Receptory chemokin z motywem CC w układzie nerwowym

advertisement
Receptory chemokin z motywem CC w układzie nerwowym
Tomasz Łukasz Radzik
1
Andrzej Głąbiński2
Ludmiła Żylińska1,*
Zakład Neurochemii Molekularnej, Uniwersytet Medyczny, Łódź
2
Klinika Neurologii i Udarów Mózgu, Uniwersytet Medyczny, Łódź
1
Zakład
Neurochemii
Molekularnej,
Uniwersytet Medyczny w Łodzi, ul.
Mazowiecka 6/8, 92-215 Łódź; tel.: (42) 272 56
80, e-mail: [email protected]
*
Artykuł otrzymano 24 października 2015 r.
Artykuł zaakceptowano 28 października
2015 r.
Słowa kluczowe: chemokiny, receptory chemokin CC, układ nerwowy, neurodegeneracja
Wykaz skrótów: CCL – chemokina z motywem CC; CCR — receptor chemokin z motywem CC;
Podziękowania: Praca powstała w trakcie realizacji projektów badawczych nr 502-03/6086-02/502-64-086 oraz 503/6-086-02/503-01
Uniwersytetu Medycznego w Łodzi.
STRESZCZENIE
C
hemotaktyczne cytokiny (chemokiny) są tradycyjnie znane jako istotne mediatory procesów zapalnych, jednak od niedawna zwraca się również uwagę na ich inne funkcje w
organizmie. Chemokiny działając poprzez specyficzne receptory należące do białek G regulują procesy immunologiczne w organizmie. Dotychczas zidentyfikowano około 20 receptorów chemokin, zaś 10 z nich wiąże chemokiny z motywem CC, tzn. posiadające w końcu aminowym cząsteczki dwie sąsiadujące reszty cysteiny. Wzrastająca liczba danych wskazuje, że
chemokiny oraz ich receptory odgrywają istotną rolę w układzie nerwowym działając jako
czynniki troficzne i ochronne zwiększające przeżywalność neuronów, regulujące migrację
neuronalną oraz transmisję synaptyczną. Szczególną rolę pełnią przede wszystkim w procesach chorobowych układu nerwowego, bowiem na skutek uszkodzenia bariery krew-mózg
oraz bariery krew-płyn rdzeniowo/mózgowy następuje infiltracja leukocytów i rozwija się
stan zapalny. Udział receptorów chemokin z motywem CC wykazano m.in. w chorobie Alzheimera, stwardnieniu rozsianym, demencji związanej z infekcją HIV, udarem czy niektórymi nowotworami.
WPROWADZENIE
Spośród aktywnych biologicznie cząsteczek jedną z ważniejszych grup stanowią chemokiny, należące do rodziny cytokin. Główną funkcją chemokin jest
stymulacja chemotaksji leukocytów, stąd też ich nazwa oznaczająca skrót od
terminu cytokiny chemotaktyczne (ang. chemoattractant cytokine). Cechą, która
wyróżnia je spośród innych chemoatraktantów jest ich specyficzność wobec różnych typów leukocytów, szczególnie istotna w stanach patologicznych.
W ośrodkowym układzie nerwowym istotnym elementem utrzymującym homeostazę jest bariera krew-mózg (BBB, ang. blood-brain barier), stanowiąca dość
złożony system będący granicą pomiędzy naczyniami krwionośnymi a tkanką
nerwową. Anatomicznie tworzy go śródbłonek mózgowych naczyń włosowatych, co pozwala na kontrolowany przepływ związków zawartych we krwi,
często wymagających aktywnego transportu, a także chroni mózg przed niekontrolowanym napływem czynników szkodliwych. Kolejnym elementem ochronnym jest bariera krew-płyn rdzeniowo/mózgowy (ang. blood cerebrospinal fluid
barrier, blood-CSF) zbudowana z nabłonka splotów naczyniówki. W warunkach
uszkodzenia obu barier dochodzi do niekontrolowanego przepływu zarówno
elementów morfotycznych krwi, jak i mediatorów reakcji zapalnych, w tym chemokin [1].
W ostatnich latach coraz więcej uwagi poświęca się znaczeniu sygnalizacji
z udziałem chemokin w układzie nerwowym, bowiem jej udział został udokumentowany w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych [2]. Choć
neuronalne chemokiny działając poprzez receptory funkcjonują jako czynniki
troficzne i ochronne zwiększające przeżywalność neuronów, regulujące migrację neuronalną oraz transmisję synaptyczną, szczególne znaczenie tego systemu
neuromodulatorów postuluje się w rozwoju procesów neurodegeneracyjnych.
Pod wpływem czynników patogennych poziom chemokin wzrasta za sprawą
wydzielania ich przez wiele różnych komórek: mikrogleju, astrocytów, oligodendrocytów, komórek śródbłonka naczyń krwionośnych w mózgu i neuronów
[3,4]. Warto podkreślić, że pojawiło się także szereg doniesień wiążących chemokiny z niektórymi chorobami psychicznymi, takimi jak depresja, schizofrenia
czy afektywna choroba dwubiegunowa [5,6].
CHEMOKINY
Historycznie, chemokiny były znane pod wieloma nazwami, jak również
poszczególne chemokiny posiadają wiele różnych nazw. W celu ujednolicenia
terminologii wprowadzono nowe nazewnictwo, w którym chemokiny zostały
podzielone na cztery grupy: CXC (α), CC (β), CX3C (γ) i C (δ) [7]. Podział opie-
436www.postepybiochemii.pl
Tabela 1. Nomenklatura chemokin z motywem CC i ich wcześniejsze nazewnictwo.
