dobicki i wsp., [2005] potwierdzają w swoich badaniach na krowach mlecznych właściwości β-glukanów, które absorbują mikotoksyny grzybów polowych i magazynowych zawartych w paszach. Skutkiem działania β-glukanu jest silniejsza naturalna zdolność organizmu do obrony, która jest niezwykle istotna właśnie w przypadku chorób infekcyjnych obciążających system immunologiczny każdego organizmu [Jamas i wsp., 2002]. βglukan neutralizuje wolne rodniki, które poprzez skutki swego działania są jedną z przyczyn powstawania zaburzeń i chorób metabolicznych [Hongtao i wsp., 2009]. Do substancji prebiotycznych zalicza się również mannano-oligosacharydy (MOS), które są złożonymi węglowodanami wyizolowanymi ze ściany komórkowej drożdży z gatunku Saccharomyces cerevisiae. Substancje te posiadają cenne mannany i β-glukany. Według Abel i Czop, [1992], Tokunaka i wsp., [2000] i Pelizon i wsp., [2005] mechanizm działania β-glukanu polega na wzajemnym jego oddziaływaniu ze swoistymi receptorami, znajdującymi się na powierzchni makrofagów, komórek NK (Natural Killer), limfocytów B i T oraz innych komórek immunokompetentnych. Komórki te identyfikują specyficzną strukturę powierzchni tych cząstek jako obcą (antygen) i uruchamiają nieswoistą odpowiedz immunologiczną za pomocą czynników swoistych przeciwciał. Ponadto β-glukan aktywuje dopełniacz oraz pobudza wytwarzanie interleukin: IL-1, IL-6, IL-10, IL-12 i TNF-α. Efektem tego jest podwyższony stan gotowości układu odpornościowego do obrony organizmu przeciwko różnym czynnikom patogennym znajdującym się w paszy. Zastosowanie β-glukanu w żywieniu różnych gatunków zwierząt Drób Zastosowanie w mieszankach paszowych dla drobiu dodatku β-glukanu [Chae i wsp., 2006; Moralez-Lopez i wsp., 2009; Cox i wsp., 2010; Elrayeh i Yildiz, 2012], nie miało wpływu na przyrosty masy ciała, a nawet spowodowało jej istotne obniżenie u brojlerów [Józefiak i wsp., 2008]. Preparaty, w których składzie znajdowały się drożdże piwne zawierające βglukan wpłynęły na przywrócenie równowagi bakteryjnej przewodu pokarmowego, zahamowały rozwój mikroorganizmów patogennych, przez co wzrosła zdrowotność [Linge, 2005] i przyrosty masy ciała drobiu [Mikulski i wsp., 2008]. 59 Dodatek β-glukanu do dawki pokarmowej dla brojlerów wpłynął pozytywnie na system odpornościowy [Hahn i wsp., 2006; Eicher i wsp., 2006; Chae i wsp., 2006], przyrosty masy ciała i aktywność komórek układu immunologicznego [Cheng i wsp., 2004]. β-glukan zneutralizował wpływu substancji toksycznych i mykotoksyn zawartych w paszy dla brojlerów, indyków i kur [Devegowda i wsp., 1996; Raju i Devegowda, 2000; Smulikowska i wsp., 2005]. Manoj i Devegowda [2001] również potwierdził w badaniach in-vitro wiążące właściwości drożdży Saccharomyces cerevisiae. Badania przeprowadzone przez Huff i wsp., [2006] na kurczętach wykazały, że dodatek β-glukanu u osobników zainfekowanych E.coli zapobiegł obniżeniu masy ciała i pogorszeniu zużycia i wykorzystania paszy oraz ograniczył upadki młodych zwierząt. Również glukomannany, będące elementem ściany komórkowej drożdży, zastosowane łącznie z mykotoksynami w paszy u brojlerów wpłynęły korzystnie na końcową masę ciała zwierząt i obniżenie śmiertelności [Kamalzadeh i wsp., 2009]. W innych badaniach na brojlerach β-glukan zmniejszył upadki zwierząt [Huff i wsp., 2006]. Zastosowanie drożdży Saccharomyces cerevisiae zwierających w swoim składzie β-glukan, zarówno w żywieniu drobiu [Asli i wsp., 2007, Yousefi i Karkoodi, 2007] jak i kurcząt [Çelik i wsp., 2007] nie miało wpływu na przyrosty dobowe masy ciała tych zwierząt. Według Józefiaka i wsp., [2008] dodatek do paszy dla brojlerów βglukanu istotnie (P≤0,05) obniżył masę ciała zwierząt doświadczalnych. Trzoda chlewna W stosowanych dawkach pokarmowych dla trzody chlewnej udział drożdży paszowych suszonych, zawierających w swoim składzie β-glukan mieści się w przedziale od 2 do 5% [Skomiał, 2001]. Zastosowanie nawet niewielkiego dodatku βglukanu w ilości 0,025% i 0,05% lub 0,04% do paszy dla odsadzonych prosiąt poprawiło przyrosty masy ciała, wykorzystanie paszy oraz wpłynęło immunomodulująco [Schoenherr i wsp., 1994; Dritz i wsp., 1995]. U dorosłych świń dodatek β-glukanu również poprawił przyrosty masy ciała oraz naturalne mechanizmy obronne organizmu [Li i wsp., 2005 i 2006; Hahn i wsp., 2006]. U prosiąt oraz loch karmiących, dawka pokarmowa zawierająca dodatek od 3% do 4% β-glukanu wpłynęła na wzrost wykorzystania składników pokarmowych zawartych w paszy, co przełożyło 60 się na wyższe przyrosty masy ciała i spadek częstotliwości zachorowań u prosiąt [Jurgens i wsp., 1997]. Schoenherr i wsp., [1994] oraz Dritz i wsp., [1995] są zdania, że wskaźniki wydajności produkcji trzody chlewnej uzależnione są od ilości lub stężenia β-glukanu zastosowanego w diecie u tych zwierząt. Autorzy ci są zdania, że optymalny poziom βglukanu w mieszance paszowej, po którym możemy zaobserwować wzrost masy ciała i wyższe przyrosty to zastosowanie tego dodatku w ilości od 0,025% do 0,05% lub stężeniu od 250-500 mg/kg paszy. Suplementacja paszy β-glukanem wynosząca powyżej 1.000mg/kg paszy obniżyła przyrosty zwierząt [Schoenherr i wsp., 1994]. Dodatek drożdży Saccharomyces cerevisiae do mieszanki dla loch ciężarnych, prosiąt ssących i odsadzonych wpłynął korzystnie na przyrosty masy ciała tych zwierząt [Schoenherr i wsp.,1994; Dritz i wsp., 1995; Jurgens i wsp., 1997; Eicher i wsp., 2006]. Zastosowanie β-glukanu w dawce pokarmowej dla świń [Hiss i Sauerwein, 2003] i prosiąt [Hester i wsp., 2012] oraz drożdży Saccharomyces cerevisiae dla tuczników nie miało wpływu na przyrosty masy ciała tych zwierząt [Rekiel i wsp., 2008]. W doświadczeniu przeprowadzonym przez Hiss i Sauerwein [2003] przy zastosowaniu w paszy dodatku β-glukanu w ilości 0,015 i 0,03% nie wykazano wpływu na przyrosty masy ciała i parametry morfologiczne oraz immunologiczne. Hester i wsp., [2012] również nie potwierdzili wpływu β-glukanu na przyrosty masy ciała, długość i masę jelit oraz długość kosmków jelitowych i głębokość krypt jelitowych. Zastosowany dodatek nie miał wpływu na rozwój parametrów jelitowych oraz immunologicznych u 3 tygodniowych prosiąt. Warchlaki żywione mieszankami zawierającymi 1-2,5% dodatek drożdży piwnych charakteryzowały się lepszym wykorzystaniem paszy oraz obniżyła się liczba padnięć i wybrakowań [Fuchs i wsp., 2011]. Suplementacja drożdżami piwnymi paszy dla loch prośny i karmiących pozytywnie wpłynął na parametry odchowu prosiąt. Drożdże Saccharomyces cerevisiae wprowadzone do mieszanki dla loch ciężarnych, prosiąt ssących i odsadzonych wpłynęły korzystnie na przyrosty masy ciała tych zwierząt [Schoenherr i wsp., 1994; Dritz i wsp., 1995; Jurgens i wsp., 1997; Hiss i Sauerwien, 2003]. Zastosowanie β-glukanu w ilości 0,015 i 0,03% w dawce pokarmowej dla rosnących świń nie miało wpływu na przyrosty masy ciała [Hiss i Sauerwien, 2003]. Również dodatek drożdży Saccharomyces cerevisiae w paszy u tuczników nie wpłynęło na przyrosty masy ciała tych zwierząt [Rekiel i wsp., 2008]. 61 Wprowadzenie do dawki pokarmowej drożdży Saccharomyces cerevisia i βglukanów spowodowało wyższe tempo wzrostu, lepsze wykorzystanie paszy i podwyższenie zdrowotność oraz ograniczało namnażanie bakterii E. coli i Clostridium sp., co ograniczało występowanie biegunek [Fuchs i wsp., 2011]. Pozytywny wpływ zastosowania w dawce pokarmowej drożdży oraz produktów ich frakcjonowania w żywieniu świń potwierdza wielu badaczy [Zimmermann i wsp., 2001; Hahn i wsp., 2006, Li i wsp., 2006; Fuchs i wsp., 2007; Fuchs i wsp., 2011].U rosnących świń pozytywny wpływ zastosowanego dodatku drożdży stwierdza się przede wszystkim poprzez wyższe tempo wzrostu [Schoenherr i wsp., 1994; Dritz i wsp. 1995; Fuchs i wsp., 2005 i 2011] oraz wzrost liczby komórek kubkowych w kryptach i kosmkach jelita cienkiego oraz zwiększenie wydzielania mucyn [Rekiel i wsp., 2008]. Przeżuwacze Zastosowanie dodatku drożdży piwnych Saccharomyces cerevisiae do dawki pokarmowej dla krów wykazało szerokie spektrum pozytywnych działań m. in. poprzez wpływ na stymulację wzrostu bakterii żwaczowych (celulolitycznych i proteolitycznych), które są odpowiedzialne za metabolizm azotu i włókna ADF oraz odpowiednie wykorzystanie energii z paszy. Wielu autorów jest zdania, że zastosowanie drożdży piwnych w żywieniu krów mlecznych zmienia korzystnie skład mleka [Skórko-Sajko i wsp., 1993; Dobicki i wsp., 2006 i 2007; Kinal i wsp., 2007] oraz stymuluje układ odpornościowy organizmu [Dobicki i wsp., 1994]. W dawkach pokarmowych dla krów w okresie laktacji zastosowanie ścian komórkowych drożdży Saccharomyces cerevisiae podwyższyło wydajność mleczną tych zwierząt. Mleko charakteryzowało się wyższą zawartością suchej masy, białka, tłuszczu i laktozy [Nocek i wsp., 2002; Lehloenya i wsp., 2008; Sretenowiĉ i wsp., 2011] oraz składników mineralnych [Strusińska i wsp., 2004]. Dobicki i wsp., [2007] przy stosowaniu tego rodzaju dodatków stwierdzili obniżenie (P≥0,01) liczby komórek somatycznych w mleku (LKS), których wysoki poziom świadczy o infekcji wymienia. W tym samym doświadczeniu Dobicki i wsp., [2007] odnotowali wzrost liczby krwinek białych (WBC), krwinek czerwonych (RBC), aminotransferazy alaninowej (ALT) oraz immunoglobulin klasy IgG w surowicy krwi, 62 co świadczy o korzystnej stymulacji układu immunologicznego krów. Zastosowany dodatek nie miał wpływu na wskaźniki morfologiczne (PLT, MCV, MCH, MCHC) i biochemiczne (AST, mocznik, cholesterol, białko, albuminy, globuliny, glukoza). W innym eksperymencie Dobicki i wsp., [2006] przetestowali w żywieniu krów mlecznych dodatek preparatu z suszonych drożdży piwnych Saccharomyces cerevisiae zawierający w swoim składzie mannanooligosacharydy (MOS). Użyty w badaniach dodatek miał wpływ na wzrost mleczności, zmianę składu mleka oraz obniżenie ilości komórek somatycznych w mleku, co może świadczyć o stymulacji układu immunologicznego. W płynie żwaczowym stwierdzono wzrost populacji bakterii żwaczowych u krów otrzymujących w dawce pokarmowej wspomniany dodatek mannanooligosacharydów. Wzrost mleczności u krów po zastosowaniu dodatku drożdży piwnych odnotowano również w doświadczeniu Korniewicza i wsp., [2005]. Eksperyment Dolezala i wsp., [2005] na bydle mlecznym wykazał korzystny wpływ suplemenacji Saccharomyces cerevisiae (P≤0,01) na produkcję krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA), wartość pH treści żwacza, wykorzystanie amoniaku i populację pierwotniaków. Zastosowanie mannano- oligosacharydów w żywieniu cieląt wywarło korzystny wpływ na wzrost masy ciała, wyższe przyrosty masy ciała oraz lepsze wykorzystania paszy na jednostkę przyrostu. Nukleotydy drożdżowe wchodzące w skład preparatów mleko zastępczych dla cieląt miały pozytywny wpływ na zwiększenie masy ciała, przyrostów masy ciała oraz obniżyło wykorzystanie paszy na jednostkę przyrostu. Wpłynęło również na parametry morfologiczne (krwinki białe-WBC, krwinki czerwone- RBC) i biochemiczne (poziom glukozy, mocznika, stężenie cholesterolu całkowitego) oraz wzrost stężenia gammaglobulin w surowicy krwi. Pod wpływem zastosowanych nukleotydów drożdżowych nie zmieniło się stężenie hemoglobiny i hematokrytu oraz poziom aminotransferazy asparaginianowej (AST). W płynie żwaczowym u cieląt otrzymujących preparat mlekozastępczy suplementowany nukleotydami drożdżowymi wzrosła ilość lotnych kwasów tłuszczowych oraz liczba bakterii [Król, 2011]. Wyższa masa ciała oraz większe przyrosty dzienne to efekt zastosowania u jagniąt [Milewski, 2009] dodatku suszonych drożdży Saccharomyces cerevisiae zawierających w swoim składzie β-glukan oraz u cieląt preparatu zawierającego w swoim składzie β-glukan [Szymańska-Czerwińska i Bednarek, 2007]. Według Dobrzańskiego i wsp., [2006] drożdże paszowe w żywieniu zwierząt stosuje się od 63 ponad stu lat, gdyż uważane są za źródło dobrze trawionego białka, które charakteryzuje się bogatym składem aminokwasowym w tym lizyny, leucyny, treoniny i waliny. W doświadczeniu przeprowadzonym przez Mordak i wsp., [2008] po zastosowaniu suszonych drożdży piwnych Saccharomyces cerevisiae w żywieniu krów mlecznych w okresie okołoporodowym nie stwierdzili zatrzymania błon płodowych i zalegania poporodowego. Choroby metaboliczne oraz procesy zapalane gruczołu mlekowego i macicy były znacznie niższe w porównaniu do grupy kontrolnej. Odnotowano również obniżenie liczby komórek somatycznych w mleku, co świadczy o pozytywnym wpływie żywienia na parametry procesu immunomodulacji. Zastosowanie β-glukanu w żywieniu jagniąt ssących miało pozytywny wpływ na cechy użytkowości mięsnej. Odnotowano wyższe tempo wzrostu i przyrosty dobowe masy ciała oraz wzrost aktywności lizozymu (50%) i gamma-globulin (30%) [Milewski i wsp., 2007]. Iniekcja z roztworem β-glukanu wykazała właściwości immunomodulujące w zapobieganiu zapalenia gruczołu mlekowego u owiec (mastitis) [Waller i Coldits, 1999]. W badaniach przeprowadzonych przez Wójcik i wsp., [2007] na owcach, wykazano pozytywny efekt działania β-glukanu, na wybrane wskaźniki nieswoistej odporności komórkowej zależnej od limfocytów i granulocytów oraz wzrost wewnątrzkomórkowej aktywności bio-bójczej fagocytów (PKA) i aktywności proliferacyjnej limfocytów krwi (MTT). W grupie jagniąt ssących parametry nieswoistej odporności humoralnej [Milewski i wsp, 2007] wykazały wyższe wartości w grupie doświadczalnej otrzymującej dodatek β-glukanu w paszy. Milewski [2009] wykazał (P≤0,05) wyższą masę ciała oraz większe przyrosty dzienne jagniąt ssących po zastosowaniu dodatku suszonych drożdży Saccharomyces cerevisiae zawierających w swoim składzie βglukan. 64 Zwierzęta laboratoryjne Beta-glukan zastosowany w dawce pokarmowej u szczurów nie miał wpływu na masę ciała, przyrosty i spożycie paszy [Delaney i wsp., 2003; Jonker i wsp., 2009]. Dawka pokarmowa z dodatkiem β-glukanu wpłynęła na neutralizację toksyn zawartych w paszy szczurów [Toklu i wsp., 2006]. W badaniach przeprowadzonych przez Toklu i wsp., [2006], Sener i wsp., [2007] oraz Ju –Woon Lee i wsp., [2009] wykazano, że właściwości antyoksydacyjne β-glukanu przyczyniły się do złagodzenia wpływu substancji szkodliwych na narządy wewnętrzne. Z eksperymentu wykonanego przez Babicěk i wsp., [2007] wynika, że zastosowanie β-glukanu nie spowodowało istotnych zmian w parametrach morfologicznych i biochemicznych krwi, śmiertelności zwierząt oraz zmianach histopatologicznych w narządach wewnętrznych, co świadczy o braku efektu toksycznego podawanych stężeń β-glukanu. W badaniach Jonker i wsp., [2009] dodatek β-glukanu w diecie dla szczurów spowodował spadek poziomu cholesterolu i lipidów we krwi natomiast w badaniach Delaney i wsp., [2003] wzrosła zawartość krwinek białych oraz ilość limfocytów we krwi, a pozostałe parametry krwi (bazofile, neutrofile i monocyty) nie uległy zmianie. Badania histologiczne nie wykazały zmian w budowie i funkcjonowaniu narządów wewnętrznych, co świadczy o braku efektu toksycznego zastosowanych dawek. W doświadczeniach przeprowadzonych na myszach zaobserwowano efekt cytoochronny na komórki i narządy wewnętrzne oraz właściwości antyoksydacyjne [Toklu i wsp., 2006]. β-glukan stosowany w dawce pokarmowej obniżył toksyczny wpływ aminopentanu na parametry morfologiczne i biochemiczne krwi i zneutralizował wprowadzane toksyny [Toklu i wsp., 2006; Ju-Woon Lee i wsp., 2009; Oliveira i wsp., 2009; Masuda i wsp., 2009]. Ponadto β-glukan wykazał zróżnicowany wpływ na aktywność komórek fagocytarnych, w zależności od drogi jego aplikacji, co zaobserwował Sakurai i wsp., [1992] u myszy. Makrofagi tych zwierząt, po dożylnym wprowadzeniu β-glukanu, zwiększyły swoją aktywność fagocytarną, produkcję H2O2 i interleukiny I (IL-1) w porównaniu do zwierząt grupy kontrolnej. Natomiast w grupie myszy traktowanych β-glukanem dootrzewnowo takiego zjawiska nie odnotowano. Trzeba zaznaczyć, że właściwości prozdrowotne z udziałem β-glukanu w dawce pokarmowej przeprowadzone na szczurach potwierdziło wielu autorów [Delaney i wsp., 2003; Toklu i wsp., 2006; Babicěk i wsp., 2007; Sener i wsp., 2007; Jonker i wsp., 2009]. 65 2.3 Charakterystyka synbiotyków Koncepcja synbiotyków jest stosunkowo nowa [Pool-Zobel i Sauer, 2007]. Połączenie probiotyku i prebiotyku w jednym produkcie stwarza szansę wzmocnienia prozdrowotnych właściwości każdej z tych dwóch substancji. Zastosowanie w diecie łącznie probiotyku z prebiotykiem powoduje korzystniejszy efekt zdrowotny niż w przypadku zastosowania każdej substancji osobno. Pozytywne wyniki badań doświadczalnych oraz wynikająca z nich potrzeba stosowania tego rodzaju dodatków powodują wzrost liczby publikacji dotyczących wpływu synbiotyków na zdrowie i funkcjonowanie organizmów [Brzóska i wsp., 2007; Reid, 2008]. Celem stosowania w żywieniu zwierząt oraz ludzi synbiotyków jest przede wszystkim poprawa przeżywalności i kolonizacji szczepów probiotycznych wprowadzonych do wnętrza organizmu [Gibson i Roberfroid, 1995; Asahara i wsp., 2001; Roller i wsp., 2004; Awad i wsp., 2009; El-Banna i wsp., 2010]. Probiotyki, będące elementem synbiotyku, wpływają przede wszystkim na utrzymanie odpowiedniego poziomu biocenozy jelit. W sposób naturalny przywracają stan równowagi mikro środowiska jelitowego w momencie wystąpienia czynników zakłócających (stres, patogeny, zanieczyszczenia paszy) oraz uszczelniają barierę jelitową. Odpowiedzialne są za produkcję jelitowego śluzu, pobudzają aktywność makrofagów, komórek NK (z ang. natural killer) oraz plazmocytów i limfocytów B do produkcji przeciwciał (IgA i IgM). Probiotyki stymulują powstawanie limfocytów T przeciwzapalnych, które produkują mediatory w reakcjach zapalnych oraz obniżają poziom prozapalnych cytokin i modulują powierzchnię komórek dendrytycznych. Komensalne bakterie jelitowe uważane są za stałe i niezbędne źródło pobudzania nieswoistej odporności organizmu. Drugi składnik synbiotyku czyli prebiotyk korzystnie wpływa na wzrost i przeżywalność bakterii probiotycznych [Gibson, 2003; Roberfroid, 2007]. Poprzez odpowiednie dostosowanie określonego podłoża do metabolizmu probiotyków, szczepy probiotyczne mają wyższą szansę na kolonizację przewodu pokarmowego i większą zdolność konkurowania z dostającymi się do treści jelita patogenami [Maitin i Rastall, 2002]. Synbiotyk, poprzez swoje naturalne działanie wpływa na utrzymanie w jelitach środowiska kwaśnego, wytwarzanie nadtlenku wodoru, co uniemożliwia rozwój patogenów bakteryjnych i wirusowych, a tym samym adhezję bakterii do ścian jelit. 66 W wielu eksperymentach synbiotyk wykazywał działanie stymulujące układ immunologiczny [Roller i wsp., 2004; Van Loo, 2004; Lasek i wsp., 2008; Frence i wsp., 2009; Rafter i wsp., 2010]. Wzmacnianie systemu odpornościowego odbywa się na drodze modyfikacji humoralnej i komórkowej oraz regulacji odporności wrodzonej [Romański, 2007] i odporności nieswoistej [Isolauri i wsp., 2001]. Wyniki wielu badań naukowych [Maitin i wsp., 2002; Rafter i wsp., 2010; Roberfroid i wsp., 2010] dowodzą, że synbiotyki hamują rozwój chorobotwórczych szczepów bakterii, utrzymują niskie pH w jelitach i sprzyjają zachowaniu równowagi w składzie mikroflory jelitowej, co pozytywnie wpływa na wzrost i rozwój młodych zwierząt. Poprzez swoje działanie regulują motorykę przewodu pokarmowego, stymulują układ immunologiczny - odporność komórkową i humoralną, obniżając zdolność przylegania czynników patogennych do ścianek jelit [Ochmański i Barabasz, 1999; Bednarek i Szymańska-Czerwińska, 2008] oraz przyczyniają się do obniżenia ryzyka wystąpienia nowotworów jelit [Juśkiewicz i wsp., 2007; Rautonen i wsp., 2008; Wang, 2009]. Wymienione czynniki w sposób korzystny wpływają na zdrowie i procesy biologiczne zachodzące w całym organizmie. Z innych doświadczeń [Zduńczyk i wsp., 2004; Juśkiewicz i wsp., 2007] wynika, że po zastosowaniu w diecie synbiotyków hamowane są procesy gnilne w jelicie grubym, które są odpowiedzialne za powstawanie związków rakotwórczych i procesów zapalnych ściany jelita przewodu pokarmowego. Składniki synbiotyku mają wpływ na obniżenie aktywności enzymów jelitowych (β-glukozydazy, β-galaktozydazy oraz β-glukoronidazy), których obecność, według Żary-Sikorskiej i Juśkiewicza [2007] jest wyznacznikiem aktywności mikroorganizmów patogennych w organizmie. Lopez i wsp., [2007] oraz Butler i wsp., [2007] zwracają uwagę, iż synbiotyki przyczyniają się do usprawnienia wchłaniania związków mineralnych (wapnia, magnezu, żelaza) oraz syntezy witamin (B1, B2, B12), które są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania i wzrostu każdego organizmu. Ponadto stwierdzono, że proliferacja komórek nabłonka jelita grubego, zwiększona międzykomórkowa bierna dyfuzja jonów oraz zmiana parametrów morfometrycznych jelit są efektem stosowania dodatków paszowych o charakterze synbiotycznym. W pomiarach morfometrycznych jelit długość kosmków jest wyznacznikiem ich aktywności, a krypty jelitowe odpowiedzialne są za wytwarzanie kosmków oraz są rezerwuarem komórek o charakterze totipotencjalnym, komórek macierzystych i przejściowych. Głębsze krypty 67 odpowiadają za skuteczniejszą wymianę komórek nabłonka jelitowego w odpowiedzi na jego stopniowe złuszczanie czy stany zapalne. Natomiast skrócenie kosmków przy większej głębokości krypt osłabia absorpcję składników pokarmowych, zwiększa sekrecję w przewodzie pokarmowym i obniża wskaźniki produkcyjne zwierząt [Xu i wsp., 2003]. Potencjał prozdrowotny stosowania synbiotyków związany jest ze zdolnością do obniżania ekspresji wielu czynników zapalnych. Składniki te mogą stanowić ochronę przed karcynogenami pochodzącymi z paszy i wody, a będącymi pierwszymi mediatorami procesu zapalnego w błonie śluzowej jelit. Skuteczność stosowania synbiotyków została potwierdzona wielokrotnie w procesach redukcji początkowych zmian nowotworowych jelit [Rowland i wsp., 1998]. Z wielu doświadczeń [Rowland i wsp., 1998; Femia i wsp., 2002; Gibson i Roberfroid, 2008] wynika, że synbiotyk lepiej chroni przed działaniem związków i czynników nowotworowych niż podawanie każdej z tych substancji wchodzących w jego skład osobno. Dobrym przykładem jest doświadczenie Rowland’a i wsp., [1998], którzy stwierdzili, że zastosowanie w diecie u szczurów połączenia probiotyku z prebiotykiem w postaci synbiotyku było bardziej efektywne w redukcji komórek nowotworowych jelita niż zastosowanie każdej z tych substancji osobno. Zatem łączne stosowanie tych dodatków zwiększa ich skuteczność działania na organizm gospodarza. Wpływ synbiotyku na mikroflorę jelitową Podczas życia płodowego przewód pokarmowy organizmu uważany jest za jałowy i pozbawiony flory jelitowej, która istotnie wpływa na podstawowe mechanizmy immunologiczne. Jedynym czynnikiem obronnym nowo narodzonego organizmu są immunoglobuliny matczyne dostarczone przez łożysko oraz różne mikroorganizmy, które dostały się podczas porodu. Możemy wśród nich wyróżnić trzy podstawowe grupy, których obecność lub brak decyduje nie tylko o zdrowiu noworodka, ale i każdego organizmu. Pierwszą grupę stanowią mikroorganizmy pożyteczne (Lactobacillus, Bifidobacterium), które hamują rozwój czynników szkodliwych i patogennych. Kolejna grupa to mikroorganizmy potencjalnie szkodliwe (E.coli) ujawniające swoją obecność w momencie osłabienia organizmu. Ostatnia grupa to organizmy bezwzględnie szkodliwe (Clostridium) produkujące substancje toksyczne lub 68 kancerogenne, których obecność zaburza homeostazę ekosystemu jelit oraz wpływa negatywnie na zdrowie i funkcjonowanie całego organizmu. Na kształtowanie się flory jelitowej w pierwszych dniach życia wpływa wiele czynników. Warty zwrócenia uwagi jest fakt, że za najważniejszy czynnik determinujący skład i funkcjonowanie ekosystemu organizmu uważa się odżywianie. W mleku matki obok cennych oligosacharydów, które stymulują rozwój pożytecznych bakterii jelitowych stwierdzono występowanie humoralnych mediatorów układu obronnego w tym immunoglobulinę wydzielniczą IgAs, cytokiny oraz czynniki wzrostu (Il-1, Il-6, Il-8, G-SCF, M-SCF, TNF-α i TFNβ). Układ odpornościowy młodego organizmu od chwili urodzenia nabywa zdolność wytwarza immunoglobuliny IgA i w tym procesie największe znaczenie odgrywa układ odpornościowy jelita (GALT). Brak równowagi mikrobiologicznej organizmu przyczynia się bezpośrednio do szerokiego spektrum chorób wynikających z rozwoju cywilizacji, zanieczyszczenia środowiska i innych czynników, które negatywnie wpływają na zdrowie i funkcjonowanie zarówno ludzi jak i zwierząt. Według Gibsona i wsp., [2004] mikroflora jelitowa odgrywa bardzo ważną rolę pod względem żywieniowym, gdyż zapobiega kolonizacji potencjalnie patogenicznych mikroorganizmów oraz jest ważnym źródłem energii dla komórek ściany jelita pochodzącej z procesu fermentacji węglowodanów do kwasów SCFA, w tym kwasu masłowego. Poprzez interakcje pomiędzy komórkami nabłonka jelitowego, a systemem odpornościowym związanym z jelitami (GALT) ma miejsce zjawisko różnicowania komórek ściany jelita, ekspresji genów i receptorów oraz modulacja procesów metabolicznych. Główna rola mikroflory jelitowej polega na zapobieganiu zjawiska dysbiozy oraz redukcji wystąpienia ryzyka jednostek chorobowych (zaparcia, biegunki, nowotwory jelit, atopowe zapalenia, alergia, otyłość, autyzm) [Gibson i Roberfroid, 2008]. Z badań przeprowadzonych przez Maitin i Rastall, [2002], Pool-Zobel i wsp., [2007] oraz Frence i wsp., [2009] wynika, że dobierając odpowiednio skład probiotyków i prebiotyków można wpływać na ilościowy i jakościowy skład krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFAs) powstałych w jelicie grubym podczas procesu fermentacji. Te z kolei są włączane w metabolizm ogólnoustrojowy lub wykorzystywane jako główne źródło energii dla kolonocytów [Roberfroid, 2000; 69 Cummings i wsp., 2001]. Kwasy SCFA lub ich sole, wykazują działanie na geny regulujące rozrost komórek jelit [Blottiere i wsp., 1999]. Głównym źródłem energii dla komórek nabłonka okrężnicy są maślany, które wpływają na rozrost komórek uwalniając czynniki wzrostu lub peptydy żołądkowo - jelitowe (np. gastrynę), albo za pomocą stymulacji przepływu krwi przez jelita [Blottiere i wsp., 1999]. Synbiotyki stanowią barierę dla antygenów pochodzących z diety i szkodliwych substancji występujących w treści przewodu pokarmowego oraz regulują motorykę jelit zapobiegając biegunkom o podłożu bakteryjnym lub wirusowym. Substancje synbiotyczne przyczyniają się do rozwoju korzystnych bakterii jelitowych oraz zapobiegają nawrotom infekcji grzybiczych i bakteryjnych błon śluzowych organizmu. Nieodpowiednie funkcjonowanie układu odpornościowego zaburza mikro środowisko jelitowe i przyczynia się do występowania chorób układu pokarmowego, w tym nieprawidłowej motoryki jelit objawiającej się biegunką. Wystąpienie niewłaściwej, fizjologicznej pracy jelit ma negatywny wpływ na skład flory bakteryjnej oraz na barierę mikrobiologiczną występującą w obrębie tkanki limfatycznej błony śluzowej jelita cienkiego, co ma pośrednio wpływ na cały układ odpornościowy oraz na prawidłowe wchłanianie składników pokarmowych niezbędnych do prawidłowego rozwoju każdego organizmu. Zdrowy organizm to przede wszystkim sprawny układ pokarmowy oraz system obronny, który obniża ryzyko zachorowania, wystąpienia chorób bakteryjnych, wirusowych i pasożytniczych, przez co w sposób naturalny przyczynia się do szybszego wzrostu osobników młodocianych. Układ immunologiczny jelit oraz wpływ synbiotyków na parametry odpornościowe organizmu Nieodpowiednie funkcjonowanie układu odpornościowego (infekcje, alergie) zaburza mikro środowisko jelitowe i przyczynia się do występowania chorób układu pokarmowego, których efektem jest nieprawidłowa motoryka jelit w postaci biegunek lub zaparć. Stosowanie w żywieniu dodatku synbiotyków zapobiega występowaniu niewłaściwej pracy jelit, która ma negatywny wpływ na skład flory bakteryjnej oraz na barierę mikrobiologiczną występującą w obrębie tkanki limfatycznej błony śluzowej jelita cienkiego. 70 Synbiotyki należą do substancji, które poprzez swoje naturalne działanie bezpośrednio wpływają na układ odpornościowy warunkując podwyższenie zdrowotności. Synbiotyki odpowiedzialne są za prawidłowe wchłanianie składników pokarmowych i związków mineralnych oraz produkcję niektórych witamin przez co mają istotny wpływ na prawidłowy wzrost i funkcjonowanie organizmu. Największym narządem odpornościowym organizmu jest jelito, gdyż w błonie śluzowej jelita znajduje się ok. 80% wszystkich komórek immunokompetentnych (immunoglobulin) i 50% wszystkich limfocytów. Ponadto ilość wydzielonej na powierzchni układu pokarmowego immunoglobuliny (IgA) oraz liczba limfocytów są najwyższe w porównaniu do pozostałych narządów limfoidalnych. Romański [2007] zwraca uwagę, że na skuteczne funkcjonowanie układu immunologicznego jelit wpływa przede wszystkim bariera mechaniczna w postaci nabłonka jelitowego i warstwy śluzu, które uważane są za mechanizm odporności wrodzonej. Układ immunologiczny przewodu pokarmowego posiada zdolność do odróżniania czynników patogennych od naturalnie występującej flory i fauny organizmu oraz neutralizuje antygenty uznane za szkodliwe, przez co modyfikuje procesy immunologiczne w całym organizmie. Na zaburzenie funkcjonowania i równowagi pomiędzy układem pokarmowym, a obronnym wpływ mają przede wszystkim liczne błędy żywieniowe i powstałe na tym tle choroby metaboliczne [Romański, 2007]. W celu zwalczania czynników chorobotwórczych i patogennych dostających się do wnętrza organizmu wykształcony został złożony system tkanki limfatycznej związanej z błoną śluzową i podśluzową układu pokarmowego MALT (z ang. mucosalassociated-lymphoid-tisues), a w szczególności w obrębie błony śluzowej jelit-układu GALT (z ang. gut associated lymphoid tissue). Do układu GALT należy ponad 70% komórek limfatycznych całego układu pokarmowego. W przewodzie pokarmowym dochodzi do kontaktu układu immunologicznego jelit (GALT) z jelitowym układem nerwowym ENS (z ang. enteric nervous system), który jest odpowiedzialny za motorykę jelit oraz zachodzące w nim procesy absorpcyjne i wydzielnicze [Górska i wsp., 2009]. Najważniejszym zadaniem układu MALT, a tym samym układu GALT jest rozpoznawanie i odróżnianie inwazyjnych patogenów od nieszkodliwych oraz substancji niezbędnych do prawidłowego funkcjonowania organizmu [Santor, 2008] oraz wydzielanie na powierzchni błony śluzowej jelit przeciwciał IgA-zwanych przeciwciałami wydzielniczymi (IgAs). Główną funkcją przeciwciał IgAs jest 71 wychwytywanie obcych antygenów i blokowanie im przejścia przez błonę śluzową w głębsze warstwy ściany jelita. W układzie MALT możemy wyróżnić zarówno komórki będące elementem odporności wrodzonej, jak i nabytej [Górska i wsp., 2009]. Z kolei w skład układu GALT wchodzą skupiska grudek limfatycznych, zorganizowane kompleksy komórkowe (kępki Peyera i samotne grudki chłonne) oraz rozproszone komórki zlokalizowane zarówno w blaszce właściwej jelita (limfocyty T i B, makrofagi, komórki dendrytyczne) jak i w okolicach nabłonka (limfocyty śródnabłonkowe). Najbardziej aktywne immunologicznie są kępki Peyera, grudki limfatyczne i limfocyty występujące między komórkami nabłonkowymi oraz pod błoną właściwą jelit. Kępki Peyera to grudki limfatyczne skupione, które zawierają limfocyty B i T. Razem z samotnymi grudkami chłonnymi są miejscem indukcji odpowiedzi immunologicznej na antygeny zewnętrzne. Odgrywają one rolę w rozpoznawaniu i wytwarzaniu odpowiedzi immunologicznej na antygeny chorobotwórczych mikroorganizmów, które mogą pojawić się w tej części przewodu pokarmowego. Według Gibsona i Roberfroida [2008] mikroorganizmy jelitowe, nabłonek cylindryczny oraz układ odpornościowy związany z błoną śluzową tworzą wysoce zintegrowany ekosystem jelitowy określany jako GES (z ang. gastrointestinal ekosystem). Multipotencjalne komórki nabłonka ulegają szybkiemu różnicowaniu w enterocyty, komórki Gobleta, komórki Panetha, komórki M oraz komórki endokrynne. Komórki Panetha wydzielają substancje antybakteryjne (lizoym, defensyny, sekrecyjna fosfolipaza A2). Komórki Gobleta to wyspecjalizowane enterocyty, które wydzielają glikokaliks przez co tworzą kolejną i skuteczną linię obronną organizmu. Uważa się, że enterocyty to kluczowe i podstawowe komórki nabłonkowe jelit, które odpowiedzialne są za wchłanianie substancji odżywczych oraz biorą udział w miejscowym mechanizmie obronnym. Wytwarzają liczne kationowe białka o działaniu przeciwbakteryjnym, w tym mucyny, lizozym, katelicydyny i defensyny, które według Fric [2007] hamują rozwój mikrobów oraz ich przyleganie do nabłonka jelitowego. W ścianie jelita produkowane są również interleukiny (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10), TNFα, TNGβ oraz niektóre chemokiny (MIP-3α, TARC). W blaszce właściwej śluzówki znajduje się sieć naczyń limfatycznych oraz występują plazmocyty (produkujące przeciwciała), T-limfocyty (CD4+ T-helperwoe) i makrofagi. Plazmocyty wydzielają immunoglobuliny 72 IgA. W badaniach doświadczalnych na zwierzętach stwierdzonio, że pod wpływem dodatków paszowych o charakterze synbiotycznym enterocyty krypt jelitowych zwiększają lub zmniejszają aktywność proliferacyjną. Zmianie ulega ich aktywność wydzielnicza, np. produkcja śluzu i czynników bakteriobójczych. Zdolność wytwarzania peptydów antybakteryjnych (katelicydyna) posiadają także komórki pośrednie krypt jelitowych oraz enterocyty [Rekiel i wsp., 2008]. Komórki nabłonkowe (komórki M) odpowiedzialne są za odnowę mikrokosmków, transport cząsteczek i mikroorganizmów ze światła jelit do głębszych warstw nabłonka. Funkcja immunologiczna komórek M polega na wychwytywaniu antygenów jakie wprowadzane są do wnętrza organizmu i przekazywaniu ich komórkom prezentującym antygen (limfocytom T i B) oraz ściśle z nimi związanymi komórkami APC (z ang. antygen presenting cells) lub komórkami dendrytycznymi DP (z ang. dendric cells). Powierzchnia błon śluzowych jelit jest miejscem pierwszego kontaktu z dużą ilością antygenów oraz miejscem wnikania drobnoustrojów, które są wprowadzane m.in. razem z paszą do wnętrza organizmu. Z dotychczasowych badań [Mikkelsen i wsp., 2004; Pickard i wsp., 2004] wynika, że dodatki paszowe o charakterze synbiotycznym korzystnie wpływają na działanie układu odpornościowego oraz immunomodulację organizmu poprzez zwiększenie m.in. ilości bakterii zakwaszających środowisko (głównie kwasu mlekowego) oraz aktywację tkanki limfatycznej związanej z błonami śluzowymi (tzw. układ GALT). Badania przeprowadzone przez Isolaurii i wsp., [2001] wskazują, że efekt ten jest związany ze stymulującym wpływem bakterii probiotycznych na mechanizm odporności nieswoistej (zwiększone namnażanie makrofagów i ich aktywności fagocytarnej oraz syntezy komórek NK. Efekt probiotycznych bakterii uwidacznia się również w zmianie mechanizmu odporności swoistej, w tym komórkowej (pobudzanie makrofagów do produkcji cytokin aktywizujących limfocyty Tc) i humoralnej (pobudzanie limfocytów B do syntezy różnego rodzaju przeciwciał antybakteryjnych, a przede wszystkim IgA w jelitach). Immunoglobuliny typu IgA odgrywają rolę w mechanizmach odpornościowych w obrębie błon śluzowych przewodu pokarmowego i zapobiegają kolonizacji patogenów, stymulując układ immunologiczny. Socha i wsp., [2002] zaobserwowali aktywację limfocytów T, wzrost syntezy IgA, IgG i pobudzenie aktywności 73 makrofagów przy stosowaniu synbiotyków. Oprócz tego stwierdzono pobudzenie odpowiedzi typu humoralnego i komórkowego. Korzystne działanie synbiotyków polega na modulowaniu ogólnej lub miejscowej odpowiedzi immunologicznej, m.in. poprzez pobudzenie syntezy IgA, IgG oraz aktywacje limfocytów T i makrofagów, zmniejszaniu przepuszczalności błony śluzowej jelit, eliminowaniu bakterii patogennych oraz degradacji antygenów. Immunoglobulina typu IgM eliminuje patogeny we wczesnych stadiach odporności zależnej od limfocytów B, zanim zostaną wyprodukowane wystarczające ilości IgG. Uważa się, że IgM stanowią pierwszą linię obrony immunologicznej i zapobiegają przenikaniu antygenów do światła jelit [Fiocchi, 1998; Santor, 2008]. Birkedal-Hansen [1993] oraz Kam i wsp., [1995] zwrócili uwagę, że główną rolę w patogenezie powstawania chorób układu pokarmowego, a przez to całego organizmu, pełnią procesy immunologiczne, w których zaangażowane są mechanizmy odpowiedzi komórkowej i humoralnej. Dokładne poznanie mechanizmów działania synbiotyków na układ immunologiczny jelit umożliwi zapobieganie chorobom, które są efektem wnikania antygenów do wnętrza organizmu oraz zaburzenia prawidłowych procesów trawienia i wchłaniania składników pokarmowych. Reid i wsp., [2003] stwierdzili, że nie ma doniesień o ewentualnym niepożądanym działaniu substancji synbiotycznych. Według tych autorów substancje te stymulują osiedlanie się żywych mikroorganizmów oraz wzrost i metabolizm poszczególnych szczepów bakterii redukując tym samym obecność bakterii chorobotwórczych, wirusów i czynników patogennych, które powodują wzrost chorobotwórczości. Prawidłowo funkcjonujący układ immunologiczny warunkuje odpowiedni wzrost i rozwój organizmu oraz utrzymuje wysoki poziom zdrowotności. Brak równowagi mikrobiologicznej przyczynia się bezpośrednio do szerokiego spektrum chorób wynikających przede wszystkim z rozwoju cywilizacji, zanieczyszczenia środowiska oraz innych negatywnych czynników, które niekorzystnie wpływają zarówno na ludzi jak i zwierzęta. 