cwiczenie_8
advertisement
MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ CHARAKTERYSTYKA GRZYBÓW PLEŚNIOWYCH Ważne pojęcia dotyczące grzybów: Teleomorf: stadium rozmnażania płciowego, zwykle o kształcie owocnika Anamorf: stadium rozmnażania bezpłciowego, często pleśnio-podobne Synanamorfy: liczne morfologicznie różne stadia bezpłciowe wytwarzane przez jednego grzyba Holomorf: cały grzyb obejmujący zarówno stadium teleomorficzne, jak i anamorficzne. Grzyby klasyfikuje się głównie na podstawie budowy struktur związanych z rozmnażaniem płciowym. Jednakże, liczne grzyby rozmnażają się tylko bezpłciowo i nie da się ich umiejscowić w takiej klasyfikacji. Inne gatunki wytwarzają zarówno stadia płciowe, jak i bezpłciowe. Do takich problematycznych gatunków należą przede wszystkim członkowie Ascomycota, ale także niektóre z Basidiomycota. Ponadto wśród grzybów, które rozmnażają się i płciowo i bezpłciowo, często jeden ze sposobów rozmnażania może być obserwowany jedynie w ściśle określonych warunkach bądź punkcie czasowym. To sprawia, że często trudno jest skojarzyć ze sobą różne stadia tego samego gatunku grzyba. Jedynie analiza molekularna genomu pozwala na prawidłowe klasyfikowanie grzybów w jednostki ze sobą spokrewnione. W chwili obecnej, artykuł 59 Międzynarodowego Kodeksu Nomenklatury Botanicznej pozwala mikologom na stosowanie podwójnego nazewnictwa („dual nomenclature”), tzn. grzybom rozmnażającym się bezpłciowo (anamorfy) nadaje się inną nazwę niż ich „płciowym odpowiednikom” (teleomorfy). Jeśli znane jest zarówno stadium anamorficzne, jak i teleomorficzne tego samego grzyba mówimy, że jest on holomorfem, i nazwa stadium płciowego jest „ważniejsza” niż nazwa stadium bezpłciowego. Np. u powszechnej i ważnej w przemyśle pleśni Aspergillus niger nie wykryto cyklu płciowego. Dlatego Aspergillus niger jest uznawany za jednostkę taksonomiczną. Natomiast, blisko z nim spokrewniony Aspergillus nidulans, ma stadium płciowe nazwane Emericella nidulans. I ta druga nazwa jest uznawana za prawidłową. Grzyby, o których wiadomo, że wytwarzają tylko stadia anamorficzne, były dotąd umiejscawiane w sztucznie wydzielonym typie Deuteromycota (Fungi Imperfecti). Obecnie termin ten jest używany nieformalnie do określania gatunków grzybów, które są rozmnażającymi się bezpłciowo członkami typów Ascomycota i Basidiomycota. Deuteromycota liczy ok. 25 000 gatunków. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 1 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ RODZAJE MUCOR I RHIZOPUS Grzybnia jednokomórkowa, wielojądrowa (komórczaki), nie podzielona (bez przegród poprzecznych tzw. sept) lub rzadko podzielona, raczej nie rozgałęziona. Rozmnażają się płciowo i bezpłciowo (wegetatywnie). zarodniki Rozmnażanie bezpłciowe polega na wytworzeniu endospor, czyli zarodników (sporangiospory), powstających wewnątrz specjalnych tworów zwanych zarodniami (sporangiami) – brak bezpośredniego kontaktu zarodników z otoczeniem (rys. 1). Sporangia są tworzone na specjalnych strzępkach, tzw. trzonkach zarodnionośnych (sporangioforach) i są zwykle brązowe. Charakterystycznym elementem strukturalnym zarodni jest kolumella, która pozostaje po rozerwaniu ściany sporangium. sporangium kolumella kołnierz Rys. 1. Mucor sp. sporangiofor z zarodnią Rozmnażanie płciowe polega na połączeniu się gametangiów męskich z żeńskimi (czyli płciowo zróżnicowanych końców strzępki, rys. 2.) z wytworzeniem zygoty i dalej zygospory (ciemne zabarwienie). zygospora sporangium fuzja gametangiów kolumella sporangiofor strzępka somatyczna spory Rys. 2. Cykl rozwojowy Mucor http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 2 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Mucor Grzybnia wysoka (z powodu licznych rosnących w górę sporangioforów), początkowo biała, później szarzejąca. Kolumella jest okrągła. Nazywane są drożdżami mukorowymi - fermentują cukry wytwarzając w środowiskach płynnych ok. 7% etanolu. Występują jako zanieczyszczenia powietrza w mleczarniach, mogą powodować wady masła (silne właściwości lipolityczne). Pleśnie z rodzaju Mucor są szkodnikami, występują na owocach i innych produktach. Ta pleśń często jest również przyczyną chorób, infekcja zwykle obejmuje górne i dolne drogi oddechowe, przewód pokarmowy lub skórę. kolumella kołnierz sporangiofor z dojrzewającym sporangium sporangiofor z pękniętym sporangium http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 3 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Rhizopus Rośnie jako jasnoszara murawka o luźnej strukturze. Podobny do Mucor, ale tworzy rozłogi, a sporangiofory mają od spodu rozgałęzione chwytniki (ryzoidy), którymi czerpią substancje z podłoża. Kolumella jest spłaszczona. Jest bardzo rozpowszechniony, przyczynia się do psucia owoców, wad niektórych serów, występuje jako zanieczyszczenie