CCL1
TCA3
Scya1
SISε
I-309
P500
CCL12
MCP-5
Scya12
CCL2
MCP-1
Scya2
Sigje
HC11
GDCF-2
CCL13
MCP-4
Scya13
NCC1
Ck-beta-10
SCYL1
CCL22
ABCD-1
Scya22
DC/B-Ck
MDC
STCP-1
CCL23
MPIF-1
Scya23
HMRP-2A
Ck-beta-8
CCL3
MIP-1α
Scya3
LD78
SCI
TY5
CCL14
HCC1
Scya14
HCC3
NCC2
Ck-beta-1
MCIF
SCYL2
CCL24
MPIF-2
Scya24
Ck-beta-6
eotaxin-2
CCL4
MIP-1β
Scya4
ACT-2
G26
H400
CCL15
HCC2
Scya15
NCC3
MIP-5
Lkn-1
MIP-1δ
HMRP-2B
CCL25
TECK
Scya25
CCL5
RANTES
Scya5
SISδ
TCP228
CCL6
MRP-1
Scya6
C10
CCL16
HCC4
Scya16
LMC
NCC4
LEC
Monotactin-1
LCC1
CCL26
MIP-4α
Scya26
eotaxin-3
IMAC
TSC-1
CCL17
TARC
Scya17
ABCD-2
ra się na liczbie reszt aminokwasowych pomiędzy dwiema
resztami cysteiny przy końcu aminowym cząsteczki, gdzie
C oznacza resztę cysteinową, a X reprezentuje inne reszty
aminokwasowe. Chemokiny są generalnie małymi zasadowymi peptydami o masie od 7 do 15 kDa. Wszystkie mają
też podobną budowę i zwykle posiadają cztery reszty cysteinowe, które tworząc mostki disiarczkowe decydują o
ich trójwymiarowej strukturze. Aktualnie zidentyfikowano
u ssaków ponad 50 chemokin, a ze względu na pełnioną
funkcję można podzielić je na chemokiny homeostatyczne
i chemokiny prozapalne [8]. Chemokiny homeostatyczne są
wydzielane cały czas i odpowiadają za prawidłową migrację komórek, np. podczas wzrostu organizmu, zaś chemokiny prozapalne wydzielane są w stanach patologicznych pod
wpływem czynników prozapalnych.
Aby komórka mogła zareagować na obecność chemokin musi posiadać odpowiednie receptory. Funkcjonalnie
receptory chemokin można przydzielić do jednej z dwóch
grup. Pierwsza z nich to rozległa rodzina klasycznych receptorów związanych z białkiem G, które pod wpływem
zewnątrzkomórkowego liganda aktywują różne systemy
sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Drugą grupą są tzw.
atypowe receptory chemokin, które przekazują sygnał bez
udziału białek G i działają głównie jako „wychwytywacze”
chemokin ograniczając stan zapalny, bądź kształtując gradienty chemokin. Do klasy CC, która stanowi największą
grupę, należy 28 chemokin (CCL1-28), a ich geny zlokalizowane są u człowieka na 17 chromosomie [2]. Klasa chemokin CC działa poprzez przynajmniej 10 znanych receptorów
(CCR1-10). Aktualnie obowiązująca nomenklatura chemokin oraz ich zwyczajowe nazwy podane są w tabeli 1.
RECEPTORY CHEMOKIN
Zasadniczy podział receptorów opiera się na rodzaju
wiązanych przez nie chemokin, co odzwierciedlone jest
Postępy Biochemii 61 (4) 2015
CCL27
ALP
Scya27
CTACK
ESkine
ILC
PESKY
CCL7
MCP-3
Scya7
FIC
NC28
MARC
CCL18
AMAC-1
Scya18
Ck-beta-7
PARC
DC-CK1
CCL8
MCP-2
Scya8
HC14
CCL9
MRP-2
Scya9
CCF18
MIP-1γ
CCL11
eotaxin
Scya11
CCL19
MIP-3β
Scya19
ELC
exodus-3
CCL20
MIP-3α
Scya20
ST38
Ck-beta-4
LARC
exodus-1
CCL21
TCA-4
Scya21
6Ckine
Ck-beta-9
exodus-2
SLC
CCL28
MEC
Scya28
w nazewnictwie i tak, wyróżniamy 4 typy: CCR, CXCR,
CX3CR i XCR. Atypowe receptory natomiast określane są
zbiorczym skrótem ACKR (ang. atypical chemokine receptors) i należy do nich 6 przedstawicieli [9]. Nazewnictwo
chemokin i receptorów nie oznacza jednak, że jeden receptor wiąże się tylko z jedną chemokiną, a i jedna chemokina
nie wiąże się tylko z jednym receptorem (Ryc. 1). Cechą
determinującą wiązanie jest powinowactwo danej chemokiny do receptora oraz gęstość receptorów poszczególnych
typów obecnych w komórce. Poszczególne receptory są w
około 50% homologiczne w obrębie tej samej klasy, a w
30% pomiędzy różnymi klasami [2,4]. Wszystkie jednak
posiadają te same główne elementy budowy, a mianowicie
składają się z około 350 reszt aminokwasowych, część N-końcowa jest krótka i kwasowa, część N-końcowa i trzy
zewnętrzne pętle zawierają reszty cysteinowe, między
którymi formują się mostki disiarczkowe, zaś część wewnątrzkomórkowa zawiera reszty seryny i treoniny, które
w czasie aktywacji receptora ulegają fosforylacji [2]. Choć
receptory z motywem CC nie stanowią najliczniejszej grupy występującej w układzie nerwowym, w ostatnich latach coraz więcej przedstawicieli tej klasy identyfikowane
jest zarówno w prawidłowym rozwoju i funkcjonowaniu
OUN, jak również wykazano ich udział w procesach neurodegeneracyjnych [10,11].
CCR1
Gen receptora CCR1 u człowieka zlokalizowany jest na
chromosomie 3. Receptor z największym powinowactwem
wiąże się z chemokinami CCL3 i CCL5, ale także łączy się
z CCL7, CCL8, CCL14, CCL15, CCL16 i CCL23 [2,12]. Interesującą jest obserwacja, że chemokina CCL4 antagonizuje
odpowiedź receptora wobec innych ligandów i może funkcjonować jako endogenny inhibitor aktywności CCR1 [13].
Powinowactwo CCL15 i CCL23 zwiększa się w czasie odpowiedzi zapalnych [12]. Jak każdy receptor, CCR1 bierze
437
mokiny CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CCL14, CCL11, CCL24
i CCL26. Spośród wszystkich ligandów CCL11 wiąże się
z najwyższym powinowactwem (Kd = 0,1 nM), zaś wartości Kd dla CCL5 i CCL7 mieszczą się w zakresie 2,7–3 nM.
CCL11 [18], CCL24, CCL26 są wyłącznymi ligandami dla
receptora CCR3, a interesującym jest fakt, że CCL11 i CCL26
są jednocześnie antagonistami dla innych receptorów CC.
