Wektory ekspresyjne
advertisement
Wybór systemu ekspresyjnego Bakterie Escherichia coli Zalety: wysoki poziom ekspresji (do 500 mg/l hodowli) dobrze poznany system proste technologie niskie koszty Wady: brak modyfikacji potranslacyjnych ograniczona wielkość klonowanego DNA różnice w „codon usage” Bacillus spp. - zalety Organizm GRAS (generally regarded as safe) Możliwość produkcji wielu białek do pożywki Bakterie dobrze scharakteryzowane (znany genom B. subtilis i B. licheniformis) Rośnie na ubogich podłożach Wysoki poziom ekspresji (10 mg/litr) Bacillus spp. - ograniczenia Preferowana ekspresja homologiczna: Geny pochodzące z Bacillus sp. produkowane z dużą wydajnością (skala produkcji białek gram/litr) Niewydajna ekspresja białek eukariotycznych (skala produkcji białek mg/litr) Grzyby Saccharomyces cerevisiae ZALETY Średni poziom ekspresji Glikozylacja białek Białka kierowane do pożywki Dobrze poznany proces fermentacji Łatwa liza komórek WADY Mała wydajność transformacji Ograniczona ilość wektorów Pichia pastoris Modyfikacje Poziom potranslacyjne białek ekspresji genów heterogenicznych jest z reguły od 10- do 100- razy wyższy niż w drożdżach Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Produkowane białka mogą być kierowane do: cytoplazmy na zewnątrz komórki (mała ilość białek Pichii kierowanych na zewnątrz komórki) Produkcję białek rekombinowanych w Pichia pastoris powinno prowadzić się w odpowiednich bioreaktorach (pełne wykorzystanie „potencjału ekspresyjnego P. pastoris) Glikozylacja białek posiadających w swej sekwencji motyw AsnX-Ser/Thr może prowadzić do utraty aktywności enzymatycznej lub antygenowych eksprymowanego białka heteregonicznego w Pichia pastoris Kluyveromyces lactis Wysoki poziom ekspresji Możliwość zakupu gotowych kompetentnych komórek K. lactis Proste protokoły (dla osób bez doświadczenia w pracy z drożdżami) Możliwość wykorzystania systemów dla celów komercyjnych (system sublicencjonowania) Możliwość produkcji białek na zewnątrz lub wewnątrz komórek http://www.neb.com/nebecomm/products/productE1000.asp Kluyveromyces lactis Ekspresja w drożdżach zachodzi spod silnego promotora LAC4, który NIE umożliwia ekspresji w E. coli (geny kodujące białka toksyczne dla E. coli mogą być klonowane do plazmidu pKLAC1 w bakteriach przed ich ekspresją w systemach drożdżowych) Białka produkowane w K. lactis ulegają modyfikacjom (glikozylacja) Selekcja odbywa się bez użycia antybiotyków – acetamidaza (amdS) z pKLAC1 pozwala transformowanym komórkom na użycie acetamidu, jako źródła azotu Hansenula polymorpha Do 150 kopii klonowanego genu na komórkę Możliwość koekspresjii do czterech różnych genów Tanie pożywki Wysoki poziom ekspresji do13.5 g/L Stabilność białek - niewielka aktywność proteolityczna http://www.artes-biotechnology.com/expres/hansenula/hansenula01.jsp Trichoderma reesei Wysoki poziom ekspresji Glikozylacja białek Możliwość ekspresji zewnątrzkomórkowej Mała wydajność transformacji Trudny proces fermentacji Ograniczony wybór wektorów Specyficzny codon usage Komórki owadzie Baculovirus system, komórki owadzie Sf9 Glikozylacja Proste zwiększanie skali www.invitrogen.com Trudne warunki hodowli Powolny wzrost Hodowle komórkowe Komórki zwierzęce Zalety Glikozylacja Mogą być z nich wyprowadzane ciągłe linie komórkowe Niektóre komórki rosną w zawiesinie (e.g., CHO cells) Tempo wzrostu bardzo wysokie (e.g., HeLa cells) Ekspresja