74 Zastosowanie synbiotyków w żywieniu zwierząt Drób Mieszanki paszowe dla brojlerów zawierające w swoim składzie synbiotyki miały korzystny wpływ na masę ciała oraz przyrosty masy ciała, co potwierdzają doświadczenia przeprowadzone przez Zhang i Doyle [2006], Brzóska, [2007], Mohnl i wsp., [2007], Awad i wsp., [2008 i 2009], El-Banna i wsp., [2010], Abdel-Raheem i Abd-Allah [2011]. Janocha i wsp., [2010] zastosowali w paszy u brojlerów dodatek synbiotyku (Bacillus subtilis z drożdżami Sachcaromyces cerevisiae) i uzyskali wzrost masy ciała oraz wzrost europejskiego wskaźnika chowu drobiu (IEWW). Brzóska i wsp., [2008] stwierdzili, że dodatek do paszy synbiotyku nie miał wpływu na masę ciała i przyrosty brojlerów. Dodatek β-glukanu i pro-biotycznych szczepów Bacillus poprawił podstawowe parametry produkcyjne brojlerów [An i wsp., 2008]. Przeciwne wyniki z zastosowaniem probiotyku z β-glukanem otrzymali w doświadczeniu na drobiu Milczarek i wsp., [2012], w którym zastosowany dodatek synbiotyku nie miał wpływu na masę ciała kurcząt brojlerów. Zastosowanie dodatku Lactobacillus plantarum i Lactobacillus rhamnosus z oligosacharydem mannanu istotnie zwiększyło spożycie paszy u brojlerów [Brzóska i wsp., 2007]. Awad i wsp., [2009] z kolei potwierdzili wpływ dodatku do paszy synbiotyków na wzrost końcowej masy ciała (P≤0,05) i wydajność tuszek. Brzóska [2007] po zastosowaniu synbiotyku u kurcząt rzeźnych odnotował wyższy (P<0,01) europejski wskaźnik produkcji (EWW), który jest stosowany w celach porównawczych efektów produkcyjnych zwierząt. Na możliwość wykorzystania w żywieniu drobiu substancji synbiotycznych jako naturalnych immunomodulatorów wskazali w swych badaniach Roller i wsp., [2004]. Dodatek Enterococcus faecium z inuliną do mieszanki paszowej dla brojlerów miał korzystny wpływ na wzrost (P≤0,05) masy ciała i przyrostów masy ciała oraz lepsze wykorzystanie paszy w tym doświadczeniu. Odnotowano wzrost wskaźnika EPEF (z ang. European Production Efficiency Factor), który informuje o wzroście wydajności produkcji zwierzęcej [Awad i wsp., 2008]. Połączenie w diecie u indyków Lactobacillus spp. z laktozą poprawiło przyrosty masy ciała oraz wykorzystanie paszy u osobników zainfekowanych szczepem Salmonella [Vicente i wsp., 2007]. Poprawę przyrostów masy ciała i wykorzystania 75 paszy przy obniżeniu częstości występowania biegunek i upadków zwierząt stwierdzono po zastosowaniu B.subtilis z frukto-oligosacharydami [Li i wsp., 2008]. Zhang i Doyle [2006] w przeprowadzonym doświadczeniu żywieniowym zastosowali u kurcząt probiotyczne szczepy Lactobacillus i Streptococcus z prebiotykami (frukto-oligosacharydami i laktozą). Stwierdzili oni, że zastosowanie dodatku synbiotyków miało istotny wpływ na wzrost masy ciała i przyrosty masy ciała niż zastosowanie każdej z tych substancji osobno. Pozytywny wpływ stosowania synbiotyków w żywieniu drobiu szeroko opisali w swojej publikacji Ohimain i Ofongo [2012]. Dodatni wpływ zastosowanych w diecie u drobiu synbiotyków na wzrost parametrów produkcyjnych potwierdziło w swoich badaniach wielu autorów [Awad i wsp., 2009; Revolledo i wsp., 2009; Vandeplas i wsp., 2009]. Suplementacja paszy produktem synbiotycznym miała porównywalny wpływ na parametry produkcji jak zastosowanie antybiotycznego promotora wzrostu AGP (z ang. Antibiotic Growth Promoters), który poprawił wydajność produkcji oraz zahamował rozwój chorób w stadzie brojlerów [Mohnl i wsp., 2007]. Dodatek do paszy probiotyków miał wpływ na wzrost długości kosmki jelitowe u niosek po zastosowaniu Bacillus subtilis var. natto [Samanaya i Yamauchi, 2002] oraz u brojlerów po zastosowaniu Eubacterium sp. [Awad i wsp., 2006]. Jednak przy połączeniu probiotyku z prebiotykiem wykazało korzystniejszy efekt dotyczący parametrów morfometrycznych, w tym wzrostu długości kosmków jelitowych [Bailey i wsp., 1991; Fukata i wsp., 1999]. Caspary [1992] na podstawie przeprowadzonych badań stwierdził, że wzrost długości kosmków jelitowych powoduje wzrost powierzchni chłonnej jelit zdolnej do większej absorbcji związków odżywczych i składników mineralnych. Zastosowanie w paszy dodatku frukto-oligosacharydów u drobiu wpłynęło na wzrost długości kosmków jelitowych i wzrost stosunku długości kosmków do głębokości krypt w dwunastnicy. W kolejnym odcinku jelita cienkiego (czczego) zaobserwowano obniżenie długości kosmków i głębokości krypt oraz wzajemnego stosunku obydwu parametrów. Z kolei w jelicie krętym odnotowano obniżenie długości kosmków i głębokości krypt, a wzrost stosunku obydwu parametrów. Doświadczenie to pokazało wpływ prebiotyku na poszczególne odcinki końcowego układu pokarmowego [Awad i wsp., 2011] oraz połącznie prebiotyku z probiotykiem na parametry fizjologiczne jelit u brojlerów [Awad i wsp., 2008]. 76 Jednak połączenie fruktanów z probiotykami nie zawsze przynosi oczekiwane korzyści jak w przypadku doświadczenia Awad i wsp., [2011], co zauważyli we wcześniejszych badaniach Bolognani i wsp., [2001]. Zastosowanie u kur w paszy dodatku inuliny miało wpływ na wzrost liczby Bifidobacterii w treści jelit [Rada i wsp., 2003], a połączenie inuliny z probiotykiem zmieniło korzystnie parametry ekosystemu jelit u brojlerów [Awad i wsp., 2008]. Robeiro i wsp., [2007] oraz Silva i wsp., [2010] w swoich badaniach na brojlerach stwierdzili, że dodatek synbiotyków wpłynął na zmianę parametrów histomorfometrycznych jelit, w tym długość kosmków, głębokość krypt jelitowych oraz stosunek długości kosmków do głębokości krypt. Według Brzóski i wsp., [2008] stosowanie preparatów probiotycznych i prebiotycznych poprawia efektywność zootechniczną produkcji i może być substytutem zakazanych do stosowania antybiotyków paszowych (AGP). Trzoda chlewna Zastosowanie w paszy u świń dodatku synbiotyku miało pozytywny wpływ na wzrost masy ciała, przyrostów oraz wykorzystanie paszy, co potwierdzili w swoich badaniach Nemcová i wsp., [1999], Estrada i wsp., [2001], Herich i wsp., [2002]. Inne eksperymenty wskazują również na wzrost masy ciała oraz przyrostów masy ciała u świń żywionych paszą zawierającą w swoim składzie dodatek synbiotyku [Nemcová i wsp., 1999; Estrada i wsp., 2001; Herich i wsp., 2002]. W doświadczeniu na prosiętach dodatek do paszy synbiotyku (różne szczepy probiotyczne z oligofruktozą) miał wpływ na wzrost masy ciała i przyrostów bez wpływu na pobranie i wykorzystanie paszy. Zastosowanie tego rodzaju dodatku nie wpłynęło na zmianę parametrów hematologicznych krwi (krwinki białe -WBC, krwinki czerwone - RBC, poziomu hemoglobiny - HGB, hematokryt - HCT oraz limfocyty, monocyty i neutrofile) za wyjątkiem obniżenia ilości płytek krwi (PLT) [Shim i wsp., 2005]. Pod wpływem zastosowanego przez Shim i wsp., [2005] w mieszance paszowej synbiotyku odnotowano podwyższenie strawności większości składników pokarmowych i mineralnych. Suplementacja diety tym dodatkiem paszowym zmieniła 77 skład mikroflory jelitowej, wzrosła liczba szczepów Lactobacillus, a obniżeniu uległ poziom patogennych szczepów E.coli. Dodatek Bifodobacterium longum z oligofruktozą obniżył poziom śmiertelności młodych świń oraz wpłynął na rozwój bakterii jelitowych, w tym wzrost Lactobacillus i Bifidobacterium [Nemcová i wsp., 1999]. Herich i wsp., [2002] stwierdzili, że zastosowanie w żywieniu tej grupy zwierząt dodatku synbiotyków powoduje korzystną zmianę parametrów immunologicznych, w tym wzrost liczby limfocytów T i B. Uzupełnienie dawki pokarmowej loch karmiących synbiotykami składającymi się z Lactobacillus paracasei z oligofruktozą wpłynęło pozytywnie na parametry immunologiczne we krwi (krwinki białe, fagocyty, leukocyty, neutrofile) u odsadzonych prosiąt [Herich i wsp., 2002]. Według Smirnov i wsp., [2005] dodatek synbiotyku miał istotny wpływ na liczbę oraz zagęszczenie komórek kubkowych w kosmkach jelitowych oraz wzrost ilości wydzielonego śluzu. W doświadczeniu na prosiętach Budiño i wsp., [2005] zastosowali dodatek synbiotyku, a uzyskane wyniki potwierdziły pozytywny wpływ tych substancji na morfometrię ściany jelita cienkiego oraz wzrost zagęszczenia kosmków jelitowych w dwunastnicy. Prosięta z zastosowanym w diecie synbiotykiem charakteryzowały się większą wysokością mikrokosmków, natomiast większe ich zagęszczenie było w grupie zwierząt z probiotykiem. Według Marinho i wsp., [2007] dodatek synbiotyków wpłynął na zmianę parametrów histomorfometrycznych jelit, w tym długość kosmków, głębokość krypt jelitowych oraz stosunek długości kosmków do głębokości krypt. Wymienione parametry jelit miały wpływ na lepsze wykorzystanie składników pokarmowych zawartych w paszy i wyższą zdrowotność zwierząt. Zastosowanie w paszy u świń szczepu Lactobacillus paracasei z maltodekstryną istotnie obniżyło poziom kolonizacji jelita czczego przez niekorzystne szczepy E. coli. Z kolei połącznie Lactobacillus paracasei z frukto-oligosacharydami spowodowało wzrost kolonii Lactobacillus spp. i Bifidobacterium spp. oraz obniżyło liczbę patogennych bakterii Clostridium i Enterobacterium [Bomba i wsp., 2002]. 78 Zwierzęta laboratoryjne Z badań Liong i Shah [2007] wynika, że dodatek do paszy szczurów Lactobacillus casei z maltodextryną i frukto-oligosacharydami (FOS) nie miał wpływu na pobranie paszy oraz wykorzystanie paszy na jednostkę przyrostu. Również Yang i wsp., [2005] nie zaobserwowali zmian w pobraniu paszy po zastosowaniu w diecie szczurów synbiotyku. Gallaher i wsp., [1996] podawali w paszy dla szczurów szczepy Bifidobacterium oraz Lactobacillus acidophilus z frukto-oliogosacharydami w obecności związku karcerogennego. W tym eksperymencie dodatek FOS oraz jego połączenie z Bifidobacterium wpłynęło na wzrost końcowej masy ciała i przyrosty szczurów oraz istotne obniżenie spożycia paszy. Z kolei połączenie FOS z Lactobacillus acidophilus nie miało wpływu na końcową masę ciała szczurów oraz pobranie przez nie paszy. Geier i wsp., [2007] po zastosowaniu w paszy Lactobacillus fermentum BR 11 z fruktooligosacharydami odnotowali spadek masy ciała i pobrania paszy u szczurów z wywołanym zapaleniem okrężnicy. Podobne wyniki po zastosowaniu u szczurów synbiotyku otrzymali Yang i wsp., [2005]. W badaniach Bieleckiej i wsp., [2002] stwierdzono w jelitach wzrost kolonii szczepów probiotycznych po zastosowaniu w diecie u szczurów dodatku synbiotyku zawierającego w swoim składzie Bifidobacterium strains z oligofruktozą. Należy stwierdzić, że zarówno probiotyki [Goldin i Gorbach, 1996] jak i prebiotyki zastosowane w diecie u szczurów miały wpływ na zahamowanie powstałego procesu nowotworowego jelit. W tym miejscu warto przytoczyć badania Rowland i wsp., [1998], którzy wykazali, że połączenie Bifidobacterium longum z inuliną okazało się skuteczniejsze w redukcji początkowych zmian nowotworowych jelit niż wpływ każdej z tych substancji osobno. Jednak nie zawsze połączenie obydwu substancji w diecie daje spodziewany i korzystny efekt, co wykazały badania przeprowadzone przez Bolognani i wsp., [2001]. Autorzy ci nie potwierdzili wpływu dodatku do diety probiotyku z inuliną w procesie redukcji początkowych zmian nowotworowych u szczurów z doświadczalnie wywołanym przez azoxymetan (AOM) schorzeniem jelit. Roller i wsp., [2004] donoszą, że zastosowanie w diecie u szczurów synbiotyku (Lactobacillus rhamnosus i Bifidobacterium lactis z inuliną) ograniczyło aktywność komórek NK w kępkach Payer’a. Zahamowania procesu zapalnego jelit nie stwierdzono w przypadku 79 zastosowania probiotyku i inuliny oddzielnie. Również Gallaher i wsp., [1996] są zdania, że zastosowanie w diecie u szczurów dodatku probiotyku oraz synbiotyku zredukowało ogniska nieprawidłowych krypt jelitowych, które uważane są za początki zwiastujące potencjalny rozwój nowotworu jelit. W swojej pracy Roller i wsp., [2004] przedstawili istotny wpływ stosowania probiotyków, prebiotyków i synbiotyków w procesie hamowania zmian nowotworowych jelit oraz stymulacji układu immunologicznego w obrębie jelit (GALT). U szczurów żywionych dietą z dodatkiem synbiotyku (L. rhamnosus i B. lactis z inuliną i oligofruktozą) stwierdzono zwiększoną produkcję immunoglobuliny klasy IgA w jelitach [Rowland i wsp., 1998]. Również kombinacja Lactobacillus rhamnosus i Bifidobacterium lactis z maltodekstryną zastosowana jako komponent paszowy miała istotny wpływ na wzrost poziom immunoglobulin klasy IgA. Stwierdzono, że jelitowa IgAs wykazuje zdolność zapobiegania adhezji antygenów do nabłonka jelita [Romański, 2007]. Działanie zastosowanego synbiotyku zaobserwowano zarówno w sekrecyjnym jak i komórkowym mechanizmie immunologicznym jelit. Femia i wsp., [2002] po zastosowaniu w dawce pokarmowej dla szczurów synbiotyku [inuliny i oligofruktozy (1:1) oraz bakterii probiotycznych: Lactobacillus rhamnosus GG i Bifidobacterium lactis] wykazali szerokie spektrum prozdrowotnego działania m.in. na układ pokarmowy oraz immunologiczny. Połączenie właściwości probiotyku z inuliną było przedmiotem badań Maitin i Rastall [2002], Pool-Zobel i wsp., [2007] oraz Frence i wsp., [2009], w których potwierdzono wpływ synbiotyków w redukcji ryzyka wystąpienia nowotworów jelit. Wykorzystanie w żywieniu probiotycznego szczepu Bifidobacterium z oligofruktozą zredukowało występowanie ognisk nieprawidłowych krypt jelitowych u szczurów [Gallaher, Khil, 1999]. Podobne wyniki otrzymali Rowland i wsp., [1998] po zastosowaniu w diecie u szczurów dodatku Bifidobacterium longum z inuliną. Aryana i McGrew, [2007] w swym eksperymencie badali krótko (DP=5), średnio (DP=10) i długołańcuchową inulinę (DP=23) oraz oligofruktozę w połączeniu z probiotycznym szczepem Lactobacillus casei. Autorzy ci stwierdzili, że długość łańcucha węglowego miała istotny wpływ na właściwości synbiotyczne. Produkcja biomasy oraz kwasu mlekowego i octowego była wyższa pod wpływem krótkołańcuchowej oligofruktozy, która szybciej niż inulina uległa fermentacji przez Bifidobakterie [Perrin i wsp., 2002], co potwierdziły wyniki innych doświadczeń 80 Kruger i wsp., [2003] oraz Aryana i McGrew [2007]. Połączenie probiotyku z fruktooligosacharydami było lepszym substratem do jelitowej produkcji kwasu octowego przez Lactobacillus casei niż probiotyku z maltodextryną [Liong i Shah, 2007]. Badania Kruger i wsp., [2003] wykazały wzrost dostępności Ca u szczurów otrzymujących w diecie długołańcuchowy fruktan (inulinę) w porównaniu do krótkołańcuchowej oligofruktozy. Połączenie Lactobacillus plantarum z inuliną lub maltodekstrozą istotnie wpłynęło na wzrost absorpcji magnezu u szczurów [Kłobukowski i wsp., 2008]. Liong i Shah, [2006] po zastosowaniu w paszy dla szczurów bakterii probiotycznych Lactobacillus casei z prebiotykiem (maltodextryna i frukto-oligosacharydy) odnotowali pozytywny wpływ tych substancji na profil lipidów i cholesterolu we krwi. Stwierdzono również wzrost liczby Bifidobacterium w mikroflorze jelit i produkcji kwasów SCFAs obniżających wartość pH treści jelit. Zastosowanie w paszy dla szczurów dodatku Lactobacillus rhamnosus KY z celobiozą miało pozytywny wpływ na zmianę składu mikroflory jelitowej oraz parametrów krwi (zawartość lipidów, cholesterolu, fosfolipidów), co stwierdzili w swoich badaniach Umeki i wsp., [2005]. Dodatki paszowe o charakterze synbiotycznym (Lactobacillus lactis z mieszaniną maltodekstryny i frukto-oligosacharydów) znalazły również zastosowanie w regulacji poziomu cholesterolu i trójglicerydów we krwi u szczurów [Liong i Shah, 2006]. Według badań Juśkiewicz i wsp., [2007] zastosowanie szczepu probiotycznego Pediococcus acidilactici nie miało wpływu na ogólny metabolizm jelit, za wyjątkiem zmiany profilu kwasów SCFAs, który był korzystniejszy w przypadku zastosowania samego probiotyku, niż w postaci połączenia probiotyku z frukto-oligosacharydami. Suplementacja paszy prebiotykiem (FOS) zmieniła masę jelita ślepego i obniżyła aktywności enzymów bakteryjnych. Według Yang i wsp., [2005] zastosowanie w paszy dodatku synbiotyków miało wpływ na wzrost liczby szczepów Bifidobacterium i Lactobacillus oraz wzrost aktywności enzymów trawiennych (lipaza, sacharaza, laktaza, izo-maltaza) w jelitach u szczurów. W badaniach dotyczących obrazu histologicznego jelit po zastosowaniu w diecie synbiotyków stwierdzono istotny wzrost długości kosmków jelitowych oraz zwiększenie liczby krypt jelitowych odpowiedzialnych za namnażanie komórek nabłonkowych oraz produkcję czynników odporności przeciwbakteryjnej [Romański, 2007; Rekiel i wsp., 2008]. 81 Zastosowanie w paszy u szczurów dodatku Bifidobacterium longum z inuliną obniżyło występowanie zmian patologicznych w obrazie histologicznym jelita cienkiego i grubego [Rowland i wsp., 1998], a zastosowanie samego probiotyku obniżyło charakter zapalny zaistniałych zmian. Pozytywne działanie synbiotyku w redukowaniu zmian patologicznych jelit wykazano u mysz [Frence i wsp., 2009]. U myszy zainfekowanych patogenem Salmonella enterica serovar Typhimurium zastosowanie w dawce pokarmowej szczepu probiotycznego Bifidobacter breve z galakto-oligosacharydami (GOS) miało wpływ na re-kolonizację jelita przez pożyteczne mikroorganizmy oraz zmniejszyło istotnie ilość translokacji jelitowych przez bakterie patogenne. W przypadku stosowania w diecie samego prebiotyku (GOS) takich wyników nie stwierdzono [Asahara i wsp., 2001]. Synbiotyk dodany do paszy przyczynił się do zmiany aktywności metabolicznej jelita poprzez obniżenie wartości pH i wzrost produkcji kwasów organicznych oraz okazał się skutecznym czynnikiem w walce z antybiotyko-opornym szczepem Salmonella. Suplementacja diety u myszy Lactobacillus ssp. z dekstranem wysoko istotnie zwiększyła aktywność limfocytów NK odpowiedzialnych za tzw. cytotoksyczność naturalną, która nie wymaga pobudzenia mechanizmów swoistych w postaci przeciwciał [Ogawa i Asai, 2006]. W eksperymencie przeprowadzonym przez Marinho i wsp., [2007] zastosowanie w dawce dla zwierząt synbiotyku (Saccharomyces cerevisiae z ksylo-oligosacharydem) nie miało pozytywnego wpływu na populację bakterii jelitowych w okrężnicy oraz na stężenie kwasów SCFA co, jak wyjaśniali autorzy, może wynikać z doboru niewłaściwej kombinacji probiotyku z prebiotykiem. Synbiotyki wykazały u szczurów działanie przeciwpasożytnicze wobec zoonozy wywołanej przez Toxoplasma gondii. Wyniki badań wskazały, że dexametazon w połączeniu z synbiotykiem podniósł istotnie poziom INF-γ oraz nie stwierdzono obecności cyst tego pierwotniaka w mózgu [Ribeiro i wsp., 2011]. Geier i wsp., [2007] po zastosowaniu Lactobacillus fermentum BR 11 z fruktooligosacharydami odnotowali wzrost masy jelita ślepego oraz okrężnicy bez wpływu na zmiany w obrazie histologicznym jelit. Zarówno zastosowana dawka FOS, jak i synbiotyku nie zredukowały klinicznych, biochemicznych ani histologicznych zmian przy wywołanym farmakologicznie zapaleniu okrężnicy. Przeciwne wyniki do badań Geier i wsp., [2007] otrzymali Osman i wsp., [2006], którzy w diecie szczurów stosowali oligofruktozę oraz inulinę w połączeniu z Bifidobacterium infantis, co 82 wpłynęło znacząco na poprawę zdrowotności zwierząt. Zastosowane substancje synbiotyczne wykazały efekt przeciwzapalny przy wywołanym sztucznie zapaleniu okrężnicy poprzez obniżenie aktywności jelitowej enzymu myleoperoxydazy (MPO) oraz cytokin (IL-Iβ) bez wpływu na poziom TNL-α, IL-10, oraz TGF-β. Według kilku autorów badań [Buddungton i wsp., 2002; Gallaher i wsp., 1996; Gallaher i Khil, 1999; Kleessen i wsp., 2001] zastosowanie szczepów probiotycznych osobno lub w połączeniu z oligosacharydami modyfikuje populację mikroflory jelitowej oraz zmniejsza niekorzystne zmiany morfologiczne jelit. 83 3. CEL PRACY Celem niniejszej pracy przeprowadzonej na szczurach, zwierzętach modelowych, była ocena wpływu zastosowanych dodatków paszowych o charakterze probiotycznym, prebiotycznym i synbiotycznym na następujące parametry: przyrosty masy ciała zwierząt, pobranie paszy oraz wykorzystanie paszy przez zwierzęta na jednostkę przyrostu, wskaźniki morfologiczne, biochemiczne i mineralne we krwi, morfometrię ściany jelita cienkiego i grubego, obraz histologiczny jelit i wątroby, obraz z mikroskopu transmisyjnego jelita cienkiego obraz z mikroskopu skaningowego jelita cienkiego i jelita grubego parametry immunohistochemiczne jelita cienkiego i grubego. 84 4. MATERIAŁ I METODY BADAŃ DOŚWIADCZALNYCH W ramach badań własnych przeprowadzono trzy cykle doświadczeń. Doświadczenie pierwsze uzyskało akceptację II Lokalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach we Wrocławiu o numerze 30/2009, a doświadczenia drugie i trzecie uzyskały akceptację o numerze 67/2010. 4.1 Doświadczenie pierwsze 4.1.1 Zwierzęta Badania zostały przeprowadzone w wiwarium Katedry Żywienia Zwierząt i Paszoznawstwa Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Doświadczenie wykonano na rosnących szczurach (samicach) szczepu Wistar pochodzących z Centrum Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej w Warszawie. Zwierzęta w wieku 4 tygodni i początkowej masie ciała około 100 g losowo przydzielono do czterech grup doświadczalnych, po 12 sztuk w każdej grupie. Wszystkie zwierzęta przez pierwszy tydzień poddane zostały aklimatyzacji do warunków laboratoryjnych. W pomieszczeniu gdzie przebywały szczury zastosowano wymuszony obieg powietrza i stałe parametry otoczenia tj. temp. 20±2ºC, wilgotność powietrza 55-65%, oświetlenie światłem sztucznym przy zastosowaniu 12-godzinnego cyklu świetlnego. Okres doświadczalny trwał 42 dni. 4.1.2 Pasza i dodatki paszowe Zwierzęta karmione były paszą ad libidum w postaci granulatu przy stałym dostępnie do wody przez okres doświadczalny wynoszący 42 dni. Szczury z grupy kontrolnej (I) karmione były granulatem paszy standardowej, natomiast poszczególne grupy doświadczalne otrzymywały różne dodatki o charakterze probiotycznym, prebiotycznym i synbiotycznym. Receptura mieszanek została opracowana w oparciu o wymagania międzynarodowych norm w zakresie żywienia zwierząt laboratoryjnych [Zduńczyk, 2009]. Codziennie kontrolowane było spożycie zadawanej mieszanki, której ilość w 85 początkowym okresie doświadczenia wyniosła 20g/szczura/dzień. Wszystkie pasze były izobiałkowe, a ich skład był dostosowany do norm i zapotrzebowania zwierząt laboratoryjnych. Tabela 5. Skład komponentowy mieszanek paszowych pierwszego doświadczenia (w g/kg) Grupy żywieniowe Wyszczególnienie I -Kontrolna II -Probiotyk III -Inulina IV -Synbiotyk Pszenica Kukurydza Śruta sojowa Olej sojowy Mączka rybna Mieszanka mineralna 1 Mieszanka witaminowa 2 Probiotyk Prebiotyk Suma 411,00 300,00 200,00 45,00 5,00 29,00 410,9979 300,00 200,00 45,00 5,00 29,00 396,00 300,00 200,00 45,00 5,00 29,00 395,9979 300,00 200,00 45,00 5,00 29,00 10,00 10,00 10,00 10,00 ------------1000,00 0,0021 ------1000,00 ------15,00 100,00 0,0021 15,00 1000,00 AIN-93G-MX, według Reeves (1997), 1000 g premiksu mineralnego zawiera: KHPO4-322.0g, CaCO3300,0g, NaCl-167,0g, MgSO4-102,0g,CaHPO4-75,0g, FeC6P5O7-27,5g, MnSO4-5,1g, KJ-0,8g, CuSO40,3g, ZnCl2-0,25g, CoCl2-0,05g. 2 AIN-93G-VM, według Reeves (1997), 1000 g premiksu witaminowego zawiera: wit. D3-545000 IU, wit. K-1.0g, wit. B12-30μg, chlorek choliny-10.0g, kwas foliowy-1,01g, biotyna-0,03g, inozytol 10,0g, PABA-10.0g, wit. A-1250000 IU, wit. B6-1,5g, wit. E-2,5g, wit. B1-5,0g, wit. C-25g, wit. PP-5,0g, wit. B2-2.5g, pantotenian wapnia -25,0g. 1 Analiza chemiczna składu pasz Pasze wchodzące w skład mieszanek przed ich wykorzystaniem zostały poddane analizie chemicznej wykonanej w Laboratorium Katedry Żywienia Zwierząt i Paszoznawstwa Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. W paszy określona została zawartość podstawowych składników pokarmowych (suchej masy, białka surowego, tłuszczu surowego, włókna surowego, popiołu surowego, związków bezazotowych wyciągowych (BAW) oraz składników mineralnych (Ca, P, Mg), według metod podanych w AOAC (1990). 86 Analiza składu chemicznego pasz Tabela 6. Zawartość składników pokarmowych w mieszankach paszowych Grupa S.M I II III IV 89,79 89,87 89,69 89,80 Popiół surowy Białko ogólne 5,99 6,01 5,95 6,02 19,89 19,27 19,45 19,10 w % s.m Włókno surowe 3,96 3,98 4,07 4,10 Tłuszcz surowy BAW Ca 5,92 5,95 5,86 6,01 64,34 64,51 64,72 64,69 6,99 6,84 6,82 6,88 g/kg P. nieorg. 5,81 5,70 5,69 5,83 Mg 1,73 1,69 1,68 1,70 4.1.3 Układ doświadczenia I Grupa kontrolna- pasza bez dodatków doświadczalnych II Grupa doświadczalna – pasza zawierająca dodatek probiotyku1 w ilości 0,00214g /1kg paszy III Grupa doświadczalna – pasza zawierająca dodatek inuliny2 w ilości 15g /kg paszy IV Grupa doświadczalna – pasza zawierająca dodatek probiotyku1 w ilości 0,00214g /1kg paszy oraz inuliny2 w ilości 15g/kg paszy Standaryzowany biopreparat BIOGEN-PROBIOTYK jako produkt handlowy zawierał 11,7 x 1012 żywych mikroorganizmów w jednym gramie biopreparatu. Probiotyk w swoim składzie zawierał: Bifidobacterium bifidum, Enterococcus faecium, Lactobacillus acidophillus, Pediccocus acidilactici. 2 inulina - Mieszanina polisacharydów otrzymywana przez ekstrakcję z kłączy cykorii, Zawierała w swoim składzie <90% inuliny oraz 5-10% fruktozy, glukozy i sacharozy. 1 4.1.4 Zabiegi i badania Spożycie pasz przez zwierzęta kontrolowane było codziennie. Ważenia zwierząt odbywały się raz w tygodniu. Dane te posłużyły do wyliczenia zużycia paszy na jednostkę przyrostu. Po pozytywnym zaopiniowaniu badań przez II Lokalną Komisję Etyczną ds. Doświadczeń na Zwierzętach we Wrocławiu nr 30/2009, w ostatnim dniu doświadczenia szczury poddano eutanazji. Proces usypiania zwierząt został wykonany przez lekarza weterynarii. W ostatnim dniu doświadczenia zwierzęta miały dostęp tylko do wody w celu częściowego opróżnienia końcowego odcinka układu pokarmowego. W pierwszej kolejności szczurom podano domięśniowo środki znieczulające w postaci ketaminy (35mg/kg masy ciała) oraz xylazyny (15mg/kg masy ciała), a następnie użyty został środek usypiający morbital w ilości 1ml/kg masy ciała. Bezpośrednio po uśpieniu zwierząt pobrana została od nich krew z serca w celu 87 oznaczenia parametrów morfologicznych i biochemicznych oraz wycinki jelit i wątroby, które przygotowano według określonych procedur do badań histologicznych pod mikroskopem. Uśpione zwierzęta zostały przekazane firmie utylizacyjnej. Analizy składu krwi pełnej i osocza przeprowadzone zostały w Laboratorium Biochemicznym Katedry Higieny Środowiska i Dobrostanu Zwierząt Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Morfologię krwi (WBC, RBC, HGB, HCT, PLT oraz MCV, MCH i MCHC) przeprowadzono za pomocą analizatora hematologicznego ABC VET firmy Horiba ABX, natomiast parametry biochemiczne krwi oznaczone zostały przy pomocy analizatora biochemicznego Pentra 400 firmy Horiba ABX. ASPAT i ALAT oznaczono przy użyciu metody enzymatycznej (detekcja UV), do GGTP wykorzystany został kinetyczny test fotometryczny zmodyfikowany. Alfa-amylazę oznaczono za pomocą enzymatycznego testu fotometrycznego, a do oznaczenia stężenia lipazy wykorzystano enzymatyczny test kalorymetryczny. W trakcie przeprowadzania dysekcji zmierzona została m.in. długość jelita cienkiego i grubego oraz zważona masa wspólna jelit i wątroby. Następnie pobrano wycinek środkowej części jelita czczego oraz prawego płata wątroby do badań histologicznych. Wycinki jelit poddane zostały analizie histomorfometrycznej, natomiast wycinki wątroby poddano analizie histopatologicznej w celu wykluczenia efektu cytotoksycznego zastosowanych w paszy substancji. Przygotowanie materiału biologicznego do badań histologicznych Barwienie HiE Materiał biologiczny (jelita i wątroby) po pobraniu utrwalono w 10% buforowanej fosforanami formalinie, a następnie zatopiono w parafinie. Bloczki parafinowe pokrojono na skrawki 5 μm na mikrotomie Zeiss Microm HM 340 E. Przygotowane preparaty odparafinowano w ksylenie, a następnie przeprowadzono przez szereg alkoholowy 100% -70 %, następnie wypłukano w wodzie bieżącej. Skrawki barwiono Hematoksyliną (Shandon) przez 3 min, po wypłukaniu w wodzie bieżącej (10 min), umieszczono preparaty w eozynie (Shandon) na 10 min. Skrawki ponownie odwodniono i zamknięto w DPX-ie. Preparaty analizowano w mikroskopie świetlnym Axio Imager A1, firmy Zeiss. 88 Analiza morfometryczna Przygotowane preparaty histologiczne jelita cienkiego oraz jelita grubego poddane zostały analizie w mikroskopie świetlnym Axio Imager A1 w celu określenia profilu histomorfometrycznego badanych wycinków jelit. Analiza morfometryczna ściany układu pokarmowego dotyczyła pomiarów grubości błony śluzowej, podśluzowej i mięśniowej oraz wysokości kosmków jelitowych, a także krypt jelitowych. Ponadto zbadano obecność poszczególnych elementów strukturalnych (enterocyty, komórki kubkowe, komórki Panetha) oraz figur mitotycznych będących efektem podziałów mitotycznych komórek jelit. Analiza obrazu jelita cienkiego w mikroskopie transmisyjnym (TEM -Transmission Elektron Microscope) Analizę wykonano w Pracowni Mikroskopii Elektronowej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Ultrastrukturę badanego materiału po uprzednim przygotowaniu według określonych procedur analizowano w skaningowym mikroskopie transmisyjnym. Materiał utrwalono przy użyciu 2,5% aldehydu glutarowego z buforem fosforanowym o pH 7,4 przez 20 minut. Następnie preparaty zostały przepłukane buforem fosforanowym przez 15minut. Materiał został odwodniony we wzrastającym szeregu alkoholowym od 30- 100% po 10 minut w każdym stężeniu po czym alkohol został odciągnięty. Materiał poddano przepajaniu w roztworze agar /aceton (50/50) przez dwanaście godzin a następnie przepojony materiał zatopiono w agarze. Bloczki poddano procesowi polimeryzacji w temp. 60°C przez dwadzieścia cztery godziny. Tak przygotowane próby pokrojono na ultramikrotomie Utramicrotom MT- X Arizona USA próby zostały skontrastowane octanem uranylu i odczynnikiem Reynoldsa. Obserwowane przy wykorzystaniu przystawki transmisyjnej w skaningowym mikroskopie elektronowym EVO LS15 Zeiss. 89 Analiza obrazu jelita cienkiego i jelita grubego w elektronowym mikroskopie skaningowym (SEM- Scanning Electron Microscope) Analizę wykonano w Pracowni Mikroskopii Elektronowej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Materiał przeznaczony do badania w skaningowym mikroskopie elektronowym został pokrojony na fragmenty wielkości 0,5 cm x 0,5 cm oraz utrwalany w 2,5% aldehydzie glutarowym na buforze fosforanowym o pH 7,4. Następie próbki wypłukano w buforze fosforanowym, po czym odwodniono w szeregu acetonowym (od 50%-100%). Materiał został wysuszony, naklejony na stoliki i napylony złotem z użyciem napylarki Scancoat 6 (Edwards, Londyn, Anglia). Ultrastrukturę badanego materiału analizowano w skaningowym mikroskopie elektronowym Evo LS 15 firmy Zeiss. Obliczenia statystyczne Otrzymane wyniki poddano jednoczynnikowej analizie wariancji (ANOVA) przy użyciu programu komputerowego Statistica StatSoft 8. Istotność różnic oceniono przy użyciu testu Duncana dla poziomu istotności P ≤ 0,05 i P ≤ 0,01. Wyliczono również odchylenie standardowe dla każdego parametru w obrębie poszczególnych grup. 90 4.2 Doświadczenie drugie 4.2.1 Zwierzęta W doświadczeniu drugim, szczury w wieku 4 tygodni i początkowej masie ciała około 100 g losowo przydzielono do czterech grup doświadczalnych, po 12 sztuk w każdej grupie. Pozostałe procedury przebiegały tak, jak w doświadczeniu pierwszym. 4.2.2 Pasza i dodatki paszowe Skład komponentowy mieszanki grupy kontrolnej i z zawartością probiotyku był identyczny jak w doświadczeniu pierwszym. Tabela 7. Skład komponentowy mieszanek paszowych drugiego doświadczenia (w g/kg) Grupy żywieniowe Wyszczególnienie I -Kontrolna II -Probiotyk III-Oligofruktoza IV -Synbiotyk Pszenica Kukurydza Śruta sojowa Olej sojowy Mączka rybna Mieszanka mineralna1 Mieszanka witaminowa2 Probiotyk Prebiotyk Suma 411,00 300,00 200,00 45,00 5,00 29,00 410,9979 300,00 200,00 45,00 5,00 29,00 361,00 300,00 200,00 45,00 5,00 29,00 360,9979 300,00 200,00 45,00 5,00 29,00 10,00 10,00 10,00 10,00 ------------1000,00 0,0021 ------1000,00 ------50,00 1000,00 0,0021 50,00 1000,00 AIN-93G-MX, według Reeves (1997), 1000 g premiksu mineralnego zawiera: KHPO4-322.0g, CaCO3300,0g, NaCl-167,0g, MgSO4-102,0g,CaHPO4-75,0g, FeC6P5O7-27,5g, MnSO4-5,1g, KJ-0,8g, CuSO40,3g, ZnCl2-0,25g, CoCl2-0,05g. 1 AIN-93G-VM, według Reeves (1997), 1000 g premiksu witaminowego zawiera: wit. D3-545000 IU, wit. K-1.0g, wit. B12-30μg, chlorek choliny-10.0g, kwas foliowy-1,01g, biotyna-0,03g, inozytol 10,0g, PABA-10.0g, wit. A-1250000 IU, wit. B6-1,5g, wit. E-2,5g, wit. B1-5,0g, wit. C-25g, wit. PP-5,0g, wit. B2-2.5g, pantotenian wapnia -25,0g. 2 91 Analiza chemiczna składu pasz Analiza składu paszy w doświadczeniu drugim została wykonana metodyką podaną w doświadczeniu pierwszym. Tabela 8. Zawartość składników pokarmowych w mieszankach paszowych Grupa I II III IV S.M 89,98 89,91 89,96 89,83 Popiół surowy Białko ogólne 5,94 5,84 5,09 4,55 19,07 19,01 19,26 18,95 w % s.m Włókn o surowe 3,79 3,81 3,57 3,86 Tłuszcz surowy BAW Ca g/kg P. nieorg. Mg 5,69 5,72 5,79 5,88 65,61 65,62 66,29 66,83 7,46 7,56 7,37 7,51 6,75 6,65 6,39 6,51 1,70 1,72 1,71 1,70 4.2.3 Układ doświadczenia I Grupa kontrolna – pasza bez dodatków doświadczalnych II Grupa doświadczalna – pasza zawierająca dodatek probiotyku1 w ilości 0,00214g /1kg paszy III Grupa doświadczalna – pasza zawierająca dodatek oligofruktozy2 w ilości g /kg paszy IV Grupa doświadczalna – pasza zawierająca dodatek probiotyku1 w ilości 0,00214g /1kg paszy oraz oligofruktozy2 w ilości 50g/kg paszy 1 Standaryzowany biopreparat BIOGEN-PROBIOTYK jako produkt handlowy zawierał 11,7 x 1012 żywych mikroorganizmów w jednym gramie biopreparatu. Probiotyk w swoim składzie zawierał: Bifidobacterium bifidum, Enterococcus faecium, Lactobacillus acidophillus, Pediccocus acidilactici. 2 oligofrutkoza – preparat 4.2.4 Zabiegi i badania Wszystkie omówione zabiegi i badania wykonano tak, jak opisano w doświadczeniu pierwszym. Analiza immunohistochemiczna Wycinki jelit utrwalano w buforowanej fosforanami formalinie, a następnie zatopiono w parafinie. Bloczki parafinowe pocięto na skrawki 3 µm na mikrotomie Zeiss Microm HM 340E i przygotowano preparaty. Następnie odparafinowano, uwodniono skrawki i umieszczono w łaźni wodnej w celu odkrycia antygenu. Po 40 min na szkiełka naniesiono 3% wodę utlenioną (5 min)- zablokowanie aktywności endogennej 92 peroksydazy. Następnie płukano w buforze TBS o pH 7,6. Pierwotne przeciwciało Ki67 inkubowano przez 1 h, po czy zastosowano zestaw En Vision z firmy DAKO. Po wypłukaniu skrawki podbarwiono Hematoksyliną Mayera i odwodniono w wzrastającym szeregu alkoholowym, po czym zamknięto w DPX-ie. 4.3 Doświadczenie trzecie 4.3.1 Zwierzęta Doświadczenie trzecie przeprowadzono na zwierzętach starszych. W chwili rozpoczęcia badań szczury były w wieku 6 tygodni i ich masa ciała wynosiła średnio 180 g. Zwierzęta losowo przydzielono do trzech grup doświadczalnych, po 12 sztuk w każdej grupie. W tym eksperymencie przedłużono okres doświadczalny do 60 dni. Pozostałe procedury przebiegały tak, jak w doświadczeniu pierwszym. 4.3.2 Pasza i dodatki paszowe Tabela 9. Skład komponentowy mieszanek paszowych trzeciego doświadczenia (w g/kg) Grupy żywieniowe Wyszczególnienie II - Probiotyk z βIII - Probiotyk z I - Kontrolna glukanem włóknem jabłkowym Pszenica 411,00 400,9979 360,9979 Kukurydza 300,00 300,00 300,00 Śruta sojowa 200,00 200,00 200,00 Olej sojowy 45,00 45,00 45,00 Mączka rybna 5,00 5,00 5,00 Mieszanka 29,00 29,00 29,00 mineralna 1 Mieszanka 10,00 10,00 10,00 witaminowa2 Probiotyk ------0,0021 0,0021 Prebiotyk ------10,00 50,00 Suma 1000,00 1000,00 1000,00 AIN-93G-MX, według Reeves (1997), 1000 g premiksu mineralnego zawiera: KHPO4-322.0g, CaCO3300,0g, NaCl-167,0g, MgSO4-102,0g,CaHPO4-75,0g, FeC6P5O7-27,5g, MnSO4-5,1g, KJ-0,8g, CuSO40,3g, ZnCl2-0,25g, CoCl2-0,05g. 1 AIN-93G-VM, według Reeves (1997), 1000 g premiksu witaminowego zawiera: wit. D3-545000 IU, wit. K-1.0g, wit. B12-30μg, chlorek choliny-10.0g, kwas foliowy-1,01g, biotyna-0,03g, inozytol 10,0g, PABA-10.0g, wit. A-1250000 IU, wit. B6-1,5g, wit. E-2,5g, wit. B1-5,0g, wit. C-25g, wit. PP-5,0g, wit. B2-2.5g, pantotenian wapnia -25,0g. 2 93 Analiza składu chemicznego pasz Analiza składu pasz w doświadczeniu trzecim została wykonana metodyką podana w doświadczeniu pierwszym. Tabela 10. Zawartość składników pokarmowych w mieszankach paszowych Grupa I II III S.M 89,73 89,69 89,80 Popiół surowy Białko ogólne % s.m Włókn o surowe Tłuszcz surowy BAW Ca g/kg P nieorg. Mg 5,98 6,02 5,96 19,02 19,19 18,93 3,87 4,05 5,92 5,55 5,31 5,38 65,58 65,43 63,81 7,30 7,57 7,33 6,28 6,33 6,21 1,73 1,74 1,72 4.3.3 Układ doświadczenia I Grupa kontrolna – pasza bez dodatków doświadczalnych II Grupa doświadczalna – pasza zawierająca dodatek probiotyku1 w ilości 0,00214g /1kg paszy oraz β-glukan2 w ilości 1%/1kg paszy III Grupa doświadczalna – pasza zawierająca dodatek probiotyku1 i włókna jabłkowego3 w ilości 50g /kg paszy Standaryzowany biopreparat BIOGEN-PROBIOTYK jako produkt handlowy zawierał 11,7 x 1012 żywych mikroorganizmów w jednym gramie biopreparatu. Probiotyk w swoim składzie zawierał: Bifidobacterium bifidum, Enterococcus faecium, Lactobacillus acidophillus, Pediccocus acidilactici. 2 β-glukan – preparat Biolex BETA XP, firmy Inter Yeast pochodził ze ściany komórkowej drożdży Saccharomyces cerevisiae 3 włókno jabłkowe - błonnik jabłkowy: frakcja nierozpuszczalna (%) - 48,27; frakcja rozpuszczalna (%) - 10,04; błonnik całkowity (%) - 58,31 1 4.3.4 Zabiegi i badania Wszystkie omówione zabiegi i badania wykonano tak, jak opisano w doświadczeniu pierwszym. Analizę obrazu jelita cienkiego i jelita grubego w elektronowym mikroskopie skaningowym (SEM- Scanning Electron Microscope) wykonano metodyką podaną w doświadczeniu pierwszym. 94 5. 1. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Doświadczenie I 5.1.1 Przyrosty masy ciała zwierząt doświadczalnych W pierwszych czternastu dniach doświadczenia przyrosty dzienne masy ciała szczurów (tabela 11) wahały się od 3,35 g (grupa I) do 3,64 g (grupa III). Różnic statystycznych w przyrostach masy ciała zwierząt w tym okresie nie stwierdzono. W następnym okresie, trwającym od 14 do 28 dnia doświadczenia, najniższe przyrosty stwierdzono w grupie III (inulina) - 2,06 g, a najwyższe 2,47 g w grupie IV (synbiotyk). Pomiędzy tymi grupami stwierdzono różnice statystycznie istotne (P≤0,05). W ostatnich dwóch tygodniach doświadczenia najwyższe przyrosty masy ciała (1,56 g) odnotowano w grupie z dodatkiem w paszy synbiotyku i były one wysokoistotnie (P≤ 0,01) wyższe niż w grupach pozostałych. W całym okresie doświadczalnym różnice wysokoistotne (P≤0,01) w przyrostach masy ciała stwierdzono pomiędzy grupą IV (synbiotyk), a pozostałymi. Szczury w całym okresie doświadczalnym uzyskały średnie przyrosty dzienne wynoszące: 2,29 g (grupa I), 2,34 g (grupa II), 2,30 g (grupa III) i 2,54 g (grupa IV). Pomiędzy grupą otrzymującą w paszy synbiotyk, a pozostałymi odnotowano różnice wysokoistotne w przyrostach masy ciała w całym okresie doświadczalnym. Wyniki badań własnych nad stosowaniem w dawce pokarmowej zwierząt probiotyku są zgodne z doświadczeniami przeprowadzonymi na szczurach [Shu i wsp., 1999; Zhou i wsp., 2000; Dock i wsp., 2004; Alves de Azeredo i wsp., 2010], gdzie zastosowanie probiotycznych szczepów bakterii Lactobacillus i Bifidobacterium nie wpłynęło na końcową masę i przyrosty masy ciała tych zwierząt. Dodatek probiotyku w dawce pokarmowej nie wpłynął również na przyrosty masy ciała u myszy [El-Jakee i wsp., 2010], kurcząt brojlerów [Mahdavi i wsp., 2005; Estrada i wsp., 2001; Klocek i wsp., 2011] oraz trzody chlewnej [Min i wsp., 2004; Taras i wsp., 2007]. Natomiast w badaniach przeprowadzonych na szczurach przez Tanida i wsp., [2008] po zastosowaniu w paszy dodatku szczepów probiotycznych stwierdzono niższą masę ciała zwierząt. 