Zwiększoną ekspresję genu CCR3 zaobserwowano w różnych komórkach zapalnych związanych z odpowiedzią
alergiczną. Szczególną rolę receptor CCR3 wraz z CCR5 odgrywa w chorobach neurologicznych indukowanych wirusem HIV, obecnym w zainfekowanych makrofagach i astrocytach [19]. Receptory te działając jako koreceptory dla HIV
obecne są także w neuronach. W warunkach fizjologicznych
obecność CCR3 wykazano w hipokampie oraz neuronach
piramidalnych kory, a także w neuronach płodu [20]. W
prekursorowych oligodendrocytach aktywacja CCR3 przez
CCL11 może regulować proces tworzenia osłonek mielinowych [21].
CCR4
Rycina 1. Receptory chemokin CC i łączące się z nimi chemokiny. Receptory
chemokin mogą wiązać wiele chemokin, jak również niektóre chemokiny mogą
wykazywać powinowactwo do kilku receptorów.
udział w odpowiedzi immunologicznej poprzez regulację
migracji komórek odpornościowych.
CCR2
CCR2 jest receptorem dla CCL2, CCL7, CCL8, CCL12 i
CCL13. U człowieka jego gen zlokalizowany jest na chromosomie 3. Może występować w dwóch izoformach powstających w procesie alternatywnego składania transkryptów
(CCR2A i CCR2B) [14]. Różnią się one budową domeny przy
końcu karboksylowym receptora oraz obecnością w komórce. Izoforma CCR2A występuje głównie w cytoplazmie, natomiast CCR2B w cytoplazmie i na powierzchni komórki. W
mózgowiu receptor CCR2 na poziomie mRNA oraz białka
wykryto w wielu obszarach, m.in. w korze, hipokampie,
przysadce, pniu mózgu oraz móżdżku [15]. Konstytutywny
typ ekspresji świadczy o istotnej roli tego receptora w sygnalizacji neuronalnej, w tym związanej z neurotransmisją
cholinergiczną i dopaminergiczną [16]. Warto dodać, że infiltracja monocytów pod wpływem wiązania CCL2 z CCR2
zaangażowana jest w uruchamianie kaskady neurodegeneracyjnej w wielu chorobach mózgu.
CCR3
Podobnie jak dwa poprzednie, gen tego receptora u człowieka występuje na 3 chromosomie. CCR3 wykazuje 63%
homologię z sekwencją CCR1 i 51% z CCR2, natomiast w
przeciwieństwie do innych receptorów z tej klasy nie posiada miejsc N-glikozylacji [17]. Receptor CCR3 wiąże che-
Receptor chemokin CCR4 jest receptorem dla CCL17
oraz CCL22. U człowieka zlokalizowany jest na chromosomie 3. W ośrodkowym układzie nerwowym mRNA dla tego
receptora obecne jest w astrocytach, mikrogleju, a także w
neuronach hipokampa [22]. Szczególnie bogate w CCR4 są
komórki T oraz komórki NK (ang. natural killer cell) zaangażowane przede wszystkim w proces niszczenia komórek
nowotworowych [23].
CCR5
Gen receptora CCR5 zlokalizowany jest w pobliżu genu
CCR2, także na chromosomie 3. CCR5 jest receptorem dla
CCL3, CCL4, CCL8 i CCL5. Reguluje on migrację limfocytów Th1, a także monocytów, makrofagów, niedojrzałych
komórek dendrytycznych i mikrogleju [24]. Fakt, że obecność receptora CCR5 w neuronach obserwowana jest już
w stadium embrionalnym sugeruje potencjalny jego udział
w ontogenezie, potwierdzając troficzne działanie w tkance
nerwowej [25]. Wydaje się więc, że fizjologiczna rola CCR5
związana jest z regulacją strukturalnych zmian w trakcie
rozwoju mózgu, takich jak rozwój i tworzenie połączeń neuronów oraz ich przeżywalność [26]. Receptor CCR5 wiązany jest także z patogenezą wielu chorób zapalnych — miażdżycy czy stwardnienia rozsianego. Potwierdzają to mysie
modele miażdżycy pozbawione genu CCR5 [27]. Ponadto,
jak wspomniano wcześniej, CCR5 działa jako koreceptor dla
HIV-1, a ludzie ze zmutowanym receptorem CCR5 wykazują praktycznie całkowitą odporność na infekcję wirusem
HIV-1 [19].
CCR6
U człowieka gen tego receptora występuje na chromosomie 6. CCR6 jest specyficznym receptorem dla chemokiny CCL20. Występuje głównie na niedojrzałych komórkach dendrytycznych, limfocytach B i komórkach T [28].
Wydzielenie CCL20 powoduje rekrutację limfocytów B
posiadających receptory CCR6. Istotne znaczenie może
mieć fakt, że CCL20 ulega konstytutywnej ekspresji w ko-
438www.postepybiochemii.pl
Rycina 2. Ścieżki sygnałowe uruchamiane aktywacją receptora chemokin. Przedstawiono główne szlaki sygnalizacyjne uruchamiane przez chemokiny oraz efekty ich
działania w komórce. Skróty i symbole zastosowane na rycinie: α, β, γ — podjednostki białka G; AC1 — cyklaza adenylanowa; cAMP — cykliczny adenozynomonofosforan; PLC-β1 — izoforma fosfolipazy C; IP3 — trisfosforan inozytolu; DAG — diacyloglicerol; PKC — kinaza białkowa C; Pyk2 — kinaza tyrozynowa bogata w prolinę 2;
ERK 1/2 — kinaza regulowana sygnałem zewnątrzkomórkowym; PI-3K — kinaza fosfatydyloinozytolu-3; PKB/Akt — kinaza białkowa B; STIM1 (ang. stromal interaction
molecule 1) — czujnik Ca2+, białko aktywujące pojemnościowy napływ wapnia; CRACM1 — kanał wapniowy aktywowany uwolnieniem Ca2+ z siateczki śródplazmatycznej; CaM — kalmodulina; CaN — kalcyneuryna; NFATC1 — czynnik transkrypcyjny aktywowanych komórek T 1; IL-2 — interleukina 2.
mórkach nabłonkowych splotu naczyniówkowego u myszy i u człowieka [29]. Sugeruje się, że działanie CCL20/
CCR6 w chorobach zapalnych powoduje migrację komórek T produkujących interleukinę-17 (TH-17) do miejsca
zapalenia. Ostatnie badania wykazały, że komórki Th17
mogą przedostawać się do ośrodkowego układu nerwowego poprzez splot naczyniówkowy wykorzystując
układ CCR6/CCL20 [30]. Może to świadczyć o kontrolnej
funkcji immunologicznej pełnionej przez ten receptor w
układzie nerwowym.
