oznaczanie wrażliwości szczepów bakteryjnych na antybiotyki

ĆWICZENIE 5
OZNACZANIE WRAŻLIWOŚCI SZCZEPÓW BAKTERYJNYCH NA
ANTYBIOTYKI (METODA DYFUZJI KRĄŻKOWEJ).
WPŁYW PROMIENIOWANIA UV NA WZROST BAKTERII.
Uwaga: Ze względu na laboratoryjny charakter zajęć oraz kontakt z materiałem biologicznym, studenci zobowiązani są
używać fartuchów i rękawiczek jednorazowych.
Antybiotyki są to swoiste substancje wytwarzane przez organizmy żywe (głównie
drobnoustroje) oraz ich półsyntetyczne pochodne, które w małym stężeniu działają hamująco,
litycznie lub niszcząco na mikroorganizmy. Efektem działania antybiotyków na bakterie najczęściej
jest bakteriostaza, rzadziej bakterioliza.
Jednym z najważniejszych etapów rutynowej diagnostyki mikrobiologicznej zakażeń
bakteryjnych jest oznaczanie wrażliwości na leki. Szerokie stosowanie antybiotyków pociąga za
sobą wzrost oporności na leki wśród wielu klinicznie ważnych szczepów bakteryjnych, a także
pojawiania się nowych mechanizmów oporności. W związku z mikrobiolog jest zobowiązany nie
tylko do ich prawidłowego określania, ale także do ich klinicznej interpretacji.
Podstawowe definicje terminów powszechnie używanych w mikrobiologii odnoszących się do
zagadnień lekowrażliwości:
Antybiotyk
–
substancja
o
aktywności
przeciwdrobnoustrojowej,
wytwarzana
przez
mikroorganizmy (bakteria, grzyby) lub uzyskana na drodze pólsyntetycznej bądź syntetycznej, lecz
mająca naturalny wzorzec;
Antybiogram – ocena wrażliwości danego gatunku drobnoustroju na działania określonych
antybiotyków przeprowadzona w laboratorium (na szalce Petriego);
Fitoncyd – substancja o aktywności przeciwbakteryjnej wytwarzania przez rośliny;
MIC (ang. minimal inhibitory concentration) – określa najmniejsze stężenie leku, wyrażone w mg/l
określone w warunkach in vitro, hamujące wzrost bakterii przy określonej gęstości inokulum i w
określonym czasie;
MBC (ang. minimal bactericidial concentration) – określa minimalne stężenie leku, wyrażone w
mg/l określone w warunkach in vitro, przy którym ginie 99,9% komórek bakteryjnych, przy
określonej gęstości inokulum i w określonym czasie.
Oporność farmakologiczna – bakterie są oporne w sensie farmakologicznym, jeśli mogą przeżyć
w obecności antybiotyku w stężeniu wyższym niż jest możliwy do osiągnięcia
in vivo;
Oporność kliniczna – oznacza, że sukces terapeutyczny jest niemożliwy do osiągnięcia pomimo
zastosowania maksymalnych dawek antybiotyku;
Oporność naturalna – stała cecha gatunku, rodzaju, rodziny drobnoustrojów; wynika z :

inaktywacja antybiotyku w wyniku enzymatycznej hydrolizy jego cząsteczki; np. laktamazy;
(rozszczepiają
pierścień
-laktamowy
w
cząsteczce
antybiotyku
(penicyliny, cefalosporyny);

modyfikacja antybiotyku poprzez wprowadzenie do jego cząsteczki różnych
podstawników
zmieniających
ich
swoistość
działania;
np.
antybiotyki
aminoglikozydowe: O- fosforylacja, N-acetylacja , O-adenylacja odpowiednich
pozycji w cząsteczce antybiotyku przez liczne enzymy kodowane przez geny
plazmidowe powoduje inaktywację antybiotyku, uniemożliwiając jego oddziaływanie
z rybosomami;

aktywne usuwanie antybiotyku z komórki:

np. oporność na tetracyklinę zależna od transpozonu Tn10;

oporność zależy od wytwarzania indukowalnego białka typu TET (Tet A) –
białko transmembranowe powodujące wypompowywanie tetracykliny w
niezmienionej formie do przestrzeni periplazmatycznej;

wytworzenie alternatywnego szlaku metabolicznego (mechanizm by-pass) np.:
oporność na sulfonamidy
Oporność nabyta – nowa cecha szczepu wynikająca ze zmian materiału genetycznego,
Wrażliwość mikrobiologiczna – oznacza, że dany szczep należy do najbardziej wrażliwej
populacji i nie posiada mechanizmów oporności;
Wrażliwiość kliniczna – oznacza wrażliwość drobnoustrojów na standardowe dawki leku;
METODY OKREŚLANIA WRAZLIWOŚCI:

DYFUZJA KRĄŻKOWA – czystą hodowlę bakterii wysiewa się na płytkę agarową w taki
sposób, aby po inkubacji otrzymać murawkę; przed inkubacją, w różnych miejscach na
powierzchni płytki umieszcza się krążki bibuły nasączone poszczególnymi antybiotykami;
podcza inkubacji z każdego krążka antybiotyk dyfunduje do podłoża; miarą wrażliwości
badanego szczepu na dany antybiotyk, jest wielkość średnicy strefy zahamowania wzrostu
wokół krążka; obecność lub wielkość (średnicę) strefy zahamowania można tylko wtedy
właściwie zinterpretować, gdy cała procedura jest standaryzowana ze względu na rodzaj
podłoża, gęstość inokulum na płytce, itp.
Pomimo prostoty oznaczanie wrażliwości metodą krążkową wymaga bardzo starannego
wykonania i przestrzegania przepisów.
Rys.1. Badanie wrażliwości na antybiotyki (test dyfuzji krążkowej).
Możliwe reakcje oraz typy stref powstających wokół krążka (rys.1):

Oporność. Brak sfery zahamowania: bakterie rosną przy samym krążku.

Oporność pośrednia. Wąska strefa braku wzrostu wokół krążka.

Wrażliwość. Szeroka strefa wokół krążka wolna od wzrostu.

Inaktywacja enzymatyczna. Wąska strefa braku wzrostu wokół krążka.
W przeciwieństwie do strefy „pośredniej”, brzeg strefy jest ostro zarysowany i
składa się na niego nieco silniejszy wzrost w postaci pewnych kolonii normalnej
wielkości lub większych niż pozostałe.

Działanie selektywne. Taki wynik otrzymuje się, gdy inokulum zawiera dwa
szczepy różniące się podatnością na dany antybiotyk. W pobliżu krążka stężenie
antybiotyku jest na tyle duże, że hamuje wzrost obydwu szczepów (wąska strefa
wolna od wzrostu). W dalszej odległości od krążka (mniejsze stężenie
antybiotyku) wzrost jednego ze szczepów zostaje zahamowany, podczas gdy
drugi rośnie.

Porównanie z kontrolą. „Półstrefa” otrzymana ze szczepem kontrolnym (po
jednej stronie krążka) jest naprzeciwko „półstrefy” dla szczepu badanego (po
przeciwnej stronie krążka). By to uzyskać, szczepy badany i kontrolny wysiewa
się na odrębne połówki szalki, a krążek kładzie się między nimi.

Mutanty oporne. Inokulum zawierało niewielki procent komórek zmutowanych
zdolnych do tworzenia kolonii w warunkach hamujących wzrost komórek
dzikich. Mutanty zwykle charakteryzują się opornością na antybiotyk. Istnieje
jednak pewien typ mutantów rosnących jedynie w obecności danego
antybiotyku i mutanty te będą również tworzyć kolonie w strefie wolnej od
wzrostu innych komórek bakteryjnych. Przykładem są mutanty zależne od
streptomycyny, które mają takie zmiany w rybosomach, że dopiero w obecności
streptomycyny następują przemiany konformacyjne pozwalające na ich
prawidłowe funkcjonowanie.

Zakażenia. Inokulum składa się z mieszaniny organizmów, z których
przynajmniej jeden jest oporny na badany antybiotyk.

Synergizm. Dwa krążki zawierają różne antybiotyki. Strefa zahamowania
wzrostu jest większa niż suma efektów każdego z antybiotyków z osobna.
Inaczej mówiąc, działanie tych antybiotyków jest synergiczne.

Antagonizm. Dwa krążki zawierają różne antybiotyki. W tym przypadku jeden
z antybiotyków hamuje aktywność drugiego.