95 Tabela 11. Średnie masy ciała oraz przyrosty masy ciała szczurów w poszczególnych okresach doświadczalnych Wyszczególnienie Grupy żywieniowe I - Kontrolna II - Probiotyk III - Inulina IV - Synbiotyk Średnia masa ciała 119,43 117,50 118,00 116,62 - początkowa (g) SD 1,71 SD 8,01 SD 0,77 SD 6,63 Średnia masa ciała 166,37 167,62 167,00 164,12 w 14 dniu SD 2,43 SD 12,09 SD 1,18 SD 8,63 Średnia masa ciała 197,28 196,37 195,83 202,13 w 28 dniu SD 5,35 SD 9,85 SD 0,58 SD 11,16 Średnia masa ciała 215,85 214,71 214,49 224,00 w 42 dniu SD 2,81 SD 10,04 SD 2,46 SD 6,57 I okres doświadczalny doświadczenia (g) II okres doświadczalny doświadczenia III okres doświadczalny doświadczenia (g) Średnie dzienne przyrosty masy ciała szczurów I Okres doświadczalny g 3,35 3,58 3,64 3,39 SD 0,22 SD 0,38 SD 0,37 SD 0,31 2,30ab 2,30ab 2,06a 2,47b SD 0,33 SD 0,23 SD 0,05 SD 0,27 1,28A 1,31A 1,33A 1,56B SD 0,19 SD 0,06 SD 0,20 SD 0,13 2,29A 2,34A 2,30A 2,54B SD 0,09 SD 0,15 SD 0,05 SD 0,15 II Okres doświadczalny g III Okres doświadczalny g Cały okres doświadczalny g SD - odchylenie standardowe, a, b - różnice istotne statystycznie (P≤ 0,05); A, B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) Wyniki badań własnych dotyczące przyrostów masy ciała zwierząt otrzymujących w diecie dodatek inuliny są zgodne z wynikami innych doświadczeń przeprowadzonych na szczurach, gdzie po zastosowaniu w diecie inuliny w ilości 4% diety [Juśkiewicz i Zduńczyk, 2004] oraz 5% diety [Levrat i wsp., 1991; Kleessen i 96 wsp., 2001; Zduńczyk i wsp., 2006] nie zauważono wpływu tej substancji na wzrost masy ciała. Podobne wyniki z zastosowaniem inuliny w paszy przeznaczonej dla szczurów uzyskali Juśkiewicz i wsp., [2005], López-Molina i wsp., [2005], Van De Viele i wsp., [2007], Juśkiewicz i wsp., [2009], Azorin-Ortuňo i wsp., [2009]. Inne doświadczenia, przeprowadzone na szczurach, u których stosowano inulinę w paszy w ilości 6% diety [Vanhoof i De Schrijver, 1996], 8,3% diety [Żary-Sikorska i Juśkiewicz, 2007] i 10% diety [Levrat i wsp., 1991; Gråsten i wsp., 2002; Van Loo, 2004; Younes i wsp., 2005] również nie potwierdzają wpływu zastosowanego dodatku na dzienne przyrosty masy ciała oraz końcową masę ciała zwierząt. Z kolei Józefiak i wsp., [2005] stwierdzili, że dodatek inuliny w ilości 5% i 10% diety oraz 20% diety [Levrat i wsp., 1991] spowodował istotne obniżenie masy ciała szczurów. W badaniach na kurczęcych brojlerach Józefiak i wsp., [2008] stwierdzili, że dodatek inuliny w ilości 0,3% diety obniżył masę ciała tych zwierząt [Józefiak i wsp., 2008]. Autorzy ci sugerują brak skuteczności dodatków prebiotycznych jako potencjalnych czynników stymulujących wzrost kurcząt brojlerów. Otrzymane wyniki badań własnych są odmienne od rezultatów doświadczeń przeprowadzonych przez Bosscher i wsp., [2006] oraz Zaky [2009], gdzie inulina zastosowana w ilości 5%, 10% oraz 15% diety [Zaky, 2009] poprawiła przyrosty masy ciała szczurów. Również u drobiu dodatek do paszy inuliny w ilości 1% diety poprawił przyrosty masy ciała [Xu i wsp., 2003]. W dostępnej literaturze jest mało badań nad wpływem dodatku do paszy synbiotyków na przyrosty masy ciała zwierząt. W badaniach własnych, zastosowanie synbiotyku wpłynęło (P≤0,01) na poprawę przyrostów masy ciała zwierząt doświadczalnych o 10,92% w stosunku do grupy kontrolnej. Również Awad i wsp., [2009] po dodaniu synbiotyku (szczepy probiotyczne z suszoną cykorią) w paszy dla brojlerów uzyskali wyższe przyrosty masy ciała tych zwierząt. Odmienne wyniki uzyskano w doświadczeniach przeprowadzonych na brojlerach po dodaniu do paszy probiotyku z MOS oraz probiotyku z inuliną i FOS [Klocek i wsp., 2011], w których wykazano, że wykorzystane synbiotyki nie miały istotnego wpływu na przyrosty lub końcową masę ciała tych zwierząt. Są również badania [Yang i wsp., 2005], w których po zastosowaniu w paszy szczepów probiotycznych z inuliną stwierdzono istotne obniżenie masy ciała zwierząt. 97 5.1.2 Pobranie paszy przez zwierzęta doświadczalne W pierwszych czternastu dniach doświadczenia najwyższym pobraniem paszy (tabela 12) charakteryzowała się I i II grupa zwierząt (odpowiednio 17,14 g i 16,83 g), a najniższym grupa III (15,41 g). Różnice w pobraniu paszy pomiędzy tymi grupami zwierząt okazały się istotne statystycznie (P≤0,05). W następnych czternastu dniach doświadczenia najwyższe dzienne pobranie paszy przez szczury wykazano w grupie kontrolnej (19,83 g), a najniższe w grupie z dodatkiem w paszy inuliny (16,26 g). Pomiędzy tymi grupami wykazano różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01). Najniższe pobranie paszy przez szczury grupy III skutkowało najniższymi przyrostami masy ciała zwierząt tej grupy w tym okresie. W ostatnich czternastu dniach doświadczenia niższe dzienne spożycie paszy wykazano w grupach II (16,89 g) i III (16,86 g) w stosunku do grupy kontrolnej (18,29 g). Te różnice okazały się istotne (P≤0,05) statystycznie. W całym okresie doświadczalnym najwyższym pobraniem karmy charakteryzowała się grupa kontrolna zwierząt (18,43 g). Pozostałe grupy zwierząt pobierały do 5% paszy mniej, ale różnic statystycznych nie stwierdzono. Tabela 12. Średnie dzienne pobranie paszy przez zwierzęta doświadczalne Wyszczególnienie (g/sztukę/dzień) Grupy żywieniowe I - Kontrolna II - Probiotyk II - Inulina IV - Synbiotyk 17,14b 16,8b 15,4a 16,46ab SD 0,88 SD 0,80 SD 1,90 SD 0,25 19,83B 18,44AB 16,26A 18,06AB SD 1,00 SD 1,00 SD 2,52 SD 0,98 18,29b 16,89a 16,86a 18,07ab SD 1,24 SD 1,42 SD 0,93 SD 1,37 18,43 17,41 17,25 17,51 SD 1,07 SD 0,96 SD 0,86 SD 0,76 I Okres doświadczalny g II Okres doświadczalny g III Okres doświadczalny g Cały okres doświadczalny g SD - odchylenie standardowe, a, b - różnice istotne statystycznie (P≤ 0,05); A, B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) 98 Własne wyniki badań są zgodne z danymi doświadczalnymi uzyskanymi przez innych badaczy [Shu i wsp., 1999; 2000; Zhou i wsp., 2000; Alves de Azerědo i wsp., 2010; De Azeredo i wsp., 2010]. Autorzy ci stosowali probiotyczne szczepy bakterii Lactobacillus i Bifidobacterium oraz Zymomonas mobilis i nie wpłynęły one na spożycie paszy u szczurów. Dawka pokarmowa zawierająca w swoim składzie probiotyczne szczepy bakterii nie miała również wpływu na spożycie paszy u mysz [El-Jakee i wsp.,2010], drobiu [Klocek i wsp., 2011] oraz trzody chlewnej [Kornegay i Risley, 1996]; Kritas i Morrison, 2004; Min i wsp., 2004; Taras i wsp., 2007]. Z kolei Zhou i wsp., [2000] badając wpływ dodatku Lactobacillus rhamnosus HN001, Lactobacillus acidophilus HN017 i Bifidobacterium lactis HN019 do diety dla myszy wykazali zmniejszenie pobrania paszy, jednak różnic tych nie potwierdzono statystycznie. Trzeba również zaznaczyć, że wzrost spożycia paszy, która zawierała dodatek probiotyków potwierdzono w doświadczeniach przeprowadzonych na szczurach i myszach [Gill i wsp., 2001; Shu i Gill, 2002], kurczętach rzeźnych [Jin i wsp., 1998], oraz prosiętach, warchlakach i tucznikach [Siuta, 2000; Simon i wsp., 2001; Rekiel, 2002]. Wyniki badań własnych, dotyczące spożycia przez szczury paszy zawierającej dodatek inuliny są zgodne z wynikami wielu doświadczeń. Po zastosowaniu w diecie u szczurów inuliny w ilości 4% diety [Juśkiewicz i Zduńczyk, 2004], 5% diety [Juśkiewicz i wsp., 2005; Juśkiewicz i wsp., 2009], 6% diety [Vanhoof i De Schrijver, 1996] oraz 8,3% diety [Żary-Sikorska i Juśkiewicz, 2007] i 10% diety [Younes i wsp., 2001; Gråsten i wsp., 2002;Van Loo, 2004] nie odnotowano wpływu zastosowanego dodatku na pobranie paszy przez zwierzęta doświadczalne. Gråsten i wsp., [2002], Józefiak i wsp., [2005], Zduńczyk i wsp., [2006] oraz Lobo i wsp., [2009] również nie potwierdzają pozytywnego wpływu zastosowania dodatku inuliny w ilości 5% i 10% diety szczurów na pobranie paszy. Podobne wyniki z zastosowaniem inuliny w ilości 5% diety uzyskano w badaniach przeprowadzonych przez Kleessen i wsp., [2001], Gråsten [2002], Kim i wsp., [2002], Lopez-Molina i wsp., [2005], Van De Viele i wsp., [2007], Juśkiewicz i wsp., [2009], Azorin-Ortuňo i wsp., [2009] oraz inuliny w ilości 5% i 10% diety [Levrat i wsp., 1991; Zduńczyk i wsp., 2006]. Wyższy (>10%) udział inuliny w diecie według Levrat i wsp., [1991] spowodował istotne obniżenie spożycie paszy u szczurów. Dodatek inuliny w ilości 0,3% diety obniżył pobranie paszy u brojlerów [Józefiak i wsp., 2008]. 99 Wyniki badań własnych są odmienne od danych pochodzących z doświadczeń przeprowadzonych przez Bosscher i wsp., [2005] oraz Zaky [2009], gdzie inulina zastosowana w ilości 5%, 10% oraz 15% [Zaky, 2009] diety poprawiła spożycie paszy u szczurów. Suplementacja paszy inuliną poprawiła również spożycie paszy u drobiu [Xu i wsp., 2003] oraz trzody chlewnej [He i wsp., 2002; Xu i wsp., 2002]. Yang i wsp., [2005] po dodaniu synbiotyku (probiotyku z inuliną) do paszy przeznaczonej dla szczurów nie stwierdzili wpływu na spożycie paszy przez te zwierzęta, co pozostaje w zgodzie z wynikami badań własnych odnośnie całego okresu doświadczalnego. 5.1.3 Zużycie paszy przez zwierzęta doświadczalne na 1 g przyrostu masy ciała W pierwszych dwóch tygodniach doświadczenia najlepszym wykorzystaniem paszy wynoszącym 4,2 g i 4,03 g/ 1g przyrostu odznaczały się zwierzęta z grupy III (inulina) oraz IV (synbiotyk), i grupy te różniły się istotnie (P≤0,05) od grupy kontrolnej, gdzie zużycie to wyniosło 5,11 g / 1g przyrostu (tabela 13). W następnym okresie trwającym od czternastego do dwudziestego ósmego dnia doświadczenia najwyższym zużyciem paszy na 1 g przyrostu charakteryzowała się doświadczalna grupa zwierząt i różniła się ona istotnie (P≤0,05) od grupy szczurów pobierających paszę z synbiotykiem. Tabela 13. Zużycie paszy [g] na 1g przyrostu masy ciała szczurów Wyszczególnienie Grupy żywieniowe I - Kontrolna II - Probiotyk III - Inulina IV Synbiotyk 5,11b SD 0,12 4,75ab SD 0,57 4,20a SD 0,90 4,03a SD 1,03 8,70b SD 0,96 8,12ab SD 1,23 7,90ab SD 1,19 7,39a SD 0,68 12,96AB SD 1,55 12,95AB SD 2,42 11,64A SD 1,29 7,47AB SD 0,51 7,53B SD 0,43 6,91A SD 0,16 I okres doświadczalny g II okres doświadczalny g III okres doświadczalny g 14,65B SD 2,53 Cały okres doświadczalny g 8,03B SD 0,42 SD - odchylenie standardowe, a, b - różnice istotne statystycznie (P≤ 0,05); A, B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) 100 Podobne tendencje stwierdzono w ostatnich czternastu dniach doświadczenia, przy czym pomiędzy wyżej wymienionymi grupami odnotowano różnice wysokoistotne (P≤0,01). W całym okresie doświadczalnym najlepszym wykorzystaniem paszy charakteryzowały się szczury z grupy IV (synbiotyk), a najgorszym z grupy kontrolnej szczurów i z dodatkiem w paszy inuliny. Różnice odnośnie tego parametru okazały się wysokoistotne (P≤0,01). Wykorzystanie paszy pozostawało na ogół w związku z wielkością pobrania paszy i przyrostami zwierząt. Według Klocek i wsp., [2011] zastosowanie u kurcząt brojlerów w mieszance paszowej dodatku probiotyku zawierającego w swoim składzie Bacillus subtilis nie miało istotnego wpływu na wskaźniki wykorzystania paszy. Dla kurcząt zastosowanie w dawce pokarmowej probiotycznych szczepów bakterii Bifidobacterium bifidum oraz Lactobacillus. plantarum, L. plantarum K, L. acidophilus i L. fermentum wpłynęło na obniżenie zużycia paszy na jednostkę przyrostu [Jin i wsp., 1998 i 2000; Brzóska i wsp., 1999]. Houng i wsp., [2010] oraz Ross i wsp., [2010] po zastosowaniu dodatku probiotyku w mieszance paszowej dla odsadzonych prosiąt, odnotowali lepsze (P≤0,05) wykorzystanie paszy na jednostkę przyrostu przez te zwierzęta. Przydatność stosowania dodatku do paszy probiotyków w żywieniu młodych świń w odniesieniu do wykorzystania paszy potwierdzają badania wykonane przez Rekiel i Kulisiewicz, [1996], Simon i wsp., [2001] oraz Mikołajczak i wsp., [2004]. Wzrost wykorzystania paszy po zastosowaniu w niej dodatku probiotyków zanotowano również w doświadczeniach na drobiu [Jin i wsp., 1998]. Istnieją jednak publikacje [Min i wsp., 2004; Taras i wsp., 2007] w których stwierdzono, że suplementacja diety szczepami probiotycznymi nie poprawiła wykorzystania paszy na jednostkę przyrostu u świń. Wyniki badań własnych, dotyczące zużycia paszy na jednostkę przyrostu u szczurów otrzymujących w paszy dodatek inuliny są zgodne z rezultatami doświadczeń innych naukowców [Kleessen i wsp., 2001; Gråsten i wsp., 2002; Zduńczyk i wsp., 2006; Lobo i wsp., 2009], którzy nie potwierdzają pozytywnego wpływu zastosowania dodatku inuliny w ilości 5% i 10% diety szczurów na zużycie paszy na jednostkę przyrostu. Wyniki badań własnych są sprzeczne z doświadczeniami innych badaczy, którzy zastosowali w paszy dla szczurów dodatek inuliny w ilości 5% diety [Lobo i wsp., 2009] oraz 7,35% diety [Zaky, 2009] i odnotowali najwyższe zużycie paszy na jednostkę 101 przyrostu. Również Józefiak i wsp., [2008] stwierdzili, że dodatek inuliny ilości 0,3% diety istotnie pogorszył zużycie paszy u brojlerów. Trzeba jednak zaznaczyć, że dodatek inuliny w ilości 1% diety poprawił wykorzystanie paszy u drobiu [Xu i wsp., 2003] oraz u tuczników [Xu i wsp., 2002]. Awad i wsp., [2009] wykazali, że zastosowanie w paszy dla brojlerów synbiotyków poprawiło zużycie paszy na jednostkę przyrostu. Według Klocek i wsp., [2011] dodatek synbiotyku do paszy dla brojlerów nie miał istotnego wpływu na wykorzystanie paszy przez tę grupę zwierząt. 5.1.4 Składniki morfologiczne krwi zwierząt doświadczalnych W badaniach dotyczących składników morfologicznych krwi (tabela 14), stwierdzono pomiędzy grupami różnice wysokoistotne (P≤0,01) w odniesieniu do stężenia krwinek białych (WBC), krwinek czerwonych (RBC), płytek krwi (PLT) oraz średniej masy hemoglobiny (MCH). W otrzymanych wynikach krwi zauważono również istotne zmiany (P≤0,05) w parametrach dotyczących wskaźnika hematokrytowego (HCT) oraz średniej objętości krwinki czerwonej (MCV). Analizując liczbę krwinek białych (WBC) można stwierdzić wzrost (P≤0,01) tej wartości w grupach otrzymujących dodatek probiotyku (5,21 G/l), inuliny (4,10 G/l) oraz probiotyku z inuliną (5,49 G/l) w porównaniu do grupy kontrolnej (2,15 G/l). Najniższa zawartość erytrocytów (RBC) (P≥0,01) wystąpiła w grupie II (3,80T/l), w porównaniu do grupy kontrolnej (8,04T/l) oraz pozostałych dwóch grup doświadczalnych III (8,47T/l) i IV (8,38T/l). Odnotowano również wysokoistotny (P≤0,01) wzrost ilości płytek krwi (PLT) w grupie doświadczalnej II (1261 G/l), w stosunku do grup - kontrolnej (784 G/l), z inuliną (865 G/l) i synbiotykiem (973G/l). Różnice wysokoistotne dotyczące średniej masy hemoglobiny (MCH) wystąpiły pomiędzy osobnikami z grupy II (2,60 fmol) w porównaniu do osobników z grupy kontrolnej (1,14 fmol) oraz pozostałych dwóch grup doświadczalnych III (1,13 fmol) i IV (1,14 fmol). Różnice istotne (P≤0,05) wystąpiły w stężeniu we krwi wskaźnika hematokrytowego (HCT) pomiędzy grupą zwierząt żywionych paszą z dodatkiem probiotyku (0,19 l/l), a grupą kontrolną (0,43 l/l) oraz pozostałymi grupami doświadczalnymi III (0,46 l/l) i IV (0,45 l/l). W grupie szczurów otrzymujących w paszy probiotyk wartość hematokrytu była poniżej wartości referencyjnych. 102 Istotny statystycznie (P≤0,05) spadek dotyczący średniej objętości krwinki czerwonej (MCV) zaobserwowano w grupie zwierząt żywionych paszą z dodatkiem probiotyku (42,66 fl) w odniesieniu do grupy kontrolnej (54,66 fl) oraz grup doświadczalnych II i IV. Tabela 14. Składniki morfologiczne krwi zwierząt doświadczalnych Parametr WBC [G/l] RBC [T/l] HGB [mmol/l] HCT [l/l] PLT [G/l] MCV [fl] MCH [fmol] MCHC [mmol/l] Wart. ref.1, 2 6,0012,60 7,009,75 6,209,94 0,300,50 2001300 45-70 1,121,37 11,8026,70 Grupy żywieniowe I - Kontrolna II - Probiotyk III - Inulina 2,15A SD 1,28 8,04B SD 0,32 9,23 SD 0,66 0,43b SD 0,02 784A SD 48,90 54,66b SD 0,57 1,14A SD 0,04 20,96 SD 0,56 5,21B SD 1,90 3,80A SD 0,95 8,33 SD 1,30 0,19a SD 0,24 1261B SD 61,25 49,00a SD 3,20 2,60B SD 0,57 20,96 SD 0,83 4,10B SD 0,40 8,47B SD 0,13 9,63 SD 0,20 0,46b SD 0,86 865A SD 52,00 54,33b SD 0,57 1,13A SD 0,02 20,83 SD 0,35 IVSynbiotyk 5,49B SD 1,31 8,38B SD 0,23 9,55 SD 0,59 0,45b SD 0,02 973A SD 48,14 54,75b SD 1,70 1,14A SD 0,04 20,90 SD 0,49 SD - odchylenie standardowe, a, b - różnice istotne statystycznie (P≤0,05); A, B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) 1 Reference values for laboratory animals. 2010. Research Animal Resources, University of Minnesota. http://www.ahc.umn.edy/rar/refvalues.html 2 Sharp E., La Regina M., 2000: The rat laboratory. CRC Press. (red. Suckow M.). Parametry morfologiczne krwi: WBC- krwinki białe, RBC- krwinki czerwone, HGB- hemoglobina, HCT (PCV)hematokryt, PLT- płytki krwi, MCV- wskaźnik średniej objętości krwinki czerwonej, MCH- wskaźnik średniej masy hemoglobiny w erytrocytach, MCHC- średnie stężenie hemoglobiny w erytrocytach. Otrzymane wartości dotyczące ilości hemoglobiny (HGB) oraz średniego stężenia hemoglobiny w cząsteczce (MCHC) nie różniły się statystycznie (P≥0,05) między grupami i mieściły się w granicach norm fizjologicznych [Sharp, La Regina, 2000]. Wyniki badań własnych są zgodne z wynikami otrzymanymi na szczurach, którym podawanie w paszy dodatku probiotyku Lactobacillus plantarum wpłynęło istotnie (P≤0,05) na obniżenie wartości wskaźnika hematokrytowego (HCT), wzrost liczby płytek krwi (PLT) oraz zwiększenie średniej liczby leukocytów (WBC) [Nara i wsp., 2009; De Azerêdo i wsp., 2010]. 103 Probiotyki wpłynęły na wzrost stężenia hemoglobiny (HGB) [Aboderin i Oyetayo, 2006], co nie potwierdzono w badaniach własnych. Pozytywny wpływ zastosowanego dodatku probiotyku do diety u myszy na parametry morfologiczne krwi odnotowali także Gill i wsp., [1998, 2000] oraz Medici i wsp., [2004]. Wyniki badań własnych przedstawiają korzystny wpływ zastosowanego probiotyku, w przeciwieństwie do wyników doświadczenia na myszach w którym zastosowanie dodatku Lactobacillus rhamnosus, L. acidophilus oraz Bifidobacterium lactis nie wpłynęło na poziom RBC, HGB, HCT we krwi u tych zwierząt [Zhou i wsp., 2000]. Po zastosowaniu szczepu Enterococcus faeciu Strompfová i wsp., [2006] odnotowali wzrost liczby leukocytów, krwinek czerwonych oraz hemoglobiny i wapnia w surowicy krwi. Zastosowanie szczepu Aspergillus Niger u brojlerów miało wpływ na wzrost poziomu hemoglobiny (HGB) oraz liczbę erytrocytów (RBC) bez wpływu na liczbę leukocytów (WBC) i pozostałe parametry krwi [Al-Kassie i wsp., 2008]. Z kolei u indyków [Capcarová i wsp., 2008] oraz u brojlerów [Alkhalf i wsp., 2010] probiotyki nie zmieniły parametrów hematologicznych krwi, w tym RBC, WBC i HCT. Po zastosowaniu w paszy u indyków probiotyków zawierających szczepy Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Enterotococcus faecium, Bifidobacterium thermophilus [Četin i Guclu, 2005] poziom WBC, RBC, HGB, HCT był istotnie wyższy niż po zastosowaniu w paszy u świń szczepu Enterococcus faecium [Strompfová i wsp., 2006]. Wyniki doświadczeń przeprowadzonych przez Juśkiewicz i wsp., [2005, 2009], Azorín-Ortuňo i wsp., [2009], López-Molina i wsp., [2005] nie potwierdziły wpływu dodatku do diety dla szczurów inuliny (5%) na zmianę stężenia parametrów morfologicznych krwi. Zastosowanie prebiotyków u krów mlecznych spowodowało wzrost liczby WBC, RBC, ALT, bez wpływu na pozostałe wskaźniki morfologiczne (PLT, MCV, MCH, MCHC) [Dobicki i wsp., 2007]. U jagniąt zastosowanie dodatku prebiotyku wpłynęło na wzrost we krwi WBC, RBC i HGB [Milewski, 2009]. 5.1.5 Składniki biochemiczne krwi zwierząt doświadczalnych Średnie wartości poszczególnych składników biochemicznych we krwi szczurów wraz z ich wartościami referencyjnymi przedstawiono w tabeli 15. W badaniach własnych nie stwierdzono różnic istotnych statystycznie w parametrach biochemicznych krwi dotyczących stężenia aminotransferazy alaninowej 104 (ALT), aminotransferazy asparaginianowej (AST), gamma-glutamylotransferazy (GGTP) oraz lipazy i ά-amylazy. Tabela 15. Składniki biochemiczne krwi zwierząt doświadczalnych Parametr ALT [U/l] AST [U/l] GGTP [U/l] Lipaza [U/l] ά -amylaza [U/l] Wart. refer.1, 2 52 -224 Grupy żywieniowe II - Probiotyk III - Inulina 134,95 164,02 SD 20,87 SD 22,37 545,10 501,75 SD 30,16 SD 23,53 3,95 6,08 SD 0,24 SD 1,10 27,66 27,15 SD 8,27 SD 10,40 1036,60 1098,03 SD 88,81 SD 66,89 I - Kontrolna 191,34 SD 26,25 535,32 SD 40,62 4,58 SD 1,01 38,52 SD 11,00 1057,58 SD 60,72 457-808 2,0-6,80 20-45 1000 – 1230 IV - Synbiotyk 104,4 SD 10,94 549,07 SD 28,98 4,15 SD 0,87 33,96 SD 9,11 1063,57 SD 72,01 SD – odchylenie standardowe 1 Reference values for laboratory animals. 2010. Research Animal Resources, University of Minnesota. http://www.ahc.umn.edy/rar/refvalues.html 2 Bernardi i wsp., [1996], Coparative Haematology International ALT- aminotransferaza asparaginianowa, AST- aminotransferaza alaninowa, GGTPgamma-glutamylotransferaza, Lipaza, ά –amylaza W grupach doświadczalnych wskaźniki biochemiczne w surowicy krwi, określające przemiany białkowo-energetyczne, były mało zróżnicowane oraz nie wykazały różnic statystycznych w porównaniu do parametrów z grupy kontrolnej zwierząt. Według hematologicznych Gibsona krwi i Roberfroid’a świadczy o [2008] prawidłowym brak zmian parametrów funkcjonowaniu układu krwionośnego, braku stanów zapalnych i anemii oraz o właściwościach prozdrowotnych zastosowanych substancji. Wyniki badań własnych dotyczące analizy podstawowych składników biochemicznych we krwi u szczurów po zastosowaniem probiotyków są zgodne z wynikami innych doświadczeń przeprowadzonych na szczurach [Shu i Gill, 2002; Nara i wsp., 2009]. W doświadczeniu wykonanym przez Nara i wsp., [2009] nie stwierdzono wpływu czynnika probiotycznego w paszy na stężenie ά - amylazy i lipazy we krwi u szczurów, co jest zgodne w wynikami badań własnych. Odmienne wyniki uzyskali Adawi i wsp., [2001] po zastosowaniem probiotycznych szczepów Lactobacillus i Bifidobacterium, które wpłynęły na obniżenie stężenia ALT-u we krwi u szczurów. 105 Suplementacja diety świń szczepami probiotycznymi nie wpłynęła na zmianę parametrów hematologicznych krwi [Chen i wsp., 2006; Ross i wsp., 2010]. Również w doświadczeniu na cielętach żywionych paszą z dodatkiem probiotyków (Enterococcus faecium, Bacillus subtilis oraz Lactobacillus casei), Berleć i Traczykowski [2004] nie wykazali wpływu czynnika probiotycznego na wartość parametrów krwi. Z kolei Rekiel [2008] po zastosowaniu probiotyku w paszy dla tuczników stwierdził wzrost aktywności aminotransferaz: AST i ALT. Wyniki badań własnych są zgodne w wynikami doświadczeń przeprowadzonych przez Juśkiewicz i wsp., [2005, 2009], Azorín-Ortuňo i wsp. [2009], Lopez-Molina i wsp., [2005] oraz Van De Viele i wsp., [2007] gdzie nie potwierdzono wpływu dodatku do diety inuliny (5%) na zmiany stężenie parametrów wątrobowych (ALT, AST) w surowicy krwi. Dodatek inuliny w diecie u myszy, tak jak w badaniach własnych również nie miał wpływu na aktywności enzymów wątrobowych (ALT, AST) [Bakr i wsp., 2009]. Według badań przeprowadzonych przez Zaky [2009] dodatek inuliny w diecie u szczurów (15%) wpłynął (P≥0,05) na obniżenie poziom ALT oraz podwyższenie stężenie AST w surowicy krwi u zwierząt, które otrzymywały wspomniany dodatek paszowy. Doświadczenia przeprowadzone przez Delzenne i Kok, [1998], Kaur i Gupta [2002] oraz Daubioul i wsp., [2005] potwierdzają pozytywne działanie inuliny (5% diety) poprzez obniżenie poziom triacylogliceroli, które akumulują się w wątrobie i obniżają stężenie aminotransferazy asparaginowej (AST) i alaninowej (ALT). Zastosowanie prebiotyków u krów mlecznych spowodowało wzrost stężenia ALT, bez wpływu na pozostałe wskaźniki biochemiczne (AST, mocznik, cholesterol, białko, albuminy, globuliny, glukoza) [Dobicki i wsp., 2007]. Badania Yang i wsp., [2005], wskazują na istotnie wyższą aktywność lipazy u szczurów otrzymujących w diecie dodatek synbiotyku (bakterie probiotyczne z inuliną). Natomiast Liong i Shah [2005] oraz Umeki i wsp., [2004] w swoich opracowaniach donoszą, że zastosowanie w paszy u szczurów synbiotyków pozytywnie wpłynęło na biochemiczne parametry krwi. 106 5.1.6 Wybrane składniki mineralne krwi zwierząt doświadczalnych Średnie wartości wybranych składników mineralnych we krwi szczurów wraz z ich wartościami referencyjnymi przedstawiono w tabeli 16. Tabela 16. Składniki mineralne krwi zwierząt doświadczalnych Parametr Wart. refer1. Wapń [mmol/] Magnez [mmol/] Fosfor nie org. [mmol/] I - Kontrolna Grupy żywieniowe II - Probiotyk III - Inulina 2,152,65 1,001,50 2,50 SD 0,13 1,41b SD 0,12 2,29 SD 0,16 1,23ab SD 0,08 2,17 SD 0,27 1,12a SD 0,24 IV Synbiotyk 2,22 SD 0,76 1,14a SD 0,17 2,204,50 3,69 SD 0,65 3,54 SD 0,60 3,42 SD 0,27 3,49 SD 0,40 SD - odchylenie standardowe, a, b - różnice istotne statystycznie (P≤0,05) 1 Bernardi i wsp., [1996], Coparative Haematology International Analizując zawartość poszczególnych składników mineralnych w surowicy krwi u szczurów stwierdzono, że stężenie wapnia i fosforu nieorganicznego u wszystkich zwierząt doświadczalnych było na zbliżonym poziomie i nie różniło się statystycznie w porównaniu do grupy kontrolnej. Stężenie magnezu w grupach zwierząt doświadczalnych III (1,12 mmol/l) i IV (1,14 mmol/l) było statystycznie niższe (P≤0,05) w porównaniu do grupy kontrolnej (1,41 mmol/l). Nara i wsp., [2009] w doświadczeniu na szczurach, podobnie jak w niniejszej pracy, nie stwierdzili istotnych różnic w średniej zawartości wapnia we krwi badanych zwierząt, które otrzymywały w diecie dodatek probiotyku. Berleć i Traczykowski [2004] nie wykazali wpływu bakterii probiotycznych Enterococcus faecium, Bacillus subtilis oraz Lactobacillus casei, na zawartość wapnia, magnezu i fosforu nieorganicznego w surowicy krwi cieląt. W eksperymencie przeprowadzonym przez Capcarová i wsp., [2008] probiotyki nie wpłynęły na wzrost stężenia wapnia, ale spowodowały wzrost stężenia fosforu nieorganicznego we krwi u indyków. Wyniki badań własnych dotyczące wpływu inuliny na zawartość wapnia i fosforu nieorganicznego we krwi u szczurów są zgodne z wynikami innych badaczy prowadzących badania na szczurach [Younes i wsp., 2001; Bosscher i wsp., 2005; Juśkiewicz i wsp., 2005, 2009; Azorín-Ortuňo i wsp., 2009; López-Molina i wsp., 2005; Van De Viele i wsp., 2007], którzy nie potwierdzają wpływu zastosowanego dodatku na zmianę stężenia tych parametrów. Również Levrat i wsp., [1991] nie stwierdzili różnic 107 w stężeniu wapnia i fosforu oraz magnezu w surowicy krwi u szczurów przy zastosowaniu dodatku inuliny w ilości 5%, 10% i 20% diety. Według Krejpcio i wsp., [2009] suplementacja diety inuliną (10%) zwiększyła biodostępność magnezu u szczurów, a 20% dodatek inuliny obniżył stężenie wapnia we krwi u szczurów w eksperymencie przeprowadzonym przez Levrat i wsp., [1991]. Otrzymane wyniki badań własnych są odmienne od doświadczeń przeprowadzonych na szczurach przez innych badaczy [Scholz – Ahrens i wsp., 2001, Bosscher i wsp., 2005, Coudray i wsp., 2005, Cieślik i Kopeć, 2005; Krejpcio i wsp., 2009; Lobo i wsp., 2009], którzy stwierdzili, że dodatek fruktanów, w tym inuliny, wskazuje na tendencję zwiększania poziomu wapnia oraz magnezu we krwi badanych zwierząt. Według Levrat i wsp., [1991] wraz ze wzrostem poziomu inuliny w diecie (5%, 10%, 20%) wzrasta powierzchnia chłonna jelit, co w efekcie polepsza mineralną absorpcję [Younes i wsp., 2001]. Krejpcio i wsp., [2009] w swych badaniach wykazali, że zastosowanie inuliny nie wpłynęło na zmianę stężenia magnezu w surowicy krwi u szczurów. 5.1.7 Długość jelit oraz masa jelit i wątroby zwierząt doświadczalnych W badaniach własnych dotyczących pomiarów histomorfometrycznych jelit (tabela 17), odnotowano wysokoistotne zmiany dotyczące zwiększenia długości jelita cienkiego w grupach zwierząt otrzymujących w paszy dodatek probiotyku (110,80 cm), inuliny (110,00 cm) oraz synbiotyku (111,50 cm) w stosunku do osobników nieotrzymujących w diecie żadnych dodatków (103,20 cm). Długość jelita grubego w grupie doświadczalnej III (16,12 cm) była wysokoistotnie niższa niż w grupie kontrolnej (17,10 cm) i z dodatkiem synbiotyku (17,20 cm). Zastosowanie w paszy dodatku probiotyku nie wpłynęło na zmianę długości jelita grubego w porównaniu do długości jelit u osobników z grupy kontrolnej. Dock i wsp., [2004] po zastosowaniu w paszy u szczurów probiotyku nie stwierdzili zmian dotyczących długości jelita cienkiego oraz grubego. Raschka i Daniel [2005], nie stwierdzili zastosowania w dawce pokarmowej szczurów inuliny w ilości 10% na całkowitą długość jelita cienkiego i grubego, co pozostaje w sprzeczności do badań własnych. 108 Tabela 17. Długość jelit oraz masa jelit i wątroby zwierząt doświadczalnych Grupy żywieniowe Parametr Długość jelita cienkiego [cm] Długość jelita grubego [cm] Łączna masa jelit [g] Masa jelit [g]/ 100 g masy szczura Masa wątroby [g] Masa wątroby [g]/ 100 g masy szczura I - Kontrolna 103,20A SD 2,50 17,10B SD 6,32 9,54A SD 1,24 II - Probiotyk 110,80B SD 5,02 16,42AB SD 2,71 12,50B SD 0,80 III - Inulina 110,00B SD 3,21 16,12A SD 6,02 13,36B SD 2,66 IV-Synbiotyk 111,50B SD 2,41 17,20B SD 3,16 13,65B SD 2,92 4,40A SD 0,92 5,43B SD 0,88 5,75B SD1,89 5,81B SD 1,59 6,75 SD 0,93 7,00 SD 1,29 6,77 SD3,06 7,16 SD 1,04 3,11 SD 0,37 3,24 SD 0,53 3,13 SD0,58 3,27 SD 0,49 SD - odchylenie standardowe, A,B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) W doświadczeniu Chen i wsp., [2005] dodatek inuliny (1% diety) u drobiu wpłynął na wydłużenie jelit ale tylko u samic, natomiast u samców długość jelit nie uległa zmianie. Podczas analizy pomiarów łącznej masy jelit stwierdzono różnice (P≤0,01) pomiędzy zwierzętami grup doświadczalnych II (12,50 g), III (13,36 g) i IV (13,65 g), a grupą kontrolną (9,54 g). Wyniki badań własnych są zgodne z doświadczeniem przeprowadzonym na szczurach przez Fåk i wsp., [2008], w którym zastosowanie probiotyku wpłynęło (P≤0,01) na zwiększenie masy jelit. Przeciwnie niż w badaniach własnych, w kilku doświadczeniach przeprowadzonych na szczurach [Zimmermana i wsp., 2001; Dock i wsp., 2004; Juśkiewicz i wsp., 2007; Urdaneta i wsp., 2007] zastosowanie w paszy dodatku bakterii probiotycznych, nie miało wpływu na masę jelit. Również u kurcząt rzeźnych nie stwierdzono różnic w masie jelita cienkiego po dodaniu do paszy probiotyków [Jin i wsp., 1998]. Wyniki badań własnych z użyciem w diecie szczurów inuliny są zgodne z danymi prezentowanymi w doświadczeniach wielu autorów [Verghese i wsp., 2002; Bielecka i wsp., 2002; Gråsten i wsp., 2002; Zduńczyk i wsp., 2004; Raschka i Daniel, 2005], gdzie odnotowano istotny wzrost masy jelit po dodaniu do paszy tej substancji. Po zastosowaniu w diecie u szczurów inuliny w ilości 4% diety [Juśkiewicz i Zduńczyk, 109 2004], 5% diety [Juśkiewicz i wsp., 2005, 2009; Lobo i wsp., 2009], 8,3% diety [ŻarySikorska i Juśkiewicz, 2007] oraz 10% diety [Gråsten i wsp., 2002; Lobo i wsp., 2009] również odnotowano wzrost masy jelit. Levrat i wsp., [1991] w swojej publikacji stwierdzili, że wraz ze wzrostem poziomu inuliny w diecie u szczurów (5%, 10%, 20%) wzrastała masa jelita cienkiego, co według autorów przekłada się na wzrost powierzchni chłonnej jelit. Zdaniem Raschka i Daniel [2005] dodatek inuliny w ilości 10% diety wpłynął istotnie (P≤0,01) na wzrost masy nie tylko jelita czczego ale również jelita grubego u szczurów doświadczalnych, bez wpływu na całkowitą masę jelita cienkiego. Przeciwne wyniki uzyskał Zduńczyk i wsp., [2004], który stwierdził, że dodatek inuliny zarówno w ilości 5% i 10% diety zmniejszył ogólną masę jelit u szczurów. Zarówno w badaniach własnych jak i w doświadczeniach na szczurach po zastosowaniu do diety dodatku Bifidobacterium longum z inuliną [Rowland i wsp., 1998] oraz Lactobacillus rhamnosus KY z celobiozą [Umeki i wsp., 2004], odnotowano istotne zwiększenie masy jelit. Tego efektu nie potwierdzają badania przeprowadzone na szczurach przez Abdelali i wsp., [1995] oraz Juśkiewicz i wsp., [2007]. W eksperymencie własnym masa jelit w przeliczeniu na 100 g masy ciała szczura w grupach doświadczalnych II (5,43 g), III (5,75 g) oraz IV (5,81 g) różniła się wysokoistotnie w stosunku do grupy kontrolnej (4,40 g). Masa wątroby oraz masa tego narządu w przeliczeniu na 100g masy ciała szczurów nie wykazywała istotnych zmian pomiędzy zwierzętami badanych grup. Zastosowanie w diecie u szczurów dodatku probiotyków, zarówno w badaniach własnych jak i w innych opublikowanych pracach [Dock i wsp., 2004; Urdaneta i wsp., 2007] nie miało wpływu na masę wątroby. Podobne wyniki uzyskali Jin i wsp., [1998] po dodaniu probiotyku do mieszanki treściwej przeznaczonej dla kurcząt rzeźnych. W badaniach przeprowadzonych przez Fåk i wsp., [2008] zastosowany w diecie u szczurów probiotyk, przeciwnie niż w badaniach własnych, wpłynął istotnie na wzrost masy wątroby. Wyniki badań własnych dotyczące wpływu dodatku do diety inuliny na masę wątroby są zgodne z wynikami Lobo i wsp., [2009], którzy zastosowali u szczurów inulinę w ilości 5% i 10% diety, i nie stwierdzili różnic istotnych w masie wyżej wymienianego narządu. W dostępnej literaturze nie znaleziono badań nad wpływem synbiotyków na masę wątroby zarówno u szczurów, jak również innych gatunków zwierząt. 110 5.1.8 Morfometria ściany jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych Wyniki pomiarów histomorfometrycznych dotyczące grubości błon komórkowych ściany jelita cienkiego przedstawiono w tabeli 18. Tabela 18. Elementy strukturalne ściany jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych Wyszczególnienie Grubość błony śluzowej (цm) Grubość błony podśluzowej (цm) Grubość błony mięśniowej (цm) Długość kosmków jelitowych (цm) Głębokość krypt jelitowych (цm) Stosunek wysokości kosmków do głębokość krypt I - Kontrolna 398,47b SD 59,29 Grupy żywieniowe II - Probiotyk III - Inulina a 377,84 368,19a SD 78,94 SD 67,73 IV- Synbiotyk 380,33a SD 48,66 35,04A SD 9,06 42,74B SD 12,02 40,38AB SD 26,72 46,39B SD19,92 69,39A SD 15,43 72,63A SD 17,57 75,98B SD 21,10 78,30B SD 16,28 205,24A SD 68,61 243,53B SD 38,50 229,74B SD 86,23 255,56B SD 12,90 177,30B SD 48,26 120,95A SD 34,76 111,09A SD 28,19 119,76A SD 17,03 1,13A SD 1,02 2,04B SD 0,83 2,10B SD 1,20 2,32B SD 0,65 SD - odchylenie standardowe, a,b - różnice istotne statystycznie (P≤ 0,05), A,B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) Zastosowane w doświadczeniu dodatki (probiotyk, inulina i synbiotyk) obniżyły istotnie (P≤0,05) grubość błony śluzowej w stosunku do grupy kontrolnej (odpowiednio: II-377,84 цm; III- 368,19 цm; IV- 380,33 цm vs 398,47 цm). Różnice wysokoistotne dotyczące grubości błony podśluzowej wystąpiły pomiędzy grupą zwierząt żywionych paszą z dodatkiem probiotyku (42,74 цm) oraz synbiotyku (46,39 цm), a grupą kontrolną (35,04 цm). Grubość błony mięśniowej ściany jelita cienkiego w grupie zwierząt otrzymujących w paszy dodatek inuliny (75,98 цm) oraz synbiotyku (78,30 цm) różniła się wysokoistotnie w porównaniu z grupą kontrolną (69,39 цm) i probiotykiem (72, 63 цm). Długość kosmków jelitowych była wysokoistotnie niższa u zwierząt grupy kontrolnej (205,24 цm), a grupami doświadczalnymi II (243,53 цm), III (229,74 цm) oraz IV (255,56 цm). Natomiast głębokość krypt jelitowych we wszystkich grupach zwierząt doświadczalnych była wysokoistotnie niższa w porównaniu do grupy 111 kontrolnej. Wzajemny stosunek wysokości kosmków jelitowych do głębokości krypt jelitowych we wszystkich grupach doświadczalnych (II-2,04, III - 2,10 i IV - 2,32) był wyższy i różnił się wysokoistotnie w porównaniu do grupy kontrolnej (1,13). Badania własne wykazały pozytywny wpływ zastosowanego w paszy dodatku probiotyku na wzrost (P≤0,01) długości kosmków jelitowych u zwierząt doświadczalnych. Podobne wyniki po dodaniu do diety szczurów probiotyków otrzymali Buts i wsp.,[1994], Ichikawa i wsp., [1999], Dock i wsp., [2004] oraz Zareie i wsp., [2006]. Podając w paszy dodatek probiotyków stwierdzono wzrost (P≤0,01) długości kosmków jelitowych w jelicie cienkim u brojleów [Chichlowski i wsp., 2007], kur niosek [Mahdavi i wsp., 2005] oraz tuczników i prosiąt [Fuller, 1991; Sakata i wsp., 1995]. Z literatury wynika, że niektóre szczepy bakterii probiotycznych nie miały wpływu na długość kosmków jelitowych w jelicie cienkim myszy [Allori i wsp., 2000] oraz prosiąt [Marinho i wsp., 2007]. Zastosowanie w badaniach własnych dodatku do paszy dla szczurów inuliny skutkowało wysokoistotnym (P≤0,01) wydłużeniem kosmków jelitowych. Podobne wyniki uzyskali Rehman i wsp., [2007] dodając inulinę do diety dla kurcząt. Dodatek inuliny w paszy dla warchlaków [Pierce i wsp., 2006] oraz tuczników w ilości 1,25% dawki [Lynch i wsp., 2007] oraz 3% [Loh i wsp., 2006] istotnie wpłynął na zwiększenie wysokości kosmków jelitowych w jelicie czczym i podwyższeniu stosunku wysokości kosmków do głębokości krypt [Pierce i wsp., 2006]. Z kolei wprowadzenie inuliny do paszy dla brojlerów [Xu i wsp., 2003; Rehman i wsp., 2007] spowodowało wzrost długości kosmków jelitowych w jelicie czczym i głębokości krypt jelitowych w tej części jelita, przeciwnie do wyników otrzymanych przez Adawi i wsp., [2009]. Wyniki badań własnych, po zastosowaniu w paszy dla szczurów inuliny są odmienne od wyników, jakie uzyskali Rehman i wsp., [2007] w których dodatek inuliny do diety zwiększył głębokości krypt jelitowych. Inulina będąca dodatkiem do paszy dla warchlaków korzystnie wpłynęła na zwiększenie stosunku wysokości kosmków do głębokości krypt w dwunastnicy i jelicie czczym [Pierce i wsp., 2006]. Z kolei substancja ta w doświadczeniach przeprowadzonych przez Xu i wsp., [2003] oraz Rehman i wsp., [2007] spowodowała wzrost głębokości krypt jelitowych bez wpływu na stosunek długości kosmków jelitowych do głębokości krypt. 112 Wyniki badań własnych są zbieżne z danymi otrzymanymi w doświadczeniu przeprowadzonym na brojlerach przez Adawi i wsp., [2009], w którym po zastosowaniu dodatku inuliny odnotowano (P≤0,01) spłycenie głębokości krypt jelitowych w jelicie czczym i krętym, bez wpływu na ich głębokość w dwunastnicy. W tej samej pracy odnotowano jednak skrócenie długości kosmków jelitowych w jelicie czczym i krętym, a ich wzrost odnotowano w dwunastnicy. Wzajemny stosunek długości kosmków do głębokości krypt był istotnie wyższy w dwunastnicy i jelicie krętym, a niższy w jelicie czczym. Xu i wsp., [2003] oraz Rehman i wsp., [2007] odnotowali wzrost głębokości krypt jelitowych w jelicie czczym u brojlerów. Według Kleessen i wsp., [2003] suplementacja diety synbiotykiem w postaci połącznia probiotyku (Bifidobacterium longum; Bacterioides vulgatus) z inuliną przyczyniła się do wzrostu długości kosmków jelitowych w jelicie czczym u szczurów. Dodatek synbiotyku (E. faecium z inuliną) do paszy dla brojlerów [Awad i wsp., 2008] poprawił ogólne parametry morfometryczne jelit, w tym wzrost długości kosmków jelitowych. Odmienne wyniki uzyskali Adawi i wsp., [2009] po zastosowanie dodatku synbiotyku w paszy u brojlerów. W tym doświadczeniu nie wykazano wpływu synbiotyku na długość kosmków, głębokość krypt oraz ich wzajemny stosunek w jelicie cienkim. W badaniach własnych dodatek probiotyku do paszy dla szczurów wpłynął (P≤0,01) na spłycenie głębokości krypt jelitowych w jelicie cienkim w porównaniu do grupy kontrolnej. Dane pochodzące z badań własnych są odmienne od wyników doświadczeń wykonanych na szczurach przez Buts i wsp., [1994], Ichikawa i wsp., [1999] i Dock i wsp., [2004] oraz na myszach [Allori i wsp., 2000]. Kleessen i wsp., [2003] oraz Zareie i wsp., [2006] nie stwierdzili zmian w głębokość krypt jelitowych w jelicie cienkim u szczurów po zastosowaniu w diecie probiotyku. W doświadczeniach na trzodzie chlewnej, zastosowanie w paszy dla prosiąt dodatku probiotyków nie wpłynęło na głębokość krypt jelitowych oraz stosunek długości kosmków jelitowych do głębokości krypt jelitowych [Marniho i wsp., 2007]. Przeciwne wyniki uzyskali Fuller [1991] oraz Sakata i wsp., [1995] po zastosowaniu szczepów probiotycznych w diecie prosiąt. Rehman i wsp. [2007] po wprowadzeniu do mieszanki paszowej inuliny w ilości 1% stwierdzili korzystny jej wpływ na głębokości krypt jelitowych u kurcząt, bez wpływu na stosunek długości kosmków do głębokości krypt. 