żywności (np. pieczywa), jest przyczyną psucia się mięsa przechowywanego w chłodni, niektóre gatunki mogą wytwarzać mikotoksyny. sporangium spory sporangiofor rozłogi ryzoidy rozłogi http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 4 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ dojrzewające sporangium kolumella wiązka sporangioforów rozłogi rizoidy Rodzaj Najlepszy wzrost Kolumella Rizoidy Mucor <37°C Okrągła - Rhizopus 45°C Spłaszczona + RODZAJE ASPERGILLUS I PENICILLIUM Pleśnie te mają wielokomórkową grzybnię. Niektóre gatunki należące do tych rodzajów w rozmnażaniu generatywnym tworzą charakterystyczne dla siebie zarodnie, zwane workami (ascus), w której zarodniki workowe (askospory) powstają wskutek rozmnażania płciowego, zwykle w liczbie 4 do 8. W rozmnażaniu bezpłciowym wytwarzają zarodniki zewnętrzne – konidia, oddzielające się od strzępki owocującej, wyrastają na specjalnych aparatach konidialnych. Strzępki tych grzybów są silnie rozgałęzione i podzielone licznymi przegrodami wewnętrznymi (septami) z otworem, przez który swobodnie przepływa protoplazma. Na podłożach stałych pleśnie te rozwijają się koncentrycznie, tworząc na ogół regularne kolonie (okrągłe lub owalne) z barwną grzybnią i białym brzegiem. Do najważniejszych rodzajów należą kropidlaki (Aspergillus) i pędzlaki (Penicillium). Aspergillus Pleśnie te tworzą kolonie o różnym zabarwieniu (patrz tabela 1). Wraz z grzybnią rozwijają się organy rozmnażania wegetatywnego, aparaty konidialne (rys. 3) o kształcie kropidła. Z grzybni ku górze wyrastają liczne strzępki zarodnikonośne, tzw. konidiofory. Konidiofory nie mają przegród i są zakończone kulistą główką w kształcie pęcherzyka lub maczugi, http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 5 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ zwaną kolumellą. Na kolumelli wyrastają liczne butelkowate twory zwane sterigmami (fialidami), z których wyrastają konidia ułożone w nierozgałęzione łańcuszki. Różnice w kształcie kolumelli, układzie sterigm i kształcie konidiów są podstawą klasyfikacji między gatunkami. Rys. 3. Aparat konidialny Aspergillus; A,B – sterigmy, C – kolumella, D - konidiofor A. flavus A. fumigatus GATUNEK POWIERZCHNIA REWERS A. clavatus Niebiesko-zielona Biały, z wiekiem brązowiejący A. flavus Żółto-zielona Złocisty do czerwonego brązu A. fumigatus Niebiesko-zielona do szarej Biały do opalonego A. glaucus group Zielona z żółtymi obszarami Żółtawy do brązowego A. nidulans Zielona do żółtej Purpurowo-czerwony do oliwkowego A. niger Czarna Biały do żółtego A. terreus Cynamonowa do brązowej Biały do brązowego A. versicolor Z początku biała, potem przechodzi w żółty, opalony, jasno zielony lub różowy kolor Biały do żółtego lub purpurowoczerwonego http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 6 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Najliczniej występują w glebie, rozwijają się na resztkach roślinnych i zwierzęcych, znanych jest ponad 150 gatunków, wśród których są odmiany odpowiedzialne za psucie się żywności, skór, drewna i papieru, liczne gatunki są patogenne dla ludzi i zwierząt. Niektóre gatunki z rodzaju Aspergillus wytwarzają mikotoksyny. Udowodniono, że długotrwałe spożywanie tych mikotoksyn oddziałuje kancerogennie na zwierzęta i ludzi. Do najważniejszych mikotoksyn należy dobrze znana aflatoksyna, która może powodować nowotwory wątroby, jest wytwarzana przez A. flavus i zanieczyszcza produkty żywnościowe, jak np. orzeszki ziemne. A. niger wytwarza kwas cytrynowy – wykorzystywany w przemyśle. Aspergillus niger Penicillium Aparaty konidialne są mniejsze i delikatniejsze niż u Aspergillus, wyglądem przypominają pędzelki, stąd polska nazwa pędzlaki. Konidiofory nie tworzą kolumelli, tylko rozgałęziają się. Rozgałęzienia mogą być dwu- lub trzypiętrowe, „górne” noszą nazwę metul. Na metulach powstają sterigmy (fialidy), na których w łańcuszkach wyrastają konidia. Kolonie zielono-niebieskie lub zielone. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 7 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Konidia są z łatwością przenoszone przez wiatr, dzięki czemu są wszechobecne w środowisku. Jako typowe saprofity, aktywnie uczestniczą w rozkładzie materii organicznej, ale są też przyczyną psucia się surowców roślinnych (podczas ich magazynowania) oraz produktów spożywczych, np. P. notatum – zielony nalot na pomarańczach. Z powodu wszędobylskości stanowią poważny problem w przemyśle spożywczym. Niektóre gatunki wytwarzają toksyny i czynią żywność niesmaczną lub wręcz trującą – należy wyrzucać pokarmy noszące choćby ślad rozwoju pleśni. Z drugiej strony liczne szczepy Penicillium są wykorzystywane w przemyśle mleczarskim i serowarskim, m.in. do dojrzewania serów typu Roquefort, Brie, Camembert. Te szczepy pleśni są bezpieczne. Gatunki z rodzaju