METODA ROZCIEŃCZEŃ W BULIONIE – wykonywana w probówkach (metoda
makrorozcieńczeń – minimalna objętość bulionu wynosi 2 ml) lub na płytkach
titracyjnych (metoda mikrorozcieńczeń – objętość bulionu w każdej studzience wynosi
100 l). Metoda makrorozcieńczeń jest stosowana tam gdzie pojawia się potrzeba
wykonania oznaczenia dla pojedynczego szczepu. Buliony zawierające antybiotyk o
znanych malejących stężeniach (zazwyczaj stosuje się podwójne rozcieńczenia) są
zaszczepione określona liczbą komórek bakteryjnych. Odczyt polega na obserwacji
zmętnienia podłoża po określonym czasie. Celem tej metody jest określenie
najmniejszego stężenia hamującego (MIC) lub najmniejszego stężenia bakteriologicznego
(MBC).

METODA ROZCIEŃCZEŃ W AGARZE – w metodzie tej antybiotyk jest obecny w
podłożu agarowym w malejących stężeniach (jedno stężenie na jedną płytkę z agarem),
na które posiewana jest zawiesina bakteryjna o określonym inokulum. Celem badania jest
określenie najmniejszego stężenia hamującego (MIC).

OKREŚLANIE WARTOŚCI MIC ZA POMOCĄ E-TESTÓW – polega na dyfuzji
antybiotyku z plastikowego paska ze stopniowo zmieniającymi się stężeniami (gradient),
wyrażonymi w g/ml. Po nałożenia paska na agar następuje natychmiastowe uwolnienie
antybiotyku do podłoża, wytwarzając w nim, bezpośrednio pod paskiem gradient stężeń
tego leku wystarczająco długotrwały, aby można było uchwycić strefę zahamowania
wzrostu większości drobnoustroju.
GRUPY ANTYBIOTYKÓW
Antybiotyki -laktamowe

w budowie posiadają pierścień -laktamowynależą do nich penicyliny, cefalosporyny
oraz liczne półsyntetyczne ich odmiany
Mechanizm działania polega na zaburzeniu syntezy ściany komórkowej. Penicylina nie dopuszcza
do odłączenia końcowej D-alaniny z disacharydopentapeptydu, hamując w ten sposób syntezę
prawidłowej mureiny. Prowadzi to do zablokowania transpeptydacji, czyli tworzenia połączeń
pomiędzy D-alaniną w jednym łańcuchu peptydowym a grupa aminową aminokwasu w sąsiednim
łańcuchu peptydowym.
Mechanizm oporności

głównie – wytwarzanie -laktamaz – enzymów hydrolizujących pierścień
-laktamowy. Geny odpowiedzialne za ich syntezę mogą występować zarówno na
chromosomie jak i na plazmidzie

modyfikacja białek wiążących penicylinę (PBP)

zmiany właściwości błony zewnętrznej mogą w konsekwencji ograniczać transport
antybiotyku do komórki
Antybiotyki aminoglikozydowe

chemicznie zdefiniowana grupa związków, których cząsteczka składa się z dwóch lub
więcej grup cukrowych

należą do nich: strepto-, genta-, neo-, kanamycyna

z dużą częstotliwością pojawiają się szczepy oporne

uszkadzają nerki i aparat słuchowy
Mechanizm działania polega na interferencji z syntezą białka poprzez wiązanie się
z podjednostką 30S i zakłóceniu odczytu informacji niesionej przez mRNA (hamują translację)
a). związanie się aminoglikozydu ze swoistym białkiem receptorowym na podjednostce 30S
rybosomu
b). zablokowanie prawidłowej aktywności kompleksu inicjującego tworzenie peptydu
(mRNA + formylometionina + tRNA)
c). błędne odczytanie informacji mRNA przez „obszar rozpoznający” rybosomu, na
w wyniku tego włączenia błędnego aminokwasu co powoduje unieczynnienie białka
Mechanizm oporności

oporność chromosomalna zależy głównie od braku swoistego białka receptorowego na
podjednostce 30S