113 Wybrane elementy komórkowe ściany jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych Wyniki analizy wybranych elementów komórkowych ściany jelita cienkiego dotyczących ilości enterocytów, komórek kubkowych, komórek mitozy, plazmocytów oraz komórek Panetha przedstawiono w tabeli 19. Tabela 19. Wybrane elementy komórkowe ściany jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych Grupy żywieniowe Elementy komórkowe (szt.) Enterocyty Komórki kubkowe Komórki mitozy Plazmocyty Komórki Panetha Stosunek enterocytów do komórek kubkowych I - Kontrolna II - Probiotyk III - Inulina IV- Synbiotyk 158,25C SD 21,58 40,00A SD 9,29 0,75A SD 0,95 5,25B SD 3,18 20,50A SD 5,06 135,00B SD 17,05 43,00B SD 8,00 2,33B SD 0,57 2,00A SD 1,00 25,87B SD 4,95 100,33AB SD 11,30 47,33C SD 7,57 94,66A SD 15,01 49,58C SD 9,20 0 0 5,00B SD 2,64 27,30B SD 2,52 4,56B SD 1,52 32,75B SD 2,64 3,36B SD 0,10 3,10A SD 0,05 2,32A SD 0,09 2,21A SD 0,08 SD - odchylenie standardowe A,B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) W ścianie jelita cienkiego, pomiędzy grupami zwierząt, zauważono różnice wysoko- istotne statystycznie w ilości enterocytów. Odnotowana ilość enterocytów we wszystkich grupach doświadczalnych [II – 135, III – 100,33 oraz IV – 94,66] była niższa (P≤0,01) w stosunku do grupy kontrolnej (158,25). Najniższą ilość enterocytów odnotowano w grupie zwierząt z dodatkiem w paszy synbiotyku, a najwyższą w grupie kontrolnej. Wyniki badań własnych wykazują zmiany w ilości enterocytów krypt jelitowych, które według wyników McCullogh i wsp., [1998] pod wpływem dodatków paszowych zmieniają aktywność proliferacyjną oraz wydzielniczą (produkcja śluzu i czynników bakteriobójczych). Najniższą ilością komórek kubkowych w ścianie jelita cienkiego charakteryzowała się grupa zwierząt kontrolnych (40,00), a najwyższą grupy z dodatkiem synbiotyku (49,50) oraz inuliny (47,33). Różnice te okazały się wysokoistotne (P≤0,01). Również probiotyk miał wpływ na wysokoistotny wzrost 114 komórek kubkowych w stosunku do grupy kontrolnej, ale ich ilość była istotnie niższa (P≤0,01) niż w grupach z inuliną i synbiotykiem. Wyniki te są zgodne z badaniami przeprowadzonymi na prosiętach [Fuller, 1991] oraz kurach nioskach [Mahdavi i wsp., 2005] gdzie również potwierdzono wzrost liczby komórek kubkowych w jelicie cienkim badanych zwierząt przy stosowaniu w paszy tego typu dodatków. W grupie drugiej zwierząt suplementacja diety probiotykiem wpłynęła wysokoistotnie (P≤0,01) na występowanie komórek podziału mitotycznego w ścianie jelita cienkiego u osobników, które otrzymywały wspomniany dodatek, w porównaniu do grupy kontrolnej bez dodatków. Wzrost ilości komórek mitozy w błonie śluzowej jelita cienkiego oraz wola [Yousefi i Karkoodi, 2007] po zastosowaniu w paszy probiotyków odnotowano u brojlerów [Kabir i wsp., 2005] oraz u kurcząt rzeźnych [Samanya i Yamauchi, 2002]. Najniższą wartością plazmocytów charakteryzowały się zwierzęta spożywające pasze z dodatkiem substancji probiotycznej (2,00) i liczba ta różniła się wysokoistotnie od pozostałych grup zwierząt. Trzeba zaznaczyć, że główną funkcją plazmocytów jest produkcja i wydzielanie przeciwciał. Przeprowadzone badania histomorfometryczne dotyczące występowania komórek Panetha wykazały wysokoistotne wyższą ich zawartość w grupach doświadczalnych w porównaniu do grupy kontrolnej zwierząt. Ponieważ komórki te biorą udział w reakcjach obronnych jelit oraz uczestniczą w fagocytozie mikroorganizmów ich wyższe wartości świadczą o pozytywnym oddziaływaniu zastosowanych dodatków na organizm zwierząt. W grupach zwierząt, które otrzymywały w paszy dodatek probiotyku (3,10), inuliny (2,32) oraz synbiotyku (2,21) stwierdzono (P≤0,01) obniżenie proporcji pomiędzy komórkami enterocytów, a komórkami kubkowymi w porównaniu do grupy kontrolnej (3,36). 115 5.1.9 Morfometria ściany jelita grubego zwierząt doświadczalnych Badania histomorfometryczne ściany jelita grubego wykazały różnice wysokoistotne statystycznie w grubości poszczególnych błon ściany jelita grubego (tabela 20). Tabela 20. Grubość błon komórkowych oraz elementy strukturalne ściany jelita grubego zwierząt doświadczalnych Wyszczególnienie Grubość błony śluzowej (цm) Grubość błony podśluzowej (цm) Grubość błony mięśniowej (цm) Głębokość krypt jelitowych (цm) Ilość komórek kubkowych Grupy żywieniowe I - Kontrolna 142,75A SD 8,10 II - Probiotyk 186,61AB SD 26,15 III - Inulina 192,11AB SD18,04 IV - Synbiotyk 235,89B SD 25,31 63,5A SD 10,92 101,74B SD 19,57 136,84B SD 24,40 164,62B SD 18,85 119,81A SD 35,62 113,72A SD 33,47 190,40B SD 20,52 182,58B SD 35,39 74,00A SD 12,47 2,50A SD 1,29 70,73A SD 20,87 3,00B SD 2,70 98,14B SD 29,38 4,95C SD 3,30 117,90 B SD 38,52 7,25D SD 1,70 SD - odchylenie standardowe, A, B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) Grubość błony śluzowej jelita grubego osobników żywionych paszą zawierającą dodatek synbiotyku (235,89 цm) była najwyższa i różniła się wysokoistotnie (P≤0,01) w porównaniu do grupy kontrolnej (142,75 цm). Zarówno probiotyk jak i inulina podwyższyły grubość błony śluzowej jelita grubego w stosunku do grupy kontrolnej zwierząt, ale różnic statystycznych nie stwierdzono. Grubość błony podśluzowej w grupach zwierząt otrzymujących w paszy dodatek probiotyku (101,74 цm), inuliny (136,84 цm) oraz synbiotyku (164,62 цm) różniła się wysokoistotnie w porównaniu do grupy kontrolnej szczurów (63,51 цm). Analizując wpływ zastosowanych dodatków paszowych na grubość błony mięśniowej można stwierdzić (P≤0,01), że dodatek do paszy inuliny (190,40 цm) oraz synbiotyku (182,58 цm) wpłynął na wzrost grubości analizowanej błony w porównaniu do grupy kontrolnej (119,81 цm) i z dodatkiem probiotyku (113,72 цm). Głębokość krypt jelitowych była wyższa w grupie doświadczalnej III (98,14 цm) i IV (117,90 цm) i różniła się istotnie w stosunku do głębokości krypt w grupie II (70, 73 цm) oraz kontrolnej zwierząt (74,00 цm). 116 Ilość komórek kubkowych w ścianie jelita grubego różniła się wysokoistotnie pomiędzy wszystkimi grupami szczurów. Najniższą ilość tych komórek odnotowano w grupie kontrolnej zwierząt (2,50) i wzrastała ona systematycznie od grupy z probiotykiem (3,00), inuliną (4,95) aby uzyskać najwyższa wartość w grupie otrzymującej synbiotyk (7,25). Podawanie szczurom probiotyku zawierającego szczep Lactobacillus według wielu autorów [Adawi i wsp., 1997, Mangel i wsp.,2006; Peran i wsp., 2006; Geier i wsp., 2007; Laudanno i wsp., 2008; Frias i wsp., 2009] wpływało na zmiany w budowie ściany jelita. Z badań Lobo i wsp., [2009] wynika, że dodatek inuliny w ilości 5% i 10% diety zwiększył głębokość krypt jelitowych w jelicie cienkim oraz grubym oraz zmniejszył [Raschka i Daniel, 2005] występowanie ich deformacji w jelicie grubym. Podawanie synbiotyku w postaci probiotyku Bifidobacterium longum z inuliną w ilości 5% [Rowland i wsp., 1998] oraz 10% diety [Femia i wsp., 2002] wpłynęło pozytywnie na parametry morfometryczne w jelicie grubym u szczurów, w tym na wzrost aktywności proliferacyjnej błony śluzowej. Podobny efekty po zastosowaniu w paszy dodatku synbiotyków zaobserwowano u szczurów [Le-Leu i wsp., 2005; Osman i wsp., 2006] oraz u brojlerów [Bailey i wsp., 1991]. 117 5.1.10 Obraz histologiczny jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych Obraz histologiczny jelita cienkiego przedstawia struktury charakterystyczne dla narządu prawidłowo funkcjonującego. Ściana jelita cienkiego jest zbudowana z wyraźnie oddzielonych od siebie warstw: błony śluzowej, błony podśluzowej i błony mięśniowej. Błona śluzowa dzieli się na trzy warstwy w których wyróżniamy blaszkę mięśniową błony śluzowej, blaszkę właściwą błony śluzowej oraz nabłonek. W błonie śluzowej widoczne są dobrze rozwinięte kosmki jelitowe, pokryte nabłonkiem jednowarstwowym cylindrycznym z mikrokosmkami. Komórki nabłonka wpuklają się do błony śluzowej wytwarzając gruczoły jelitowe. W obrębie nabłonka gruczołów jelita cienkiego można spotkać komórki wykazujące figury podziału mitotycznego oraz rozproszone pojedynczo lub w niewielkich grupach komórki endokrynowe należące do układu komórek APUD (z ang. amine precursors uptake, decarboxylation) (Ryc. 4, Ryc. 8). Błona mięśniowa zwierząt otrzymujących w paszy dodatek probiotyku zbudowana z komórek mięśni gładkich, które tworzą dwie wyraźne warstwy: warstwę wewnętrzną (okrężną) oraz warstwę zewnętrzną (podłużną) otoczoną przez nabłonek jednowarstwowy płaski otrzewnej. Pomiędzy kosmkami jelitowymi występują komórki kubkowe wydzielające śluz. Zarówno błona podśluzowa jak i mięśniowa wyraźnie grubsza w porównaniu do zwierząt grupy kontrolnej (Ryc. 5, Ryc. 9). W grupie eksperymentalnej zwierząt otrzymujących w paszy dodatek inuliny błona śluzowa uformowana jest w postaci kosmków jelitowych, które przyjmują formę palczastych wyniosłości. Kosmki jelitowe pokryte są nabłonkiem jednowarstwowym walcowym, który wpukla się w głąb blaszki właściwej tworząc cewkowate gruczoły. W nabłonku zlokalizowano kilka typów komórek jelitowych: enterocyty, komórki śluzogenne (kubkowe), komórki dokrewne oraz komórki migrujące. Występują liczne fałdy okrężne i palczaste kosmki jelitowe. Widoczne enterocyty na nabłonku, komórki migrujące (limfocyty B, neutrofile) oraz fragment rozszerzonego naczynia limfatycznego. Komórki kubkowe oraz komórki Panetha występują liczniej niż w grupie kontrolnej zwierząt (Ryc. 6, Ryc. 10). Blaszka właściwa błony śluzowej zwierząt otrzymujących w paszy dodatek synbiotyku utworzona jest z tkanki łącznej wiotkiej, która wypełnia przestrzenie pomiędzy gruczołami jelitowymi. Stwierdzono także obecność komórek plazmatycznych, fibroblastów i makrofagów. Błona podśluzowa zbudowana z tkanki łącznej luźnej, z licznymi naczyniami krwionośnymi i chłonnymi. Na dnie gruczołów jelitowych widoczne są komórki ziarniste (Panetha), których obecność związana jest ze 118 śluzówkowym układem odpornościowym. Blaszka mięśniowa błony śluzowej oddziela błonę śluzową od błony podśluzowej, która utworzona jest przez warstwę włóknistosprężystej tkanki łącznej zawierającej naczynia krwionośne, nerwy oraz pojedyncze grudki chłonne. Komórki kubkowe oraz komórki Panetha występują liczniej niż w grupie kontrolnej zwierząt. Zaobserwowana ilość plazmocytów porównywalna z grupą szczurów nie otrzymującą w paszy żadnych dodatków (Ryc. 7, Ryc. 11). Obraz histologiczny jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych d c c e b a a b Rycina 4. Przekrój podłużny przez ścianę jelita cienkiego zwierząt grupy kontrolnej. Wyraźnie widoczna błona mięśniowa (a), podśluzowa (b) oraz śluzowa z licznymi fałdami i kosmkami jelitowymi (c). H i E, pow. 40x. Rycina 5. Przekrój podłużny przez ścianę jelita cienkiego zwierząt otrzymujących w paszy probiotyk. Warstwa zewnętrza (a) i wewnętrzna (b) błony mięśniowej, błona podśluzowa (c) oraz śluzowa z kosmkami (d) i licznymi komórkami kubkowymi (e). H i E, pow. 100x. b d a a c c b Rycina 6. Przekrój podłużny przez ścianę jelita cienkiego zwierząt otrzymujących w paszy dodatek inuliny. Wyraźnie widoczne kosmki jelitowe (a), nieliczne komórki kubkowe (b), naczynie limfatyczne (c). H i E, pow. 40x. 119 Rycina 7. Przekrój podłużny przez ścianę jelita cienkiego zwierząt otrzymujących w paszy dodatek syniotyku. Kosmki jelitowe (a), gruczoły jelitowe (b), komórki kubkowe (c), komórki Panetha (d). H i E, pow. 40x. Wyniki badań własnych są zgodne z doświadczeniami, w których zastosowany dodatek inuliny [Zaky, 2009] oraz probiotyków [Dock i wsp., 2004; Zareie i wsp., 2006; Alves de Azerědo i wsp., 2010] nie miał wpływu na zmianę obrazu histologicznego jelit szczurów. 120 5.1.11 Obraz jelita cienkiego z mikroskopu elektronowego- skaningowego (SEM) zwierząt doświadczalnych a b Rycina 8. Obraz mikroskopowy jelita cienkiego zwierząt grupy kontrolnej z mikroskopu skaningowego. Widoczna struktura kosmków jelitowych (a) z elementami śluzu (b). c a c b b Rycina 9. Obraz mikroskopowy jelita cienkiego zwierząt otrzymujących w paszy probiotyk. Widoczne szczyty kosmków jelitowych (a) z obecnością wynaczynionych erytrocytów (b) oraz limfocytów (c). 121 a b Rycina 10. Obraz mikroskopowy jelita cienkiego zwierząt otrzymujących w paszy inulinę z mikroskopu skaningowego. Kosmki jelitowe (a) powleczone wydzieliną komórek kubkowych (b). a Rycina 11. Obraz mikroskopowy jelita cienkiego zwierząt otrzymujących w paszy synbiotyk z mikroskopu skaningowego. Regularny i prawidłowy kształt kosmków jelitowych pokrytych mikrokosmkami (a). 122 5.1.12 Obraz jelita cienkiego z mikroskopu transmisyjnego (TEM) zwierząt doświadczalnych Badania komórek nabłonka kosmków jelitowych w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM) wykazały we wszystkich grupach prawidłowo rozwinięty nabłonek pokryty od strony światła jelita licznymi mikrokosmkami. Najistotniejsze zmiany dotyczą części apikalnej (szczytowej) komórki, w tym rozmieszczenia i rozmiarom mikrokosmków. Tuż pod strefą mikrokosmków występuje strefa brzeżna, w której są obecne jedynie drobne pęcherzyki endocytarne, brak jest natomiast pozostałych organelli komórkowych. Strefa ta jest wyznaczona poprzez najbardziej apikalnie obecne połączenia typu desmosomy. Powyżej nich (bliżej powierzchni komórki) występują tylko połączenia zwierające, uniemożliwiające przedostawanie się treści pokarmowej pomiędzy enterocytami. Poniżej strefy brzegowej, liczne mitochondria towarzyszą siateczce plazmatycznej wraz z diktiosomem oraz pęcherzykami lizosomalnymi i egzocytarnymi (Ryc. 12). W grupie z probiotykiem (Ryc. 13) oraz inuliną (Ryc. 14) obserwuje się w pojedynczych komórkach nieco niższe ale jednocześnie nieco grubsze mikrokosmki. W grupie z synbiotykiem (Ryc. 15), kosmki jelitowe wykazują największą długość przy nieco mniejszym stopniu występowania na jednostkę powierzchni. Świadczy to o zachowaniu zdolności do prawidłowego wchłaniania oraz utrzymaniu zwiększonej powierzchni wchłaniania w obrębie pojedynczej komórki w stosunku do grupy zwierząt otrzymujących w paszy dodatek probiotyku i inuliny. 123 a a Rycina 12. Obraz mikroskopowy jelita cienkiego zwierząt grupy kontrolnej z mikroskopu transmisyjnego. Widoczna struktura mikrokosmków jelitowych (a) Rycina 13. Obraz mikroskopowy jelita cienkiego zwierząt otrzymujących w paszy probiotyk z mikroskopu transmisyjnego. Widoczna struktura mikrokosmków jelitowych (a). a a Rycina 14. Obraz mikroskopowy jelita cienkiego zwierząt otrzymujących w paszy inulinę z mikroskopu transmisyjnego. Mikrokosmki jelitowe (a). 124 Rycina 15. Obraz mikroskopowy jelita cienkiego zwierząt otrzymujących w paszy synbiotyk z mikroskopu transmisyjnego. Mikrokosmki jelitowe (a). 5.1.13 Obraz histologiczny jelita grubego zwierząt doświadczalnych Obraz histologiczny jelita grubego przedstawia struktury charakterystyczne dla narządu prawidłowo funkcjonującego. Wyraźnie zaznaczone są trzy warstwy ściany jelita: błona mięśniowa, błona podśluzowa oraz błona śluzowa wysłana nabłonkiem jednowarstwowym walcowym z licznymi kryptami jelitowymi w których znajdują się komórki kubkowe. Błona mięśniowa jelita grubego zbudowana jest podobnie jak w pozostałych odcinkach przewodu pokarmowego, przy czym występują tutaj fałdy okrężne nie zawierające elementów mięśniowych (Ryc. 16, Ryc. 20). Błona śluzowa zbudowana jest z tkanki łącznej siateczkowatej pokrytej nabłonkiem jednowarstwowym walcowatym. Komórki nabłonka wpuklając się w głąb błony śluzowej tworzą cewkowate krypty jelitowe. W nabłonku występują licznie enterocyty, a w obrębie krypt dodatkowo lokalizują się komórki macierzyste i endokrynowe. W nabłonku krypt spotyka się komórki w trakcie podziału mitotycznego, co ma znaczenie dla odnowy nabłonka (nie zaznaczono na rycinie) oraz widoczne są liczne komórki kubkowe (Ryc. 17, Ryc. 21). W błonie śluzowej znajdują się długie proste gruczoły cewkowate zbudowane z nabłonka walcowatego. Nabłonek zbudowany z kilku typów komórek: walcowatych odpowiedzialnych za resorpcję, kubkowych - produkujących śluz, macierzystych (regeneracja) i wydzielniczych (hormony peptydowe). Krypty jelitowe nie zawierają komórek z ziarnistościami kwasochłonnymi. Natomiast w blaszce właściwej błony śluzowej sporadycznie występują pojedyncze grudki limfatyczne z limfocytami i makrofagami oraz komórki kubkowe i granulocyty kwasochłonne (Ryc. 18, Ryc. 22). W błonie śluzowej jelita grubego zwierząt otrzymujących w paszy dodatek synbiotyku zlokalizowano liczne grudki chłonne samotne, które łącząc się ze sobą przekraczają granicę blaszki mięśniowej i przechodzą do warstwy błony podśluzowej. Mikrokosmki jelitowe tworzą na powierzchni jelita rąbek szczoteczkowy (tzw. rąbek wchłaniający) (Ryc. 19, Ryc. 23). 125 d d a c b a b Rycina 16. Obraz histologiczny jelita grubego zwierząt grupy kontrolnej. Przekrój podłużny przez ścianę jelita. Widoczna błona mięśniowa (a), podśluzowa (b), śluzowa z kryptami jelitowymi (c), liczne naczynia krwionośne (d). H i E, pow. 10x. Rycina 17. Obraz histologiczny jelita grubego zwierząt otrzymujących w paszy probiotyk. Błona śluzowa (a) oraz liczne komórki kubkowe (b). H i E, pow. 40x. b c a d a c a a b Rycina 18. Obraz histologiczny jelita grubego zwierząt otrzymujących w paszy inulinę. Widoczne krypty jelitowe (a), komórki kubkowe (b), limfocyty (c), makrofagi (d). H i E, pow. 40x. 126 Rycina 19. Obraz histologiczny jelita grubego zwierząt otrzymujących w paszy synbiotyk. Grudki chłonne zlane ze sobą (a), które wpuklają się do błony śluzowej (b), rąbek szczoteczkowy (c). H i E, pow. 40x. 5.1.14 Obraz jelita grubego z mikroskopu elektronowego - skaningowego (SEM) zwierząt doświadczalnych. a b Rycina 20. Obraz mikroskopowy jelita grubego zwierząt grupy kontrolnej z mikroskopu skaningowego. Wejście do krypt jelitowych (a), liczne mikrokosmki jelitowe (b). a c b Rycina 21. Obraz mikroskopowy jelita grubego zwierząt otrzymujących w paszy probiotyk z mikroskopu skaningowego. Powierzchnia jelit silnie pokryta śluzem (a), wejście do krypt jelitowych (b), liczne komórki złuszczone (c). 127 b a Rycina 22. Obraz mikroskopowy jelita grubego zwierząt otrzymujących w paszy inulinę z mikroskopu skaningowego. Silnie pofałdowana powierzchnia błony śluzowej (a) z elementami śluzu (b). a Rycina 23. Obraz mikroskopowy jelita grubego zwierząt otrzymujących w paszy synbiotyk z mikroskopu skaningowego. Nieznaczne pofałdowania błona śluzowa (a), szczyty komórek kubkowych (b). 128 5.1.15 Obraz histologiczny wątroby zwierząt doświadczalnych Opis histologiczny wątroby jest wspólny dla wszystkich grup doświadczalnych zwierząt, u których nie stwierdzono żadnych zmian w budowie i funkcjonowaniu tego narządu. W ogólnym obrazie histologicznym wątroby nie stwierdzono oznak cytotoksyczności po zastosowaniu w dawce pokarmowej u szczurów dodatków paszowych. Na rycinach widoczna jest prawidłowa struktura zarówno gruczołu jak i łącznotkankowych elementów wątroby (Ryc. 24). Uwidoczniono regularny układ zrazików wątrobowych z zaznaczonymi żyłami środkowymi (Ryc. 25). Przestrzenie wrotne mają zachowaną prawidłową architekturę triady wątrobowej. Tkanka łączna zrazikowa jest bez cech rozrostu. W obrazie histologicznym nie stwierdzono cech związanych z zastojem czy też przekrwieniem (Ryc. 26). Wątroba posiada łącznotkankowy zrąb, który podtrzymuje naczynia krwionośne, limfatyczne, nerwy i przewody żółciowe. Miąższ zbudowany głównie z hepatocytów. Przewody żółciowe są umiarkowanie wypełnione żółcią. Widoczne są również makrofagi obecne pomiędzy komórkami śródbłonka naczyniowego oraz tętnica międzyzrazikowa, żyła międzyzrazikowa i przewód żółciowy międzyzrazikowy, zwane triadą wątrobową (Ryc. 27). Wyniki badań własnych dotyczących obrazu histologicznego jelita cienkiego, jelita grubego oraz wątroby zwierząt doświadczalnych przedstawiają struktury charakterystyczne dla narządów prawidłowo funkcjonujących. Wyniki badań własnych są zgodne z doświadczeniami, w których zastosowany dodatek inuliny [Zaky, 2009] oraz probiotyków [Dock i wsp., 2004; Zareie i wsp., 2006; Alves de Azerêdo i wsp., 2010] nie miał wpływu na zmianę obrazu histologicznego wątroby u szczurów. 129 a b b a Rycina 24. Obraz histologiczny wątroby zwierząt grupy kontrolnej. Tkanka łączna zrazikowa jest bez cech rozrostu. Liczne komórki wątrobowe- hepatocyty (a), żyła centralna (b). HiE, pow.100x Rycina 25. Obraz histologiczny wątroby zwierząt grupy otrzymującej w paszy probiotyk. Regularny układ zrazików wątrobowych z żyłą centralna (a), hepatocyty (b). HiE, pow. 100x. b c a a b Rycina 26. Obraz histologiczny wątroby zwierząt grupy otrzymującej w paszy inulinę. Hepatocyty (a), żyła centralna (b), fragment żyły międzypłacikowej (c). HiE, pow. 40x. 130 Rycina 27. Obraz histologiczny wątroby zwierząt grupy otrzymującej w paszy synbiotyk. Widoczne makrofagi pomiędzy komórkami śródbłonka (a), triada wątrobowa (b). HiE, pow. 40x. 5.2 WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Doświadczenie II 5.2.1 Przyrosty masy ciała zwierząt doświadczalnych W pierwszych czternastu dniach doświadczenia przyrosty dzienne masy ciała szczurów (tabela 21) wahały się od 2,40 g (grupa I) do 3,40 g (grupa III). Grupy doświadczalne zwierząt uzyskały w tym okresie przyrosty wysokoistotnie wyższe (P≤0,01) niż szczury grupy kontrolnej. W następnym okresie, trwającym od 14 do 28 dnia doświadczenia, przyrosty masy ciała w grupach doświadczalnych II (2,90 g), III (3,10 g) oraz IV (2,95 g) nie różniły się statystycznie w porównaniu do grupy kontrolnej (2,88 g). W ostatnich dwóch tygodniach doświadczenia najwyższe przyrosty masy ciała (2,45 g) odnotowano w grupie z dodatkiem w paszy synbiotyku i były one wysokoistotnie wyższe (P≤0,01) niż w pozostałych grupach szczurów. W całym okresie doświadczalnym różnice wysokoistotne (P≤0,01) w przyrostach masy ciała stwierdzono pomiędzy grupami doświadczalnymi II (2,43 g), III (2,66 g) i IV (3,01 g), a grupą kontrolną (2,02 g). Wykazano, że dodatek do paszy synbiotyku spowodował wyższe przyrosty masy ciała szczurów niż dodatek probiotyku, ponieważ różnice w przyrostach pomiędzy zwierzętami tych grup okazały się wysokoistotne (P≤0,01). Otrzymane wyniki badań własnych dotyczące zastosowania w paszy probiotycznych szczepów bakterii są przeciwne do wyników, w których nie stwierdzono zmiany masy ciała u szczurów [Shu i wsp., 1999; Zhou i wsp., 2000; Dock i wsp., 2004; Alves de Azerědo i wsp., 2010], a nawet odnotowano jej obniżenie u myszy [Tanida i wsp., 2008]. Wyniki tej części badań własnych potwierdziły pozytywny wpływ suplementacji paszy szczepami probiotycznymi na wzrost masy ciała, co jest zgodne z innymi doświadczeniami przeprowadzonymi na szczurach [Aboderin i Oyetayo, 2006] oraz myszach [Gill i wsp., 2001; Shu i Gill, 2002; Wagner i wsp., 2009], w których stwierdzono zwiększone przyrosty masy ciała. Trzeba zaznaczyć, że w doświadczeniu I, gdzie stosowano ten sam zestaw bakterii probiotycznych choć wykazano wzrost masy ciała w stosunku do grupy kontrolnej to nie został on potwierdzony statystycznie. 131 Tabela 21. Średnie masy ciała oraz przyrosty masy ciała szczurów w poszczególnych okresach doświadczalnych Grupy żywieniowe Wyszczególnienie I - Kontrola Średnia masa ciała - II - Probiotyk III -Oligofruktoza IV-Synbiotyk 94,50 94,83 94,50 94,76 SD 4,03 SD 3,28 SD 5,28 SD 4,15 Średnia masa ciała 128,16A 141,00B 142,17B 140,17B w 14 dniu SD 6,17 SD 3,56 SD 8,30 SD 7,44 Średnia masa ciała 168,66A 181,67AB 185,16 AB 188,50B w 28 dniu SD 10,44 SD 7,60 SD8,64 SD 6,15 Średnia masa ciała 182,33A 197,00B 206,17BC 220,83C w 42 dniu SD 9,07 SD 8,24 SD 10,53 SD 3,43 2,40A 3,30B 3,40B 3,39B SD 0,53 SD 0,40 SD 0,70 SD 0,21 2,88 2,90 3,10 2,95 SD 0,47 SD 0,54 SD 0,54 SD 0,14 0,97A 1,09 AB 1,50 B 2,45C SD 0,22 SD 0,13 SD 0,24 SD 0,40 2,02A 2,43B 2,66 BC 3,01C SD 0,57 SD 0,20 SD 0,32 SD 0,13 początkowa (g) I okres doświadczalny doświadczenia (g) II okres doświadczalny doświadczenia (g) III okres doświadczalny doświadczenia (g) Średnie dzienne przyrosty masy ciała szczurów I Okres doświadczalny g II Okres doświadczalny g III Okres doświadczalny g Cały okres doświadczalny g SD - odchylenie standardowe, A, B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) Pozytywny wpływ probiotyków na wzrost masy ciała i przyrosty masy ciała zwierząt potwierdzono w doświadczeniach na drobiu [Jin i wsp., 1998; Jin i wsp., 2000; Brzóska i wsp., 1999 i 2008; Alkhalf i wsp., 2010] oraz trzodzie chlewnej [Taras i wsp., 2005, 2006, 2007; Chen i wsp., 2006; Marinho i wsp., 2007; Scharek i wsp., 2007; Wang i wsp., 2009; Kenny i wsp., 2010; Ross i wsp., 2010]. 132 Otrzymane wyniki badań własnych dotyczące zastosowania probiotyków są przeciwne do wyników otrzymanych na myszach [El-Jakee i wsp., 2010], drobiu [Estrada i wsp., 2001; Chen i wsp., 2003; Mahdavi i wsp., 2005; Klocek i wsp., 2011] oraz trzodzie chlewnej [Kritas i Morrison, 2004; Min i wsp., 2004; Taras i wsp., 2007]. Z wielu eksperymentów wynika, że zastosowanie w paszy dodatku fruktanów, w tym oligofruktozy nie miało wpływu na końcową masę ciała oraz przyrosty u szczurów [Ohta i wsp., 1998; Juśkiewicz i wsp., 2005] oraz [Le Blay i wsp., 1999; Kleessen i wsp., 2001; Lobo i wsp., 2009; Krejpcio i wsp., 2009] i mysz [Taper i wsp., 1998; Taper, Roberfroid, 1999, 2000a, 2002, Wang i wsp., 2009]. W badaniach własnych dodatek do diety oligofruktozy wpłynął na wzrost masy ciała i przyrostów szczurów. Podobne wyniki otrzymano w badaniach na szczurach [Campbell i wsp., 1997] i prosiętach [Houdijk i wsp., 1997; Estrada i wsp., 2001]. W doświadczeniach wykonanych na prosiętach oraz tucznikach również zauważono, że dodatek fruktanów zwiększył przyrosty masy ciała tych zwierząt [Grela i Pastuszek, 2001; Lipiński, 2007; Świątkiewicz i Świątkiewicz, 2008 i 2009]. Wyniki badań własnych przedstawiają korzystny wpływ zastosowanego synbiotyku na wzrost masy ciała szczurów. Innego zdania są Roller i wsp., [2004], którzy stwierdzili, że suplementacja paszy probiotykierm, prebiotykiem oraz synbiotykiem (Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium lactis Bb12 z inuliną i oligofruktozą) nie miała wpływu na przyrosty masy ciała szczurów. Natomiast zastosowanie w paszy dodatku synbiotyku (FOS z Bifidobacterium longum) wpłynęło pozytywnie na przyrosty masy ciała prosiąt [Estrada i wsp., 2001]. 5.2.2 Pobranie paszy przez zwierzęta doświadczalne W pierwszych czternastu dniach doświadczenia najwyższe pobranie paszy stwierdzono w grupie I (21,95 g), a najniższe w grupie III (19,86 g) i IV (19,90 g). Różnice w pobraniu paszy pomiędzy tymi grupami zwierząt okazały się wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) [tabela 22]. W następnych czternastu dniach doświadczenia najwyższe dzienne pobranie paszy przez szczury wykazano również w grupie kontrolnej (17,16 g) oraz w grupie II (17,15 g), a najniższe w grupie z dodatkiem w paszy synbiotyku (15,51 g). Pomiędzy tymi grupami wykazano różnice istotne statystycznie (P≤0,05). Najniższe pobranie 133 paszy przez szczury grupy IV nie miało wpływu na przyrosty masy ciała zwierząt tej grupy w tym okresie. W ostatnich czternastu dniach doświadczenia najniższe dzienne spożycie paszy wykazano w grupach zwierząt otrzymujących w paszy dodatek synbiotyku (14,01 g), a najwyższe w grupie z probiotykiem (15,11 g) i wartości te okazały się statystycznie istotne (P≤0,05). W całym okresie doświadczalnym najwyższym pobraniem karmy charakteryzowała się kontrolna grupa zwierząt (18,73 g) i grupa doświadczalna II (18,22 g), w porównaniu do grup III (17,69 g ) oraz IV (17,21 g). Tabela 22. Średnie dzienne pobranie paszy przez zwierzęta doświadczalne Grupy żywieniowe Wyszczególnienie (g/osobnika/dzień) I - Kontrolna II - Probiotyk III- Oligofruktoza IV - Synbiotyk 21,95C 20,75B 19,86A 19,90A SD 0,23 SD 0,38 SD 0,36 SD 0,73 17,16b 17,15b 16,50a b 15,51a SD 0,73 SD 0,60 SD 0,84 SD 0,87 14,3ab 15,11b 14,38ab 14,0a SD 0,47 SD 0,97 SD 0,68 SD 1,09 18,73 C 18,22C 17,69B 17,21A SD 0,33 SD 0,12 SD 0,31 SD 0,19 I Okres doświadczalny g II Okres doświadczalny g III Okres doświadczalny g Całe doświadczenie g SD - odchylenie standardowe, a, b - różnice istotne statystycznie (p≤ 0,05); A, B, C - różnice wysokoistotne statystycznie (p≤0,01) Wyniki badań własnych są zgodne z doświadczeniami innych badaczy [Shu i wsp., 1999; Zhou i wsp., 2000; Alves de Azerědo i wsp., 2010; De Azeredo i wsp., 2010] w których zastosowanie probiotycznych szczepów bakterii Lactobacillus i Bifidobacterium oraz Zymomonas mobilis nie wpłynęło na spożycie paszy u szczurów. Trzeba jednak wspomnieć, ze istotnego wzrostu pobrania paszy nie potwierdzili Klocek i wsp., [2011] w doświadczeniu przeprowadzonym na brojlerach. 134 Otrzymane wyniki badań własnych oraz wspomnianych wyżej autorów są odmienne od danych podanych z doświadczenia przeprowadzonego na myszach u których probiotyk zwiększył pobranie paszy [Gill i wsp., 2001; Shu i Gill, 2002]oraz zmniejszył pobranie (P>0,05) [Zhou i wsp., 2000]. Wyniki badań własnych są również odmienne od przeprowadzonych na drobiu, gdzie stwierdzono wzrost spożycia paszy po zastosowaniu dodatku probiotyku [Jin i wsp., 1998]. Otrzymane wyniki badań własnych dotyczące wpływu zastosowanego probiotyku na spożycie paszy przez szczury są odmienne od wyników otrzymanych na prosiętach, warchlakach, tucznikach [Rekiel i Kulisiewicz, 1996; Siuta, 2000;Simon i wsp., 2001; Rekiel, 2002] oraz lochach [Marinho i wsp., 2007], i ich potomstwa [Taras i wsp., 2005, 2006], gdzie stwierdzono obniżenie pobrania paszy przez te zwierzęta. Z kolei badania Kritas i Morrison, [2004], Min i wsp., [2004] oraz Taras i wsp., [2007] nie potwierdzają tych efektów po zastosowaniu w diecie u świń probiotyków. Trzeba jednak wspomnieć, że istotnego wzrostu pobrania paszy nie potwierdzili Klocek i wsp., [2011] w doświadczeniu przeprowadzonym na brojlerach. Oligofruktoza zastosowana w diecie u szczurów nie miała wpływu na pobranie paszy przez szczury [Ohta i wsp., 1998; Kleessen i wsp., 2001; Juśkiewicz i wsp., 2005], a według Buddington i wsp., [2002] obniżyła pobrania paszy u myszy. Roller i wsp., [2004] stwierdzili, że suplementacja paszy probiotykiem, prebiotykiem oraz synbiotykiem (Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium lactis Bb12 z inuliną i oligofruktozą) nie miała wpływu pobranie paszy przez szczury. Z Badań Estrada i wsp., [2001] wynika, że zastosowanie synbiotyku (FOS z Bifidobacterium longu) u prosiąt wpłynęło pozytywnie na pobranie i wykorzystanie paszy u prosiąt. 5.2.3 Zużycie paszy przez zwierzęta doświadczalne na jednostkę przyrostu [g] W pierwszych dwóch tygodniach doświadczenia najlepszym wykorzystaniem odznaczały się zwierzęta z grup doświadczalnych II (6,31 g/g), III (6,01 g/g) oraz IV (6,05 g/g). Grupy te różniły się wysokoistotnie (P≤0,01) od grupy kontrolnej, gdzie zużycie to wyniosło 9,27 g/ 1g przyrostu (tabela 23). 135 W następnym okresie trwającym od czternastego do dwudziestego ósmego dnia doświadczenia niższym zużyciem paszy charakteryzowały się grupy doświadczalna III (5,39 g/g) oraz IV (5,25 g/g) w porównaniu do grup kontrolnej (5,93 g/g) i II (5,96 g/g). Różnice pomiędzy tymi grupami okazały się wysokoistotne (P≤0,01). W ostatnich dwóch tygodniach doświadczenia najlepsze wykorzystanie paszy było w grupie zwierząt, które otrzymywały w diecie dodatek synbiotyku (5,60 g/g) w porównaniu do grupy kontrolnej (15,00 g/g) i z udziałem w dawce probiotyku (13,55 g/g). Istotność różnic pomiędzy poszczególnymi grupami zaznaczono w tabeli 23. Podczas całego okresu doświadczalnego, najlepszym (P≤0,01) wykorzystaniem paszy charakteryzowała się grupa doświadczalna IV (5,94 g/g) w stosunku do grupy kontrolnej (8,98 g/g) oraz II (7,53 g/g). Tabela 23. Zużycie paszy [g] na 1 g przyrostu masy ciała szczurów Wyszczególnienie Grupy żywieniowe I - Kontrolna I okres doświadczalny g II - Probiotyk III-Oligofruktoza IV - Synbiotyk 9,27B SD 1,34 6,3A SD 0,30 6,01A SD 1,24 6,05A SD 0,35 5,93B SD 0,22 5,96B SD 0,57 5,39A SD 0,31 5,25A SD 0,44 15,00C SD 2,42 13,55C SD 0,33 9,76B SD 0,81 5,60A SD 0,84 Cały okres doświadczalny g 8,98C SD 0,44 7,53B SD 0,59 6,74AB SD 0,82 5,94A SD 0,23 II okres doświadczalny g III okres doświadczalny g SD - odchylenie standardowe, A, B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) W badaniach własnych tego cyklu dodatek do paszy dla szczurów probiotyków poprawił istotnie wykorzystanie paszy przez te zwierzęta w stosunku do grupy kontrolnej, natomiast w doświadczeniu pierwszym wykorzystanie paszy przy tym dodatku również poprawiło się ale istotności statystycznej nie potwierdzono. Wzrost wykorzystania paszy u drobiu, po zastosowaniu w niej dodatku probiotyków zanotowali również Jin i wsp., [1998]. 136 Według Klocek i wsp., [2011] zastosowanie u kurcząt brojlerów w mieszance paszowej dodatku probiotyku zawierającego w swoim składzie Bacillus subtilis nie miało istotnego wpływu na wskaźniki wykorzystania paszy. U kurcząt zastosowanie probiotycznych szczepów bakterii Bifidobacterium bifidum oraz Lactobacillus. plantarum, L. plantarum K, L. acidophilus, L. fermentum wpłynęło na obniżenie zużycia paszy na jednostkę przyrostu [Jin i wsp., 1998, 2000; Brzóska i wsp., 1999]. Giang [2010] oraz Ross i wsp., [2010] po zastosowaniu dodatku probiotyku w mieszance paszowej dla odsadzonych prosiąt, odnotowali lepsze (P≤0,05) wykorzystanie paszy na jednostkę przyrostu przez te zwierzęta, co pozostaje w zgodzie z badaniami własnymi. Przydatność stosowania dodatku do paszy probiotyków w żywieniu młodych świń w odniesieniu do wykorzystania paszy potwierdzają badania wykonane przez Rekiel i Kulisiewicz [1996], Simon i wsp., [2001] oraz Mikołajczak i wsp., [2004]. Wyniki licznych doświadczeń [Rekiel i Kulisiewicz, 1996; Siuta, 2000; Simon i wsp., 2001; Rekiel, 2002] potwierdzają pozytywne zmiany w zakresie pogorszenia wykorzystania paszy na jednostkę przyrostu u prosiąt, warchlaków i tuczników, które otrzymywały paszę z dodatkiem probiotyków. Zastosowanie dodatku probiotyków do paszy dla trzody chlewnej pozytywnie wpływa na lepsze wykorzystanie paszy przez te zwierzęta [Alkhalf i wsp., 2010; Simon, 2010]. Badania przeprowadzone przez Kritas i Morrison, [2004], Min i wsp., [2004] oraz Taras i wsp., [2007] również nie potwierdzają poprawy wykorzystania paszy po zastosowaniu w diecie u świń probiotyków. 5.2.4 Składniki morfologiczne krwi zwierząt doświadczalnych Średnie wartości poszczególnych składników morfologicznych krwi szczurów wraz z ich wartościami referencyjnymi przedstawiono w tabeli 24. Porównując zawartość krwinek białych (WBC) zarówno w grupie kontrolnej (3,18 G/l) jak i w grupach doświadczalnych II (5,75 G/l), III (5,55 G/l) i IV (5,59 G/l) stwierdzono, że stężenie tego parametru jest poniżej wartości referencyjnych (6,99- 137 12,00 G/l). Odnośnie tego parametru wystąpiły różnice wysokoistotne pomiędzy grupami doświadczalnymi, a grupą kontrolną szczurów. Analizując liczbę erytrocytów (RBC) stwierdzono różnice (P≤0,01) pomiędzy grupami zwierząt otrzymującymi paszę suplementowaną probiotykiem (8,15 T/l) oraz synbiotykiem (8,77 T/l) w porównaniu do grupy bez dodatków (6,50 T/l). Najwyższa średnia masa hemoglobiny (MCH) wystąpiła u osobników otrzymujących w paszy dodatek synbiotyku (1,19 fmol) w porównaniu do osobników pozostałych grup (I - 1,13 fmol; II - 1,14 fmol; III – 1,13 fmol). Wartości dotyczące ilości hemoglobiny w cząsteczce (HGB), wskaźnika hematokrytu (HCT), ilości płytek krwi (PLT), średniej masy hemoglobiny (MCV) oraz średniego stężenia hemoglobiny w krwinkach czerwonych (MCHC) nie różniły się statystycznie między grupami i mieściły się w granicach norm fizjologicznych [Sharp, La Regina, 2000]. Tabela 24. Składniki morfologiczne krwi zwierząt doświadczalnych Parametr WBC [G/l] RBC [T/l] HGB [mmol /l] HCT [l/l] PLT [G/l] MCV [fl] MCH [fmol] MCH C [mmol /l] Wartość 1,2 refer. Grupy żywieniowe 6,0012,00 7,008,50 I - Kontrolna 3,18A SD 0,47 6,50A SD 0,48 II - Probiotyk 5,75B SD 1,02 8,15B SD 0,69 III -Oligofruktoza 5,55B SD 2,82 7,72AB SD 1,93 IV- Synbiotyk 5,59B SD 0,80 8,77B SD 0,75 6,209,94 9,90 SD 0,82 10,03 SD 0,80 9,65 SD 0,94 9,43 SD 0,83 0,300,50 7501200 1,121,37 0,483 SD 0,02 847,50 SD 96,39 54,25 SD 2,87 1,13A SD 0,01 0,492 SD 0,06 853,75 SD 104,39 55,45 SD 2,58 1,14A SD 0,03 0,449 SD 0,10 913,25 SD 142,71 54,70 SD 0,95 1,13A SD 0,02 0,490 SD 0,12 903,54 SD 191,23 57,25 SD 0,95 1,19B SD 0,03 11,8026,70 20,80 SD 0,28 20,72 SD 0,67 20,30 SD 0,25 20,83 SD 0,27 45-70 SD - odchylenie standardowe, A, B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) 1 Reference values for laboratory animals. 2010. Research Animal Resources, University of Minnesota. http://www.ahc.umn.edy/rar/refvalues.html 2 Sharp E., La Regina M., 2000: The rat laboratory. CRC Press. (red. Suckow M.). 138 Parametry morfologiczne krwi: WBC- krwinki białe, RBC- krwinki czerwone, HGB- hemoglobina, HCT (PCV)hematokryt, PLT- płytki krwi, MCV- wskaźnik średniej objętości krwinki czerwonej, MCH- wskaźnik średniej masy hemoglobiny w erytrocytach, MCHC- średnie stężenie hemoglobiny w erytrocytach Wyniki badań własnych są rozbieżne w stosunku do wyników otrzymanych na szczurach przez Nara i wsp., [2009] oraz De Azeredo i wsp., [2010], gdzie podawanie w paszy dodatku probiotyku Lactobacillus plantarum wpłynęło istotnie (P≤0,05) na zmianę wartości wskaźnika hematokrytowego (HCT), wzrost liczby płytek krwi (PLT) oraz (HGB) [Aboderin i Oyetayo, 2006]. W badaniach własnych oraz badaniach w.w. autorów odnotowano zwiększenie średniej liczby leukocytów (WBC). Zastosowanie dodatku Lactobacillus rhamnosus, L. acidophilus oraz Bifidobacterium lactis w diecie u mysz nie wpłynęło na poziom RBC, HGB, HCT we krwi u tych zwierząt [Zhou i wsp., 2000]. U indyków [Capcarová i wsp., 2008] oraz u brojlerów [Alkhalf i wsp., 2010] probiotyki nie zmieniły parametrów hematologicznych krwi, w tym RBC, WBC i HCT. Po zastosowaniu w paszy u indyków probiotyków zawierających szczepy Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Enterotococcus faecium, Bifidobacterium thermophilus [Ćetin i Guclu, 2005] poziom WBC, RBC, HGB, HCT był istotnie wyższy. W dostępnej literaturze nie znaleziono publikacji dotyczących wpływu oligofruktozy oraz synbiotyku (probiotyku z oligofruktozą) na badane parametry krwi szczurów. 5.2.5 Składniki biochemiczne krwi zwierząt doświadczalnych Średnie wartości poszczególnych składników biochemicznych w surowicy krwi szczurów wraz z ich wartościami referencyjnymi przedstawiono w tabeli 25. W badaniach własnych nie stwierdzono różnic istotnych statystycznie w parametrach biochemicznych krwi dotyczących stężenia aminotransferazy alaninowej (ALT), aminotransferazy asparaginowej (AST), gamma-glutamylotransferazy (GGTP) oraz lipazy i ά-amylazy. 139 W grupach doświadczalnych wskaźniki biochemiczne w surowicy krwi, określające przemiany białkowo-energetyczne, były mało zróżnicowane oraz nie wykazały różnic statystycznych w porównaniu do parametrów z grupy kontrolnej. Tabela 25. Składniki biochemiczne krwi zwierząt doświadczalnych Parame tr ALT [U/l] AST [U/l] GGTP [U/l] Lipaza [U/l] Wart. referen1, I –Kontrolna 2 . 59,95 52 -224 SD 9,72 227,52 457-808 SD 46,01 2,0-6,8 4,75 SD 1,31 20-45 21,25 SD 3,71 1000830,00 1280 SD 112 Grypy żywieniowe II- Probiotyk III - Oligofruktoza IV - Synbiotyk 58,02 SD 8,54 239,28 SD 69,41 5,15 SD 1,16 20,63 SD 4,23 759,25 SD 101 ΆAmylaz a [U/l] SD – odchylenie standardowe 64,25 SD 7,68 201,75 SD 38,07 5,38 SD 1,16 19,93 SD 3,80 740,25 SD 119 53,75 SD 8,79 320,75 SD 58,49 4,95 SD 1,87 22,03 SD 2,12 855,75 SD 128 1 Reference values for laboratory animals. 2010. Research Animal Resources, University of Minnesota. http://www.ahc.umn.edy/rar/refvalues.html 2 Bernardi i wsp., [1996], Coparative Haematology International Wyniki badań własnych są zgodne z doświadczeniami przeprowadzonymi na szczurach, w których zastosowanie w diecie probiotyków [Nara i wsp., 2009] i oligofruktozy [Krejpcio i wsp., 2009] nie miało wpływu na zmianę parametrów biochemicznych surowicy krwi zwierząt. 5.2.6 Wybrane składniki mineralne krwi zwierząt doświadczalnych Średnie wartości wybranych składników mineralnych w surowicy krwi szczurów przedstawiono w tabeli 26. Analizując doświadczalnych stężenie magnezu w surowicy krwi szczurów z grup II (0,93 mmol/l), III (0,86 mmol/l) oraz IV (0,87 mmol/l) stwierdzono różnice wysokoistotne (P≤0,01) statystycznie w porównaniu do stężenia tego parametru u osobników z grupy kontrolnej (1,24 mmol/l). 