CCR7
Gen dla tego receptora zlokalizowany jest na chromosomie 11. CCR7 jest receptorem dla chemokin CCL19 i
CCL21. Wraz ze swoimi ligandami CCR7 łączy odporność wrodzoną i nabytą wpływając na oddziaływania
między komórkami T i komórkami dendrytycznymi [31].
Komórki T wnikają do węzłów chłonnych przez żyłki,
których śródbłonek wydziela CCL21. Z kolei komórki
dendrytyczne i makrofagi wchodzą do węzłów poprzez
naczynia limfatyczne. Spotkanie limfocytów T i komórek
dendrytycznych jest zależne od CCR7. Występowanie
CCR7 na komórkach nowotworowych jest związane z ich
przerzutami do węzłów chłonnych. Wykazano, że CCR7
pośredniczy w migracji białaczkowych limfocytów T do
Postępy Biochemii 61 (4) 2015
ośrodkowego układu nerwowego wykorzystując ścieżkę
sygnalizacyjną związaną z Noth1 [32,33].
CCR8
Jak wiele poprzednich, gen dla tego receptora u człowieka
znajduje się na chromosomie 3. Receptor CCR8 wiąże chemokinę CCL1. Występuje on na niektórych grupach komórek T, monocytach, makrofagach, eozynofilach, tymocytach,
komórkach Langerhansa, neuronach i komórkach mięśni
gładkich naczyń [34,35]. Aktywacja receptora CCR8 przez
CCL1 powoduje migrację monocytów i apoptozę komórek
grasicy [36]. Uważa się, że CCR8 może być alternatywnym
ko-receptorem dla CD4 w infekcji wirusem HIV [37].
CCR9
U człowieka gen dla tego receptora występuje na chromosomie 9. Receptor CCR9 wiąże specyficznie chemokinę
CCL25. Przypisuje mu się udział w rozwoju komórek T w
grasicy, zaś kompleks CCR9/CCL25 pełni istotną rolę w
oporności komórek na apoptozę [38,39]. Wykazano także
zwiększoną obecność CCR9 w aktywowanych komórkach
mikrogleju w mysim modelu, co wiąże się bezpośrednio z
indukcją procesów zapalnych oraz neurodegeneracji [40].
439
CCR10
Gen receptora znajduje się na chromosomie 17. CCR10
jest receptorem dla CCL27 i CCL28. Występuje na małej
podgrupie pamięciowych komórek T, komórek wydzielających IgA, komórek śródbłonka mikronaczynek skórnych i melanocytach [41-43].
MECHANIZM DZIAŁANIA RECEPTORÓW CHEMOKIN
Główną drogą działania receptorów chemokin z motywem CC są heterotrimeryczne białka G związane przede
wszystkim z Gi/o, co prowadzi do hamowania aktywności cyklazy adenylanowej oraz reguluje przepływ Ca2+ [2].
Nowsze badania wykazały, że receptory CC mogą łączyć
się również z innymi białkami G, potencjalnie wpływając
na wiele wewnątrzkomórkowych ścieżek sygnałowych
oraz transkrypcję genów [44]. Aktywacja białka G powoduje dysocjację heterotrimeru na podjednostki α i βγ.
Większość odpowiedzi na aktywację receptora chemokin
CC można zablokować za pomocą toksyny PTX. Aktywowane białko G uruchamia kilka równoległych ścieżek sygnałowych [2]. Podjednostka α powoduje spadek aktywności wspomnianej cyklazy adenylanowej, natomiast kilka innych ścieżek może być aktywowanych przy udziale
jednostek βγ (Ryc. 2). Aktywacja specyficznej fosfolipazy
fosfatydyloinozytolowej C (PLC) prowadzi do powstania
diacyloglicerolu (DAG) i trisfosforanu 1,4,5-inozytolu
(IP3), który wiążąc się z receptorem w siateczki śródplazmatycznej uwalnia wewnątrzkomórkowe zapasy jonów
wapnia. Diacyloglicerol oraz jony wapnia aktywują różne izoformy kinazy białkowej C. Takie działanie chemokin zostało najlepiej zbadane i służy jako swego rodzaju
marker funkcjonalnej ekspresji genów ich receptorów w
komórkach. Opróżnienie siateczki śródplazmatycznej z
zapasów jonów wapnia uruchamia tzw. pojemnościowy
napływ wapnia poprzez kanały CRAC (ang. calcium release-activated channel). Następuje przemieszczenie białka
STIM1 do błony komórkowej i aktywacja CRACM1 [45].
Zwiększony poziom Ca2+ w cytosolu indukuje tworzenie
kompleksu Ca2+/kalmodulina, który aktywuje kalcyneurynę. Defosforylacja przez kalcyneurynę czynnika transkrypcyjnego NFATc1 powoduje jego przemieszczenie do
jądra i rozpoczęcie transkrypcji interleukiny 2 (IL-2). Sygnalizacja uruchamiana przez IL-2 wywołuje proliferację
komórki [45].
Kolejna ścieżka sygnałowa uruchamiana jest na skutek
aktywacji kinazy fosfatydyloinozytolowej-3-OH (PI3K)
[46]. Prowadzi ona do akumulacji trisfosforanu 3,4,5-fosfatydyloinozytolu, który jest aktywatorem kinazy białkowej PKB/Akt. Kinaza ta jest związana z wieloma różnymi
ścieżkami sygnałowymi regulującymi przeżywalność komórek. Ponadto, wiele chemokin aktywuje ścieżkę kinazy
białkowej MAPK prowadzącą do aktywacji kinazy ERK1/2 i zależnej od wapnia kinazy Pyk2 [46,47].
Warto nadmienić, że w ostatniej dekadzie coraz większe znaczenie w regulacji działania receptorów chemokin
przypisuje się zjawisku oligomeryzacji, które w specyficzny sposób modyfikuje odpowiedź na wiązanie chemokin.
Receptory mogą tworzyć homo- lub heterooligomery, zaś
skład takich kompleksów decyduje o ich powinowactwie
do chemokin, co w konsekwencji może prowadzić do
uruchamiania odmiennych ścieżek sygnalizacyjnych [48].
