Starzenie neuronów STRESZCZENIE S tarzenie prowadzi do nieodwracalnych zmian w układzie nerwowym, które w różnym stopniu mogą upośledzać jego funkcje, takie jak zdolność do uczenia się i pamięć. W starych neuronach i mózgu, podobnie jak to może mieć miejsce w innych komórkach organizmu, podwyższony jest poziom stresu oksydacyjnego, zaburzona równowaga energetyczna i metabolizm, akumulują się uszkodzenia w białkach i kwasach nukleinowych. Charakterystyczne dla samych starych neuronów są m. in. zmiany w plastyczności, szkielecie komórki, przekaźnictwie synaptycznym oraz we wrażliwości na czynniki neurotroficzne. Niektóre z klasycznych markerów starzenia komórkowego, do których należy aktywacja SAβ-galaktozydazy, zostały zastosowane do określenia procesu starzenia neuronów zarówno in vitro, jak i in vivo. Badania sugerują, że mimo, iż neurony są komórkami postmitotycznymi, to pewną rolę w ich biologii, na przykład w różnicowaniu, odgrywają białka cyklu komórkowego. Natomiast nie jest znana, czy wyjaśniona ich rola w starzeniu. Starzenie stanowi poważny czynnik rozwoju chorób neurodegeneracyjnych m.in. choroby Alzheimera. WPROWADZENIE Starzenie prowadzi do zmian w obrębie układu nerwowego. Zmiany te obejmują wszystkie procesy, w które zaangażowany jest mózg, m.in. uczenie się, pamięć, funkcje zmysłowe i ruchowe, motywację oraz odczuwanie emocji. Poniższy artykuł przedstawia badania nad molekularnymi i strukturalnymi zmianami towarzyszącymi i (lub) przyczyniającymi się do starzenia się neuronów sensu stricto oraz całego mózgu. Ze względu na to, że w niektórych przytoczonych pracach materiałem do badań był cały mózg, część uzyskanych wyników jest wypadkową zmian zachodzących zarówno w neuronach, jak i gleju. Artykuł jest przeglądem literatury prezentującej wyniki badań mózgów ludzi, którzy osiągnęli podeszły wiek i badań mózgów gryzoni i małp. Przytoczono także prace, które rozpatrują i charakteryzują starzenie się neuronów w świetle istniejącej wiedzy na temat starzenia się innych komórek, w szczególności komórek zdolnych do proliferacji. Umożliwia to wskazanie oprócz tego, co specyficzne i wyłączne dla neuronów, markerów starzenia, które komórki nerwowe mogą dzielić z innymi komórkami. Oprócz badań in vivo przedstawiono również wyniki badań starzenia się neuronów w pierwotnych hodowlach neuronalnych. PODSTAWOWE INFORMACJE O BIOLOGII NEURONU W strukturze neuronów występuje ciało neuronalne i dwa rodzaje wypustek: dendryty i aksony (Ryc. 1). Cała struktura neuronu zaangażowana jest w generowanie i przewodzenie sygnału elektrycznego zwanego potencjałem czynnościowym, który służy do przesyłania i kodowania informacji w sieci neuronalnej. Przesyłanie informacji przebiega jednokierunkowo: od dendrytów, poprzez ciało neuronalne do aksonu, który przekazuje sygnały do następnej komórki. Aksony pokryte są mieliną, otoczką lipidową, która umożliwia szybkie przewodnictwo impulsów nerwowych. Dendryty tworzą wiele rozgałęzień, dzięki czemu zapewniona jest bogata komunikacja z sąsiednimi neuronami — pojedynczy neuron w mózgu może utrzymywać kontakt z mniej więcej 1000 innych neuronów. Dwa neurony komunikują się ze sobą w miejscu zwanym synapsą. Neuron przekazujący sygnał zwany jest neuronem presynaptycznym, a neuron odbierający sygnał neuronem postsynaptycznym. W presynaptycznych zakończeniach (kolbki synaptyczne) znajdują się pęcherzyki synaptyczne wypełnione cząsteczkami neuroprzekaźników. W neuronach pobudzonych neuroprzekaźniki są uwalniane do szczeliny synaptycznej i wiążą się do receptorów w błonie neuronu postsynaptycznego, co inicjuje dalszą kaskadę sygnałową. Większość zakończeń presynaptycznych tworzy synapsy z dendrytami neuronów postsy- Postępy Biochemii 60 (2) 2014 Małgorzata Piechota Piotr Sunderland Pracownia Molekularnych Podstaw Starzenia, Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN, Warszawa Pracownia Molekularnych Podstaw Starzenia, Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN, ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa; tel.: (22) 589 24 36, e-mail: [email protected] Artykuł otrzymano 24 marca 2014 r. Artykuł zaakceptowano 9 kwietnia 2014 r. Słowa kluczowe: starzenie, neuron, stres, synapsa, plastyczność, mózg Wykaz skrótów: 4HNE — 4-hydroxynonenal; AMPA — ang. α-amino-3-hydroxy-5-methyl4-isoxazolepropionic acid; APP — ang. amyloid prekursor protein; BDNF — ang. brain-derived neurotrophic factor; CaMKIIα — ang. calcium/ calmodulin dependent protein kinase II; GABA – ang. gamma-aminobutyric acid; GFAP — ang. glial fibryllary acidic protein; Glut3 — ang. glucose transporter 3; GnRH — ang. gonadotropin-releasing hormone; HDACs — ang. histone deacetylases; IEGs — ang. immediate early genes; IGF-1 — ang. insulin-like growth factor 1; IL-6 — ang. interleukin 6; MAP2 — ang. microtubule-associated protein 2; mTOR — ang. mammalian target of rapamycin; NMDA — ang. N-Methyl-D-aspartate; NF-κB — ang. nuclear factor kappa-lightchain-enhancer of activated B cells; p38MAPK — ang. p38 mitogen-activated protein kinase; PSD — ang. postsynaptic density; REST — ang. repressor element 1 — silencing transcription factor; SA-βgal — ang. senescence-associated β-galactosidase; SIPS — ang. stress-induced premature senescence; SNAP-25 — ang. Synaptosomal-associated protein 25; Sod2 — ang. superoxide dismutase 2; SynGAP — ang. Synaptic Ras GTPase-activating protein 1; Trf2 — ang. telomeric repeat binding factor 2; TRPM — ang. transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 2 177 razujących anatomię mózgu w latach 80. i 90. zweryfikowało ten pogląd. Badania wskazują, że fizjologiczne starzenie, w przeciwieństwie do chorób neurodegeneracyjnych, nie prowadzi do wyraźnych zmian liczby neuronów w mózgu [1,2]. Natomiast obserwowane jest zmniejszenie się ciała neuronów, zmiany strukturalne drzewka dendrytycznego, spadek liczby kolców dendrytycznych i synaps, zmiany w neuroprzekaźnictwie i w czynności bioelektrycznej neuronów. Obserwuje się również spadek zdolności do neurogenezy [3]. Różne obszary mózgu poddają się tym zmianom w różnym stopniu np. hipokamp, struktura zaangażowana w uczenie się i pamięć, podlega szczególnie dużym zmianom w procesie starzenia. ZMIANY STRUKTURALNE Rycina 1. Struktura neuronu. Neurony składają się z ciała neuronu z jądrem, aksonu i dendrytów. Na dendrytach tworzą się charakterystyczne struktury zwane kolcami dendrytycznymi, które mogą być miejscem tworzenia synaps z zakończeniami aksonów neuronów presynaptycznych. Synapsa służy do komunikacji międzyneuronalnej, która odbywa się za pośrednictwem wydzielanego do szczeliny synaptycznej neuroprzekaźnika. naptycznych. Synapsy te mogą powstawać na charakterystycznych wypustkach zwanych kolcami dendrytycznymi. Przekazywanie synaptyczne może być pobudzające lub hamujące, co oznacza odpowiednio zwiększenie lub obniżenie możliwości powstania potencjału czynnościowego w postsynaptycznym neuronie. Głównym neuroprzekaźnikiem pobudzającym w mózgu jest kwas glutaminowy, który może wiązać się do receptorów jonotropowych, m.in. receptora NMDA (ang. N-methyl-D-aspartate) i AMPA (ang. α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) oraz receptorów metabotropowych mGlu. Receptory jonotropowe sprzężone są z kanałami przepuszczalnymi dla jonów, a receptory metabotropowe związane są z białkiem G. Głównym