1. Wiadomości ogólne dotyczące pestycydów Pestycydy (łac. pestis

Ćwiczenie 1. OZNACZANIE PESTYCYDÓW W WODACH
1. Wiadomości ogólne dotyczące pestycydów
Pestycydy (łac. pestis – zaraza, pomór, caedo – zabijam) – ogół substancji pochodzenia naturalnego
lub uzyskanych na drodze syntezy, stosowanych do zwalczania niepożądanych organizmów. Używane
są głównie w rolnictwie do ochrony roślin uprawnych, lasów, zbiorników wodnych, ale również
zwierząt, ludzi, czy produktów żywnościowych, a także do niszczenia żywych organizmów, uznanych
za szkodliwe, w budynkach inwentarskich, mieszkalnych, szpitalnych i magazynach.
Podział pestycydów w zależności od kierunku zastosowania:
- Zoocydy - środki do zwalczania szkodników zwierzęcych, np. insektycydy (Karbaryl),
- Fungicydy - środki grzybobójcze (Nimrod, Topsin).
- Herbicydy - środki chwastobójcze (Roundup).
- Regulatory wzrostu - środki stymulujące lub hamujące procesy życiowe roślin.
- Atraktanty - środki zwabiające.
- Repelenty - środki odstraszające.
Podział pestycydów pod względem chemicznym:
- Pestycydy nieorganiczne – np.
insektycyd arsenian ołowiu PbHAsO4, herbicyd
amidosulfonian amonu H2NS(O2)ONH4, fungicyd zasadowy chlorek miedzi(II) 3Cu(OH)2
·CuCl2·H2O
- Pestycydy organiczne – np. pestycydy chloroorganiczne (HCH, DDT, metoksychlor),
fosforoorganiczne (monokrotofos), pochodne kwasu fenoksyoctowego, (2,4-D; 2,4-DB;
2,4,5-T), pochodne triazynowe (symazyna, atrazyna)
Stosowanie pestycydów przynosi wiele niewątpliwych korzyści, do których można zaliczyć m.in.
zwiększenie plonów upraw rolniczych dzięki ograniczaniu chorób roślin oraz niszczeniu patogenów,
czy chwastów oraz zmniejszenie strat żywności w trakcie magazynowania i transportu. Niestety ich
stosowanie ma też negatywne skutki. Ponieważ wykazują one dużą trwałość, ulegają akumulacji w
środowisku oraz bioakumulacji. Sprzyja też temu duża ich mobilność w środowisku naturalnym
człowieka. Kumulacja szkodliwych pozostałości po stosowanych zabiegach zależy od gatunku rośliny,
rodzaju pestycydu, wielkości dawki oraz sposobu aplikacji. Do organizmu człowieka pestycydy
przenikają głównie przez przewód pokarmowy, a dostarczone jednorazowo dawki tych środków nie są
na ogół szkodliwe, jednak nawet niewielka ich ilość przyjmowana stale, kumuluje się w organizmie i
staje się niebezpieczna.
Z uwagi na wspomniane właściwości szczególnie narażone na obecność pestycydów są
zbiorniki i cieki wodne, w tym te, które są źródłem wody pitnej. Choć wiele spośród pestycydów
zostało wycofanych z użycia w wielu krajach, to jednak są one nadal produkowane i stosowane w
wielu krajach rozwijających się. Z uwagi na dosyć wysoką lotność niektórych pestycydów rozsiane na
polach uprawnych i plantacjach w krajach tropikalnych przedostają się stosunkowo łatwo do atmosfery
i transportowane wraz z masami powietrza w kierunku biegunów, trafiają z opadami atmosferycznymi
do gleb strefy umiarkowanej. Największy problem stanowią tu
pozostałości pestycydów
chloroorganicznych takich, jak DDT i jego metabolity (p,p’-DDE i p,p’-DDD) oraz stereoizomery
heksachlorocykloheksanu, heptachlor, aldryna i dieldryna.