RECEPTORY CHEMOKIN CC W CHOROBACH
NEURODEGENERACYJNYCH
W stanach zapalnych w ośrodkowym układzie nerwowym szczególną rolę odgrywa proces migracji komórek,
które pozostają w kontakcie z płynem rdzeniowo-mózgowym oraz barierą krew–mózg. Komórki takie, jak T, B
czy dendrytyczne (DCs, ang. dendritic cells) znajdowane
są w wielu chorobach neurodegeneracyjnych zarówno w
płynie rdzeniowo-mózgowym, jak i w ośrodkowym układzie nerwowym [49].
W chorobie Alzheimera nie tylko limfocyty T, lecz
także monocyty i komórki B migrują przez barierę krew-mózg. Powoduje to, że zwiększone stężenie prozapalnych chemokin obserwuje się zarówno w tkankach peryferyjnych, jak i w mózgu. Postuluje się, że zaburzenia
układu chemokin oraz ich receptorów prowadzi do akumulacji komórek mikrogleju w blaszkach amyloidowych,
powodując w konsekwencji śmierć neuronów. Wykazano także zwiększoną obecność receptorów CCR2, CCR4,
CCR5 i CCR6, co potencjalnie wiąże się z uszkodzeniem
mózgu [50]. Udział receptorów CCR6 potwierdzają także
badania na mysim transgenicznym modelu choroby Alzheimera [51]. Interesującą informacją była obserwacja,
że receptor CCR4 oprócz choroby Alzheimera, wydaje się
brać udział w procesie przerzutowania do mózgu czerniaka, formy nowotworu o bardzo niekorzystnym rokowaniu [52]. CCR4 może zatem stanowić cenny molekularny marker ułatwiający podjęcie optymalnej terapii.
Zaburzenia odpowiedzi immunologicznej prowadzą
do patologicznych reakcji autoimmunologicznych, zaś
receptory CCR1 oraz CCR5 wiązane są z chorobami takimi jak stwardnienie rozsiane czy alergiczne stany zapalne
[53,54]. Migracja autoagresywnych limfocytów T poprzez
barierę krew-mózg jest nieodłącznym elementem indukujacym eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie
mózgu i rdzenia, będące zwierzęcym modelem ludzkiego stwardnienia rozsianego (EAE, ang. experimental autoimmune encephalomyelitis). Model ten charakteryzuje się
infiltracją komórek jednojądrzastych oraz demielinizacją
i pozwala na w miarę dokładną analizę niektórych molekularnych aspektów choroby. Wykazano na przykład,
że wzrost zawartości CCR4 towarzyszy indukcji EAE
[55,56]. Stwierdzono także, że limfocyty T produkujące
interleukinę 17 mogą przenikać do ośrodkowego układu
nerwowego poprzez splot naczyniówkowy wykorzystując mechanizm angażujący receptor CCR6 [57]. W przewlekłym, nawracającym eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia zwiększała się
ilość receptorów CCR7 i CCR8, lecz tylko podczas pierwszego oraz drugiego nawrotu choroby. Wzrost ten wyraźnie korelował ze stopniem nasilenia choroby i obecny
był głównie w okołonaczyniowych naciekach zapalnych
w ośrodkowym układzie nerwowym [58]. Indukowana
synteza CCR8 łączona jest nie tylko z EAE, lecz także ze
440www.postepybiochemii.pl
stwardnieniem rozsianym, udarem oraz postępującą wieloogniskową leukoencefalopatią [59]
Jednym ze skutków zakażenia wirusem HIV dotyczącym układu nerwowego jest demencja. Zaobserwowano, że w mózgowiu pacjentów cierpiących na demencję
związaną z HIV oraz przy zapaleniu mózgu związanym z
HIV wzrastała ilość chemokin i ich receptorów. Szczególnie wysoki był poziom receptorów CCR1, CCR3 i CCR5
w komórkach mikrogleju, a także podwyższona była zawartość chemokin CCL2, CCL3 i CCL5 [60]. Ponadto, receptory CCR3 występowały na neuronach piramidalnych
hipokampu oraz w części śródwęchowej kory. W zapaleniu mózgu związanym z HIV obniżała się jednocześnie
aktywność receptorów CCR5 w regionach CA3 i CA4 mózgu [61].
Interesującym doniesieniem są najnowsze badania
na japońskich pacjentach z narkolepsją, które wykazały związek tego schorzenia z punktowymi mutacjami w
regionie promotorowym receptorów CCR1 i CCR3 [62].
Chorzy na narkolepsję wykazywali także znacząco niższy poziom tych receptorów w komórkach krwi krążącej,
w porównaniu do osób zdrowych. Sugeruje to także, że
narkolepsja zmienia odporność immunologiczną pacjentów.
Niniejsza praca nie wyczerpuje na pewno wszystkich
dostępnych informacji związanych z udziałem receptorów chemokin z motywem CC w funkcjonowaniu układu
nerwowego. Należy także pamiętać, że nie wszystkie receptory działają w układzie nerwowym i w osamotnieniu.
Wprost przeciwnie, współzależność działania wszystkich
4 klas decyduje o ostatecznej odpowiedzi komórek nerwowych na sygnalizację uruchamianą przez chemokiny.
Szeroko prowadzone badania nad ich rolą obejmują bowiem bardzo różnorodny materiał biologiczny, w tym
patologiczny, modele zwierzęce oraz linie komórkowe.
Poznanie molekularnych mechanizmów leżących u podstaw zmian neurodegeneracyjnych angażujących receptory chemokin CC będzie ważnym krokiem w kierunku
nie tylko poznania przyczyn chorób układu nerwowego,
lecz także opracowania i wdrożenia skutecznych metod
terapii.
PIŚMIENNICTWO
1. Engelhardt B, Ransohoff RM (2012) Capture, crawl, cross: the T cell
code to breach the blood-brain barriers. Trends Immunol 33: 579-589
2. White GE, Iqbal AJ, Greaves DR (2013) CC chemokine receptors and
chronic inflammation - therapeutic opportunities and pharmacological challenges. Pharmacol Rev 65: 47-89
3. Rostène W, Dansereau MA, Godefroy D, Van Steenwinckel J, Reaux-Le Goazigo A, Mélik-Parsadaniantz S, Apartis E, Hunot S, Beaudet
N, Sarret P (2011) Neurochemokines: a menage a trois providing new
insights on the functions of chemokines in the central nervous system.