neuroprzekaźnikiem hamującym jest kwas γ-aminomasłowy GABA (ang. gamma-aminobutyric acid). Właściwością neuronów i tworzonej przez nich sieci neuronalnej jest ich plastyczność — zdolność do reorganizacji i zmiany będąca podstawą takich procesów jak uczenie się, pamięć i regeneracja po uszkodzeniach. Szeroko badane jest zjawisko plastyczności synaptycznej, które związane jest ze wzmocnieniem lub osłabieniem odpowiedzi synapsy na bodźce oraz ze zmianami strukturalnymi: modyfikacją kształtu, zanikiem lub powstawaniem kolców dendrytycznych i synaps. STARZENIE SIĘ NEURONÓW I MÓZGU W procesie starzenia dochodzi m.in. do zmniejszenia objętości mózgu, grubości warstw korowych, np. atrofii kory przedczołowej oraz degeneracji zmielinowanych włokien. Przez długi czas uważano, że starzenie wiąże się ze śmiercią neuronów. Dopiero opracowanie metod lepiej ob- 178 Badania wskazują na trwałe zmiany w morfologii neuronów zachodzące w procesie starzenia. Zaobserwowano ograniczenie stopnia rozgałęzienia dendrytów w korze przedczołowej i w hipokampie ludzi starszych i u szczura, przy czym w korze przedczołowej zmiany te były bardziej znaczące [4]. Co ciekawe, w niektórych regionach hipokampa ludzi zaobserwowano odwrotny proces, a mianowicie, że stopień rozgałęzienia dendrytów zwiększał się wraz z wiekiem. Spadek liczby kolców dendrytycznych stwierdzono w korze przedczołowej starych małp [5,6]. Najbardziej podatne na degenerację były cienkie kolce dendrytyczne charakteryzujące się dużą plastycznością. Natomiast w hipokampie zmiany degeneracyjne dotykają przede wszystkim klasy dużych i stabilnych kolców grzybkowatych [7]. Prace Bloss’a dostarczyły dowodów na utratę plastyczności neuronów w hipokampie starych szczurów [8,9]. Zwierzęta były wystawione na działanie stresu. U młodych zwierząt stres zredukował długość apikalnych dendrytów i liczbę rozgałęzień i zmiany te były odwracalne po ustaniu stresu, podczas gdy u zwierząt starych, wyindukowane stresem zmiany były nieodwracalne. Co więcej, u zwierząt młodych stres wpłynął na liczbę i w nieznacznym stopniu również na morfologię kolców dendrytycznych, podczas gdy u zwierząt starych nie było wpływu stresu na i tak już zmniejszoną liczbę kolców dendrytycznych. Ukazało się wiele prac, które różnymi metodami pokazują zmiany w synapsach w procesie starzenia. Zmiany te nie są jednakowe i uniwersalne, lecz specyficzne dla różnych obszarów mózgu. Zarówno presynaptyczne, jak i postsynaptyczne zakończenia zmieniają się w efekcie starzenia. Metodami biochemicznymi ustalono m.in. spadek poziomu białek pęcherzyków synaptycznych: synaptofizyny i SNAP25 (ang. Synaptosomal-associated protein 25) w hipokampie 14–24-miesięcznych szczurów w porównaniu z grupą szczurów w wieku 2 miesięcy [10]. Może to świadczyć o związanym z wiekiem zmniejszeniu liczby zakończeń presynaptycznych, bądź o obniżonej syntezie wymienionych białek w tych zakończeniach. Obrazowanie synaps za pomocą mikroskopii świetlnej i elektronowej potwierdziło zmiany zaobserwowane metodami biochemicznymi. Barwienie na synaptofizynę wykazało obniżony poziom tego białka w regionie CA3 hipokampa starych szczurów i co ciekawe, zmiany w poziomie synaptofizyny skorelowane były ze stopniem upośledzenia zdolności uczenia się tych zwierząt [11]. W innym badaniu wykazano spadek liczby www.postepybiochemii.pl synaps w zakręcie zębatym hipokampa starych szczurów [12]. Z kolei badanie ultrastruktury zakończeń presynaptycznych w hipokampie starych małp wykazało spadek ilości kolbek synaptycznych i podwojenie liczby kolbek, które nie tworzyły połączenia synaptycznego z żadnym z kolców dendrytycznych [13]. Nie wszystkie populacje neuronów są narażone na utratę synaps w równym stopniu np. nie zaobserwowano związanej z wiekiem utraty synaps w regionie CA1 hipokampa u gryzoni, a u ludzi powyżej 65 roku życia nie było spadku liczby synaps w jednym z regionów kory czołowej [14,15]. W badaniach tych jednak nie analizowano, czy funkcjonowanie tych synaps było prawidłowe. W GŁĄB SYNAPS Badania ultrastruktury zakończeń presynaptycznych odpowiedzialnych za uwolnienie neuroprzekaźników z pęcherzyków synaptycznych i zawierających oprócz tego takie organella jak mitochondria, autofagosomy, endosomy i siateczkę endoplazmatyczną przyniosły na razie zaskakująco mało wyników świadczących o zmianach z upływem czasu. Applegate i Landfield [16] zaobserwowali spadek gęstości pęcherzyków zlokalizowanych 150 nm od strefy aktywnej w synapsach hipokampa szczura. Soghomonian i wsp. [17] pokazali wzrost liczby pęcherzyków w synapsach hamujących w korze przedczołowej starych małp i powiększenie mitochondriów w akso-dendrytycznych synapsach hamujących. W starych organizmach występują zmiany w składzie białek tworzących synapsy, np. obniża się poziom białka Bassoon w synapsach glutaminergicznych w hipokampie starych szczurów [18]. Białko to odgrywa rolę w kontroli uwalniania neurotransmiterów z zakończeń presynaptycznych, a delecja jego genu powoduje inaktywację synaps pobudzających. Analiza immunohistochemiczna wykazała również obniżenie poziomu białka SynGAP (ang. Synaptic Ras GTPase-activating protein 1) i podwyższenie poziomu podjednostki GluR1 w receptorze AMPA (ang. α-amino-3hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) oraz białka PSD-95 (ang. Postsynaptic density-95), które w aktywnych synapsach odpowiada za rekrutację i formowanie dużych kompleksów receptorów, kanałów jonowych i innych białek uczestniczących w sygnalizacji. Wszystkie te białka są elementami struktury PSD (ang. postsynaptic density), zwanej gęstością postsynaptyczną, koniecznej do prawidłowego funkcjonowania synaps pobudzających. Zaobserwowano również, że synteza podjednostki NR2B w receptorze NMDA obniża się w hipokampie starych szczurów i zmiana ta koreluje z deficytem pamięci u tych zwierząt [19]. Różnice w poziomie wielu białek w hipokampalnych synaptosomach u starych szczurów zostały odkryte metodą proteomiki [20]. Zmiany obejmujące ponad 250 białek pozwoliły na wyodrębnienie procesów, których regulacja zmienia się w starzeniu. Dotyczy to metabolizmu glukozy i białek, cytoszkieletu (F-aktyna, γ-aktyna, β-aktyna, izoformy tubuliny, interneksyna), endocytozy i egzocytozy pęcherzyków synaptycznych, kontroli neuroprzekaźnictwa oraz formowania kompleksów receptorów postsynaptycznych. Ta sama grupa w kolejnej pracy wskazała na zmiany w poziomie białek w synaptosomach hipokampalnych charakterystyczne dla starych zwierząt z zaburzoną funkcją poznawczą w porównaniu ze Postępy Biochemii 60 (2) 2014 zdrowymi starymi zwierzętami i grupą młodych zwierząt [21]. Zaobserwowano podwyższenie poziomu białek odgrywających rolę w utrzymaniu i modelowaniu struktury neuronów (MAP2 ang. microtubule-associated protein 2, drebrin, Nogo-A) i obniżenie poziomu białek zaangażowanych w aktywność i plastyczność synaptyczną (PSD-95, 14-3-3θ, CaMKIIα (ang. calcium/calmodulin dependent protein kinase II). NEUROPRZEKAŹNIKI I CZYNNIKI TROFICZNE Zmiany w starzeniu mogą dotyczyć zaburzenia w wytwarzaniu, uwalnianiu i usuwaniu kwasu glutaminowego w odpowiedzi na bodziec w różnych regionach mózgu [22,23]. Modyfikacje w przekaźnictwie glutaminergicznym wpływają także na inne przekaźniki i modulatory. Na przykład zwiększenie poziomu kwasu glutaminowego w przestrzeni zewnątrzkomórkowej w wyniku podania zwierzętom