Biorąc pod uwagę powyższe, kontrola poziomu pozostałości pestycydów w żywności jest
ciągle konieczna. Wybór odpowiedniej metody analitycznej do oznaczania pozostałości pestycydów
1
zależy głównie od rodzaju produktu spożywczego poddanego badaniu, tzw. matrycy, oraz od jego
natury chemicznej. Przed przystąpieniem do oznaczania analitów, należy wykonać wiele czynności
poprzedzających ten proces, do których należą: właściwe pobranie próbki, ekstrakcja pestycydów z
próbki, oczyszczanie ekstraktu oraz jego odpowiednie przygotowanie i dopiero na końcu identyfikacja
odpowiednio dobraną techniką badawczą. Metodami chromatograficznymi, służącymi do oznaczania
pestycydów mogą być zarówno chromatografia gazowa (GC), która jest stosowana najczęściej, jak i
chromatografia cieczowa (HPLC).
2. Ogólne zasady postępowania przy oznaczaniu pestycydów w wodach
Pestycydy występują w wodach na stosunkowo niskich poziomach stężeń. Dlatego niezbędny
jest etap izolacji pestycydów ze skomplikowanej matrycy wodnej oraz etap wzbogacania przed
ostatecznym oznaczeniem końcowym. Schemat poniżej pokazuje typowe etapy postępowania przy
analizie śladowych ilości pestycydów:
Metody izolacji (wzbogacania) pestycydów z próbek wody. Metodą najczęściej wykorzystywaną
przy przygotowaniu próbki do analizy jest ekstrakcja do fazy stałej (SPE) oraz pewna jej odmiana
mikroekstrakcja do fazy stałej (SPME). Zasada ekstrakcji w SPE polega na wykorzystaniu zjawiska
podziału związków między dwie fazy: stałą i ciekłą. W pierwszym etapie anality są zatrzymywane na
2
powierzchni złoża sorbentu przy czym muszą mieć większe powinowactwo do fazy stałej niż do
matrycy próbki. Ekstrakcja do fazy stałej umożliwia przechowywanie analitów niestabilnych lub o
dużej lotności na powierzchni stałego sorbentu oraz wykonywanie reakcji derywatyzacji między
aktywnymi grupami analitu i sorbentu.
Właściwy proces ekstrakcji analitów do fazy stałej jest zwykle poprzedzony etapem
kondycjonowania złoża sorbentu. Proces ten polega na przygotowaniu powierzchni sorbentu do
efektywnej izolacji i wzbogacania analitów z wody. W wyniku kondycjonowania sorbentu centra
aktywne złoża ulegają aktywacji np. w przypadku żelu krzemionkowego modyfikowanego fazą
oktadecylową skręcone łańcuchy ulegają rozprostowaniu, tworząc na powierzchni sorbentu swego
rodzaju szczotkę o znacznie powiększonej powierzchni aktywnej. Należy zwrócić uwagę, aby ten sam
rozpuszczalnik był stosowany zarówno do kondycjonowania, jak i do elucji analitów z powierzchni
sorbentu po wzbogaceniu. W praktyce kondycjonowanie przeprowadza się przez przepłukanie złoża
niewielką objętością rozpuszczalnika lub rozpuszczalników organicznych oraz rozpuszczalnika o
właściwościach najbardziej zbliżonych do właściwości matrycy badanej próbki (wody dejonizowanej w
przypadku próbek wodnych).
Oddzielenia analitów od zanieczyszczeń w trakcie SPE można dokonać na trzy sposoby - poprzez:
 ekstrakcję selektywną - na sorbencie w trakcie wzbogacania są zatrzymywane jedynie oznaczane
związki organiczne, a pozostałe przechodzą przez złoże bez zatrzymywania,
 selektywne wymywanie zanieczyszczeń - w trakcie płukania złoża sorbentu są wymywane
zanieczyszczenia, a oznaczane anality pozostają na złożu i są wymywane innymi
rozpuszczalnikami,
 selektywne wymywanie analitu - wymywanie oznaczanych związków przy jednoczesnym
pozostawaniu na złożu sorbentu związków stanowiących zanieczyszczenie.