zewnątrzkomórkowa Wady Niektóre komórki rosną przytwierdzone do podłoża Skomplikowana hodowla Wolny wzrost niektórych linii komórkowych (15-25h) Bardzo wrażliwe na kontaminację Bardzo wrażliwe na wstrząsy Hodowla komórek roślinnych Zalety Hodowla w zawiesinie Małe wymagania napowietrzania Białka w wakuolach Wady Mała ilość systemów Agrobacterium Specyficzne wirusy Powolny wzrost Wrażliwe na wstrząsy Inne systemy Zwierzęta Transformacja zarodków Użycie tkankowo-specyficznych promotorów (np. produkcja w mleku) ESCHERICHIA COLI Plazmid - definicja Plazmidy – autonomiczne, pozachromosomalne elementy genetyczne występujące (zwykle w postaci kolistych, lub rzadziej w postaci liniowych cząsteczek DNA) w bardzo wielu organizmach prokariotycznych (i niektórych eukariotycznych) Plazmidy - charakterystyczne cechy Zdolność do trwałego utrzymywania się w komórce Zdolność replikowania się w komórce w kontrolowany sposób Plazmidy nie kodują funkcji, które byłyby niezbędne do życia komórki (w „normalnych” warunkach) Wybór systemów ekspresyjnych w E. coli Zalety: wysoki poziom ekspresji (do 500 mg/l hodowli) dobrze poznany system proste technologie niskie koszty Wady: brak modyfikacji posttranslacyjnych ograniczona wielkość klonowanego DNA różnice w „codon usage” Wektory prokariotyczne Zawierają tzw. markery selekcyjne, nadające komórkom gospodarza łatwy do testowania fenotyp (np. oporność na antybiotyk) Posiadają unikalne miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne w obrębie rejonów, w które można wprowadzić obcy DNA, bez naruszania zdolności wektora do replikacji i możliwości selekcji zrekombinowanych cząstek Są niezdolne do przeżycia poza komórką gospodarza, namnażają się w niewielu szczepach i nie posiadają zdolności koniugacyjnych Wektory prokariotyczne - podział Wektory autonomiczne – autonomicznie replikują się w komórkach gospodarza Wektory integracyjne – włączają się do genomu gospodarza (duża stabilność, mała liczba kopii) Wektory ekspresyjne - podział Wektory ekspresyjne z silnym promotorem - jeżeli klonowany gen nie posiada efektywnego promotora, ale zawiera własny rejon RBS to włączany jest do wektora tuż za silnym promotorem (fuzja genowa transkrypcyjna) Wektory ekspresyjne Wektory ekspresyjne z sygnałami translacyjnymi – konieczność modyfikacji sekwencji genu w miejscu kodonu inicjatorowego translacji (ATG) (fuzja genowa translacyjna) Wektory ekspresyjne Wektory ekspresyjne umożliwiające produkcję białek hybrydowych – białka hybrydowe z dodatkowymi aminokwasami w części N-terminalnej (fuzje proksymalne) lub w części C-terminalnej (fuzje dystalne) (fuzja translacyjnie złożona) Wybór systemu Wybór stopień tolerancji komórek gospodarza na obecność obcego białka zasada: siła promotora determinuje możliwy do osiągnięcia stan jego represji (słabszy promotor jest ściślej kontrolowany, natomiast silny promotor jest gorzej regulowany) Wybór odpowiedniego systemu odpowiedniego wektora: ilość kopii wektora na komórkę promotory bakteriofagowe (PR i PL z faga λ oraz Φ10 z faga T7), promotory bakteryjne (PLAC) oraz eukariotyczne (PCMV) Składniki systemu ekspresyjnego DNA kodujace białko docelowe Wektor (plazmid) mRNA cDNA genomowe DNA pET pQE pGEX Szczep ekspresyjny (E. coli ) BL21(DE3) Rosetta(DE3) plus pRARE Tuner(DE3) ADA494(DE3)trxB mutant Origami(DE3) trxB and gor mutations System nadprodukcji białek bakteriofaga T7 (Tabor-Studier) Indukcja