inhibitora, który hamuje usuwanie tego neuroprzekaźnika ze szczeliny synaptycznej, powoduje wzrost ilości uwolnionej dopaminy i GABA w obrębie ciała prążkowanego u zwierząt młodych. Natomiast u zwierząt starych kwas glutaminowy powoduje zmniejszone uwalnianie dopaminy i zwiększenie GABA w przestrzeni zewnątrzkomórkowej [24]. Poza tym zaobserwowano, że u szczurów w wieku 1221 miesięcy obniża się poziom czynnika troficznego BDNF (ang. brain-derived neurotrophic factor), który odgrywa istotną rolę w plastyczności synaptycznej [25]. W innej natomiast pracy pokazano, że poziom syntezy białek zachodzącej pod wpływem stymulacji kory mózgowej za pomocą insulinopodobnego czynnika wzrostu IGF-1 (ang. insulin-like growth factor 1) jest niższy u starych szczurów w porównaniu z młodymi [26]. PROTEOM I STRES OKSYDACYJNY Cechą starzenia się neuronów, która w nasilonym stopniu występuje w chorobach neurodegeneracyjnych, jest akumulacja uszkodzonych białek zarówno wewnątrz komórek, jak i zewnątrzkomórkowo [27]. Istnieją dowody wskazujące na to, że z wiekiem obniża się zdolność komórki do enzymatycznej degradacji uszkodzonych białek, która kontrolowana jest przez cytozolowe proteazy, autofagię i lizosomy oraz proteasom. Aktywność proteasomu spada wraz z wiekiem w korze i hipokampie szczura [28]. Pogarsza się funkcjonowanie autofagii i wydaje się, że stymulacja autofagii poprzez zastosowanie restrykcji kalorycznej może opóźnić procesy starzenia [29]. Badania pokazały, że farmakologiczne zahamowanie aktywności proteasomu i lizosomów ma niekorzystny wpływ na funkcję i strukturę neuronów. Z wiekiem zwiększa się ilość białek, które w wyniku działania stresu oksydacyjnego ulegają toksycznym modyfikacjom, czego efektem może być np. zaburzenie procesu wytwarzania energii [30]. Badania proteomów zwierząt pozwoliły na wyodrębnienie głównych procesów komórkowych, które podlegają zmianie w mózgach starzejących się organizmów. Zmiany dotyczą metabolizmu białek i kwasów nukleinowych, przekazywania sygnału, odpowiedzi komórki na stres oksydacyjny, cytoarchitektury, transportu oraz przekaźnictwa synaptycznego [31,32]. Badania koncentrują się także na roli sirtuin, białek z rodziny deacetylaz, w starzeniu. Sirt1 odgrywa rolę w takich procesach jak: odpowiedź na stres, metabolizm energetyczny, dojrze- 179 wanie neuronów i wykazuje właściwości neuroprotekcyjne. Co ciekawe, wyniki wskazują, że poziom Sirt1 obniża się w hipokampie starych szczurów [33]. EKSPRESJA GENÓW Jedna z pierwszych prac badająca transkryptom w mózgu pokazała zmiany w obszarze CA1 hipokampa, które korelowały ze spadkiem zdolności poznawczych starych szczurów [34]. Zaobserwowano podniesioną ekspresję genów związanych ze stanem zapalnym i sygnalizacją wapniową oraz obniżoną ekspresję genów regulujących metabolizm energetyczny, procesy biosyntezy i synaptogenezę. Badania mózgów uzyskanych od ludzi w wieku 26–106 lat sugerują, że powyżej 40 roku życia spada ekspresja genów odgrywających rolę w plastyczności synaptycznej, transporcie pęcherzykowym i funkcji mitochondriów w korze czołowej [35]. Następnie indukują się geny regulujące odpowiedź komórki na stres, w tym stres oksydacyjny, oraz naprawę DNA. Przedmiotem badań nad starzeniem są również zmiany w ekspresji genów wczesnej odpowiedzi (IEGs, ang. immediate early genes). Geny wczesnej odpowiedzi charakteryzują się tym, że ich ekspresja nie wymaga aktywacji innych genów i syntezy białek de novo, w związku z tym stanowią one najwcześniejszą odpowiedź genomu na bodziec. Niektóre z tych genów odgrywają rolę w plastycznosci synaptycznej i zmiany w ich ekspresji, m.in. genu c-fos i Arc, zaobserwowano w procesie starzenia [36,37]. Zmiany w ekspresji mogą ograniczać się do konkretnej populacji neuronów, np. w hipokampie starych szczurów spada liczba wyłącznie neuronów ziarnistych zakrętu zębatego z indukowaną ekspresją genu Arc. EPIGENOM Zmiany epigenetyczne mogą być jedną z możliwych przyczyn zmian w transkrypcji genów w procesie starzenia. Epigenom tworzą kowalencyjne modyfikacje DNA i białek jądrowych, w tym histonów, które determinują i zmieniają strukturę chromatyny. Zainteresowanie zmianami epigenetycznymi w neuronach wzbudziły odkrycia modyfikacji chromatyny, które współodpowiedzialne są za mechanizmy plastyczności synaptycznej i funkcjonowania pamięci u dorosłych zwierząt [38]. Zaobserwowano m.in., że podanie inhibitorów specyficznych deacetylaz histonów (HDACs, ang. histone deacetylases) może poprawić plastyczność synaptyczną i pamięć [39]. Generalnie nieznane są zmiany w acetylacji histonów czy metylacji DNA w regionie genów, które odgrywają rolę w procesie starzenia, lub których ekspresja zmienia się w starzeniu. Jedna z prac pokazała, że w komórkach hipokampa starych szczurów zachodzą zmiany w metylacji promotora genu oraz w obrębie samego genu Arc, co może być przyczyną spadku jego transkrypcji [40]. PRZEKAZYWANIE SYGNAŁU WAPNIOWEGO Jony wapnia odgrywają kluczową rolę w fizjologii neuronów. Aktywne neurony ze wzbudzonym potencjałem czynnościowym inicjują otwarcie kanałów dla wapnia, co jest koniecznym etapem w procesie uwalniania neuroprzekaź- 180 ników do szczeliny synaptycznej. Sygnalizacja wapniowa odbywa się również przez uwolnienie wapnia z organelli: siateczki endoplazmatycznej i mitochondriów. Badania wydają się wskazywać na stres oksydacyjny i zaburzony metabolizm energetyczny jako przyczyny osłabienia regulacji gospodarki wapniowej w starych neuronach. Na przykład produkt peroksydacji lipidów, 4-hydroksynonenal (4HNE), upośledza funkcje niektórych białek zaangażowanych w sygnalizację wapniową w neuronach. Do tych białek należą błonowe ATPazy (ATPazy Na+/K+ i Ca2+) i neuronalny transporter glukozy Glut3 (ang. glucose transporter 3) [41]. Inne zmiany obejmują zwiększone przewodnictwo kationów wapnia, zwiększoną gęstość kanałów dla wapnia typu L odgrywających rolę m.in. w plastyczności synaptycznej oraz opóźnioną reakcję przywrócenia prawidłowego stężenia wapnia w komórce [42,43]. Zaburzenie homeostazy wapniowej może wpłynąć ujemnie na pobudliwość neuronów i integralność sieci neuronalnej [44]. STARZENIE MÓZGU A CHOROBY NEURODEGENERACYJNE Powyżej 60-go roku życia wzrasta prawdopodobieństwo rozwoju demencji i innych chorób neurodegeneracyjnych m.in. choroby Alzheimera, Parkinsona oraz choroby naczyń mózgowych [27]. Coraz więcej wiadomo na temat genetycznego podłoża i patofizjologii tych chorób. Szeroko badana, choć nie do końca jednak zrozumiała pozostaje kwestia zwiększonej podatności wybranej populacji neuronów na degenerację np. hipokampa w chorobie Alzheimera czy istoty czarnej w chorobie Parkinsona. Badania wydają się wskazywać na starzenie jako czynnik ryzyka w rozwoju tych chorób. Oprócz znaczenia genów, czynniki środowiskowe, które z jednej strony mogą sprzyjać starzeniu się neuronów, a z drugiej, przed nim chronić, mogą determinować prawdopodobieństwo zapadnięcia na chorobę neurodegeneracyjną. Zmiany w procesie starzenia, takie jak podwyższony stres oksydacyjny, zaburzona równowaga energetyczna, akumulacja uszkodzonych i nieprawidłowo sfałdowanych białek, uszkodzenia materiału genetycznego oraz mitochondriów występują w nasilonym stopniu w przebiegu chorób neurodegeneracyjnych. W chorobie Alzheimera obserwuje się większą, niż w przypadku fizjologicznego starzenia, atrofię mózgu, śmierć neuronów i utratę synaps. Charaketrystyczna dla choroby Alzheimera jest obecność w mózgu amyloidowych blaszek starczych złożonych z agregatów β-amyloidu otoczonych siecią degenerujących neuronów oraz obecność wewnątrzkomórkowych splotów neurofibrylarnych zbudowanych z hiperfosforylowanego białka tau. Wydaje się, że β-amyloid może się również akumulować u ludzi starszych zachowujących zdolności umysłowe, natomiast badania sugerują zależność między poziomem upośledzenia umysłowego w chorobie Alzheimera a ilością splotów neurofibrylarnych i stopniem utraty synaps [45]. Jedna z najnowszych prac dotycząca tej choroby opisuje istotną różnicę na poziomie molekularnym między fizjologicznym starzeniem a patologią [46]. Autorzy pokazali, że w neuronach ludzi starszych występuje indukcja czynnika transkrypcyjnego REST (ang. repressor element 1 - silencing transcription factor), natomiast nie obserwuje się jej u ludzi chorych na chorobę Alzheimera. Ma to daleko idące konsekwencje, ponieważ REST hamuje transkrypcję www.postepybiochemii.pl genów promujących apoptozę i rozwój patologii choroby Alzheimera m.in. wytwarzanie β-amyloidu i hiperfosforylację białka tau, a indukuje geny odpowiedzi na stres. Poza tym aktywacja REST pełni funkcję ochronną przed stresem oksydacyjnym i toksycznością β-amyloidu. Jednym z najważniejszych wyników w tej pracy było odkrycie pozytywnej korelacji między poziomem REST a zachowaniem zdolności umysłowych starszych ludzi. Na podstawie tej pracy można sądzić że REST jest elementem molekularnych systemów chroniących stare neurony przed zwiększonym poziomem stresu i przyczyniających się do opóźnienia powstawania zmian neurodegeneracyjnych w mózgu. STARZENIE NEURONÓW A PROCES STARZENIA KOMÓRKOWEGO Starzenie komórkowe (ang. cellular senescence) polega na nieodwracalnym zatrzymaniu podziałów w komórce proliferującej i w związku z tym może stanowić początkowy mechanizm obronny komórek zagrożonych transformacją nowotworową. Starzenie komórkowe może zajść w wyniku stresu związanego przede wszystkim z uszkodzeniami DNA. Badania dostarczyły informacji na temat komórkowych markerów opisujących ten proces. Charakterystyczne jest powiększenie rozmiarów komórki i wzrost jej ziarnistości. Zatrzymanie podziałów przebiega w wyniku aktywacji jednej bądź dwóch ścieżek przekazywania sygnału. Uczestniczą w nich takie białka jak p53 i p21WAF1/CIP1 (p21) oraz pRB. Kolejnym markerem jest zwiększenie aktywności enzymu β-galaktozydazy (SA-β-gal, ang. senescence-associated β-galactosidase). Stare komórki rozwijają fenotyp sekrecyjny wydzielając do środowiska cytokiny, czynniki wzrostowe i proteazy, które odpowiadają za rozwój stanu zapalnego i mogą przyczyniać się do rozwoju chorób związanych z wiekiem np. nowotworu i neurodegeneracji. Poza tym zachodzą zmiany w strukturze chromatyny i tworzą się tzw. skupiska heterochromatynowe. Starzeniu komórkowemu może towarzyszyć stres oksydacyjny1. Bez względu na to, że starzenie komórkowe z definicji zakłada zatrzymanie podziałów, a więc nie powinno dotyczyć komórek postmitotycznych, pojawiły się w literaturze naukowej prace, które to pojęcie rozszerzają na potrzebę opisu zjawiska starzenia neuronów. Autorzy wskazują na podobieństwa między starzeniem komórkowym a starzeniem neuronów czy też neurodegeneracją na poziomie molekularnym. Grupa pod kierunkiem von Zglinickiego pokazała, że neurony starych myszy rozwijają podobny do starzenia obserwowanego w innych komórkach fenotyp charakteryzujący się obecnością uszkodzeń DNA, zwiększoną produkcją wolnych rodników tlenowych i peroksydacją lipidów oraz zwiększoną syntezą ufosforylowanej kinazy p38MAPK (ang. p38 mitogen-activated protein kinase), która może odpowiadać za powstanie fenotypu sekrecyjnego komórek [47]. Poza tym neurony produkowały interleukinę 6- IL-6 (ang. interleukin 6), miały podwyższoną aktywność SA-β-gal i zmienioną syntezę markera heterochromatyny- histonu mH2A (ang. macroH2A). Podobne zmiany następowały w wyniku uszkodzenia telomerów w mysim mutancie F4TERC-/- pozbawionym genu kodującego podWięcej o znacznikach starzenia można znaleźć w tym numerze Postępów Biochemii w artykule O. Alster i Z. Korwek 1 Postępy Biochemii 60 (2) 2014 jednostkę RNA telomerazy. Co ciekawe, delecja genu p21 w mutancie F4TERC-/- spowodowała cofnięcie się zmian poziomu uszkodzeń DNA, peroksydacji lipidów, aktywności p38MAPK i produkcji IL-6 przez neurony. Autorzy spekulują, że zaobserwowane przez nich starzenie neuronów może być związane z upośledzeniem funkcji poznawczych w starych organizmach. Proponują również bardziej ogólną definicję starzenia komórkowego. Według nich starzenie komórkowe jest wynikiem działania wewnątrzkomórkowych ścieżek przekazywania sygnału, które są następstwem uaktywnienia się ścieżki uszkodzeń DNA. Jednym z przejawów aktywności tych ścieżek byłoby zatrzymanie proliferacji w komórkach mitotycznych. Warto tu przytoczyć dwie hipotezy dotyczące rozwoju neurodegeneracji, które w pewnym stopniu nawiązują do zjawiska starzenia komórkowego. Badania mózgów pacjentów z chorobą Alzheimera ujawniły niewytłumaczalny do tej pory wzrost syntezy białek cyklu komórkowego [48]. Według jednej z hipotez, w zdrowych neuronach białka cyklu komórkowego przejmują nowe funkcje związane z kształtowaniem synaps i plastycznością. W odpowiedzi na stres przewyższający neuroprotekcyjne mechanizmy komórki dochodzi do utraty części synaps i procesu odróżnicowania neuronów, który powoduje wejście neuronów w cykl komórkowy i prowadzi do ich śmierci. Druga hipoteza wiąże neurodegenerację z chronicznym stanem zapalnym [49]. Inaczej mówiąc nieprawidłowo sfałdowane, zagregowane białka indukują wrodzoną odpowiedź układu odpornościowego i stan zapalny. Stan zapalny z kolei wywołuje starzenie neuronów i gleju, które objawia się m.in. fenotypem sekrecyjnym, wydzielaniem do środowiska cytokin i innych czynników, które dodatkowo pogłębiają stan zapalny w mózgu. Z upływem czasu zmiany te powodują nieodwracalne zaburzenie funkcji neuronów i spadek ich wrażliwości na czynniki troficzne. Do tej pory niewiele wiadomo o fenotypie sekrecyjnym starzejących się neuronów. Badania wskazują na rolę starzenia astrocytów w rozwoju stanu zapalnego zarówno w fizjologicznym starzeniu mózgu, jak i w nasilonym stopniu w stanach patologicznych. Czynniki wydzielane przez astrocyty to m.in. IL-6, IL-1β i czynnik martwicy nowotworów TNF-α (ang. tumor necrosis factor) [50,51]. Starzenie komórkowe gleju upośledza pełnione przez niego funkcje metaboliczne, troficzne i strukturalne, względem neuronów [52]. W procesie starzenia dochodzi również do wzrostu liczby komórek mikrogleju [53] Badania wskazują, że w podwzgórzu starych myszy mikroglej rozwija stan zapalny aktywując m.in. jądrowy czynnik transkrypcyjny NF-κB (ang. nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) i zwiększając produkcję TNF-α. W późniejszym czasie NF-κB ulega aktywacji również w neuronach, co może świadczyć o parakrynnym działaniu czynników zapalnych wydzielanych przez mikroglej. Najciekawszym aspektem tych badań było pokazanie wpływu starzenia podwzgórza na starzenie się całego organizmu. Wydaje się, że obecny w podwzgórzu stan zapalny obniża wydzielanie hormonu uwalniającego gonadotropinę GnRH (ang. gonadotropin-releasing hormone), co wpływa na obniżenie neurogenezy, kondycję fizyczną i długość życia zwierząt. 