Najczęściej stosuje się ekstrakcję takimi rozpuszczalnikami, jak: dichlorometan, pentan, aceton,
metanol, izopropanol, octan etylu, heksan, acetonitryl, izooktan lub ich mieszaniny. Najbardziej
skutecznym rozpuszczalnikiem do wymywania zaadsorbowanych pestycydów ze złoża sorbentu jest
metanol ze względu na swoją dużą siłę eluotropową.
Oznaczanie pestycydów. Metoda HPLC stosowana w przypadku oznaczania związków
polarnych, a przede wszystkim niestabilnych chemicznie i nietrwałych. Metody GC można stosować
zarówno w przypadku związków polarnych, jak i niepolarnych, jednakże muszą one cechować się
lotnością albo dawać się przekształcić w związki lotne (derywatyzacja). Derywatyzacja daje
możliwość jednoczesnego oznaczenia pestycydów z różnych grup. Ważnym elementem analizy jest
właściwa detekcja rozdzielanych związków. Najczęściej używanymi detektorami do oznaczania
pozostałości pestycydów są detektory: spektrometru mas, wychwytu elektronów, płomieniowojonizacyjny, płomieniowo-fotometryczny czy termojonowy, czuły na związki azoto- i
fosforoorganiczne. W przypadku analizy pestycydów chloroorganicznych naturalnym jest stosowanie
detektora wychwytu elektronów (ECD – ang. Electron capture detector).
ECD wykorzystuje absorpcje elektronów w fazie gazowej przez cząsteczki elektronofilowe.
Podstawowym jego elementem jest komora jonizacyjna z dwoma elektrodami. W komorze
umieszczone jest źródło radioaktywne emitujące promieniowanie β (elektrony). Elektrony pierwotne
emitowane przez źródło zderzają się z cząsteczkami gazu w detektorze, powodując jonizację
połączoną z emisją wtórnych elektronów i tworzeniem jonów dodatnich:
β + M → β’ + M+ + e
gdzie: M – oznacza cząsteczka gazu, e – elektron.
3
Pomiędzy elektrody w komorze przyłożone jest pewne napięcie. W wytworzonym polu elektrycznym
elektrony szybko migrują do anody, co powoduje stały przepływ prądu o natężeniu kilku nA.
Prawdopodobieństwo rekombinacji jonów dodatnich z wolnymi elektronami jest znikomo małe.
Wielkość prądu płynącego prze detektor ulega zmniejszeniu, jeśli przez detektor przechodzą
cząsteczki wykazujące powinowactwo do elektronów. W takim przypadku zachodzi absorpcja
wolnych elektronów przez te cząsteczki, zgodnie z jednym z równań:
AB + e → AB + hν
AB + e → A• + BW efekcie prąd płynący przez detektor ulega zmniejszeniu, co jest sygnałem pomiarowym. Czułość i
selektywność detektora wychwytu elektronów zależą od powinowactwa elektronowego związków. W
przypadku związków organicznych powinowactwo elektronowe (elektronofilowość) zależy przede
wszystkim od dominujących grup funkcyjnych w cząsteczce (np. atomy chlorowców, grupy estrowe,
hydroksylowe, czy inne zawierające tlen). Odpowiedź detektora może się zmieniać w granicach od 1
do 107 w zależności od charakteru cząsteczki. Z tego względu detektora musi być kalibrowany osobno
na wszystkie oznaczone związki
3. Część eksperymentalna
Celem ćwiczenia jest identyfikacja w próbkach wody pestycydów chloroorganicznych DDE i DDD
metodą GC-ECD oraz zapoznanie się z techniką przygotowania próbki do analizy metodą zatężania
do ciała stałego (SPE).
Student wykonuje zatężenie techniką SPE związków organicznych z trzech próbek wodny o objętości
100 ml, przygotowanych przez prowadzącego a następnie dokonuje analizy chromatograficznej
uzyskanych próbek. Niezależnie dokonuje rozdziału chromatograficznego mieszaniny znanej ilości
standardów wybranych pestycydów (po 1 ng/μl DDD i DDE) celem określenia czasów ich retencji i
siły sygnału.