140 Badając stężenie wapnia oraz fosforu nieorganicznego w surowicy krwi u szczurów można stwierdzić, że zawartość tych składników mineralnych u wszystkich zwierząt doświadczalnych było na zbliżonym poziomie i nie różniło się statystycznie w porównaniu do grupy kontrolnej. Tabela 26. Składniki mineralne krwi zwierząt doświadczalnych Parametr Wapń [mmol/l] Magnez [mmol/l] Fosfor nie org. [mmol/l] Wart. refer.1 2,152,65 1,001,50 I - Kontrolna 2,51 SD 0,15 1,24B SD 0,05 2,204,50 3,06 SD 0,44 Grupy żywieniowe II - Probiotyk III-Oligofruktoza IV- Synbiotyk 2,45 2,47 2,50 SD 0,10 SD 0,06 SD 0,20 0,93A 0,86A 0,87B SD 0,16 SD 0,10 SD 0,07 2,72 SD 0,48 2,87 SD 0,28 2,81 SD 0,12 SD - odchylenie standardowe, A, B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) 1 Bernardi i wsp., [1996], Coparative Haematology International Badania przeprowadzone na szczurach przez Nara i wsp., [2009] nie potwierdziły wpływu czynnika probiotycznego na zmianę stężenia wapnia w surowicy krwi zwierząt. Podobne wyniki uzyskano w badaniach własnych, w których również nie stwierdzono wpływu probiotyków na stężenie wapnia w surowicy krwi szczurów. Zastosowanie dodatku oligofruktozy nie wpłynęło na zmianę stężenia magnezu w surowicy krwi u szczurów [Krejpcio i wsp., 2009], co jest przeciwne do wyników badań własnych. 5.2.7 Długość jelit oraz masa jelit i wątroby W badaniach własnych dotyczących pomiarów histomorfometrycznych jelit (tabela 27), odnotowano wysokoistotne zmiany (P≤0,01 dotyczące zwiększenia długości jelita cienkiego w grupie zwierząt otrzymujących w paszy dodatek synbiotyku (123,06 cm) w stosunku do szczurów nie otrzymujących w paszy żadnych dodatków (109,85 cm) oraz zwierząt pobierających z paszą probiotyk (111,55 cm). Długość jelita grubego w grupie doświadczalnej III (13,96 cm) oraz IV (14,55 cm) była wysokoistotnie wyższa niż u zwierząt z grupy kontrolnej (12,50 cm) oraz grupy z probiotykiem (12,90 cm). 141 Zastosowanie w paszy szczurów dodatku probiotyku, oligofruktozy oraz synbiotyku zwiększyło (P≤0,01) masę jelit w porównaniu do grupy kontrolnej (10,48 g; 10,59 g; 12,92 g vs 9,31 g), która nie otrzymywała w paszy żadnych dodatków. Masa wątroby nie różniła się statystycznie pomiędzy grupami zwierząt. Podawane w paszy dodatki doświadczalne nie miały wpływu na masę wątroby zwierząt. Tabela 27. Długość jelit oraz masa jelit i wątroby zwierząt doświadczalnych Parametr I - Kontrolna Długość jelita cienkiego [cm] Długość jelita grubego [cm] Łączna masa jelit [g] Masa wątroby [g] 109,85A SD 6,77 12,50A SD 3,30 9,32A SD 1,76 6,63 SD 1,52 Grupy żywieniowe II - Probiotyk III Oligofruktoza A 111,55 115,48AB SD 7,75 SD 7,14 12,90A 13,96B SD 2,52 SD 3,89 10,48B 10,59B SD 1,00 SD 2,98 6,78 6,68 SD 1,42 SD 1,03 IV - Synbiotyk 123,06B SD 10,08 14,55B SD 2,63 12,93C SD 2,80 6,80 SD 1,66 D - odchylenie standardowe, A, B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) Zastosowanie w badaniach własnych dodatku probiotyków nie miało wpływu na zmianę długości jelita cienkiego oraz grubego. Analogiczne wyniki po zastosowaniu w paszy probiotyków uzyskano w badaniach przeprowadzonych na szczurach przez Dock i wsp., [2004] oraz Juśkiewicz i wsp., [2007]. Juśkiewicz i wsp., [2005] stwierdzili wzrost masy jelit po zastosowaniu u szczurów dodatku oligofruktozy, analogicznie jak w wynikach badań własnych. W dostępnej literaturze naukowej nie znaleziono badań nad wpływem zastosowanego w badaniach własnych synbiotyku na wyżej wymienione parametry u szczurów. 5.2.8 Morfometria ściany jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych Zastosowanie w paszy dodatku synbiotyku zwiększyło (P≤0,01) grubość błony śluzowej jelita cienkiego (453,60 цm) w porównaniu do pozostałych grup zwierząt (I 410,23 цm, II- 426,18 цm, III – 420,46 цm) (tabela 28). Grubość błony podśluzowej u szczurów otrzymujących w paszy synbiotyk (38,82 цm) różniła się wysokoistotnie w stosunku do grupy II (30,51 цm) kontrolnej (31, 23 цm). 142 Szczury otrzymujące w paszy dodatek oligofruktozy oraz synbiotyku charakteryzowały się wysokoistotnie (P≤0,01) grubszą błoną mięśniową w porównaniu do osobników grupy kontrolnej, a także z dodatkiem probiotyku (odpowiednio – 75,28 цm i 79,88 цm vs 72,47 цm i 70,92 цm). Tabela 28. Elementy strukturalne ściany jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych Wyszczególnienie Grubość błony śluzowej (цm) Grubość błony podśluzowej (цm) Grubość błony mięśniowej (цm) Długość kosmków jelitowych (цm) Głębokość krypt jelitowych (цm) I- Kontrolna Grupy żywieniowe II- Probiotyk III- Oligofruktoza IV- Synbiotyk 410,23A SD62,85 426,18A SD 83,15 420,46A SD 77,34 453,6B SD 69,98 31,23A SD 8,98 30,51A SD 12,81 33,02AB SD 10,16 38,82B SD 16,35 72,47A SD 18.57 70,92A SD 21,25 75,28B SD 24,34 79,88B SD 25.92 215,02A SD 98,67 233,42B SD 53,27 231,74B SD 47,12 268,47D SD 78,39 133,41A SD 48,26 136,75A SD 52,16 135,16A SD 56,11 140,52B SD 64,14 SD - odchylenie standardowe, A, B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) Najniższą wysokością kosmków jelitowych charakteryzowała się grupa kontrolna (215,02 цm) i grupa ta różniła się wysokoistotnie odnośnie tego parametru od szczurów pozostałych grup. Wysokoistotne różnice dotyczące długości kosmków jelitowych odnotowano również pomiędzy grupami doświadczalnymi II (233,42 цm) i III (231,74 цm), a IV (268,47 цm). Krypty jelitowe miały najwyższą głębokość w grupie zwierząt z dodatkiem synbiotyku (140,53 цm) w porównaniu do pozostałych grup zwierząt (I- 133,41 цm; II – 136,75 цm i III – 135,16 цm). Różnice te okazały się wysokoistotne (P≤0,01). 143 Wybrane elementy komórkowe ściany jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych Wyniki analizy wybranych elementów komórkowych ściany jelita cienkiego dotyczących ilości enterocytów, komórek kubkowych, komórek mitozy, plazmocytów oraz komórek Panetha przedstawiono w tabeli 29. W ścianie jelita cienkiego stwierdzono różnice wysokoistotne statystycznie (P≤,01) dotyczące ilości zaobserwowanych enterocytów w grupach doświadczalnych III (139,15) i IV (127,15) w porównaniu do grupy kontrolnej (98,46) i grupy II (101,12). Liczba komórek kubkowych w grupach szczurów otrzymujących w paszy dodatek oligofruktozy oraz synbiotyku różniła się wysokoistotnie w porównaniu do ilości tych komórek w grupach kontrolnej (52,12) i z zawartością probiotyku (54,24). W wynikach badań własnych odnotowano wzrost (P≤0,01) liczby komórek kubkowych w ścianie jelita cienkiego po dodaniu do paszy badanych dodatków. Przeprowadzone badania histomorfometryczne dotyczące występowania komórek Panetha wykazały wysokoistotne różnice pomiędzy grupą IV (28,19), a pozostałymi grupami zwierząt (I – 23,18; II – 24,01; III – 24,23). Komórki te biorą udział w reakcjach obronnych jelit oraz uczestniczą w fagocytozie mikroorganizmów. Tabela 29. Wybrane elementy komórkowe ściany jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych Elementy komórkowe (szt.) Enterocyty Komórki kubkowe Komórki mitozy Plazmocyty Komórki Panetha Stosunek enterocytów do komórek kubkowych I - Kontrolna 98,46A SD 11,58 52,12A SD 8,02 1,25 A SD 0,46 4,15A SD 2,16 23,18A SD 6,26 1,39A SD 0,08 Grupy żywieniowe III II - Probiotyk Oligofruktoza 101,12A 139,15B SD 26,40 SD 22,18 A 54,24 62,46B SD 9,75 SD 10,12 IV- Synbiotyk 0 0 4,00A SD 1,00 24,01A SD 5,75 6,25B SD 2,64 24,23A SD 2,52 127,15B SD 20,21 64,28B SD 10,46 3,50B SD 1,25 6,50B SD 1,52 28,19B SD 10,12 1,35A SD 0,07 2,15B SD 0,04 1,95B SD 0,06 SD - odchylenie standardowe, A, B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) 144 W grupie zwierząt, która otrzymywała w paszy dodatek oligofruktozy oraz synbiotyku stwierdzono (P≤0,01) wzrost proporcji pomiędzy komórkami enterocytów, a komórkami kubkowymi w porównaniu do grupy kontrolnej (1,39) oraz z probiotykiem (1,35). Otrzymane wyniki sugerują na polepszenie procesu wchłaniania jelitowego na poziomie komórkowym, co potwierdzają wyniki dotyczące wyższych przyrostów masy ciała szczurów otrzymujących w diecie wspomniane dodatki paszowe. 5.2.9 Morfometria ściany jelita grubego zwierząt doświadczalnych Grubość błony śluzowej jelita grubego (tabela 30) osobników żywionych paszą zawierającą dodatek synbiotyku (218,13 цm) była największa i różniła się wysokoistotnie (P≤0,01) w porównaniu do grupy kontrolnej (159,17 цm) oraz z dodatkiem probiotyku (165,64 цm). Tabela 30. Grubość błon komórkowych oraz elementy strukturalne ściany jelita grubego zwierząt doświadczalnych Wyszczególnienie Grubość błony śluzowej (цm) Grubość błony podśluzowej (цm) Grubość błony mięśniowej (цm) Głębokość krypt jelitowych (цm) Ilość komórek kubkowych Grupy żywieniowe I - Kontrolna II - Probiotyk 159,17A SD 29,22 165,64A SD 20,18 208,65AB SD 26,98 218,13B SD 35,98 86,22B SD 9,67 80,15A SD 19,57 98,81C SD 15,42 103,23C SD 18,85 140,18 SD 50,88 138,74 SD 41,11 144,89 SD 53,02 149,01 SD 65,18 85,55A SD 42,47 89,15A SD 38,17 82,13A SD 41,11 101,23B SD 59,42 6,25A SD 2,02 5,98A SD 3,15 9,79B SD 4,28 10,32 B SD 5,04 SD - odchylenie standardowe, A, B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) 145 III-Oligofruktoza IV - Synbiotyk Największą grubość błony podśluzowej odnotowano w grupach zwierząt otrzymujących w paszy dodatek oligofruktozy (98,81 цm) oraz synbiotyku (103,23 цm), a najmniejszą w grupie z dodatkiem probiotyku (80,15 цm). Istotność różnic zaznaczono w tabeli 30. Grubość błony mięśniowej we wszystkich grupach szczurów była na zbliżonym poziomie i nie różniła się statystycznie pomiędzy sobą. Głębokość krypt jelitowych w grupie zwierząt otrzymującej w paszy dodatek synbiotyku była najwyższa i różniła się wysokoistotnie (P≤0,01) w stosunku do głębokości krypt w grupach pozostałych. Statystycznie wyższą (P≤0,01) ilość komórek kubkowych w ścianie jelita grubego odnotowano w grupie szczurów otrzymujących w paszy dodatek oligofruktozy (9,79) oraz synbiotyku (10,32) w porównaniu do grupy kontrolnej (6,25) i grupy z probiotykiem (5,98). Podawanie szczurom bakterii probiotycznych, zarówno w badaniach własnych jak i pracach wielu autorów [Peran i wsp., 2006; Geier i wsp., 2007; Frias i wsp., 2009] wpłynęło na zmiany budowy ściany jelit zwierząt doświadczalnych. 146 5.2.10 Obraz histologiczny jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych Obraz histologiczny jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych jest zgodny z opisem podanym w doświadczeniu pierwszym. We wszystkich grupach zwierząt nie stwierdzono zmian w budowie i funkcjonowaniu jelit. U zwierząt grupy kontrolnej wyraźnie widoczna dwuwarstwowa błona mięśniowa oraz błona podśluzowa zbudowana z tkanki łącznej zawierającej naczynia krwionośne i nerwy. Błona śluzowa dzieli się na trzy warstwy: blaszkę mięśniową błony śluzowej, blaszkę właściwą błony śluzowej oraz nabłonek. W błonie śluzowej występują liczne kosmki i gruczoły jelitowe oraz komórki kubkowe i enterocyty. Mikrokosmki tworzą na powierzchni komórki tzw. rąbek szczoteczkowy (wchłaniający) (Ryc. 28, Ryc. 32). U szczurów otrzymujących dodatek probiotyku zauważono wzrost grubości błony podśluzowej oraz wydłużenie kosmków jelitowych (Ryc. 29, Ryc. 33). W obrazie histologicznym zauważono wzrost liczby enterocytów, komórek kubkowych, komórek Panetha i plazmocytów u osobników otrzymujących w diecie dodatek oligofruktozy (Ryc. 30, Ryc. 34), co potwierdzono statystycznie w pomiarach histomorfometrycznych. W nabłonku błony śluzowej jelita występują licznie enterocyty, które są komórkami podłużnymi, jądra komórkowe umieszczone są w podstawnej części komórki, poszczególne enterocyty łączą się obwódkami zamykającymi. Enterocyty biorą udział w procesie wchłaniania z jelita cienkiego do krwi, za pomocą rąbka szczoteczkowego, który pokrywa je od strony światła jelita. Zauważalny jest wzrost długości kosmków jelitowych i głębokości krypt u osobników otrzymujących paszę suplementowaną synbiotykiem (Ryc. 31, Ryc. 35). 147 d c d c c a b b b a a a Rycina 28. Obraz jelita cienkiego zwierząt grupy kontrolnej. Przekrój podłużny przez ścianę jelita cienkiego. Wyraźnie widoczna błona mięśniowa (a), podśluzowa (b) oraz śluzowa (c) z kosmkami i gruczołami jelitowymi (d). HiE, pow. 40x. Rycina 29. Obraz jelita cienkiego zwierząt grupy doświadczalnej otrzymującej w paszy dodatek probiotyku. Kosmki jelitowe (a), komórki kubkowe (b), enterocyty (c), rąbek szczoteczkowy (d), HiE, pow. 40x. a b a a a b Rycina 30. Obraz jelita cienkiego grupy doświadczalnej otrzymującej w paszy dodatek oligofruktozy. Komórki Panetha (a), komórki kubkowe (b). HiE, pow. 40x. 148 Rycina 31. Obraz jelita cienkiego grupy doświadczalnej otrzymującej w paszy dodatek synbiotyku. Kosmki jelitowe (a), a w nich komórki Panteha (b). HiE, pow. 40x. 5.2.11 Obraz jelita cienkiego z mikroskopu elektronowego- skaningowego (SEM) zwierząt doświadczalnych b a Rycina 32. Obraz mikroskopowy jelita cienkiego zwierząt grupy kontrolnej z mikroskopu skaningowego. Widoczna struktura kosmków jelitowych (a), limfocyty (b). b a Rycina 33. Obraz mikroskopowy jelita cienkiego zwierząt grupy doświadczalnej otrzymującej w paszy probiotyk z mikroskopu skaningowego. Widoczna struktura kosmków jelitowych (a) z elementami śluzu oraz limfocyty (b). 149 a Rycina 34. Obraz mikroskopowy jelita cienkiego zwierząt otrzymujących w paszy oligofruktozę z mikroskopu skaningowego. Widoczna struktura kosmków jelitowych (a). a b Rycina 35. Obraz mikroskopowy jelita cienkiego zwierząt otrzymujących w paszy probiotyk z oligofruktozą z mikroskopu skaningowego. Widoczna struktura kosmków jelitowych (a) powleczone śluzem i komórkami złuszczonymi (b). 150 5.2.12 Obraz histologiczny jelita grubego zwierząt doświadczalnych Obraz histologiczny jelita grubego zwierząt doświadczalnych jest zgodny z opisem podanym w doświadczeniu pierwszym. We wszystkich grupach zwierząt nie stwierdzono zmian w budowie i funkcjonowaniu jelit. Błona śluzowa jelita grubego wysłana nabłonkiem jednowarstwowym. Mikrokosmki znacznie krótsze (Ryc. 36, Ryc. 40). Nabłonek wpukla się w blaszkę właściwą błony śluzowej, tworząc zagłębienia w kształcie cewek, które nie mają komórek z ziarnistościami kwasochłonnymi. Tkanka podśluzowa zbudowana jest z tkanki łącznej luźnej, w obrębie której znajdują się sploty naczyniowe oraz sploty nerwów (Ryc. 37, Ryc. 41). W błonie mięśniowej występują dwa pokłady komórek mięśniowych gładkich (wewnętrzny i zewnętrzny). Błona śluzowa oraz podśluzowa jelita grubego szczurów otrzymujących w paszy dodatek oligofruktozy (Ryc. 38, Ryc. 42) oraz synbiotyku (Ryc. 39, Ryc. 43) jest wyraźnie grubsza w porównaniu do grupy bez dodatków, co wykazano w badaniach histomorfometrycznych. Głębsze krypy jelitowe oraz większa ilość komórek kubkowych stwierdzono w obrazie histologicznym u szczurów, których pasza suplementowana była synbiotykiem. 151 c b b aa b dd a Rycina 36. Obraz histologiczny jelita grubego zwierząt grupy kontrolnej. Przekrój podłużny z wyraźnie zaznaczoną błoną mięśniową (a), podśluzową (b) oraz śluzową (c). Sploty naczyniowe tkanki podśluzowej (d). HiE, pow. 40x. Rycina 37. Obraz histologiczny jelita grubego zwierząt otrzymujących w paszy probiotyk. Krypty jelitowe (a) i komórki kubkowe (b). HiE, pow. 40x. b b a a aa Rycina 38. Obraz histologiczny jelita grubego zwierząt otrzymujących w paszy oligofruktozę. Krypty jelitowe (a), komórki kubkowe (b). HiE, pow. 10x. 152 Rycina 39. Obraz histologiczny jelita grubego zwierząt otrzymujących w paszy synbiotyk. Liczne komórki kubkowe (a). HiE, pow. 100x. 5.2.13 Obraz jelita grubego z mikroskopu elektronowego - skaningowego (SEM) zwierząt doświadczalnych a Rycina 40. Obraz mikroskopowy jelita grubego zwierząt grupy kontrolnej z mikroskopu skaningowego. Powierzchnia jelit silnie pokryta śluzem (a). b a Rycina 41. Obraz mikroskopowy jelita grubego zwierząt grupy doświadczalnej otrzymującej w paszy probiotyk z mikroskopu skaningowego. Wejście do krypt jelitowych (a), liczne komórki złuszczone (b). 153 a Rycina 42. Obraz mikroskopowy jelita grubego zwierząt otrzymujących oligofrutkozę z mikroskopu skaningowego. Wejście do krypt jelitowych (a). a Rycina 43. Obraz mikroskopowy jelita grubego zwierząt otrzymujących probiotyk z oligofruktozą z mikroskopu skaningowego. Wejście do krypt jelitowych (a). 154 5.2.14 Obraz immunohistochemiczny jelit zwierząt doświadczalnych Badania immunocytochemiczne ujawniły zwiększoną liczebność komórek układu białokrwinkowego (plazmocytów, limfocytów B) zarówno w jelicie grubym jak i cienkim w obrębie błony śluzowej w grupie żywionej synbiotykiem w porównaniu do grupy kontrolnej, co potwierdza wyniki uzyskane w badaniu histologicznym. Świadczy to o pobudzeniu układu odpornościowego przez składniki synbiotyku, co ujawnia się poprzez wzrost syntezy przeciwciał. Jest to szczególnie istotne w jelicie grubym, gdzie obecne bakterie mogą stanowić zagrożenie dla organizmu, a syntezowane tutaj przeciwciała tworzą swoistą barierę zapobiegające inwazji w głąb ciała. Komórki plazmatyczne układają się najczęściej wokół gruczołów jelitowych lub krypt jelitowych. Rzadko tworzą skupiska przypominające grudki chłonne. Zazwyczaj w niewielkiej odległości od nich występują makrofagi. Pozostałe limfocyty spotkać można zarówno w tkance łącznej błony śluzowej jak i w obrębie nabłonka jelitowego jako komórki migrujące. Obraz immunohistochemiczny jelita cienkiego i jelita grubego przedstawiono na rycinach 44-51. 155 Obraz immunohistochemiczny jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych Rycina 44. Obraz jelita cienkiego szczurów grupy kontrolnej. Przekrój poprzeczny przez ścianę jelita czczego. Widoczne trzy błony (mięśniowa, śluzowa i podśluzowa) z pozostałością treści pokarmowej. HiE, pow. 100x. Rycina 45. Obraz jelita cienkiego zwierząt otrzymujących w paszy probiotyk. Kosmki jelitowe i krypty jelitowe z elementami komórkowymi. HiE, pow. 100x. Rycina 46. Obraz jelita cienkiego szczurów otrzymujących w paszy oligofruktozę. Kosmki i gruczoły jelitowe. HiE, pow. 100x. Rycina 47. Obraz jelita cienkiego szczurów otrzymujących w paszy synbiotyk. Liczne komórki kubkowe. HiE, pow. 100x. 156 Obraz immunohistochemiczny jelita grubego zwierząt doświadczalnych Rycina 48. Obraz mikroskopowy jelita grubego zwierząt grupy kontrolnej. Prawidłowa budowa ściany jelita. HiE, pow. 100x. Rycina 49. Obraz mikroskopowy jelita grubego zwierząt otrzymujących w paszy probiotyk. HiE, pow. 100x. Rycina 50. Obraz mikroskopowy jelita grubego zwierząt otrzymujących w paszy oligofruktozę. HiE, pow. 100x. Rycina 51. Obraz mikroskopowy jelita grubego zwierząt otrzymujących w paszy synbiotyk. HiE, pow. 100x. 157 5.2.15 Obraz histologiczny wątroby zwierząt doświadczalnych b a a Rycina 53. Obraz histologiczny wątroby szczurów otrzymujących w paszy probiotyk. Komórki zapalne limfocytów (a). HiE, pow. 100x. Rycina 52. Obraz histologiczny wątroby szczurów grupy kontrolnej. Żyła centralna (a), hepatocyty (b). HiE, pow. 100x. a a Rycina 54. Obraz histologiczny wątroby szczurów otrzymujących w paszy oligofruktozy. Triada wątrobowa (a). HiE, pow. 100x. Rycina 55. Obraz histologiczny wątroby szczurów otrzymujących w paszy synbiotyk. Triada wątrobowa (a). HiE, pow. 100x. Obraz histologiczny wątroby zgodny z opisem podanym w doświadczeniu pierwszym. 158 5.3 WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Doświadczenie III 5.3.1 Przyrosty masy ciała zwierząt doświadczalnych W pierwszym okresie doświadczalnym przyrosty masy ciała szczurów (tabela 31) wahały się od 1,33 g (grupa I) do 1,76 g (grupa III). Najwyższe przyrosty (P≤0,01) uzyskały zwierzęta z grupy III, które otrzymywały w paszy dodatek probiotyku z włóknem jabłkowym. W drugim okresie doświadczalnym odnotowano wysokoistotne zmiany dotyczące przyrostów masy ciała szczurów, które wystąpiły pomiędzy grupami doświadczalnymi II (0,86 g) i III (0,84 g), a grupą kontrolną (0,74g). Dla całego okresu doświadczalnego stwierdzono różnice wysokoistotne statystycznie dotyczące przyrostów masy ciała zwierząt, pomiędzy grupami doświadczalnymi (probiotyk z z β-glukanem – 1,29g; probiotyk z włóknem jabłkowym – 1,32 g), a grupą kontrolną (1,11 g). Tabela 31. Przyrosty masy ciała zwierząt doświadczalnych Wyszczególnienie I - Kontrolna Grupy żywieniowe II - Probiotyk + β glukan 178,57 SD 9,59 Średnia początkowa 183,83 masa ciała- (g) SD 4,85 I okres doświadczalny Średnia masa ciała 229,16A szczurów w 34 dniu SD 5,28 doświadczenia (g) II okres doświadczalny Średnia masa ciała szczurów 250,27 w 60 dniu SD 6,87 doświadczenia Średnie dzienne przyrosty masy ciała szczurów I Okres doświadczalny g 1,33A SD 0,39 II Okres doświadczalny g 0,74A SD 0,15 Cały okres doświadczenia g 1,11A SD 0,18 III - Probiotyk + włókno jabłkowe 182,29 SD 6,03 233,85AB SD 8,84 242,0B SD 10,13 256,28 SD 9,29 261,36 SD 10,30 1,63AB SD 0,16 1,76B SD 0,45 0,86B SD 0,15 0,84B SD 0,23 1,29B SD 0,14 1,32B SD 0,24 SD – odchylenie standardowe; A, B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) 159 W badaniach własnych dodatek do paszy szczurów probiotyku z β-glukanem oraz probiotyku z włóknem jabłkowym miał korzystny (P≤0,01) wpływ na przyrosty masy ciała zwierząt drugiego okresu doświadczalnego (od 35 do 60 dnia eksperymentu) jak również całego cyklu badawczego. W wielu doświadczeniach przeprowadzonych na szczurach zastosowanie w paszy dodatku samego probiotyku [Shu i wsp., 1999; Zhou i wsp., 2000; Dock i wsp., 2004; Alves de Azerêdo i wsp., 2010] oraz dodatku samego β-glukanu [Delaney i wsp., 2003; Babiček i wsp., 2007; Jonker i wsp., 2009] nie miało wpływu na przyrosty masy ciała tych zwierząt podczas okresu doświadczalnego. Wyniki badań własnych sugerują, że połączenie probiotyku z β-glukanem okazało się korzystniejsze niż, jak to wynika z przedstawionych powyżej publikacji zastosowanie w paszy każdej z tych substancji osobno. W dostępnej literaturze nie znaleziono wielu danych dotyczących badań nad stosowaniem w dawkach pokarmowych u zwierząt dodatku probiotyku z β-glukanem. Dodatek β-glukanu i probiotycznych szczepów Bacillus amyloliquefaciens poprawił podstawowe parametry produkcyjne brojlerów [An i wsp., 2008] podobnie jak w otrzymanych na szczurach wynikach badań własnych. Przeciwne wyniki z zastosowaniem probiotyku z β-glukanem otrzymali w doświadczeniu na drobiu Milczarek i wsp., [2012], w którym zastosowany dodatek synbiotyku nie miał wpływu na masę ciała kurcząt brojlerów. Mátéová i wsp., [2008] po zastosowaniu dodatku synbiotyku stwierdzili wzrost przyrostów masy ciała u kurcząt przeciwnie do wyników Liong i Shah [2006], którzy zaobserwowali obniżenie przyrostów masy ciała u szczurów otrzymujących dodatek synbiotyku (bakterii probiotycznych z inuliną i oligofruktozą). Wyniki badań własnych wskazują, że zastosowanie w paszy u szczurów dodatku probiotyku z włóknem jabłkowym korzystnie (P≤0,01) wpłynęło na przyrosty masy ciała podczas całego okresu doświadczalnego. Z publikacji naukowych wynika, że suplementacja diety u szczurów szczepami probiotycznymi spowodowała wzrost masy ciała [Aboderin i Oyetayo, 2006] lub jej obniżenie [Tanida i wsp., 2008] bądź nie miała wpływu na zmianę masy ciała [Dock i wsp., 2004; Alves de Azerêdo i wsp., 2010]. Zastosowanie w paszy dodatku samego włókna jabłkowego [Aprikian i wsp., 2003; Pirman i wsp., 2007, 2009] miało istotny wpływ na zmniejszenie przyrostów masy ciała szczurów, przeciwnie do otrzymanych wyników badań własnych, w których włókno jabłkowe podano łącznie z probiotykiem. 160 Gallaher i wsp., [1996] stwierdzili, że zastosowanie dla szczurów paszy zawierającej w swoim składzie dodatek synbiotyków korzystnie wpłynęło na masę ciała oraz przyrosty masy ciała zwierząt, co potwierdzono w badaniach własnych. Przeciwne wyniki badań, przeprowadzonych na tej samej grupie zwierząt, otrzymali Yang i wsp., [2005], Liong i Shah [2006] oraz Geier i wsp., [2007]. 5.3.2 Pobranie paszy przez zwierzęta doświadczalne W pierwszym okresie doświadczalnym najwyższe pobranie paszy (tabela 32) stwierdzono w grupach II (18,48 g) i III (18,64 g), a najniższe w grupie I (17,85 g). Różnice w pobraniu paszy pomiędzy tymi grupami zwierząt okazały się istotne statystycznie (P≤0,05). W następnym okresie doświadczalnym najwyższe (P≤0,01) pobranie paszy przez szczury wykazano w grupie III (21,98 g), a najniższe w grupie kontrolnej (20,79 g). W całym okresie doświadczalnym najwyższym (P≤0,01) pobraniem karmy charakteryzowała się grupa III (19,67g), a najniższym grupa kontrolna (18,54 g). Biorąc pod uwagę cały okres doświadczalny dodatek do paszy probiotyku z βglukanem nie miał wpływu na pobranie paszy przez szczury w porównaniu do grupy kontrolnej. Tabela 32. Pobranie paszy przez zwierzęta doświadczalne Wyszczególnienie I Okres doświadczalna g II Okres doświadczalny g Całe doświadczenie g Grupy żywieniowe II - Probiotyk + β glukan III - Probiotyk + włókno jabłkowe 17,85a SD 0,62 18,48b SD 0,31 18,64b SD 0,42 20,79A SD 1,22 21,40AB SD 0,69 21,98B SD 0,71 18,54A SD 0,83 18,98AB SD 0,58 19,67B SD 0,64 I - Kontrolna SD - odchylenie standardowe; a, b – różnice istotne statystycznie (P≤0,05); A, B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) 161 Suplementacja paszy probiotykiem z β-glukanem nie wpłynęła na pobranie paszy przez szczury, co również wykazali inni autorzy z zastosowaniem u szczurów dodatku probiotyku [Alves de Azerêdo i wsp., 2010; De Azeredo i wsp., 2010] oraz βglukanu [Delaney i wsp., 2003; Babiček i wsp., 2007; Jonker i wsp., 2009]. Zastosowanie w badaniach własnych probiotyku w połączeniu z włóknem jabłkowym wpłynęło na wzrost (P≤0,01) pobrania paszy przez szczury podczas całego doświadczenia. Natomiast w badaniach wykonanych na szczurach przez Aprikian i wsp., [2003] oraz Pirman i wsp., [2007, 2009] suplementacja paszy tylko włóknem jabłkowym nie miała wpływu na pobranie paszy. Wyniki niektórych eksperymentów wskazują, że zastosowanie synbiotyku wpłynęło (P≤0,01) na wyższe pobranie paszy przez kurczęta [Brzóska i wsp., 2008; Abdel-Raheem i Abd-Allah, 2011]. Istnieją także wyniki doświadczeń Taherpour i wsp., [2009], w których dodatek synbiotyku wysokoistotnie ograniczył pobranie paszy przez brojlery. 5.3.3 Zużycie paszy przez zwierzęta doświadczalne na jednostkę przyrostu [g] W pierwszym okresie doświadczalnym najlepszym wykorzystaniem paszy wynoszącym 11,10 g/1g przyrostu odznaczała się grupa III, która różniła się wysokoistotnie od grupy kontrolnej, w której wykorzystanie to wyniosło 15,18 g / 1g przyrostu. Tabela 33. Wykorzystanie paszy przez zwierzęta doświadczalne na jednostkę przyrostu [g] I - Kontrolna Grupy żywieniowe II – Probiotyk + β glukan III - Probiotyk + włókno jabłkowe 15,18B SD 4,83 11,48AB SD 1,18 11,10A SD 2,18 25,59A SD 4,29 25,62A SD 5,34 22,50B SD 8,06 Cały okres doświadczalny g 17,35B SD 3,08 15,65A SD 2,39 15,18A SD 2,60 Wyszczególnienie I okres doświadczalny g II okres doświadczalny g SD - odchylenie standardowe; A, B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) 162 W drugim okresie doświadczalnym lepszym wykorzystaniem paszy charakteryzowała się grupa III zwierząt (22,50 g/1g) i różniła się ona wysokoistotnie w porównaniu do grupy II (25,62 g/1g) i kontrolnej (25,59 g/1g). W całym okresie doświadczalnym najlepszym wykorzystaniem paszy charakteryzowały się zwierzęta grupy doświadczalnej II (15,65 g/1g) oraz III (15,18 g/1g) w porównaniu do grupy kontrolnej szczurów (17,35 g/1g). Różnice odnośnie tego parametru okazały się wysokoistotne (P≤0,01). Wyniki badań własnych dotyczące zastosowania w paszy dodatku probiotyku z β – glukanem wskazują na lepsze (P≤0,01) wykorzystania paszy przez szczury na jednostkę przyrostu. Połączenie obydwu substancji w dawce pokarmowej wywołuje korzystniejszy efekt żywieniowy niż użycie każdej z nich osobno. W doświadczeniach na szczurach nie stwierdzono zmian w wykorzystaniu paszy zawierającej w swoim składzie dodatek samego probiotyku [Dock i wsp., 2004] oraz samego β – glukanu [Delaney i wsp., 2003; Babiček i wsp., 2007; Jonker i wsp., 2009]. Wyniki badań własnych dotyczące zastosowania w paszy dla szczurów dodatku probiotyku z włóknem jabłkowym wskazują również na lepsze (P≤0,01) wykorzystanie paszy na jednostkę przyrostu. Podobne wyniki otrzymali Aprikian i wsp., [2003] po zastosowaniu w paszy dla szczurów dodatku włókna jabłkowego. 5.3.4 Składniki morfologiczne we krwi zwierząt doświadczalnych Średnie wartości poszczególnych składników morfologicznych krwi szczurów wraz z ich wartościami referencyjnymi przedstawiono w tabeli 34. W badaniach dotyczących składników morfologicznych krwi stwierdzono różnice wysokoistotne (P≤0,01) pomiędzy grupami doświadczalnymi, a kontrolną w odniesieniu do stężenia krwinek białych (WBC) [odpowiednio 4,58 G/l (gr II) I 4,85 G/l (gr III) vs 2,13 G/l (gr I) i czerwonych (RBC) [8,46 T/l (gr II) I 8,23 T/l (gr III) vs 7,10 T/l (gr (I)]. Najniższe stężenie płytek krwi (PLT) odnotowano w grupie III (775,67 G/l), a najwyższe w grupie II (898,70 G/l). Odnośnie tego parametru wykazano różnice wysoko- istotne pomiędzy badanymi grupami szczurów. W badaniach morfologicznych krwi szczurów, otrzymane wartości dotyczące poziomu hemoglobiny (HGB), hematokrytu (HCT), wskaźnika średniej objętości krwinki czerwonej (MCV), średniej masy hemoglobiny w erytrocytach (MCH) oraz 163 średniego stężenia hemoglobiny w erytrocytach (MCHC) nie różniły się statystycznie pomiędzy grupami i mieściły się w granicach norm fizjologicznych lub na granicy tych norm [Sharp, La Regina, 2000]. Tabela 34. Składniki morfologiczne we krwi zwierząt doświadczalnych Parametr WBC [G/l] RBC [T/l] HGB [mmol/l] HCT [l/l] PLT [G/l] MCV [fl] MCH [fmol] MCHC [mmol/l] Wartość refer.1, 2 6-12 7,008,50 6,209,94 0,300,50 7501200 45-70 1,121,37 11,8026,70 I - Kontrolna 2,13A SD 0,39 7,10A SD 0,86 9,23 SD 0,98 0,39 SD 0,02 828,00B SD 35,13 43,17 SD 1,25 1,15 SD 0,03 23,33 SD 0,85 Grupy żywieniowe II - Probiotyk + β glukan 4,58B SD 0,98 8,46B SD 0,28 9,07 SD 0,44 0,38 SD 0,04 898,70C SD 20,11 49,33 SD 1,03 1,17 SD 0,06 23,62 SD 0,68 III – Probiotyk + włókno jabłkowe 4,85B SD 0,87 8,23B SD 0,35 8,68 SD 0,82 0,36 SD 0,03 775,67A SD 24,90 48,83 SD 1,40 1,16 SD 0,04 24,02 SD 0,91 SD – odchylenie standardowe; A, B, C - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) 1 Reference values for laboratory animals. 2010. Research Animal Resources, University of Minnesota. http://www.ahc.umn.edy/rar/refvalues.html 2 Sharp, La Regina, 2000 Parametry morfologiczne krwi: WBC - krwinki białe, RBC - krwinki czerwone, HGB - hemoglobina HCT (PCV)- hematokryt, PLT- płytki krwi, MCV- wskaźnik średniej objętości krwinki czerwonej, MCH- wskaźnik średniej masy hemoglobiny w erytrocytach, MCHC- średnie stężenie hemoglobiny w erytrocytach W dostępnej literaturze znaleziono tylko jedna pracę opisującą wpływ synbiotyków na składniki morfologiczne krwi [Fleige i wsp., 2007]. Stwierdzono w niej, że synbiotyk (Enterococcus faecium z laktulozą) istotnie obniżył ilość płytek krwi bez wpływu na pozostałe składniki. 5.3.5 Składniki biochemiczne krwi zwierząt doświadczalnych Średnie wartości poszczególnych składników biochemicznych w surowicy krwi szczurów wraz z ich wartościami referencyjnymi przedstawiono w tabeli 35. W badaniach biochemicznych krwi stwierdzono różnice wysokoistotne statystycznie dotyczące aktywności enzymatycznej aminotransferazy alaninowej (ALT), 164 aminotransferazy asparaginianowej (AST) oraz lipazy pomiędzy grupa kontrolną, a grupami doświadczalnymi. Wyższe stężenie ALT było w grupach doświadczalnych II (125,17 U/l) i III (142,18 U/l) w porównaniu do grupy kontrolnej (91,92 U/l), ale wszystkie wartości mieściły się w granicach norm fizjologicznych. Również stężenie AST było statystycznie wyższe w grupach doświadczalnych II (220,75 U/l) i III (230,03 U/l) w stosunku do stężenia tego parametru krwi u osobników z grupy kontrolnej (189,68 U/l). We wszystkich grupach zwierząt określone wartości AST były znacznie niższe niż podane wartości referencyjne. Zawartość gamma-glutamylo-transferazy (GGTP) w surowicy krwi we wszystkich grupach doświadczalnych mieściła się w granicach norm fizjologicznych. Zwierzęta grup doświadczalnych II (13,16 U/l) i III (10,22 U/l) charakteryzowały się wyższym stężeniem lipazy w porównaniu do grupy kontrolnej (4,78 U/l). Jednak wszystkie te wartości były niższe niż dane zawarte w opracowaniach dotyczących wartości referencyjnych. Najwyższe stężenie ά-amylazy odnotowano w grupie doświadczalnej II (1600,75 U/l), a najniższe w grupie kontrolnej (704,42 U/l). Pomiędzy wszystkimi grupami zwierząt odnotowano różnice wysokoistotne odnośnie tego składnika krwi. Trzeba zaznaczyć, że stężenie ά-amylazy w grupie kontrolnej było znacznie poniżej norm fizjologicznych. Tabela 35. Składniki biochemiczne krwi zwierząt doświadczalnych Parametr Wartości refer.1, 2 I - Kontrolna ALT 52 -224 [U/l] AST 457-808 [U/l] GGTP 2,0-6,80 [U/l] Lipaza 20-45 [U/l] ά-amylaza 100[U/l] 1230 91,92A SD 12,50 189,68A SD 27,68 3,93 SD 1,53 4,78A SD 0,35 704,42A SD 38,73 Grupy żywieniowe II - Probiotyk + βIII - Probiotyk + glukan włókno jabłkowe 125,17B 142,18B SD 10,06 SD 15,64 B 220,75 230,03B SD 29,74 SD 31,07 3,71 4,01 SD 1,16 SD 0,89 13,16B 10,22B SD 2,06 SD 1,84 C 1600,75 1337,07 B SD 89,75 SD 68,49 SD – odchylenie standardowe; A, B, C - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) 1 Reference values for laboratory animals. 2010. Research Animal Resources, University of Minnesota. http://www.ahc.umn.edy/rar/refvalues.html 2 Bernardi i wsp., [1996], Coparative Haematology International 165 ALT- aminotransferaza asparaginianowae, AST- aminotransferaza alaninowa, GGTPgamma-glutamylotransferaza, Lipaza, ά –amylaza Według Mátéová i wsp., [2008] zastosowanie dodatku do paszy synbiotyku nie miało wpływu na stężenie ALT oraz AST w surowicy krwi brojlerów. Również dodatek do paszy probiotycznych drożdży Saccharomyces cerevisiae z mannano- oligosacharydami nie wywarło wpływu na zmianę stężenia ALT, AST w surowicy krwi tego samego gatunku zwierząt [Abdel-Raheem i Abd-Allah, 2011]. Wyniki powyższych eksperymentów pozostają w sprzeczności do danych uzyskanych w badaniach własnych. W eksperymencie przeprowadzonym na szczurach przez Yang i wsp., [2005] stwierdzono istotnie wyższą aktywność lipazy u zwierząt otrzymujących w diecie dodatek synbiotyku, podobnie jak w wynikach badań własnych. 5.3.6 Składniki mineralne we krwi u zwierząt doświadczalnych Zastosowanie w paszy dodatku synbiotyków w przypadku szczurów grupy doświadczalnej II oraz III skutkowało istotnie wyższym poziomem wapnia w surowicy krwi u szczurów w porównaniu do szczurów grupy (I) bez dodatków (tabela 36). Wyższe stężenie magnezu w surowicy krwi odnotowano w grupach doświadczalnych II (1,03 mmol/l) i III (1,17 mmol/l) jednak różnic statystycznych w porównaniu do grupy kontrolnej (0,98 mmol/l) nie potwierdzono. Tabela 36. Składniki mineralne we krwi u zwierząt doświadczalnych Parametr Grupy żywieniowe Wart. refer.1 II - Probiotyk + βglukan 2,45b SD 0,13 1,03 SD 0,19 I -Kontrolna Wapń [mmol/l] Magnez [mmol/l] Fosfor nie org. [mmol/l] a 2,152,65 1,001,50 2,10 SD 0,22 0,98 SD 0,10 2,204,50 1,77 SD 0,36 a a 2,04 SD 0,58 SD – odchylenie standardowe; a, b - różnice istotne statystycznie (P≤0,05) 1 Bernardi i wsp., [1996], Coparative Haematology International 166 III - Probiotyk + włókno jabłkowe 2,39b SD 0,11 1,17 SD 0,18 b 2,78 SD 0,89 Wyższe (P≤0,05) stężenie fosforu nieorganicznego stwierdzono u zwierząt w grupie doświadczalnej III (2,78 mmol/l) w porównaniu do grupy kontrolnej I (1,77 mmol/l) i grupy II (2,04 mmol/l). Wyniki eksperymentów przeprowadzonych na brojlerach przez niektórych badaczy [Mátéová i wsp., 2008; Abdel-Raheem i Abd-Allah, 2011] nie wykazują by synbiotyki wpływały na zmianę stężenia Ca i P w surowicy krwi, co pozostaje w sprzeczności do wyników badań własnych. 5.3.7 Długość jelit oraz masa jelit i wątroby zwierząt doświadczalnych W badaniach własnych (tabela 37) dotyczących pomiarów morfometrycznych jelit nie odnotowano zmian dotyczących długości jelita cienkiego w grupach doświadczalnych II (117,14 cm) i III (116,30 cm) w stosunku do grupy kontrolnej zwierząt (113,66 cm). Długość jelita grubego w grupach doświadczalnych II (16,39 cm) oraz III (17,08 cm) była wysokoistotnie wyższa niż w grupie kontrolnej (14,35 cm). Przeciwne wyniki otrzymano po zastosowaniu w paszy dodatku samego probiotyku u szczurów [Dock i wsp., 2004] oraz tylko β-glukanu [Elrayeh i Yildiz, 2011] lub preparatu drożdżowego [Ivković i wsp., 2012] u brojlerów. Podczas analizy dokonanych pomiarów stwierdzono różnice wysokoistotne (P≤0,01) dotyczące masy jelit pomiędzy zwierzętami wszystkich grup doświadczalnych. Najniższą masą jelit charakteryzowała się grupa kontrolna (11,40 g), a najwyższą grupa III (15,28 g). Trzeba wspomnieć, że według Milczarek i wsp., [2012] zastosowanie synbiotyku (probiotyku z β-glukanem) istotnie obniżyło masę przewodu pokarmowego. Natomiast suplementacja paszy włóknem jabłkowym miała istotny wpływ na zwiększenie masy jelit u szczurów [Aprikian i wsp., 2003], analogicznie jak w doświadczeniu własnym, w którym jednym z dodatków również było włókno jabłkowe. W przeprowadzonych badaniach własnych zastosowanie synbiotyku nie miało wpływu na zmianę masy wątroby. Z przeglądu literatury wynika, że synbiotyki zastosowane w dawce pokarmowej mogą wpływać na zwiększenie masy wątroby [Brzóska, 2007], obniżenie [El Banna i wsp., 2010; Awad i wsp., 2009] lub nie zmieniać masy tego narządu [Abdel-Raheem i Abd-Allah, 2011]. 