J Neurochem 118: 680-694
4. Rostène W, Guyon A, Kular L, Godefroy D, Barbieri F, Bajetto A, Banisadr G, Callewaere C, Conductier G, Rovère C, Mélik-Parsadaniantz
S, Florio T (2011) Chemokines and chemokine receptors: new actors in
neuroendocrine regulations. Front Neuroendocrinol 32: 10-24
5. Stuart MJ, Baune BT (2014) Chemokines and chemokine receptors in
mood disorders, schizophrenia, and cognitive impairment: a systematic review of biomarker studies. Neurosci Biobehav Rev 42: 93-115
Postępy Biochemii 61 (4) 2015
6. Stuart MJ, Singhal G, Baune BT (2015) Systematic review of the neurobiological relevance of chemokines to psychiatric disorders. Front Cell
Neurosci 9: 357
7. Bachelerie F, Ben-Baruch A, Burkhardt AM, Combadiere C, Farber
JM, Graham GJ, Horuk R, Sparre-Ulrich AH, Locati M, Luster AD,
Mantovani A, Matsushima K, Murphy PM, Nibbs R, Nomiyama H,
Power CA, Proudfoot AE, Rosenkilde MM, Rot A, Sozzani S, Thelen
M, Yoshie O, Zlotnik A (2013) Update on the extended family of chemokine receptors and introducing a new nomenclature for atypical
chemokine receptors. Pharmacol Rev 66: 1-79
8. Takeshita Y, Ransohoff RM (2012) Inflammatory cell trafficking across
the blood-brain barrier (BBB): Chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev 248: 228-239
9. Bachelerie F, Graham GJ, Locati M, Mantovani A, Murphy PM, Nibbs
R, Rot A, Sozzani S, Helen M (2014) New nomenclature for atypical
chemokine receptors. Nature Immunol 15: 207-208
10. Hu X, Liou AK, Leak RK, Xu M, An C, Suenaga J, Shi Y, Gao Y, Zheng
P, Chen J (2014) Neurobiology of microglial action in CNS injuries:
receptor mediated signaling mechanisms and functional roles. Prog
Neurobiol 119-120: 60-84
11. Mines M, Ding Y, Fan G-H (2007) The many roles of chemokine receptors in neurodegenerative disorders: emerging new therapeutical
strategies. Curr Med Chem 14: 2456-2470
12. Berahovich RD, Miao Z, Wang Y, Premack B, Howard MC, Schall TJ
(2005) Proteolytic activation of alternative CCR1 ligands in inflammation. J Jmmunol 174: 7341-7345
13. Chou C-C, Fine JS, Pugliese-Sivo C, Gonsiorek W, Davies L, Deno G,
Petro M, Schwarz M, Zavodny PJ, Hipkin RW (2002) Pharmacological
characterization of the chemokine receptor, hCCR1 in a stable transfectant and differentiated HL-60 cells: antagonism of hCCR1 activation
by MIP-1b. Br J Pharmacol 137: 663-675
14. Wong LM, Myers SJ, Tsou CL, Gosling J, Arai H, Charo IF (1997) Organization and differential expression of the human monocyte chemoattractant protein 1 receptor gene. Evidence for the role of the carboxyl-terminal tail in receptor trafficking. J Biol Chem 272: 1038-1045
15. Banisadr G, Quéraud-Lesaux F, Boutterin MC, Pélaprat D, Zalc B,
Rostène W, Haour F, Parsadaniantz SM (2002) Distribution, cellular
localization and functional role of CCR2 chemokine receptors in adult
rat brain. J Neurochem 81: 257-269
16. Banisadr G, Gosselin RD, Mechighel P, Rostène W, Kitabgi P, Mélik
Parsadaniantz S (2005) Constitutive neuronal expression of CCR2
chemokine receptor and its colocalization with neurotransmitters in
normal rat brain: functional effect of MCP-1/CCL2 on calcium mobilization in primary cultured neurons. J Comp Neurol 492: 178-192
17. Ponath PD, Qin S, Post TW, Wang J, Wu L, Gerard NP, Newman W,
Gerard C, Mackay CR (1996) Molecular cloning and characterization
of a human eotaxin receptor expressed selectively on eosinophils. J
Exp Med 183: 2437-2448
18. Daugherty BL, Siciliano SJ, DeMartino JA, Malkowitz L, Sirotina A,
Springer MS (1996) Cloning, expression, and characterization of the
human eosinophil eotaxin receptor. J Exp Med 183: 2349-2354
19. Klein RS, Williams KC, Alvarez-Hernandez X, Westmoreland S, Force
T, Lackner AA, Luster AA (1999) Chemokine receptor expression and
signaling in macaque and human fetal neurons and astrocytes: implications for the neuropathogenesis of AIDS. J Immunol 163: 1636-1646
20. Van Der Meer P, Goldberg SH, Fung KM, Sharer LR, González-Scarano F, Lavi E (2001) Expression pattern of CXCR3, CXCR4, and CCR3
chemokine receptors in the developing human brain. J Neuropathol
Exp Neurol 60: 25-32
21. Maysami S, Nguyen D, Zobel F, Heine S, Höpfner M, Stangel M (2006)
Oligodendrocyte precursor cells express a functional chemokine receptor CCR3: implications for myelination. J Neuroimmunol 178: 1723
22. Flynn G, Maru S, Loughlin J, Romero IA, Male D (2003) Regulation of
chemokine receptor expression in human microglia and astrocytes. J
Neuroimmunol 136: 84-93
441
23. Meucci O, Fatatis A, Simen AA, Bushell TJ, Gray PW, Miller RJ (1998)
Chemokines regulate hippocampal neuronal signaling and gp120 neurotoxicity. Proc Natl Acad Sci USA 95: 14500-14505
24. Oppermann M (2004) Chemokine receptor CCR5: insights into structure, function, and regulation. Cell Signal 16: 1201-1210
25. Bouteta A, Salim H, Leclerc P, Tardieu M (2001) Cellular expression
of functional chemokine receptor CCR5 and CXCR4 in human embryonic neurons. Neurosci Lett 311: 105-108
26. Kieseier BC, Tani M, Mahad D, Oka N, Ho T, Woodroofe N, Griffin
JW, Toyka KV, Ransohoff RM, Hartung HP (2002) Chemokines and
chemokine receptors in inflammatory demyelinating neuropathies: a
central role for IP-10. Brain 125: 823-834
27. Quinones MP, Martinez HG, Jimenez F, Estrada CA, Dudley M, Willmon O, Kulkarni H, Reddick RL, Fernandes G, Kuziel WA, Ahuja SK,
Ahuja SS (2007) CC chemokine receptor 5 influences late-stage atherosclerosis. Atherosclerosis 195: e92-103
28. Coughlan CM, McManus CM, Sharron M, Gao Z, Murphy D, Jaffer S,
Choe W, Chen W, Hesselgesser J, Gaylord H, Kalyuzhny A, Lee VM,
Wolf B, Doms RW, Kolson DL (2000) Expression of multiple functional
chemokine receptors and monocyte chemoattractant protein-1 in human neurons. Neuroscience 97: 591-600