IPTG Indukcja IPTG polimeraza RNA polimeraza RNA T7 E.coli gen T7 lac O promotor lac polimeraza RNA T7 lac O promotor T7 Inaktywacja DE3 represor lacI represor lacI gen kodujący represor lacI lizozym T7 gen kodujący lizozym genom E.coli gen docelowy pLysS pET gen kodujący represor lacI Komórka gospodarza http://www.pg.gda.pl/chem/Katedry/Mikrobiologia/inzgen.html System pET (Novagen) Możliwość klonowania genów, które chcemy eksprymować w E. coli, pod silny promotor bakeriofaga T7, który nie jest rozpoznawany przez polimerazę RNA E. coli Brak ekspresji genów spod promotora T7 w komórkach E. coli dopóki nie pojawi się w nich polimeraza RNA faga T7 System pET –części składowe Plazmidowy wektor serii pET umożliwiający ekspresję wklonowanego do niego genu pod kontrolą silnych sygnałów transkrypcyjnych (promotor) i translacyjnych (RBS) pochodzących z bakteriofaga T7 Szczep E. coli pozwalający na indukcję na ściśle kontrolowanym poziomie polimerazy RNA bakteriofaga T7 spod wybranego promotora E. coli np. pLacUV5 Induktor IPTG regulujący poziom ekspresji genu z plazmidu pET w komórkach E. coli Wektory ekspresyjne serii pET (Novagen) Wektory ekspresyjne serii pET - wektory transkrypcyjne Dostępne trzy wektory transkrypcyjne: pET21(+), pET23(+) i pET24(+) umożliwiają silną transkrypcję mRNA wklonowanego genu z promotora T7 Brak sekwencji RBS w obrębie transkryptu powstającego spod promotora T7 W celu uzyskania białka z genu wklonowanego do tych wektorów należy klonować go z własną sekwencją RBS umożliwiającą translację w E. coli Wektory ekspresyjne serii pET - wektory translacyjne Umożliwiają silną transkrypcję mRNA wklonowanego genu z promotora T7 Posiadają sekwencje RBS w obrębie transkryptu powstającego spod promotora T7 zapewniającą wydajną translacje Większość zawiera miejsca restrykcyjne pozwalające klonować w jedną z trzech możliwych ramek odczytu spod RBS znajdującego się na wektorze Wektory ekspresyjne rodziny pET Większość wektorów serii pET poza typowym ori replikacyjnym zawiera również sekwencję origin replikacji faga f1 umożliwiającą uzyskanie jednoniciowej formy DNA tych plazmidów np. w celu przeprowadzenia mutagenezy ukierunkowanej w obrębie ich sekwencji Wszystkie wektory z origin f1 zawierają w nazwie sufix (+) pET System – trzy podstawowe kryteria wyboru wektora ekspresyjnego 1. Ilość białka, którą chcemy wyprodukować: „małe” ilości białka (techniki badania aktywności białek, badania oddziaływania uzyskanego białka z wybranymi ligandami, uzyskiwanie przeciwciał przeciwko tym białkom) „duże” ilości białka (uzyskanie stężonych lub wysoce aktywnych preparatów – badania strukturalne, zastosowania przemysłowe) pET System – 3 podstawowe kryteria wyboru wektora ekspresyjnego 2. • • • Możliwość lub konieczność uzyskania białka w postaci fuzji z wybranymi domenami fuzyjnymi mającemu na celu np.: ułatwienie procedury oczyszczania eksprymowanego białka zwiększenie rozpuszczalności uzyskanego białka w cytozolu E. coli transport eksprymowanego białka do przestrzeni periplazmatycznej E. coli pET System – 3 podstawowe kryteria wyboru wektora ekspresyjnego 3. Strategia klonowania czyli wybór wektora pod względem miejsc restrykcyjnych obecnych w MCS oraz pod względem wyboru jednej z trzech możliwych ramek odczytu pET System – trzy podstawowe kryteria wyboru wektora ekspresyjnego Jeżeli możliwość klonowania do wektorów ekspresyjnych jest ograniczona