Przeprowadzenie wzbogacania techniką SPE
Wykonanie zatężenia próbek techniką SPE przeprowadza się z wykorzystaniem systemu do ekstrakcji
SPE (Baker SPE-12G) i kolumienek typu C18 o objętości złoża 500 mg (krzemionka modyfikowana
fazą oktadecylową). Etapy wykonania procedury:
1. Zmontowanie zestawu próżniowego - założenie końcówek, zaworków i kolumienek, podłączenie
pompy próżniowej, wstawienie do komory plastikowego pojemnika na przesącz.
2. Kondycjonowanie kolumienek (pod próżnią ok. -10 kPa):
- dwukrotnie po 3 ml MeOH
- dwukrotnie po 3 ml wodą bidestylowaną (Uwaga: nie dopuścić do wysuszenia złoża),
4
3. Przepuścić przez złoża badane próbki (100 ml preparowanej próbki wody, przygotowanej przez
prowadzącego) z prędkością nie większą niż 10 ml/min.
4. Przepłukać kolumienki po ok. 3 ml czystej wody,
5. Osuszyć kolumienki powietrzem (pod próżnią ok -40 kPa przez ok. 5 min),
6. Usunąć z komory systemu SPE pojemnik ze zlewkami i wstawić statyw z naczyńkami
szklanymi, przeznaczonymi do zbierania eluatu,
7. Wymyć ekstrakt z kolumienki 2x1 ml mieszaniną eteru dietylowego i heksanu (1:1) lub
metanolem (pod próżnią ok. -10 kPa),
8. Odparować rozpuszczalnik do sucha pod azotem, a pozostałości rozpuścić 0.5 ml MeOH,
9. Po 1 ul uzyskanych roztworów poddajemy analizie na GC-ECD (wg osobnej instrukcji).
Pliki wyników kolejnych analiz (chromatogramy) oznaczamy w sposób następujący: XPESTY – dla
mieszaniny standardów pestycydów; XH2OYN – dla analiz wód (pisanie rozszerzenia pliku nie jest
konieczne); gdzie X – oznacza nr grupy, Y – nr zespołu. Pliki zapisujemy w katalogu:
C:\CHROMA\ANALIZY\KURS2.
Warunki pracy chromatografu GC-ECD:
Typ aparatu
SHIMADZU GC-14B
Detektor
ECD
Kolumna
(dł. x śred. wewn. x grubość filmu)
RTX-5
30 m x 0,25 mm x 0,25 μm
Dozowana objętość próbki
1 μl
Gaz nośny
Azot, 99,999% czystości
Program temperaturowy
100°C (1min)→20°/min→300°C (3 min)
Temperatura detektora
300 °C
Temperatura dozownika
240 °C
W/w parametry pracy wprowadza się do aparatu „ręcznie”.
Opracowanie wyników
1. Zidentyfikować rodzaj pestycydu w danej próbce wody.
2. Odczytać z chromatogramów powierzchnie pod pikami odpowiadającymi poszczególnym
herbicydom z mieszaniny wzorcowej.
3. Odczytać z chromatogramów powierzchnie pod pikami odpowiadającymi czasom retencji
poszczególnych herbicydów w ekstraktach otrzymanych z kolumienek.
4. Obliczyć stężenia pestycydów w μg/100 ml.
Literatura:
Biziuk M. Pestycydy, występowanie, oznaczanie i unieszkodliwianie, WNT, Warszawa 2001.
5
Ćwiczenie I
Data:
Godzina:
Imiona i Nazwiska
Grupa
1.
2.
3.
Opis
Powierzchnia piku
Stężenie
Wzorzec DDD
RtDDD =
1 ng/μl
Wzorzec DDE
RtDDE =
1 ng/μl
Próbka wody 1
μg/100 ml
Próbka wody 2
μg/100 ml
Próbka wody 3
μg/100 ml
Wnioski:
6