181 Jeden z molekularnych mechanizmów starzenia neuronów wydaje się angażować białko Bmi1 (ang. full name Bmi1 polycomb ring finger oncogene) [54]. Myszy pozbawione genu Bmi1 rozwijają fenotyp przedwczesnego starzenia, charakteryzują się wzrostem liczby apoptotycznych neuronów i obecnością podwyższonego stresu oksydacyjnego. Wykazano, że poziom Bmi1 maleje w neuronach starych myszy oraz w hipokampie i siatkówce starszych ludzi. Obniżony poziom Bmi1 powoduje wzrost transkrypcji genów kodujących inhibitory cyklu komórkowego p16Ink4a (p16) i p19ARF (p19) oraz genu IL-6. Interleukina 6 jest mediatorem stanu zapalnego, natomiast znaczenie wzrostu transkrypcji p16 i p19 nie jest wyjaśnione. Skorelowany ze spadkiem Bmi1 jest również wzrost poziomu białka p53, które m.in. bierze udział w indukcji apoptozy i hamowaniu transkrypcji genów kodujących białkowe przeciwutleniacze np.: Sod2 (ang. superoxide dismutase 2). Pokazano, że zwiększony poziom Bmi1 w neuronach towarzyszy obniżeniu stresu oksydacyjnego i działa neuroprotekcyjnie. Starzenie komórkowe mogą indukować uszkodzone lub skrócone telomery2. W jednej z prac porównano wpływ efektu uszkodzenia telomerów na starzenie komórkowe neuronów, astrocytów i neuroblastomy [55]. Uszkodzenie telomerów wywołano upośledzeniem funkcji białka TRF2 (ang. telomeric repeat binding factor 2), które jest białkiem kluczowym w utrzymaniu integralności telomerów. We wszystkich badanych komórkach uaktywniło to ścieżkę uszkodzeń DNA, aczkolwiek najmniej uszkodzeń wykryto w neuronach. We wszystkich komórkach obserwowano obecność skupisk kinazy ATM w jądrze, istotnego przekaźnika informacji w szlaku uszkodzeń DNA. Natomiast neurony zasadniczo różniły się od komórek mitotycznych tym, że nie dochodziło w nich do wzrostu poziomu białka p53, choć zaobserwowano wyraźny wzrost białka p21. Poza tym w komórkach neuroblastomy i astrocytach wzrosła aktywność SA-β-gal, a w neuronach jej nie wykryto. Zaobserwowano również wydłużenie neurytów w komórkach neuroblastomy i różnicowanie neuronów w bardziej dojrzałe komórki o dłuższych wypustkach. Na podstawie swoich i innych badań autorzy sugerują, że białko p21 zaangażowane jest w proces różnicowania neuronów, które zachodzi w wyniku aktywacji ścieżki uszkodzeń DNA. Według teorii Blagosklonnyego, zatrzymanie podziałów w komórkach mitotycznych nie musi jednoznacznie prowadzić do starzenia komórkowego. Warunkiem koniecznym jest jednoczesna aktywacja w komórkach ścieżek stymulujących wzrost np. ścieżki kinazy mTOR (ang. mammalian target of rapamycin). Prowadzi to m.in. do hipertrofii czyli nadmiernego powiększenia się rozmiarów ciała komórki zatrzymanej w cyklu i do zwiększenia jej aktywności wydzielniczej [56]. Komórkowa hipertrofia z kolei powoduje aktywację autofagii, lizosomów oraz zwiększenia aktywności SA-β-gal. Przyczyną starzenia nie jest więc zatrzymanie podziałów komórkowych per se, ale nadmierna stymulacja funkcji komórki. Wg tej teorii nadmierna i chroniczna stymulacja funkcji komórki powoduje również starzenie komórek postmitotycznych, np. starzenie adipocytów związaWięcej o tym można znaleźć w tym numerze Postępów Biochemii w artykule A. Bielak-Żmijewskiej, W. Grabowskiej i D. Przybylskiej 2 182 ne by było ze wzrostem akumulacji tłuszczu, a starzenie komórek gruczołów ze wzrostem ich fenotypu sekrecyjnego. W przypadku neuronów takie podejście do badań procesu ich starzenia się nie było do tej pory stosowane. BADANIA NAD STARZENIEM NEURONÓW W PIERWOTNYCH HODOWLACH NEURONALNYCH Technika wydajnej izolacji i hodowli neuronów rozwinęła się znacząco na początku lat 90 XX wieku [57]. Wtedy też zaczęto zwracać uwagę na zmiany zachodzące w komórkach wraz z wydłużonym czasem prowadzenia hodowli. Pokazano m.in. rozwój i degenerację synaps, ich liczba w przeliczeniu na komórkę osiągała maksimum w 28 dniu in vitro, by stopniowo zmniejszać się do końca prowadzenia obserwacji [58]. Stwierdzono też stopniowe zwiększanie liczby kanałów wapniowych na powierzchni neuronów powiązane z ich zwiększoną śmiertelnością [59]. Opisane zmiany były traktowane jako naturalna stopniowa degeneracja pierwotnej hodowli, której nie utożsamiano ze starzeniem. Pierwsze spojrzenie na długotrwałą hodowlę neuronów jako model starzenia komórkowego miało miejsce w 1999 roku w badaniu zespołu Mariny Aksenovej [60]. Kilka lub kilkanaście tygodni życia pierwotnej hodowli neuronalnej to okres tak intensywnej akumulacji uszkodzeń, że według badaczy może być porównany z kilkudziesięcioma latami w starzejącym się organizmie. Ageing in a dish, jak autorzy nazywają ten proces, to efekt przede wszystkim stresu oksydacyjnego. Ciśnienie cząstkowe tlenu w niektórych strukturach mózgu nie przekracza 10 mmHg [61], podczas gdy komórki hodowane w standardowym inkubatorze stykają się z wartościami pO2 dochodzącymi do 150 mmHg. Aksenova poszerzyła ówczesne dane na temat degeneracji neuronów w późnej fazie hodowli o wyniki badania utlenienia białek i poziomu kinazy kreatyninowej. Oba parametry rosły, co potwierdzało tezę o przyspieszonej akumulacji uszkodzeń. W innej pracy z tego okresu wykazano wzrastającą z czasem nitryfikację białek, parametr równie istotny co utlenianie, oraz zmiany w syntezie markerów synaptogenezy. Po początkowym wzroście poziom synaptofizyny i synapsyny IIa stabilizował się, a następnie malał począwszy od drugiego tygodnia. Pokazano też, że komórki z bardzo późnego stadium hodowli, niezależnie od zmian w fenotypie, są zdolne do uruchomienia szlaku apoptozy. Działanie na stare neurony bodźcem uszkadzającym DNA (kamptotecyna) wywoływało śmierć komórkową o tym samym natężeniu, ale innym mechanizmie niż w komórkach kilkudniowych. Różnica polegała przede wszystkim na braku aktywowanej kaspazy-3 w przebiegu śmierci komórek starych [62]. Współczesne badania nad starzeniem neuronów in vitro to z jednej strony próba pokazania klasycznych markerów starzenia komórkowego w przedłużającej się hodowli pierwotnej, a z drugiej szukanie w niej wskaźników znanych dotąd z chorób neurodegeneracyjnych lub pojawiających się w mózgu starych organizmów. Sukcesem było opisanie spontanicznego wytwarzania β-amyloidu w hodowli komórkowej. W badaniu na komórkach izolowanych ze szczurzych hipokampów wykazano zarówno wydzielanie amyloidu do środowiska, jak i tworzenie agregatów wewww.postepybiochemii.pl gal. Wraz ze wzrastającą w czasie populacją komórek wykazujących zwiększoną Model starzenia Wskaźniki starzenia Piśmiennictwo aktywność SA-β-gal roHipokamp 20 div SA-β-gal [72] sło stężenie reaktywnych form tlenu, wskazując na Hipokamp 40-65 div β-Amyloid w medium i w komórce, ocena różnicowania [63] zwiększoną produkcję lub Kora 12-24 div IGF1-R [64] upośledzone mechanizmy usuwania wolnych rodniHipokamp 30 div karbonylacja białek, kinaza kreatyninowa [60] ków. Za pierwszym z poKora 22 div β-Amyloid, neurotoksyczność [68] wodów przemawia obserwowany równolegle spaKora 28 div spadek liczby synaps [58] dek potencjału Δψm błony Hipokamp 30 div SA-β-gal, potencjał Δψm, tworzenie reaktywnych form tlenu [65] mitochondrialnej, który obniżył się o 40% w czasie Hipokamp 14-29 div aktywacja kanału dla jonów wapnia TRPM2 [73] trwania hodowli. ZdepoKora 15-60 div synaptogeneza, kaspaza-3 [62] laryzowana błona mitochondrium, co jest prawHipokamp 10-26 div gęstość kolców dendrytycznych, receptory dla glutaminianu [69] dopodobnie konsekwencją upośledzenia łańcucha oddechowego, może być wnątrzkomórkowych, oba zjawiska pojawiały się po 2–3 przyczyną powstawania reaktywnych form tlenu [66]. tygodniach prowadzenia hodowli i znacznie się nasilały do końca jej prowadzenia (60 dni). Wspomniane 2–3 tygodnie Innym wskaźnikiem starzenia hodowli neuronów, mająuznano tym samym za granicę między hodowlą młodą a cym odzwierciedlenie w starzeniu in vivo, jest zmiana w godojrzałą. Pokrywa się to ze zmianami w ekspresji genów. spodarce jonów wapniowych. Niepobudzone neurony w 9 W 21 dniu hodowli znikają w komórkach ostatnie ślady i 23 dniu hodowli różnią się stężeniem Ca2+, które w starych nestyny będącej markerem niezróżnicowanych neuronów. neuronach jest zauważalnie wyższe oraz kinetyką reakcji Jednocześnie maksimum osiąga stężenie białka MAP2 chana bodziec uwalniający jony wapnia. Wyrzut Ca2+ jest w rakterystycznego dla neuronów w pełni zróżnicowanych. 