Mikrosatelitarne sekwencje DNA - analizy dna drzew leśnych na
advertisement
Mikrosatelitarne sekwencje DNA Małgorzata Pałucka Wykorzystanie sekwencji mikrosatelitarnych w jądrowym DNA drzew leśnych do udowodnienia pochodzenia materiału dowodowego w postępowaniu sądowym 27.09.2012 Leśny Bank Genów Kostrzyca Spis treści I. DNA II. Ogólne zasady genetyki molekularnej III.Reakcja PCR IV.Markery genetyczne V.Mikrosatelity 2 DNA DNA • kwas deoksyrybonukleinowy (dawn. kwas dezoksyrybonukleinowy), w skrócie DNA (od ang. deoxyribonucleic acid) • wielkocząsteczkowy organiczny związek chemiczny należący do kwasów nukleinowych • może być zlokalizowany w jądrze komórkowym i w cytoplazmie, u wirusów w kapsydach • pełni rolę nośnika informacji genetycznej organizmów żywych • autorami modelu podwójnej helisy DNA są James Watson i Francis Crick, na podstawie zdjęć krystalografii rentgenowskiej wykonanych przez Rosalind Franklin i Maurice’a Wilkinsa (1953 r.) 3 DNA DNA W komórkach DNA znajduje się w: • jądrze komórkowym (nDNA- jądrowy DNA) DNA • chloroplastach (cpDNA- chloroplastowy DNA) DNA • mitochondriach (mtDNA- mitochondrialny DNA) DNA 4 DNA DNA- nieskomplikowana budowa chemiczna • przeważnie cząsteczka jest dwuniciowa, nici są skręcone spiralnie wokół siebie • koniec (5’) jednej nici leży naprzeciwko początku (3’) drugiej nici (usytuowanie naprzeciwległe) • podstawową jednostką budulcową jest nukleotyd: cukier (deoksyryboza lub ryboza) + zasada azotowa + reszta kwasu fosforowego nukleotyd 5 DNA DNA- nieskomplikowana budowa chemiczna Zasady azotowe dwóch przeciwległych nici łączą się ze sobą komplementarnie (łac. complementum – dopełnienie), tj. zawsze adenina łączy się z tyminą a cytozyna z guaniną 6 Ogólne zasady genetyki molekularnej • Przepływ informacji genetycznej w komórce odbywa się jednokierunkowo: DNA RNA BIAŁKA • Wszystkie komórki organizmu zawierają identyczną, pełną informację genetyczną • Zależnie od rodzaju komórki, fazy cyklu życiowego, jej stanu i warunków zewnętrznych- ekspresji ulegają inne fragmenty zapisu genetycznego • Jednostki informacji genetycznej (m.in.): Nukleotyd- cukier (deoksyryboza lub ryboza) + zasada azotowa + reszta kwasu fosforowego Gen- odcinek DNA odpowiedzialny za powstanie jednej cząsteczki białka, tRNA lub rRNA Chromosom- nić DNA połączona z białkami, która jako całość wędruje z komórki macierzystej do komórki potomnej Genom- całość informacji genetycznej zawartej w komórce lub w określonym organellum np. genom chloroplastowy, genom mitochondrialny 7 Ogólne zasady genetyki molekularnej Każda cecha fenotypowa (np. kolor włosów) jest warunkowana przez zapis genetyczny w genach Locus (l. mnoga loci)loci określony obszar chromosomu zajmowany przez gen. W obrębie chromosomu znajduje się wiele różnych loci. W locus mogą znajdować się różne warianty danego genu (różniące się sekwencją nukleotydów w DNA) zwane allelami Organizm haploidalny ma zestaw pojedynczych chromosomów (N) Organizm diploidalny ma zestaw chromosomów połączonych parami (2N) 2N 8 Reakcja PCR PCR- Reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction) – metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych (w termocyklerze). Składniki do przeprowadzenia PCR: 1) 2) 3) 4) 5) 9 wyizolowany, o odpowiedniej czystości DNA (z tkanek roślinnych, z krwi, z włosów itp.) środowisko reakcji (bufor, jony magnezowe oraz odpowiedniej czystości woda) primery (in. startery- czyli kilku do kilkunastu nukleotydowe sekwencje flankujące znany lub nieznany odcinek DNA) dNTP (wolne nukleotydy) termostabilna (nie ulegająca degradacji w wysokich temperaturach) polimeraza DNA