można zastosować „klonowanie bez ligazy” (wektory LIC serii pET np. pET30LIC) Klonowanie bez użycia ligazy Domeny fuzyjne- różnorodność wektorów plazmidowych pET Domeny fuzyjne („tag”) umożliwiają ekspresję tego samego genu w postaci białek fuzyjnych różniących się właściwościami wynikającymi z ich sekwencji Domeny fuzyjne mogą składać się z kilku reszt aminokwasowych np. 6 reszt aminokwasowych HisTag lub mogą być to sekwencje reszt aminokwasowych białek np. 495 reszt aa. białka NusA z Nus-Tag Domeny fuzyjne - różnorodność wektorów plazmidowych pET Domeny fuzyjne umożliwiające łatwą detekcję białek fuzyjnych za pomocą techniki Western blotting: S•Tag, T7•Tag, GST•Tag, His•Tag, Nus•Tag, HSV•Tag Domeny fuzyjne umożliwiające „proste” oszacowanie poziomu ekspresji białka nawet w surowych ekstraktach komórkowych: S•Tag, GST•Tag Domeny fuzyjne - różnorodność wektorów plazmidowych pET Domeny fuzyjne umożliwiające łatwe oczyszczanie białek fuzyjnych za pomocą różnego typu chromatografii powinowactwa: His•Tag, GST•Tag, S•Tag, T7•Tag Domeny fuzyjne umożliwiające transport eksprymowanego białka do przestrzeni periplazmatycznej E. coli np. sekwencja sygnalna ompT/pelB w wektorach pET12a-c Domeny fuzyjne - różnorodność wektorów plazmidowych pET Sekwencje rozpoznania dla wybranych enzymów proteolitycznych umożliwiające łatwe odcięcie domeny fuzyjnej po wykorzystaniu ich w oczyszczaniu docelowego białka typu dzikiego za pomocą wybranej metody chromatografii powinowactwa: LeuValProArg*GlySer – trombina AspAspAspAspLys* - enterokinaza IleGluGlyArg* - czynnik X * - miejsce cięcia Domeny fuzyjne - różnorodność wektorów plazmidowych pET Domeny fuzyjne zwiększające rozpuszczalność białek fuzyjnych i ułatwiające powstawanie właściwych mostków disiarczkowych: W cytoplazmie szczepów E. coli mutantów trxB- - Nus•Tag, Trx•Tag i GST•Tag W przestrzeni periplazmatycznej E. coli oraz wspomagające „folding” białek fuzyjnych DsbA•Tag DsbC•Tag Domeny fuzyjne - różnorodność wektorów plazmidowych pET Domena fuzyjna zmniejszająca rozpuszczalność białek fuzyjnych i ułatwiające powstawanie ciał inkluzyjnych tzw „kamień białkowy”: KSI-Tag silnie eksprymowana silnie hydrofobowa domena fuzyjna zbudowana ze 125 aa użyteczna także przy ekspresji małych białek a nawet peptydów zabezpieczająca je przed proteolizą w cytoplazmie His•Tag Sekwencja domeny fuzyjnej Ligand wiążący domenę fuzyjną: Elutant: • Zbuforowane roztwory imidazolu (pH=7,9) • Poprzez powolne obniżanie pH Np. HisHisHisHisHisHisMetXXXX His•Tag Zalety Możliwość oczyszczania białka Możliwość oczyszczania białka w warunkach denaturujących (6M Gu-HCl lub 6M mocznik) Wady www.invitrogen.com Należy unikać buforów zawierających związki: redukujące takie jak: merkaptoetanol, ditiotreitol oraz chelatujące tj. EDTA Plazmidy serii pETBlue Powodem skonstruowania plazmidów serii pETBlue była chęć połączenia zalet plazmidów serii pET tj. wysokokopijność i ekspresja wklonowanych genów spod silnego promotora T7 z prostą selekcją rekombinantowych klonów E. coli opartą o znany z plazmidów pUC18/19 system selekcji białe/niebieskie kolonie na podłożach z X-Gal i IPTG Plazmidy serii pETBlue oraz pET Plazmidy serii pET Plazmidy serii pETBlue Plazmidy serii pETBlue – selecja „białe/niebieskie” Ekspresja -peptydu galaktozydazy LacZ E. coli odbywa się spod „słabego” promotora ptet E. coli Dzięki umiejscowieniu MCS w obrębie fragmentu genu lacZ kodującego -peptyd galaktozydazy LacZ E. coli możliwa jest prosta selekcja klonów rekombinantowych na podłożach z X-gal i IPTG - Białe kolonie rekombinantowe - Niebieskie kolonie niosące nierekombinowane plazmidy serii pETBlue Plazmidy serii pETBlue – selecja „białe/niebieskie” Selekcja „białe/niebieskie” dla plazmidów pETBlue jest możliwa do przeprowadzenia tylko w szczepach E. coli, które nie produkują natywnej betagalaktozydazy E. coli Plazmidy serii pETBlue – selekcja „białe/niebieskie” Plazmidy serii pETBlue – ekspresja spod promotora T7 W plazmidach serii pETBlue znajdują się dwie sekwencje operatorowe lacO (miejsca wiązania dla represora lacI) Plazmidy serii pETBlue – ekspresja spod promotora T7 Plazmidy serii pETBlue nie niosą własnej kopii genu lacI represora (w przeciwieństwie do plazmidów serii pET) Plazmidy serii pETBlue – ekspresja spod promotora T7 Plazmidy serii pETBlue są wykorzystywane do ekspresji białek w warunkach ściślejszej kontroli represorem lacI niż ma to miejsce w przypadku plazmidów serii pET Szczepy ekspresyjne E. coli dla plazmidów pETBlue www.novagen.com Szczepy ekspresyjne E. coli dla plazmidów pETBlue www.novagen.com Szczepy ekspresyjne E. coli dla plazmidów pETBlue Istniej możliwość prowadzenia ekspresji w komórkach E. coli NovaBlue transformowanych plazmidem serii pETBlue po ich zakażeniu fagiem CE6 Plazmidy serii pETBlue www.novagen.com Koekspresja dwóch i więcej genów w systemie pET Koekspresja dwóch (lub więcej genów) w E. coli może mieć na celu np.: Wyprodukowanie dużej liczby multimerycznych kompleksów białek enzymatycznych Produkcję określonych białek wraz ze specyficznymi dla nich białkami opiekuńczymi Koekspresja dwóch i więcej genów w systemie pET Produkcja multi-podjednostowych kompleksów białek służy: Badaniu oddziaływań pomiędzy poszczególnymi podjednostkami kompleksu Badaniu właściwości enzymatycznych multimerycznego kompleksu enzymatycznego Koekspresja z białkiem opiekuńczym jest często jedyną drogą otrzymania niektórych białek w postaci natywnej z zachowaniem ich „pierwotnej” funkcji Koekspresja dwóch i więcej genów w systemie pET Koekspresja dwóch i więcej genów w E. coli może być osiągnięta: Poprzez wklonowanie dwóch lub więcej genów do jednego wektora plazmidowego Poprzez transformację komórek E. coli dwoma lub więcej plazmidami posiadającymi kompatybilne ori replikacji oraz niosącymi różne geny oporności na antybiotyki Koekspresja dwóch i więcej genów w systemie pET Koekspresja dwóch i więcej genów w systemie pET Koekspresja dwóch i więcej genów w systemie pET Istotny jest odpowiedni wybór wektora i szczepu ze względu na kompatybilność ori replikacji i genów oporności na antybiotyki wektorów (oporność „własna” szczepów ekspresyjnych na antybiotyki) Koekspresja dwóch i więcej genów w systemie pET DuetSystem System składa się z czterech wektorów plazmidowych umożliwiających jednoczesną ekspresję nawet ośmiu różnych białek w E. coli Każdy z tych wektorów pozwala na jednoczesną ekspresję do dwóch różnych genów spod niezależnych promotorów T7lac Wektory te umożliwiają ekspresję wklonowanych białek w postaci natywnej lub fuzji z His-Tag lub S-Tag w celu detekcji i łatwego oczyszczania powstałych białek fuzyjnych Koekspresja dwóch i więcej genów w systemie pET Duet System System ten pozwala na stosowanie innych wektorów serii pET, pETBlue, pETcoco wymiennie z poszczególnymi wektorami Duet System