23-dniowych komórkach osłabiony, a powrót do poziomu Poziom MAP2 maleje od 40 dnia in vitro, wyraźna też stawyjściowego znacznie opóźniony [67]. Wykazano też spaje się wtedy degeneracja sieci neuronalnej, ten etap można dek częstotliwości wewnątrzkomórkowej oscylacji jonów uznać za starzenie się neuronów [63]. wapnia, w neuronach 22-dniowych był o jedną czwartą niż- Tabela 1. Wskaźniki starzenia zaobserwowane w pierwotnych hodowlach neuronalnych in vitro (div: ang. days in vitro), TRPM2 (ang. transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 2). Pierwotna hodowla neuronów jest de facto kokulturą komórek glejowych i neuronalnych. Zawartość gleju może być różna w zależności od składu pożywki i sposobu izolacji, ale wskaźnik ten wiąże się też wyraźnie ze starzeniem hodowli. Stosunek GFAP (ang. glial fibryllary acidic protein), będącego białkiem specyficznym dla astrocytów, do MAP2 rośnie liniowo przez cały czas jej trwania. Nie jest to tylko konsekwencja różnego tempa dojrzewania i śmierci obu typów komórek. Jak pokazano w pracy Claudio Costantiniego i wsp. [64] astroglej jest niezbędny do pojawienia się jednej z cech starych neuronów, nadprodukcji receptora dla IGF1. Poziom receptora, którego nadmiar obserwuje się m.in. w mózgu osób dotkniętych demencją, rośnie z każdym dniem, począwszy od drugiego tygodnia in vitro. W hodowli pozbawionej komórek glejowych traktowanej arabinozydem cytozyny Ara-C (ang. cytosine arabinoside) blokującym ich rozwój, nie obserwowano tej zależności. Liczba receptorów IGF1-R pozostawała na stałym, niskim poziomie. Warto zauważyć, że stężenie IGF1-R rośnie w tych samych etapach prowadzenia hodowli, co β-amyloid. Zatem zjawisko regulacji syntezy β-amyloidu przez sygnał od receptora dla IGF1 znane z modeli in vivo zdaje się również występować in vitro. Od początku badań nad starzeniem neuronów in vitro zwraca się uwagę na poziom reaktywnych form tlenu i skutki ich działania. W doświadczeniu Weiguo Dong i wsp. [65] skorelowano stężenie reaktywnych form tlenu i mitochondrialny potencjał błonowy Δψm z aktywnością SA-βPostępy Biochemii 60 (2) 2014 szy niż w neuronach 15-dniowych [68]. Starzenie jest prawie zawsze związane ze zmianami morfologicznymi komórek, ale w przypadku neuronów zmiany te są szczególne i ściśle związane z ich funkcją. Poza typowym powiększeniem ciała komórki [62] obserwuje się wspomnianą już degenerację sieci neuronalnej [63] oraz zmiany w gęstości i budowie kolców dendrytycznych. Ten ostatni parametr, oceniany liczbowo w obrazie mikroskopowym, potwierdził wcześniejsze dane pokazujące, że cechą starych neuronów in vitro jest obniżenie plastyczności synaptycznej. Gęstość kolców dendrytycznych wzrasta między 10 a 18 dniem w hodowli i pozostaje na niezmienionym poziomie do 21 dnia, po którym zaczyna spadać. W tym samym momencie zaczyna zmniejszać się średnia wielkość pojedynczego kolca [69]. Należy zaznaczyć, że nie wszystkie opisane parametry przedłużonej hodowli pierwotnej muszą być równoznaczne z cechami starzenia neuronów. Tylko część jednoznacznie skorelowano z uznanymi markerami starzenia takimi jak SA-β-gal. Z kolei ocena niektórych klasycznych markerów, jak choćby inhibitorów cyklu komórkowego, nie daje odpowiedzi na temat starzenia neuronów, z powodu ich postmitotycznego charakteru. Jedno z doświadczeń wskazuje, że hodowle komórkowe mogą być w większym stopniu modelami chorób neurodegeneracyjnych niż starzenia, czego dowodzi konwersja białka p35 (aktywatora kinazy Cdk5) do p25 charakterystyczna dla choroby Alzheimera, a niezacho- 183 badaczy problemu starzenia pozostaje bardziej wnikliwe poznanie na poziomie molekularnym genezy i mechanizmów zmian zachodzących w neuronach. PIŚMIENNICTWO 1. Pakkenberg B, Gundersen HJ (1997) Neocortical neuron number in humans: effect of sex and age. J Comp Neurol 384: 312-320 2. West MJ, Coleman PD, Flood DG, Troncoso JC (1994) Differences in the pattern of hippocampal neuronal loss in normal ageing and Alzheimer’s disease. Lancet 344: 769-772 3. Morrison JH, Baxter MG (2012) The ageing cortical synapse: hallmarks and implications for cognitive decline. Nat Rev Neurosci 13: 240-250 4. Burke SN, Barnes CA (2006) Neural plasticity in the ageing brain. Nat Rev Neurosci 7: 30-40 Rycina 2. Wpływ starzenia na fizjologię neuronów. Starzenie prowadzi do zmian w środowisku zewnątrzkomórkowym i wewnątrzkomórkowym. Rozwija się stan zapalny. Podwyższony poziom stresu powoduje zmiany strukturalne neuronów m.in. spadek liczby kolców dendrytycznych i zmiany w proteomie, co prowadzi do zaburzeń istotnych procesów fizjologicznych w neuronach takich jak: przekaźnictwo synaptyczne, przewodnictwo elektryczne oraz komunikacja z glejem. Stare neurony, podobnie jak komórki mitotyczne, mają podwyższony poziom aktywności β-gal. dząca w starzejącym się mózgu [70]. W zdrowym mózgu kinaza Cdk5 odgrywa istotną rolę w takich procesach jak: plastyczność synaptyczna, migracja neuronów, regulacja cytoszkieletu. Nadmiar stresu w komórce powoduje enzymatyczne cięcie białka p35 do jego krótszej formy p25, której wiązanie do kinazy Cdk5 jest trwalsze i prowadzi do niekontrolowanej hiperfosforylacji różnych substratów kinazy Cdk5 m.in. białka APP (ang. amyloid prekursor protein) i tau. W konsekwencji rozwija się proces neurodegeneracyjny. Nie można pominąć różnic w stosowanych modelach starzejącej się hodowli (Tab. 1). Opisane wyżej badania wykonywano na różnych gatunkach, szczurach i myszach, a do izolacji używano różnych obszarów mózgu, głównie hipokampa i kory. Proces starzenia powinien być jednakowy dla wszystkich neuronów, jednak kinetyka tego procesu może się znacząco różnić, podobnie jak różni się wrażliwość pewnych obszarów mózgu na degenerację i stres oksydacyjny [71]. PODSUMOWANIE Celem tego artykułu było przedstawienie przeglądu literatury z dziedziny badań starzenia mózgu, a w szczególności starzenia neuronów. Starzenie prowadzi do aktywacji wewnątrzkomórkowych ścieżek odpowiedzi na stres. Zaburzony jest m.in. metabolizm komórki, funkcjonowanie białek, rozwija się stan zapalny, spada wrażliwość neuronów na czynniki troficzne i zdolność do plastyczności synaptycznej (Ryc. 2). Zachodzące szkodliwe zmiany akumulują się z wiekiem i zwiększają podatność neuronów na rozwój chorób neurodegeneracyjnych. Wyzwaniem dla 184 5. Peters A, Sethares C, Luebke JI (2008) Synapses are lost during aging in the primate prefrontal cortex. Neuroscience 152: 970-981 6. Dumitriu D, Hao J, Hara Y, Kaufmann J, Janssen WG, Lou W, Rapp PR, Morrison JH (2010) Selective changes in thin spine density and morphology in monkey prefrontal cortex correlate with aging-related cognitive impairment. J Neurosci 30: 7507-7515 7. Petralia RS, Mattson MP, Yao PJ (2014) Communication breakdown: The impact of ageing on synapse structure. Ageing Res Rev, w druku 8. Bloss EB, Janssen WG, McEwen BS, Morrison JH (2010) Interactive effects of stress and aging on structural plasticity in the prefrontal cortex. J Neurosci 30: 6726-6731 9. Bloss EB, Janssen WG, Ohm DT, Yuk FJ, Wadsworth S, Saardi KM, McEwen BS, Morrison JH (2011) Evidence for reduced experience-dependent dendritic spine plasticity in the aging prefrontal cortex. J Neurosci 31: 7831-7839 10.Canas PM, Duarte JM, Rodrigues RJ, Köfalvi A, Cunha RA (2009) Modification upon aging of the density of presynaptic modulation systems in the hippocampus. Neurobiol Aging 30: 1877-1884 11.Smith TD, Adams MM, Gallagher M, Morrison JH, Rapp PR (2000) Circuit-specific alterations in hippocampal synaptophysin immunoreactivity predict spatial learning impairment in aged rats. J Neurosci 20: 6587-6593 12.Geinisman Y, deToledo-Morrell L, Morrell F, Persina IS, Rossi M (1992) Age-related loss of axospinous synapses formed by two afferent systems in the rat dentate gyrus as revealed by the unbiased stereological dissector technique. Hippocampus 2: 437-444 13.Hara Y, Park CS, Janssen WG, Punsoni M, Rapp PR, Morrison JH (2011) Synaptic characteristics of dentate gyrus axonal boutons and their relationships with aging, menopause, and memory in female rhesus monkeys. J Neurosci 31: 7737-7744 14.Geinisman Y, Ganeshina O, Yoshida R, Berry RW, Disterhoft JF, Gallagher M (2004) Aging, spatial learning, and total synapse number in the rat CA1 stratum radiatum. Neurobiol Aging 25: 407-416 15.Scheff SW, Price DA, Sparks DL (2001) Quantitative assessment of possible age-related change in synaptic numbers in the human frontal cortex. Neurobiol Aging 22: 355-366 16.Applegate MD, Landfield PW (1988) Synaptic vesicle redistribution during hippocampal frequency potentiation and depression in young and aged rats. J Neurosci 8: 1096-1111 www.postepybiochemii.pl 17.Soghomonian JJ, Sethares C, Peters A (2010) Effects of age on axon terminals forming axosomatic and axodendritic inhibitory synapses in prefrontal cortex. Neuroscience 168:74-81 18.Nyffeler M, Zhang WN, Feldon J, Knuesel I (2007) Differential expression of PSD proteins in age-related spatial learning impairments. Neurobiol Aging 28: 143-155 19.Clayton DA, Mesches MH, Alvarez E, Bickford PC, Browning MD (2002) A hippocampal NR2B deficit can mimic age-related changes in long-term potentiation and spatial learning in the Fischer 344 rat. J Neurosci 22: 3628- 36237 20.VanGuilder HD, Yan H, Farley JA, Sonntag WE, Freeman WM (2010) Aging alters the expression of neurotransmission-regulating proteins in the hippocampal synaptoproteome. J Neurochem 113: 1577-1588 21.VanGuilder HD, Farley JA, Yan H, Van Kirk CA, Mitschelen M, Sonntag WE, Freeman WM (2011) Hippocampal dysregulation of synaptic plasticity-associated proteins with age-related cognitive decline. Neurobiol Dis 43: 201-212 22.Segovia G, Porras A, Del Arco A, Mora F (2000) Glutamatergic neurotransmission in aging: a critical perspective. Mech Ageing Dev 122: 1-29 23.Stephens ML, Quintero JE, Pomerleau F, Huettl P, Gerhardt GA (2011) Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus. Neurobiol Aging 32: 811-820 24.Segovia G, Del Arco A, Mora F (1999) Effects of aging on the interaction between glutamate, dopamine, and GABA in striatum and nucleus accumbens of the awake rat. J Neurochem 73: 2063-2072 response in hippocampus of aged, memory-impaired rats. J Neurosci 17: 2876-2885 37.Small SA, Chawla MK, Buonocore M, Rapp PR, Barnes CA (2004) Imaging correlates of brain function in monkeys and rats isolates a hippocampal subregion differentially vulnerable to aging. Proc Natl Acad Sci USA 101: 7181-7186 38.Penner MR, Roth TL, Barnes CA, Sweatt JD (2010) An epigenetic hypothesis of aging-related cognitive dysfunction. Front Aging Neurosci 2: 9 39.Vecsey CG, Hawk JD, Lattal KM, Stein JM, Fabian SA, Attner MA, Cabrera SM, McDonough CB, Brindle PK, Abel T, Wood MA (2007) Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation. J Neurosci 27: 6128-6140 40.Penner MR, Roth TL, Chawla MK, Hoang LT, Roth ED, Lubin FD, Sweatt JD, Worley PF, Barnes CA (2011) Age-related changes in Arc transcription and DNA methylation within the hippocampus. Neurobiol Aging 32: 2198-2210 41.Camandola S, Mattson MP (2011) Aberrant subcellular neuronal calcium regulation in aging and Alzheimer’s disease. Biochim Biophys Acta 1813: 965-973 42.Thibault O, Landfield PW (1996) Increase in single L-type calcium channels in hippocampal neurons during aging. Science 272: 10171020 43.Toescu EC, Verkhratsky A, Landfield PW (2004) Ca2+ regulation and gene expression in normal brain aging. Trends Neurosci 27: 614-620 25.Hattiangady B, Rao MS, Shetty GA, Shetty AK (2005) Brain-derived neurotrophic factor, phosphorylated cyclic AMP response element binding protein and neuropeptide Y decline as early as middle age in the dentate gyrus and CA1 and CA3 subfields of the hippocampus. Exp Neurol 195: 353-371 44.Gleichmann M, Chow VW, Mattson MP (2011) Homeostatic disinhibition in the aging brain and Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis 24: 15-24 26.D’Costa AP, Xu X, Ingram RL, Sonntag WE (1995) Insulin-like growth factor-1 stimulation of protein synthesis is attenuated in cerebral cortex of aging rats. Neuroscience 65: 805-813 46.Lu T, Aron L, Zullo J, Pan Y, Kim H, Chen Y, Yang TH, Kim HM, Drake D, Liu XS, Bennett DA, Colaiácovo MP, Yankner BA (2014) REST and stress resistance in ageing and Alzheimer’s disease. Nature 507: 448-454 27.Mattson MP, Magnus T (2006) Ageing and neuronal vulnerability. Nat Rev Neurosci 7: 278- 294 28.Keller JN, Hanni KB, Markesbery WR (2000) Possible involvement of proteasome inhibition in aging: implications for oxidative stress. Mech Ageing Dev 113: 61-70 29.Bergamini E, Cavallini G, Donati A, Gori Z (2003) The anti-ageing effects of caloric restriction may involve stimulation of macroautophagy and lysosomal degradation, and can be intensified pharmacologically. Biomed Pharmacother 57: 203-208 30.Floyd RA, Hensley K (2002) Oxidative stress in brain aging. Implications for therapeutics of neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging 23: 795- 807 31.Yang S, Liu T, Li S, Zhang X, Ding Q, Que H, Yan X, Wei K, Liu S (2008) Comparative proteomic analysis of brains of naturally aging mice. Neuroscience 154: 1107-1120 32.Ottis P, Topic B, Loos M, Li KW, de Souza A, Schulz D, Smit AB, Huston JP, Korth C (2013) Aging-induced proteostatic changes in the rat hippocampus identify ARP3, NEB2 and BRAG2 as a molecular circuitry for cognitive impairment. PLoS One 8, doi: 10.1371/annotation/2546f4c2-b07f-4450-8d3c-f3ee81127b4a 33.Quintas A, de Solís AJ, Díez-Guerra FJ, Carrascosa JM, Bogónez E (2012) Age-associated decrease of SIRT1 expression in rat hippocampus: prevention by late onset caloric restriction. Exp Gerontol 47: 198201 34.Blalock