Penicillium wytwarzają również liczne antybiotyki, np. penicylina jest wytwarzana przez Penicillium chrysogenum. Identyfikacja na poziomie gatunków pleśni z rodzaju Penicillium jest oparta o morfologię kolonii i cechy mikroskopowe. konidia fialida odgałęzienie metula odgałęzienie asymetrycznie rozgałęziony konidiofor http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 8 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ fialidy konidia metula odgałęzienie odgałęzienie asymetrycznie rozgałęziony konidiofor strzępka POZOSTAŁE PLEŚNIE Fusarium Tworzy obfitą, „wełnistą” grzybnię o jasnych barwach (biały przez różowy do czerwieni), od spodu zabarwioną intensywnie pomarańczowo, czerwono lub fioletowo. Grzybnia jest septowana. Konidiofory są proste lub rozgałęzione, luźno umieszczone w strzępkach, na osi głównej powstają fialidy, na nich konidia. Wytwarzają 2 rodzaje zarodników: małe jednolub dwukomórkowe, owalne lub elipsoidalne mikrokonidia (B), często przedzielone poprzeczną przegrodą oraz rzadziej, duże wielokomorowe makrokonidia (A), o rogalikowatym lub łódkowatym kształcie. Identyfikacja gatunków trudna ze względu na duże zróżnicowanie w zależności od warunków hodowli. A) B) Fusarium solani http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 9 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Są powszechnie występującymi saprofitami bytującymi w glebie, a także na produktach spożywczych (ziarno, owoce), liczne są pasożytami roślin (zbóż, roślin motylkowych, ziemniaków, buraków). Powodują gnicie – wytwarzają enzymy hydrolizujące pektyny. Wiele gatunków wytwarza bardzo silne toksyny, które mogą wywoływać śmiertelne zatrucia u ludzi. młode makrokonidia makrokonidia fialida rozgałęziony konidiofor Botrytis Charakteryzuje się „wełnistą” grzybnią, początkowo biała, następnie przechodzi w jasnoszarą lub oliwkowobrunatną z szarą warstwą konidiów. Rewers jest ciemny. Konidiofory są proste, podobnie jak strzępki septowane, rozgałęzione na końcu, kończą się pęcherzykami z blastokonidiami na ich powierzchni. Powszechnie występują w przyrodzie, spełniając ważną rolę w procesie biodegradacji celulozy i pektyn w warunkach naturalnych, są saprofitami, ale w pewnych warunkach występują jako organizmy patogenne, na owocach miękkich (np. truskawki) identyfikowana jest jako tzw. szara pleśń, powodując ich psucie. Botrytis cinerea jest postrachem wielu winiarzy, jednak dla producentów win naturalnie słodkich grzyb ten może być warunkiem sukces, gdyż zarażenie winogron pleśnią umożliwia uzyskanie wysokiego stężenia cukru. Sekretem jest to, jak słodkie są winogrona w momencie, gdy atakuje je pleśń. Jeżeli cukru w jagodach jest mało (poniżej 20%), strzępki grzyba mogą wniknąć głęboko i zniszczyć tkankę owocu, a tym samym uprawy. Jeżeli jednak winogrona są http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 10 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ bardzo słodkie (zawartość cukru dwadzieścia kilka procent), grzyb nie wnika w miąższ, a jego strzępki jedynie uszkadzają skórkę owocu. Gdy temu procesowi towarzyszy jeszcze słoneczna i sucha pogoda, uszkodzone jagody łatwo tracą wodę – dochodzi do dalszej koncentracji cukru. W końcu na krzakach zwisają owoce przypominające bardziej rodzynki, niż świeże winogrona. I to z nich właśnie otrzymuję się później wina słodkie – począwszy od węgierskiego tokaju, po francuskie Sauternes. Stosunek producentów win słodkich do Botrytis cinerea najlepiej oddaje to, że grzyb ten nazywają w tym przypadku: pleśnią szlachetną. Poprzez zatężenie cukrów i aromatu w owocach winogron Botrytis wpływa także na proces fermentacji. konidia kolumella Alternaria Tworzy grzybnię aksamitną, wełnista, ciemnoszarą i oliwkową, z wydzielanym do podłoża czarnym pigmentem (barwi na czarno powierzchnię zaatakowanych produktów). Konidiofory septowane, brązowe, na końcu mają proste lub rozgałęzione konidia. Konidia http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 11 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ są duże, wielokomorowe (septy poprzeczne i podłużne), w kształcie pałki, o szerszej podstawie, brunatne, ostatnia komórka wypączkowuje nowe konidium, co w rezultacie daje ich łańcuchy. Grzyby te występują pospolicie jako saprofity i pasożyty roślin, są przyczyną psucia surowców i artykułów spożywczych, głównie owoców, powodując mięknięcie tkanki i wyciek soku, są zdolne do wytwarzania mikotoksyn (patulina, alternariol, trichotecyna). Częsty w powietrzu zakładów produkcyjnych. dojrzałe konidia młode konidia Cladosporium Tworzy grzybnię początkowo białą, później przybierającą czarne lub oliwkowe zabarwienie, rewers czarny. Konidiofory nie są rozszerzone na końcach. Konidia są jednokomórkowe lub wielokomórkowe (przegroda tylko poprzeczna), cylindryczne, lub o kształcie cytryny, zakończone tępo, o