Reakcja PCR PCR- Reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction) – metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych. Technika została wynaleziona w 1983 r. przez Karye’go Mullisa z kalifornijskiej firmy Cetus, za co Mullis otrzymał w roku 1993 Nagrodę Nobla PCR znajduje wiele zastosowań, m.in.: w badaniach nad genomem charakterystyce ekspresji genów w klonowaniu genów diagnostyce klinicznej identyfikacji osób zaginionych kryminalistyce paleontologii 10 Reakcja PCR 11 Markery genetyczne Markery genetyczne to cechy jakościowe organizmów podlegające prostym zasadom dziedziczenia zgodnie z prawami Mendla. Można je podzielić na 3 główne klasy: I. Markery morfologiczne (brak chlorofilu, specyficzny kształt łusek szyszkowych czy blaszki liściowej), II. Markery biochemiczne (izoenzymy, terpeny, antygeny), III. Markery DNA (oparte na zmienności sekwencji nukleotydów). Markery genetyczne służą m.in.: badaniu zmienności genetycznej populacji umożliwiają identyfikację osobniczą, w tym analizę rodzicielstwa umożliwiają badanie śladów biologicznych w miejscu przestępstwa i porównanie ich z genotypami osób podejrzanych o jego popełnienie są szeroko wykorzystywane w badaniach populacyjnych drzew leśnych. 12 Mikrosatelity Specyficznym rodzajem markerów DNA są sekwencje mikrosatelitarne czyli mikrosatelity- SSR (ang. Simple Sequence Repeats) Występują jako tandemowe powtórzenia krótkich jednostek (sekwencji) o długości od 1 do 6 nukleotydów. O polimorfizmie (różnorodności) mikrosatelitów stanowi zmienność liczby powtórzeń krótkich sekwencji, która w zależności od locus może wahać się od kilku do ponad trzydziestu. Polimorfizm mikrosatelitów bada się poprzez analizę długości fragmentów DNA zawierających mikrosatelity, wykorzystując mechanizm reakcji PCR, a różne allele identyfikuje się jako fragmenty DNA o różnej długości mierzone liczbą nukleotydów. 13 Mikrosatelity Mikrosatelity- SSR (ang. Simple Sequence Repeats) należą do grupy powtarzających się sekwencji DNA. Występują jako tandemowe powtórzenia krótkich jednostek (sekwencji) o długości od 1 do 6 nukleotydów np. : O polimorfizmie (różnorodności) mikrosatelitów stanowi zmienność liczby powtórzeń krótkich sekwencji, sekwencji która w zależności od locus może wahać się od kilku do ponad trzydziestu: 14 Mikrosatelity Typowy locus mikrosatelitarny składa się zatem z obszaru DNA, w ramach którego występują sekwencje powtarzające się, oraz z konserwatywnych fragmentów końcowych, które są podstawą do wyznaczenia (opracowania) starterów – oligonukleotydów o długości ok. 20 nukleotydów wykorzystywanych w reakcji PCR. 5’ CTACCCGAACACACACACACATTTCGACATTA 3’ 3’ GATGGGCTTGTGTGTGTGTGTAAAGCTGTAAT 5’ fragment końcowy, flankujący fragment końcowy, flankujący mikrosatelita 15 Mikrosatelity Zalety i wady mikrosatelitów Zalety • wykazują wysoki polimorfizm • kodominacyjny system dziedziczenia • genotyp można analizować na podstawie każdej tkanki, z której można wyizolować DNA • analizy laboratoryjne są wysoce powtarzalne, a sam proces można w dużym stopniu zautomatyzować Wady • stosunkowo wysokie koszty wyposażenia laboratoryjnego • umiarkowanie wysokie koszty analiz laboratoryjnych • podawana przez niektórych autorów podatność tych markerów na zmienność mutacyjną oraz błędy określania genotypów wynikające m.in. z występowania alleli null 16 Dziękuję za uwagę [email protected] autorki prezentacji: E. Kaczmarek, A. Pasławska Zdjęcia w prezentacji: www.corbis.com Internet A.Pasławska M.Pałucka Wykorzystano m.in. Markery mikrosatelitarne DNA i ich wykorzystanie w badaniach z zakresu genetyki drzew leśnych, J.Burczyk 17