EM, Chen KC, Sharrow K, Herman JP, Porter NM, Foster TC, Landfield PW (2003) Gene microarrays in hippocampal aging: statistical profiling identifies novel processes correlated with cognitive impairment. J Neurosci 23: 3807-3819 35.Lu T, Pan Y, Kao SY, Li C, Kohane I, Chan J, Yankner BA (2004) Gene regulation and DNA damage in the ageing human brain. Nature 429: 883-891 36.Lanahan A, Lyford G, Stevenson GS, Worley PF, Barnes CA (1997) Selective alteration of long-term potentiation-induced transcriptional Postępy Biochemii 60 (2) 2014 45.Jagust W (2013) Vulnerable neural systems and the borderland of brain aging and neurodegeneration. Neuron 77: 219-234 47.Jurk D, Wang C, Miwa S, Maddick M, Korolchuk V, Tsolou A, Gonos ES, Thrasivoulou C, Saffrey MJ, Cameron K, von Zglinicki T (2012) Postmitotic neurons develop a p21-dependent senescence-like phenotype driven by a DNA damage response. Aging Cell 11: 996-1004 48.Hunter S, Arendt T, Brayne C (2013) The senescence hypothesis of disease progression in Alzheimer disease: an integrated matrix of disease pathways for FAD and SAD. Md Neurobiol 48: 556-570 49.Golde TE, Miller VM (2009) Proteinopathy-induced neuronal senescence: a hypothesis for brain failure in Alzheimer’s and other neurodegenerative diseases. Alzheimers Res Ther 1:5 50.Bhat R, Crowe EP, Bitto A, Moh M, Katsetos CD, Garcia FU, Johnson FB, Trojanowski JQ, Sell C, Torres C (2012) Astrocyte senescence as a component of Alzheimer’s disease. PLoS One 7: e45069 51.Salminen A, Ojala J, Kaarniranta K, Haapasalo A, Hiltunen M, Soininen H (2011) Astrocytes in the aging brain express characteristics of senescence-associated secretory phenotype. Eur J Neurosci 34: 3-11 52.Chinta SJ, Lieu CA, Demaria M, Laberge RM, Campisi J, Andersen JK (2013) Environmental stress, ageing and glial cell senescence: a novel mechanistic link to Parkinson’s disease? J Intern Med 273: 429-436 53.Zhang G, Li J, Purkayastha S, Tang Y, Zhang H, Yin Y, Li B, Liu G, Cai D (2013) Hypothalamic programming of systemic ageing involving IKK-β, NF-κB and GnRH. Nature 497: 211-216 54.Abdouh M, Chatoo W, El Hajjar J, David J, Ferreira J, Bernier G (2012) Bmi1 is down-regulated in the aging brain and displays antioxidant and protective activities in neurons. PLoS One 7: e31870 55.Zhang P, Furukawa K, Opresko PL, Xu X, Bohr VA, Mattson MP (2006) TRF2 dysfunction elicits DNA damage responses associated with senescence in proliferating neural cells and differentiation of neurons. J Neurochem 97: 567-581 56.Blagosklonny MV (2011) Cell cycle arrest is not senescence. Aging 3: 94-101 185 57.Brewer GJ, Torricelli JR, Evege EK, Price PJ (1993) Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res 35: 567-576 58.Ichikawa M, Muramoto K, Kobayashi K, Kawahara M, Kuroda Y (1993) Formation and maturation of synapses in primary cultures of rat cerebral cortical cells: an electron microscopic study. Neurosci Res 16: 95-103 59.Porter NM, Thibault O, Thibault V, Chen KC, Landfield PW (1997) Calcium channel density and hippocampal cell death with age in longterm culture. J Neurosci 17: 5629-5639 60.Aksenova MV, Aksenov MY, Markesbery WR, Butterfield DA (1999) Aging in a dish: age-dependent changes of neuronal survival, protein oxidation, and creatine kinase BB expression in long-term hippocampal cell culture. J Neurosci Res 58: 308-317 61.Secomb TW, Hsu R, Beamer NB, Coull BM (2000) Theoretical simulation of oxygen transport to brain by networks of microvessels: effects of oxygen supply and demand on tissue hypoxia. Microcirculation 7: 237-247 62.Lesuisse C, Martin LJ (2002) Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death. J Neurobiol 51: 9-23 63.Bertrand SJ, Aksenova MV, Aksenov MY, Mactutus CF, Booze RM (2011) Endogenous amyloidogenesis in long-term rat hippocampal cell cultures. BMC Neurosci 12: 38 64.Costantini C, Lorenzetto E, Cellini B, Buffelli M, Rossi F, Della-Bianca V (2010) Astrocytes regulate the expression of insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1-R) in primary cortical neurons during in vitro senescence. J Mol Neurosci 40: 342-352 65.Dong W, Cheng S, Huang F, Fan W, Chen Y, Shi H, He H (2011) Mitochondrial dysfunction in long-term neuronal cultures mimics changes with aging. Med Sci Monit 17: 91-96 66.Parihar MS, Brewer GJ (2007) Simultaneous age-related depolarization of mitochondrial membrane potential and increased mitochondrial reactive oxygen species production correlate with age-related glutamate excitotoxicity in rat hippocampal neurons. J Neurosci Res 85: 10181032 67.Toescu EC, Verkhratsky A (2000) Neuronal ageing in long-term cultures: alterations of Ca2+ homeostasis. Neuroreport 11: 3725-3729 68.Kuroda Y, Kobayashi K, Ichikawa M, Kawahara M, Muramoto K (1995) Application of long-term cultured neurons in aging and neurological research: aluminum neurotoxicity, synaptic degeneration and Alzheimer’s disease. Gerontology 1: 2-6 69.Nwabuisi-Heath E, LaDu MJ, Yu C (2012) Simultaneous analysis of dendritic spine density, morphology and excitatory glutamate receptors during neuron maturation in vitro by quantitative immunocytochemistry. J Neurosci Methods 207: 137-147 70.Kim MJ, Oh SJ, Park SH, Kang HJ, Won MH, Kang TC, Park JB, Kim JI, Kim J, Lee JY (2007) Neuronal loss in primary long-term cortical culture involves neurodegeneration-like cell death via calpain and p35 processing, but not developmental apoptosis or aging. Exp Mol Med 39: 14-26 71.Valadka AB, Gopinath SP, Contant CF, Uzura M, Robertson CS (1998) Relationship of brain tissue PO2 to outcome after severe head injury. Crit Care Med 26: 1576-1581 72.Geng YQ, Guan JT, Xu XH, Fu YC (2011) Senescence-associated beta-galactosidase activity expression in aging hippocampal neurons. Biochem Biophys Res Commun 396: 866-869 73.Belrose JC, Xie YF, Gierszewski LJ, MacDonald JF, Jackson MF (2012) Loss of glutathione homeostasis associated with neuronal senescence facilitates TRPM2 channel activation in cultured hippocampal pyramidal neurons. Mol Brain 5: 11 Neuronal ageing Małgorzata Piechota, Piotr Sunderland Laboratory of the Molecular Bases of Aging, Nencki Institute of Experimental Biology, 3 Pasteura St., 02-093 Warsaw, Poland e-mail: [email protected] Key words: ageing, senescence, neuron, stress, synapse, plasticity, brain ABSTRACT Ageing leads to irreversible alterations in the nervous system, which to various extent impair its functions such as capacity to learn and memory. In old neurons and brain, similarly to what may take place in other cells, there is increased oxidative stress, disturbed energetic homeostasis and metabolism, accumulation of damage in proteins and nucleic acids. Characteristic of old neurons are alterations in plasticity, synaptic transmission, sensitivity to neurotrophic factors and cytoskeletal changes. Some markers of senescence, whose one of them is SA-β-galactosidase were used to show the process of neuronal ageing both in vitro, and in vivo. Some research suggest that, despite the fact that neurons are postmitotic cells, it is cell cycle proteins which play a certain role in their biology, e.g. differentiation. However, their role in neuronal ageing is not known or explained. Ageing is the serious factor of development of neurodegenerative diseases among others Alzheimer disease. 186 www.postepybiochemii.pl