zabarwieniu oliwkowym, ułożone w łańcuszki, często rozgałęzione. Są saprofitami materiału roślinnego, żywności, tekstyliów i materiałów gumowych, niektóre gatunki produkują toksyczne metabolity. Powodują ciemnienie ziarna zbożowego. Liczne patogeny roślin: Cladosporum herbarum (psucie i ciemnienie produktów w chłodniach), http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 12 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Cladosporum fulvum (plamistość liści pomidora w szklarniach). Mogą wywoływać u ludzi alergie. Częsty w powietrzu. konidia konidiofor Geotrichum Tworzy grzybnię niską, gładką o zabarwieniu białym. Spotykany w glebie, wodzie, powietrzu, na roślinach, zbożach i produktach mleczarskich. Jest uciążliwym mikroorganizmem w przemyśle mleczarskim i przy produkcji kiszonek, wykorzystuje kwas mlekowy jako źródło węgla powodując odkwaszanie środowiska i stwarzając warunki do rozwoju http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 13 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ mikroflory gnilnej. Najbardziej znane gatunki to: Geotrichum candidum. Geotrichum clavatum i Geotrichum fici. Rozmnaża się przez rozpad strzępki, która ulega fragmentacji na odcinki o różnej długości, zwane oidiami (artrokonidiami). Geotrichum candidum Trichoderma Mają niebieskozieloną grzybnię, gąbczaste wykwity, z nieregularną, białawą, watowatą obwódką. Konidiofory są rozgałęzione, z osią centralną - tworzą kształt drzewka. Fialidy są kształtu butelkowatego, na ich końcach umieszczone są w grupach konidia, zwykle zielone, czasami szkliste. Trichoderma viride – wykazano, że jest to forma niedoskonała, stanowi stadium konidialne workowca Hypocrea rufum. Może wytwarzać mikotoksyny, jak również antybiotyki. Występuje w glebie, często spotykany na powierzchni zmurszałego wilgotnego drewna. Jest wykorzystywany komercyjnie jako producent enzymu celulazy. Trichoderma może dzięki niej być użyteczny w kontrolowaniu innych patogennych grzybów. Stąd w rolnictwie wykorzystywany jako naturalny środek biologiczny do ochrony nasion - działa antagonistycznie w stosunku do innych grzybów glebowych. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 14 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ konidia fialida rozgałęziony konidiofor MIKOTOKSYNY Są toksycznymi metabolitami wtórnymi grzybów (pleśni), należących przede wszystkim do rodzajów Aspergillus, Penicillium i Fusarium. Mogą powstawać w wielu produktach rolnych i w bardzo różnych warunkach. Mikotoksyny mają różnorodne działania toksyczne oraz charakteryzują się wysoką odpornością na temperaturę i dlatego ich obecność w żywności i paszach niesie ze sobą potencjalne zagrożenie dla zdrowia zarówno ludzi jak i zwierząt. Liczne gatunki pleśni wytwarzają mikotoksyny, np. ochratoksyny, aflatoksyny, patulinę, kwas penicylinowy, cytryninę. Główne grupy mikotoksyn MIKOTOKSYNY PRODUCENT Aflatoksyny B1, B2, G1, G2 i M1 Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. nomius Ochratoksyna A Penicillium verrucosum, Aspergillus alutaceus Patulina Penicillium expansum, Aspergillus clavatus, Byssochlamys nivea Fumonizyny Fusarium moniliforme, F. proliferatum Deoksywalenon Fusarium graminearum, F. culmorum, F. crookwellense, F. sporotrichoides, F. poae, F. acuminatum Zearalenon Fusarium graminearum, F. culmorum, F. crookwellense http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 15 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Ochratoksyny są wytwarzane przez kilka szczepów grzybów rodzaju Aspergillus i Penicillium. Grzyby te są wszechobecne i stanowią duże zagrożenie zakażenia żywności i pasz. Ochratoksyna A należy do najbardziej rozpowszechnionych związków i stwierdzono jej występowanie w ponad 10 krajach Europy i USA. Wytwarzanie ochratoksyny przez grzyby rodzaju Aspergillus (Aspergillus ochraceus) jest ograniczone i następuje w warunkach wysokiej wilgotności i podwyższonej temperatury, podczas gdy co najmniej kilka szczepów Penicillium (Penicillium viridictum) może wytwarzać ochratoksynę w niskiej temperaturze, w granicach 5°C. Aflatoksyny są produkowane przez niektóre rodzaje A. flavus i większość, lecz nie wszystkie, rodzaje A. parasiticus. Istnieją cztery główne aflatoksyny: B1, B2, G1, G2. Mają zdolność fluorescencji w świetle UV. Aflatoksyny mogą znajdować się w mleku, serze, ziarnach zbóż, orzeszkach ziemnych, nasionach bawełny, orzechach, migdałach, figach, przyprawach oraz różnych innych produktach żywnościowych i paszach. Obecność toksyn w mleku, jajach i mięsie wynika z faktu, że zwierzęta spożywały zanieczyszczona paszę. Jednak największe ryzyko skażenia toksynami występuje w takich produktach jak ziarno kukurydzy, orzeszki ziemne oraz nasiona bawełny. Patulina jest toksycznym metabolitem wtórnym niektórych gatunków grzybów, zarówno z rodzaju Aspergillus, Penicillium, jak