167 Tabela 37. Długość jelit oraz masa jelit i wątroby zwierząt doświadczalnych Parametr Długość jelita cienkiego [cm] Długość jelita grubego [cm] Masa jelit [g] Masa wątroby I - Kontrolna 113,66 SD 3,23 14,35A SD 2,27 11,40A SD 3,76 7,38 SD 1,43 Grupy żywieniowe II - Probiotyk +βglukan 117,14 SD 5,41 16,39B SD 3,38 13,35B SD 2,64 7,88 SD 1,17 III - Probiotyk + włókno jabłkowe 116,30 SD 3,88 17,08B SD 1,85 15,28C SD 3,43 7,62 SD 0,80 SD – odchylenie standardowe; A, B, C - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) 5.3.8 Morfometria ściany jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych Pomiary histomorfometryczne ściany jelita cienkiego wykazały różnice statystyczne (P≤0,01) dotyczące grubości błony śluzowej i mięśniowej pomiędzy wszystkimi grupami zwierząt (tabela 38). Grubość błony śluzowej niższa była u zwierząt grupy II (163,19 µm), a najwyższa w grupie III (248,83 µm). Zmiany w grubości błony śluzowej jelita cienkiego po podaniu w preparatach mleko zastępczych dla prosiąt tego typu dodatków paszowych wykazali także w swych badaniach Kotuni i wsp., [2004]. Grubość błony podśluzowej w grupie zwierząt żywionych paszą z dodatkiem probiotyku z włóknem jabłkowym (61,63 µm) była wysokoistotnie wyższa w porównaniu do szczurów grupy kontrolnej (47,17 µm) oraz grupy II (45,22 µm). Grubość błony mięśniowej była najniższa (P≤0,01) w grupie II (52,47 µm) a najwyższa w grupie III (114,72 µm). Pośrednią wartość tego parametru odnotowano w grupie kontrolnej (80,27µm). Trzeba zaznaczyć, że dodatek synbiotyku w postaci połączenia probiotyku z β-glukanem spowodował wysokoistotne obniżenie grubości błony śluzowej oraz błony mięśniowej zarówno w porównaniu do grupy kontrolnej, jak również do grupy zwierząt, która otrzymywała dodatek probiotyku z włóknem jabłkowym. Długość kosmków jelitowych uległa obniżeniu (P≤0,01) w grupie szczurów otrzymujących w paszy dodatek probiotyku z β-glukanem (147,57 µm) w porównaniu 168 do grupy kontrolnej (208,07 µm). U zwierząt otrzymujących w paszy dodatek probiotyku z włóknem jabłkowym stwierdzono wzrost (P≤0,01) długości kosmków jelitowych (231,72 µm) w stosunku do pozostałych grup szczurów. Z badań Fleige i wsp., [2007] wynika, że po zastosowaniu synbiotyku (Enterococcus faecium z laktozą) w preparatach mlekozastępczych dla cieląt stwierdzono wzrost długości kosmków jelitowych w jelicie czczym oraz obniżenie w jelicie krętym. Natomiast Awad i wsp., [2009] stwierdzili, że synbiotyk dodawany do paszy spowodował wzrost długości kosmków jelitowych w dwunastnicy i jelicie krętym u brojlerów. Głębokość krypt jelitowych w grupach doświadczalnych była wysokoistotnie niższa (II) - 144, 36 µm lub wyższa (III) - 355,22 µm w porównaniu do grupy kontrolnej (I) - 276,49 µm. Wyniki badań własnych dotyczące zastosowania w diecie rozpuszczalnej frakcji włókna pokarmowego są zgodne z doświadczeniem przeprowadzonym na szczurach przez Pirman i wsp., [2007], gdzie zaobserwowano wzrost długości kosmków jelitowych i głębokości krypt jelitowych w jelicie grubym. Wzajemny stosunek wysokości kosmków jelitowych do głębokości krypt jelitowych był wyższy w grupach doświadczalnych, ale różnic statystycznych nie potwierdzono. Tabela 38. Wyniki pomiarów histomorfometrycznych ściany jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych Grupy żywieniowe Parametr 213,60B SD 33,11 47,17A SD 5,49 80,27B SD 16,76 208,07B SD 27,86 276,49B SD 21,19 II - Probiotyk + ßglukan 163,19A SD 21,83 45,22A SD 6,13 52,47A SD 1,95 147,57A SD 12,66 144,36A SD 28,56 III - Probiotyk +włókno jabłkowe 248,83C SD 25,52 61,63B SD 9,69 114,72C SD 22,98 231,72C SD 24,36 355,22 C SD 117,41 0,62 SD 0,98 1,01 SD 0,83 0,63 SD 1,24 I - Kontrolna Grubość błony śluzowej (µm) Grubość błony podśluzowej (µm) Grubość błony mięśniowej (µm) Długość kosmków jelitowych(µm) Głębokość krypt jelitowych(µm) Długość kosmków jelitowych/ Głębokość krypt jelitowych SD – odchylenie standardowe; A, B, C - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) 169 Wybrane elementy komórkowe ściany jelita cienkiego Wyniki analizy wybranych elementów komórkowych ściany jelita cienkiego dotyczące ilości enterocytów, komórek kubkowych, komórek mitozy, plazmocytów oraz komórek Panetha przedstawiono w tabeli 39. Tabela 39. Wybrane elementy komórkowe ściany jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych 48,00A SD 12,80 75,90A SD 14,04 3,25A SD 2,21 Grupy żywieniowe II - Probiotyk + β-glukan 92,50B SD 20,47 81,45B SD 19,05 4,75B SD 4,15 Plazmocyt 0 0 Komórki Panetha 11,63 SD 4,82 0,62A SD 0,09 10,97 SD 4,92 1,02B SD 0,08 Wyszczególnienie Enterocyty Komórki kubkowe Komórki mitozy Enterocyty/ k-ki kubkowe I - Kontrolna III - Probiotyk + włókno jabłkowe 86,30B SD 11,50 112,26C SD 28,17 6,25C SD 4,10 7,00 SD 5,65 11,32 SD 3,56 0,98B SD 0,11 SD – odchylenie standardowe; A, B - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) W ścianie jelita cienkiego zauważono wysokoistotny wzrost ilości enterocytów, które odnotowano u zwierząt w grupach doświadczalnych II (92,50) oraz III (86,30) w stosunku do grupy kontrolnej (48,00). Stwierdzono różnice wysokoistotne pomiędzy liczbą komórek kubkowych w ścianie jelita cienkiego pomiędzy wszystkimi grupami zwierząt. Najwyższą liczbę tych komórek odnotowano w grupie III (112,26), a najniższą w grupie kontrolnej (75,90). Ilość komórek podziału mitotycznego różniła się wysokoistotnie w grupach doświadczalnych II (4,75) oraz III (6,25) w porównaniu do grupy kontrolnej (3,25). Plazmocyty w ścianie jelita cienkiego odnotowano tylko w grupie III. W pozostałych grupach nie zlokalizowano tego typu komórek w preparatach histologicznych. Liczba komórek Panetha w ścianie jelita cienkiego we wszystkich grupach zwierząt była na zbliżonym poziomie i nie różniła się statystycznie. W grupach doświadczalnych zwierząt, które otrzymywały dodatki synbiotyczne (probiotyk z β-glukanem oraz probiotyk z włóknem jabłkowym) stwierdzono (P≤0,01) wzrost proporcji pomiędzy komórkami enterocytów, a komórkami kubkowymi w 170 porównaniu do grupy kontrolnej. Otrzymane wyniki sugerują polepszenie procesu wchłaniania jelitowego na poziomie komórkowym. 5.3.9 Morfometria ściany jelita grubego zwierząt doświadczalnych Grubość błony śluzowej jelita grubego (tabela 40) osobników żywionych paszą zawierającą dodatek probiotyku z β-glukanem (194,70 µm) oraz probiotyku z włóknem jabłkowym (179,71 µm) nie różniła się statystycznie w porównaniu do grupy kontrolnej (172,93 µm). Badania histomorfometryczne ściany jelita grubego wykazały różnice wysokoistotne statystycznie w grubości błony podśluzowej oraz mięśniowej. Grubość błony podśluzowej jelita grubego zwierząt była najniższa w grupie doświadczalnej II (39,41 µm), a najwyższa w grupie doświadczalnej III (72,57 µm). Pomiędzy tymi grupami szczurów odnotowano różnice wysokoistotne odnośnie tego parametru. Najmniejsza grubość błony mięśniowej jelita grubego wystąpiła w grupie szczurów bez dodatków (130,19 µm), a największa w grupie zwierząt otrzymujących dodatek probiotyku z włóknem jabłkowym (197,25 µm). Tabela 40. Pomiary histomorfometryczne ściany jelita grubego zwierząt doświadczalnych Wyszczególnienie Grubość błony śluzowej (цm) Grubość błony podśluzowej (цm) Grubość błony mięśniowej(цm) Głębokość krypt jelitowych Ilość komórek kubkowych I - Kontrolna 172,93 SD 32,71 64,91AB SD 27,22 130,19A SD 23,78 74,39 SD 19,36 106,41A SD 24,48 Grupy żywieniowe II - Probiotyk + ßglukan 194,70 SD 45,70 39,41A SD 2,93 172,70AB SD 25,11 78,54 SD 23,17 141,83B SD 61,59 III - Probiotyk + włókno jabłkowe 179,71 SD 49,10 72,57B SD 23,79 197,25B SD 58,02 57,18 SD 24,84 174,91C SD 60,16 SD – odchylenie standardowe; A, B, C - różnice wysokoistotne statystycznie (P≤0,01) Głębokość krypt jelitowych w grupach doświadczalnych II (78,54 µm) oraz III (57,18 µm) nie różniła się istotnie w stosunku do grupy kontrolnej (74,39 µm). Z badań przeprowadzonych przez Fleige i wsp., [2007] wynika, że po dodaniu do preparatów 171 mlekozastępczych dla cieląt synbiotyku (Enterococcus faecium z laktozą) nastąpiło w jelicie grubym obniżenie głębokość krypt jelitowych w jelicie ślepym. W badaniach własnych stwierdzono również obniżenie głębokości krypt jelitowych przy podawaniu szczurom probiotyku z włóknem jabłkowym choć różnic statystycznych nie wykazano. Średnia ilość komórek kubkowych w ścianie jelita grubego u osobników grup doświadczalnych II (141,83) i III (174,91) różniła się wysokoistotnie w stosunku do grupy kontrolnej (106,41). W dostępnej literaturze brak jest danych dotyczących wpływu synbiotyków na koncentrację komórek kubkowych w jelicie grubym. 172 5.3.10 Obraz histologiczny jelita cienkiego zwierząt doświadczalnych Obraz ten przedstawia struktury charakterystyczne dla narządu prawidłowo funkcjonującego. Ściana jelita cienkiego zwierząt grupy kontrolnej zbudowana jest z wyraźnie oddzielonych od siebie warstw: błony śluzowej, błony podśluzowej i błony mięśniowej. W skład błony śluzowej wchodzi blaszka mięśniowa błony śluzowej, blaszka właściwa błony śluzowej oraz nabłonek. W błonie śluzowej widoczne są prawidłowo rozwinięte kosmki jelitowe, pokryte nabłonkiem jednowarstwowym cylindrycznym z mikrokosmkami oraz gruczoły jelitowe (Ryc.56, Ryc. 60). W blaszce właściwej błony śluzowej zwierząt grupy otrzymującej w paszy dodatek probiotyku z β-glukanem zauważalne są komórki układu immunologicznego (makrofagi i limfocyty) tworzące grudki chłonne. Komórki grudek chłonnych wykazują różną gęstość optyczną jądra i cytoplazmy, co świadczy o prowadzeniu intensywnych procesów związanych z odpowiedzią immunologiczną. Nie stwierdzono obecności plazmocytów i granulocytów. Obraz enterocytów jest prawidłowy. Dobrze rozwinięte i wykształcone są gruczoły jelitowe. W strefie nabłonka powierzchniowego oraz nabłonka gruczołowego obecne są liczne komórki śluzowe. Stwierdzono krótsze kosmki jelitowe i płytsze krypty jelitowe u szczurów otrzymujących paszę suplementowaną probiotykiem z β-glukanem. U tych osobników występuje delaminacja kosmków jelitowych oraz widoczna jest degradacja nabłonka jelit połączona z lokalnym pobudzeniem układu immunologicznego. U tej grupy zwierząt wystąpił najwyższy stosunek długości kosmków do głębokości krypt, co może świadczyć o lepszym wykorzystaniu składników pokarmowych paszy (Ryc. 57, Ryc. 61, Ryc. 62). Błona śluzowa, podśluzowa i mięśniowa jelita cienkiego szczurów otrzymujących w paszy dodatek probiotyku z włóknem jabłkowym jest zauważanie grubsza w porównaniu do szczurów grupy kontrolnej (Ryc. 58, Ryc. 63). Występują grudki chłonne skupione oraz plazmocyty, co świadczy o nadpobudzeniu układu immunologicznego jelit. (Ryc. 59). W grupach doświadczalnych otrzymujących w paszy probiotyk z β-glukanem oraz probiotyk z włóknem jabłkowym zaobserwowano wzrost liczby enterocytów oraz większą liczbę komórek podziału mitotycznego w porównaniu do grupy bez dodatków. 173 b c a b a Rycina 56. Obraz histologiczny jelita cienkiego zwierząt grupy kontrolnej. Błona mięśniowa (a), podśluzowa (b), śluzowa z kosmkami i kryptami jelitowymi (c), HiE. pow.100x Rycina 57. Obraz histologiczny jelita cienkiego zwierząt otrzymujących probiotyk z β-glukanem. Kosmki jelitowe (a), komórki kubkowe (b). HiE. pow.100x c b a b Rycina 58. Obraz histologiczny jelita cienkiego zwierząt otrzymujących probiotyk z włóknem jabłkowym. Plazmocyty (a), makrofagi (b). HiE. pow.100x 174 a Rycina 59. Obraz histologiczny jelita cienkiego zwierząt otrzymujących probiotyk z włóknem jabłkowym. Limfocyty (a), enterocyty (b), gruczoły jelitowe (c). HiE. pow.100x 5.3.11 Obraz jelita cienkiego z mikroskopu elektronowego - skaningowego zwierząt doświadczalnych a Rycina 60. Obraz mikroskopowy jelita cienkiego zwierząt grupy kontrolnej z mikroskopu skaningowego. Szczyty kosmków jelitowych (a). a Rycina 61. Obraz mikroskopowy jelita cienkiego zwierząt otrzymujących probiotyk z β-glukanem z mikroskopu skaningowego. Szczyty kosmków jelitowych (a). 175 a b Rycina 62. Obraz mikroskopowy zwierząt otrzymujących dodatek probiotyku z β-glukanem z mikroskopu skaningowego. Powierzchnia kosmków jelitowych, a na nich komórki złuszczone (a), erytrocyt (b). a Rycina 63. Obraz mikroskopowy jelita cienkiego zwierząt otrzymujących probiotyk z włóknem jabłkowym z mikroskopu skaningowego. Komórki złuszczone (a). 176 5.3.12 Obraz histologiczny jelita grubego zwierząt doświadczalnych W grupie kontrolnej szczurów błona śluzowa jelita grubego wysłana jest nabłonkiem jednowarstwowym walcowym z licznymi komórkami kubkowymi. W nabłonku krypt spotyka się komórki w trakcie podziału mitotycznego, co ma znaczenie dla odnowy nabłonka. W blaszce właściwej błony śluzowej sporadycznie występują pojedyncze grudki limfatyczne z limfocytami i makrofagami oraz granulocyty kwasochłonne (Ryc. 64, Ryc. 68). Krypty jelitowe nie zawierają komórek z ziarnistościami kwasochłonnymi. Błona mięśniowa jelita grubego zbudowana jest podobnie jak w pozostałych odcinkach przewodu pokarmowego, przy czym występują tutaj fałdy okrężne błony śluzowej nie zawierające elementów mięśniowych (Ryc. 65). W grupie doświadczalnej II (probiotyk z β- glukanem) naczynia krwionośne wypełnione są krwią, co świadczy o silnym przekrwieniu oraz występują nacieki umiarkowanego stopnia o charakterze limfocytarnym. Widoczne są pojedyncze komórki tuczne i eozynofile mieszczące się w granicach fizjologicznej normy. Zaobserwowano akumulację komórek o charakterze limfocytarnym w warstwie podśluzowej i śluzowej jelita. Występują pojedyncze limfocyty naciekające przestrzenie między kryptami jelitowymi. Taki obraz jest typowy dla grudek chłonnych rozsianych w obrębie błony śluzowej narządów rurowych. Biorąc pod uwagę fakt dodatkowego przekrwienia, można wysunąć wniosek, że zastosowanie synbiotyku składającego się z probiotyku i β-glukanu wywołało nasilenie odpowiedzi immunologicznej w badanym narządzie (Ryc. 66, Ryc. 69). W grupie doświadczalnej III (probiotyk z włóknem jabłkowym) stwierdzono liczne nacieki plazmocytów oraz komórki kubkowe wypełnione dużą ilością wydzieliny. Zaobserwowano dużą liczbę figur mitotycznych, które mogą świadczyć o pobudzeniu immunologicznym. Stwierdzono również dużą ilość śluzu (agregaty komórek kubkowych), a także sporadycznie spotyka się eozynofile i plazmocyty. Zaobserwowano również bardzo dużą ilość figur mitotycznych odpowiedzialnych za podziały mitotyczne komórek. W jelicie grubym u osobników otrzymujących w paszy probiotyk z włóknem jabłkowym wykazano wzrost ilości komórek kubkowych (Ryc. 67, Ryc. 70, Ryc. 71). 177 a a b Rycina 64. Obraz histologiczny jelita grubego zwierząt grupy kontrolnej. Krypty jelitowe (a), komórki kubkowe (b). HiE. pow. 40x. Rycina 65. Obraz histologiczny jelita grubego zwierząt grupy kontrolnej. Krypty jelitowe (a). HiE. pow. 40x. b a a Rycina 66. Obraz histologiczny jelita grubego zwierząt otrzymujących probiotyk z β-glukanem. Naczynie krwionośne (a). Figury mitotyczne (b). HiE. pow. 40x. 178 Rycina 67. Obraz histologiczny jelita grubego zwierząt otrzymujących probiotyk z włóknem jabłkowym. Krypty jelitowe (a). HiE. pow. 40x. 5.3.11 Obraz jelita grubego z mikroskopu elektronowego - skaningowego (SEM) zwierząt doświadczalnych a Rycina 68. Obraz mikroskopowy jelita grubego zwierząt grupy kontrolnej z mikroskopu skaningowego. Gładka powierzchnia błony surowiczej(a). a Rycina 69. Obraz mikroskopowy jelita grubego zwierząt otrzymujących w paszy probiotyk z β-glukanem z mikroskopu skaningowego. Mikrokosmki jelitowe pokryte śluzem (a). 179 b a Rycina 70. Obraz mikroskopowy jelita grubego zwierząt otrzymujących w paszy probiotyk z włóknem jabłkowym. Mikrokosmki jelitowe (a), śluz (b). a Rycina 71. Obraz mikroskopowy jelita grubego zwierząt otrzymujących w paszy dodatek probiotyku z włóknem jabłkowym. Mikrokosmki jelitowe (a). 180 5.3.14 Obraz histologiczny wątroby zwierząt doświadczalnych Obraz histologiczny wątroby zgodny z opisem podanym w doświadczeniu pierwszym. a b a Rycina 72. Obraz histologiczny wątroby zwierząt grupy kontrolnej. Komórki wątrobowe - hepatocyty (a), triada wątrobowa (b). HiE, pow. 40x. b Rycina 73. Obraz histologiczny wątroby zwierząt otrzymujących w paszy probiotyk z β-glukanem. Komórki wątrobowe - hepatocyty (a), fragment żyły (b). HiE, pow. 10x. b a a Rycina 74. Obraz histologiczny wątroby zwierząt otrzymujących w paszy probiotyk z β-glukanem. Komórki wątrobowe - hepatocyty (a). HiE, pow. 20x. 181 Rycina 75. Obraz histologiczny wątroby zwierząt otrzymujących probiotyk z włóknem jabłkowym. Hepatocyty (a), triada wątrobowa (b). HiE, pow. 20x. 6. WNIOSKI Rezultaty uzyskane w niniejszych badaniach upoważniają do sformułowania następujących wniosków: 1. Zastosowane w doświadczeniach synbiotyki spowodowały wzrost przyrostów masy ciała szczurów. Podobny wynik odnotowano w przypadku stosowania w dawkach pokarmowych oligofruktozy. 2. Synbiotyki zastosowane w badaniach spowodowały niższe zużycie paszy na jednostkę przyrostu. 3. Dodatki doświadczalne podawane w paszy dla szczurów wywarły wzrost białych krwinek we krwi zwierząt. 4. U młodych osobników (Doświadczenie I i II) probiotyki i prebiotyki nie różnicują wskaźników biochemicznych w surowicy krwi. 5. Prebiotyki (inulina i oligofruktoza) oraz synbiotyki zawierające te prebiotyki powodują wzrost długości jelita cienkiego. 6. Wszystkie zastosowane dodatki doświadczalne do paszy dla szczurów wywołały wzrost łącznej masy jelit zwierząt. 7. Trzy z zastosowanych synbiotyków (probiotyk + inulina), probiotyk + oligofruktoza, probiotyk + włókno jabłkowe) spowodowały wzrost grubości błony podśluzowej jelita cienkiego. 8. Prebiotyki (inulina i oligofruktoza) oraz synbiotyki mające w swoim składzie w/w prebiotyki powodują wzrost grubości błony mięśniowej jelita cienkiego. 9. Synbiotyk zawierający w swoim składzie β-glukan powoduje spadek grubości błony śluzowej, mięśniowej oraz obniża długość kosmków jelitowych oraz głębokość krypt jelitowych. 10. Probiotyk podany w dawce pokarmowej zwierząt doświadczalnych wywarł wzrost długości kosmków jelitowych jelita cienkiego. Podobny efekt uzyskano przy stosowaniu w pokarmie dodatku inuliny, oligofruktozy oraz synbiotyków (oprócz probiotyku z β-glukanem). 11. Inulina i oligofruktoza oraz synbiotyki zawierające te prebiotyki powodowały wzrost grubości błony podśluzowej jelita grubego u szczurów. 12. Prebiotyki i synbiotyki wywołały wzrost ilości komórek kubkowych jelita grubego zwierząt doświadczalnych. 182 7. SPIS LITERATURY 1) Abd El-Ghani A. A., 2004: Influence of diet supplementation with yeast culture (Saccharomyces cerevisiae) on performance of Zaraibi goats. Small Ruminant Research, 52, 223-229 2) Abdel-Raheem S. M., Abd-Allah S. M. S., 2011: The Effect of Single or Combined Dietary Supplementation of Mannan Oligosacharide and Probiotics on Performance and Slaughter Characteristics of Broilers. International Journal of Poultry Science, 10, 11, 854-862 3) Abdelrahman M. M., Hunaiti D. A., 2008: The effect of dietary yeast and protected methionine on performanceand trace minerals status of growing Awassi lambs. Livestock Science, 115, 235–241 4) Abel G., Czop J. K., 1992: Stimulation of human monocyte beta-glucan receptors by glucan particles induces production of TNF-alpha and IL-1 beta. International Journal of Immunopharmacology, 14, 8, 1363-73 5) Aboderin F., Oyetayo V., 2006: Haematological studies of rats fed differentn doses of probiotic, Lactobacillus plantarum, isolated from fermenting corn slurry. Pakistan Journal of Nutrition, 5, 2, 102 – 105 6) Abrams S., Griffin I., Hawthorne K., Ellis K., 2007: Effect of prebiotic supplementation and calcium intake on body mass index. Journal of Pediatrics, 151, 3, 293 - 298 7) Adawi D., Ahrné S., Molin G., 2001: Effects of different probiotic strains of Lactobacillus and Bifidobacterium on bacterial translocation and liver injury in an acute liver injury model. International Journal Food Microbiology, 8, 70, 3, 213-20 8) Adawi D., Kasravi F.B., Molin G., Jeppsson B., 1997: Effect of Lactobacillus supplementatation with and without arginine on liver damage and bacterial translocation in an acute liver injury model in the rat. Hepathology, 25, 3, 642-647 9) Al – Kassie G., Al – Juma Y., Jameel Y., 2008: Effect of probiotic (Aspergillus niger) and prebiotic (Taraxacum officinale) on blood picture and biochemical properties of broiler chicks. International Journal of Poultry Science, 7, 12, 1182 – 1184 10) Alkhalf A., Alhaj M., Al – Homidan I., 2010: Influence of probiotic supplementation on blood parameters and growth performance in broiler chickens. Saudi Journal of Biological Science, 17, 219 – 225 11) Allori C., Auguero G., Ruiz H., Nader O., Perdigon G., 2000: Gut mucosa morphology and micrflora changes in malnourished mice after renutrition with milk and administration of Lactobacillus casei. Journal of Food Protection, 63, 83 – 90 183 12) Al-Saiady M. Y., 2010. Effect of probiotic bacteria on immunoglobulin G concentration and other blood components of newborn calves. Journal of Animal and Veterinary Advances, 9, 3, 604-609 13) Alves de Azerêdo G., Stamford T., de Souza E., Veras F., de Almeida E. R., de Araujo J. M., 2010: In vivo assessment of possible probiotic properties of Zymomonas mobilis in Wistar rat model. Electronic Journal of Biotechnology, 13, 2, 1 – 7 14) An B. K., Cho B. L., You S. J., Paik H. D., Chang H. I., Kim S. W., Yun C. W., Kang C.W., 2008: Growth performance and antibody response of broiler chicks fed yeast derived [beta]-glucan and single-strain probiotics. Asian Australian Journal Animal, 21, 1027-1032 15) Taherpour K., Moravej H., Shivazad M., Adibmoradi M., Yakhchali B., 2009: Effects of dietary probiotic, prebiotic and butyric acid glycerides on performance and serum composition on broiler chickens. African Journal of Biotechnology, 8, 10, 2329-2334 16) Mátéová S., Ńály J., Tućková M., Końĉová J.; Nemcová R., Gaálová M., Baranová D., 2008. Effect of probiotics, prebiotics and herb oil on performance and metabolic parameters of broiler chickens. Medycyna Weterynaryjna, 64, 294-297 17) AOAC 1990. Official Methods of Analysis. Association of Official Analytical Chemists, Arlington,Va, 15th Edition 18) Aprikian O., Duclos V., Guyot S., Besson C., Manach C., Bernalier A., Morand C., Rémésy C., Demigné C., 2003: Apple pectin and a polyphenol-rich apple concentrate are more effective together than separately on cecal fermentations and plasma lipids in rats. The Journal of Nutrition, 133,1860-1865 19) Aryana K., J., McGrew P., 2007: Quality attributes of yogurt with Lactobacillus casei and various prebiotics. LWT-Food Science and Technology, 40, 1808–1814 20) Asahara T., Nomoto K., Shimizu K., Watanuki M., Tanaka R., 2001: Increased resistance of mice to Salmonella enterica serovar Typhimurium infection by synbiotic administration of Bifidobacteria and transgalactosylated oligosaccharides. Journal of Applied Microbiology, 91, 6, 985-96 21) Asli M. M., Hosseini S. A., Lotfollahian H., Shariatmadari F., 2007: Effect of probiotics, yeast, vitamin E and vitamin C supplements on performance and immune response of laying hen during high environmental temperature. International Journal of Poultry Science, 6, 12, 895-900 22) Awad W. A., Ghareeb K., Böhm J., 2011: Evaluation of the chicory inulin efficacy on ameliorating the intestinal morphology and modulating the intestinal electrophysiological properties in broiler chickens. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 95, 1, 65-72 23) Awad W. A., Böhm J., Razzazi-Fazeli E., Ghareeb K., Zentek J., 2006: Effect of addition of a probiotic microorganism to broiler diets contaminated with deoxynivalenol on performance and histological alterations of intestinal villi of broiler chickens. Poultry Science, 85, 974-979 184 24) Awad W. A., Ghareeb K., Abdel-Raheem S., Böhm J., 2009: Effects of dietary inclusion of probiotic and synbiotic on growth performance, organ weights, and intestinal histomorphology of broiler chickens. Poultry Science, 88, 49-55 25) Awad, W. A.; Ghareeb, K.; Bo¨hm, J., 2008: Intestinal structure and function of broiler chickens on diets supplemented with a synbiotic containing Enterococcus faecium and oligosaccharides. International Journal of Molecular Science, 9, 2205– 2216 26) Azorín-Ortuño M., Urbán C., Cerón J. J., Tecles F., Allende A., Tomás-Barberán F. A., Espín J. C., 2009: Effect of low inulin doses with different polymerisation degree on lipid metabolism, mineral absorption, and intestinal microbiota in rats with fatsupplemented diet. Food Chemistry, 113, 1058–1065 27) Baba S., Ohta A., Ohtsuki M., Takizawa T., Adachi T, Hara H., 1996: Fructooligosaccharides stimulate the absorption of magnesium from the hindgut in rats. Nutrition Research, 16, 657- 66 28) Babicěk K., Cechová R., Simon R., Harwood M., 2007: Toxicological assessment of a particulate yeast (1,3/1,6)- β-D-glucan in rats. Food and Chemical Toxicology, 45, 1719–1730 29) Bailey J. S., Blankenship L. C., Cox N. A., 1991: Effect of fructooligosaccharide on Salmonella colonization of the chicken intestine. Poultry Science, 70, 2433-2438 30) Bakr H. A., Said E. M., Abd El-Tawab M. M., Hassan M. S., 2009: The impact of probiotic (Biovet®) on some clinical, hematological and biochemical parameters in buffalo-calves. Veterinary Medical Journal, 19, 1, 1-10 31) Barcelo A., Claustre J., Moro F., Chayvialle J. A., Cuber J. C., Plaisancie P., 2000: Mucin secretion is modulated by luminal factors in the isolated vascularly perfused rat colon. Gut, 46, 2, 218–224 32) Bautista-Garfias C. R., Ixta-Rodriguez O., Martinez-Gomez F., Lopez M. G., AguilarFigueroa B. R., 2001: Effect of viable or dead Lactobacillus casei organisms administered orally to mice on resistance against Trichinella spiralis infection. Parasite, 8, 226–228 33) Bednarek D., Szymańska – Czerwińska M., 2008: Wpływ prebiotyków na procesy immunologiczne u zwierząt. Medycyna Weterynaryjna, 64, 3, 262-264 34) Bengmark S., 1998: Ecological control of the gastrointestinal tract. The role of probiotic flora. Gut, 42, 2–7 35) Berleć K., Traczykowski A., 2004: Wpływ wybranych probiotyków na kształtowanie sie makroelementów w surowicy krwi cieląt. Zeszyty Naukowe Akademii Rolniczej we Wrocławiu, 501, 19 – 23 36) Bernardi C., Monetal D., Brughera M., Di Salvo M., Lamparelli D, Mazué G., Iatropoulos M. J., 1996: Haematology and clinical chemistry in rats: Comparison of different blood collection sites. Comparative Haematology International, 6, 3, 160-166 185 37) Beynen A. C., Baas J. C., Hoekemeijer P. E., Kappert H. J., Bakker M. H., Koopman J. P., Lemmens A. G., 2002: Faecal bacterial profile, nitrogen excretion and mineral absorption in healthy dogs fed supplemental oligofructose. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 86, 9, 298-305 38) Bielecka M., Biedzycka E., Majkowska A., Juśkiewicz J., Wróblewska M., 2002: Effect of non - digestible oligosaccharides on gut microecosystem in rats. Food Research International, 35, 139 – 144 39) Bindelle J., Leterme P., Buldgen A., 2008: Nutritional and environmental consequences of dietary fibre in pig nutrition: a review. Biotechnology Agronomic Society Environmental, 12, 1, 69-80 40) Birkedal-Hansen H., 1993: Role of cytokines and inflammatory mediators in tissue destruction. Journal Periodont Research, 28, 500 -510 41) Blottiere H., Cherbut C., Le Blay G., Michel C., 1999: Prolonged intake of fructo – Oligosaccharides Inductes a Short – Term Elevation of Lactic Acid – Producting Bacteria and a Persistent Increase in Cecal Butyrate in Rats. American Society for Nutritional Sciences, 2231 – 2235 42) Bobel B., Sokół J., 2002: Probiotyki w żywieniu tuczników. Trzoda Chlewna, 40, 1, 46 – 48 43) Bolognani F., Rumney C. J., Pool-Zobel B. L., Rowland I. R., 2001: Effect of lactobacilli, bifidobacteria and inulin on the formation of aberrant crypt foci in rats. European Journal of Nutrition, 40, 293–300 44) Bomba A., Nemcová R., Gancarcíková S., Herich R., Guba P., Mudronová D., 2002: Improvement of the probiotic effect of microorganisms by their combination with maltodextrins, fructooligosaccharides and polyunsaturated fatty acids. British Journal of Nutrition, 88, S1, S95 S99 45) Bosscher D., Van Loo J., Franck A., 2005: Inulin and oligofructose as functional ingredients to improve bone mineralization. International Dairy Journal, 16, 10921097 46) Brown G. D., Gordon S., 2001: Immune recognition. A new receptor for beta-glucans. Nature, 6, 413, 36 -7 47) Brown R. C., Kelleher J., Losowsky M. S., 1979: The effect of pectin on the structure and function of the rat small intestine. British Journal of Nutrition, 42, 3, 357–365 48) Brownlee I. A., 2011: The physiological roles of dietry Fibre. Food Hydrocolloids, 25, 238-250 49) Brownlee I. A., Allen A., Pearson J. P., Dettmar P. W., Havler M. E., Atherton M. R., Onsøyen E., 2005: Alginate as a source of dietary fiber. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 45, 6, 497–510 50) Brownlee I. A., Havler M. E., Dettmar P. W., Allen A., Pearson J. P., 2003: Colonic mucus:secretion and turnover in relation to dietary fibre intake. Proceedings of the Nutrition Society, 62, 1, 245–249 186 51) Bruno R., Rutigliano H., Cerri R., Robinson P., Santos J., 2009: Effect of feeding Saccharomyces Cerevisiae on performance of dairy cows during summer heat stress. Animal Feed Science and Technology, 150, 3, 175-186 52) Brzóska F., 2007: Efektywność kwasów organicznych i synbiotyku w żywieniu kurcząt rzeźnych. Medycyna Weterynaryjna, 63, 7, 831–835 53) Brzóska F., Brzybowski R., Stecka K., Pieszka M., 1999: Nutritive efficacy of selected probiotic microorganisms in chicken broilers. Roczniki Nauk Zootechnicznych, 26, 4, 291-301 54) Brzóska F., Buluchevskij S., Stecka K., Śliwiński B., 2007: The effects of lactic acid bacteria and mannan oligosaccharide, with or without fumaric acid, on chicken performance, slaughter yield and digestive tract microflora. Journal of Animal Feed Science, 16, 241–251 55) Brzóska F., Śliwiński B., Stecka K., Wawrzyński M., 2008: Efektywność bakterii probiotycznych, kwasu fumarowego i prebiotyku w żywieniu kurcząt rzeźnych. Roczniki Naukowe Zootechniki, 35, 2, 173-185 56) Buddington K. K., Donahoo J. B., Buddington R. K., 2002: Dietary oligofructose and inulin protect mice from enteric and systemic pathogens and tumor inducers. The Journal of Nutrition, 132, 472–477 57) Budiño F. E .L., Thomaz M.C., Kronka R. N., Nakaghi L. S. O., Tucci F. M., Fraga A. L., Scandolera A. J., Huaynate R. A. R., 2005: Effect of probiotic and prebiotic inclusion in weaned piglet diets on structure and ultra-structure of small intestine. Brazilian Archives of Biology and Technology, 48, 6, 921-929 58) Butler G. M., Giffard R. N., Howard P. M., Stanley G., 2007: Prebiotic and Synbiotic fructooligosaccharides administration fails to reduce the severity of experimental colitis in rats. Diseases Colon and Rectum, 50, 1061-1069 59) Buts J., Keyser N., Raedemaker L., 1994: Saccharomyces boulardii enhances rat intestinal enzyme expression endoluminal release of polyamines. Pediatric Research, 36, 522 – 527 60) Byrne D.V., Thamsborg S. M., Hansen L. L., 2008: A sensory description of boar taint and the effects of crude and dried chicory roots (Cichorum intybus L.) and inulin feeding in male and female pork. Meat Science, 79, 252–269 61) Cani P. D., Delzenne N. M., 2009: The Role of the Gut Microbiota in Energy Metabolism and Metabolic Disease. Current Pharmaceutical Design, 15, 1546-1558 62) Capcarová M. Chmelnicka L., Kolesárová A., Massyni P., Kovacik J., 2010: Effect of Enterococcus faecium M 74 strain on selected blood and production parameters of laying hens. British Poultry Science, 51, 5, 614-620 187 63) Capcarová M., Hasick P., Kolesarova A., Kacaniova M., Mihok M. Pal G., 2011: The effect of selected microbial strains on internal milieu of broiler chickens after peroral administration. Research in Veterinary Science, 91, 132-137 64) Capcarová M., Kolesarovó A., Massanyi P., Kovacik J., 2008: Selected Blood Biochemical and Haematological Parameters in Turkeys after an Experimental Probiotic Enterococcus faecium M – 74 Strain Administration. International Journal of Poultry Science, 7, 12, 1194 – 1199 65) Caspary W. F., 1992: Physiology and pathophysiology of intestinal absorption. The American Journal of Clinical Nutrition, 55, 2995-3085 66) Çelik K., Mutluay M., Uzatici A., 2007: Effect of probiotic and organic acid od performance and organ weights in broiler chicken. Archiva Zootechnica, 10, 51-56 67) Ĉetin N., Guclu B., 2005: The effects of probiotics and mannanooligosaccharide on some haematological parameters in turkey. Journal Veterinary Medicine Physiology Pathology Clinical Medicine, 52, 263 – 267 68) Chae B. J., Lohakare J. D., Moon W. K., Lee S. L., Park Y. H., Hahn T. W., 2006: Effect of supplementation of b-glucan on the growth performance and immuny in broilers. Research in Veterinary Science, 80, 3, 291-298 69) Charalampopoulos D., Rastall R. A., 2012: Prebiotics in foods. Current Opinion in Biotechnology, 3, 2, 187-91 70) Chaucheyras-Durant, F., Durant, H., 2010. Probiotics in animal nutrition and health. Beneficial Microbes, 1, 3-9 71) Chen Y. C., Chen T. C., 2004: Mineral utilization in layers as influenced by dietary oligofructose and inulin. International Journal of Poultry Science, 3, 442–445 72) Chen Y. C., Nakthong C., Chen T. C., 2005: Effect of chicory fructans on egg cholesterol in commercial laying hen. International Journal of Poultry Science, 4, 109114 73) Chen Y. C., Nakthong C., Chen T. C., 2005: Improvement of laying hen performance by dietary prebiotic chicory oligofructose and inulin. International Journal of Poultry Science, 4, 103-108 74) Chen Y. J., Min B. J., Cho J. H., Kwon O. S., Son K. S., Kim H. J., Kim I. H., 2006: Effects of dietary Bacillus-based probiotic on growth performance, nutrients digestibility, blood characteristics and fecal noxious gas content in finishing pigs. Asian-Australian Journal of Animal Science, 19, 4, 587–59 75) Cheng Y. H., Lee D. N., Wen C. M., Weng C. F., 2004: Effects of β-glucan on lymphocyte proliferation, macrophage chemotaxis and specific immune responses broiler. Asian Australian Journal of Animal Science, 17, 1145-1149 188 76) Cherbut C., Michel C., Lecannu G., 2003: The prebiotic characteristics of Fructooligosaccharides are necessary for reduction of TNBS-induced colitis in rats. The Journal of Nutrition, 133, 21–27 77) Chichlowski M., Croom W. J., Edens F. W., Mc Bride B. W., Qiu R., Chiang C. C., Daniel L. R., Havenstein G. B., Koci M. D., 2007: Microarchitecture and spatial relationship between bacteria and ileal, cecal, and colonic epithelium in chicks fed a direct-fed Microbial, PrimaLac and Salinomycin. Poultry Science, 86, 1121–1132 78) Cieślik E, Gębusia A., 2011: Żywność funkcjonalna z dodatkiem fruktanów. Żywność Nauka Technologia Jakość, 2, 27-37 79) Cieślik E. i Topolska K., 2009: Effect of inulin-type fructans on body weight gain and selected biochemical parameters at calcium hypoalimentation in rats. Polish Journal of Food and Nutrition Sciences, 59, 2, 163-168 80) Compton R., Williams D., Browder W., 1996: The beneficial effect of enhanced macrophage function on the healing of bowel anastomoses. American Surgery, 62, 1, 14-20 81) Coudray C, Feillet-Coudray C., Tressol J.C. et al., 2005: Stimulatory effect of inulin on intestinal absorption of calcium and magnesium in rats is modulated by dietary calcium intakes Short- and long-term balance studies. European Journal of Nutrition, 44, 5, 293-302 82) Coudray C., Bellanger, J., Castíglia-Delavaud, C., Vermorel, V., Rayssiguier, Y. 1997: Effect of soluble or partly soluble dietary fibres supplementation on absorption and balance of calcium, magnesium, iron, and zinc in healthy young men. European Journal of Clinical Nutrition, 51, 375–380 83) Cox C. M., Stuard L. H., Kim S., McElroy A.P., Bedford M.R., Dalloul R.A., 2010: Performance and immune responses to dietary beta-glucan in broiler chicks. Poultry Science, 89, 9, 1924-33 84) Cummings J.H., Macfarlane G.T., Englyst H.N., 2001: Prebiotic digestion and fermentation. American Journal of Clinical Nutrition, 73, Supl., 425 - 420S 85) Dalloul R. A., Lillehoj H. S.,Shellem T. A., Doerr J. A., 2003: Enhanced mucosal immunity aganist Eimeria acervulina in broilers fed Lactobacillus – based probiotic. Poultry Science, 82, 62 – 66 86) De Azeredo G., Stamford T., de Souza E., Veras F., Araujo J., 2010: In vivo assessment of possible probiotic properties of Zymomonas mobilis in Wistar rat model. Electronic Journal of Biotechnology, 13, 2, 1 – 7 87) Delaney B., Carlson T., Frazer S., Zheng T., Hess R., Ostergren K., Kierzek K., Haworth J., Knutson N., Junker K., Jonker D., 2003: Evaluation of the toxicity of concentrated barley β-glucan in a 28-day feeding study in Wistar rats. Food and Chemical Toxicology, 41, 477 - 487 189 88) Delgado G. T. C., Tamashiro W. M. D. S. C., Junior M. R. M., Moreno Y. M. F., Pastore G.M., 2011: The putative effects of prebiotics as immunomodulatory agents. Food Research International, 44, 10, 3167–3173 89) Delzenne N. M., Kok N., 1998: Effect of non-digestible fermentable carbohydrates on hepatic fatty acid metabolism. Biochemica Society Transactions, 26, 228-230 90) Delzenne N., Aertssens, J., Verplaetse, H., Roccaro, M., Roberfroid, M., 1995: Effect of fermentable fructo-oligosaccharides on mineral, nitrogen, and energy digestive balance in the rat. Life of Science, 57, 1579–87 91) Delzenne N.M., Kok N.N., 1999: Biochemical basis of oligofructose – inducted hypolipidemia in animal models. The Journal of Nutrition, 129, 3, 1467S -1470S 92) Depta A., 2001. Probiotyki – właściwości i ich rola, i znaczenie oraz możliwości stosowania w profilaktyce i leczeniu schorzeń przewodu pokarmowego u prosiąt. Trzoda chlewna, 39, 7,98–100 93) Devegowda G., Arvind B. R., Morton M. G., 1996: Saccharomyces cerevisiae and mannanooligosacharides to counteract aflatoxicosis in broilers. Proc. Australian Poultry Science Symphosium in Sydney 8, 103–106 94) Dobicki A., Preś J., Zachwieja A., Kwaśnicki R., 2006: Saccharomyces cerevisiae preparations in the feeding of cows and their effect on milk yield and composition as well as rumen microorganisms. Electronic Journal of Polish Agricultural Universities (EJPAU), 9, 4,48 1. Dobicki A., Preś J., 2006: Drożdże piwne w żywieniu cieląt i krów mlecznych. Bydło, 7, 24-27 2. Dobicki A., Preś J., Fuchs B., Łuczak W., 2004: Znaczenie drożdży piwnych w żywieniu bydła i trzody chlewnej. Przegląd hodowlany, 2, 5-10 3. Dobicki A., Preś J., Łuczak W., Szyrner A., 2005: Wpływ dodatku suszonych drożdży piwnych na przyrosty masy ciała, wskaźniki fizjologiczno-biochemiczne krwi i rozwój drobnoustrojów żwacza cieląt. Medycyna Weterynaryjna, 61, 946-949 4. Dobicki A., Preś J., Zachwieja A., Mordak R., Jakus W., 2007: Wpływ preparatów drożdżowych na wybrane parametry biochemiczne krwi i skład mleka krów. Medycyna Weterynaryjna, 63, 8, 955-959 5. Dobrzański Z., Dolińska B., Chojnacka K., Opaliński S., Ryszka F., 2006: Znaczenie drożdży w żywieniu zwierząt gospodarczych. Medicina Veterinaria, 5, 2, 49-66 6. Dock D. B., Aguilar-Nascimento J. E., Latorraca M. Q., 2004: Probiotics enhance the recovery of gut atrophy in experimental malnutrition. Biocell, 28, 2, 143-150 95) Dolezal P., Dolezal J., Trinacty J., 2005: The effect of Saccharomyces cerevisiae on ruminal fermentation in dairy cows. Czech Journal of Animal Science, 50, 11, 503– 510 190 96) Dritz S. S., Shi J., Kielian T. L., Goodband R. D., Nelsen J. L., Tokach M. D., Chengappa M.M., Smith J.E., Blecha F., 1995.: Influence of dietary β-glucan on growth performance, nonspecific immunity, and resistance to Streptococcus suis infection in wealing pigs. Journal of Animal Sciences, 73, 3341-3350 97) Drzymała-Czyż S., Banasiewicz T., Tubacka M., Majewski P., Biczysko M., Kościński T., Drews M., Walkowiak J., 2011: Inulin supplementation in rat model of pouchitis. Acta Biochemica Polonica, 58, 3, 381–384 98) Dziuba M, Tokarska G., 2001: Wybrane zagadnienia z zakresu działania probiotyków. Trzoda Chlewna, 39, 11, 81-83 99) Eicher S. D., Mc Kee C. A., Carroll J. A., Pajor E. A., 2006: Supplemental witamin C yeast cell wall β-glucan as growth enhancers in newborn pigs and as immunomodulators after an endotoxin challenge after wealing. Journal of Animal Sciences, 84, 2352-2360 100) El - Banna H. A., El - Zorba H. Y., Atitta T. A., Abd Elatif A., 2010: Effect of probiotic, prebiotic and synbiotic on broiler performance. World Applied Science, 11, 388–393 101) El-Jakee J., Moussa M., Nada S. A., Mohamed Kh. F., Ashgan M. H., Mohamed M. L., 2010: Influence of Probiotics Mixture on Salmonella typhimurium in Mice. International Journal of Microbiological Research, 1, 2, 50-61 102) Elrayeh A. S., Yildiz G., 2012: Eff ects of inulin and β-glucan supplementation in broiler diets on growth performance, serum cholesterol, intestinal length, and immune system. Turkey Journal Veterinary of Animal Sciences, 36, 4, 388-394 103) Estrada A., Drew M. D., van Kessel A., 2001: Effect of the dietary supplementation of fructooligosaccharides and Bifidobacterium longum to early-weaned pigs on performance and fecal bacterial populations. Canadian Journal of Animal Sciences, 81, 141–148 104) Fåk F., Ahrné S., Linderoth A., Molin G., Jeppsson B., Westrőm B. 2008: Age – related Effects of probiotic bacterium Lactobacillus plantarum 299v on gastroinestinal function in suckling