oporność zależna od plazmidów polega na wytwarzaniu przez drobnoustrój enzymów
adenylujących albo fosforylujących, które uczestniczą w przekształcaniu antybiotyków
aminoglikozydowych
i fosforany
w
nieaktywne
pochodne
–
adenylany
Antybiotyki tetracyklinowe

postawę budowy tetracyklin stanowi czteroczłonowy pierścień tetracenowy

należą do nich: chloro-, oksytetracyklina, doksycyklina

szeroki zakres działania

w małych stężeniach działają bakteriostatycznie, w dużych bakteriobójczo
Mechanizm działania polega na interferencji tetracyklin z biosyntezą białka. Blokują przyłączanie
aminoacetylo-tRNA do podjednostki 50S rybosomu.
Mechanizm oporności:

zahamowanie czynnego transportu do wnętrza komórki

oporność na wysokie dawki leku, polega na czynnym wymagającym nakładu energii
wypływie antybiotyku z komórki do środowiska
Antybiotyki makrolidowe

składają się z dużego pierścienia laktonowego sprzężonego z aminocukrami wiązaniem
glikozydowym

należą do nich erytromycyna, amfoterycyna B (lek przeciwgrzybiczy)

działają bakteriostatycznie na bakterie Gram+ i ziarniaki Gram-
Mechanizm działania erytromycyny polega na współzawodniczeniu antybiotyku aminoacetylotRNA o miejsce A na podjednostce 50S rybosomu
Mechanizm oponości na erytromycynę związany jest z modyfikacją rybosomów. Mogą mieć
miejsce dwojakiego rodzaju zmiany:

modyfikacja białek dużej podjednostki rybosomu

zmiana rRNA w podjednostce 23S, polegająca na dodatkowej metylacji jednej
dimetyloadeniny, co ogranicza możliwość wiązania antybiotyku z rybosomem
Chloramfenikol

budowa zbliżona do fenyloalaniny

szeroki zakres działania
Mechanizm działania polega na hamowaniu biosyntezy białka. Antybiotyk wiąże się
z podjednostką 50S rybosomu zaburzając przyłączenia nowych aminokwasów do tworzącego się
łańcucha peptydowego głównie w skutek hamowania aktywności peptydylotransferazy.
Mechanizm oporności

zdolność wytwarzania przez drobnoustroje enzymu acetylotransferazy
chloramfenikolowej który w obecności acetylo-CoA, ATP i jonów Mg2+ inaktywuje
chloramfenikol
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
 Oznaczanie wrażliwości szczepu bakteryjnego na poszczególne antybiotyki metodą
krążkową (sporządzanie antybiogramów).

Sterylną wymazówką pobrać czystą kolonię bakteryjną z płytki i zawiesić w 3 ml
soli fizjologicznej;

Wymazówką rozprowadzić sporządzoną zawiesinę bakteryjną dokładnie na
szalkę Petriego z podłożem Mueller-Hintona w sposób wskazany przez
prowadzącego;

Następnie, posługując się jałową pęsetą umieścić na płytce krążki bibułowe
nasycone antybiotykami; odległość pomiędzy poszczególnymi krążkami
powinna wynosić około 2 cm i ilość krążków na płytce nie powinna być większa
niż sześć;

Płytkę pozostawić na 30 min w temperaturze pokojowej (w tym czasie
antybiotyki dyfundują do podłoża (nie odwracać płytki);

Inkubować w temperaturze 35ºC (odwrócić płytkę denkiem do góry);

Po 24 godzinach zmierzyć wielkość strefy zahamowania wzrostu bakterii i
odczytać skuteczność działania antybiotyków według tabeli;
 Oznaczanie wrażliwości bakterii na fitoncydy z cebuli i czosnku.
 Na płytki wysiać hodowle rozcieńczone jak punkcie 1;
 Na jednej połowie umieścić plasterek cebuli a na drugiej połowie kawałeczek
czosnku;
 Płytkę umieścić w 4ºC; po 2 godzinach przenieść do cieplarki na 37ºC;
 Określić wrażliwość bakterii na fitoncydy;
 Wpływ promieniowania UV na bakterie.
 Na płytki wysiać hodowle rozcieńczone jak punkcie 1;
 Płytkę umieścić pod lampą UV i naświetlamy 30s, 90s, 3 min. 5 min.
 Po kilkudniowej inkubacji policzyć kolonie wyrosłe na płytce