i Byssochlamys nivea. Wśród wyżej wymienionych grzybów pleśniowych najważniejszym gatunkiem, który powszechnie skaża jabłka i inne owoce jest Penicillium expansum. P. expansum jest często izolowany z ziemi, która zanieczyszcza powierzchnię zdrowych tkanek owoców. Tym niemniej, porost pleśni i towarzysząca mu produkcja patuliny, normalnie zachodzą tylko w następstwie uszkodzenia powierzchni owocu, które może być spowodowane przez owady i/lub burze oraz w toku obróbki. W warunkach laboratoryjnych patulina może być produkowana przez wiele różnych grzybów pleśniowych na jabłkach, winogronach, zbożach i nawet produktach przetrzymywanych w lodówce, takich jak żółty ser i konserwowane mięsa, ale w warunkach naturalnych znana jest przede wszystkim jako substancja skażająca jabłka i sok jabłkowy. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 16 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ MIKROFLORA POWIETRZA Powietrze nie jest środowiskiem sprzyjającym rozwojowi drobnoustrojów, jednakże mikroflora pozostaje stale w nim obecna, przedostając się do powietrza z gleby, wody, powierzchni roślin i od zwierząt (z otwartych jam ciała, ich wydalin). Przyjmuje się, że mikroorganizmy raczej nie rozmnażają się w powietrzu, a jedynie są za jego pośrednictwem przenoszone (prądy powietrzne) z miejsca na miejsce. Drobnoustroje rzadko występują w postaci wolnej, zwykle jako bioaerozole. Bioaerozol to układ dwu- lub trójfazowy, składający się z fazy rozpraszającej (powietrza) i rozproszonej (drobne cząsteczki płynu lub substancji stałych zawierające pyłki roślin, zarodniki grzybów, komórki bakterii, drożdży i wirusy). Drobnoustroje, przyczepione do cząstek kurzu i pyłu lub mikrokropelek płynów, mogą przebywać w powietrzu bardzo długo. Sposoby rozprzestrzeniania się bioaerozoli w powietrzu: - dynamiczna projekcja kropel – uzyskiwana w momencie ich wyrzucania przy skurczu mięśni dróg oddechowych (kaszel, kichanie), - system wentylacyjno-klimatyzacyjny pomieszczeń, z obecnością kanałów wywiewnych i nawiewnych, szybów, wind itp., - prądy konwekcyjne powietrza – na duże odległości. Oddziaływanie bioaerozoli na organizmy żywe i środowisko Saprofity i patogeny mogą powodować pogorszenie stanu higienicznego środowiska. Patogeny wywołują choroby zakaźne ludzi (błonica, odra, ospa, świnka, różyczka,), zwierząt (pryszczyca, wąglik, różyca, gruźlica, nosacizna) i roślin (choroby wirusowe, bakteryjne i grzybice). Niektóre patogeny i saprofity są przyczyną alergii u ludzi. Mogą też powodować zanieczyszczenie produktów spożywczych, farmaceutycznych, surowców dla wielu gałęzi przemysłu, materiałów budowlanych, środowiska gleby i wody. Skład ilościowy i jakościowy mikroflory powietrza zależy od wielu czynników. Po pierwsze od terenu, nad którym powietrze się znajduje (m.in. okrywy roślinnej, nasłonecznienia, gleby, opadów, wysokości). Nad miastami znajduje się więcej mikroflory niż nad lasami i polami, nad glebą jest więcej mikroorganizmów niż nad pustynią, podobnie http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 17 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ przed deszczem niż bezpośrednio po opadach. Najmniej „zakażone” jest powietrze nad górami, morzami, oceanami i lasami. Zawartość drobnoustrojów w powietrzu zmienia się wraz z wysokością. Na ulicach miasta znajduje się kilka-kilkaset tysięcy komórek drobnoustrojów w 1 dm3 powietrza. Na wysokości 500 m ponad miastem wykrywa się tylko 2-3 komórek/dm3, a na wysokości 2 km średnio 0,5 komórki w 1 dm3. Duży wpływ na stopień zakażenia powietrza drobnoustrojami ma również pora roku, najwięcej mikroorganizmów stwierdza się w miesiącach czerwiec – sierpień, najmniej w grudniu i styczniu (mikroflora jest uwięziona w lodzie, zamarzniętej glebie i przykryta śniegiem). Ilość drobnoustrojów w pomieszczeniach, szczególnie o dużym zagęszczeniu ludzi i sprzętów, jest wielokrotnie większa niż w powietrzu w miejscach odkrytych. W pomieszczeniach znajduje się szczególnie dużo drobnoustrojów chorobotwórczych, wydzielanych ze śliną podczas kaszlu i kichania przez ludzi. W zakładach przemysłowych stopień skażenia powietrza zależy od stanu sanitarnego pomieszczeń produkcyjnych, sprzętów, kanałów, higieny osobistej pracowników oraz od stanu mikrobiologicznego surowców, półproduktów i produktów. W pomieszczeniach zamkniętych, w tym biurowych, bakterie stanowią zwykle do 30% mikroflory powietrza (w tym ziarniaki zwykle ok. 50%, gronkowce 10%), ok. 70% stanowią grzyby (głównie zarodniki pleśni). Wykazywano do 100 różnych gatunków drobnoustrojów w powietrzu. W przeważającej części saprofitycznych, gatunki chorobotwórcze spotykane są zasadniczo tylko w otoczeniu człowieka. Saprofityczną mikroflorę powietrza stanowią bakterie: ziarniaki z rodzaju Micrococcus i Sarcina (na podłożu hodowlanym rosną w postaci