29. Axtell RC, Steinman L (2009) Gaining entry to an uninflamed brain.
Nature Immunol 10: 453-455
tial functions of CCR9- or CXCR3-expressing microglia. WebmedCentral Infectious Diseases 2: WMC001727
41. Hu S, Yang K, Yang J, Li M, Xiong N (2011) Critical roles of chemokine receptor CCR10 in regulating memory IgA responses in intestines.
Proc Natl Acad Sci USA 108: E1035-E1044
42. Jarmin DI, Rits M, Bota D, Gerard N, Graham GJ, Lewis IC, Gerard C
(2000) Cutting edge: Identification of the orphan receptor G-protein-coupled receptor 2 as CCR10, a specific receptor for the chemokine
ESkine. J Immunol 164: 3460-3464
43. Homey B, Wang W, Soto H, Buchanan M, Wiesenborn A, Catron D,
Muller A, McClanahan T, Nosjean MCD, Orozco R, Ruzicka T, Lehmann P, Oldham E, Zlotnik A (2000) The orphan chemokine receptor
G protein-coupled receptor-2 (GPR-2, CCR10) binds the skin-associated chemokine CCL27 (CTACK/ALP/ILC). J Immunol 164: 3465-3470
44. Rajagopal S, Rajagopal K, Lefkowitz RJ (2010) Teaching old receptors
new tricks: biasing seven-transmembrane receptors. Nat Rev Drug Discov 9: 373-386
45. Bergmeier W, Weidinger C, Zee I, Feske S (2013) Emerging roles of
store-operated Ca2+ entry through STIM and ORAI proteins in immunity, hemostasis and cancer. Channels 7: 379-391
46. Curnock AP, Logan MK, Ward SG (2002) Chemokine signalling: pivoting around multiple phosphoinositide 3-kinases. Immunology 105:
125-136
30. Reboldi A, Coisne C, Baumjohann D, Benvenuto F, Bottinelli D, Lira
S, Uccelli A, Lanzavecchia A, Engelhardt B, Sallusto F (2009) C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through
the choroid plexus is required for the initiation of EAE. Nature Immunol 10: 514-523
47. Vlahakis SR, Villasis-Keever A, Gomez T, Vanegas M, Vlahakis N,
Paya CV (2002) G protein-coupled chemokine receptors induce both
survival and apoptotic signaling pathways. J Immunol 169: 5546-5554
31. Gomez-Nicola D1, Pallas-Bazarra N, Valle-Argos B, Nieto-Sampedro
M (2010) CCR7 is expressed in astrocytes and upregulated after an inflammatory injury. J Neuroimmunol 227: 87-92
49. Pedemonte E, Mancardi G, Giunti D, Corcione A, Benvenuto F, Pistoia
V, Uccelli A (2006) Mechanisms of the adaptive immune response inside the central nervous system during inflammatory and autoimmune
diseases. Pharmacol Ther 111: 555-566
32. Weng AP, Ferrando AA, Lee W, Morris JPt, Silverman LB, Sanchez-Irizarry C, Blacklow SC, Look AT, Aster JC (2004) Activating mutations of NOTCH1 in human T cell acute lymphoblastic leukemia.
Science 306: 269-271
33. Buonamici S, Trimarchi T, Ruocco MG, Reavie L, Cathelin S, Mar BG,
Klinakis A, Lukyanov Y, Tseng JC, Sen F, Gehrie E, Li M, Newcomb
E, Zavadil J, Meruelo D, Lipp M, Ibrahim S, Efstratiadis A, Zagzag
D, Bromberg JS, Dustin ML, Aifantis I (2009) CCR7 signalling as an
essential regulator of CNS infiltration in T-cell leukaemia. Nature 459:
1000-1004
34. Tiffany HL, Lautens LL, Gao JL, Pease J, Locati M, Combadiere C,
Modi W, Bonner TI, Murphy PM (1997) Identification of CCR8: a human monocyte and thymus receptor for the CC chemokine I-309. J Exp
Med 186: 165-170
35. Annunziato F, Cosmi L, Liotta F, Lazzeri E, Manetti R, Vanini V, Romagnani P, Maggi E, Romagnani S (2002) Phenotype, localization, and
mechanism of suppression of CD4(+)CD25(+) human thymocytes. J
Exp Med 196: 379-387
36. Roos RS, Loetscher M, Legler DF, Clark-Lewis I,Baggiolini M, Moser
B (1997) Identification of CCR8, the receptor for the human CC chemokine I-309. J Biol Chem 272: 17251-17254
37. Calado M, Matoso P, Santos-Costa Q, Espirito-Santo M, Machado J,
Rosado L, Antunes F, Mansinho K, Lopes MM, Maltez F, Santos-Ferreira MO, Azevedo-Pereira JM (2010) Coreceptor usage by HIV-1 and
HIV-2 primary isolates: the relevance of CCR8 chemokine receptor as
an alternative coreceptor. Virology 408: 174-182
38. Wurbel M-A, Malissen B, Campbell JJ (2006) Complex regulation of
CCR9 atmultiple discrete stages of T cell development. Eur J Immunol
36: 73-81
39. Qiuping Z, Jei X, Youxin J, Wei J, Chun L, Jin W, Qun W, Yan L, Chunsong H, Mingzhen Y, Qingping G, Kejian Z, Zhimin S, Qun L, Junyan
L, Jinquan T (2004) CC chemokine ligand 25 enhances resistance to
apoptosis in CD4+ T cells from patients with T-cell lineage acute and
chronic lymphocytic leukemia by means of living activation. Cancer
Res 64: 7579-7587
40. Yuling H, Li L, Xiao W, Tan X, Wu M, Li J, Wang L, Chen L, Xiao R,
Huang, Zheng X, Zhou R, Ji X, Xiong J, Jiang Y, Tan J (2011) Differen-
48. Stephens B, Handel TM (2013) Chemokine receptor oligomerization
and allostery. Prog Mol Biol Transl Sci 115: 375-420
50. Goldeck D, Larbi A, Pellicanó M, Alam I, Zerr I, Schmidt C, Fulop T,