rats. Digestive Diseases and Sciences, 53, 664 – 671 105) FAO/WHO 2002: Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, Report of a Joint FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. London, Ontario, Kanada, 106) Farnworth E. R., Modler H. W., Jones J. D., Cave N., Yamazaki H., Rao A. V., 1992: Feeding Jerusalem artichoke flour rich in fructooligosaccharides to weanling pigs. Canadian Journal of Animal Sciences, 72, 977–980 107) Femia A., Luceri C., Dolara P., Giannini A., Biggeri A., Salvadori M., Clune Y., Collins K., Paglierani M., Caderni G., 2002: Antitumorigenic activity of the prebiotic inulin enriched with oligofructose in combination with the probiotics Lactobacillus rhamnosus and Bifidobacterium lactis on azoxymethaneinduced colon carcinogenesis in rats. Carcinogenesis, 23, 1953–1960 191 108) Fiocchi C., 1998: Inflammatory bowel disease: Etiology and pathogenesis. Gastroenterology, 115, 182 - 205 109) Fiordaliso M., Kok N., Desager J. P., Goethals F., Deboyser D., Roberfroid M., Delzenne N., 1995: Dietary oligofructose lowers triglycerides, phospholipids and cholesterol in serum and very low density lipoproteins in rats. Lipids, 30, 163-167 110) Fleige S., Preißinger W., Meyer H. H. D., Pfaffl M.W., 2007: Effect of lactulose on growth performance and intestinal morphology of pre-ruminant calves using a milk replacer containing Enterococcus faecium. Animal, 1, 367–373 111) Frence J., Kos B., Svetec I., Zgaga Z., Beganović J., Leboń A., Ńuńković J., 2009: Synbiotic effect of Lactobacillus helveticus M92 and prebiotics on the intestinal microflora and immune system of mice. Journal of Dairy Research, 76, 98-104 112) Frias R., Ouwenhand A., Spillmann T., Vankerckhoven V., Hewicker-Trautwein M., Salminen S., Gueimonde M., 2009: Effect of clinical and probiotic Lactobacillus rhamnosus strains on intestinal permeability and bacterial translocation in healthy and colitic rats. Food Research International, 42, 636-640 113) Fuchs B., Frericks J., Szuba-Trznadel A., Ragaller V., Lira R., 2011: Wpływ preparatów złożonych z mannanów i β-D-1-3/1-6-glukanów na wskaźniki produkcyjne i fizjologiczne prosiąt w okresie okołoodsadzeniowym. Zeszyty Naukowe UP we Wrocławiu, Biologia i Hodowla Zwierząt, LXII, 580, 131–141 114) Fuchs B., Preś J., Szuba-Trznadel A., Zawadzki A., 2005: Zastosowanie suszonych drożdży piwnych w żywieniu warchlaków jako substytutu antybiotyku. Acta Scientiarum Polonorum, Zootechnica, 4, 2, 51-58 115) Fuchs B., Rząsa A., Szuba-Trznadel A., Haremza D., 2007: Preparat drożdży piwnych podawany lochom prośnym i karmiącym jako czynnik stymulujący produkcyjności zdrowotność prosiąt. Acta Scientiarum Polonorum, Zootechnica, 6, 4, 17–28 116) Fukata T., Sasai K., Miyamoto T., Baba E., 1999: Inhibitory effects of competitive exclusion and fructooligosaccharide, singly and in combination, on Salmonella colonization of chicks. Journal of Food Protection, 62, 229–233 117) Fukunaga T., Sasaki M., Araki Y., Okamoto T., Yasuoka T., Tsujikawa T., et al., 2003: Effect of soluble fiber pectin on intestinal cell proliferation, fecal short chain fatty acid production and microbial population. Digestion, 67, 42–9 118) Fuller R., 1989: Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology, 66, 5, 365–78 119) Fuller R., 1991: Probiotics in human medicine. Gut, 32, 439-442 120) Fuller R., Gibson G. R., 1997: Modification of the intestinal microflora using probiotics and prebiotics. Scandynawian Journal of Gastroenterology, 32, 28–31 192 121) Galdeano C. M., de Moreno de Le Blanc A., Vinderola G., Bonet M. E., Perdigon G., 2007: Proposed model: mechanisms of immunomodulation induced by probiotic bacteria. Clinical Vaccine Immunology, 14, 485-492 122) Gallaher D. D., Khil, J., 1999: The effect of synbiotics on colon carcinogenesis in rats. The Journal of Nutrition, 129, 1483–1487 123) Gallaher D. D., Stallings W. H., Blessing L. L., Bush, F. F., Brady L. J., 1996: Probiotics, cecal microflora and aberrant crypts in the rat colon. The Journal of Nutrition, 126, 1362-1371 124) Gedek B., 1994: Probiotika. Űbersicht Z. Tierernähr, 1, 134 -140 125) Gedek B., 2001: Erhohter Mytoxin belastung mit Hefenbegegen. Krafifutter,4, 1-2 126) Geier M. S., Butler R. N., Giffard P. M., Howarth G. S., 2007: Lactobacillus fermentum BR11, a potential new probiotic, alleviates symptoms of colitis induced by dextran sulfate sodium (DDS) in rats. International Journal of Food Microbiology,114, 267-274 127) Giang H. H., 2010: Impact of Bacteria and Yeast with Probiotic Properties on Performance, Digestibility, Health Status and Gut Environment of Growing Pigs in Vietnam, Doctoral Thesis Swedish University of Agricultural Sciences Uppsala, Acta Universitatis agriculturae Sueciae 128) Gibson G. R., Roberfroid M. B., 1995: Dietary modulation of the human colonic microbiota. Introducing the concept of prebiotics. The Journal of Nutrition, 125, 1401 -1412 129) Gibson G. R, 2003: Prebiotics. Gastroenterology, 18, 287- 298 Best Practice and Research. Clinical 130) Gibson G. R., Probert H. M., Van Loo J., Rastall R. A., Roberfroid R. B., 2004: Dietary modulation of the human colonic microbiota: updating the concept of prebiotics. Nutrition Research Reviews, 17, 259-275 131) Gibson G. R., Roberfroid M. B., 2008: Editors, Handbook of Prebiotics, CRC Press 2008 132) Simon O., 2010: An interdisciplinary study on the mode of action ofprobiotics in pigs. Journal of Animal and Feed Sciences, 19, 230–243 133) Gill H. S., Shu Q., Lin H., Rutherfurd K. J., Cross M. L., 2001: Protection against translocating Salmonella typhimurium infection in mice by feeding the immuneenhancing probiotic Lactobacillus rhamnosus strain HN.001. Medical Microbiology and Immunology, 190, 97-104 134) Goldin B. R., Gorbach S. L., 1980: Effect of Lactobacillus acidophi-lus dietary supplements on 1, 2-dimethylhydrazine dihydrochloride-induced intestinal cancer in rats. Journal of the National Cancer Institute, 64, 263–265 193 135) González-Tomás L., Bayarri S., Costell E., 2009: Inulin-enriched dairy desserts: Physicochemical and sensory aspects. Journal of Dairy Science, 92, 4188 – 4199 136) Górska S., Jarząb A., Gamian A., 2009: Bakterie probiotyczne w przewodzie pokarmowym człowieka jako czynnik stymulujący układ odpornościowy. Postępy Higieny Medycyny Doświadczalnej, 63, 653-667 137) Gråsten S. M., Pajarib A. M., Liukkonenc K. H., Karppinenc S., Mykkanena H. M., 2002: Fibers with different solubility characteristics alter similarly the metabolic activity if intestinal micro biota in rats fed cereal brans and inulin. Nutrion Research, 22, 1435 – 1444 138) Grela E., 2004: Optymalizacja żywienia świń z wykorzystaniem nowej generacji dodatków paszowych. Prace i Materiały Zootechniczne, 15, 53-63 139) Grela E., Pastuszak J., 2001. Oligosacharydy w żywieniu świń. Trzoda Chlewna, 5, 69 – 72 140) Grela E., Semeniuk V., 2006: Konsekwencje wycofania antybiotykowych stymulatorów wzrostu z żywienia zwierząt. Medycyna Weterynaryjna, 62, 5, 502– 507 141) Grela R., Semeniuk V., 1999. Probiotyki w produkcji zwierzęcej. Medycyna Weterynaryjna, 55, 222 – 228 142) Gujjar S. R., Ahmad M., Javid S. R., 2006: Effect of Biovet and probiotic (BMtechnology) on milk production in lactating bufalloes. The Pakistan Veterinary Journal, 26, 4, 201-203 143) Hadjipanayiotou M., Antoniou I., Photiou A., 1997: Effects of the inclusion of yeast culture on the performance of dairy ewes and goats and the degradation of feedstuffs. Livestock Production Scince, 48, 129-134 144) Haghighi H. R., Gong J., Gyles C. L., Hayes M. A., Sanei B., Parvizi P., GisaviH., Chambers J. R., Sharif S., 2005: Modulation of Antibody-Mediated Immune Response by Probiotics in Chickens. Clinical and Vaccine Immunology, 12, 1387-1392 145) Haghighi H., Gong J., 2006: Probiotic stimulate production of natural antibodies in chickens. Clinical and Vaccine Immunology, 13, 975 – 980 146) Hahn T. W., Lohakare J. D., Lee S. L., Moon W. K., Chae B. J., 2006: Effect of supplementation of b-glucan on growth performance, nutrient digestibility and immunity in weaning pigs. Journal of Animal Science, 84, 1422-1428 147) Hamilton-Miller J. M. T., 2004: Probiotics and prebiotics in the elderly. Postgraduate Medical Journal, 80, 447-451 148) He G., Baidoo S. K., Yang Q., Golz D.,Tungland B., 2002: Evaluation of chicory inulin extracts as feed additive for early-weaned pigs. Journal of Animal Science, 80, Suppl. 1, 81 194 149) Herich R., Revajova V., Levkut M., Bomba A., Nemcova R., Guba P., Gancarcikova S., 2002: The effect of Lactobacillus paracasei and Raftilose P95 upon the nonspecific immune response of piglets. Food Agricultural Immunology, 14, 171-179 150) Hester S. N., Comstock S. S, Thorum S. C, Monaco M. H, Pence B. D, Woods J. A, Donovan S. M., 2012: Intestinal and systemic immune development and response to vaccination are unaffected by dietary (1,3/1,6)-β-D-glucan supplementation in neonatal piglets. Clinical and Vaccine Immunology, 19, 9, 1499-508 151) Hiss S., Sauerwein H., 2003: Influence of dietary b-glucan on growth performance, lymphocyte proliferation, specific immune response and haptoglobin plasma concentration in pigs. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 87, 2-11 152) Holzapfel W. H., Schillinger U., 2002: Introduction to pre and probiotiocs. Food Research International, 35, 109-116 153) Hongtao B., Xiuzhen N., Xiaoyu L., Jeff I., Guihua T., Yifa Z., Jimin Z., 2009: A novel water-soluble β-(1-6)-D-glucan isolated from the fruit bodies of Bulgaria inquinans (Fries). Carbohydrate Research, 344, 1254–1258 154) Houdijk J. G. M., Bosch M. W., Tamminga S., Verstegen M.W.A., Berenpas E.J., Knoop H.,1999: Apparent ileal and total tract nutrient digestion by pigs as affected by dietary non-digestible oligosaccharides. Journal of Anim Science, 77, 148–158 155) Houdijk J., Bosch M., Verstegen M., Berenpas E., 1998: Effects of dietary oligosaccharides on the growth performance and faecal characteristics of young growing pigs. Animal Feed Science and Technology, 71, 35 – 48 156) Hso-Chi Chaung, Tzou-Chi Huang, Jou-Hui Yu, Mei-Li Wu, Wen-Bin Chung, 2009: Immunomodulatory effects of beta-glucan on porcine alveolar macrophages and bone marrow haematopoietic cell-derived dendritic cells. Veterinary Immunology and Immunopathology, 131, 147-157 157) Huang M., Choi Y., Li S., Piao X., Ren J., 2004: Effect of Lactobacilli and acidophilic fungus on the production performance and immune responses in broiler chickens. Poultry Science, 83, 5, 788 – 795 158) Huebner J., Wehling R. L., Hutkins R. W., 2007: Functional activity of commercial prebiotics. International Dairy Journal, 17, 770–775 159) Huff G. R., Farnell M. B., Huff W. E., Rath N. C., Solis F. de los Santos., Donoghue A. M., 2006: Effect of dietary yeast extract on hematological parameters, heterophil function and bacterial clearance in turkey poults challenged with E. coli and subjected to transport. European Symposium on Poultry Nutrition 160) Huff G. R., Huff W. E., Rath N. C., Tellez G., 2006: Limited treatment with β-1,3/ 1,6-glucan improves production values of broiler chickens challenged with Escherichia coli. Poultry Science, 85, 613-618 161) Hunter K. W., Gault R. A., Berner M. D., 2002: Preparation of microparticulate betaglucanfrom Saccharomyces cerevisiae for use in immunepotentiation. Letters in Applied Microbiology, 35, 267–272 195 162) Hunter K. W., Washburn R., 1998: Efficacy of topical antimicrobial acid and immunostimulatory -Glucan in Animal Models of Cutaneous Infection. Applied Research Grant 163) Ichikawa H., Kuroiwa T., Inagaki A., Shineha R., Nishihira T., Satomi S., Sakata T. 1999. Probiotic bacteria stimulate gut epithelial cell proliferation in rat. Digestive Diseases and Sciences, 44, 2119 – 2123 164) Ishida-Fujii K., Sato R., Goto R., Tang X. P., Kuboki H., Hirano S. I., Sato M., 2007: Prevention of pathogenic Escherichia coli infection in mice and stimulation of macrophage activation in rats by an oral administration of probiotic Lactobacillus casei I-5. Biosciences. Biotechnology. Biochemistry. 71, 4, 866-873 165) Isolaurii E., Sütas Y., Kankaanpää P., Arvilommi H., Salminen S., 2001: Probiotics: Effects on immunity. American Journal of Clinical Nutrition, 73, 444S-450S 166) Ivković M., Perić L., Ņikić D., Cvetković D., Glamoćić D., Spring P., 2012: Effects of a novel carbohydrate fraction on broiler performance and intestinal function. South African Journal of Animal Science, 42, 2, 131-138 167) Iyer C., Kosters A., Sethi G., Kunnumakkara A. B., Aggarwal B. B., Versalovic J., 2008: Probiotic Lactobacillus reuteri promotes TNF induced apoptosis in human myeloid leukemia-derived cells by modulation of NF-kappaB and MAPK signalling. Cell Microbiology, 10, 1442-1452 168) Jaehrig S. C., Rohn S., Kroh L. W., Wildenauer F. X., Lisdat F., Fleischer L. G., Kurz T., 2008: Antioxidative effect of (1-3), (1-6)-β-G-glucan from Saccharomyces cerevisiae grown on different media. Food Science and Technology, 41, 868-877 169) Jamas S., Easson D., Ostroff G., 2002: Underivatilized aqueous soluble beta (1,3) glucan, composition and method of making same. U.S. Patent Application 20020032170, 2002, 14, 170) Janik A., Koska M., Paluch U., Pieszka M., Barowicz T., 2006 : Probiotyki w żywieniu prosiąt. Wiadomości Zootechniczne, R. XLIV, 1, 3-9 171) Janik A., Pieszka M., 2008: Znaczenie probiotyków, prebiotyków, zakwaszaczy i ziół w żywieniu prosiąt. Hodowla Trzody Chlewnej, 1, 6-12 172) Janocha A., Milczarek A., Osek M., Turyk Z., 2010: Efektywność bakterii probiotycznych i prebiotyku w zywieniu kurcząt brojlerów. Acta Scientarum Polonorum, Zootechnica, 9, 1, 21–30 173) Jatkauskas J., Vrotniakiene V., 2010: Effects of probiotic dietary supplementation on diarrhoea patterns, faecal microbiota and performance of early weaned calves. Veterinarni Medicina, 55, 494-503 174) Jenkins D. J. A., Kendall C. W. C, Vuksan V., 1999: Inulin, oligofructose and intestinal function. The Journal of Nutrition, 129, 1431S-1433S 196 175) Jensen B. B., 2006:. Prevention of boar taint in pig production. Factors affecting the level of skatole. Acta Veterinaria Scandinavica, 48, S6 176) Jensen M. T., Cox R. P., Jensen B. B., 1995. Microbial production of skatole in the hind gut of pigs given different diets and its relation to skatole deposition in backfat. Animal Sciences, 6, 293–304 177) Jin L. Z., Ho Y. W, Abdullah N, Jalaludin S., 1996:. Influence of dried Bacillus subtilis and lactobacilli cultures on intestinal microflora and performance in broilers. Asian-australas. Journal of Animal Sciences, 9, 397-404 178) Jin L. Z., Y. W. Ho, Abdullah N., Jalaludin S., 1997: Probiotics in poultry: Modes of action. World’s Poultry Science Journal, 53, 352–368 179) Jin L. Z., Y. W. Ho, Abdullah N., Jalaludin S., 2000: Digestive and bacteria enzyme activities in broilers fed diets supplemented with Lactobacillus cultures. Poultry Science, 79, 886–891 180) Jin L. Z., Y. W. Ho, Abdullah N., Jalaludin S., 1998: Growth performance, intestinal microbial populations and serum cholesterol of broilers fed diets containing Lactobacillus cultures. Poultry Science, 77, 259–1265 181) Jin L., Ho Y., Abdullah N., Ali M., Jalaludin S., 1998: Effects of adherent Lactobacillus cultures on growth, weight of organs and intestinal microflora and volatile fatty acids in broilers. Animal Feed Science Technology, 70, 197 – 209 182) Jonker D., Hasselwander O., Tervilä-Wilo A., Tenning P. P., 2009: 28day oral toxicity study in rats with high purity β-glucan (Glucagel). Food and Chemical Toxicology, 48, 422–428 183) Józefiak D., Kaczmarek M., Rutkowski A., 2008: A note on the effects of selected prebiotics on the performance and ileal microbiota of broiler chickens. Journal of Animal and Feed Science, 17, 392–397 184) Józefiak D., Krejpcio Z., Trojanowska K., Wójciak R.W., Tubacka M., 2005: Effect of dietary inulin on microbial ecosystem and concentrations of volatile fatty acids in rat’s caecum. Journal of Animal and Feed Science, 14, 171-178 185) Jurgens M. H., Rikabi R. A., Zimmerman D. R., 1997: The effect of dietary active dry yeast supplement on perfor of sows during gestation-lactation and their pigs. Journal of Animal and Feed Science,75, 3, 593-7 186) Jurgoński A., Juskiewicz J., Zduńczyk Z., 2008: Compartive effect of dietary levels of celulose and fructooligosaccharides on fermentative in the cecum of rats. Journal of Animal and Feed Science, 17, 88- 99 187) Juśkiewicz J., Jankowski J., Zduńczyk Z., Mikulski D., 2006: Performance and gastrointestinal tract metabolism of turkeys fed diets with different contents of fructooligosaccharides. Poultry Science, 85, 886-891 197 188) Juśkiewicz J., Semaskaite A., Zduńczyk Z., Wróblewska M., Gruņauskas R., Juśkiewicz M., 2007: Minor effect of the dietary combination of probiotic Pediococcus acidilactici with fructooligosaccharides or polysaccharidases on beneficial changes in the cecum of rats. Nutrition Research, 27, 133–139 189) Juśkiewicz J., Wróblewska M., Jarosławska J., Baliński P., Matuseviĉius P., Zduńczyk P., Biedrzycka E., Zduńczyk Z., 2009: 1 Effects of inulin supplemented to cellulose-free or cellulose-rich diets on caecal environment and biochemical blood parameters in rats. Journal of Animal and Feed Sciences, 18, 709–722 190) Juśkiewicz J., Zduńczyk Z., 2004: Effects of cellulose, carboxymethylocellulose and inulin fed to rats as single supplements or in combination on their caecal parameters. Compparative Biochemistry and Physiology – Part A, Molecilar and integrative physiology,139, 4, 513–519 191) Juśkiewicz J., Zduńczyk Z., Jankowski J., Król B., 2002: Caecal metabolism in young turkey fed diets supplemented with oligosaccharides. Archive Geflugelkunde, 66, 206-210 192) Juśkiewicz J., Zduńczyk Z., Wróblewska M., 2005: The effect of the administration of cellulose and fructans with different degree of polymerization to rats on cecal fermentation and biochemical indicators in the serum. Czech Journal of Animal Science, 50, 273–280 193) Ju-Woon Lee M., Eui-Hong Byun K., Nak-Yun Sung N., Hanumantha R., Balaji Raghavendran N., Eui-Baek Byun M., Jae-Hun Kim Z., Jong-il Choi, Myung-Gon S., Myung-Woo B., 2009: Effect of gamma irradiation on the efficacy of β-glucan against acetaminophen inducted toxicity in mice. Chemico-Biological Interaction, 180, 98-105 194) Kabir S., Rahman M., Hosain M., Akand M., 2005: Viability of probiotics in balancing intestinal flora and effecting histological changes of crop and caecal tissues of broilers. Biotechnology, 4, 4, 325 – 330 195) Kam L., Pizarro T., Cominelli F., 1995: Cytokines and chemokines in inflammatory bowel disease. Current Opinion in Gastroenterology, 11, 305-309 196) Kamalzadeh A., Hosseini A., Mordai S., 2009: Effect of Yeast Glucomannan on performance of broiler chickens. International Journal of Agruculture and Biology, 11, 1, 49-53 197) Kapka-Skrzypczak L., Niedźwiecka J., Wojtyła A., Kruszewski M., 2012: Probiotyki i prebiotyki jako aktywny składnik żywności funkcjonalnej. Pediatric Endocrinology, Diabetes and Metabolism, 18, 2, 79-83 198) Karczmarewicz E., Skorupa E., Lorenc R. S., 2002: Wpływ probiotyków i prebiotyków na gospodarkĘ wapniowo-fosforanową i metabolizm kostny. Pediatria Współczesna. Gastroenterologia, Hepatologia i Żywienie Dziecka, 4, 1, 63-69 199) Kaur N., Gupta H., 2002: Applications of inulin and oligofructose in health and nutrition. Journal of Bioscience, 27, 703–714 198 200) Kenny M., Smidt H., Mengheri E., Miller B., 2011: Probiotics – do they have a role in the pig industry? Animal, 5, 3,462–470 201) Kinal S., Korniewicz A., Rząsa A., Korniewicz D., Białoń K., Lubojemska B., 2007: Effect of Saccharomyces cerevisiae yeast metabolites on colostrum quality and passive immunity transfer in calves. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy, 51, 1, 97-103 202) Kirat D., Kondo K., Shimada R., Kato S., 2009: Dietary pectin up-regulates monocaboxylate transporter1 in the rat gastrointestinal tract. Experimental Physiology, 94, 4, 422–433 203) Kivelä R. L., Nystrőm L., Salovaara N. H., Sontag-Strohm T., 2009: Role of oxidative cleavage and acid hydrolysis of oat beta-glucan in modeled beverage conditions. Journal of Cereal Science, 50, 2, 190-197 204) Kjos N. P., Øverland M., Fauske A. K., Sørum H., 2010: Feeding chicory inulin to entire male pigs during the last period before slaughter reduces skatole in digesta and backfat. Livestock Science, 134, 143–145 205) Kleessen B., Hartmann L., Blaut M., 2001: Oligofructose and long-chain inulin: influence on the gut microbial ecology of rats associated with a human faecal flora. British Journal of Nutrition, 86, 2, 291–300 206) Kleessen B., Hartmann L., Blaut M., 2003: Fructans in the diet cause alterations of intestinal mucosal architecture, released mucins and mucosa-associated bifidobacteria in gnotobiotic rats. British Journal of Nutrition, 89, 5, 597-606 207) Kłobukowski J., Modzelewska-Kapituła M., Kornacki K., 2009:Calcium bioavailability from diets based on white chees containing probiotiocs or synbiotics in short-time study in rats. Pakistan Journal of Nutrition, 8, 7, 933-936 208) Koenen M. E., J. Karmer, R. van der Hulst, L. Heres, S.H. Jeurissen and W.J. Boersma, 2004. Immunomodulation by probiotic lactobacilli in layer and meat-type chickens. British Poultry Science, 45, 355-366 209) Kok N., Roberfroid M., Delzenne N., 1998: Systemic effects of nondigestible fructoooligosaccharides in rats. W: Functional properties of non-digestible carbohydrates, INRA, Nantes, 123-125 210) Kopeć A., Cieślik E., 2005: The effect of fructans on glucose level in experimental rats. Polish Journal of Nutrition, 14, 55, 207–210 211) Korniewicz A., Kinal S., Karniewicz D., Białoñ K., 2005: Wpływ dodatku paszowego Diamond VXP yeast culture na produkcję i skład mleka krów. Acta Scientarum Polonorum. Zootechnica, 4, 81-94 212) Krejpcio Z., Wójciak R., Staniek H., Wiśniewska J., 2009: Wpływ suplementacji diety fruktanami typu inuliny i chromem III na wskaźniki gospodarki magnezem u szczura. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość. 4, 65, 175-182 199 213) Kritas S. K., Morrison R. B., 2004: Can probiotics substitute for subtherapeutic antibiotics? A field evaluation in a large pig nursery. Proceedings of the 18th IPVS Congress, Hamburg, Germany, 2 214) Król B., 2011: Effect of mannanooligosaccharides, inulin and yeast nucleotides added to calf milkreplacers on rumen microflora, level of serum immunoglobulin and health condition of calves. Electronic Journal of Polish Agricultural Universities (EJPAU) 14, 2. http://www.ejpau.media.pl/volume14/issue2/abs-18.html 215) Kruger M. C., Brown K. E., Collett G., Layton L., Schollum L. M., 2003: The effect of fructooligosaccharides with various degrees of polymerization on calcium bioavailability in the growing rat. Experimental Biology and Medicine, 228, 6, 683– 688 216) Kubik C., Piasecka K., Anyszka A., Bielecki S., 2006: Polifruktany i fruktooligosacharydy (FOS) – występowanie, otrzymywanie i zastosowanie. Biotechnologia, 2, 73, 103–116 217) Kuczaj M., Dobicki A., Preś J., Zachwieja A., Jakus W., 2010: An influence of driedbrewer’s yeast (Saccharomyces cerevisiae) addition before and after calving on yield and chemical composition of milk and biochemical indices of blod in the first 100 days of lactation. Electronic Journal of Polish Agricultural Universities (EJPAU) 13, 3. http://www.ejpau.media.pl/volume13/issue3/abs-12.html 218) Kwiatkowski T., Szyszkowska A., Pres J., 1985: LBC bacterial preparation in the prophylaxis of diarrhoea in calves. Roczniki Naukowe Zootechniki. Monografie i Rozprawy, 23, 75-81 219) Lachowski W., 2000: Wyniki zastosowania preparatu drożdżowego YEA-SACC 1026 w żywieniu owiec. Folia Universitatis Agriculturae Stentinensis. Zootechnica, 210, 39, 91-98 220) Laparra R., Glahn R., Miller D., 2008: Effect of inulin and probiotic bacteria on iron availability in beans (Phaseolus vulgaris L.). Proceedings of the Nutrition Society, 6772 221) Lara-Villosladaa F., Debrasb E., Nietoc A., Conchad A., Ga´lveze J., Lo´pezHuertasa E., Bozaa J., Obledb C., Xaus J., 2006: Oligosaccharides isolated from goat milk reduce intestinal inflammation in a rat model of dextran sodium sulfate-induced colitis. Clinical Nutrition, 25, 477–488 222) Lasek W. Gołąb J., Jakubisiak M., Lasek W., Stokłosa T., 2008: Immunologia. Wydawnictwo Naukowe PWN,Warszawa, 343–375 223) Lasek W., 2002: Tkanka limfatyczna związana z błoną sluzową jelita. Gastroenterologia Polska, 9, 2, 139-145 224) Laudanno O. M., Cesolari J. A., Godoy A., Sutich E., Sorangone S., Catalano J., San Miguel P., 2008: Bioflora probiotic in immunomodulation and prophylaxis of intestinal bacterial translocation in rats. Digestive Diseases and Sciences, 53, 26672670 200 225) Le Leu R.K., Brown I.B., Hu Y., Bird A.R., Jackson M., Esterman A., Young G.P., 2005. A synbiotic combination of resistant starch and Bifidobacterium lactis facilitates apoptotic deletion of carcinogen-damaged cells in rat colon. The Journal of Nutrition. 135, 996–1001 226) Lee N. K., Park J. S., Park E., Paik H. D., 2007: Adherence and anticarcinogenic effects of Bacillus polyfermenticus SCD in the large intestine. Letters in Applied Microbiology, 44, 3, 274-278 227) Lee S., Lillehoj H. S., Dalloul R. A., Park D. W., Hong Y. H., Lin J. J., 2007: Influence of Pediococcus-based probiotic on coccidiosis in broliler chickens. Poultry Science, 86, 63-66 228) Lehloenya K. V., Stein D. R., Allen D. T., Selk G. E., Jones D. A., Aleman M. M., Rehberger T. G., Mertz K. J., Spicer L. J., 2008: Effects of feeding yeast and propionibacteria to dairy cows on milk yield and components, and reproduction. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 92, 2, 190-202 229) Levrat A. M., Rémésy C., Demigné C., 1991: High propionic acid fermentation, and mineral accumulation in the cecum of rats adapted to different levels of inulin. The Journal of Nutrition, 121, 1730–1737 230) Levrat M A, Remesy C., Demigne C., 1993: Influence of inulin on urea and ammonia in the rat caecum: consequences on nitrogen excretion. Journal of Nutritional Biochemistry, 4 351–356 231) Li J., Li D. F., Xing J. J., Cheng Z. B., Lai C. H., 2006. Effects of β-glucan extracted from Saccharomyces cerevisiae on growth performance, and immunological and somatotropic responses of pigs challenged with Escherichia coli lipopolysaccharide. Journal of Animal Science, 84, 2374–2381 232) Li J., Xing J., Li D., Wang X., Zahao L., Lu S., Huang D., 2005: Effects of β-glucan extracted from Saccharomyces cerevisae on humoral and cellular immunity in weaned pig. Archives of Animal Nutrition, 59, 5, 303-312 233) Li X., Qiang L., Liu Xu G.H., 2008: Effects of supplementation of fructooligosaccharide and/or Bacillus subtilis to diets on performance and on intestinal microflora in broilers. Archive fur Tierzucht, 51, 64-70 234) Li Z., Yang S., Lin H., Huang J., Watkins P. A., Moser A. B., Desimone C., Song X. Y., Diehl A. M., 2003: Probiotics and antibodies to TNF inhibit inflammatory actvity and improve nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology, 37,343–350 235) Libao-Mercado A. J., Yin Y., van Eys J., de Lange C. F. M. 2006: True ileal amino acid digestibility and endogenous ilealamino acid losses in growing pigs fed wheat shorts- or casein-based diets. Journal of Animal Science, 84, 6, 1351–1361 236) Libudzisz Z., 2002: Probiotyki i prebiotyki w fermentowanych napojach mlecznych. Pediatria Współczesna. Gastroenterologia, Hepatologia i Żywienie Dziecka, 4, 1,19-25 201 237) Libudzisz Z., 2008: Mikroflora jelitowa, rola probiotyków w żywieniu. Żywność dla zdrowia, 8, 3-4 238) Lilly D.M., Stillwell R.H., 1965: Probiotics: Growth promoting factors produced by microorganisms. Science, 147, 747-748 239) Linge P., 2005: The use of probiotics and yeast derivatives in India. World Poultry, 21, 10, 12-15 240) Liong M. T, Shah N. P., 2006: Effects of a Lactobacillus casei Synbiotic on Serum Lipoprotein, Intestinal Microflora, and Organic Acids in Rats. Journal of Dairy Science, 89,1390 – 1399 241) Liong M. T., Shah N. P., 2005: Optimization of Cholesterol Removal by Probiotics in the Presence of Prebiotics by Using a Response Surface Method.Applied nad Environmental Microbiology, 71, 4, 1745 - 1753 242) Liong M. T., Shah N. P., 2007: Sorbitol, maltodextrin, inulin and Bifidobacterium infantis modify serum lipid profiles, intestinal microbial population and organic acids concentration in rats. International Journal od Probiotic and Prebiotic, 1, 121-130 243) Lipiński K., 2007: Znaczenie dodatków prebiotycznych w żywieniu prosiąt. Trzoda chlewna, 11, 71 – 74 244) Lobo A. R., Fihlo J. M., Alvares E. P., Cocato M. L., Colli C., 2009. Effects of dietary lipid compositionand inulin – type fructans on mineral availability on growing rats. Nutrition, 25, 2, 216 – 225 245) Lodemann U., Hubener K., Jansen N., Martens H., 2006: Effect of Enterococcus faecium NCIMB 10415 as probiotic supplement on intestinal transport andbarrier function of piglets. Animal Nutrition, 60, 35-48 246) Loh G., Eberhard M., Brunner R. M., Hennig U., Kuhla S., Kleessen B., Metges C. C., 2006: Inulin alters the intestinal microbiota and short-chain fatty acidconcentrations in growing pigs regardless of their basal diet. The Journal of Nutrition, 136, 1198 - 1202 247) Lomax A. R., Calder P. C., 2008: Prebiotics, immune function, infection and inflammation: a review of the evidence. British Journal of Nutrition, 1-26 248) Lopez G., Ross G., Perez-Conesa D., 2007: Effect of probiotics, prebiotics and synbiotics follow-up infant formulas on large intestine morphology and bone mineralization in rats. Food Science and Technology International, 13, 1, 69 – 77 249) Lopez H.W., Coudray C., Levrat-Verny M.A., Feillet-Coudray C., Demigné C., Rémésy C., 2000: Fructooligosaccharides enhance mineral apparent absorption and counteract the deleterious effects of phytic acid on mineral homeostasis in rats. Journal of Nutritional Biochemistry, 11, 500-508 250) López-Molina D., Navarro-Martínez M. D., Rojas-Melgarejo F. R., Hiner A. N. P., Chazarra S., Rodríguez-López J. N., 2005: Molecular properties and prebiotic effect of inulin obtained from artichoke (Cynara scolymus L.). Phytochemistry, 66, 1476–1484 202 251) Lupton J. R., Kurtz P. P., 1993: Relationship of colonic luminal short-chain fatty acids and pH to in vivo cell proliferation in rats. The Journal of Nutrition, 123, 1522– 1530 252) Lutgendorff F., Nijmeijer R.M., Sandstro¨m P. A., Trulsson L. M., Magnusson K. E., Timmerman H. M., van Minnen L. M., Rijkers G. T., Gooszen H. G., Akkermans L. M. A., SÖderholm J. D., 2009: Probiotics Prevent Intestinal Barrier Dysfunction in Acute Pancreatitis in Rats via Induction of Ileal Mucosal Glutathione Biosynthesis. Public Library of Science, 4, 2, 1-13 253) Lynch M. B., Sweeney T., Callan J. J., Flynn B., O’Doherty J. V., 2007: The effect of high and low dietary crude protein and inulin supplementation on nutrient digestibility, nitrogen excretion, intestinal microflora and manure ammonia emissions from finisher pigs. Animal Nutrition, 1, 1112-1121 254) Macfarlane, G. T., Steed, H., and Macfarlane, S., 2008: Bacterial metabolism and health-related effects of galacto-oligosaccharides and other prebiotics. Journal of Applied Microbiolpgy, 104, 305-344 255) Mahdavi A. H., Rahmani H. R., Pourreza J., 2005: Effect of probiotic supplements on egg quality and laying hens performance. International Journal of Poultry Science, 4, 4, 488- 492 256) Maia O., Duarte R., Silva A. 2001. Evaluation of the components of commercial probiotic in gnotobiotic mice experimentally challenged with Salmonella enterica subsp. Enterica ser. Typhimurium. Veterinary Microbiology, 79, 2, 183 – 189 257) Maitin V., Rastall R., 2002: Pebiotics and synbiotics: toward the next generation. Cur. Opinion in Biotechnol, 13, 490-96 258) Mangel P., Lennhernas P., Wang M., Olsson C., Ahrne S., Molin G., Thorlacius H., Jeppsson B., 2006: Adhesive capability of Lactobacillus plantarum 299v is important for preventing bacterial translocation in endotoxemic rats. Acta Pathologica, Microbiologica et Immunologica Scandinavica, 114, 611-618 259) Manoj K.B., Devegowda G., 2001: Use of esterified glucomannan to reduce the effects of T-2 toxin in laying hens. Proc. World Mycotoxin Forum, 14-15 May Noordwijk, Holland. p. 71 260) Mantovani M. S., Bellini M. F., Angeli J. P., Oliveira R. J., Silva A. F., Ribeiro L. R., 2008: B-glucans in promoting heath: Prevention against mutation and cancer. Mutation Research, 658, 154-161 261) Marco M. L., Pavan S., Kleerebezem M., 2006: Towards understanding molecular modes of probiotic action. Current Opinion in Biotechnology, 17, 204–10 . 262) Marinho M. C., Pinho M. A., Mascarenhas R. D., Silva F. C., Lordelo M. M., Cunha L. F., Freire J. P. M., 2007: Effect of prebiotic or probiotic supplementation and ileo rectal anastomosis on intestinal morphology of weaned piglets. Livestock Science, 108, 240–243 203 263) Marinho M. C., Lordelo M. M., Cunha L. F., Freire J. P. B., 2007: Microbial activity In the gut of piglets: I. Effect of prebiotic and probiotic supplementation. Livestock Science, 108, 236-239 264) Mańek T., Mikulec Ņ., Valpotić H., Antuna N., Mikulec N., Stojević Z., Filipović N., Pahović S., 2008: Influence of Live Yeast Culture (Saccharomyces cerevisiae) on Milk Production and Composition, and Blood Biochemistry of Grazing Dairy Ewes during the Milking Perio. Acta Veterinaria. Brno, 77, 547-554 265) Mańek T., Mikulec Ņ., Valpotić H., Kuńće L., Mikulec N., Antunac N., 2008: The influence of live yeast cells (Saccharomyces cerevisiae) on the performance of grazing dairy sheep in late lactation. Veterinarski Arhives., 78, 2, 95-104 266) Masuda Y., Munechika I., Miyata A., Mizuno S., Nanba H., 2009: Maitake β-glucan enhances therapeutic effect and reduces myelosupression and nephrotoxicity of cisplatin in mice. International Immunopharmacology, 9, 620–626 267) McBain A.J., MacFarlane G.T., 2001: Modulation of genotoxic enzyme activities by non-digestible oligosaccharide metabolism in in-vitro human gut bacterial ecosystems. Journal of Medicine Microbiology, 50, 9, 833-842 268) McCullough J.S., Ratcliffe B., Mandir N., Carr K.E., Goodlad R.A. 1998. Dietary fibre and intestinal microflora: Effects on intestinal morphometry and crypt branching. Gut, 42, 6, 799–806 269) Medici M., Vinderola C., Perdigon G. 2004. Gut mucosal immunomodulation by probiotic fresh chees. International Dairy Journal, 14, 7, 611 – 618 270) Miecznikow E., 1907: O naturze ludzkiej - Zarys filozofii optymistycznej (tłumaczenie F. Wermiński). Wyd. Biblioteka Naukowa, Warszawa 271) Mikkelsen L. L., Bach Knudsen K. E., Jensen B., B., 2004: In vitro fermentation of fructo-oligosaccharides and trans-galactooligosaccharides by adapted and unadapted bacterial populations from the gastrointestinal tract of piglets. Anim Feed Science and Technology, 116, 225–238 272) Mikkelsen L. L., Jensen B.B., 2004: Effect of fructo-oligosaccharides and transgalacto-oligosaccharides on microbial populations and microbial activities in the gastrointestinal tract of piglets post-weaning. Anim Feed Science and Technology,117,107–19 273) Mikołajczak J., Jarzynowska A., El-Essa 2004: Wpływ preparatu probiotycznego na tempo wzrostu i stan zdrowotny prosiąt. Roczniki Naukowe Zootechniki, Supl., 20, 115-119 274) Mikulski D., Kozłowski K., Jankowski J., Blok J., Sobolewski Z., 2008: Efektywność odchowu indyków żywionych paszą z dodatkiem ekstraktu z drożdży Saccharomyces cerevisiae. Medycyna Weterynaryjna, 64, 11, 1331 – 1334 204 275) Milczarek A., Osek M., Olkowski B., Klocek B., 2012: Wpływ dodatku probiotyku, prebiotyku lub synbiotyku na masę i pH przewodu pokarmowego kurcząt brojlerówżywionych dietami z udziałem różnych zbóż. Roczniki Naukowe Zootechniki, 39, 1, 119–128 276) Milewski S., 2009: Wpływ preparatów z Saccharomyces cerevisiae na cechy użytkowości mięsnej oraz wskaźniki hematologiczne jagniąt ssących. Medycyna Weterynaryjna, 65, 1, 51-54 277) Milewski S., Wójcik R., Małaczewska J., Trapkowska S., Siwicki A., 2007: Wpływ b-1,3/1,6-D-glukanu na cechy użytkowości mięsnej oraz nieswoiste humoralne mechanizmy obronne jagniąt. Medycyna Weterynaryjna, 63, 360 -363 278) Min B. J., Kwon O. S., Son K. S., Cho J. H., Lee W. B., Kim J. H., Park B. C., Kim I. H., 2004: The effect of Bacillus and active yeast complex supplementation on the performance, fecal Bacillus counts and ammonia nitrogen concentrations in weaned pigs. Journal of Animal Science, 82, (Suppl. 1), 26 279) Modesto M., D'Aimmo R., Ilaria S., Paolo T., De Filippi S., Casini L., Mazzoni M., Bosi P., Biavati B., 2009: A novel strategy to select Bifidobacterium strain and prebiotic as natural growth promoters in newly weaned pigs. Livestock Science, 122, 248-253 280) Mogilner J. G., Srugo I., Lurie M., Shaoul R., Coran A G., Shiloni E., Sukhotnik I., 2007: Effect of probiotics on intestinal regrowth and bacterial translocation after massive small bowel resection in a rat. Journal of Pediatric Surgery, 42, 8, 1365-1371 281) Mohnl M., Acosta Y., Aragon A. Acosta Ojeda, Rodriguez Sanchez B., Pasteiner S., 2007: Effect of symbiotic feed additives in comparism to antibiotic growth promoter on performance and health status of broilers. Poultry Science, 86, Suppl. 1,217 282) Mokrzycka A., Michałowski P., 2001: Rola i znaczenie probiotyków w żywieniu trzody chlewnej. Trzoda Chlewna, 39, 6, 90 – 92 283) Mølbak L., Thomsen L. E., Jensen T. K.,Knudsen K. E. B., Boye M., 2007: Increased amount of Bifidobacterium thermacidophilum and Megasphaera elsdenii in the colonic microbiota of pigs fed a swine dysentery preventive diet containing chicory roots and sweet lupine. Journal of Applied Microbiology, 103, 1853–1867 284) Morales-Lopez R., Auclair E., Garcia F., Esteve-Garcia E., Brufau J., 2009: Use of yeast cell walls; 1,3/1,6-glucans and mannoproteins in broiler. Poultry Science, 88, 601-607 285) Mordak R., Zachwieja A., Preś J., Dobicki A., Jakus W., 2008: Wpływ dodatku drożdży piwnych w diecie na stan zdrowia krów w aspekcie obserwacji klinicznych. Materiały Międzynarodowej Konferencji Nauk. „Problemy w rozrodzie i hodowli bydła mięsnego” Polanica Zdrój 27-28 06, 128 – 131 286) Mosenthin R., Sauer W. C., Ahrens F. 1994. Dietary pectin’s effect on ileal and fecal amino acid digestibility and exocrine pancreatic secretion in growing pigs. The Journal of Nutrition 124, 8, 1222–1229 205 287) Mountzouris K. C., Xypoleas I., Kouseris I., Fegeros K., 2006: Nutrient digestibility, faecal physicochemical characteristics and bacterial glycolytic activity of growing pigs fed a diet supplemented with oligofructose or trans-galactooligosaccharides. Livestock Science, 105, 168–175 288) Mussatto S. I., Aguilar C. N., Rodrigues L. R., Teixiera J. A., 2009: Fructooligosaccharides and β-fructofuranosidase production by Aspergillus japonicas immobilized on lignocellulosic materials. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 59, 76-81 289) Nara L., Horst M., Marques R., Dietsel C., Matzke B., Caetano C., Simoes F., Andrade A., Labao W., Vaz L., Portela M., Braga J., Melo P. 2009: Effects of Probiotic supplementation on markers of acute pancreatitis in rats. Current Therapeutic Research, 70, 2, 137 – 148 290) Nemcova´ R., Bomba A., Gancarcˇikova´ S., Herich R., Guba P., 1999: Study on the effect of Lactobacillus paracasei and fructooligosaccharides on the faecal microflora in weanling piglets. Berl Munch Tierarztl Wochenschr, 112, 225–228 291) Niness K. R., 1999: Inulin and oligofructose: What a they? The Journal of Nutrition, 129, 75, 14023 292) Nocek J.E., Kautz W.P., Leedle J.A.Z., Allman J.G., 2002: Ruminal supplementation of direct-fed microbials on diurnal pH variation and in situ digestionin dairy cattle. Journal of Dairy Science, 85, 429 - 433 293) Nowak A., Śliżewska K., Libudzisz Z., Socha J., 2010: Probiotyki – efekty zdrowotne. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 4, 71, 20-36 294) Nowak A., Śliżewska K., Libudzisz Z., 2010: Probiotyki – historia i mechanizmy działania. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 4, 71, 5-19 295) Ochmański W., Barabasz W., 1999: Probiotyki oraz ich terapeutyczne właściwości. Przegląd Lekarski, 56, 3211 - 3215 296) Ogawa T., Asai Y., 2006: Oral immune adjuvant activity of Lactobacillus casei subp. casei in dextran fed layer chicken. British Journal of Nutrition, 95, 430 – 434 297) Ohama H., Ikeda H., Moroyoshi H., 2006: Health foods and foods with health claims in Japan. Toxicolology, 221, 95 – 111 298) Ohimain E. I., Ofongo R. T. S., 2012: The Effect of Probiotic and Prebiotic Feed Supplementation on Chicken Health and Gut Microflora. A Review. International Journal of Animal and Veterinary Advances, 4, 2, 135-143 299) Ohta A., Ohtsuki M., Baba S., Takizawa T., Adachi T., Kimura S.,1995: Effects of fructooligosaccharides on the absorption of iron, calcium and magnesium in irondeficient anemic rats. Journal of Nutritional Science and Vitaminolology, 41, 281–291 206 300) Ohta A., Baba S., Takizawa T., Adachi T., 1994: Effects of fructooligosaccharides on the absorption of magnesium in the magnesium-deficient rat model. Journal of Nutritional Science and Vitaminolology, 40,171 – 80 301) Ohta A., Motohashi Y., Ohtsuki M., Hirayama M., Adachi T., Sakuma K., 1998: Dietary fructooligosaccharides change the concentration of calbindin-D9k differently in the mucosa of the small and large intestine of rats. The Journal of Nutrition, 128,934-939 302) Ohta A., Ohtsuki M., Hosono A. i wsp., 1998: Dietary fructooligosaccharides prevent osteopenia after gastrectomy in rats. The Journal of Nutrition,128, 106-110 303) Ohta A., Ohtsuki M., Takizawa T., Inaba H., Adachi T., Kimura S., 1994: Effects of fructooligosaccharides on the absorption of magnesium and calcium by cecectomized rats. International Journal forf Vitamin and Nutrition Research, 64, 316- 23 304) Ohta A., Sakai K., Takasaki M., Uehara M., Tokunaga T., Adachi T., 1999: Dietary heme iron does not prevent postgastrectomy anemia but fructooligosaccharides improve bioavailability of heme iron in rats. Int J Vitam Nutr Res, 69,348- 55 305) Ohta A., Ohtsuki M., Uehara M., Hosono S., Hirayama M., Adachi T, Hara H., 1998: Dietary fructooligosaccharides prevent post gastrectomy anemia and osteopenia in rats. The Journal of Nutrition, 128, 485– 490 306) Ohya T., Marubashi T., Ito H., 2000: Significance of fecal volatile fatty acids in shedding of Escherichia coli Escherichia coli O157 from calves: experimental infection and preliminary use of a probiotic product. The Journal of Veterinary MedicalScience, 62,1151-1155 307) Olejnik A., Tomczyk J., Kowalska K., Grajek W., 2010: Rola naturalnych składników diety w chemioprewencji nowotworów jelita grubego. Postepy Higieny Medycyny Doświadczalnej, 64, 175-187 308) Oliveira R. J., Salles M.J., da Silva A. F., Kanno T. Y., Lourenço A. C., Freiria G. A., Matiazi H. J., Ribeiro L. R., Mantovani M. S., 2009: Effects of the polysaccharide beta-glucan on clastogenicity and teratogenicity caused by acute exposure to cyclophosphamide in mice. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 53, 3, 164-73 309) Osman N., Adawi D., Molin G., Ahrne S., Berggren A., Jeppsson B., 2006: Bifidobacterium infantis strains with and without a combination of oligofructose and inulin (OFI) attenuate inflammation in DSS-induced colitis in rats. BMC Gastroenterol., 28, 6-31 310) Paluch U., Janik A., Koska M., Pieszka M., Barowicz T., 2006: Probiotyki w żywieniu prosiat. Wiadomości Zootechniczne, R XLIV, 1, 3 – 9 311) Panda A. K., Reddy M. R., Rao S. V. R., Raju M.V.L.N., Praharaj N. K., 2000: Growth, carcass characteristics, immunocompetence and response to Escherichia coli of broilers fed diets with various levels of probiotic. Archiv fur Geflugelkunde., 64, 152-156 207 312) Parker R., 1974: Probiotics, the other half of antibiotic story. Animal Nutrition and Health, 29, 4-8 313) Pelizon A. C., Kaneno R., Soares A. M., Meira D. A., Satori A., 2005: Immunomodulatory activities associated with β-glucan derived from Saccharomyces cerevisiae. Physiology Research, 54, 557 - 564 314) Peran L, Camuesco D, Comalada M, Nieto A, Concha A., Adrio J. L., Olivares M., Xaus J., Zarzuelo A., Galvez J., 2006: Lactobacillus fermentum, a probiotic capable to release glutathione, prevents colonic inflammation in the TNBS model of rat colitis. International Journal of Colorectal Disease., 21, 8, 737–746 315) Peran L., Camuesco D., Comalada M., Bailon E., Henriksson A., Xaus J., Zarzuelo A., Galvez J., 2006: A comparative study of the preventative effects exerted by three probiotics, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus, in the TNBS model of rat colitis. Journal of Applied Microbiology, 103, 836-844 316) Peran L., Camuesco D., Comalada M., Nieto A., Concha A., Dı´az-Ropero M. P., Olivares M., Xaus J., Zarzuelo A., Galvez J., 2005: Preventive effects of a probiotic, Lactobacillus salivarius ssp. Salivarius, in the TNBS model of rat colitis. World Journal of Gastroenterology, 7, 11, 33, 5185–5192 317) Perrin S., Fougnies C., Grill J. P., Jacobs H., Schneider F., 2002: Fermentation of chicory fructo-oligosaccharides in mixtures of different degrees of polymerization by three strains of bifidobacteria. Canadian Journal of Microbiology, 48, 8, 759–763 318) Pickard K., Bremmer A., Gordon J., Macdonald T., 2004: Microbial-gut interactions in health and disease. Immune responses. Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology, 18, 271-285 319) Pierce K. M., Sweeney T., Brophy P. O., Callan J. J., Fitzpatri E., McCarthy P., O’Doherty J. V., 2006: The effect of lactose and inulin on intestinal morphology, selected microbial populations and volatile fatty acid concentration sinthe gastrointestinal tractoftheweanling pig. Animal Science, 82, 311–318 320) Pirman T., Patureau Mirand P., Oreśnik A., Salobomir J., 2009: Effects of dietary pectin on protein digestion and metabolism in growing rats. Acta argiculturae Slovenica, 94, 2, 111–119 321) Pirman T., Ribeyre M.C., Mosoni L., Rémond D., Vrecl M., Salobir J., Patureau Mirand P. 2007. Dietary pectin stimulates protein metabolism in the digestive tract. Nutrition, 23, 1, 69–75 322) Podkówka W., Podkówka Z.,1995: Probiotyki. Dodatki paszowe dla świń. Praca zbiorowa pod re-dakcją M. Kotarbińskiej i E. Greli. Instytut Fizjologii i Żywienia Zwierząt PAN, 75-86 323) Pool-Zobel B. L., Neudecker C., Domizlaff I., Ji S., Schillinger U., Rumney C., Moretti M., Vilarini I., Scassellati-Sforzolini R., Rowland I., 1996: Lactobacillus- and bifidobacterium-mediated antigenotoxicity in the colon of rats. Nutrition and Cancer, 26, 3, 365-380 208 324) Pool-Zobel B. L., Sauer J., 2007: Overview of experimental data on reduction of colorectal cancer risk by inulin-type fructans. The Journal of Nutrition, 137, 25802584 325) Pool-Zobel B.L., van Loo J., Rowland I.R., Roberfroid M.B., 2007: Experimental evidences on the potential of prebiotic fructans to reduce the risk of colon cancer. British Journal of Nutrition, 87, Suppl. 2, S273–S281 326) Poulson M., Molock A. M., Jacobsen B. L., 2002: Different effects of short and longchained fructans on large intestinal physiology and carcinogen – inducted aberrant crypt foci in rats. The Nutrition Cancer, 42, 194-205 327) Prost E. 1999. Probiotyki. Medycyna Weterynaryjna, 55, 2, 75 – 83 328) Rada V., Duskova D., Marounek M., Petr J., 2003: Enrichment of Bifidobacteria in the hen caeca by dietary inulin. Folia-Microbiologica, 46, 73–75 329) Rafter J, Bennett M, Caderni G, Clune Y, Hughes R, Karlsson P. C., Klinder A., O'Riordan M., O'Sullivan G. C., Pool-Zobel B., Rechkemmer G., Roller M., Rowland I., Salvadori M., Thijs H., Van Loo J., Watzl B., Collins J K., 2007: Dietary synbiotics reduce cancer risk factors in polypectomized and colon cancer patients. The American Journal of Clinical Nutrition, 85, 2, 488-96 330) Rafter J., 1995: The role of lactic acid bacteria in colon cancer prevention. Scandinavian Journal of Gastroenterology, 30, 497–502 331) Rafter J., 2004: The effects of probiotics on colon cancer development. Nutrition Research Reviews, 17, 277–284 332) Rafter J., Bennett M., Caderni G., Clune Y., Hughes R., Karlsson P. C., Klinde A., O'Riordan M., O'Sullivan G. C., Pool-Zobel B., Rechkemmer G., Roller M., Rowland I., Salvadori M., Thijs H., Van Loo J., Watzl B., Collins J. K., 2010: Dietary synbiotics reduce cancer risk factors in polypectomized and colon cancer patients. American Journal ofClinical Nutrition, 85, 2, 488-496 333) Raju M. V. L. N., Devegowda G., 2000: Influence of modified glucomannan on performance and organ morphology, serum biochemistry and hematology in broilers exposed to individual and combined mycotoxicosis (Aflatoxin, Ochratoxin and T-2 toxin). British Poultry Science, 41, 640-650 334) Raju, M. V. L. N., Devegowda G., 2002: Esterifed glucomannan in broiler chicken diets contaminated with aflatoxin, ochratoxin and T-2 toxin: Evaluation of its binding ability (in vitro) and Efficacy as immunomodulator. Asian-Australian Journal of Animal Science, 15, 1051-1056 335) Rakoff-Nahoum S., Paglino J., Eslami-Varzaneh F., 2004: Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell, 118, 229–41 209 336) Rao C. V., Chou D., Simi B., Ku H., Reddy B. S., 1998: Prevention of colonic aberrant crypt foci and modulation of large bowel microbial activity by dietary coffee fiber, inulin and pectin. Carcinogenesis, 19, 1815–1819 337) Rao V. A., 2001: The prebiotic properties of oligofructose at low intake levels. Nutrition Research, 21, 843–848 338) Raschka L., Daniel H., 2005: Mechanisms underlying the effects on inulin-type fructans on calcium absorbtion in he large intestine of rats. Bone, 37, 728-735 339) Rautonen N., Tiihonen K., Suomalainen T., Tynkkynen S., 2008: Effect of prebiotic supplementation on a probiotic bacteria mixture: comparison between a rat model and clinical trials. British Journal of Nutrition, 826-31 340) Reeves P. G., 1997: Components of the AIN-93 diets as improvements in the AIN76A diet. The Journal of Nutrition, 127, 838S– 841S. 341) Reference values for laboratory animals. 2010: Research Animal Resources, University of Minnesota. http://www.ahc.umn.edy/rar/refvalues.html 342) Rehman H., Bo¨hm J. Zentek J., 2006: Effects of diets with sucrose and inulin on the microbial fermentation in the gastrointestinal tract of broilers. Proceedings of the Society of Nutritional Physiology, Go¨ ttingen, Germany, 155-15 343) Rehman H., Rosenkranz C., Bo¨hm J., Zentek J., 2007: Dietary inulin affects the morphology but not the sodium-dependent glucose and glutamine transport in the jejunum of broilers. Poultry Science, 86, 118–122 344) Reid G., 2008: Probiotics and prebiotics- progress and challenges. International Dairy Journal, 18, 969-75 345) Reid G., Sanders M.E., Gaskins H. R., Gibson G. R., Mercenier A., Rastall R., Roberfroid M., Rowland I., Cherbut C., Klaenhammer T. R., 2003: New scientific paradigms for probiotics and prebiotics. Journal of Clinical Gastroenterology, 37, 105118 346) Rekiel A., 2002: Wykorzystanie dodatków paszowych mogących efektywnie zastąpić antybiotykowe stymulatory wzrostu. Wykorzystanie genetycznych i poza genetycznych metod zmierzających do poprawy jakości produkowanej wieprzowiny. Mat. Konf., IZ ZZD Pawłowice, 6.11.2002, 51-63 347) Rekiel A., Bielecki W., Cichowicz M., Więcek J., Kulisiewicz J., 2008: Wpływ wybranych dodatków paszowych na stan histologiczny błony śluzowej jelit tuczników. Medycyna Weterynaryjna, 64, 3, 339-343 348) Rekiel A., Gajewska J., 2006: Zmiana mikroflory jelitowej tuczników pod wpływem wybranych czynników żywieniowych. Medycyna Weterynaryjna, 62, 8, 925-930 349) Rekiel A., Kulisiewicz J., 1996: Zastosowanie dodatków zakwaszających i probiotycznych w wychowie prosiąt. Medycyna Weterynaryjna, 52, 266-269 210 350) Revolledo L., Ferreira C .S. A., Ferreira A. J. P., 2009: Prevention of Salmonella typhimurium colonization and organ invasion by combination treatment in broiler chicks. Poultry Science, 88, 734–743 351) Ribeiro C. M., Costa V. M., Gomes M. I., Golim M. A., Modolo J. R., Langoni H., 2011: Effects of synbiotic-based Bifidobacterium animalis in female rats experimentally infected with Toxoplasma gondii. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 34, 2, 111-114 352) Rideout T. C., Fan M. Z., Cant J. P., Wagner-Riddle C., Stonehouse P., 2004: Excretion of major odor-causing and acidifying compounds in response to dietary supplementation of chicory inulin in growing pigs. Journal of Animal Science, 82, 1678–1684 353) Rideout T. C., Fan M. Z., 2004: Nutrient utilisation in response to dietary supplementation of chicory inulin in growing pigs. Journal of the Science of Food and Agriculture, 84, 1005–1012 354) Robeiro A. M. L., Vogt L. K., Canal C. W., Cordoso M. R. I., Streck A. F., Bessa M. C., 2007: Effects of prebiotics and probiotics on the colonization and immune response of broiler chickens challenged with Salmonella enteritidis. Brazilian Journal of Poultry Science, 9, 3, 193-200 355) Roberfroid M. B., 2000: Chicory fructooligosaccharides and the gastrointestinal tract. Nutrition, 16, 677-679 356) Roberfroid M. B., 2005: Introducing inulin-type fructans. British Journal of Nutrition, 93, Suppl 1, S13–25 357) Roberfroid M. B., Inulin-type fructans: functional food ingredients, CRC Press 2005. 358) Roberfroid M. D, 2007. Prebiotics: the concept revisited. The Journal of Nutition, 137, 830–837 359) Roberfroid M. D., Gibson G. R., Hoyles L., McCartney A. L., Rastall R., Rowland I., Wolvers D., Watzl B., Szajewska B., Stahl B., Guarner F., Respondek R., Whelan K., Coxam V., Davicco M-J., Le´otoing L., Wittrant Y., Delzenne N. M., Cani P. D., Neyrinck A. M., Meheust A., 2010: Prebiotic effects: metabolic and health benefits. British Journal of Nutrition, 104, 2, S14-S52 360) Roberfroid M. B., 1993. Dietary fiber, inulin, and oligofructose: a review comparing their physiological effects. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 33, 103– 148 361) Roberfroid M. B., Slavin J., 2000: Nondigestible oligosaccharides Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 40, 461-480 362) Roberfroid, M. B., 1999: Concepts in functional foods: the case of inulin and oligofructose. The Journal of Nutrition, 129 1398S–401S 211 363) Roller M., Rechkemmer G., Watzi B., 2004. Prebiotic inulin enriched with Oligofructose in combination with the probiotics Lactobacillus rhamnosus and Bifidobacterium lactis modulates intestinal immune functions in rats. The Journal of Nutrition, 134, 153-156 364) Romański K., 2007: Podstawy immunologii przewodu pokarmowego. Medycyna Weterynaryjna, 63, 7, 768-772 365) Ross G. R., Gusils C., Oliszewski R., Colombo de Holgado S., González S.N., 2010: Effects of probiotic administration in swine. Journal of Bioscience and Bioengineering, 109, 6, 545–549 366) Ross. G. R., Gusils C., Oliszewski R., Colombo de Holgado S., Gonzales S. N., 2010: Effect of probotic administration on swin. Journal of Bioscence and Bioengineering, 109, 6, 545-549 367) Rowghani E., Arab M., Akbarian A., 2007: Effects of a Probiotic and Other Feed Additives on Performance and Immune Response of Broiler Chicks. International Journal of Poultry Science, 6, 261-265 368) Rowland I. R., Rumney C. J., Coutts J. T., Lievense L. C., 1998: Effect of Bifidobacterium longum and inulin on gut bacterial metabolism and carcinogeninduced crypt foci in rats. Carcinogenesis, 2, 281–285 369) Russell T. J., Kerley M. S., Allee G. L., 1996: Effect of fructooligosaccharides on growth performance of the weaned pig. Journal of Animal Science, 74, Suppl. 1, 61 370) Sakata T., Adachi M., Hashida M., Sato N., Kojima T., 1995: Effect of n-butyric acid on epithelial cell proliferation of pig colonic mucosa in short-term culture. Deutsche Tierärztliche Wochenschrift, 102, 163-164 371) Sakurai T. K., Hashimoto I., Suzuki N., Ohno S., Oikawa A., Masuda A., Yadomae T., 1992: Enhancement of murine alveolar macrophage functions by orally administered β-glucan. International Journal of Immunopharmacology, 14, 821– 830 372) Samanya M., Yamauchi K., 2002: Histological alterations of intestinal villi in chickens fed dried Bacillus subtilis var. Natto. Comparative Biochemistry and Physiology, 133, 95–104 373) Samli H.E., Senkoylu N., Koc F., Kanter M., Agma. A., 2007: Effects of Enterococcus faecium and dried whey on broiler performance, gut histomprphology and microbiota. Archives of Animal Nutrition, 61, 42-49 374) Santor R., 2008: Microbial influence in inflamantory bowel disease, Gastro., 577–94 375) Saulnier D. M. A., Spinler J. K., Gibson G. R., Versalovi J., 2009: Mechanisms of probiosis and prebiosis: considerations for enhanced functional foods. Current Opinion in Biotechnology, 20, 135–141 376) Saulnier D. M., Molenaar D., de Vos W. M., Gibson G. R., Kolida S., 2007: Identification of prebiotic fructooligosaccharide metabolism in Lactobacillus 212 plantarum WCFS1 through microarrays. Applied and Environmental Microbiology, 73, 1753-1765 377) Scharek L., Altherr B. J., Tölke C., Schmidt M. F. G., 2007: Influence of the probiotic Bacillus cereus var. toyoi on the intestinal immunity of piglets. Veterinary Immunology and Immunopathology, 120, 136-147 378) Schoenherr W. D., Pollmann D. S, Coalson J. A., 1994: Titration of Macro Gardson growth performance of nursery pigs. J.Anim.Sci., 72, Suppl. 2, 57 379) Scholz-Ahrens K.E., Schaafsma G., Heuvel E.G.H., Schrezenmeier J., 2001: Effects of prebiotics on mineral metabolism, Am. J. Clin. Nutr., 73, 459S - 464S 380) Scholz-Ahrens, K. E., Açi, Y., Schrezenmei, J., 2002: Effect of inulin, oligofructose and dietary calcium on repeated calcium and phosphorus balances, bone mineralization, and trabecular structure in ovariectomized rats. British Journal of Nutrition, 88, 365–377 381) Schrezenmeir J., de Vrese M., 2001: Probiotics, prebiotics and synbioticsapproaching a definition. The American Journal of Clinical Nutrition, 73, 361S-364S 382) Schrezenmier J., Vrese M. D., 2001: Probiotics and synbiotics approaching a definition. The American Journal of Clinical Nutrition, 73, 305-3645 383) Schwartz D.L., Muller L.D., Rogers G.W., Varga G.A., 1994: Effect of yeast culture on performance of lactating dairy cows. A field study. Journal of Dairy Science, 77, 3073–3080 384) Seifert S., Watzl B., 2007: Inulin and oligofructose: review of experimental data on immune modulation. The Journal of Nutrition, 137, 2563S–2567S 385) Sembries S., Dongowski G, Jacobasch G, Mehrlander K, Will F, Dietrich ., 2003: Effects of dietary fibre-rich juice colloids from apple pomace extraction juices on intestinal fermentation products and microbiota in rats. British Journal of Nutrition, 90, 607-615 386) Sembries S., Dongowski G, Mehrlander K, Will F, Dietrich H., 2006: Physiological effects of extraction juices from apple, grape, and red beet pomaces in rats. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 10269-10280 387) Sener G., Toklu H.Z., Cetinel S., 2007: β-Glucan protects against chronic nicotineinducted oxidative damage in rat kidney and bladder. Environmental Toxicology and Pharmacology, 23, 25 - 32 388) Shah N. P., 2007: Functional cultures and health benefits – A review. International Dairy Journal, 17, 1262-1277 389) Shareef A.M., AL - Dabbagh A. S. A., 2009: Effect of probiotic (Saccharomyces serevisisiae) on performance of broiler chicks. Iraqi Journal of Veterinary Sciences, 23, 1, 23-29 390) Sharp E., La Regina M., 2000: The rat laboratory. CRC Press. (red. Suckow M.). 213 391) Shu Q., Gill H. S., 2002. Immune protection mediated by the probiotic Lactobacillus rhamnossus HN001 (DR20™) against Escherichia coli O157:H& infection in mice. FEMS Imynology and Medical Microbiology, 34, 59-64 392) Shu Q., Zhou J., Rutherfurd S., Kay J., Birtles M. J., Prasad J., Gopal P. K., Gill H. S., 1999: Probiotic lactic acid bacteria (Lactobacillus acidophilus HN017, Lactobacillus rhamnosus HN001 and Bifidobacterium lactis HN019) have no adverse effects on the health of mice. International Dairy Journal, 9, 11, 831-836 393) Siggers R. H., Siggers J., Boye M., Thymann T., Mølbak L., Leser T., Jensen B.B., Sangild P.T., 2008: Early administration of probiotics alters bacterial colonization and limits diet-induced gut dysfunction severity of necrotizing enterocolitis in preterm pigs. The Journal of Nutrition, 138, 1437–1444 394) Silva V.K., Della Torre Da Silva J., Gravena R.A., Marques R.H., Hada F.H., Barbosa de Moraes V.M., 2010: Yeast extract and prebiotic in pre-initial phase diet for broiler chickens raised under different temperatures. Revista Brasiliera de Zootecnia, 39, 1, 165-174 395) Simon O., Jadamus A., Vahjen W., 2001: Probiotic feed additives effectiveness and expected modes of action. Journal of Animal and Feed Sciences, 10, 1, suppl., 51-67 396) Siuta A., 2000: Wpływ krajowego preparatu probiotycznego na wskaźniki odchowu prosiąt. Rocz. Nauk. Zoot., Supl., 6, 213-217 397) Skomiał J., W., 2001: Żywienie zwierząt i paszoznawstwo. Wyd. Nauk. PWN, Warszawa, 3, 227-228 398) Skórko-Sajko H., Sajko J., Zalewski W., 1993. The effect of Yea-Sacc in the ration for dairy cows on production and composition of milk. J. Anim. Feed. Sci., 2,159–167 399) Śliżewska K., Biernasiak J., Libudzisz Z., 2006: Probiotyki jako alternatywa dla antybiotyków. Zeszyty Naukowe Politechniki Łódzkiej, Chemia spożywcza i Biotechnologia, 984, 70, 79-91 400) Smiricky M. R., Grieshop C. M., Albin D. M., Wubben J. E., Gabert V. M., Fahey G. C. Jr., 2002: The influence of soy oligosaccharides on apparent and true ileal amino acid digestibilities and fecal consistency in growing pigs. Journal of Animal Sciences, 80, 2433 - 2441 401) Smirnov A., Perez R., Amit-Romach E., Sklan D., Uni Z.: Mucin Dynamics and microbial populations in chicken Small intestine are changed by dietary probiotic and antibiotic growth promoter supplementation. The Journal of Nutrition, 2005, 135, 187–192 402) Socha J., Stolarczyk A., Socha P., 2002: Miejsce bifidobakterii w profiaktyce i leczeniu wybranych chorób wieku dziecięcego. Pediatr Współcz Gastroenterol Hepatol Żywienie Dziecka, 4, 43 -47 214 403) Sretenović Li., Petrović M. P., Aleksić S., Pantelić V., Katić V., Bogdanović V., Beskorovajni R., 2008: Influence of yeats,probiotic and enzymes in rations on dairy cows performances during transition. Biotechnology in Animal Husbandry, 24, 33-43 404) Steve W., Cui Ć., Wang Q., 2009: Cell wall polysaccharides in cereals: chemical structures and functional properties. Structural Chemistry, 20, 291–297 405) Strompfová V., Marcináková M., Simonová M., Gancarcíková S., Jonecová Z., Sciranková L., Koscová J., Buleca V., Cobanová K., Lauková A., 2006: Enterococcus faecium EK13-an enterocin a-producing strain with probiotic character and its effect in piglets. Anaerobe, 12, 5-6, 242-248 406) Strusińska D., Iwańska S., Mierzejewska J., Skok A., 2003: Wpływ dodatków mineralno-witaminowych i drożdży na poziom wybranych wskaźników biochemicznych w surowicy krwi krów. Medycyna Weterynaryjna, 59, 323-326 407) Strusińska D., Mierzejewska J., Skok A., 2004. Concentration of mineral components β-carotene, vitamins A and E in cow colostrums and milk when using mineral-vitamin supplements (in Polish). Medycyna Weterynaryjna, 60, 202-206 408) Sushma M., Sujatha D., Spandana K., Bharathi K., Prasad K., 2009: Effect of probiotic dairy product,. Prebiotic honey and their combination on different types of ulcers in albino rats. Pharmacologyonline, 1, 944 – 968 409) Świątkiewicz S., Świątkiewicz M., 2008: Zastosowanie fruktanów o właściwościach prebiotycznych w żywieniu zwierząt gospodarskich. Medycyna weterynaryjna, 64, 8,987 - 990 410) Świątkiewicz S., Świątkiewicz M., 2009: Wpływ wybranych dodatków paszowych na gospodarkę mineralną drobiu. Medycyna Weterynaryjna, 65,1, 25 – 28 411) Szymańska-Czerwińska M., Bednarek D., 2007: Wpływ dodatku prebiotyków na aktywność interleukiny 1 i zmiany w subpopulacjach leukocytów cieląt. Med. Wet., 412) Szyszkowska A., Pres J., Jamroz D., Tolpa S., 1984: Different growth promoters in concentrate feeds for calves. Roczniki Naukowe Zootechniki. Monografie i Rozprawy 22, 53–61 413) Szyszkowska A., Pres J., Jamroz D., Wertelecki T.,1998: Effect of Zn-bacitracin, salinomycin, monensin and avoparcin on the growth and nutrient availability in calves. Prace i Materialy Zootechniczne, 52, 97–104 414) Tada R., Asuka T., Haruyo I., 2008: Structural characterisation and biological activities of a unique type β-D-glucan obtained from Aureobasidium pullulans. J. Glycoconj., 25, 851–861 415) Tamura M., Nakagawa H., Tsushida T., Hirayama K., Itoh K., 2007: Effect of pectin enhancement on plasma quercetin and fecal flora in rutin-supplemented mice. Journal of Food Science, 72, 9S648-51 416) Tanida M., Shen J., Maeda K., Horii Y., Yamano T., Fukushima Y., Nagai K., 2008: High-fat diet induced obesity is attenuated by probiotic strain Lactobacillus paracasei ST11(NCC2461) in rats. Obesity Research and Clinical Practice, 2, 159-169 215 417) Taper H. S., Lemort C., Roberfroid M. B.,1998 : Inhibition effect of dietary inulin and oligofructose on the growth of transplantable mouse tumor. Anticancer Research, 18, 4123 – 4126 418) Taper H. S., Roberfroid M., 1999: Influence of inulin and oligofructose on breast cancer and tumor growth. The Journal of Nutrition, 129, supl.7S, 1488S-1491S 419) Taras D., Vahjen W., Macha M.,Simon O., 2006: Performance, diarrhea incidence, and occurrence of Escherichia coli virulence genes during long-term administration of a probiotic Enterococcus faecium strain to sows and piglets. Journal of Animal Science, 84, 3, 608-617 420) Taras D., Vahjen W., Macha M., Simon O., 2005: Response of performance characteristics and fecal consistency to long-lasting dietary supplementation with the probiotic strain Bacillus cereus var. toyoi to sows and piglets. Archives of Animal Nutrition, 59, 6, 405-417 421) Taras D., Vajhen W., Simon O., 2007: Probiotics in pigs- modulation of their intestinal distribution and their impact on health and performance. Livestock Sciences, 108, 229-231 422) Ten Bruggencate S. J. M., Bovee-oudenhoven I. M. J., Letink-Wissing M. L. G., Van Der Meer R., 2003: Dietary fructo-oligosaccharides dose-dependently increase translocation of salmonella in rats. The Journal of Nutrition, 133, 2313-2318 423) Terada A.H., Hera J., Sakamoto N., Sato S., Takagi T., Mitsuoka R., Mino K., Hara I., Fujimori T., 1994: Effects of dietary supplementation with lactosucrose (4G-β-Dgalactosylsucrose) on fecal flora, cecal metabolites, and performance in broiler chickens. Poultry Science, 73, 1663-1672 424) Thomas T., Versalovic J., 2010: Probiotics-host communication. Modulation of signaling pathways in the intestine. Gut Microbes, 1, 3, 148-163 425) Toklu H. Z., Sehirli A. O., Velioğlu-Oğünç A., Cetinel S., Sener G., 2006: Acetaminophen-inducted toxicity is prevented by β-D-glucan treament in mice. European Journal of Pharmacology, 543, 133 - 140 426) Toklu H. Z., Sener G., Jahovic N., Uslu B., Arbak S., Yeðen B.C., 2006: Beta-glucan protects against burn-induced oxidative organ damage in rats. International Immunopharmacology, 6, 156-69 427) Tokunaka K., Ohno N., Adach Y., Tanaka S., Tamura H., Yadomae T., 2000: Immuno pharmacological and immunotoxicological activities of a water-soluble (13)-beta-D-glucan, CSBG from Candida spp. International Journal of Immunopharmacology, 22, 383 - 394 428) Umeki M., Oue K., Mochizuki S., Shirai Y., Sakai K., 2004: Effect of Lactobacillus rhamnosus KY-3 and cellobiose as synbiotics on lipid metabolism in rats. Journal Nutrition Sciences Vitaminol., 50, 5, 330-334. 216 429) Urdaneta E., Barrenetxe J., Aranguren P., Irigoyen A., Marzo F., Ibanez F., 2007: Intestinal beneficial effects of kefir – supplemented diet in rats. Nutrition Research, 27, 653 – 658 430) Ushida K., Hashizume K., Miyazaki K., Kojima Y., Takakuwa S., 2003: Isolation of Bacillus spp. as a volatile sulfur-degrading bacterium and its application to reduce the fecal odor of pig. Asian-Australas Journal of Animal Science, 16, 12, 1795–1798 431) Usman B., Hosono A. 2001. Hypocholesterolemic effect of Lactobacillus gasseri SBT0270 in rats fed a cholesterol – enriched diet. Journal Dairy, 60, 617 – 624 432) Van de Wiele T., Boon N., Possemiers S., Jacobs H., Verstraete W., 2007: Inulin type fructans of longer degree of polymerization exert more pronounced in vitro prebiotic effects. Journal of Applied Microbiology, 102, 452–460 433) Van Heugten E., Dorton K. L., 2001: Effects of live yeast siupplementation on weanling pig performance, Annual Swine Report, North Carolina State Univ. USA,1-4 434) Van Loo J., 2004: The specificity of the interaction with intestinal fermentation by prebiotics determines their physiological efficacy. Nutrition Research Reviews, 17, 89–98 435) Van Loo J., Cummings J., Delzenne N., Englyst H., Franck A., Hopkins M., Kok N., Macfarlane G., Newton D., Quigley M., Roberfroid R., Vliet T., Heuvel E., 1999: Functional food properties of non-digestible oligosaccharides: A consensus report from the ENDO project (DGXII AIRII-CT94-1095). British Journal of Nutrition, 81, 121–132 436) Van Loo, J., Coussement P., De Leenheer L., Hoebregs H., Smits G.,1995: On the presence of inulin and oligofructose as natural ingredients in the Western diet, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 35, 525–552 437) Vandeplas S., Dubois Dauphin, R., Thiry, C., Beckers, Y., Welling, G.W., Thonart, P.,Théwis, A., 2009. Efficiency of a Lactobacillus plantarum-xylanase combination on growth performances, microflora populations, and nutrient digestibilities of broilers infected with Salmonella typhimurium. Poultry Science, 88, 1643–1654 438) Vanhoof K., De Schrijver R., 1996: Availability of minerals in rats and pigs fed non-purified diets containing inulin. Nutrition Research, 16,1017–22 439) Vanhoof K., De Schrijver R., 1996: Nitrogen metabolism in rats and pigs fed inulin. Nutrition Research 16, 1035–1039 440) Verghese M., Rao D.R., Chawan C.B., Shackelford L., 2002: Dietary Inulin Suppresses Azoxymethane-Induced Preneoplastic Aberrant Crypt Foci in Mature Fisher 344 Rats.The Journal of Nutrition, 132, 2804-2808 441) Vicente J., Wolfenden A., Torres-Rodriguez A., Higgins S., Tellez G., Hargis B. M., 2007:. Effect of a Lactobacillus-based probiotic and dietary lactose prebiotic on turkey poult performance with or without Salmonella enteritidis challenge. The Journal of Applied Poultry Research., 16, 1, 361–364 217 442) Videla S., Vilaseca J., Antolín M., García-Lafuente A., Guarner F., Crespo E., Casalots J., Salas A., Malagelada J. R., 2001: Dietary inulin improves distal colitis induced by dextran sodium sulfate in the rat. American Journal of Gastroenterology, 96, 5, 1486–93 443) Vrese M., Marteau P., 2007: Probiotics and Prebiotics: Effectson Diarrhea. The Journal of Nutrition, 137, 803S-811S 444) Wagner R. D., Johnson S.J., Rubin D.K., 2009: Probiotic bacteria are antagonistic to Salmonella enterica and Camphylobacter jejuni and influence host lymphocyte responses in human microbiota – associated immunodeficient and immunocompetent mice. Molecular Nutrition and Food Research, 53, 377-388 445) Waller K.P., Coldits I.G., 1999: Effect of intramammary infusion of beta-1,3-glucan or interleukin 2 on leukocyte subpopulations in mammary glans of sheep. American Journal of Veterinary Research, 60, 6, 703-707 446) Waltz B., Girrbach S., Roller M., 2005: Inulin, immunomodulation. British Journal of Nutrition, 93, S49-S55 oligofructose and 447) Wang A. N., Yu H. F., Gao X., Li X. J., Qiao S. Y., 2009: Influence of Lactobacillus fermentum I5007 on the intestinal and systemic immune responses of healthy and E. coli challenged piglets. Antonie van Leeuwenhoek – International Journal of General and Molecular Microbiology, 96, 89–98 448) Wang J., Zhang L., 2009: Structure and chain conformation of five water-soluble derivatives of a β-D-glucan isolated from Ganoderma lucidum, Carbohydrate Research, 344, 105–112 449) Wang J., Zhou H., 2007: Comparison of the effects of Chinese herbs, probiotics and prebiotics with those of antibiotics in diets on the performance of meat ducks. Journal of Animal and Feed Sciences, 16, 96–103 450) Wang Y., 2009: Prebiotics: Present and future in food science and technology, Food Research Inter., 42, 8-12 451) Wang Y., Cho J.H., Chen Y.J., Yoo J.S., Huang Y., Kim H.J., Kim I.H., 2009: The effect of probiotic BioPlus 2B® on growth performance, dry matter and nitrogen digestability and slurry noxious gas emission in growing pigs. Livestock Sciences, 120, 35-42 452) Wang Z., Eastridge M. L., Qin X., 2001: Effects on forage neutral detergent fiber and yeast culture on performance of cows during early lactation. Journal Dairy Science, 84, 204-212 453) Waszkiewicz-Robak B., 2006: Właściwości funkcjonalne i prozdrowotne preparatów β-glukanów i suszonych pofermentacyjnych drożdży piwowarskich Saccharomyces cerevisiae. Rozprawy Naukowe i Monografie. Wydawnictwo SGGW 454) Kocek B., Osek M., Milczarek A., Olkowski B, Janocha A., 2011. Wpływ probiotyku, prebiotyku i synbiotyku na wskaźniki produkcyjne i jakość mięsa kurcząt brojlerów żywionych dietami na bazie dwóch zbóż (kukurydza/pszenica, 218 pszenica/pszenżyto). Zeszyty Naukowe UP we Wrocławiu, Biologia i Hodowal Zwierząt, LXII, 580: 243–253 455) Watzl B., Girrbach S., Roller M., 2005: Inulin, oligofructose immunomodulation. Brititish Journal of Nutrition, 93, Suppl. 1, S49 - S55 and 456) Weaver C. M., 2005: Inulin, oligofructose and bone health: Experimental approaches and mechanisms. British Journal of Nutrition, 93, S99–S103 457) White L. A., Newman M. C., Cromwell G. L., Lindemann M. D., 2002: Brewers dried yeast as a source of mannan oligosaccharides for weanling pigs. Journal of Animal Science, 80, 2619-2628 458) Whitlow L., Diaz D. E., Hopkins B. A., Hagler W. M., 2000: Mycotoxins and milk safety: the potential to block transfer to milk, Biotechnology in the Feed Industry, Ed. Lyons, T.P. and Jacques, K.A, Nottingham Univ. Press, Loughborough, Leics, UK., 391-408 459) Wójcik R., Magaczewska J., Trawkowska S., Siwicki A., 2007: Wpływ β-1,3/1,6-Dglukanu na nieswoiste komórkowe mechanizmy obronne jagniąt. Medycyna Weterynaryjna, 63, 1, 84 - 89 460) Wollowski I., Rechkemmer G., Pool-Zoobel B. L., 2001:Protective role of probiotics and prebiotics in colon cancer. American Journal of Clinical Nutrition, 73, 451S-455S 461) Xu Z. R., Hu C. H., Xia M. S., Zhan X. A., Wang M. Q., 2003 Effects of dietary fructooligosaccharide on digestive enzyme activities, intestinal microflora and morphology of male broilers. Poultry Science, 82, 1030 - 1036 462) Xu Z.R., Hu C.H., Wang M.Q., 2002: Effects of fructooligosaccharide on conversion of L-tryptophan to skatole and indole by mixed populations of pig fecal bacteria. Journal of General and Applied Microbiology, 48, 83-89 463) Yang S. C., Chen J. Y., Shang H. F., Cheng T. Y., Tsou S. C., Chen J. R., 2005. Effect of synbiotics on intestinal microflora and digestive enzyme activities in rats. World Journal of Gastroenterology, 11,47, 7413-7417 464) Yasuda E., Serata M., Sako T., 2008: Suppressive effect on activation of macrophages by Lactobacillus casei strain Shirota genes determining the synthesis of cell wall-associated polysaccharides. Applied and Environmental Microbiology, 74, 4746-4755 465) Yasuda K., Roneker K., Miller D., Welch R., Xin G.L., 2006 : Supplemental Dietary Inulin Affects the Bioavailability of Iron in Corn and Soybean Meal to Young Pig. American Society for Nutrition. The Journal of Nutrition, 136, 3033 - 3038 466) Younes H., Coudray C., Bellanger J., Demigné C., Rayssiguier Y., Rémésy C., 2001: Effects of two fermentable carbohydrates (inulin and resistant starch) and their combination on calcium and magnesium balance in rats. British Journal of Nutrition, 86, 1–8 219 467) Yousefi M., Karkoodi K., 2007: Effect of probiotic Thepax® and Saccharomyces cerevisiae supplementation on performance and egg quality of laying hens. International Journal of Poultry Science, 6, 1, 52-54 468) Zaky E. A., 2009: Physiological Response to Diets Fortified with Jerusalem Artichoke Tubers (Helianthus tuberosus L.) Powder by Diabetic Rats. AmericanEurasian Journal of Agricultural Environmental Science, 5, 5, 682-688 469) Zareie M., Johnson-Henry K., Jury J, Yang P. C., Ngan B. Y., McKay D. M., Soderholm J. D.,Perdue M. H., Sherman P. M., 2006: Probiotics prevent bacterial translocation and improve intestinal barrier function in rats following chronic psychological stress. Gut, 55, 1553-1560 470) Żary – Sikorska E., Juśkiewicz J., 2007: Wpływ fruktanów o różnym stopniu polimeryzacji łańcucha węglowodanowego na procesy fermentacyjne w końcowym odcinku przewodu pokarmowego u szczurów doświadczalnych. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 5, 54, 385 – 391 471) Zduńczyk Z., 2002: Probiotyki i prebiotyki oddziaływania lokalne i systemowe, Przemysł Spożywczy 2002, 4, 6-8 472) Zduńczyk Z., 2009. Żywienie zwierząt i paszoznawstwo. Tom II. Żywienie szczurów laboratoryjnych, 20, 514. 473) Zduńczyk Z., Juśkiewicz J., Wróblewska M., Król B., 2004: Physiological effects of lactulose and inulin in the cecum of rats. Archives of Animal Nutrition, 58, 89–98 474) Zhang G., Ma L., Doyle M. P., 2006: Effect of Probiotics, Prebiotics and Symbiotics on Weight Increase of Chickens (Gallus domesticus). Retrieved from: http//www.ugacfs.org/research/pdf/poultry 475) Zhang J., Lupton J. R., 1994: Dietary fibers stimulate colonic cell proliferation by different mechanisms at different sites. Nutrition and Cancer, 22, 267–276 476) Zhou J. S., Shu Q., Rutherfurd K.J., Prasad J., Birtles M.J, Gopal P.K, Gill H. S., 2000: Safety assessment of potential probiotic lactic acid bacterial strains Lactobacillus rhamnosus HN001, Lb. Acidophilus HN017, and Bifidobacterium lactis HN019 in BALB/C mice. International Journal of Food Microbiology, 56, 87–96 477) Zhu C. L., Rademacher M., de Lange C. F. M., 2005: Increasing dietary pectin level reduces utilization of digestible threonine intake, but not lysine intake, for body protein deposition in growing pigs. Journal of Animal Science, 83, 5, 1044–1053 478) Zimmermann B., Bauer E., Mosenthin P., 2001: Pro and prebiotics in pigs nutrition potential modulators of gut health? Journal of Animal Feed Science, 10, 47-56 220