barwnych kolonii – białych, żółtych lub pomarańczowych) wytwarzające barwniki, pałeczki Achromobacter (Alcaligenes), tlenowe laseczki przetrwalnikujące z rodzaju Bacillus, a także gronkowce (Staphylococcus epidermidis) i Alcaligenes faecalis promieniowce (Streptomyces), oraz grzyby: drożdże, najczęściej rodzaje Rhodotorula, Torulopsis i Candida, http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 18 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ zarodniki pleśni z rodzajów Cladosporium, Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Rhizopus i Mucor. Alternaria Cladosporium Penicillium W atmosferze bakterie chorobotwórcze są stosunkowo rzadkie, ale w pomieszczeniach zamkniętych, w których przebywają ludzie są dość powszechne. Gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus), pałeczka ropy błękitnej (Pseudomonas aeruginosa), a także paciorkowce z rodzaju Enterococcus i Streptococcus przedostają się do powietrza z jamy nosowo-gardłowej, zakażonych ran czy bielizny szpitalnej. Shigella sp., Salmonella sp., Clostridium sp. są wykrywane w pobliżu zakładów produkcyjnych i zakładów zbiorowego żywienia. W instalacjach wentylacyjnych i klimatyzacyjnych istnieją natomiast sprzyjające warunki do rozwoju bakterii z rodzaju Legionella, które mogą być przyczyną legionellozy i gorączki Pontiac. Grzyby pleśniowe często są czynnikiem alergizującym, mogącym wpływać na rozwój astmy, alergicznych nieżytów nosa, zapalenia spojówek i nieżytów przewodu pokarmowego. Zdolność do przetrwania mikroorganizmów w powietrzu zależy od ich wrażliwości na wysuszenie i działanie promieni UV. Najszybciej giną formy wegetatywne, najdłużej żyją formy przetrwalne, np. endospory bakterii, konidia pleśni, mikrocysty, ale też komórki osłonięte śluzem czy inną substancją organiczną oraz te, które wytwarzają barwniki karotenoidowe (żółte i czerwone). Mycobaterium tuberculosis, Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa, a także liczne gronkowce są odporne na wysuszenie i giną w powietrzu powoli. Natomiast Neisseria meningitidis (dwoinka zapalenia opon mózgowych), http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 19 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Vibrio coma (przecinkowiec cholery) czy Pasteurella pestis (pałeczka dżumy) – giną w analogicznych warunkach stosunkowo szybko. Neisseria meningitidis Legionella pneumophila Powietrze samooczyszczania grawitacyjnych. ma zdolność powietrza Szybkość jest samooczyszczania. osiadanie osiadania zależy Podstawowym drobnoustrojów oczywiście od pod mechanizmem wpływem wielkości sił komórek drobnoustrojów lub ich aglomeratów. Dlatego mieszanie i zawartość wilgoci w powietrzu znacząco wpływają na proces oczyszczania. Im większa wilgotność tym większe prawdopodobieństwo tworzenia aglomeratów i osiadania drobnoustrojów. Powietrze jest również oczyszczane poprzez działanie promieniowania UV, przy czym skuteczność tego promieniowania jest odwrotnie proporcjonalna do stopnia zapylenia powietrza. W przemyśle spożywczym i farmaceutycznym powietrze używane np. do napowietrzania hodowli prowadzonych w warunkach tlenowych, stanowi w pewnym sensie surowiec, który podobnie jak inne surowce musi podlegać wyjałowieniu. Dezynfekcja i wyjaławianie powietrza może być prowadzona następującymi metodami: mechanicznie – filtrowanie przez filtry włókniste bawełniane, z włókien szklanych lub przez roztwory kwasów i ługów, fizycznie – ogrzewanie powietrza poprzez sprężanie go do wysokich ciśnień, odpylanie elektrostatyczne oraz z zastosowaniem promieniowania UV, promieniowania jonizującego, wysokoenergetycznych promieni katodowych, gamma lub ultradźwięków, http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 20 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ chemicznie – stosowanie substancji bakteriobójczych, w tym preparatów na bazie kwasu nadoctowego, nadtlenku wodoru, podchlorynu sodu, kwasu mlekowego, glikolu propylenowego i jego pochodnych. Skuteczność dezynfekcji zależy od stopnia rozproszenia i stężenia substancji bakteriobójczej oraz wilgotności powietrza (nie niższa niż 40-60%). Dezynfekcja powinna być prowadzona skutecznie w stosunku do drobnoustrojów, ale nie powinna być toksyczna dla człowieka! OZNACZANIE STOPNIA ZAKAŻENIA POWIETRZA Analiza powietrza prowadzona jest w oparciu o obecność tzw. wskaźników bakteriologicznego zanieczyszczenia powietrza. Są to gatunki lub rodzaje wytypowane jako przedstawiciele mikroflory pochodzącej z określonych zanieczyszczeń – gleby, wód powierzchniowych, od ludzi i zwierząt. Wskaźniki bakteriologicznego zanieczyszczenia powietrza: - z przewodów oddechowych człowieka – gronkowce i paciorkowce hemolizujące Staphylococcus albus, Streptococcus salivarius, Streptococcus viridans, - cząstkami gleby – promieniowce, - cząstkami wód powierzchniowych – Pseudomonas fluorescens. Poznanie mikroflory powietrza jest szczególnie ważne dla oceny warunków higienicznych w zakładzie przemysłu spożywczego oraz określenia źródła zanieczyszczenia i mechanizmów psucia się produktów. W chwili obecnej w zakładach produkcyjnych są coraz większe wymagania odnośnie mikrobiologicznej czystości powietrza – opracowywane są coraz nowsze procedury pobierania próbek, standaryzacji metod badań mikrobiologicznych (analiza jakościowa i ilościowa), ustalenia źródeł powstawania, skutecznych metod usuwania i niszczenia mikroorganizmów w powietrza. Obecność drobnoustrojów w powietrzu może mieć wpływ na długość okresu przydatności do spożycia produktów niesterylizowanych czy też aseptyczność pakowanych produktów sterylizowanych. Wokół linii produkcyjnych źródłem wtórnego zanieczyszczenia produktów mogą być zły stan sanitarny urządzeń, sprzętów, kanałów wentylacyjnych, higiena personelu, natomiast cząstki kurzu i pyłu z ziarniakami i przetrwalnikami bakterii tlenowych oraz zarodnikami pleśni mogą wykazywać silne właściwości rozkładu niektórych substancji organicznych co jest niekorzystne w przetwórstwie spożywczym. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 21 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Trzy główne źródła zakażeń mikrobiologicznych w przemyśle spożywczym: personel – osoba nie wykonująca żadnej pracy emituje od 100 tys. do 6 mln cząstek wielkości 0,3 m w czasie 1 minuty. Wzrost jej aktywności to nawet do 107 mln cząstek na minutę. Stopień zanieczyszczenia zmienia się w ciągu dnia, wpływa na to liczba osób przebywających w dziale, ruchy osób i urządzeń, wentylacja, wentylacja – powinna minimalizować mikrobiologiczne zanieczyszczenia, kondensację pary, zapachy. Projekt wentylacji powinien uwzględnić przepływ powietrza z pomieszczeń o mniejszym skażeniu do tych o większym skażeniu oraz z obszaru produkcyjnego do obszaru surowców lub na zewnątrz. Zbyt duża wilgotność sprzyja rozwojowi grzybów strzępkowych, podobnie jak nieskuteczne filtry mogą być źródłem zanieczyszczeń, nieodpowiednie mycie – jednorazowe spłukiwanie wodą posadzki powoduje np. przedostawanie się mikroorganizmów z kurzem do powietrza, ciągłe spłukiwanie zmniejsza zanieczyszczenia biologiczne. Stopień zanieczyszczenia powietrza atmosferycznego określamy w oparciu o oznaczoną liczbę bakterii, promieniowców oraz drożdży i pleśni w 1 m3. Stopień Ogólna liczba Liczba drożdży Promieniowce zanieczyszczenia bakterii jtk/m3 i pleśni jtk/m3 jtk/m3 powietrza atmosferycznego Poniżej 1000 10 3000-5000 1000-3000 10-100 5000-10000 Powyżej 3000 Powyżej 100 Powyżej 10000 Niezanieczyszczone Średnio zanieczyszczone Silnie zanieczyszczone W Polsce nie ma obowiązujących norm określających czystość mikrobiologiczną powietrza w zakładach przemysłowych. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 22 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Najważniejszym i najtrudniejszym momentem przy oznaczaniu mikroflory powietrza jest pobieranie próbek. W tym zakresie wykonano najwięcej prac. Zasadniczo wyróżnia się dwie grupy metod pobierania prób: 1) osiadanie zawiesin drobnoustrojów, 2) filtracja powietrza przez filtry. OSIADANIE ZAWIESIN DROBNOUSTROJÓW Wyróżniamy kilka metod. 1) osiadanie drobnoustrojów pod wpływem naturalnych sił grawitacji (metoda sedymentacyjna Kocha) Najczęściej stosowana, najprostsza i najstarsza metoda badania stopnia zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza jest metodą sedymentacyjną. Oparta jest na swobodnym osiadaniu pod wpływem sił grawitacji pyłków i kropelek niosących mikroorganizmy. Omeliański stwierdził, że w czasie 5 minut na płytce o powierzchni 100 cm2 osiada tyle drobnoustrojów, ile znajduje się w 10 dm3 powietrza. Ta zależność jest wykorzystywana do ilościowego oznaczania mikroflory w powietrzu. Pobranie próby polega na otwarciu przez ściśle określony czas płytki Petriego z wylaną uprzednio pożywką, a następnie inkubacji przez 48h (najczęściej 2 płytki z agarem odżywczym w 37C i 2 z agarem brzeczkowym w 26C) i policzeniu wyrosłych kolonii. Zakładając, że z każdej komórki wyrosła 1 kolonia oblicza się ilość drobnoustrojów (L) w 1 m3 powietrza korzystając ze wzoru: L a 100 100 Pk gdzie: L – ilość drobnoustrojów [jtk/m3] a – średnia ilość kolonii wyrosłych na płytkach Petriego z danym podłożem, P – powierzchnia płytki [cm2], k – współczynnik czasu ekspozycji płytki, k=1 dla 5 minut, k=2 dla 10 minut, k=3 dla 15 minut. Wady metody: - na płytce osiadają nie tylko drobnoustroje znajdujące się w powietrzu nad płytką, ale również te z warstw sąsiednich naniesione prądami powietrznymi, http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 23 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ - na płytkach osiadają przede wszystkim drobnoustroje skupione w większych aglomeratach, a tylko niewielki procent komórek bardzo rozproszonych. Przy użyciu metody filtracji aparatem Korotowa stwierdzono, że wyniki uzyskane metodą Kocha są około 3-krotnie zaniżone. Jednak przy zapewnieniu stałych parametrów (wielkość płytek, czas pomiaru) metoda Kocha pozwala uzyskać w prosty sposób porównywalne i w miarę dokładne wyniki. 