Pawelec G (2013) Enhanced chemokine receptor expression on leukocytes of patients with Alzheimer’s disease. PLoS ONE 8: e66664
51. Subramanian S, Ayala P, Wadsworth TL, Harris CJ, Vandenbark AA,
Quinn JF, Offner H (2010) CCR6: a biomarker for Alzheimer’s-like disease in a triple transgenic mouse model. J Alzheim Dis 22: 619-629
52. Izraely S, Klein A, Sagi-Assif O, Meshel T, Tsarfaty G, Hoon DS, Witz
IP (2010) Chemokine-chemokine receptor axes in melanoma brain metastasis. Immunol Lett 130: 107-114
53. Rottman JB, Slavin AJ, Silva R, Weiner HL, Gerard CG, Hancock WW
(2000) Leukocyte recruitment during onset of experimental allergic encephalomyelitis is CCR1 dependent. Eur J Immunol 30: 2372-2377
54. Trebst C, Sorensen TL, Kivisakk P, Cathcart MK, Hesselgesser J,
Horuk R, Sellenbjerg F, Lassmann H, Ransohoff RM (2001) CCR1+/
CCR5+ mononuclear phagocytes accumulate in the central nervous
system of patients with multiple sclerosis. Am J Pathol 159: 1701-1710
55. Alt C, Laschinger M, Engelhardt B (2002) Functional expression of
the lymphoid chemokines CCL19 (ELC) and CCL 21 (SLC) at the blood-brain barrier suggests their involvement in G-protein-dependent
lymphocyte recruitment into the central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis. Eur J Immunol 32: 2133-2144
56. Forde EA, Dogan RN, Karpus WJ (2011) CCR4 contributes to the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis by regulating inflammatory macrophage function. J Neuroimmunol 236: 17-26
57. Axtell RC, Steinman L (2009) Gaining entry to an uninflamed brain.
Nature Immunol 10: 453-455
58. Bielecki B, Mazurek A, Wolinski P, Glabinski A (2007) Expression of
chemokine receptors CCR7 and CCR8 in the CNS during ChREAE.
Scand J Immunol 66: 383-392
59. Trebst C, Staugaitis SM, Kivisäkk P, Mahad D, Cathcart MK, Tucky
B, Wei T, Rani MR, Horuk R, Aldape KD, Pardo CA, Lucchinetti CF,
Lassmann H, Ransohoff RM (2003) CC chemokine receptor 8 in the
central nervous system is associated with phagocytic macrophages.
Am J Pathol 162: 427-438
442www.postepybiochemii.pl
60. Vallat AV, De Girolami U, He J, Mhashilkar A, Marasco W, Shi B,
Gray F, Bell J, Keohane C, Smith TW, Gabuzda D (1998) Localization
of HIV-1 co-receptors CCR5 and CXCR4 in the brain of children with
AIDS. Am J Pathol 152: 167-178
61. Petito CK, Roberts B, Cantando JD, Rabinstein A, Duncan R (2001)
Hippocampal injury and alterations in neuronal chemokine co-receptor expression in patients with AIDS. J Neuropathol Exp Neurol 60:
377-385
62. Toyoda H, Miyagawa T, Koike A, Kanbayashi T, Imanishi A, Sagawa Y, Kotorii N, Kotorii T, Hashizume Y, Ogi K, Hiejima H, Kamei
Y, Hida A, Miyamoto M, Imai M, Fujimura Y, Tamura Y, Ikegami A,
Wada Y, Moriya S, Furuya H, Takeuchi M, Kirino Y, Meguro A, Remmers EF, Kawamura Y, Otowa T, Miyashita A, Kashiwase K, Khor SS,
Yamasaki M, Kuwano R, Sasaki T, Ishigooka J, Kuroda K, Kume K,
Chiba S, Yamada N, Okawa M, Hirata K, Mizuki N, Uchimura N, Shimizu T, Inoue Y, Honda Y, Mishima K, Honda M, Tokunaga K (2015)
A polymorphism in CCR1/CCR3 is associated with narcolepsy. Brain
Behav Immun 49: 148-155
Chemokine CC receptors in the nervous system
Tomasz Łukasz Radzik1, Andrzej Głąbiński2, Ludmiła Żylińska1,*
Department of Molecular Neurochemistry and 2Department of Neurology and Stroke, Medical Uniwersity, 6/8 Mazowiecka Str., 92-215 Lodz,
Poland
1
*
e-mail: [email protected]
Key words: chemokines, chemokine CC receptors, nervous system, neurodegeneration
ABSTRACT
Chemoattractant cytokines (chemokines) are traditionally known as the important mediators of inflammatory processes, however, recently, is
also given to their other functions in the body. Acting through specific receptors belonging to the G proteins they regulate immune processes
in the body. About 20 chemokine receptors have been identified so far, and 10 of them bind chemokines CC, i.e. having in amino-terminal
domain 2 adjacent molecules of cysteins. An increasing number of data indicates that chemokines and their receptors play an important role
in the nervous system by acting as trophic factors, increasing the neurons survival, neural migration and synaptic transmission. Special role
chemokine receptors play primarily in the diseases of the nervous system, because due to damage of the blood-brain barrier and the blood
cerebrospinal fluid barrier, infiltration of leukocytes results in development of inflammation. Chemokine CC receptors has been shown to
participate in Alzheimer’s disease, multiple sclerosis, dementia associated with HIV infection, stroke or some type of cancers.
Postępy Biochemii 61 (4) 2015
443
Download
Random flashcards
123

2 Cards oauth2_google_0a87d737-559d-4799-9194-d76e8d2e5390

ALICJA

4 Cards oauth2_google_3d22cb2e-d639-45de-a1f9-1584cfd7eea2

Create flashcards