2) wymuszone osiadanie drobnoustrojów na powierzchni podłoża hodowlanego przez nadanie powietrzu energii kinetycznej (np. aparat Korotowa) 3) osadzanie zawiesin drobnoustrojów siłami elektrostatycznymi, 4) osadzanie zawiesin drobnoustrojów parą wodną lub rozpyloną cieczą (np. przyrząd Reczmienskiego). FILTRACJA POWIETRZA PRZEZ FILTRY Polegają na przepuszczaniu określonej objętości powietrza przez odpowiedni jałowy filtr. Po przefiltrowaniu powietrza, wypłukuje się zatrzymane drobnoustroje ze stałego materiału filtracyjnego znaną objętością cieczy, którą następnie posiewa się na pożywki stałe. Wyróżnia się kilka metod w zależności od rodzaju użytego filtru: 1) filtracja powietrza przez filtry stałe nierozpuszczalne 2) filtracja powietrza przez filtry stałe rozpuszczalne 3) filtracja powietrza przez ciecze w odpowiednich przyrządach. Niektórzy wydzielają jeszcze trzecią grupę – METODY ZDERZENIOWE Wyróżniamy w nich dwa sposoby przepuszczania powietrza tzn. wirowanie powietrza wciąganego przez przyrząd (mikroorganizmy osadzają się na cylindrze) lub zderzanie strumienia zassanego powietrza z pożywką. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 24 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ ANALIZA ILOŚCIOWA MIKROORGANIZMÓW – METODY HODOWLANE Znajomość ilości mikroorganizmów potrzebna jest dla oceny wzrostu drobnoustrojów w warunkach hodowli laboratoryjnych, dla oceny prawidłowego przebiegu procesów biotechnologicznych, dla określenia stopnia zanieczyszczenia produktów żywnościowych lub farmaceutycznych. Metody określania ilości drobnoustrojów oparte są na metodach bezpośrednich (mikroskopowych) lub pośrednich (wagowych, optycznych, hodowlanych). Metody pośrednie hodowlane oparte są na zdolności drobnoustrojów do rozmnażania, dzięki czemu oznacza się tylko żywe komórki zdolne do wzrostu: - w pożywkach płynnych (metoda rozcieńczeń), - w pożywkach stałych (metoda płytkowa). METODA ROZCIEŃCZEŃ Metoda seryjnych rozcieńczeń Listera należy do klasycznych technik stosowanych do określania liczby drobnoustrojów oraz do izolowania czystych hodowli ze środowiska płynnego. Polega na wieloetapowym rozcieńczaniu badanej zawiesiny, tak by w 1 cm 3 znajdowała się 1 komórka. W kolejnych rozcieńczeniach wykonuje się posiewy po 1 cm3 do pożywek płynnych co najmniej w 2 powtórzeniach. Po inkubacji określa się ilość prób dodatnich (takich, w których rosną drobnoustroje). Korzystając ze specjalnych tablic (McCrady’ego) ujmujących statystycznie ilość prób wylicza się w oparciu o rachunek prawdopodobieństwa NPL, czuli najbardziej prawdopodobną liczbę drobnoustrojów w 1 cm3 badanej próby. Dokładność metody zależy od przygotowania właściwych rozcieńczeń i ilości równoległych prób. Warunkiem jest przygotowanie takiego szeregu rozcieńczeń, aby w ostatnim nie były już obecne mikroorganizmy. Jest to metoda czasochłonna, pracochłonna, wymagająca dużej ilości szkła i jest rzadko stosowana. METODA PŁYTKOWA Tradycyjna metoda mikrobiologiczna stosowana powszechnie, wprowadzona przez Roberta Kocha w 1881 roku. Znajduje zastosowanie do określania liczby drobnoustrojów, izolacji czystych kultur oraz obserwacji mikroskopowych Polega na wysiewie odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny drobnoustrojów na pożywkę stałą, inkubację i liczenie wyrosłych kolonii. Wady: wyrosłe kolonie mogą się łączyć w łańcuszki, zlewać się itp., a więc mogą http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 25 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 8 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ powstawać z więcej niż 1 komórki, poza tym wyrastają kolonie tylko z tych komórek, które są zdolne do rozmnażania. Procedura: - rozcieńczenia zawiesiny (0,85% NaCl jałowy – jako rozpuszczalnik, w objętości 9,90 lub 99 cm3 uzupełnia się odpowiednio 0,10 lub 1 cm3 zawiesiny drobnoustrojów, uzyskując żądane rozcieńczenia, roztwór dokładnie zamieszać, do każdego rozcieńczenia osobne pipety!) - posiewy na płytki Petriego – metoda wgłębna lub powierzchniowa - inkubacja – czas 24-48 godzin, w temperaturze optymalnej dla danego gatunku drobnoustrojów, płytki z agarem odwrócone do góry nogami, z żelatyną normalnie - liczenie – liczy się kolonie wyrosłe, odrzucając te płytki, gdzie kolonii jest więcej niż 300 L = (R2 / r2) an gdzie: R – promień płytki [mm], r – promień pola widzenia [mm], a – średnia liczba kolonii w polu widzenia, n – rozcieńczenie zawiesiny drobnoustrojów. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 26
